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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA UFBA

INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SADE

CAMPUS ANSIO TEIXEIRA

PROGRAMA MULTICNTRICO DE PS-GRADUAO

EM CINCIAS FISIOLGICAS - SBFIS

RAIMUNDO NONATO FARIA

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO

EXTRATO ETANLICO DA FOLHA DE Phanera flexuosa

(MORIC.) L. P. QUEIROZ (CAESALPINIOIDEAE) E DA

INIBIO DE FATORES DE VIRULNCIA DE Staphylococcus

aureus RESISTENTES A ANTIBITICOS.

Vitria da Conquista - BA

2012

RAIMUNDO NONATO FARIA

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO

EXTRATO ETANLICO DA FOLHA DE Phanera flexuosa

(MORIC.) L. P. QUEIROZ (CAESALPINIOIDEAE) E DA

INIBIO DOS FATORES DE VIRULNCIA DE

Staphylococcus aureus RESISTENTES A ANTIBITICOS.

Dissertao apresentada ao Programa Multicntrico de

Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas/Sociedade

Brasileira de Fisiologia para a obteno do ttulo de

Mestre em Cincias Fisiolgicas.

Orientadora: Profa. Dra. Regiane Yatsuda

Co-Orientador: Prof. Dr. Lucas Miranda Marques

Vitria da Conquista - BA

2012

Biblioteca Universitria Campus Ansio Teixeira - UFBA

Faria, Raimundo Nonato

Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato etanlico da folha de Phanera

flexuosa (Moric.) L. P. Queiroz (Caesalpinioideae) e da inibio de fatores de virulncia

de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos / Raimundo Nonato Faria - 2012.

129 f. : il.

Orientadora: Profa. Dr

a Regiane Yatsuda; Co-orientador: Prof. Dr. Lucas Miranda

Marques.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal da Bahia, Programa Multicntrico de

Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas, 2012.

1. Plantas Medicinais Phanera flexuosa (Moric.). 2. Farmacorresistncia Bacteriana - Staphylococcus aureus - MRSA. I. Universidade Federal da Bahia. Programa Multicntrico de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas. II. Ttulo.

CDU 633.88

Dedico este trabalho aos meus pais, Pedro Paulo de Farias e Margarida Maria de Farias,

que sempre me proporcionaram as melhores condies possveis para o aprendizado, o

desenvolvimento do carter e da honestidade e permitir uma vida de tantas alegrias.

A Deliene Martins de Carvalho, por ser minha companheira amada, meu porto seguro e a

fora que me aconselha e sustenta nos momentos difceis, mo anam cara.

Ao meu filho Joo Pedro de Carvalho Faria, a luz que ilumina meu horizonte e me faz

querer voltar pra casa a cada dia, te amo.

Aos meus sogros Newton Rodrigues Carvalho e Hermelina Martins de Carvalho, pois sei

o quanto torceram por mim e o quanto regojizam-se com esta conquista.

Sonaly Martins de Carvalho Arajo, Ana Clara Carvalho Arajo e Newton Cleber

Martins de Carvalho por existirem e serem uma continuidade da minha famlia.

Aos professores Regiane Yatsuda e Lucas M. Marques por suas presenas, amizade e

orientaes constantes.

AGRADECIMENTOS

A Deus, Jhav, Alah, que tem sempre colocado nos caminhos trilhados por mim, pessoas

maravilhosas que me acolheram, orientaram e tornaram-se blsamo nos momentos de

dificuldade.

Agradeo s Instituies financiadoras, Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico

e Tecnolgico (CNPq UNIVERSAL 014/2008; 13389/2010-0), Fundao de Amparo

Pesquisa e Inovao Tecnolgica do Estado da Bahia (FAPESB/PPSUS 0008/2009).

O ingresso no mestrado me abriu um grande horizonte de conhecimentos, de oportunidades e,

sem dvida alguma, um imenso prazer. Hoje tenho a certeza que ningum caminha sozinho,

sempre existe algum em quem se apoiar nos momentos de fraqueza, ou compartilhar os

momentos de alegria. para elas que apresento meus mais sinceros agradecimentos e carinho.

A Universidade Federal da Bahia Instituto Multidisciplinar em Sade Campus

Ansio Teixeira (UFBA- IMS/CAT), por trazer aos rinces do estado baiano a oportunidade

e oferta de cursos de graduao e ps-graduao primando pela excelncia e qualidade.

Em especial, a minha professora orientadora, Dra. Regiane Yatsuda, pela imensa pacincia,

dedicao, amizade e pela confiana em me aceitar em seu laboratrio, pelos valiosos

ensinamentos, e por seu exemplo nico de pesquisadora.

A meu co-orientador de corao, o professor Dr. Lucas Miranda Marques, que sempre se

mostrou solcito no auxlio em momentos de dificuldade e que abriu as portas da sua famlia

para proporcionar vivncias enriquecedoras pessoais e acadmicas.

s heroicas professoras Dra. Amlia Cristina Mendes de Magalhes, Dra. Telma de Jesus

Soares e Dra. Najara de Oliveira Belo, por todo empenho, zelo e perseverana para fazer

com que o Programa Multicntrico em Cincias Fisiolgicas da UFBA, continue como um

projeto para a gerao de profissionais qualificados e comprometidos com a qualidade

acadmica.

A todos os docentes do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFMG, em especial

queles que participaram mais diretamente da minha formao acadmica e cientfica: Prof.

Dr. Andr Klein, Prof. Dr. Steyner Cortes, Profa. Dra. Miriam T. P. Lopes, Profa. Dra.

Janetti N. Francischi, Prof. Dr. Fabrcio Moreira, Profa. Dra. Daniele Aguiar, Prof. Dr.

Jorge Pesquero e Prof. Dr. Igor Dimitri Gama Duarte.

Ao Prof. Dr. Jorge Timenetsky, Aricelma Pinheiro Franca, Denise Jaqueto, Carlos

Augusto Scachetti Almeida, Profa. Dra. Glucia Maria Machado Santelli, Beatriz A.

Cortez, Roberto Cabado M. Junior, Profa. Dra. Dolores rsula Mehnet, Telma Alves

Monezi, Angelita M. O. Gusmo dos Santos e demais amigos e professores do ICB-USP

que nos receberam carinhosamente e permitiram a realizao dos experimentos necessrios ao

sucesso dessa dissertao.

Aos colegas discentes do programa de ps-graduao em Fisiologia e Farmacologia do

ICB/UFMG, por proporcionarem um ambiente acadmico acolhedor, compartilhando

convvio edificante e descontrado que minimizaram as saudades e a distncia dos entes

familiares na minha estadia em Belo Horizonte-MG: Pedro Henrique Gobira Nunes, Ana

Flvia Santos Almeida, Thrcia Guedes Viana, Giovane Galdino de Souza, Raphael

Gomes Ferreira, Viviane Saito, Lindisley Ferreira Gomides, Danielle Bernardes,

Alessandra de Castro Montandon, Amilton Cerqueira de Andrade, Rogrio Pereira

Bilheiro, Paulo Marcelo de Andrade Lima, Lukas Miranda Cangussu Gomes Oliveira,

Rosria Dias Aires, Cynthia Dela Cruz, e tantos outros que pude conviver neste perodo.

Aos pesquisadores Dr. Marcelo H. Napimoga, Dra. Juliana T. Clemente-Napimonga, Dr.

Humberto M. Spindola, Dra. Mary Ann Folgio, Dr. Pedro Luiz Rosalen e Msc. Avaldo

de Oliveira S. Filho pelo amparo, auxlio, suporte tcnico e disponibilidade para a pesquisa.

rika Pereira de Souza e Joseline Cezrio Duarte, por sua amizade, conversas,

ensinamentos, convivncia e por serem meus guias nos primeiros passos no convvio no

grupo de pesquisa e na rotina do laboratrio.

Ao esquadro dourado, que com tanto afinco e dedicao ajudou-me na rotina exaustiva dos

experimentos realizados, em especial a Gladistone Correia Messias e Geysa Silva Santos,

assim como a Mrcio Augusto Meira Santana, Mssio Piraj Mattos e Tiara Oliveira

Castro.

Aos amigos e companheiros do laboratrio de Farmacologia: Andressa Arajo Oliveira,

Camila Brito Cardoso, Cassya Maviony Fiuza Andrade, Daniel Dias Sampaio,

Emanuella Gomes Maia, Keila Silva de Jesus, Maiana Ferraz Andrade, Mahala Correia

Cludio, Monique Dutra Fonseca, Naira Kelle Barbosa Ribeiro, Priscila Silva

Cunegundes, Rafael Santos Dantas Miranda Drea, Roberta Alves Mota, e Vincius

Saboia Meireles por toda amizade e ajuda do transcorrer desta conquista. Nem tenho palavras

para agradecer a todos vocs pelo carinho e pelo cuidado que tiveram comigo. Mostrando que

realmente temos uma equipe, que sabemos trabalhar em grupo e isso uma lio que

levaremos para toda a nossa vida, um grande ensinamento, alm de muitos outros, que se

insere neste grande universo que a nossa pesquisa. Saibam que eu fui apenas porta-voz de

um trabalho desenvolvido com muito empenho de todos, e que se hoje tenho um ttulo eu

ofereo todo o reconhecimento a vocs.

Aos amigos e companheiros de laboratrio do Programa de Educao Tutorial (PET):

Aparecido Almeida Conceio, Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa, Aracely Vieira

de Melo, Deivid Alan Luz Santos, Iaquine Santos Da Silva, Jeisa Zielle de Souza

Rodrigues, Manoel Neres Santos Junior, Marcelly Machado Santos, Nayara Silva de

Macedo, Pedro Aldo Silva Cunegundes, Qeren Hapuk Rodrigues Ferreira e Saulo

Rocha Sales, que apesar de estarem no projeto mais recentemente, puderam contribuir de

forma relevante para a consecuo de nosso trabalho at o presente instante, e que com

certeza iro fazer mais ainda no futuro. Os mritos tambm so de vocs.

Aos amigos e companheiros do laboratrio de Microbiologia: Danilo Cordeiro Cariri da

Silva, Guilherme Barreto Campos, Simone Gomes de Souza, Daniel Santos Sousa,

Verena Macedo e Aline Amorim, que propiciaram os alicerces sobre o qual nosso projeto se

desenvolveu e que sempre se mostraram receptivos, cuidadosos e atenciosos em todos os

momentos em que foram solicitados. Que nossa amizade e companheirismo estendam-se alm

dos limites do tempo e do espao. Obrigado!

