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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

AVALIAÇÃO DO PAPEL REPELENTE DE VOLÁTEIS ISOLADOS NO ODOR DE CÃES DA RAÇA BEAGLE CONTRA O CARRAPATO Rhipicephalus

sanguineus (Acari: Ixodidae)

Jaires Gomes de Oliveira Filho

Orientadora: Drª. Lígia Miranda Ferreira Borges

GOIÂNIA 2014

iii

JAIRES GOMES DE OLIVEIRA FILHO

AVALIAÇÃO DO PAPEL REPELENTE DE VOLÁTEIS ISOLADOS NO ODOR DE CÃES DA RAÇA BEAGLE CONTRA O CARRAPATO Rhipicephalus

sanguineus (Acari: Ixodidae)

Dissertação apresentada para a obtenção do grau de Mestre em

Ciência Animal junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração:

Sanidade Animal Higiene e Tecnologia de Alimentos

Linha de Pesquisa: Parasitos e doenças parasitárias dos animais

Orientadora:

Profª Drª Lígia Miranda Ferreira Borges – IPTSP/UFG Comitê de Orientação:

Profª Drª. Andréa Caetano da Silva – IPTSP/UFG Profª Drª Carla Cristina B. Louly – UNIP

GOIÂNIA 2014

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

GPT/BC/UFG

O482a

Oliveira Filho, Jaires Gomes.

Avaliação do papel repelente de voláteis isolados no

odor de cães da raça Beagle contra o carrapato

Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) [manuscrito] /

Jaires Gomes de Oliveira Filho. - 2014.

52 f. : il., figs., tabs.

Orientadora: Profª. Drª. Lígia Miranda Ferreira Borges;

Coorientadoras: Profª. Drª. Andrea Caetano da Silva, Profª.

Drª. Carla Cristina Braz Louly.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,

Escola de Veterinária e Zootecnia, 2014.

Bibliografia.

Inclui lista de figuras e tabelas.

Apêndices.

1. Rhipicephalus sanguineus – Cães – Repelente. 2. Cães

(raça Beagle) – Repelência natural. I. Título.

CDU: 636.7:595.42

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AGRADECIMENTOS

Em primeiro à Profª Drª. Lígia Miranda Ferreira Borges, a quem serei

eternamente grato por abrir as portas para mim, me acolher e me orientar no

início desta jornada acadêmica. Também pela paciência, presteza e compreensão

que sempre guiou suas orientações e correções.

À Profª Drª Carla Cristina Braz Louly pelos ensinamentos práticos,

sobre tudo no que diz respeito à condução dos experimentos em olfatometria.

Também a Profª Drª Andréa Caetano da Silva pela participação em meu comitê

de orientação, além de conselhos e correções sugeridos durante sessões de

seminários que acrescentaram muito durante toda essa caminhada.

A todos os colegas que passaram, estão e também aos que chegaram

ao Laboratório de Parasitologia Veterinária da UFG e ao setor de Medicina

Veterinária Preventiva, pela ajuda e conselhos. Principalmente a colega Lorena

Lopes Ferreira e a estagiaria do setor de parasitologia Thaynara Thatiely Oliveira

que sempre me ajudaram durante toda a condução dos experimentos.

À Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG, por disponibilizar a

estrutura para a execução do experimento, assim como pela excepcional

oportunidade de participar de seu programa de pós-graduação. Ao Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão

da bolsa de estudos.

Principalmente a minha família, meus pais Jaires Gomes de Oliveira e

Iria Inês Gomes Vilela e minha irmã Naiara Cristina Gomes Vilela, que sempre

estiveram ao meu lado tanto nos momentos de alegria quanto nos momentos de

tristeza e que foram meu esteio durante toda minha vida inclusive nesta jornada

acadêmica.

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“Todas as substâncias são venenos; não há nenhuma que não seja veneno. A dose correta diferencia um veneno de um remédio.”

Paracelso 1443-1541

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................1

2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................4

2.1. Rhipicephalus sanguineus................................................................................4

2.2. Percepção sensosorial na biologia comportamental..................................7

2.3. Repelentes.....................................................................................................11

2.4. Presença de repelentes naturais em hospedeiros resistentes................16

3. OBJETIVOS.......................................................................................................22

3.1. Objetivo geral................................................................................................22

3.2. Objetivos especificos...................................................................................22

4. MATERIAL E METODOS..................................................................................23

4.1. Local e duração do experimento.................................................................23

4.2. Obtenção de carrapatos adultos não alimentados....................................23

4.3. Substâncias testadas...................................................................................24

4.4. Ensaios de repelência..................................................................................25

4.4.1. Ensaio de escolha (placa de Petri)..............................................................25

4.4.2. Ensaio no Olfatômetro em Y........................................................................27

4.4. Análise estatística.........................................................................................28

5. RESULTADOS..................................................................................................29

5.1. Placa de Petri.................................................................................................29

5.2. Olfatômetro em Y..........................................................................................33

6. DISCUSSÃO......................................................................................................34

7. CONCLUSÃO....................................................................................................41

REFERÊNCIAS.....................................................................................................42

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Bioensaio da Placa de Petri..................................................................26

Figura 2 – Olfatômetro em Y..................................................................................27

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Percentagem de repelência em teste da placa de Petri de adultos de

R. sanguineus para o DEET, β-citronelol e compostos químicos encontrados no

odor de cães da raça Beagle.................................................................................31


R. sanguineus para as misturas de benzaldeído e 2-hexanona (1:1) e

benzaldeído, 2-hexanona e undecano...................................................................32

Tabela 3 – Percentagem de repelência em teste do olfatômetro em Y de adultos

de Rhipicephalus sanguineus para o DEET, β-citronelol e compostos químicos

encontrados no odor de cães da raça Beagle, em duas diferentes

concentrações........................................................................................................33

xi

RESUMO

Carrapatos são artrópodes de grande importância dentro da saúde pública, devido à transmissão de inúmeros patógenos. Rhipicephalus sanguineus parasita principalmente cães. Sabe-se que cães da raça Beagle são menos susceptíveis ao R. sanguineus que cães Cocker Inglês, e ainda apresentam padrões de resistência ligados a imunidade. A menor susceptibilidade de cães Beagle está ligada a compostos químicos que estes produzem, os quais atuam na diminuição da carga parasitária de R. sanguineus sobre estes animais. Sabendo-se disso com esta pesquisa objetivou-se verificar a repelência química de compostos que foram identificados no odor de cães resistentes, além de compostos sintéticos repelentes para outros carrapatos, contra o R. sanguineus. Para os testes de repelência química foram utilizados dois ensaios de repelência, o da placa de Petri e do olfatômetro em Y. Foram testados cinco compostos com provável poder repelente e identificados nos odores de Beagle (2-hexanona, nonano, decano, undecano e benzaldeído), o composto de origem botânica β-citronelol e o repelente padrão DEET (N,N-dietil-3-metilbenzamida). Além destes compostos testados isoladamente, duas misturas foram avaliadas: benzaldeído e 2-hexanona (1:1), e benzaldeído, 2-hexanona e undecano (1:1:1) Todos estes compostos foram formulados a partir de uma solução mãe de 7,2% (≈ 0,200 mg/cm²) da qual foi obtida posteriormente outras duas concentrações (0,100 e 0,050 mg/cm²). O DEET foi repelente nas duas maiores concentrações, sendo que 68,33 a 86,67% dos carrapatos foram encontrados nas áreas não tratadas, nos diferentes tempos de observação. Na concentração de 0,050 mg/cm² os carrapatos se distribuíram similarmente (sem diferença significativa) em ambas as áreas. β-citronelol foi o único composto testado que foi repelente em todos os tempos e concentrações testados. Os percentuais de carrapatos nas áreas não tratadas variaram de 73,33 a 93,33%. Quando comparado com o DEET o β-citronelol foi mais eficiente em repelir os adultos de R. sanguineus. Para o benzaldeido, aos 30 minutos, na concentração de 0,200 mg/cm² foi observado um percentual de 63,33% de carrapatos na área não tratada. Percentual de 76,67 foi observado aos cinco minutos, na concentração de 0,050 mg/cm². A 2-hexanona foi repelente aos 30 minutos, na concentração de 0,200 mg/cm², aos 10 minutos, na concentração de 0,100 mg/cm² e aos 30 minutos, na concentração de 0,050 mg/cm². Para o undecano foi observado um percentual de 65,00 de carrapatos na área não tratada em apenas um momento dos testes, na maior concentração, durante os primeiros cinco minutos de avaliação. Nonano e decano não causaram qualquer repelência para os carrapatos testados, em qualquer uma das concentrações ou intervalos de tempo avaliados. A mistura benzaldeido + 2-hexanona foi repelente nas três maiores concentrações, em quase todos os tempos avaliados, inclusive no teste de olfatometria. Durante todo o teste esta mistura mostrou semelhança estatística quando comparada com o DEET. A adição de undecano a esta mistura não potencializou o seu poder repelente. O principal resultado obtido foi a constatação da presença de repelentes naturais em cães resistentes ao carrapato R. sanguineus. Palavras-chave: 2-hexanona; β-citronelol; benzaldeido; DEET; olfatômetro em Y; undecano;

xii

ABSTRACT

Ticks are arthropods of great importance in public health, due to the transmission of many pathogens. Rhipicephalus sanguineus parasites mainly dogs. It is known that Beagle dogs are less susceptible to R. sanguineus than English Cocker Spaniel, and still have resistance patterns linked to immunity. The lower susceptibility of Beagle dogs is due to chemical compounds they produce, which act in reducing the parasitic load of R. sanguineus on these animals. Given that this research aimed to verify the chemical repellency against R. sanguineus of compounds that have been identified in the odor of resistant dogs, and synthetic repellent compounds to other tick species. For testing chemical repellency two tests were used, the Petri dish and the Y-olfactometer. Five compounds identified in Beagle odors were selected and tested: 2- hexanone, nonane, decane, undecane and benzaldehyde, the compound of botanical origin β-citronellol and the standard repellent DEET (N,N-diethyl-3-methylbenzamide). These compounds were tested alone and also two mixtures were evaluated: benzaldehyde and 2-hexanone (1:1), and benzaldehyde, 2-hexanone and undecane (1:1:1). All these compounds were prepared in a stock solution of 7.2 % ( ≈ 0.200 mg/cm²) and two lower concentrations were also tested: 0.100 and 0.050 mg/cm². DEET was repellent in the two highest concentrations and 68.33 to 86.67% of the ticks were found in untreated areas in different time points. At the concentration of 0.050 mg/cm² ticks were distributed similarly (without significant difference) in both areas. β-citronellol was the only compound tested that was repellent at all times and concentrations tested. The percentage of ticks in untreated areas ranged from 73.33 to 93.33 %. When compared β-citronellol with DEET the first compound was more effective at repelling the adults of R. sanguineus. For benzaldehyde, 30 minutes at a concentration of 0.200 mg/cm² a percentage of 63.33 % of ticks was observed in the untreated area. Percentage of 76.67 was observed after 5 min. at a concentration of 0.050 mg/cm². 2-hexanone was repellent at 30 min. at a concentration of 0.200 mg/cm² at 10 min. at a concentration of 0.100 mg/cm² and 30 minutes at a concentration of 0.050 mg/cm². For undecane a rate of 65.00% of ticks was observed in the untreated area in one moment of testing, the highest concentration during the first 5 min. of the evaluation. Nonane and decane not were not repellent at any of the concentrations and time intervals. The blend benzaldehyde + 2-hexanone was repellent in the three highest concentrations in almost all evaluated times, including in the olfactometer testing. During the whole test this mixture showed statistical similarity when compared with DEET. The addition of undecane to this blend did not potentiate its repellent power. The main result was the finding of natural repellents in resistant dogs to the tick R. sanguineus. Keywords: 2-hexanone; β-citronellol; benzaldehyde; DEET; undecane; Y-

olfactometer

1. INTRODUÇÃO

Os artrópodes ectoparasitas representam grande ameaça à saúde

pública e animal, podendo agir de forma direta ou indireta sobre seus hospedeiros

(PETER et al., 2005; WALL, 2007). Além disso, levam a perdas econômicas

devido a quedas no ganho de peso, danos no couro entre outros (JONGEJAN &

UILENBERG, 2004; PETER et al., 2005). Na atualidade os carrapatos são os

vetores de maior importância, pois cerca de 10% das espécies conhecidas atuam

na transmissão de zoonoses. Também são capazes de transmitir a maior

variedade de patógenos que qualquer outro vetor (JONGEJAN & UILENBERG,

2004). Sendo responsáveis não só pela transmissão de doenças, mas atuando

diretamente sobre o hospedeiro causando as chamadas ixodidoses, que levam a

quadros de eczema, anemia e até paralisia (JONGEJAN & UILENBERG, 2004;

MARCONDES, 2009).

