UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

CONRADO DE CAMPOS GONÇALVES

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE CHAPERONAS

ESSENCIAIS PARA A SOLUBILIZAÇÃO DE AGREGADOS PROTEICOS:

O PAPEL DE CHIP DE SORGHUM BICOLOR E DO SISTEMA DE

DESAGREGAÇÃO HUMANO ENVOLVENDO HSPB1.

CAMPINAS

2018

CONRADO DE CAMPOS GONÇALVES

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE CHAPERONAS ESSENCIAIS

PARA A SOLUBILIZAÇÃO DE AGREGADOS PROTEICOS: O PAPEL DE CHIP DE

SORGHUM BICOLOR E DO SISTEMA DE DESAGREGAÇÃO HUMANO

ENVOLVENDO HSPB1.

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Biologia Funcional e Molecular, na Área de Bioquímica.

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CONRADO DE CAMPOS GONÇALVES E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS

CAMPINAS 2018

Campinas, 29 de agosto de 2018

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos

Prof. Dr. Cláudio Chrysostomo Werneck

Profa. Dra. Ljubica Tasic

Profa. Dra. Juliana Helena Costa Smetana

Prof. Dr. Vadim Viviani

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

“Don’t panic”

Douglas Adams

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

que tornou possível a realização desta tese de doutorado através do apoio financeiro

concedido pela bolsa de doutorado no país (processo 2014/00076-0) e pela bolsa estágio de

pesquisa no exterior (BEPE - processo 2016/03764-0).

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) agradeço imensamente pela

oportunidade de frequentar desde a graduação uma das melhores universidades do país, o

que me propiciou um profundo crescimento profissional e humano. Em particular, agradeço

aos Institutos de Biologia e de Química, pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia

Funcional e Molecular e pela magnífica infra-estrutura e equipe de funcionários que

possibilitam o desenvolvimento de pesquisa e ensino de altíssima qualidade. Também

agradeço aos funcionários e às instalações do CNPEM (Centro Nacional de Pesquisa em

Energia e Materiais), onde se situam o LNBio (Laboratório Nacional de Biociências) e o LNLS

(Laboratório Nacional de Luz Síncronton) e onde foram realizados alguns experimentos aqui

mostrados.

Ao Prof. Dr. Carlos H. I. Ramos pela oportunidade de trabalhar em seu

laboratório, pela orientação ao longo desses anos e pela extensa contribuição para minha

formação, tanto em caráter teórico e experimental, quanto em caráter científico,

estimulando o pensamento crítico e propondo novas idéias.

Ao Prof. Dr. Jason Young e à McGill University, pela possibilidade de desenvolver

um projeto de pesquisa numa das universidades mais conceituadas no exterior, contribuindo

para meu amadurecimento científico e pessoal.

Aos membros da banca examinadora pela contribuição intelectual nesta etapa

final do trabalho para que a tese ficasse a melhor possível, particularmente agradeço ao

Prof. Dr. Claudio C. Werneck e à Profa. Dra. Juliana H. C. Smetana que participaram também

da banca da qualificação.

A todos os demais professores que de alguma forma participaram da minha

formação, desde o ensino básico até a pós-graduação. Em especial agradeço à Profa. Dra.

Fernanda R. Gadelha e ao Prof. Dr. Eduardo de F. Peloso por terem despertado em mim,

durante a iniciação científica, o interesse e a curiosidade necessários no início da carreira; e

ao Prof. Dr. Marcelo C. Dornelas, meu orientador durante o mestrado, pelos diversos

ensinamentos em biologia molecular e vegetal.

A todos os integrantes, passados e presentes, do grupo de pesquisa do Prof.

Carlos Ramos pelo apoio, ótima convivência e compartilhamento de experiências ao longo

desses anos. Particularmente agradeço a minha amiga Aline, pelas conversas, conselhos e

boas horas de almoço (mesmo que no bandejão). Agradeço também aos membros do grupo

do Prof. Jason Young, Michael, Yogita, Jeff, Imad e Sam pela gentileza, recepção, ótima

convivência e por terem feito minha adaptação muito mais fácil.

Aos meus amigos proteicos, Anne, Gláucia, Natália e Josi, por todas as

discussões, gritarias, risadas, aconselhamentos e conversas no (café) laboratório e fora dele.

Com certeza vocês fizeram o trabalho cotidiano muito mais produtivo e divertido, “como se

fossemos amigos”. Em especial, agradeço muito a essas duas mulheres maravilhosas: à

Gláucia por ter sido minha primeira tutora no laboratório e por todos os ensinamentos

teóricos e experimentais, químicos e biofísicos que possibilitaram esta tese de acontecer; e à

Anne por toda organização, ajuda, discussões, puxões de orelhas e planejamentos de

experimentos.