Aos meus colegas de jornada Anna Carolina Sade Dantas, Daniela de Oliveira Gusmo,

Everaldo Nery de Andrade, Gleisy Kelly Neves Gonalves, Jacqueline Pereira da Silva,

Leda Maria de Castro Coimbra, Liliany Souza de Brito Amaral, Samira Itana de Souza

e Thiago Henrique Caldeira de Oliveira. Tambm aos novos colegas: Erika Pereira de

Souza, Luciano E. dos Santos, Jussara A. Silva, Grazielle P. L. dos Santos e Clarissa L.

S. e Souza que enfretaro as lutas e batalhas por que passamos, mas que apesar de difceis,

so extremamente engrandecedoras e gratificantes. Fora sempre!

A Ndia Mariza Ledo Costa e Juliana Ledo Costa por abrirem seu lar e me acolherem na

minha estadia em Belo Horizonte-MG; permitindo um ambiente de conforto e descontrao

durante os momentos difceis do afastamento do lar.

A Alexandre Pereira Flores, colega e amigo especial que me acolheu inicialmente em

Vitria da Conquista, e sua companheira Janana Santos Albuquerque que permitiram

minha adaptao a esta maravilhosa cidade, que apesar de fria em clima exulta calor no

corao.

Aos meus ex-alunos e amigos da Faculdade Guanambi, que sempre foram e sero a razo

precpua do meu ingresso na vida acadmica e na busca da qualificao contnua neste

objetivo; e que mesma na ausncia nunca deixaram de manifestar apreo, carinho e desejo de

compartilharmos outras vivncias.

"Educar crescer. E crescer viver. Educao , assim, vida no sentido mais autntico da

palavra."

Ansio Spnola Teixeira.

(1900-1971)

FARIA, Raimundo Nonato. Avaliao da atividade antimicrobiana do extrato etanlico

da folha de Phanera Flexuosa (Moric.) L. P. Queiroz (CAESALPINIOIDEAE) e da

inibio dos fatores de virulncia de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos. Dissertao (Mestrado) Instituto Multidisciplinar em Sade, Universidade Federal da Bahia,

Vitria da Conquista, 2012.

RESUMO

O Staphylococcus aureus um patgeno envolvido em infeces noscomiais e comunitrias.

O objetivo deste estudo foi analisar in vitro a atividade antimicrobiana do extrato etanlico da

folha de Phanera flexuosa (Moric) L.P.Queiroz (EFPF), conhecida como escada de macaco,

coletada na Floresta Nacional Contendas do Sincor (BA), sobre o crescimento bacteriano e

sobre alguns fatores de virulncia de Staphylococcus aureus resistentes a antibiticos

(MRSA), isolados de ambientes hospitalares de Vitria da Conquista (BA). O EFPF foi

testado nas concentraes entre 4000 a 125 g/mL na determinao de concentrao inibitria

mnima (CIM) e concentrao bactericida mnima (CBM). Foram estudados Staphylococcus

aureus ATCC 43300 e 31 isolados resistentes a oxacilina em antibiograma e que

apresentaram o gene mecA em reao de PCR. Na CIM, as placas foram incubadas a 37C,

24h, sendo interpretadas de acordo com o crescimento bacteriano e confirmado com o corante

ressazurina. Como controle dos experimentos, foi utilizado o veculo, etanol (10%, v/v).

Verificou-se a inibio de formao do biofilme de MRSA em 3, 5, 7 e 24 h, aps a exposio

ao EFPF, avaliou-se a formao de biomassa total com cristal de violeta, viabilidade celular

com MTT e morfologia do biofilme usando microscopia confocal aps 24 h (isolados clnicos

16A e 92). Foi realizada curva de crescimento de MRSA avaliando a absorbncia e

viabilidade da cultura bacteriana suplementada com 1% glicose, e tratada com o veculo ou

EFPF em concentrao subinibitria (CIM50). Nos tempos de 5 e 24 h de exposio ao EFPF,

da curva foi analisada a expresso gnica de -hla, PVL, sea, seb, spa, icaA, icaB, icaC,

icaD, icaR dos isolados 16A e 112. Foram realizadas 03 triplicatas para cada experimento e

anlise estatstica. Todos os isolados testados e a cepa ATCC apresentaram CIM ente 125 e

4000 g/mL, sendo resultados relevantes de CIM (125 g/mL) foram obtidos para a cepa

ATCC 43300 e para os isolados 27A, 27B, 28, 29, 33A, 43.1, 47.1, 52, 76, 85.1, 85.2, 92 e

113. Quanto ao CBM, ocorreu para os isolados 47.1 e 92 (4000 g/mL), isolado 12D (1000

g/mL), e isolado 29 (500 g/mL). Na inibio de formao de biofilme, os resultados em

reduo de clulas viveis e formao da biomassa total ocorreram nos tempos de 7 e 24h,

sendo que na concentrao 5000 g/mL foi efetiva no biofilme de 24 h. Quanto curva de

crescimento, a atividade antimicrobiana de EFPF ocorreu na fase final exponencial e

estacionria inicial avaliada pela reduo de absorbncia, e tambm a reduo da viabilidade

celular do EFPF em relao ao veculo nas cepas testadas. Houve diminuio da expresso de

PVL do isolado 16A tratado com EFPF (p

FARIA, Raimundo Nonato. Evaluation of the antimicrobial activity of ethanolic leaf

extract of Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz (CAESALPINIOIDEAE) and

inhibition of the virulence factors of Staphylococcus aureus resistant to antibiotics Thesis

(MsC) - Multidisciplinary Health Institute, Federal University of Bahia, Vitria da Conquista,

2012.

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is a pathogen involved in nosocomial and community infections. The

aim of this study was to analyze in vitro antimicrobial activity of ethanol extract of leaf

Phanera flexuosa (Moric) L.P. Queiroz (EFPF), known as monkey ladder, collected in the

National Forest Contendas Sincor (BA) on bacterial growth and on some virulence factors of

antibiotic-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), isolated from hospital environments of

Vitoria da Conquista (BA). The EFPF was tested at concentrations between 4000 to 125

g/mL in the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum

bactericidal concentration (MBC). We studied Staphylococcus aureus ATCC 43300 and 31

isolates resistant to oxacillin in sensitivity and that had the mecA gene in PCR. In the MIC,

the plates were incubated at 37C, 24 are interpreted according to the bacterial growth and

confirmed with the dye ressazurin. As control experiments, we used the vehicle, ethanol (10%

v/v). There was inhibition of biofilm formation of MRSA 3, 5, 7 and 24 h after exposure to

EFPF evaluated to complete the formation of biomass with crystal violet, with MTT cell

viability and morphology of the biofilm using microscopy confocal after 24 h (16A and 92

clinical isolates). Growth curve was performed by evaluating the absorbance of MRSA and

viability of bacterial cultures supplemented with 1% glucose, and treated with vehicle or in

EFPF subinihibtory concentration (MIC50). In times of 5 and 24 h of exposure to EFPF, the

curve was analyzed the gene expression of hla-, PVL, sea, seb, spa, icaA, icaB, icaC, icaD icaR in isolates 16A and 112. 03 triplicates were performed for each experiment and statistical

analysis. All isolates and ATCC strains showed MIC being 125 and 4000 g/mL, with

relevant results from CIM (125 g/mL) were obtained for strain ATCC 43300 and isolates

27A, 27B, 28, 29, 33A, 43.1 , 47.1, 52, 76, 85.1, 85.2, 92 and 113. As to the CBM was

isolated for the 47.1 and 92 (4000 g/ml) isolated 12D (1000 g/mL), 29 and isolated (500

g/mL). Inhibition of biofilm formation, results in reduced formation of viable cells and total

biomass of the 7 and 24 times, and the concentration 5000 g/mL was effective in the biofilm

24 h. The growth curve, the antimicrobial activity of EFPF occurred at the end of exponential

and stationary initial absorbance measured by the reduction, and also the reduction of cell

viability versus vehicle EFPF the strains tested. There was decreased expression of PVL

treated with isolate 16A EFPF (p

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz. Folhas e caule em seu habitat na

Floresta Nacional (FLONA) de Contendas do Sincor- BA............................

40

Figura 2A Inibio da formao do biofilme de S. aureus ATCC 43300 resistente a

antibiticos pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.)

L.P. Queiroz EFPF........................................................................................

53

Figura 2B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus ATCC 43300 resistente a

antibiticos MRSA pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa

(Moric.) L.P. Queiroz EFPF..........................................................................

53

Figura 3A Inibio da formao do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos

MRSA (isolado 16A) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa


54

Figura 3B Viabilidade celular do biofilme de S. aureus resistente a antibiticos

MRSA (isolado 16A) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa


54


MRSA (isolado 29) pelo extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa


55




55




56




57




58




58

Figura 7 Micrografia dos biofilmes do isolado S. aureus 16A tratados com veculo

ou o extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz

(EFPF) pela microscopia confocal a laser.......................................................

60

Figura 8 Micrografia dos biofilmes do isolado S. aureus 92 tratados com veculo ou

o extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa (Moric.) L.P. Queiroz

(EFPF) pela microscopia confocal a laser........................................................

61

Figura 9 Determinao da liberao da interleucina IL-1por macrfagos J774

estimulados com endotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou veculo

(Etanol 10%, v/v).............................................................................................

62


estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF ou veculo

(Etanol 10%, v/v).............................................................................................

63



(Etanol 10%, v/v).............................................................................................

64

Figura 12 Determinao da liberao da interleucina TNF-por macrfagos J774


(Etanol 10%, v/v).............................................................................................

65

Figura 13 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico das folhas de Phanera

flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico de S. aureus ATCC

43300.

66


flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico do isolado S. aureus

112...

67


flexuosa (EFPF) sobre o crescimento planctnico do isolado S. aureus

16A...

68

Figura 16 Influncia do extrato etanlico das folhas de Phanera flexuosa (EFPF)

sobre a expresso do gene sea na formao do biofilme de 24 h de S. aureus

ATCC 43300....................................................................................................

69


sobre a expresso dos genes -hla, PVL, sea, seb e spa na formao do

biofilme de 24 h do isolado de S. aureus 112..................................................

70


sobre a expresso do gene -hla, PVL e spa na formao do biofilme de 24

h do isolado de S. aureus 16A........................................................................