Os carrapatos são membros do filo Arthropoda, classe Arachnida e

subordem Ixodida. São conhecidas atualmente 899 espécies, que se encontram

divididas em três famílias, Ixodidae, Argasidae e Nuttalliellidae (BARKER &

MURRELL, 2004). Os membros da família Ixodidae são os mais estudados,

devido principalmente ao grande número de doenças que estes podem transmitir,

além de prejuízos na produção animal associados com sua presença (BARKER &

MURRELL, 2004; JONGEJAN & UILENBERG, 2004; ANDREOTTI, 2010).

Dentre os membros da família Ixodidae se destacam os do gênero

Rhipicephalus, por sua ampla difusão global, patógenos que podem transmitir e

prejuízos que podem acarretar. O Rhipicephalus sanguineus é o carrapato mais

cosmopolita, ocorrendo em quase todo o mundo (DANTAS-TORRES, 2008a;

DANTAS-TORRES, 2010). Normalmente parasita cães, porém podem parasitar

outros hospedeiros, inclusive humanos (DANTAS-TORRES et al., 2006; LOULY

et al., 2006). O R. sanguineus atua como vetor de vários agentes patogênicos

para os cães como vírus, bactérias, espiroquetas, protozoários entre outros

(DANTAS-TORRES, 2008b; MARCONDES, 2009). Podem também atuar como

vetor de zoonoses para a população humana (ESTRADA-PEÑA & JOGEJAN,

1999 DEMMA et al., 2006; ROZENTAL et al., 2008; MARCONDES et al., 2009;

SOCOLOVICH et al., 2009; EREMEEVA et al., 2011).

2

Estudos realizados com objetivo de determinar se o cão é capaz de

desenvolver resistência contra o R. sanguineus são contraditórios. SZABÓ (1991),

BECHARA et al. (1994) e FERREIRA & BECHARA (1995) afirmam que o cão é

incapaz de desenvolver resistência, entretanto INOKUMA et al. (1997),

JITAPALLAPONG et al. (2000a) e LOULY et al. (2009) demonstram que a

resistência pode estar presente, porém varia em função da raça do individuo.

LOULY et al. (2009) demonstraram que cães da raça Beagle são menos

susceptíveis a infestações por este carrapato que cães da raça Cocker Inglês.

Segundo PICKETT et al. (2010), animais apresentam menor carga

parasitária diante de duas situações: animais não hospedeiros que são capazes

de inibir o parasitismo, expressando maior quantidade de compostos químicos

voláteis em seus odores; animais hospedeiros que produzem maior quantidade de

compostos químicos em certas condições o que diminui a infestação sobre esses.

Através de cromatografia gasosa associada à espectrofotometria de massa

verificou-se uma maior quantidade de compostos químicos voláteis no odor de

cães da raça Beagle e ainda notou-se compostos químicos que só eram

detectados nos cromatogramas de Beagles como: benzaldeido, 2-hexanona,

undecano, decano e nonano (BORGES et al., 2011; BORGES et al., 2013).

Portanto, os resultados se encaixam na hipótese de PICKETT et al. (2010).

Sabe-se que os animais interagem com o mundo a sua volta de

diversas formas como por meio de sinais visuais, auditivos, táteis e químicos. A

importância que cada um destes sinais recebe na biologia comportamental difere

entre as várias espécies animais existentes (FERREIRA, 2001; VILELLA &

DELLA LÚCIA, 2001). Os carrapatos orientam seu comportamento em função

principalmente de estímulos químicos (SONENSHINE, 2004). Para tanto utilizam

órgãos sensoriais adaptados a essa função como o órgão de Haller e palpos

maxilares. Estes órgãos são dotados por receptores celulares denominados

sensilas por onde os carrapatos detectam os estímulos (SONENSHINE, 1991;

GUERIN et al., 2000).

Os compostos químicos que carreiam informações, semioquimicos,

podem atuar dentro de indivíduos de uma mesma espécie como os feromônios,

ou entre indivíduos de espécies diferentes como os aleloquímicos, tais como os

cairomônios, alomônios e sinomônios. (FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA

3

LÚCIA, 2001; SONENSHINE, 2004). Os cairomônios são compostos químicos

que quando emitidos por um organismo, causam uma resposta fisiológica

adaptativa positiva no organismo receptor destes químicos, consequentemente

acarreta em prejuízo ao organismo emissor. Os alomônios são compostos

químicos que quando emitidos por um organismo, causam uma resposta

fisiológica adaptativa negativa no organismo receptor destes químicos,

simultaneamente uma resposta adaptava positiva ao organismo emissor

(FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001; SONENSHINE, 2004).

Enquanto sinomônios são compostos químicos que quando emitidos por um

organismo provocam uma resposta adaptativa positiva, tanto ao organismo

emissor quanto para o organismo receptor (FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA

LÚCIA, 2001).

A principal forma de controle de carrapatos ainda é o uso de acaricidas

com bases químicas neurotóxicas, porém o uso excessivo destas substâncias

ocasiona o aparecimento de cepas resistentes (MILLER et al., 2001; BORGES et

al., 2007; ANDREOTTI, 2010). Além da seleção de cepas resistentes, estes

acaricidas causam contaminação ambiental e de produtos de origem animal

(PETER et al., 2005; WALL, 2007; ANDREOTTI, 2010).

Desta forma, o encontro de substâncias químicas como as que

participam da biologia comportamental deste carrapato, como os alomônios, e

que possam ser introduzidas no seu controle é uma alternativa mais salutar, pois

atuam preferencialmente sobre a espécie alvo e diminuem a quantidade de

acaricidas a ser utilizada.

Tendo em vista as dificuldades no controle do carrapato R. sanguineus,

a crescente preocupação com a contaminação ambiental, além de este carrapato

emergir atualmente como um vetor de importância para a saúde publica, o

trabalho teve como objetivo avaliar novos compostos químicos como os

alomônios, repelentes naturais, com potencial para o uso no seu controle.

4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806)

R. sanguineus é a espécie dentre todos os ixodídeos mais cosmopolita,

estando presente em quase todo o mundo entre as latitudes 35ºS a 50ºN

(DANTAS-TORRES, 2008a; DANTAS-TORRES, 2010). Originária do continente

africano, onde existem cerca 20 espécies do gênero Rhipicephalus, a espécie R.

sanguineus está distribuída em todo território nacional (WALKER et al., 2000;

ONOFRIO et al., 2006). Acredita-se que a espécie tenha sido introduzida no Brasil

com as primeiras incursões europeias que traziam consigo animais, por volta do

século XVI (LABRUNA & PEREIRA, 2001).

Seu principal hospedeiro e grande responsável por sua manutenção no

ambiente assim como as explosões populacionais deste parasito, é o cão (LOULY

et al., 2007). Porém, existem relatos desta espécie parasitando diversos

hospedeiros como aves rasteiras, pombos, cavalos, bovinos e até o homem,

quando ocorre um íntimo contato destes hospedeiros com o cão (ESTRADA-

PEÑA & JOGEJAN, 1999; LABRUNA & PEREIRA, 2001; DANTAS-TORRES et

al., 2006; LOULY et al., et al., 2006; SZABÓ et al., 2012).

O R. sanguineus atua diretamente no ciclo epidemiológico de vários

agentes patogênicos como vírus, bactérias, protozoários entre outros (DANTAS-

TORRES, 2008b; MARCONDES, 2009). É o principal vetor de Babesia canis,

Erlichia canis e Hepatozon canis, hemoparasitos com altas taxas de prevalência

em cães infestados por estes carrapatos (LABRUNA & MACHADO, 2006;

DANTAS-TORRES, 2008b). Devido à associação íntima deste parasito com o

principal reservatório de Leishmania spp., o cão, e ainda sua capacidade em

transmitir outros protozoários, inúmeros estudos vêm sendo realizados para

elucidar a possível participação deste carrapato no ciclo da leishmaniose canina.

Contudo seu papel como vetor do patógeno ainda não é claro (COUTINHO et al.,

2005; PAZ et al., 2010; SOLANO-GALLEGO et al., 2012).

Em estados do sul dos E.U.A. como Califórnia e Arizona e no México

seu parasitismo em humanos está associado à transmissão de Rickettsia

rickettsii, agente causal da febre maculosa, zoonose com alta taxa de letalidade

5

(DEMMA et al., 2006; MARCONDES, 2009; EREMEEVA et al., 2011). No Brasil,

existem estudos que sugerem a capacidade deste carrapato atuar como vetor da

doença principalmente em áreas endêmicas. Porém, o principal vetor para esta

doença em território nacional ainda é o Amblyomma cajennense (ROZENTAL et

al., 2008; MARCONDES, 2009). Ainda em países do mediterrâneo europeu o R.

sanguineus é considerado o principal vetor de Rickettsia conorii agente da febre

botonosa, doença que também pode levar ao óbito (ESTRADA-PEÑA &

JOGEJAN, 1999; SOCOLOVICH et al., 2009).

Além de atuar na transmissão, manutenção e até a amplificação de

vários agentes patogênicos, o R. sanguineus atua ainda como um bioagente,

causando danos aos seus hospedeiros relacionados diretamente a seu

parasitismo. Este carrapato pode conduzir seus hospedeiros a quadros de

anemia, eczema, toxicoses e até paralisia flácida (MARCONDES, 2009;

OTRANTO et al., 2012).

Assim como os demais membros da família Ixodidae, o R. sanguineus

apresenta quatro estágios no desenvolvimento de seu ciclo vital, sendo que três

destes são ativos e dependem do repasto sanguíneo para desempenho pleno de

suas funções biológicas (FACCINI & BARROS-BATTESTI, 2006). Os estágios

comuns aos ixodídeos são o ovo embrionado, a larva, a ninfa e os adultos

(SONENSHINE, 1993; FACCINI & BARROS-BATTESTI, 2006; MARCONDES,

2009). Durante seu ciclo de vida os carrapatos apresentam duas fases distintas, a

de vida livre e a parasitária. Ambas as fases são importantes no desenvolvimento

do parasito e se complementam (MARCONDES, 2009).

Os carrapatos podem apresentar dois ciclos vitais distintos, monoxeno

quando parasitam apenas um hospedeiro se fixando neste ainda como larva e o

abandonando já na fase adulta, ou podem ser heteroxenos quando se fixam e

abandonam os hospedeiros para realizar a ecdise no ambiente (SONENSHINE,

1993; MARCONDES, 2009). O R. sanguineus é um carrapato de ciclo trioxeno, ou

seja, realiza a ecdise no meio ambiente, necessitando de três hospedeiros para

completar seu ciclo vital. É uma espécie de hábito nidícola, sendo extremamente

adaptada ao habitat do cão (SONENSHINE, 1993; DANTAS-TORRES, 2010).

As teleóginas de R. sanguineus podem chegar a pesar até 250 mg e

chegam a ovipor cerca de 4.000 ovos durante a postura (GUGLIELMONE et al.,

6

2006; DANTAS-TORRES, 2008a; DANTAS-TORRES, 2010). Durante o período

de pré-oviposição que pode variar entre três a 14 dias, a fêmea busca ninhos

próximos a seus hospedeiros, a oviposição pode durar até 21 dias. As larvas e as

ninfas quando fixadas em seus hospedeiros alimentam-se de três a cinco dias e

de cinco a sete dias, respectivamente. Uma vez fora de seus hospedeiros as

metalarvas e metaninfas fazem a ecdise em um período aproximado de oito a 11

dias e de 11 a 23 dias, respectivamente, sob condições ideais (GUGLIELMONE et

al., 2006; DANTAS-TORRES, 2008a; MARCONDES, 2009).