A todos meus amigos, hoje espalhados pelo mundo, mas que fizeram cada um a

seu modo e por certo tempo parte da minha trajetória, auxiliando a moldar minha

personalidade e trazendo momentos de muita alegria, diversão, aprendizado e ternura. Aos

meus amigos conterrâneos, agradeço muito a amizade do Henrique, Felipe, Erick, Gabriel e

Grace. As minhas delícias Edilene, Nati, Lia, Erica, Naty, Vicky e Camila sou muito grato por

ter tido a oportunidade de saber que pessoas tão maravilhosas existem e passaram pelo

meu caminho. Agradeço ainda ao Hugo, Lucas e Victor, com quem morei a maior parte da

graduação. Foram momentos muito bons e sinto muito a falta de todos.

À toda minha família, todos essenciais nessa trajetória, sou grato por todo apoio,

amor e respeito oferecidos ao longo de toda minha vida. Em especial, agradeço muito aos

meus tios Paulo e Ana pelo carinho. A minha prima Calissa, por todo apoio, apreço e

amizade. As minhas tias madrinhas Tata e Nei pela atenção, carinho e pelo esforço por

terem feito parte da minha educação e da construção do meu caráter durante a infância e

adolescência.

Aos meus avós queridos, Ercília e Daniel, a quem dedico este trabalho, por todo

carinho, humildade e honestidade que me foram transmitidos de forma tão simples e

natural, algo que nenhum doutorado é capaz de ensinar.

Agradeço ao meu irmão Rômulo pelo ótimo convívio e por todas as discussões,

muitas vezes calorosas, mas certamente produtivas, sempre abrindo minha cabeça para

diferentes possibilidades e visões de mundo.

Ao meu pai, Cláudio, pelo respeito e amor a seu modo, pelo incentivo ao estudo

desde muito cedo e pelo orgulho que transpassa barreiras.

A minha mãe, Tânia, pelo amor, pela garra, por toda ajuda e pela luta incansável

para oferecer aos filhos sempre a melhor condição de vida possível. Certamente minha mãe

personifica os conceitos de dedicação, abnegação e amor incondicional.

Ao meu companheiro, Fabilo, pelo conforto, paciência, amizade, amor e, acima

de tudo, pelo companheirismo em todas as horas, nos longos planos traçados para o futuro,

nos momentos de dificuldades e frustrações e nas decisões mais dificieis a serem tomadas.

E por fim, aos meus eternos nenéns, Lana e Marvin, pelo olhar, inocência,

lealdade e amor incontestáveis e impossíveis de serem encontrados em seres humanos.

Muito obrigado a todos.

Conrado de Campos Gonçalves

RESUMO

A regulação da homeostase celular realizada pelo sistema de controle de qualidade proteico (PQC) é

muito complexa e depende da ação de múltiplos processos orquestrados tanto pelas chaperonas

moleculares quando pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Em condições metabólicas normais, mas

principalmente em situações de estresse celular, é extremamente importante que todos esses

processos ocorram eficientemente, evitando assim o acúmulo de proteínas não funcionais que

podem gerar graves consequências para as células. Desse modo, o estudo estrutural e funcional das

proteínas que compõem o sistema PQC torna-se bastante relevante por produzir conhecimento com

alto potencial de gerar inovações terapêuticas e biotecnológicas. Neste trabalho, conduzimos nossos

estudos para a compreensão de duas proteínas muito importantes, cujas funções estão diretamente

relacionadas com o direcionamento do destino de substratos proteicos. Primeiramente, o objeto de

investigação foi a co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Assim, sua sequência gênica foi

identificada através da homologia com o ortólogo de Arabidopsis, clonada e utilizada para

superexpressão em E. coli. Após o estabelecimento de um protocolo de purificação, alguns

parâmetros conformacionais foram determinados. Nossos resultados indicam que essa co-chaperona