71

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Sequncia dos primers utilizados na amplificao das regies promotoras dos

genes .................................................................................................................

49

Tabela 2 Atividade antimicrobiana do extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa

(Moric.) L.P. Queiroz - EFPF na determinao da concentrao inibitria

mnima (CIM) e na concentrao bactericida mnima (CBM) de S. aureus

resistentes a antibiticos (MRSA).....................................................................

51

Tabela 3 Avaliao da presena dos genes de virulncia dos S. aureus (MRSA) pelo

mtodo de PCR.....................................................................................................

68

Tabela 4 caractersticas dos isolados selecionados para avaliao dos fatores de

virulncia............................................................................................................

88

Tabela 5 Protocolos de ciclos das reaes de PCR........................................................... 89

Tabela 6 Protocolo das quantidades de reagentes por tipo de PCR (x1).......................... 90

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

agr Acessory gene regulator

AIP Autoinducing peptide

ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

ANOVA Anlise de varincia

BHI Brain Heart Infusion

CA-MRSA Community-Acquired Methicilin resistant S. aureus

CBM Concentrao Bactericida Mnima

CDC Center for Disease Control and Prevention

cDNA cido desoxirribonuclico complementar

ClfA/B Clumping factor A/B

CIM Concentrao Inibitria Mnima

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

Dr. Doutor

Dra. Doutora

D.P. Desvio padro

EDTA cido etileno diamino tetra actico

EFPF Extrato etanlico da folha de Phanera flexuosa

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ensaio imuno-enzimtico em

fase slida

FAPESB Fundao de Amparo Pesquisa e Inovao Tecnolgica do

Estado da Bahia

FDA Food and Drug Administration

fnb Fibronectinas estafiloccicas

FLONA Floresta nacional Contendas do Sincor

CAPES Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior

EPI Efllux Pump inihibtors

g Gramas

h Horas

HA-MRSA Hospital-Acquired Methicilin resistant S. aureus

ica Intercelular adhesin lcus

IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

Renovveis

IH Infeco Hospitalar

IL-1 Interleucina-1

IL-10 Interleucina-10

IL-1 Interleucina-1

IL-2 Interleucina-2

IL-6 Interleucina-6

LTA cido lipoteicico

M Molar

Min Minutos

MHC II Molcula do complexo principal de histocompatibilidade do tipo II

mL Mililitros

MRSA Methicilin resistant Staphylococcus aureus

MS Ministrio da Sade

MSCRAMM Microbial surface components recognizing adhesive matrix

molecules

NaCl Cloreto de sdio

NCBI National Center for Biotechnology Information

NO xido Ntrico

OD Densidade ptica

OMS Organizao Mundial da Sade

PBP Penicilin Binding Protein

PBS Salina tamponada com fosfatos

PCR Polymerase Chain Reaction

PEG Peptdeoglicano

PNSG Polissacardeo Poli-N-succinil--1,6-glicosamina

pH Potencial hidrogeninico

PIA Polyssacaridic intercelular adhesin

PVL Leucocidina de Panton-Valentine

RNA cido ribonuclico

SarA Staphylococcal acessory regulator

SCCmec Staphylococcal cassete chromosome mec

Sea Enterotoxina estafiloccica tipo A

Seb Enterotoxina estafiloccica tipo B

Sec Enterotoxina estafiloccica tipo C

Sed Enterotoxina estafiloccica tipo D

Spa Protena A estafiloccica

TAE Tampo TRIS-cido actico EDTA

TLR2 Tooll Like Receptor tipo 2

TNF-

TSB

Fator de necrose tumoral-alfa

Triptone soy broth

TSST-1 Toxina da Sndrome do choque txico 1

UFBA Universidade Federal da Bahia

UESB Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia

UFC Unidade Formadora de Colnia

UTI Unidade de Terapia Intensiva

UNESCO Organizao das Naes Unidas para Educao, Cincia e Cultura

VRE Vancomycin resistant Enterococcus faecium

v/v Relao entre volume e volume

M Micromol

L Microlitros

g Microgramas

VISA Vancomycin intermediate resistant Staphylococcus aureus

VRSA Vancomycin resistant Staphylococcus aureus

WHO World Health Organization

SUMRIO

1 INTRODUO.................................................................................................... 17

2 FUNDAMENTOS TERICOS.......................................................................... 19

2.1 AVALIAO DA ATIVIDADE BIOLGICA DE PLANTAS MEDICINAIS.......................................................................................................

.

F

19

2.1.1 Antibioticoterapia................................................................................................. 20

2.2 RESISTNCIA MICROBIANA E INFECES HOSPITALARES............ 24

2.2.1 Resistncia Microbiana.......................................................................................... 24

2.2.2 Infeces Hospitalares............................................................................................ 25

2.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS......................................................................... 28

2.3.1 Staphylococcus aureus............................................................................................ 28

2.3.2 Fatores de virulncia de S. aureus........................................................................ 32

2.4 BIODIVERSIDADE BRASILEIRA.................................................................. 37

2.5 Phanera flexuosa (MORIC.) L. P. Queiroz........................................................ 39

2.5.1 Caractersticas Botnicas e de localizao da Phanera flexuosa..................... 39

2.5.2 Composio qumica e usos medicinais.............................................................. 40

3 OBJETIVOS......................................................................................................... 42

3.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................... 42

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................................. 42

4 MATERIAL E MTODOS................................................................................. 43

4.1 COLETA E IDENTIFICAO DA ESPCIE VEGETAL............................ 43

4.2 PREPARO DOS EXTRATOS............................................................................ 43

4.3 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EFPF................ 43

4.3.1 Microrganismos.................................................................................................... 44

4.3.2 Teste de Concentrao Inibitria Mnima (CIM) e Concentrao

Bactericida Mnima (CBM) do extrato etanlico da folha de P. flexuosa

(EFPF) contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)........

57

57

44

4.4 AVALIAO DA ATIVIDADE DO EFPF SOBRE OS FATORES DE

VIRULNCIA DE S. AUREUS.....................................................................................

47

45

4.4.1 Inibio da formao do biofilme......................................................................... 45

4.4.2 Avaliao da morfologia do biofilme tratado com EFPF.................................. 46

4.4.3 Ensaio de liberao de fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucinas

(IL-1, IL-6 e IL-10) por macrfagos J774 estimulados com exotoxinas de S. aureus tratados com EFPF.............................................................................................

60

56

47

4.4.4 Avaliao da expresso gnica dos fatores de virulncia do S. aureus............. 48

4.5 ANLISE ESTATSITCA................................................................................... 50

5 RESULTADOS..................................................................................................... 51

5.1 TESTE DA CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) E DA

CONCENTRAO BACTERICIDA MNIMA (CBM) DO EFPF CONTRA S.

aureus................................................................................................................................

63

53

51

5.2 INIBIO DA FORMAO DE BIOFILME POR EFPF............................. 52

5.3 AVALIAO DA MORFOLOGIA DO BIOFILME TRATADO COM

EFPF.................................................................................................................................

61

59

5.4 ENSAIO DE LIBERAO DE FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA

(TNF-) E INTERLEUCINAS (IL-1, IL-6 E IL-10) POR MACRFAGOS J774 ESTIMULADOS COM EXOTOXINAS DE S. aureus TRATADOS COM EFPF...

63

63

61

5.5 AVALIAO DA EXPRESSO GNICA DOS FATORES DE

VIRULNCIA...................................................................................................... 65

6 DISCUSSO......................................................................................................... 72

7 CONCLUSO....................................................................................................... 87

8 ANEXOS............................................................................................................... 88

REFERNCIAS................................................................................................... 91

17

1 INTRODUO

A Organizao Mundial da Sade (OMS), denomina como plantas medicinais todas as

espcies silvestres ou cultivadas, quando utilizadas como recurso para prevenir, aliviar, curar,

modificar um processo fisiolgico normal ou patolgico ou quando estas so fontes de

frmacos ou de seus precursores (ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD, 2000). Em

1978, a OMS reconheceu os medicamentos de origem vegetal como recurso teraputico

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001) e recomendou aos pases que executassem

levantamentos regionais e identificao botnica de espcies vegetais usadas na medicina

popular tradicional; estimulassem e indicasse o uso das plantas medicinais com eficcia e

segurana comprovadas e contraindicassem o emprego das prticas medicinais populares

consideradas inteis ou prejudiciais (CAVALCANTE, 2010).

A busca de alternativas teraputicas complementares farmacoterapia tradicional

converteu-se recentemente numa diretriz importante no contexto da sade pblica.

Atualmente, a pesquisa de plantas medicinais eixo fundamental nas polticas de sade

implementadas pelas esferas governamentais como parte da Poltica Nacional de Prticas

Integrativas e Complementares do Sistema nico de Sade (BRASIL, 2006).

As plantas medicinais participam de forma fundamental no aumento do mercado de

medicamentos, particularmente no desenvolvimento de fitoterpicos e na identificao de

novas molculas ou prottipos bsicos para gerao de novos medicamentos sintticos

(YATSUDA, 2004), visto que muitos constituintes de plantas e/ou seus derivados

semissintticos constituem uma parcela aprecivel dos frmacos de ponta recm-introduzidos

no mercado. Trata-se de um mercado poderoso, por isso, h a necessidade de buscar novas

molculas para assegurar a competitividade na produo de novos medicamentos patenteados.

Alm disto, tambm representam a oportunidade de elaborar os medicamentos denominados

fitoterpicos, que so extratos vegetais padronizados e validados do ponto de vista da sua

eficcia, segurana e qualidade (BHATTARAM; GRAEF; KOHLERT, 2002).

O uso de fitoterpicos no Brasil constitui um mercado de US$ 400 milhes, e ainda

so recomendadas pela Organizao das Naes Unidas, que reconheceu o uso de plantas

medicinais por 2/3 da populao da Terra (BARATA, 2010). Estima-se que o Brasil possui

aproximadamente 55 mil espcies vegetais catalogadas, das quais apenas 8% foram estudadas

para identificao de molculas bioativas e, quatro mil so reconhecidas como plantas

medicinais (BRASIL, 2004).

18

A populao brasileira utiliza as plantas medicinais como antimicrobianos, uma forma

alternativa para tratamento de diversas infeces. As doenas infecciosas so a segunda causa

de morte no mundo e terceira causa de morte em pases em desenvolvimento (FAUCI, 2001).