Tendo em vista seu ciclo, e levando em conta que cerca de 2/3 da vida

completa do R. sanguineus se passa no ambiente (GUGLIELMONE et al., 2006;

DANTAS-TORRES, 2008a), este carrapato teve que desenvolver mecanismos

adaptativos específicos para a localização de seus hospedeiros (GUERIN et al.,

2000; GUERENSTEIN & LAZZARI, 2009). Sabe-se que esta espécie busca

ativamente o hospedeiro, principalmente pela percepção de CO2 e do latido de

seu hospedeiro preferencial (SONENSHINE, 1993; LOULY, 2003).

Devido a seu poder de adaptação e à sua grande distribuição, alguns

autores questionam se esta espécie faz diapausa e quantas gerações ela realiza

durante um ano. Sabe-se que assim como outros carrapatos o R. sanguineus

sofre grande influência de fatores abióticos, como temperatura e umidade do

ambiente (USPENSKY, 2002; MARCONDES, 2009; DANTAS-TORRES, 2008a;

DANTAS-TORRES, 2010). Sendo assim, dependendo da região onde esses

carrapatos se desenvolvem, eles podem ter de 2,5 até quatro gerações em um

ano (GUGLIELMONE et al., 2006; LOULY et al., 2007).

A principal forma de controle deste carrapato ainda é o uso de

acaricidas com bases químicas neurotóxicas, porém o uso excessivo destas

substâncias ocasiona o aparecimento de cepas resistentes (MILLER et al., 2001;

BORGES et al., 2007; ANDREOTTI, 2010). Além da seleção de cepas

resistentes, estes acaricidas têm sido incriminados na contaminação ambiental e

de produtos de origem animal (PETER et al., 2005; WALL, 2007). BORGES et al.

(2007) constataram a presença de cepas de R. sanguineus resistentes à

deltametrina, cipermetrina e coumafós no município de Goiânia, bases químicas

disponíveis no mercado e largamente utilizadas. Uma alternativa ao uso de

7

acaricidas seria o controle biológico realizado com compostos químicos que

façam parte da ecologia química deste parasito.

2.2. Percepção Sensorial na Biologia Comportamental

Os animais orientam sua biologia comportamental em função de sinais

acústicos, táteis, visuais e químicos (semioquímicos) que conseguem detectar em

seu habitat (EISNER & MEINWALD, 1995; FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA

LÚCIA, 2001; GUERENSTEIN & LAZZARI, 2009). A ênfase que cada um destes

sinais assume no desenvolvimento do comportamento do animal está diretamente

relacionada à sua ecologia e fisiologia. Por exemplo, sinais acústicos assumem

papel de grande importância na comunicação de artrópodes que vivem a espreita

ou escondidos (FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001), também

parecem desempenhar função importante na ecologia de carrapatos que buscam

ativamente seus hospedeiros, como o latido dos cães (SONENSHINE, 1993). Por

outro lado, comunicação tátil tem grande importância para artrópodes sociais, que

vivem em sistemas coloniais. Mas, sem dúvida alguma todos os artrópodes têm

sua ecologia influenciada por sinais químicos (FERREIRA, 2001; VILELLA &

DELLA LÚCIA, 2001).

É comum percebemos e interagirmos com o mundo a nossa volta

através de sinais visuais e acústicos. Porém nos esquecemos de que estamos

cercados por sinais químicos, e que esses são ubiquitários (EISNER &

MEINWALD, 1995). Todos os seres vivos animais e vegetais estão aptos à

emissão destes sinais químicos e responderem a esses de sua própria maneira

(BERENBAUM, 1995; EISNER & MEINWALD, 1995).

Por vezes os seres humanos atribuem o uso de compostos químicos

exclusivamente a si próprios, porém na natureza é comum o uso destes

compostos na comunicação entre indivíduos da mesma espécie e de espécies

diferentes de artrópodes (TRIGO et al., 2000; FERREIRA, 2001; VILELLA &

DELLA LÚCIA, 2001). Um exemplo do uso de compostos químicos por artrópodes

são as inúmeras espécies se comunicando interespecificamente por meio de

feromônios, que são substâncias químicas isômeras e em proporções

praticamente similares (FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001). “Os

8

artrópodes são capazes não só de produzirem os vários componentes do

feromônio com alto grau de pureza por meio de caminhos biossintéticos

específicos, mas também controlam o isomerismo geométrico e óptico das

moléculas” (VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001).

Os carrapatos tem sua biologia comportamental voltada principalmente

para a percepção de compostos químicos que possam atuar como sinais

(VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001; SONENSHINE, 2004). Provavelmente a grande

importância dos compostos químicos para os carrapatos se dê pela sua

morfofisiologia (SONENSHIENE, 1991), além da fácil dispersão dos compostos

químicos voláteis pelo ar (GUERIN et al., 2000; VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001).

A maioria dos carrapatos não possuem olhos propriamente ditos,

mesmo aqueles que os possuem é duvidoso que esses possibilitem que

enxerguem formas definidas ou discriminem objetos (SONENSHINE, 1991). O

órgão de maior importância para a percepção sensorial dos carrapatos é, sem

duvida, o órgão de Haller presente em todas as espécies e localizado no dorso do

tarso no primeiro par de patas (SONENSHINE, 1991; SONENSHINE, 2004;

FABBRO & NAZZI, 2013). Tem como principal função a olfação, uma vez que

possui maior número de quimiosensilas, mas apresenta ainda mecanossensilas e

termohigrossensilas. As quimiosensilas são divididas em olfativas e gustativas, as

olfativas são especializadas na percepção de compostos químicos voláteis como

CO2, enquanto sensilas gustativas são especializadas na percepção de

compostos químicos encontrados em soluções como cloreto de potássio (KCl) e

cloreto de sódio (NaCl) (WALLADE & RICE, 1977; SONENSHINE, 1991;

FERREIRA, 2013; SOARES et al., 2013). O número e tipo de sensilas varia

sensivelmente entre as espécies de carrapatos (SONENSHINE, 1991).

Os compostos químicos, notavelmente os voláteis, assumem um papel

de importância na ecologia de artrópodes, principalmente daqueles que assim

como os carrapatos são de hábitos terrestres (VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001;

SONENSHINE, 2004). Estes animais não possuem grande dispersão devido a

sua ecologia, exceto durante a fase parasitária quando podem ser transportados

por longas distâncias por seus hospedeiros (LABRUNA & PEREIRA, 2001;

SZABÓ et al., 2012). Diferentemente de outros sinais como acústicos, visuais,

táteis e até compostos químicos solúveis, os compostos químicos voláteis são

9

facilmente dispersados pelo vento por grandes distâncias, podendo ainda

permanecer por maiores períodos de tempo e fornecendo informação segura da

direção da fonte emissora de estímulo (GUERIN et al., 2000; FERREIRA, 2001;

VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001).

Os compostos químicos voláteis que desempenham papel na ecologia

dos animais são chamados de semioquímicos, do grego semeion=sinal, ou seja,

químicos que carregam o sinal (AGELOPOULOS, et al., 1999; VILELLA & DELLA

LÚCIA, 2001; PICKETT et al., 2010). Esses podem desencadear comportamentos

como alimentação, oviposição, acasalamento, agregação, interrupção de hábitos

alimentares, dispersão entre outros (VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001;

SONENSHINE, 2004; LOGAN & BIRKETT, 2007; PICKETT et al., 2010).

Os carrapatos, assim como outros artrópodes hematófagos, utilizam

compostos químicos inerentes ao metabolismo de seus hospedeiros preferenciais

(cairomônios) para os localizarem (SONENSHINE, 2004; GUERENSTEIN &

LAZZARI, 2009). Assim como também para identificar em seus hospedeiros locais

de preferência para fixação e realização do repasto sanguíneo (SONENSHINE,

2004; WANZALA et al., 2004). Dentre os cairomônios mais conhecidos estão o

CO2, ácido lático, 1-octen-3-ol (octenol), amônia, ácido butírico e ácido acético,

que podem indicar não só a presença do hospedeiro como também o local de

maior probabilidade para o encontro desses (CARROLL, 2002; SONENSHINE,

2004; DITZEN et al., 2008).

No entanto, alguns compostos químicos como os alomônios, provocam

uma resposta fisiológica adaptativa negativa ao receptor da informação, fazendo

com que os carrapatos cessem o comportamento de busca pelo hospedeiro ou

até mesmo provocando um afastamento desses da fonte emissora provocando

um comportamento de repelência sobre os indivíduos (FERREIRA, 2001;

VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001; SONENSHINE, 2004). É interessante destacar

que apesar do termo alomônio geralmente ser encontrado associado à defesa

química de organismos, pode estar também associado a outras características

comportamentais (BERENBAUM, 1995; TRIGO et al., 2000). Por exemplo, um

predador quando emite compostos químicos que são atraentes para a sua presa,

favorecendo a sua captura, produz um alomônio, porém não de defesa

(BERENBAUM, 1995).

10

É importante ressaltar que nenhum composto químico é responsável

por sinalizar o desencadeamento de uma resposta comportamental de forma

isolada. A associação e o balanço dos compostos químicos presentes em cada

hospedeiro podem atuar de forma sinérgica para uma espécie e antagônica para

outra espécie de parasito (KENNEDY, 1977; EISNER & GRANT, 1980;

BERENBAUM, 1995; WELDON, 2010). Além disso, fatores abióticos como

temperatura, umidade, velocidade e direção da pluma de vento, além de pressão

atmosférica, interferem não apenas com a percepção dos químicos pelos

artrópodes, como também com a sua resposta comportamental (GUERIN et al.,

2000; VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001; PELLEGRINO et al., 2013).

Durante anos, os estudos comportamentais vêm sendo focados em

dois principais aspectos do comportamento de artrópodes, repelência e

atratividade, principalmente daqueles de hábitos hematófagos como os carrapatos

(KENNEDY, 1977; SCHRECK, 1977; GUERIN et al., 2000; GUERENSTEIN &

LAZZARI, 2009). Os mecanismos e compostos químicos que levam estes

artrópodes a serem repelidos ou atraídos ainda geram discussão (VILELLA &

DELLA LÚCIA, 2001; MILLER et al., 2009; PALUCH et al., 2010; FABBRO &

NAZZI, 2013), no entanto, sabe-se que tanto a atração quanto a repelência

podem ser causadas por mecanismos de cinese e taxia, que são respostas

direcionadas ou não direcionadas em círculos ou curvas em direção à fonte de

odor, respectivamente (VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001; MILLER et al., 2009).

Porém, a maioria dos eventos fisiológicos e bioquímicos que desencadeiam estes

comportamentos nos artrópodes quando estimulados por um composto químico,

ainda são desconhecidos (BISSINGER & ROE, 2010; BOHBOT & DICKENS,

2010; FABBRO & NAZZI, 2013).

Estudos sobre os mecanismos de ação de compostos químicos que

provocam o comportamento de repelência são realizados desde o

desenvolvimento do DEET (N,N-dietil-3-metilbenzamida), repelente padrão ouro

desenvolvido na década de 40 (SCHRECK, 1977; FRADIN & DAY, 2002;

BISSINGER & ROE, 2010). Segundo DAVIS (1985) a repelência é provocada por

cinco mecanismos. Primeiro ocorre pela inibição neural seletiva quando um

composto químico inibe a resposta de neurônios relacionados com a atração e o

artrópode deixa de realizar o repasto sanguíneo em um hospedeiro atrativo.

11

Estímulo dose-dependente ocorre quando um composto químico, que em

determinada concentração resulta em atração, gera repelência por estar

altamente concentrado. O estímulo de neurônios inibitórios ocorre quando alguns

receptores neurais são estimulados levando o artrópode a cessar a busca por

alimento. A nocicepção direta acontece quando receptores neurais registram a

presença de substâncias prejudiciais ao artrópode, que adota um comportamento

de fuga. E por último, é quando há um sobrefluxo de dados, pois alguns

compostos químicos não se ligam especificamente a um receptor, mas

simultaneamente a vários, havendo a perda do estímulo de atração já que os

receptores estão previamente ligados.