Atualmente, a presso de seleo de microrganismos resistentes pelos antimicrobianos

consequente no s do uso indiscriminado dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente

hospitalar, ao uso teraputico ou profiltico destas drogas em medicina e odontologia

humanas, como tambm de seu emprego em medicina veterinria, na conservao de

alimentos, no combate a elementos biolgicos daninhos aos seres humanos e na engorda de

animais destinados alimentao. Atualmente, os microrganismos multirresistentes so uma

preocupao global, acarretando prejuzos financeiros e sociais estimados em 25.000 mortes e

gasto com custos hospitalares por volta de 1,5 bilho de euros na Europa e 35 bilhes de

dlares nos Estados Unidos ao ano, gerando um significativo aumento dos custos totais para o

sistema de sade (LEUNG et al., 2011).

Devido ao rpido aumento mundial da resistncia microbiana aos antibiticos

disponveis no mercado, necessria a pesquisa por novos antimicrobianos contra essas cepas

resistentes. Paradoxalmente, a busca por novos agentes antimicrobianos tem declinado nos

ltimos anos, sendo que as grandes companhias farmacuticas tm extinguido ou diminudo

seus programas de pesquisa (SPELLBERG et al., 2004).

Assim, importante estudar plantas da caatinga como a Phanera flexuosa, conhecida

popularmente como escada de macaco, uma planta ainda pouco estudada apesar do seu uso

pela populao do semirido. Tambm importante avaliar a atividade antimicrobiana da

Phanera flexuosa, principalmente frente os microrganismos multirresistentes, no intuito de

descobrir novos antimicrobianos, assim como, avaliar a influncia desse extrato sobre os

fatores de virulncia de Staphylococcus aureus, um dos principais patgenos resistentes

envolvidos nas infeces hospitalares.

A descoberta de novos produtos de origem natural ou compostos qumicos isolados

com atividade biolgica de grande interesse cientfico, ambiental, tecnolgico e econmico

para o Brasil, principalmente considerando o possvel desenvolvimento de novos fitoterpicos

e fitofrmacos, alm da gerao de patentes. Deste modo, o presente trabalho tem como

objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanlico das folhas de Phanera

flexuosa (Moric.) L.P.Queiroz (Caesalpinioideae) contra Staphylococcus aureus resistentes a

antibiticos, e sua influncia sobre os fatores de virulncia desses isolados de ambientes

hospitalares de Vitria da Conquista BA.

19

2 FUNDAMENTOS TERICOS

2.1 AVALIAO DA ATIVIDADE BIOLGICA DE PLANTAS MEDICINAIS

As plantas medicinais tm formado a base dos cuidados em sade em todo o mundo,

desde os primrdios da humanidade at os dias atuais, sendo que so de grande importncia

no comrcio internacional. O reconhecimento de seu valor clnico, farmacutico e econmico

continua a crescer, embora isso varie muito entre os pases. As plantas so importantes fontes

para a investigao farmacolgica e desenvolvimento de medicamentos, no s quando

fitocompostos bioativos so usados diretamente como agentes teraputicos, mas tambm

como matrias-primas para a sntese de drogas ou como modelos para os compostos

farmacologicamente ativos (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).

O valor dos produtos naturais claramente reconhecido na descoberta de novos

compostos bioativos, sendo que, das novas drogas aprovadas pelo FDA desde 1983 at 1994,

28% procedem inteiramente de produtos naturais, 39% so derivados de produtos naturais e

33% so drogas de origem sinttica (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).

As espcies vegetais apresentam a capacidade de produzir, transformar e acumular

inmeras substncias que no esto necessariamente relacionadas de forma direta com a

manuteno da vida da planta, mas garantem vantagens para a sua sobrevivncia e para a

perpetuao da espcie, sendo chamados de metablitos secundrios. A sua produo

determinada por necessidades ecolgicas e possibilidades biossintticas. Assim, os

metablitos secundrios, por serem fatores de interao entre organismos, frequentemente

apresentam atividades farmacolgicas importantes (SANTOS, 2007).

Os fitofrmacos, molculas com aes teraputicas de origem vegetal representam

uma alternativa tecnolgica e econmica em relao ao elevadssimo custo de

desenvolvimento de um novo medicamento realizado atravs da anlise combinatria e

sntese de molculas a partir de moldes biolgicos que apresentam diversos efeitos

indesejveis, tais como a prpria dificuldade de adaptao ao receptor biolgico (LASTRES

et al., 2001).

Alm disso, as preparaes vegetais tm uma caracterstica muito especial que as

distinguem de drogas qumicas: uma nica planta pode conter um grande nmero de

fitocompostos bioativos e ainda mais em uma combinao de plantas. Essa complexidade

um dos desafios mais importantes para a tentativa de identificar um nico composto bioativo

no universo enorme que inclui um nico extrato bruto (MENDONA-FILHO, 2006).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Newman+DJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Cragg+GM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Snader+KM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Newman+DJ%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Cragg+GM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Snader+KM%22%5BAuthor%5D

20

A avaliao do potencial teraputico de plantas medicinais e seus metablitos

secundrios, tais como alcalides, esterides, triterpenos, taninos, saponinas, flavonides,

lignanas (ARRUDA, 2008), tm sido objeto de constante estudo que inclui a investigao da

atividade farmacolgica e toxicolgica de substncias isoladas, fraes e extratos totais da

droga vegetal (ZANETTI, 2002).

2.1.1 Antibioticoterapia

Desde os primrdios da existncia humana, o homem vem sendo acometido por

doenas de origem microbiana (CLEVELAND et al., 2001; RILEY; WERTZ, 2002). Embora

na histria da humanidade, a luta contra infeces causadas por microrganismos existe h

mais de 50.000 anos, s recentemente foi descoberta a natureza infecciosa de algumas

doenas. No incio, utilizando-se de conhecimentos empricos, buscava-se na natureza a cura

para todos os tipos de doenas, onde inclusive, se usava extratos vegetais e venenos de

animais (WHITE, 2002; PAGES, 2004).

Em 1910, Paul Ehrlich, um mdico alemo, aps testar centenas de substncias

encontrou um agente quimioterpico efetivo no combate da sfilis, chamado salvarsan, um

derivado de arsnico (MCDERMOTT et al., 2003). Em 1929, o primeiro antibitico, a

penicilina G, foi descoberta por Fleming, seguido pelo surgimento de derivados

sulfonamdicos na dcada de 30 e novas classes de antibiticos nos anos seguintes (CHOPRA

et al., 2002; BUYNAK et al., 2004).

A penicilina liga-se s protenas de ligao de penicilina (PBP penicilin binding

protein) e possui 04 isoformas (PBP1, 2, 3 e 4), distintamente expressas pelo microrganismo.

Ao ser internalizado pelo microrganismo, o frmaco atua ao inibir a atividade de

transpeptidase realizada por estas PBPs, responsvel pela ligao cruzada entre a N-acetil-

glucosamina e o cido N-acetil-murmico, que formam o arcabouo da rede do

peptideoglicano, principal constituinte da parede celular bacteriana. O evento final a

inativao do agente inibidor de enzimas autolticas da parede celular bacteriana, levando a

clula lise (TIPPER, 1985; RANG et al., 2007)

A introduo da benzilpenicilina teve um efeito marcante nas taxas de mortalidade

provocada por S. aureus. Desde ento, inmeros pacientes foram curados de infeces

potencialmente fatais usando-se um ou mais esquemas teraputicos com antibiticos. Porm,

o uso indiscriminado de tais drogas resultou no aparecimento de patgenos resistentes, o que

tornou necessrio o emprego cada vez maior de novos frmacos (FALCO et al., 2002).

21

A evoluo das cepas de bactrias resistentes e multirresistentes atravs da histria

tem sido rpida e preocupante. Em 1944, foram descritas as primeiras cepas produtoras de

penicilinase em ambiente hospitalar, at ento raramente encontradas (ERSON, 2005;

ROLAIN; RAULT, 2005). O aumento da prevalncia de S. aureus resistentes a

benzilpenicilina foi inicialmente superado pela introduo das penicilinas semissintticas, e

dcadas mais tarde, pelas penicilinas sintticas (CHAMBERS, 2001).

Em 1959, a meticilina foi introduzida para o tratamento das infeces causadas por S.

aureus resistentes a penicilinas. No entanto, em 1961, no Reino Unido, ocorreram os

primeiros relatos de cepas isoladas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA methicilin

resistant S. aureus), que rapidamente apareceram em outros pases europeus, com surtos

hospitalares provocados por estes organismos. Rapidamente, houve relatos de MRSA isolados

no Japo, Austrlia, Estados Unidos e na Amrica Latina (POWERS, 2004). A resistncia

meticilina e oxacilina se deve a alterao na expresso das protenas de ligao a penicilina

(PBPs), onde uma variante mutante, a PBP2a tem menor afinidade pelos antibiticos -

lactmicos, mantendo suas funes na fisiolgica do microrganismo, garantindo sua

multiplicao (MALOUIN; BRYAN, 1986).

Uma vez que a grande maioria dos clones de MRSA, internacionalmente disseminados

nos hospitais, apresentava frequentemente multirresistncia a drogas, a vancomicina tornou-se

o antibitico de escolha para o tratamento das infeces causadas por esses microrganismos.

A vancomicina um glicopeptdio conhecido desde 1956, mas no foi utilizado anteriormente

devido o sucesso da meticilina, da oxacilina e de outras isoxazolilpenicilinas (MAINARDI et

al.,1995). Os glicopeptdeos, como vancomicina e teicoplanina, ainda constituem a

teraputica de escolha nas infeces por MRSA. Contudo, h relatos de cepas de S. aureus

apresentando susceptibilidade reduzida aos glicopeptdeos, isolados com resistncia

intermediria vancomicina (VISA) e os resistentes vancomicina (VRSA) no Japo e nos

Estados Unidos (CENTERS FOR DISEASE CONTROL PREVENTION, 2002;

HIRAMATSU et al., 1997).

A resistncia a drogas de patgenos humanos e animais um dos casos mais bem

documentados de evoluo biolgica e um srio problema, tanto em pases desenvolvidos

como em desenvolvimento. Baquero e Blzquez (1997) relataram o perigo do retorno a uma

era pr-antibitico, particularmente considerando que nenhuma nova classe de antibitico foi

descoberta nos ltimos anos, apesar das intensas pesquisas das indstrias farmacuticas. Em

vista do presente cenrio, a busca por novas substncias antimicrobianas a partir de fontes

22

naturais, como as plantas, tem ganhado importncia nas companhias farmacuticas

(DUARTE, 2006).