Apesar do conhecimento destes mecanismos, não é possível prever

como um composto químico pode atuar e por qual mecanismo ele poderá repelir

ou atrair as várias espécies de artrópodes parasitos conhecidas (KENNEDY,

1977; PALUCH et al., 2010; FABBRO & NAZZI, 2013). Um exemplo disso são os

vários ensaios de repelência com o DEET. Este químico atua sobre Aedes

aegyptii como inibidor seletivo de acido láctico (DOGAN et al., 1999), sendo ainda

capaz de bloquear os receptores de octenol nesta espécie devido a sua

similaridade com essa molécula (BOHBOT & DICKENS, 2010). O químico

também bloqueia a resposta olfativa sensorial em Anopheles gambiae e

Drosophila melanogaster (DITZEN et al., 2008). Em trabalhos recentes foi

demonstrado que o DEET atua ainda como uma molécula de odor, assim sendo

tem capacidade de se ligar e estimular receptores específicos (SYED & LEAL,

2008; SYED et al., 2011).

2.3. Repelentes

No contexto da saúde pública os repelentes desempenham um

importante papel na proteção pessoal contra a transmissão de doenças vetoriais,

pois impedem que parasitos hematófagos se alimentem evitando assim a

transmissão das doenças (NETWING, 2003; WHO, 2006).

Várias definições para o termo repelente são encontradas na literatura.

Segundo DETHIER (1956) um repelente pode ser qualquer estímulo que atue sob

o comportamento de artrópodes fazendo com que esses evitem a fonte do

12

estímulo. Ainda segundo este autor, teoricamente existem categorias de

repelentes assim como há classes de estímulos externos, destacando duas

divisões principais, física e química, sendo que a química se subdivide em

repelentes olfativos (voláteis) e gustativos (deterrentes). Segundo hipótese

proposta por McMAHON et al. (2003), repelentes são compostos que atuam em

fase de vapor (voláteis) inibindo a resposta de artrópodes a atraentes, enquanto

deterrentes são compostos que atuam por contato inibindo a resposta a um

estímulo arrestante. Mas segundo PICKETT et al. (2008) repelência pode ser

descrita como um comportamento causado pela estimulação de neurônios

sensoriais periféricos, causando um estimulo de não alimentação no artrópode e

afastamento do hospedeiro tratado.

Substâncias com odor desagradável como alcatrão e urina de animais

são usadas a milênios com o objetivo de afastar artrópodes parasitos. Já nas

antigas civilizações egípcias e romanas existem relatos do uso dessas

substâncias no intuito de coibir o ataque de ectoparasitos (PETERSON & COATS,

2001; CHARLWOOD, 2003; NENTWIG, 2003; KATZ et al., 2008). Heródotos (484

aC-425 aC) descreve o uso do óleo de rícino, extraído da planta Ricinus comunis

cuja a variedade egípcia é dotada de um odor extremamente desagradável, por

pescadores egípcios no intuito de afastar mosquitos (CHARLWOOD, 2003).

A primeira substância química com ação repelente comprovada a ser

comercializada foi o óleo de citronela em 1901 (DETHIER, 1956; KATZ et al.,

2008), bastante utilizado principalmente para o combate da pediculose humana

até meados da década de 40 (PETERSON & COATS, 2001). Antes da segunda

guerra mundial existiam apenas três repelentes sintéticos: o dimetilftalato

(dimetil1,2-benzenedicarboxilato), indalona (butil3,3di-hidro2,2dimetil4oxo2H-

pirano-6-carboxilato) e etilhexanodiol (Rutgers 612) (DETHIER, 1956; BROWN &

HEBERT, 1997; NENTWIG, 2003; BISSINGER & ROE, 2010).

No inicio da segunda guerra mundial os três compostos sintéticos

conhecidos, foram combinados em uma formulação para uso militar denominado

6-2-2 ou M-250, sendo 60% de dimetilfitalato, 20% de indalona e 20% de

RUTGERS 612 (DETHIER, 1956; PETERSON & COATS, 2001; BISSINGER &

ROEL, 2010). Devido ao fracasso da formulação do 6-2-2 em conferir a proteção

necessária aos soldados em campo de batalha, teve inicio então o avanço

13

sistêmico de pesquisas com compostos químicos candidatos a repelentes

principalmente por parte de programas militares dos Estados Unidos da América

(E.U.A.) e União das Republicas Socialistas Soviéticas (U.R.S.S.) (DETHIER,

1956; YOUNG & EVANS, 1998; BISSINGER & ROE, 2010; PALUCH et al., 2010).

Apenas durante o período entre guerra e pós-guerra (1942-1949), o

Departamento de Agricultura dos E.U.A. testou mais de 7.000 compostos com

prováveis propriedades repelentes (NENTWIG, 2003; BISSINGER & ROE, 2010).

Em 1946 foi formulado o DEET, que foi registrado em 1957 nos E.U.A.

junto à agência de proteção ambiental (Environmental Protection Agency/E.P.A.)

e disponibilizado comercialmente. Este composto é considerado até hoje um

repelente padrão ouro devido à sua eficácia contra vários ectoparasitos (FRADIN

& DAY, 2002; BISSINGER & ROE, 2010). E até hoje depois de mais de cinco

décadas ainda é o composto químico de ação repelente mais estudado e

comercializado (PICKET et al., 2008; BISSINGER & ROE, 2010).

O DEET é disponível comercialmente em concentrações que podem

variar entre 5% a 100% e em múltiplas formulações, incluindo loções, cremes,

aerossóis e rolons (KATZ et al., 2008; OSIMITZ et al., 2010). A maioria das

formulações comerciais encontradas hoje é de 40% ou menos (FRADIN & DAY,

2002). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) preconiza que no

Brasil a comercialização de produtos com DEET superior a 30% em sua formula

passem antes por avaliações de risco (BRASIL, 2013).

Apesar de em meio século geralmente produtos a base deste

composto químico se apresentarem seguros e de baixa toxicidade para a

população humana, existem relatos de efeitos adversos (OSIMITZ et al., 2010;

PALUCH et al., 2010). Na literatura são relatadas reações como: dermatites,

eczemas, vômitos, enxaquecas, fotossensibilização, ataxia, hipertensão e

dificuldades respiratórias (ROLAND et al., 1985; BRIASSOULIS et al., 2001;

OSIMITZ et al., 2010), ainda foram verificadas quantidades significativas em

liquido placentário deste composto químico (McGREADY et al., 2001). Podendo

ainda conduzir a casos de crises epilépticas e até ao coma (BRIASSOULIS et al.,

2001; OSIMITZ et al., 2010). Também são registradas três mortes de crianças

associadas ao uso de produtos contendo DEET em sua formulação

(BRIASSOULIS et al., 2001).

14

Os óleos essências são uma mistura de inúmeros metabólitos

secundários como hidrocarbonetos: terpenos, monoterpenos e sequiterpenos e

compostos oxigenados: álcoois, cetonas e fenóis, que conferem as plantas

características únicas como odor, atratividade de polinizadores e resistência a

herbivoria (BERENBAUM, 1995; TRIGO et al., 2000; NERIO et al., 2010). Nas

últimas décadas grandes avanços foram feitos na análise destes extratos como

repelentes, devido principalmente aos avanços da química analítica que

permitiram separar, quantificar e estudar intrinsicamente cada um destes

compostos químicos complexos presentes nos óleos essências (EISNER &

MEINWALD, 1995).

Na literatura a repelência causada por extratos de plantas comumente

está associada à presença de terpenos e sesquiterpenos como citronelal, cineole,

eugenol e camfor, constituintes típicos do óleo de citronela (NERIO et al., 2010).

No entanto recentemente o papel de compostos oxigenados como álcoois, fenóis

e cetonas vem se destacando (TUNÓN et al., 2006; BISSINGER & ROE, 2010;

NERIO et al., 2010). Assim como o álcool β-citronelol que pode ser encontrado

como composto majoritário de óleo da flor de cravo (Dianthus caryophyllum),

citronela (Cymbopogon winterianus) e gerânio (Perlagonium graveolens L.)

(TUNÓN et al., 2006; SCHERER et al., 2009; ZHANG et al., 2012), e que atua

como um repelente de alta eficácia contra carrapatos Ixodes ricinus (TUNÓN et

al., 2006).

Apesar da grande aceitação dos compostos botânicos, nem sempre

estes serão mais seguros ou mesmo tão eficazes quanto produtos sintéticos.

Podem ocorrer efeitos adversos, apesar de sua baixa toxicidade na população

humana em geral (TRUMBLE, 2002; NENTWIG, 2003; NERIO et al., 2010). É

preciso desmistificar mensagens que são transmitidas ao público como ‘natural é

seguro’ e principalmente ‘não contém compostos químicos’ (TRUMBLE, 2002),

haja vista que algumas das propriedades que são usadas como repelentes são

toxinas oriundas de processos metabólicos primários (BERENBAUM, 1995;

TRUMBLE, 2002).

O interesse em estudar o modo de ação dos repelentes surgiu com a

disponibilidade comercial do DEET (SCHRECK, 1977). Informações sobre o modo

de ação destes compostos químicos são pertinentes, pois servem como um

15

‘manual’ para o desenvolvimento de novos repelentes (DAVIS, 1985). Contudo

ainda não são claras as relações da estrutura-química com a atividade repelente

sobre os parasitos (PETERSON & COATS, 2001; PALUCH et al., 2010).

DAVIS (1985) menciona a necessidade de um grupo oxigênio-funcional

para que um composto químico exerça a função de repelente. Ainda outros

parâmetros além do grupo oxigênio-funcional são utilizados para se deduzir a

repelência de um químico, como potenciais hidrofóbicos, ligações moleculares e

cargas negativas em átomos de hidrogênio, além de configuração espacial

(PALUCH et al., 2010). Mas o único parâmetro que parece ter correlação com

repelência, para todo composto químico, é a pressão de vapor (DAVIS, 1985;

PALUCH et al., 2010). Isso se torna claro uma vez que se supõe que um

repelente deva atuar sobre a fase de vapor (McMAHON et al., 2003). Porém, em

estudos recentes com carrapatos I. ricinus não foi verificada uma correlação direta

entre pressão de vapor e repelência, mas a repelência de um composto químico

parece estar intrinsicamente ligada a seu grupo químico (FABBRO & NAZZI,

2013).

Apesar disso, a atividade biológica de um composto químico não pode

ser comprovada através de métodos químicos, mas sim biológicos

(BERENBAUM, 1995; EISNER & MEINWALD, 1995; TRIGO et al., 2000). Estudos

que investigam o papel destes compostos químicos em um contexto biológico,

comportamental, são chamados de bioensaios (KENNEDY, 1977; EISNER &

MEINWALD, 1995; TRIGO et al., 2000). Em geral são utilizados ensaios que

discriminem respostas comportamentais de atratividade ou de repelência, para

análise de compostos químicos (KENNEDY, 1977; VILELLA & DELLLA LÚCIA,

2001). Segundo DAUTEL (2004), os bioensaios de repelência podem ser

divididos em três categorias: ensaios sem uso de estímulos atrativos, ensaios

com uso de estímulos atrativos e ensaios com uso de hospedeiros.

Os bioensaios que não utilizam estímulos atrativos são feitos durante

os primeiros passos dos testes de compostos químicos para verificar se um

composto apresenta repelência para espécie alvo do teste. Ressalta-se que eles

são baratos, de fácil execução, o que permite o teste de inúmeros compostos

químicos e um grande número amostral da população de artrópodes, em curtos

períodos. Estes ensaios se utilizam do comportamento de caminhada dos

16

artrópodes, geralmente em arenas como placas de Petri contendo zonas tratadas

e não tratadas. A repelência, neste caso é deduzida pelo número

significativamente reduzido de artrópodes entrando na zona tratada comparada à

área controle (CARROLL et al., 2004; DAUTEL, 2004; BISSINGER et al., 2009).

Os ensaios com estímulos atrativos utilizam geralmente estímulos

associados ao comportamento de busca pelos hospedeiros (DAUTEL, 2004). Os

ensaios que se utilizam de estímulos anemotáxicos como os olfatômetros em Y,

de quatro vias e em arena, contam com o estímulo dos artrópodes em se

orientarem em função da pluma de vento predominante (FERREIRA, 2001;

VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001). A confirmação da repelência é observada

mediante a escolha, uma vez que um número significativo de artrópodes

escolham o braço controle, ou se afastem da fonte emissora tratada, a repelência

pode ser confirmada (DAUTEL, 2004).

Ensaios com uso de hospedeiros utilizam animais, geralmente de

laboratório, ou mesmo de voluntários humanos. Estes ensaios são realizados

aplicando o repelente sobre a pele ou sobre a roupa de voluntários que serão

submetidos a uma área com pressão de infestação pré-determinada e

comparados com indivíduos não tratados (KUMAR et al., 1992; KUMAR et al.,

1995; BISSINGER et al., 2011). Estes ensaios por trabalharem diretamente com

hospedeiros propiciam um melhor conhecimento e até certa previsão da provável

interação do repelente com os animais. Contudo ao se utilizar animais que não

são hospedeiros naturais, como animais de laboratório, os dados obtidos podem

ser superestimados (DAUTEL, 2004).

2.4. Presença de repelentes naturais em hospedeiros resistentes

Os seres vivos expressam químicos voláteis, que podem ser utilizados

em sua defesa contra o ataque de parasitos (BERENBAUM, 1995; PICKETT et

al., 2010). Normalmente os compostos químicos envolvidos na rejeição química

de hospedeiros por parasitos são aqueles de caráter secundário ao metabolismo

e por isso estão expressos em menor quantidade. Evolutivamente estes

metabolitos secundários podem ser fisiologicamente ativos e provavelmente

foram selecionados durante a co-evolução entre os indivíduos, que se encontram

17

envolvidos em relações de predação ou parasitismo (EISNER & GRANT, 1980;

BERENBAUM, 1995; WELDON, 2010).

O processo de co-evolução é uma construção ativa entre indivíduos,

logo hospedeiros e parasitos interagem e transformam-se mutualmente (PENNA,

1990; BERENBAUM, 1995; MANZ & NEITZ, 2003; GUERENSTEIN & LAZZARI,

2009; WELDON, 2010). Portanto organismos mais susceptíveis são extintos,

deixando apenas resistentes na população de hospedeiros (PENNA, 1990;

BERENBAUM, 1995). Enquanto que os parasitos adaptam tanto sua alimentação

a seus hospedeiros disponíveis (MANZ & NEITZ, 2003), quanto sua percepção

química para seleção e rejeição de hospedeiros que posam acarretar benefícios

ou prejuízos ao seu desenvolvimento (GUERENSTEIN & LAZZARI, 2009;

WELDON, 2010).

Uma diversidade de características inerentes ao indivíduo como

imunocompetência, autolimpeza excessiva, toxicidade e inacessibilidade, podem

levar os compostos químicos emitidos por vertebrados a serem interpretados

como um sinal para a rejeição desses pelo o parasito (WELDON, 2010). Animais

com resistência imune apresentam substâncias no soro, que quando percebidas

por sensilas gustativas inibem o repasto sanguíneo pelo carrapato (WALLADE &

RICE, 1977; FERREIRA, 2013), esses ainda podem expressar algumas

substâncias em sua pele e seus odores participando assim da seleção do

hospedeiro (WALLADE & RICE, 1977; LOULY et al., 2010; WELDON, 2010).

Alguns autores acreditam que a resposta imunológica é menos

acentuada em relações de parasitismo já estabelecidas há muito tempo, como o

R. sanguineus para cães e Dermacentor variabilis para camundongos

(Peromyscus spp.) (SONENSHINE, 1993; RIBEIRO, 1995). O que levou a se

acreditar que cães não teriam a capacidade de desenvolver uma reação imune

eficiente contra infestações de R. sanguineus (SZABÓ, 1991; BECHARA et al.,

1994; FERREIRA & BECHARA, 1995).

No intuito de elucidar os mecanismos de imunidade existentes na

relação de parasitismo e desvendar qual a real competência imune dos cães

frente às infestações por R. sanguineus, os autores SZABÓ (1991), e BECHARA

et al. (1994) e FERREIRA & BECHARA (1995) chegaram a conclusão de que

cães não desenvolvem resistência a esse carrapato. Ainda observaram que em

18

sucessivas infestações sobre cães há um aumento significativo dos parâmetros

biológicos e reprodutivos apresentados pelo R. sanguineus (SZABÓ, 1991).

Bechara et al. (1994) verificaram que cães não apresentaram resistência

significativa em infestações desafios pós-inoculações com extratos de intestino de

carrapato. Tampouco foi observado que a domesticação tem efeito sobre a

susceptibilidade, uma vez que cães do mato Cerdocyon thous (LINNAEUS)

também foram susceptíveis ao R. sanguineus (FERREIRA & BECHARA, 1995).

Segundo SZABÓ (1991), BECHARA et al. (1994) e FERREIRA &

BECHARA (1995) o R. sanguineus é uma espécie extremamente adaptada ao

cão, sendo capaz de burlar seu sistema imune para realizar sua alimentação.

Porém, sabe-se que caracteres que definem a imunidade variam entre espécies,

raças e até indivíduos (PENNA, 1990; WIKEL, 1996; WIKEL, 1999). A

imunocompetência de um indivíduo pode atuar como fator de seleção deste pelo

parasito (WALLADE & RICE, 1977; LOULY et al., 2010; WELDON, 2010;

FERREIRA, 2013), por isso que alguns indivíduos de uma espécie podem ser

rejeitados por parasitos, mesmo que este esteja extremamente adaptado a esta

espécie (PICKETT et al., 2010).

Ao contrário do observado por SZABÓ (1991), BECHARA et al. (1994)

e FERREIRA & BECHARA (1995), outros autores como INOKUMA et al., (1997),

JITTAPALAPONG et al. (2000a), JITAPALAPONG et al. (2000b) e LOULY et al.

(2009) demonstram que a capacidade em adquirir resistência está presente em

cães, porém está intrinsicamente ligada ao fator raça, sendo o cão da raça Beagle

um hospedeiro menos susceptível a infestações por R. sanguineus. Os carrapatos

alimentados nos cães dessa raça, tiveram diminuição de parâmetros reprodutivos

e biológicos. Segundo WIKEL (1996) e WIKEL (1999) a diminuição destes

parâmetros está ligada ao desenvolvimento de imunidade por parte do

hospedeiro.

INOKUMA et al. (1997) conseguiram demonstrar que cães da raça

Beagle eram capazes de adquirir resistência em infestações sucessivas, que

diminuía efetivamente o número de fêmeas ingurgitadas sobre esses pós primeira

infestação. JITTAPALAPONG et al. (2000a) imunizaram cães da mesma raça

com extratos de intestino e de glândulas salivares de carrapatos R. sanguineus e

verificaram que esses apresentaram diminuição de parâmetros biológicos e

19

reprodutivos quando se alimentavam sobre os cães imunizados. Foi ainda

observado por JITTAPALAPONG et al. (2000b) picos de anticorpos pós-

imunização. Os estudos destes dois últimos autores demonstraram que os cães

Beagle não são só capazes de expressar resistência por diminuição dos

parâmetros dos carrapatos que se alimentam nesses, mas também reconhecem

antígenos e respondem com produção de anticorpos contra a infestação de

carrapatos.

LOULY et al. (2009) infestaram, sucessivamente, cães da raça Beagle

e Cocker Spaniel Inglês. Foram realizadas três infestações com intervalos de 15

dias, depois comparados os resultados entre e dentro das raças. Em geral o

desempenho biológico dos carrapatos obtidos das infestações de cães da raça

Cocker foi melhor que de carrapatos obtidos de Beagles. Nos carrapatos

recuperados de Cockers houve maior percentagem de ecdise de larvas e ninfas,

maior número de adultos fixados e ingurgitados (machos e fêmeas) e mais alto

desempenho reprodutivo das fêmeas (conversão do peso corporal em ovos e

maior taxa de eclodibilidade). O período de ingurgitamento, número de ninfas

ingurgitadas e peso das fêmeas não diferiram muito entre as raças, mas mais

larvas se fixaram e ingurgitaram nos Beagles. Nas duas raças, um efeito das

infestações sucessivas no número de larvas e ninfas ingurgitadas foi observado,

os quais demonstram desenvolvimento de uma resposta imune para estes dois

estágios. Entretanto, a conversão do peso corporal em ovos e a percentagem de

ecdise só foram afetadas nos carrapatos alimentados nos cães da raça Beagle.

Baseado no que foi apresentado, pôde ser concluído que animais da raça Cocker

Inglês são mais susceptíveis ao R. sanguineus do que os cães da raça Beagle e

que infestações sucessivas afetam o desenvolvimento do carrapato,

principalmente nos animais resistentes.

LOULY (2010) investigaram o envolvimento de quimiorrecepção na

escolha entre cães susceptíveis (Cocker Spaniel Inglês) e resistentes (Beagle).

Para tanto foi avaliada a escolha dos carrapatos pelos hospedeiros durante

infestações, o arrestamento dos carrapatos em flanelas com odor das duas raças,

além da resposta em olfatômetro perante o estímulo do odor das duas raças.

Durante as duas primeiras infestações foi recuperado um número significativo

maior de larvas em Cockers do que em Beagles, mas não houve diferença entre

20

os grupos na terceira. O número de ninfas colhido em Cockers foi

significativamente maior do que nos Beagles, nas três infestações. O número total

de adultos foi significativamente maior em Cockers do que em Beagles, nas três

infestações. Nos testes comportamentais com substâncias colhidas da pele das

duas raças, após 1 hora de exposição os carrapatos já se arrestaram sobre as

flanelas, sendo significativamente maior em flanelas de Cockers do que de

Beagles. Após 18 e 24 horas houve um incremento no número de carrapatos

arrestados nas substâncias colhidas de Cockers e de Beagles, mas a flanela com

substâncias de Cockers continha significativamente mais carrapatos arrestados.

Os resultados obtidos no teste de olfatometria com odores colhidos das duas

raças, indicaram uma repelência pelo odor de Beagles para adultos de R.

sanguineus.

A escolha de hospedeiros por ectoparasitos é essencial para a sua

sobrevivência, uma vez que permite a esses driblar efeitos deletérios ocasionados

ao se alimentarem em indivíduos resistentes (LOULY et al., 2010; WELDON,

2010), como a diminuição de parâmetros biológicos e reprodutivos apresentados

por carrapatos que se alimentam em cães resistentes (INOKUMA et al., 1997;

JITAPALAPONG et al., 2000a; LOULY et al., 2009). Sendo assim, os compostos

químicos emitidos por hospedeiros que apresentem resistência imune a

infestações por ectoparasitos podem ser utilizados como repelentes naturais

(WELDON, 2010). Não obstante a isso WALLADE & RICE (1977) sugerem que

animais resistentes apresentam substâncias químicas tanto no soro quanto na

pele, que quando detectados por carrapatos inibem a realização do repasto

sanguíneo por esses.

Os resultados de LOULY et al. (2010) demonstraram que carrapatos R.

sanguineus apresentavam certa repelência a odores de Beagles em testes de

olfatômetro, também predileção ao arrestamento em odores de Cockers e ainda

se alimentarem nesses animais em contraposição aos Beagles. Estes resultados

corroboram com a teoria de PICKETT et al. (2010) de que animais hospedeiros

sobre certas condições produzem químicos voláteis que atuam na diminuição das

taxas de parasitismo e podem ser utilizados como repelentes naturais.

Posteriormente aos trabalhos de LOULY et al. (2009) e LOULY et al.