Entre os anos 1980-2000, as principais ferramentas utilizadas para a busca de novos

antibiticos foram a genmica e as triagens de colees de compostos, em detrimento s

triagens de produtos naturais microbianos. Porm, houve uma reduo dramtica na

identificao de novos prottipos antibiticos, ao mesmo tempo em que ocorreu um aumento

na incidncia de resistncia bacteriana (GUIMARES et al., 2010). Dentre as razes que

justificam a necessidade urgente do surgimento de novos agentes antibiticos podemos

destacar: as doenas infecciosas que so a segunda maior causa de mortalidade do mundo; as

altas taxas de resistncia microbiana em ambientes hospitalares; o decrscimo constante

observado no nmero total de novos agentes antimicrobianos aprovados pelo FDA; e a

necessidade de agentes que atuem por mecanismos de ao diferentes aos atuais frmacos em

uso, com maior seletividade e menor toxicidade (GUIMARES et al., 2010).

As plantas podem contribuir na descoberta de novos antibiticos na medida em que

possvel que metablitos secundrios com atividade antimicrobiana sejam biossintetizados

para prevenir e/ou combater o ataque de microrganismos patognicos s plantas. Gibbons

(2004) cita vrios exemplos de metablitos isolados de plantas frente Staphylococcus sp. As

plantas so possuidoras de vrias vias metablicas que do origem a compostos, tais como,

fenis, terpenos, alcalides, lecitinas, polipeptdios e poliacetilenos. Alm dessas classes,

outras substncias de origem vegetal mostram certa atividade antimicrobiana, como:

poliaminas, isotiocianatos, tiossulfinatos e glicosdeos (NOGUEIRA, 2000). Os vegetais ricos

em taninos, flavonides, leos essenciais e poli fenis esto entre os extratos mais avaliados

para esta atividade (COUTINHO et al., 2008). Deste modo, a diversidade de molculas

encontradas nas plantas faz das mesmas promissoras fontes de novos agentes antimicrobianos

(COUTINHO et al., 2008).

Os trabalhos relacionados atividade atimicrobiana de plantas tiveram incio na

dcada de 1940. Em 1943, Osborn pesquisando a atividade de 2300 plantas superiores contra

S. aureus e Escherichia coli, verificou que as plantas pertencentes a 63 gneros continham

substncias que inibiam o crescimento de um ou de ambos os microrganimos (PEDERSON;

FISHER, 1984). No Brasil, as pesquisas sobre substncias antimicrobianas de origem vegetal

iniciaram-se com Cardoso e Santos (1948) que avaliaram extratos de 100 diferentes plantas

indicadas em teraputica popular como anti-inflamatrios ou cicatrizantes/antimicrobianos.

Destas plantas, cinco extratos apresentaram atividade contra S. aureus, Escherichia coli e

Proteus X-19 (SANDERS; WEATHERWAX; MCCLUNG, 1945).

23

O estudo cientfico de plantas medicinais usados na medicina tradicional essencial

para diminuir os riscos de efeitos adversos para a populao, comprovar a atividade biolgica

das plantas e perpetuar o conhecimento tradicional sobre essas plantas medicinais. Tambm

importante que sejam realizados estudos para garantir que estes frmacos naturais sejam

seguros, estveis, padronizados e mais seletivos quanto a sua atividade biolgica.

Os produtos naturais so responsveis diretamente ou indiretamente por cerca de 40%

de todos os frmacos disponveis na teraputica moderna e, se considerarmos os usados como

antibiticos e antitumorais, esta porcentagem pode chegar a aproximadamente 70%

(PHILLIPSON, 2001; YUNES; CALIXTO, 2001). Os compostos isolados de plantas so

substncias com estruturas qumicas bem diferenciadas dos antimicrobianos obtidos a partir

de bactrias, leveduras e fungos. Tais produtos podem atuar no metabolismo intermedirio

ativando enzimas no nvel nuclear ou ribossomal, provocando alteraes nas membranas ou

interferindo no metabolismo (ESTEVAM, 2006).

No Brasil, a investigao sobre produtos naturais com atividade antimicrobiana contra

MRSA tambm aumentou significativamente nos ltimos anos. Machado et al. (2003)

estudando 14 extratos de plantas usadas tradicionalmente no Brasil para tratamento de

doenas infecciosas, verificaram que Punica granatum (rom) inibiu linhagens de S. aureus

sensveis e resistentes (MRSA) a meticilina, concluindo que esta substncia apresenta

potencial como agente no tratamento de infeces causadas por MRSA. Silva et al. (2007)

avaliaram a ao antimicrobiana do extrato hidroalcolico da casca do caule de Anacardium

occidentale (cajueiro) sobre MRSA e obtiveram Concentrao Inibitria Mnima (CIM) de

6,25 mg/mL do extrato, para 4 amostras MRSA. A atividade antimicrobiana positiva do

extrato do cajueiro frente a amostras de S. aureus, pode ser devido presena de compostos

como taninos (compostos polifenlicos) e alcalides previamente encontrados na planta, uma

vez que estes compostos tm comprovada ao antimicrobiana, e que compostos fenlicos

possuem uma ao inespecfica sobre o microrganismo, rompendo a parede celular bacteriana

e inibindo os sistemas enzimticos para a formao da mesma (HASLAM, 1996; JORGE et

al., 1996; AKINPELU, 2001).

Agente modificador de resistncia ou da atividade antibitica um termo usado para

substncias que modulam ou mesmo revertem resistncia bacteriana a certos antibiticos, ou

seja, potencializam a atividade de um antibitico contra uma cepa resistente (DE MARCO;

CUSHING; FREMPONG-MANSO, 2007; GIBBONS, 2004). Dentre esses modificadores,

destacamos vrios produtos naturais de origem vegetal (extratos e fitoconstituintes) que

alteram a susceptibilidade microbiana aos antibiticos por inibio de bombas de efluxo

24

(GIBBONS, 2004). A reserpina um composto isolado da planta Rawolfia serpentina

conhecida como inibidora de bomba de efluxo (EPI - efllux pump inhibitors), em vrios

microrganismos multirresistentes, incluindo S. aureus (GIBBONS; OLUWATUYI; KAATZ,

2003; STAVRI et al., 2007; OLUWATUYI; KAATZ; GIBBONS, 2004). Entretanto, a

toxicidade da reserpina e seus efeitos adversos em seres humanos, mesmo em baixas

concentraes (MASHOUR; LIN; FRISHMAN, 1998), limitou o seu uso, justificando-se

assim a busca de EPIs alternativas. Mohtar et al. (2009) avaliou o potencial de 13 alcalides

como inibidores e/ou agentes modificadores da resistncia atravs da inibio da bomba de

efluxo contra S. aureus sensvel meticilina (MSSA) e em cinco outros MRSA isolados,

apresentando diferentes nveis de susceptibilidade vancomicina. A notvel atividade

inibitria de efluxo foi detectada pelo quinino, piperina e harmalina, usando a reserpina como

controle positivo. Os resultados deste estudo sustentam a opinio de que um grande nmero

de fitocompostos possui potencial farmacolgico e ainda no foram descobertas.

2.2 RESISTNCIA MICROBIANA E INFECES HOSPITALARES

2.2.1 Resistncia microbiana

O uso indiscriminado dos antimicrobianos na comunidade e tambm no ambiente

hospitalar um fator de risco importante para aparecimento e disseminao da resistncia

microbiana (ANVISA, 2005). A presso de seleo de microrganismos resistentes pelos

antimicrobianos consequente no s ao uso teraputico ou profiltico destas drogas em

medicina e odontologia humanas, como tambm de seu emprego em medicina veterinria, na

conservao de alimentos, no combate a elementos biolgicos daninhos aos seres humanos e

na engorda de animais destinados alimentao. Em geral, bactrias tm a habilidade

gentica de transmitir e adquirir resistncia a drogas usadas como agentes teraputicos

(NASCIMENTO et al., 2000), pois so frequentes os relatos sobre isolamentos de bactrias

que eram reconhecidamente sensveis as drogas de uso na rotina, mas que se tornam

resistentes a todos, ou a quase todos, frmacos disponveis no mercado (SAKAGAMI;

KAJAMURA, 2002).

25

As bactrias podem desenvolver resistncia aos antibiticos por meio de alguns

mecanismos bioqumicos j bem difundidos na literatura (JACOBY, 2005; HOOPER, 2005;

BOMONO; SZABO, 2006; MIN et al., 2007). Esses mecanismos incluem:

a) modificao qumica do antibitico, atravs de enzimas especficas;

b) alterao do stio de ligao do antibitico;

c) substituio do stio de ligao da droga;

d) diminuio da permeabilidade ao antibitico;

e) aumento da sntese de substrato com o qual a droga compete;

f) efluxo do antibitico, por intermdio de transporte ativo (ROUVEIX, 2007)

g) sntese de protenas protetoras dos ribossomos.

Esses mecanismos podem coexistir em uma mesma cepa bacteriana que, ainda pode

desenvolver resistncia cruzada contra distintos antibiticos (NEU, 1992; GOLD;

MOELLERING, 1996; RUSSEL, 2002; CHOPRA et al., 2002). A resistncia pode ser

consequncia da ao de outros fatores, como o stio de infeco onde se encontra a cepa

bacteriana e a concentrao do antibitico.

A colonizao por S. aureus, especialmente envolvendo amostras multirresistentes, em

pacientes hospitalizados e profissionais de sade, representa um srio problema para a sade

pblica (SCOTT; BLOOMFIELD, 1990). O Ministrio da Sade (MS), na portaria n 2.616

de 12/05/1998, define infeco hospitalar (IH) como a infeco adquirida aps a admisso do

paciente na unidade hospitalar e que se manifesta durante a internao ou aps a alta, quando

puder ser relacionada com a internao ou procedimentos hospitalares. So tambm infeces

hospitalares aquelas manifestadas aps 72 horas da internao, quando associadas a

procedimentos diagnsticos e/ou teraputicos, realizados durante este perodo (BRASIL,

1998).

2.2.2 Infeces hospitalares (IH)

As infeces hospitalares constituem atualmente um problema de sade pblica.