(2010), BORGES et al. (2011) com o uso de cromatografia gasosa de alta

21

resolução, observaram que os odores de de cães da raça Beagle continham um

maior número de químicos voláteis do que os obtidos de Cockers. Nos

cromatogramas de cães da raça Beagle foram observados cinco compostos que

não foram observados em cramatogramas de cães da raça Cocker Inglês sendo

estes identificados como 2-hexanona, benzaldeído, nonano, decano e undecano.

22

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

O objetivo geral deste trabalho foi estudar a repelência de compostos

químicos naturais obtidos do odor de cães da raça Beagle contra o carrapato R.

sanguineus. Objetivou-se ainda, avaliar a repelência de β-Citronelol um repelente

testado pela primeira vez para esta espécie de carrapato, com comparação de

dados com DEET, um repelente padrão ouro.

3.2. Objetivos específicos - Avaliação da repelência, por meio dos ensaios comportamentais da placa de

Petri e do olfatômetro em Y sobre R. sanguineus:

- De compostos químicos identificados no odor de cães da raça Beagle

(benzaldeído, 2-hexanona, nonano, decano e undecano) (BORGES et al.,

2011).

- De duas misturas de compostos químicos identificados no odor de cães

da raça Beagle: benzaldeído e 2-hexanona (1:1), benzaldeído, 2-hexaona e

undecano (1:1:1).

- De compostos sintéticos DEET e β-citronelol.

- Comparação da repelência para os compostos acima mencionados.

23

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local e duração do experimento

O estudo foi realizado no período de agosto de 2012 a setembro de

2013 no Centro de Parasitologia Veterinária, Escola de Veterinária e Zootecnia,

Universidade Federal de Goiás (CPV/EVZ/UFG). Os experimentos foram

conduzidos em ambiente climatizado (T = 28ºC; UR = 70%).

4.2. Obtenção de carrapatos adultos não alimentados

Foram colhidas fêmeas ingurgitadas de cães, naturalmente infestados,

e levadas ao laboratório. As fêmeas foram fixadas com fita dupla-face em placas

de Petri de 10 cm de diâmetro, em decúbito dorsal, e armazenadas em estufa B.

O. D (T= 27° C, UR > 80%), onde permaneceram por 30 dias para realização da

postura. Os ovos foram removidos das placas de Petri e armazenados em

seringas plásticas, com o tampo removido e fechadas com algodão, por 30 dias,

para a eclosão das larvas. Coelhos (Oryctolagus cuniculus) foram utilizados para

as infestações, larvas de cinco dias eram postas nesses, nos quais

permaneceram se alimentando por quatro dias, quando foram então retiradas e

armazenadas na estufa novamente em seringas plásticas nas mesmas condições

anteriores por sete a dez dias, para a muda para ninfas. Posteriormente outros

coelhos eram infestados com ninfas de cinco dias, essas permaneceram se

alimentando por cinco dias. As ninfas então eram retiradas e armazenadas na

estufa novamente em seringas plásticas nas mesmas condições anteriores por 11

a 15 dias, para a muda para adultos. Os adultos não alimentados a partir de sete

dias eram separados por sexo e testados, até idade máxima de 21 dias (LOULY

et al., 2010).

24

4.3. Substâncias testadas

Foram selecionados cinco compostos químicos exclusivamente

presentes no odor de Beagle, sendo três deles majoritários (nonano decano e

undecano), além de dois minoritários, benzaldeido e 2-hexanona. Os

hidrocarbonetos nonano, decano e undecano foram selecionados para os testes

comportamentais uma vez que se apresentaram em grandes quantidades nos

cromatogramas de cães da raça Beagle (BORGES et al., 2011). A 2-hexanona foi

selecionada, apesar de em menor quantidade nos cromatogramas, pois existem

inúmeros trabalhos que sugerem o papel de repelentes de compostos

pertencentes ao grupo das cetonas como a octalactona e metilcetona (GIKONYO

et al., 2002; GIKONYO et al., 2003). E também foi selecionado o benzaldeído

composto que foi identificado em menor quantidade, apesar disso em trabalho

realizado por OLIVEIRA et al. (2008) este composto químico foi identificado como

um dos compostos majoritários presentes nos odores de cães portadores de

leishmaniose.

Além dos compostos químicos identificados nos odores de cães da

raça Beagles, dois compostos químicos repelentes sintéticos, DEET repelente

padrão ouro e o β-citronelol foram selecionados para os testes.

Todos os compostos químicos utilizados nos testes foram obtidos junto

à empresa Sigma Aldrich:

- DEET (N,N-Diethyl-3-methylbenzamide, Fluka, C12H17NO, 97% pureza, lote

MKBH0428V).

- β-citronelol (ReagentPlus, C10H20O, 95% pureza, lote MKBF5458V).

- Benzaldeído (ReagentPlus, C6H5CHO, 99% pureza, lotes MKBL2043V,

MKBF4834V).

- 2-hexanona (Sulpelco Analytcal, butil-methil-ketona, C6H12O, 99,9% pureza,

lotes LB85836V, LB94241V).

- Nonano (Sulpelco Analytcal n-Nonano, CH3(CH2)7CH3, 99,9% pureza, lotes

LB89241V, LB96990V).

- Decano (Sulpelco Analytcal n-Decano, C10H22, 99,9% pureza, lote LB85358V).

- Undecano (ReagentPlus, C11H24, 99% pureza, lote MKBH8310V).

25

Além dos compostos testados isoladamente foram testadas duas

misturas. Na primeira mistura foram testados os compostos 2-hexanona e

benzaldeído na proporção de 1:1. Na segunda mistura além de 2-hexanona e

benzaldeído foi acrescentado o undecano, a proporção utilizada nesta mistura foi

de 1:1:1.

Até a utilização nos testes os compostos químicos foram mantidos em

temperatura ambiente. O DEET e o β-citronelol foram diluídos em álcool etílico

(99,5%), enquanto 2-hexanona, benzaldeído, nonano, decano, undecano e as

duas misturas foram diluídas em hexano (99,5%). A concentração empregada

para a formulação das diluições partiu de uma solução a 7,2%, concentração

muito próxima das formulações com menor concentração de DEET disponíveis no

mercado. A partir desta concentração 7,2% (≈0,200 mg/cm², considerando um

volume de 2,75 µl/cm2) foram obtidas outras duas mais diluídas (0,100 e 0,050).

As três concentrações foram usadas no ensaio da placa de Petri, enquanto no

ensaio no olfatômetro em Y foram utilizadas apenas as duas maiores.

4.4. Ensaios de repelência

Foram realizados dois bioensaios para avaliação do comportamento

dos carrapatos R. sanguineus aos compostos químicos em teste. O ensaio de

escolha ou da placa de Petri (BISSINGER et al., 2009), e o ensaio no olfatômetro

em Y segundo metodologia descrita por LOULY et al. (2010).

4.4.1. Ensaio de escolha (placa de Petri)

Foram utilizadas placas de Petri de 63,6 cm² de área, contendo dois

semicírculos de 31,8 cm² de papel filtro (Whatman qualitative cat nº 1001- 90mm)

sendo um tratado e outro controle (sem tratamento) (Figura. 1 A). Após o

tratamento de um dos lados com 87 μl (2,75 μl/cm²) do composto em teste e do

outro com a mesma quantidade de solvente, os papeis filtro foram secos por 10

min, em capela fechada (Permution) para evaporação do solvente. Os carrapatos

foram colocados no centro da placa em grupos de seis, sendo três machos e três

26

fêmeas. A posição em que estavam após cinco, dez e 30 min (Figura. 1 B, C, D)

após o início do teste foi então avaliada.

Os ensaios foram procedidos em total escuridão (exceto durante

pequenos intervalos de aproximadamente cinco segundos que eram usados para

avaliar a posição dos carrapatos nas placas). Cada placa com composto químico

em teste tinha uma correspondente, sem tratamento em ambos os lados, usada

como controle para avaliar o comportamento dos carrapatos nas condições

experimentais (Figura. 1 D).

FIG 1. Bioensaio da Placa de Petri; A: placas de Petri de 63,6 cm² de área com

papel filtro dividido em dois semicírculos de 31,8 cm²; B, C e D: Avaliação aos

cinco, dez e 30 min; D: Placa com tratamento e placa sem tratamento (controle).

Fonte: Arquivo pessoal, 2012.

Foi ainda avaliada a possível interferência dos solventes no padrão de

repelência, sendo que neste caso a metade do papel filtro foi tratada com 87 μl de

solvente enquanto a outra metade não recebeu nenhum tratamento, então o teste

foi desenvolvido normalmente. Para cada composto e misturas avaliadas foram

feitas dez repetições em cada concentração.

27

4.4.2. Ensaio no olfatômetro em Y Para os testes de olfatometria foi utilizado um olfatômetro em Y, de

acrílico, com 36 cm total de comprimento, sendo 13 cm para cada braço e 18 cm

para o corpo e 6 cm de diâmetro (FIG. 2). Cada abertura dos braços foi conectada

com uma mangueira de silicone de 1 cm de diâmetro a dois kitasatos de 50 ml.

Um dos kitasatos foi preenchido com água destilada enquanto o outro serviu para

a liberação do odor. A evaporação da água presente nos kitasatos cria uma

atmosfera de alta umidade no interior do olfatômetro o que auxilia a percepção

dos químicos por parte dos artrópodes em teste. No fim da conexão do último

kitasato de cada lado havia um fluxômetro regulado em 100 ml/min (Parker-P3A)

e um filtro de carvão ativado (Fluka-Sigma Aldrich). O fluxo de ar foi gerado por

um compressor (Diapump/Fanem), conectado a abertura do corpo do olfatômetro

por uma mangueira de silicone, com comprimento de 2 m e 1 cm de diâmetro.

FIG 2. Olfatômetro em Y; A: Braços; B: Haste.

Fonte: Arquivo pessoal, 2012.

Papeis filtro Whatman qualitative (cat nº 1001-110mm) foram

recortados em 1x4 cm para utilização neste ensaio. Cada papel foi tratado com 11

µl (2,75 µl/cm²) de composto em teste ou solvente (controle). Após o tratamento

dos papéis, estes foram secos em capela fechada (Permution) por 1 min, então

colocados nos kitasatos de liberação de odor, um para cada braço do olfatômetro.

28

Os ensaios foram feitos testando um composto químico candidato a

repelente contra o controle. Os carrapatos foram colocados individualmente, no

corpo do olfatômetro, em seguida, foram observados entre dez segundos e 1 min

para registro do braço de escolha. Os carrapatos que não optaram ou não

caminharam na haste neste intervalo foram retirados e reintroduzidos, com o

máximo de três tentativas por indivíduo.

Também durante este ensaio foram avaliados os solventes hexano,

acetona e álcool etílico. Foram utilizados 15 carrapatos machos e 15 fêmeas para

cada composto em cada concentração. Durante os ensaios o olfatômetro foi

frequentemente limpo com álcool etílico (99,5%), no intervalo de três testes.

Também houve sempre a inversão entre braço tratado e controle no mesmo

intervalo em que eram feitas as limpezas com álcool etílico.

4.4 ANÁLISE ESTATÍSCA

A comparação do número de carrapatos, nas duas áreas (tratada e

controle), nos dois bioensaios, foi feita com auxílio do teste do qui-quadrado (2).

Quando maior proporção, estatisticamente significativa, de carrapatos foi

observada na área sem tratamento, o composto foi considerado repelente. O teste

t de Student foi realizado para comparar a repelência provocada pelos compostos

com o repelente padrão DEET. Em ambos os testes foi considerado um nível de

significância de P<0,05. Para o teste de t foram utilizados apenas os dados

obtidos no ensaio da placa de Petri.

29

5. RESULTADOS

5.1 Placa de Petri

Nos testes feitos com o DEET, 86,67% a 68,33% (2= 32,267, p=1,3e-

08; 2=8,067 p=0.0045) dos carrapatos, nas concentrações de 0,200 e 0,100

mg/cm² ficaram nas áreas não tratadas. Na concentração de 0,050 mg/cm² os

carrapatos se distribuíram similarmente (sem diferença significativa) em ambas as

áreas (Tabela 1).

O β-citronelol foi o único composto testado que manteve percentuais

significativos de carrapatos nas áreas não tratadas em todos os três tempos e

concentrações avaliadas neste ensaio. Foi observado maior percentual (93,33)

(2=45,06, p=1,90e -11) aos 30 minutos e aos cinco minutos, nas concentrações de

0,200 e 0,100 mg/cm², sendo estes percentuais os maiores encontrados neste

teste. Quando comparado com o DEET o β-citronelol foi mais eficiente em repelir

os adultos de R. sanguineus, só se mostrando estatisticamente semelhante a este

repelente na maior concentração, nos três intervalos de tempos avaliados (Tabela

1).

Para o benzaldeido, aos 30 minutos, na concentração de 0,200 mg/cm²

foi observado um percentual de 63,33% (2=4,267; p=0.038) de carrapatos na

área não tratada, no entanto o DEET demonstrou um percentual estatisticamente

maior (p=0,013), neste mesmo tempo e concentração. Percentual de 76,67

(2=9,73, p=0,0018) foi observado aos cinco minutos, na concentração de 0,050

mg/cm², enquanto o DEET não apresentou percentuais significativos neste

momento em suas áreas não tratada (Tabela 1).

No teste com a 2-hexanona foi observado um percentual de 68,33%

(2=8,067, p=0,0045) de carrapatos na área não tratada, aos 30 minutos, na

concentração de 0,200 mg/cm², sendo estatisticamente semelhante ao percentual

apresentado pelo DEET no mesmo tempo e concentração avaliados (p= 0,089).

Também aos dez minutos, na concentração de 0,100 mg/cm², foi observado o

mesmo percentual e houve ainda semelhança estatística quando comparado com

DEET (p= 0,059). Aos 30 minutos, na concentração de 0,050 mg/cm², um

percentual de 63,33 (2=4,267; p=0,038) carrapatos foi observado na área não

30

tratada, enquanto o DEET não apresentou percentuais significativos em nenhuma

das áreas (Tabela 1).

Para o undecano foi observado um percentual de 65,00 (2=5,4,

p=0,02) de carrapatos na área não tratada em apenas um momento dos testes,

na maior concentração, durante os primeiros cinco minutos de avaliação. Porém,

este percentual foi estatisticamente menor do que obtido com o DEET (p = 0,029).

(Tabela 1).

Nonano ou decano não causaram qualquer repelência para os

carrapatos testados, em qualquer uma das concentrações ou intervalos de tempo

avaliados. O maior percentual apresentado foi 61,67 nas áreas não tratadas, na

concentração de 0,100 mg/cm² aos cinco minutos, e na concentração de 0,200

mg/cm² aos dez minutos, para o nonano e decano respectivamente. E o menor

percentual nas áreas não tratadas foi de 40,00, aos dez minutos, na concentração

de 0,050 mg/cm² para decano, e de 38,33 na concentração 0,100 mg/cm² aos 10

minutos para nonano.


R. sanguineus para o DEET, β-citronelol e compostos químicos encontrados no

odor de cães da raça Beagle.

Conc

mg/cm²

Tempo

min

% Repelência

DEET β-citronelol benzaldeído 2-

hexanona

undecano

0,200 5 83,33* 91,67*# 56,67 46,67 65,00*

10 86,67* 90,00*# 55,00 50,00 53,33

30 81,67* 93,33*# 63,33* 68,33*# 55,00

0,100 5 78,33* 93,33* 56,67 60,00 43,33

10 73,33* 90,00* 55,00 68,33*# 51,67

30 68,33* 90,00* 58,33 58,33 45,00

0,050 5 60,00 73,33* 76,66* 56,67 58,33

10 61,66 73,33* 61,66 46,67 58,33

30 58,33 78,33* 56,66 63,33* 43,33

31

* indica diferença estatisticamente significativa entre área tratada e não tratada, demonstrando preferencia significativa

para área não tratada, pelo teste de 2 (p< 0,05)

# indica semelhança estática com os resultados obtidos nos testes com o DEET, pelo teste de t (p< 0,05)

Para a mistura benzaldeido + 2-hexanona foram observados

percentuais significativos de carrapatos nas áreas não tratadas, nas três maiores

concentrações, em quase todos os tempos avaliados. Estes percentuais variaram

de 76,67 a 63,33 % (2=17,06, p=0,000036; 2=4,26, p=0,038), com exceção da

avaliação aos 30 minutos nas concentrações de 0,100 e 0,050 mg/cm², quando

não se observou percentual significativo de carrapatos na área não tratada

(Tabela 2). Durante todo o teste esta mistura mostrou semelhança estatística

quando comparada com o DEET (P<0,05).

Para a mistura entre benzaldeido, 2-bexanona e undecano (1:1:1)

foram observados percentuais significativos de carrapatos nas áreas não

tratadas, nas três maiores concentrações, variando entre 73,33 e 65,00%

(2=13,06, p=0,0003; 2=5,4, p=0,02). Porém, aos cinco minutos na concentração

de 0,100 mg/cm² e aos 10 minutos na concentração de 0,050 mg/cm² não foram

observados percentuais significativos de carrapatos na área não tratada (Tabela

2). Esta mistura foi semelhante estatisticamente ao DEET apenas aos cinco

minutos na maior concentração (p = 0,51) e aos dez e 30 minutos na

concentração de 0,100 mg/cm² (p= 0,56, p= 0,47).

32


R. sanguineus para as misturas de benzaldeído e 2-hexanona (1:1) e

benzaldeído, 2-hexanona e undecano.



# indica semelhança estatística com os resultados obtidos nos testes com o DEET, pelo teste de t (p< 0,05)

Nenhum dos solventes aqui testados foi repelente. Portanto, a

repelência observada nos produtos testados não foi ocasionada pelo solvente

utilizado. Para o álcool foi observado um percentual de carrapatos na área não

tratada entre 56,67 e 46,67%, para a acetona esta taxa foi de 60,00 a 46,67%,

enquanto que para o hexano foi entre 53,33 e 45,00%. Em todos os testes e

tempos avaliados nas placas controle, que não continham nenhum tipo de

tratamento ou solvente, foi observado que as os carrapatos também se

distribuíram de forma homogênea sem diferença estatística entre os dois lados da

placa.

Conc

mg/cm²

Tempo

min

% Repelência

Benzaldeído + 2-hexanona

(1:1)

Benzaldeído + 2-hexanona +

undecano (1:1:1)

0,200 5 76,66*# 71,67*#

10 70,00*# 68,33*

30 73,33*# 65,00*

0,100 5 71,67*# 61,67

10 75,00*# 68,33*#

30 60,00 73,33*#

0,050 5 63,33* 65,00*

10 70,00* 46,67

30 58,33 65,00*

33

5.2. Olfatômetro em Y

Nos testes no olfatômetro em Y foram confirmados os principais

resultados encontrados durante o bioensaio da placa de Petri. Percentuais de

83,33 (2=13,33, p=0,0002), 83,33 (2=13,33, p=0,0002) e 73,33 (2=6,5,

p=0,010) de carrapatos foram observados nos braços não tratados para o DEET,

β-citronelol e a mistura entre benzaldeido e 2-hexanona respectivamente, na

concentração de 0,200 mg/cm². Nenhum dos outros compostos químicos testados

apresentou percentuais significativos nesta concentração. Na concentração de

0,100 mg/cm² nenhum dos compostos químicos foi repelente (Tabela 3).

Tabela 3 – Percentagem de repelência em teste do olfatômetro em Y de adultos

de Rhipicephalus sanguineus para o DEET, β-citronelol e compostos químicos

encontrados no odor de cães da raça Beagle, em duas diferentes concentrações.

Compostos Químicos % Repelência

0,200mg/cm² 0,100mg/cm²

DEET 83,33* 46,67

β-citronelol 83,33* 50,00

Benzaldeido+2-

Hexanona

73,33* 56,66

Benzaldeido+2-

Hexanona+Undecano

66,67 50,00

2-Hexanona 63,33 56,66

Benzaldeido 66,67 50,00

Undecano 53,33 66,67

Decano 53,33 66,67

Nonano 53,33 62,22



Durante os testes no olfatômetro em Y os solventes testados não

causaram percentuais significativos de carrapatos caminhando em direção ao

braço não tratado e portanto não foram repelentes.

34

6. DISCUSSÃO

Neste estudo ficou demonstrado que cães da raça Beagle produzem

repelentes naturais contra o carrapato R. sanguineus. Dos cinco compostos

testados, três deles benzaldeído, 2-hexanona e undecano, causaram,

isoladamente, certo grau de repelência. No entanto, repelência semelhante e

consistente à do repelente padrão ouro, DEET, foi observada quando os

compostos foram associados. Até o que se sabe, este é o primeiro estudo

demonstrando a presença de repelentes naturais mediando o comportamento de

carrapatos em animais resistentes.

Cães da raça Beagle são hospedeiros menos susceptíveis a

infestações por carrapatos R. sanguineus pois são capazes de apresentar certos

padrões de resistência (INOKUMA et al., 1997; LOULY et al., 2009). Sabe-se que

estes ainda têm a capacidade de apresentar reação imune mediada por

anticorpos (JITAPALAPONG et al., 2000a; JITAPALAPONG et al., 2000b). Desta

forma, pode-se inferir que a emissão destes químicos voláteis por cães da raça

Beagle está ligada à sua capacidade imune contra o carrapato assim como o

sugerido por WELDON (2010). Sendo assim os carrapatos teriam a capacidade

de selecionar os indivíduos devido a suas características de susceptibilidade que

poderiam estar associadas ao odor destes animais. Isto faz que estes compostos

químicos sejam extremamente eficientes em sua proposta de atuar como

repelentes para a espécie alvo.

Sabe-se que em estados anômalos como aqueles causados por

doenças infecciosas ou parasitárias, a homeostase do indivíduo é alterada,

levando o organismo a emitir compostos químicos voláteis divergentes dos

habituais (PENN et al., 1998; PENN & POTTS, 1998; OLIVEIRA et al., 2008;

MESCHER & MORAES, 2013). Estes compostos podem ter papel importante na

identificação e seleção de hospedeiros pelos parasitos (OLIVEIRA et al., 2008;

MESCHER & MORAES, 2013). Desta forma, hipotetiza-se que, uma vez que uma

reação imune exacerbe as funções de homeostase do indivíduo, esta também

poderia levar a uma produção de químicos voláteis divergentes e assim a

alteração do odor ‘natural’ do animal. Recentemente MESCHER & MORAES

(2013) demonstraram que hemoparasitos são capazes de alterar o odor de seus

35

hospedeiros causando atração de vetores para hospedeiros infectados. Por outro

lado, a maior quantidade de voláteis no odor de cães Beagles devido à resistência

apresentada por estes seria responsável pelo menor parasitismo observado

nestes animais (LOULY et al., 2009).

Em outros modelos parasito e hospedeiro resistentes, a presença de

repelentes naturais já foi identificada. Na África Subsaariana, a mosca tsetsé

(Glossina morsitans) é um dos vetores cíclicos da tripanossomíase, uma zoonose

de alta prevalência no continente. Repelentes para o controle desta mosca foram

identificados em uma mistura de voláteis de animais não preferências, o antílope

(Kobus defassa), os quais são comuns nos habitats deste díptero, mas não são

parasitados por estes (GIKONYO et al., 2003). A mistura contendo 2-metoxi-

4metilfenol, um repelente sintético contra esta mosca, e cinco constituintes do

odor de K. defassa foi avaliada em testes de larga escala. A despeito do protótipo

usado para liberação dos repelentes, estes compostos providenciaram um

controle substancial da proteção de bovinos contra a tripanossomíase, com

redução de >90% da incidência da doença (SAINI et al., 2013).

Durante a análise cromatográfica realizada por BORGES et al. (2011)

undecano, decano e nonano foram os compostos que se apresentaram

majoritariamente nos cromatogramas de Beagles, porém, destes três apenas o

undecano causou certo grau de repelência nos testes. Os compostos 2-hexanona

e benzaldeído foram observados em menores quantidades, no entanto estes dois

compostos foram responsáveis pelos mais altos graus de repelência quando os

cinco compostos foram analisados isoladamente. Ainda quando combinados em

proporções iguais demonstraram repelência semelhante à causada pelo DEET.