Inferncias epidemiolgicas as colocam como uma das principais causas de

morbimortalidade, alm de constiturem significativa carga social, emocional e econmica

para os pacientes e para todo o sistema de sade. No Brasil, mesmo com a legislao vigente

no pas, os ndices de IH permanecem altos, em torno de 15,5%, o que corresponde a 1,18

episdios de infeco por paciente internado nos hospitais brasileiros. Alm disso, considera-

se mais um agravante, o fato das instituies pblicas de sade possurem a maior taxa de

26

prevalncia de IH no pas, com 18,4% (PRADE, 1995). Uma infeco hospitalar acresce, em

mdia, 5 a 10 dias ao perodo de internao. Alm disso, os gastos relacionados a

procedimentos diagnsticos e teraputicos da infeco hospitalar fazem com que o custo do

tratamento dos clientes com IH seja trs vezes maior que o custo dos clientes sem infeco.

Dados da literatura internacional demonstram, por exemplo, que as unidades de terapia

intensiva so propcias ao aparecimento e disseminao da resistncia microbiana. Os

pacientes mais vulnerveis para adquirirem bactrias multirresistentes so os internados em

setores crticos do Hospital, como Unidades de Terapia Intensiva, Berrio de neonatos, Setor

de Dilise e Transplantados, ou que necessitem de observao mais rigorosa e utilizao de

procedimentos teraputicos invasivos (RICHARDS et al., 1999; 2000). Os pacientes desses

ambientes esto em estado mais grave e so submetidos aos vrios procedimentos invasivos

que regionalmente utilizam antibiticos de amplo espectro de ao. Alguns locais e materiais

reutilizados nos hospitais so descritos na literatura como fatores de risco para a aquisio de

microrganismos antibitico-resistentes, para o surgimento de infeces nosocomiais e a

disseminao destes como algumas cepas de estafilococos e bacilos Gram-negativos.

Outra caracterstica, que contribui para a sua persistncia em hospitais, a capacidade

dessas cepas de sobreviver por longos perodos de tempo fora do corpo humano (KRAMER;

SCHWEBKE; KAMPF, 2006). Estudos sobre as caractersticas do biofilme formado pelos S.

aureus revelaram que essas cepas so capazes de persistir por at 7 meses sobre superfcies

inanimadas secas (SCOTT; BLOOMFIELD, 1990; WAGENVOORT; PENDERS, 1997;

NEELY; MALEY, 2000), principalmente se essas superfcies forem plsticas (KRAMER;

SCHWEBKE; KAMPF, 2006). As superfcies inanimadas e os equipamentos so possveis

fontes de bactrias, principalmente as resistentes (DREES et al., 2008; KAYABAS et al.,

2008). No raramente apontada a contaminao de equipamentos, superfcies e solues de

limpeza por microrganismos de importncia epidemiolgica. Estes dados se tornam

extremamente relevantes em hospitais, onde as superfcies esto frequentemente

contaminadas com patgenos nosocomiais e em contato com as mos, representam

importantes vetores de transmisso cruzada.

Alguns locais e materiais reutilizados nos hospitais so descritos na literatura como

fatores de risco para a aquisio de microrganismos antibitico-resistentes, para o surgimento

de infeces nosocomiais e a disseminao destes como algumas cepas de estafilococos e

bacilos Gram-negativos. Amrutkar et al. (2006) citam que existem vrios outros fatores de

risco que podem colocar os pacientes em risco de candidemia e bacteremia, como o uso de

materiais termossensveis que so desinfetados e reutilizveis, incluindo-se cateteres

27

intravenosos, instrumentos para nutrio parenteral, ventilao mecnica, entre outros

materiais como mscara de nebulizadores (CATHERINE et al., 2007; KIKUCHI et al., 2007).

Os profissionais da sade tambm tm sido apontados, por meio de suas mos, como

importantes fatores de disseminao do MRSA no ambiente hospitalar. Estes profissionais

adquirem transitoriamente o microrganismo atravs do contato com o paciente infectado, ou

mesmo, colonizado, ou ainda pelo contato indireto, atravs do ambiente, via reservatrios

inanimados (BOYCE; POTTER-BYNOE; CHENEVERT, 1997).

No Brasil, a frequncia de isolamento de S. aureus MRSA e sua relao com infeces

hospitalares atingem valores elevados. Em muitos hospitais brasileiros, a prevalncia de

isolamento de cepas de MRSA varia de 40 a 80% (OLIVEIRA et al., 2001; TRINDADE et

al., 2005). Um estudo realizado no Hospital Espanhol em Salvador (BA) demonstrou que em

9 anos a prevalncia dessas bactrias resistentes meticilina/oxacilina foi de 28%, sendo que

os lugares com maior deteco dessas bactrias foram a UTI (59%), a unidade de hemodilise

(43%), unidade de doenas infectocontagiosas (34%), unidade neonatal (18,5%) quando

comparados com os outros locais do hospital (BRITES et al., 2006). Foram relatados por

Souza e Figueiredo (2008), 68 casos de infeces atribudas ao S. aureus resistente oxacilina

entre fevereiro de 2003 a janeiro de 2006 no Hospital Universitrio Regional de Maring. A

avaliao de diferentes materiais clnicos detectou maior prevalncia de isolamento em pontas

de catter (39,2%) e em secrees orotraqueais (34,2%).

Cepas de S. aureus resistentes meticilina, enterococos resistentes vancomicina e

bastonetes Gram negativos multirresistentes esto tornando prevalentes tambm em hospitais

infantis (BIZARRO; GALLAGHER, 2007). A vancomicina era o nico antibitico efetivo

contra os MRSA, mas, em 1997, foram descritos S. aureus com resistncia vancomicina e

teicoplanina. Estafilococos com resistncia aos glicopeptdeos foram recentemente

encontrados no Brasil. Registrou-se o isolamento de S. aureus com resistncia intermediria

vancomicina no Rio de Janeiro, em So Paulo e Porto Alegre e de estafilococos coagulase

negativos resistentes vancomicina e teicoplanina em So Paulo (OTLIA; 1999;

MAMIZUKA; OLIVEIRA, 2000).

Assim, a aquisio de MRSA pode levar a consequncias adversas graves para os

pacientes, alm de ampliar o tempo de hospitalizao e aumentar os custos relacionados com

a assistncia mdico-hospitalar (HUANG; PLATT, 2003). Deste modo, nos ltimos anos, as

indstrias farmacuticas tm sido motivadas para o desenvolvimento de novas drogas

antimicrobianas, especialmente em funo da ocorrncia de resistncia microbiana a tais

medicamentos.

28

2.3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

2.3.1 Staphylococcus aureus

Os microrganismos do gnero Staphylococcus pertencem famlia Micrococcaceae e

apresentam forma de coco, tendendo a formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva.

So gram positivos, possuindo dimetro variando entre 0,5 e 1,5 m, imveis e no formam

esporos. Possuem metabolismo fermentativo e respiratrio, neste ltimo, vindo a produzir

catalase (VARNAN; EVANS, 1991; KLOOS; BANNERMAN, 1999). Crescem em meios

comuns, pH 7, temperatura de 37C. O gar manitol-sal um meio seletivo para essa

espcie, devido capacidade desse microrganismo fermentar o manitol com produo de

cido ltico. As colnias formadas, aps 18-24 horas de incubao, so arredondadas, lisas e

brilhantes. A cor da colnia varia do acinzentado ao amarelo-ouro. Na cultura em gar sangue

caracterstica a formao de um halo de beta hemlise ao redor das colnias (KONEMAN et

al., 2001).

Staphylococcus spp. possui uma distribuio ubiquitria, sendo seu reservatrio

primrio a pele e membranas mucosas, especialmente a regio nasofarngea de mamferos e

aves (ATANASSOVA; MEINDL; RING, 2001). Atualmente, o gnero composto por 38

espcies e 24 subespcies (EUZBY, 2005), sendo que algumas so frequentemente

associadas a uma ampla variedade de infeces de carter oportunista, tanto em seres

humanos como em animais (TRABULSI; TEIXEIRA; BUERIS, 2004). Dentre estas espcies,

destaca-se S. aureus como a mais envolvida em doenas em seres humanos (KONEMAN et

al., 2001).

Os S. aureus so normalmente encontrados colonizando a pele e membranas mucosas

de humanos. Elevadas concentraes desse microrganismo podem estar colonizando as axilas,

poro anterior das narinas e o perneo. Porm, essas bactrias tambm podem estar

distribudas em outros nichos, como orofaringe, boca, vagina, trato intestinal e glndulas

mamrias (WERTHEIM et al., 2005). A capacidade de um patgeno de superar as defesas do

organismo humano, conseguir coloniz-lo e manifestar a sua patogenicidade so os fatores

responsveis pela variao no quadro de sinais e sintomas que caracterizam as patologias

(CARDOSO et al., 2007; ROUVEIX, 2007). A patogenicidade das bactrias determinada

29

pelo desenvolvimento de mecanismos que contribuem para o aumento de sua capacidade de

infeco e que ajudam a burlar o sistema imunolgico do hospedeiro (CHOPRA et al., 2002).

O S. aureus tambm o principal patgeno envolvido em uma grande variedade de

manifestaes clnicas, tais como infeces de feridas, pneumonia, septicemia e endocardite

tanto em pases desenvolvidos como os Estados Unidos, e tambm aqueles em

desenvolvimento. um microrganismo nico quando comparado a outros clinicamente

relevantes, pois apresenta trs caractersticas fundamentais: apresenta uma srie de fatores de

virulncia, apresenta capacidade crescente de desenvolver resistncia a antibiticos, e

responsvel por infeces nosocomiais e comunitrias (JACOBSSON, 2009). Agentes

antimicrobianos -lactmicos, como a penicilina, so os frmacos de escolha para o

tratamento das infeces graves por S. aureus. Contudo, a partir da introduo dos mesmos a

partir da dcada de 1940, rapidamente surgiram cepas resistentes, por meio da produo de -

lactamases (penicilinases), enzimas que inativam tais frmacos. A seguir, foram introduzidas

novas drogas resistentes ao das -lactamases, tais como a meticilina no uso clnico,

surgindo posteriormente o S. aureus resistente meticilina.