Apesar de animais, serem capazes de produzir e emitir compostos químicos em

grande quantidade, em geral são aqueles encontrados em menor quantidade que

provocam o comportamento de repelência nos artrópodes parasitos (EISNER &

GRANT, 1980; BERENBAUM, 1995). Normalmente os compostos envolvidos na

rejeição química de hospedeiros por parasitos são aqueles de caráter secundário

ao metabolismo e por isso estão expressos em menor quantidade.

Evolutivamente, estes metabólitos secundários podem ser fisiologicamente ativos

e provavelmente foram selecionados durante a co-evolução entre os indivíduos

(EISNER & GRANT, 1980; BERENBAUM, 1995; WELDON, 2010).

36

Isoladamente o benzaldeído e a 2-hexanona apresentaram baixo grau

de repelência, mas quando associados, a repelência se igualou estatisticamente

com a observada nos testes com o DEET. Sabe-se que, na maioria das vezes,

um composto químico não é capaz de desencadear uma resposta

comportamental completa de forma isolada, havendo assim uma associação entre

estes compostos presentes nos odores dos hospedeiros (KENNEDY, 1977;

WELDON, 2010). Porém, destaca-se que o acréscimo de undecano a esta

mistura não acarretou em incremento da repelência, havendo ainda um

decréscimo desta que pode ser observado durante os testes de olfatometria. Em

hospedeiros resistentes e susceptíveis ocorre naturalmente a associação de

compostos químicos (PICKETT et al., 2010), isto pode acarretar a ocultação ou

ampliação de demais compostos químicos que atuam como sinais para parasitos.

Desta forma, a combinação e também as proporções de compostos químicos em

cada hospedeiro pode atuar de forma sinérgica ou antagônica para o parasito

(KENNEDY, 1977; EISNER & GRANT, 1980; WELDON, 2010). Na mistura dos

três compostos químicos (benzaldeído, 2-hexanona e undecano) as quantidades

de benzaldeído e 2-hexanona usadas foram menores do que quando estes foram

testados em conjunto, o que pode explicar o decréscimo da repelência observado.

Apesar de este estudo apontar repelência principalmente para os

compostos benzaldeído e 2-hexanona, na literatura pode-se encontrar estudos da

associação destes dois compostos químicos com a atratividade de outros

parasitos hematófagos como Lutzomia longipalpis (DOUGHERTY et al., 1999;

OLIVEIRA et al., 2008). Na verdade esta divergência entre resultados corrobora

com teorias de que os ectoparasitas adaptam a sua percepção a seu hospedeiro,

além de que cada organismo responde a um estímulo químico de sua própria

maneira (BERENBAUM, 1995; EISNER & MEINWALD, 1995; GUERENSTEIN &

LAZZARI, 2009; WELDON, 2010).

Observa-se essa variação de comportamento em outros compostos

químicos do grupo dos aldeídos assim como o benzaldeído. Por exemplo, o

nonanal que atua como um atraente para triatomíneos (GUERENSTEIN &

LAZZARI, 2009), é um repelente para mosquitos A. aegypti (LOGAN et al., 2008).

Também são inúmeros os estudos associando a presença de cetonas com o odor

de hospedeiros vertebrados (DOUGHERTY et al., 1999; GIKONYO et al., 2002;

37

GIKONYO et al., 2003; LOGAN & BIRKETT, 2007; OLIVEIRA et al., 2008;

PALUCH et al., 2010). Talvez por isso existam tantos compostos nesta classe

química associados a atração de parasitos hematófagos. As cetonas 4-hidroxi-4-

metil-2-pentanona, 4-metil-2-pentanona e a própria 2-hexanona atraem L.

longipalpis (DOUGHERTY et al., 1999). O papel repelente destes compostos

também já foi demonstrado no modelo citado anteriormente, entre G. morsitans e

K. defassa, onde as cetonas metil-cetona e octalactona foram responsáveis por

inibirem o parasitismo de moscas no hospedeiro (GIKONYO et al., 2002;

GIKONYO et al., 2003).

Não foram encontrados na literatura, estudos avaliando a resposta

comportamental de artrópodes hematófagos para os hidrocarbonetos nonano,

decano e undecano. Porém, sabe-se que o undecano tem atividade biológica

comprovada sobre insetos (REGINER & WILSON, 1969; LENZ et al., 2012). Este

químico é constituinte majoritário das secreções das glândulas da formiga Lasius

alienus e Formica argentea, exercendo papel de feromônio de alarme para estas

espécies (REGINER & WILSON, 1969; LENZ et al., 2012).

Os dois testes avaliam respostas a diferentes estímulos, olfatômetro

estímulos anemotáxicos e placa de Petri, contato. Sendo assim a placa de Petri é

um teste que avalia o gradiente de concentração criado pelo composto químico no

interior da arena, sendo ideal para se avaliar estímulos deterrentes, repelentes

que atuem por contato (FERREIRA, 2001; McMAHON et al., 2003). Enquanto que

no olfatômetro, os artrópodes que se guiam por estímulos anemotáxicos

caminham deliberadamente exercendo sua escolha instantaneamente na

bifurcação da arena, e a escolha só poderá ser diretamente influenciada pela

presença de compostos químicos que atuem na fase de vapor, ou seja,

carregados com facilidade pela pluma de vento sem que sua informação se perca

(FERREIRA, 2001; VILELLA & DELLA LÚCIA, 2001; McMAHON et al., 2003).

Sendo assim, o encontro de resultados semelhantes nos dois ensaios indicam,

com certeza, que os compostos isolados de Beagle foram repelentes, pois

atuaram na fase de vapor. Vale ressaltar que o percentual de repelência

observado no olfatômetro em Y para a mistura 2-hexanona e benzaldeido foi

praticamente igual ao observado por LOULY et al. (2010) quando testando o odor

de Beagle.

38

As diferenças observadas entre um teste e outro, como não ter

encontrado repelência para nenhum composto na concentração de 0,100mg/cm²

no teste do olfatômetro pode ser atribuída a diferença do tempo de realização

entre os dois testes. Na placa os carrapatos permaneciam em contato com as

substâncias químicas por até 30 minutos, no olfatômetro a escolha dos indivíduos

era instantânea (1 minuto, ou menos).

Neste estudo, o DEET foi capaz de repelir adultos de R. sanguineus

nas concentrações de 0,200 e 0,100 mg/cm². SOARES et al (2010) observaram

repelência de 95% de ninfas de A. cajennense por uma solução de DEET a 7,2%

(0,200 mg/cm2), por até cinco horas. CARROL et al. (2005) observaram taxas de

repelência próximos aos deste estudo contra o carrapato A. americanum e I.

scapularis com concentrações pouco superiores (0,927 mg/cm²). Também

FRADIN & DAY (2002) demonstraram que formulações comerciais contendo

6,75%, concentração próxima à utilizada neste estudo, são capazes de conferir

120 minutos, em média, de proteção total contra mosquitos A. aegypti.

Na literatura foi encontrado apenas um estudo avaliando o papel do

DEET como repelente para R. sanguineus. KUMAR et al. (1992) observaram

taxas de repelência significativas contra este carrapato, em coelhos tratados com

0,3 ml de várias soluções de DEET. Foi obtido taxa >90% de repelência contra

larvas, até 15 dias após o tratamento, com concentrações de 25%. Taxa >90% foi

observada contra ninfas, até sete dias após o tratamento, na concentração de

25%. Enquanto à 25% o DEET só foi capaz de atingir taxa de repelência >90%,

por até cinco dias para carrapatos adultos. Na solução de 30% ele repeliu >90%

de carrapatos adultos por até nove dias pós-tratamento. Houve um efeito platô,

sendo que nas soluções de DEET a 35 e 40% taxa de repelência >90% de

carrapatos adultos foi mantida também por nove dias. Como observado o R .

sanguineus apresenta maior sensibilidade em estágios imaturos como larvas e

ninfas. Para adultos, a medida que a concentração aumenta, há um incremento

na repelência, até que se atinja o efeito platô.

Existem diferenças tanto na sensibilidade ao DEET entre as diferentes

classes, ordens, gêneros e famílias de artrópodes, quanto no tipo de respostas

observadas. Exemplo disso são as diferenças das respostas observadas em

carrapatos do gênero Amblyomma. Enquanto que carrapatos A. cajennense são

39

fortemente repelidos por este composto químico (SOARES et al., 2010), A.

americanum e A. variegatum não foram repelidos (MAcMAHON et al., 2003;

CARROL et al., 2004). E ainda, para se alcançar taxas de repelências para A.

hebraeum comparáveis às taxas de repelências observadas em A. cajennense,

são necessárias mais que dez vezes a concentração utilizada em ensaios com A.

cajennense (JESENIEUS et al., 2005; SOARES et al., 2010). Também para A.

cajennense foi observado o efeito knockdown pós-tratamento, o que demonstra a

extrema sensibilidade desse carrapato ao composto (SOARES et al., 2010). Este

mesmo efeito também foi observado após aplicações tópicas em A. aegypti na

dosagem de 0,94 μg/mg, em Anopheles quadrimaculatus na dosagem de 0,40

μg/mg, A. albimanus na dosagem de 0,22 μg/mg e em Culex quinquefasciatus na

dosagem de 0,64 μg/mg (PRIDGEON et al., 2009).

Diante do exposto acima, conclui-se que o R. sanguineus não parece

ser um carrapato extremamente sensível ao DEET como o A. cajennense, mas

também não demonstra insensibilidade para esse composto assim como A.

hebraeum e A. americanum. Novos estudos são recomendáveis para se avaliar

“in vivo” o papel do DEET como repelente de R. sanguineus para cães e até

mesmo em humanos, com uso dos três estágios, uma vez que estes demonstram

variação de sua sensibilidade a este composto químico.

Dentre os compostos químicos aqui testados, o β-citronelol foi o mais

eficiente, sendo capaz de repelir um número significativo de carrapatos, em todas

as concentrações, no teste da placa, e ainda apresentou a mesma taxa de

repelência que o DEET, no teste do olfatômetro. Resultados semelhantes foram

obtidos por TUNÓN et al. (2006) que observaram repelência significativa do β-

citronelol, porém em uma concentração mais alta (10%) sobre ninfas de

carrapatos I. ricinus, em testes de placa de Petri, por até oito horas. Este

composto não foi efetivo em repelir mosquitos A. aegytpi, em testes com

voluntários (TUNÓN et al., 2006). Ressalta-se que diferentemente do estudo

realizado por estes autores, no presente trabalho foram utilizadas concentrações

menores que 10% e ainda não foi avaliada a repelência em um estágio

normalmente menos sensíveis aos repelentes, os adultos. Portanto, infere-se que

os carrapatos R. sanguineus são mais sensíveis ao β-citronelol do que carrapatos

I. ricinus e também que mosquitos A. aegytpi. Além disso, este composto químico

40

parece atuar mais efetivamente como um repelente para R. sanguineus do que o

próprio DEET.

Este estudo demonstra que cães resistentes ao carrapato R.

sanguineus produzem compostos químicos voláteis que atuam como repelentes

naturais para este carrapato. A partir deste momento novos testes são

necessários visando avaliar a possibilidade do uso destes compostos no controle

de R. sanguineus em cães naturalmente susceptíveis.

41

7. CONCLUSÃO

Cães da raça Beagle, um hospedeiro resistentes ao carrapato R.

sanguineus, produzem repelentes naturais contra este carrapato.

Os compostos químicos identificados nos odores de cães Beagles,

benzaldeído, 2-hexanona e undecano apresentaram atividade repelente, porém

esta foi baixa quando os compostos foram apresentados isoladamente.

A mistura entre benzaldeído e 2-hexanona (1:1) é tão eficaz em repelir

carrapatos R. sanguineus quanto o DEET, sendo ainda capaz de manter

repelência em menores concentrações.

DEET e β-citronelol são eficazes como repelentes contra o carrapato R.

sanguineus, porém o β-citronelol mostra-se mais eficaz que o DEET em testes de

placa.

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