O S. aureus resistente meticilina (MRSA) surgiu a partir de 1960, como importante

patgeno hospitalar em todo o mundo (CHAMBERS, 2009; DIEKEMA et al., 2001;

HIRAMATSU et al., 2002). Inicialmente, restritas ao ambiente hospitalar (hospital-acquired

methicillin resistant S. aureus, HA-MRSA), as cepas resistentes tomaram um novo perfil a

partir da dcada de 1990, com infeces comunitrias (community-acquired methicillin

resistant S. aureus, CA-MRSA) relevantes em indivduos saudveis e no sujeitos aos fatores

de risco do ambiente hospitalar, tais como cirurgias, imunossupresso e outros

(KOBAYASHI; DeLEO, 2009). O aumento da prevalncia de MRSA tornou-se uma grande

ameaa para o setor da sade em todo o mundo, devido principalmente sua virulncia,

opes teraputicas limitadas e sua distribuio em ambos os ambientes, hospitalar e

comunidade (HULETSKY et al., 2004).

A resistncia dos S. aureus a meticilina causada principalmente pela aquisio

exgena do gene mecA, que codifica uma protena de ligao penicilina (PBP penicilin

binding protein) com baixa afinidade de ligao ao antibitico, denominada por PBP2a ou

PBP2 (HIRAMATSU et al., 2001).

O gene mecA, confere a expresso da resistncia meticilina/oxacilina em S. aureus.

O gene mecA carreado por um elemento gentico mvel de 26 a 67 kilobases, denominado

cassete cromossmico estafiloccico (staphylococcal cassette chromosome mec - SCCmec)

30

(KURODA et al., 2001), responsveis por codificar a protena de ligao alterada, resultando

no quadro de multirresistncia. O sequenciamento de vrias linhagens de MRSA tem revelado

oito diferentes altipos de SCCmec, tipos I-V, todos carreando dois componentes genticos

essenciais combinados, conhecidos como complexo gnico mec e o complexo gnico cassete

cromossmico recombinase (ccr). Os isolados de MRSA associados ou adquiridos na

comunidade (CA-MRSA) apresentam caractersticas fenotpicas e genticas distintas, quando

comparadas s cepas tpicas isoladas nos hospitais (HA-MRSA). O SCCmec tipo I (34 kb) foi

detectado na cepa NCTC 10442, o primeiro MRSA isolado em 1961, no Reino Unido. O tipo

II (52 kb) foi identificado em uma cepa de MRSA, isolada no Japo em 1982, denominada

N315, e o tipo III (66 kb) foi identificado em uma cepa de MRSA, isolada em 1985 na Nova

Zelndia e foi denominada 82/2082.

Posteriormente, foi identificado em duas cepas associadas a infeces comunitrias, o

menor elemento mec, o tipo IV (20 a 24 kb), que confere aos MRSA um perfil de

sensibilidade diferente dos outros trs tipos, sendo sensvel s outras classes de

antimicrobianos, que no os -lactmicos. (DUARTE; LENCASTRE, 2002; OKUMA et al.,

2002). O mec tipo V (28kb) foi descrito a partir do cromossomo de uma cepa de MRSA, de

origem comunitria, isolada na Austrlia, denominada WIS (WBG8318). Este elemento foi

estruturalmente similar ao SCCmec tipo IV. (ITO et al., 2004). No final de 2006, outro tipo

SCCmec foi proposto - o tipo VI. Cepas caractersticas deste tipo possuem o complexo mecB,

o ccrAB altipo 4 e uma regio especfica J1. Quinze cepas de MRSA contendo SCCmec

tipoVI foram inicialmente descritas no hospital Dona Estefnia (Lisboa) e outras quatro cepas

foram encontradas em outros trs hospitais, sendo dois tambm situados em Lisboa e outro em

Coimbra (OLIVEIRA; MILHEIRIO; DE LENCASTRE, 2006).

Em 2008, Higuchi et al.(2008) demonstrou a presena do SCCmec tipo VII, em cepas

CA-MRSA pertencendo ao tipo de sequncia multilocus (ST) 59 de Taiwan, tinha 41.347

pares de base em tamanho e flanqueado por 19 pares de bases de sequncias attL e attR. A

regio central de 21.245 pares de bases contm o complexo mec (C2b) e outro ccrC gene

(ccrC2), e era altamente homlogo ao SCCmecV, mas com substituies, inseres e

rearranjos. A poro final do lado 3 apresentou uma sequncia nica de 10.191 pares de

bases.

Os SCCmec tipos I, II e III esto associados a cepas de origem hospitalar que tm

como caracterstica a resistncia a mltiplos antimicrobianos alm dos -lactmicos como os

macroldeos, aminoglicosdeos, tetraciclinas, rifampicina, cotrimoxazol e quinolonas

31

(HIRAMATSU et al., 1997). Muitos isolados de MRSA que apresentam mltipla resistncia

so susceptveis apenas aos glicopeptdeos como a vancomicina. Os SCCmec tipo IV e V no

possuem nenhum outro determinante de resistncia a antimicrobianos alm do gene mecA, o

que explica uma das principais caractersticas dos isolados comunitrios de MRSA, a

sensibilidade a diversos antimicrobianos no -lactmicos. (DUARTE; LENCASTRE, 2002;

ENRIGHT et al., 2002; OKUMA et al., 2002; ITO et al., 2004).

O complexo gene mec corresponde s regies do gene mecA e dos reguladores para a

expresso do mecA (mecR1 e mecI), e ainda o complexo gene ccr, correspondendo regio

onde se encontram os genes para as recombinases, as quais so responsveis pela mobilidade

do SCCmec. O gene mecA um segmento de DNA exgeno, ou seja, que no nativo do S.

aureus, de 2,1 Kb, e controlado pelos genes mecR1 e mecI. O produto do gene mecI reprime

a expresso do mecA ao se ligar ao operador, sendo esta represso revertida pela presena

de meticilina ou qualquer outro -lactmico no meio (mecanismo de induo). J a protena

mecR1, um produto do gene mecR1, uma protena de membrana envolvida em um sistema

de transduo de sinal, a qual reconhece a presena de -lactmicos atravs de seu domnio

extracelular ligador penicilina. Seu domnio citoplasmtico apresenta atividade de protease e

degrada o mecI, permitindo assim a transcrio do gene mecA. (McKINNEY et al., 2001).

Alm desses genes, outros elementos genticos tambm podem estar presentes, dentre

eles os elementos de insero IS431 e IS257, os plasmdeos pUB110 e pT181 e o transposon

Tn554, que carreia genes de resistncia eritromicina e espectinomicina. Em adio, a

presena de mais de uma cpia do IS256 parece servir como hot spot (regies de elevada

frequncia de recombinaes) para a insero de outros genes de resistncia s drogas. Assim,

torna-se claro o porqu dos MRSA apresentarem, frequentemente, mltipla resistncia aos

antimicrobianos associado presena do gene mecA (KATAYAMA; ITO; HIRAMATSU,

2000).

O gene mecA regulado pelos genes mecI e mecR1, similarmente regulao do blaZ

pelos genes blaI e blaR1 frente exposio penicilina. Na verdade, mecI e mecR1 so

homlogos ao blaI e blaR1. A expresso dessa resistncia pode ser homognea ou

heterognea. Na expresso homognea todas as colnias expressam resistncia oxacilina e

na heterognea expressa apenas por parte das colnias apesar da presena do gene mecA,

dificultando a interpretao do teste (ROSSI; ANDREZZI, 2006).

Alguns genes, denominados genes auxiliares ou fatores essenciais, o gene fem (factor

essential for methicilin resistance), auxiliam o gene mecA a expressar um alto nvel de

resistncia aos beta-lactmicos. Foram identificados muitos desses genes fem, denominados

32

femA, femB, femC, femD, femE e femF (VANNUFFEL et al., 1995). O gene femA essencial

para a expresso da resistncia dos MRSA e parece ser uma caracterstica peculiar de S.

aureus, no sendo encontrado em outras espcies de estafilococos. Outro importante

mecanismo de resistncia o efluxo em MRSA, sendo este identificado como um dos

principais contribuintes para a resistncia de vrios antibiticos estruturalmente

independentes. As bombas de efluxo so protenas integrantes da membrana plasmtica

bacteriana e que tm sido responsabilizadas por diversos casos de resistncia a drogas, as

quais so expelidas para fora da clula (PIDDOCK, 2006).

2.3.2 Fatores de virulncia de S. aureus

A capacidade de colonizao e patogenicidade de S. aureus so provenientes de seus

fatores de virulncia. Tais fatores permitem sua aderncia s clulas do hospedeiro ou

matriz extracelular, invadem as defesas imunolgicas e proporcionam a invaso celular,

penetrao tecidual ou adeso a superfcies de catteres e prteses. Esses diferentes

mecanismos de sobrevivncia, que partem dos constituintes de parede celular e da produo

de enzimas e toxinas oferecem proteo ao microrganismo e permitem sua disseminao

(VELZQUEZ-MEZA, 2005). As leses superficiais decorrentes de S. aureus incluem

infeces cutneas como impetigo, foliculite, terol, furnculo, carbnculo e mastite

(LEVINSON; JAWETZ, 2005). Em carter sistmico pode ocasionar pneumonia, artrite,

endocardite e bacteremia (STAPLETON; TAYLOR, 2002). S. aureus tambm esto

relacionados osteomielites. A expresso de adesinas que permitem a fixao aos

componentes da matriz ssea, o fato de sobreviver intracelularmente em osteoblastos e a

capacidade de formar biofilmes na superfcie de materiais estranhos ao organismo como as

prteses, armam em conjunto, proteo contra o sistema imunolgico do hospedeiro e tornam

essas cepas tolerantes ao dos antimicrobianos (DAVIS, 2005).

A formao do biofilme bacteriano tem sido descrita desde que Van Leeuwenhoek

descreveu as placas bacterianas de seus prprios dentes no sculo XVII. Entretanto, demorou

at 1978 para que houvesse o entendimento da importncia dessas estruturas nos

ecossistemas, e seu significado mdico, por meio dos conhecimentos obtidos para explicar sua

estrutura e relevncia. (DONLAN; COSTERTON, 2002).

Biofilmes so complexas comunidades microbianas fixadas em uma superfcie e

embebidas em uma matriz extracelular. Estas comunidades podem se fixar em uma grande

33

variedade de superfcies com composies qumicas diversas. Esforos tm sido realizados

para compreender como se d o processo de adeso, desenvolvimento e maturao dos

biofilmes, assim como a sua capacidade de desagregamento e disperso, disseminando-se para

outras superfcies (BOLES; HORSWILL, 2011).

Do ponto de vista mdico, a formao de biofilmes representa um importante

mecanismo de virulncia microbiano, pois ao aderir a superfcies e produzir uma matriz

polissacardica, o microrganismo garante a continuidade do processo infeccioso, assim como

maior resistncia aos mecanismos imunolgicos do hospedeiro e tambm maior resistncia

aos antimicrobianos que as clulas planctnicas do mesmo agente patognico (RODRGUEZ-

MARTNEZ; PASCUAL, 2008; BRYERS, 2008).

H uma clara percepo de que as clulas bacterianas em crescimento nos biofilmes se

comportam distintamente das clulas com crescimento planctnico, com alterao no padro e

na taxa de expresso gnica de molculas essenciais para seu metabolismo, assim como de

fatores de virulncia (MACK et al., 2004). Nestas situaes, assume papel preponderante um

sistema de intercomunicao celular conhecido como quorum sensing, que constitudo por

pequenas molculas secretadas pelas clulas bacterianas (AIP- autoinducing peptide)

moduladas pelo complexo gnico agr (acessory gene regulator) e tambm pelos complexos

SarA e RNAIII, dentre outros (YARWOOD et al., 2004). Foi demonstrado que nas populaes

bacterianas em biofilme existem variantes que expressam distintamente fatores de

virulncia relacionados ao processo de adeso e crescimento bacteriano dos prprios

biofilmes, como as adesinas, fibronectinas entre outros, e que so geralmente modulados pelo

complexo agr (YARWOOD et al., 2007).

A formao do biofilme um processo dividido em etapas que depende da aderncia

do microrganismo superfcie a ser colonizada, seguida da secreo das molculas de adeso

intercelulares, secreo da matriz polissacardica, consolidao da estrutura e em seguida o

destacamento de fraes ou pedaos que facilitam a disperso e persistncia da infeco. O

fundamental neste processo a produo da adesina polissacardica intercelular (PIA

polyssacaridic intercelular adhesin) que codificada pelo operon ica (intercelular adeshin

locus) (FLUCKIGER et al., 2005) nos S. aureus.

Tal operon contm os genes icaA, icaB, icaC, icaD que produzem enzimas

responsveis pela sntese do principal componente da PIA, o polissacardeo poli-N-succinil--

1,6-glicosamina (PNSG), que apresenta resposta imunognica e tem sido testado como

potencial alvo de vacinas; alm do gene icaR um modulador negativo do sistema de expresso

(WILSON et al., 2011). O gene icaA responsvel pela produo de protena transmembrana

34

com funo de N-acetil-glucosamina transferase, e que para a sua tima atividade, requer a

co-expresso do produto do gene icaD. O polissacardeo produzido alcana um tamanho

mximo de cerca de 20 resduos, sendo necessria a co-expresso do produto do gene icaC

para obteno de estruturas de maior extenso. O produto do gene icaC tambm est

envolvido na translocao do produto de sntese polissacardica para a superfcie celular,

enquanto o produto do icaB responsvel pela desacetilao do carboidrato que relevante

para os mecanismos de adeso intercelular e com as superfcies que so substrato para a

instalao do biofilme (OGARA, 2007). O papel dos genes icaA e icaD para formao de

biofilmes, tanto em S. aureus quanto S. epidermidis foi demonstrado a partir do isolamento de

microrganismos de catteres urinrios de pacientes, apresentando uma importante correlao

entre os isolados fortemente produtores de biofilme e a presena de tais genes nas espcies

estudadas (GAD et al., 2009).

O produto do gene icaR membro da famlia TetR de protenas regulatrias, e

localiza-se no mesmo locus, sendo divergentemente transcrito em relao ao icaADBC. Ele

responsvel pela regulao negativa, ligando-se ao promotor 5 do cdon de inicializao do

gene icaA. A transcrio de icaADBC tambm regulada positivamente pelo regulador

global SarA e pelo fator SigB em condies de stress e por algumas cepas (CUE et al., 2009)

Alm disso, estudos recentes tm demonstrado mecanismos independentes do operon

ica e da presena de PIA para formao de biofilmes, pois isolados que no possuem esses

genes, isolados defectivos, tm mantido esta propriedade patognica. O papel dos reguladores

globais agr e SarA tm sido elucidado, atuando de formas divergentes, enquanto o sistema

SarA est envolvido no ataque e adeso s superfcies, o sistema agr parece estar envolvido

nos mecanismos de disperso (LAUDERDALE et al., 2009)

Anlise de isolados clnicos de S. aureus das infeces de prteses articulares,

bacteremia, ou infeces relacionadas a cateteres demonstraram a presena do locus ica na

maioria dos isolados, mas porcentagens variantes dessas cepas apresentaram falta de produo

de PIA in vitro (ARCIOLA; BALDASSARRI; MONTANARO, 2001; CRAMTON, 1999,

2001; FOWLER, 2001; KNOBLOCH et al., 2002; MARTN-LPEZ et al., 2002;

PEACOCK, 2002; ROHDE et al., 2001). Recentes publicaes demonstram que outros

fatores influenciam a produo de PIA ou de biofilme, como glicose e outros acares, alta

osmolaridade e anaerobiose (CRAMTON, 2001; GERKE et al., 1998; KNOBLOCH et al.,

2001, 2002; MACK; SIEMSSEN; LAUFS, 1992; RACHID et al., 2000 ).

As fibronectinas estafiloccicas (fnbA e fnbB) tm sido amplamente investigadas pelo

seu papel de adeso as estruturas de clulas eucariticas in vitro e in vivo, sendo que tais

35

adesinas exercem participao relevante no processo de fixao aos tecidos colonizados e

internalizao por clulas fagocticas, e assim, contribuindo para o desenvolvimento do curso

letal da infeco (SHINJI et al., 2011). De fato, as fibronectinas estafiloccicas atuam como

MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules), ou

seja, so molculas capazes de reconhecer protenas presentes no plasma e na matriz

extracelular (fibronectina, fibrinognio e elastina) e expressam variao genotpica e

fenotpica, funcionando como mecanismo de evaso as aes do sistema imune (BURKE et

al., 2010).

Alm das fibronectinas, outros fatores de virulncia apresentam importncia para a

adeso tecidual e invaso celular, destacando-se a Protena A (Spa), o clumping factor A e B

(CflA e CflB), atuando tambm como mecanismos de evaso as respostas imunolgicas do

hospedeiro, tanto humano quanto animal (STUTZ; STEPHAN; TASARA, 2011). A protena

A (Spa), presente na maioria das cepas de S. aureus, capaz de interagir com diversos tipos

de receptores em clulas eucariticas, superfcies e plaquetas (HENRY-STANLEY et al.,

2011; NGUYEN; GHEBREHIWET; PEERSCHKE, 2000; MERINO et al., 2009) se liga a

poro Fc da molcula de IgG, alterando a ligao da imunoglobulina com receptores de

macrfagos e outras clulas fagocticas, alm de componentes sricos importantes pra defesa

imune, gerando efeitos anticomplementares, quimiotticos e antifagocitrios, funcionado

como mecanismo de evaso resposta do hospedeiro (STUTZ; STEPHAN; TASARA, 2011).

A capacidade de ligao da Spa com diversas estruturas contribui para a aderncia de

S. aureus as variadas superfcies levando sua persistncia nas infeces e a complicaes

dos quadros como endocardite (NGUYEN; GHEBREHIWET; PEERSCHKE, 2000),

formao de biofilmes em cateteres (HENRY-STANLEY et al., 2011) at mesmo em

ausncia de PIA (MERINO et al., 2009). Pode ainda desencadear a cascata pr-inflamatria

nas vias areas por ativao do receptor 1 de TNF- (DAVID; DAUM, 2010).

Os clumping factors A e B (CflA e CflB) so componentes da famlia das

MSCRAMMs capazes de se ligar ao fibrinognio no plasma humano e causar coagulao

intravascular. Ele tambm capaz de se ligar ao fator I, que estimula a clivagem do fragmento

C3b na superfcie de clulas de S. aureus, para sua forma inativa C3bi, que perde sua funo

de opsonina, com isso funcionando como um mecanismo de evaso da resposta imune para o

microrganismo (WILSON et al., 2011). A capacidade de se ligar a estruturas proteicas como

fibrinognio e outras protenas da matriz extracelular, alm de sua imunogenicidade, tem

levado a realizao de estudos que visam definir o papel dos CflA e CflB em patologias,

36

como a septicemia (COLQUE-NAVARRO et al., 2000) e a artrite sptica (JOSEFSSON et

al., 2001).

O S. aureus apresenta em sua parede celular, polissacardeos, protenas antignicas e

molculas como o cido teicico, o glicanopeptdio, a protena A, alm de cpsula e adesinas

que so capazes de induzir resposta imunolgica no hospedeiro (OLIVEIRA et al., 2001). O

cido teicico capaz de ativar a via alternativa do complemento e estimular a produo de

citocinas. O glicanopeptdio atua como agente quimiottico e induz a produo de interleucina

1 (IL-1) e opsoninas, facilitando a fagocitose. A cpsula protege o microrganismo da

fagocitose, tornando-o mais virulento e com maior capacidade de invaso tecidual. A cpsula

uma estrutura polissacardica que envolve a parede celular da maioria das cepas de S.

aureus, protegendo a bactria da fagocitose mediada pelo complemento (C3b) por parte dos

neutrfilos polimorfonucleares, aumentando a virulncia e a capacidade de invaso nos

tecidos e na corrente sangunea. As adesinas pertencem estrutura gelatinosa do glicoclix e

promovem a aderncia s clulas do hospedeiro atravs da interao com receptores qumicos

(VELZQUEZ-MEZA, 2005).

Alm disso, o S. aureus produz numerosas enzimas que favorecem a invaso e

destruio tecidual do hospedeiro, assim como a disseminao para demais stios anatmicos

(GORDON; LOWY, 2008). A mais conhecida a coagulase, caracterstica do prprio S.

aureus, que coagula o plasma, ocasionando um emparedamento do stio infectado, com o

objetivo de retardar a migrao de neutrfilos e dificultar a fagocitose celular (LEVINSON;

JAWETZ, 2005). Outras enzimas incluem a catalase, desoxirribonuclease (DNase),

hialu

universidade federal da bahia ufba instituto ... - mestrado... · martins de carvalho por existirem...

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