é um dímero alongado em solução, com estrutura rica em hélices-α e relativamente bem estável em

situações de estresse térmico. Além disso, caracterizamos a formação de complexos entre ela e a

chaperona Hsc70 e avaliamos sua atividade de auto-ubiquitinação e de ubiquitinação de outros

substratos proteicos. Outro alvo de investigação foi o papel da sHsp HspB1 no sistema humano de

desagregação de proteínas. Os resultados obtidos apoiam um modelo que explica o mecanismo de

desagregação no qual HspB1 ativada por fosforilação é responsável por co-agregar com

polipeptídeos desenovelados durante estresse térmico. Quando isso ocorre, o sistema da Hsp70,

formado por Hsp70, Hsp40 e Hsp110, é capaz de extrair peptídeos dos agregados e também

promover a dissociação de HspB1 em dímeros, sendo que esse processo permite uma desagregação

mais eficiente. Mostramos que a fosforilação de HspB1 é importante para ativação da proteína,

desestabilização dos oligômeros, mas não para a formação imediata de dímeros, a qual ocorre

durante o processo de desagregação, por estimulação das chaperonas. Os dímeros de HspB1 se

reorganizam espontaneamente em oligômeros permitindo o recomeço do ciclo para uma nova

rodada de desagregação, exceto para o mutante GPG onde a desestabilização foi forçada

artificialmente. De maneira geral, acreditamos que nossos resultados contribuem para o melhor

entendimento da relação entre estrutura e função de CHIP de uma planta e fornecem informação

para a compreensão do mecanismo de solubilização de agregados em células humanas.

ABSTRACT

The maintenance of cellular homeostasis by the protein quality control (PQC) system is very complex

and relies on multiple processes governed by molecular chaperones and ubiquitin-proteasome

system. During normal metabolic conditions, but especially during stress conditions, it is extremely

important that all these processes occur efficiently in the cell, avoiding the deposition of non-

functional polypeptides which may cause damage. Therefore, the investigation of structural and

functional aspects of proteins that belong to PQC system is quite relevant to gain information to

terapheutic and biotechnology innovation. Thus, in this work, we aim to understand two very

important proteins, whose functions are directly related to protein triage decisions in the cell. First,

we investigate details about the co-chaperone CHIP from Sorghum bicolor (SBCHIP) and report on the

sequence of the gene of interest identified through homology with the ortholog present in

Arabidopsis. Additionally, the gene was cloned, used for superexpression in E. coli and the protein

was purified and characterized as a dimer, rich in α-helix secondary structure and stable under

thermal stress conditions. We also characterized the assembly of SbCHIP and HsHsc70 in complexes

and evaluated SbCHIP activity of auto-ubiquitination and ubiquitination of other protein substrates.

In addition, our research focus was on the role of the human HspB1 in the protein disaggregation

activity of Hsp70 system. Taken together, our results support a model of disaggregation in which

unfolded polypeptide co-aggregates with oligomers of activated HspB1. Hsp70 and co-chaperones

(Hsp40 and Hsp110) extract the substrate from the aggregates, but also help to disassemble HspB1

into dimers, and this is required for efficient disaggregation. Activation of HspB1 by phosphorylation

is important to destabilize oligomers, but not for the immediate formation of dimers. We propose

that after disassembly aided by chaperones, HspB1 dimers reassemble spontaneously into oligomers,

which allows the cycle to restart for a new round of disaggregation, except for the GPG mutant. In

conclusion, the data presented here provides a better understanding of the relationship between

structure and function of CHIP from a plant and also contributes to the understanding of the

mechanism of solubilization of protein aggegates in human cells.

Sumário

Introdução geral ....................................................................................................................... 12

As proteínas e o enovelamento proteico ........................................................................................... 12

Chaperonas moleculares e sua importância para homeostase celular ............................................. 15

Capítulo 1. Caracterização da co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP) ................. 26

1.1. Introdução .............................................................................................................................. 26

1.2. Objetivos ................................................................................................................................ 34

1.3. Material e métodos ................................................................................................................ 35

1.4. Resultados .............................................................................................................................. 55

1.5. Discussão ................................................................................................................................ 77

1.6. Conclusões.............................................................................................................................. 88

Capítulo 2. O papel da HspB1 humana na desagregação de substrato pelo sistema da

Hsp70 ........................................................................................................................................ 90

2.1. Introdução .............................................................................................................................. 90

2.2. Objetivos ................................................................................................................................ 97

2.3. Material e métodos ................................................................................................................ 98

2.4. Resultados ............................................................................................................................ 106

2.5. Discussão .............................................................................................................................. 135

2.6. Conclusões............................................................................................................................ 146

Considerações finais ...............................................................................................................148

Referências bibliográficas .......................................................................................................151

Anexos .....................................................................................................................................163

12

Introdução geral

As proteínas e o enovelamento proteico

As proteínas constituem uma das classes de biomoléculas mais importantes e

abundantes encontradas em todos os seres vivos, participando de uma imensa diversidade

de processos celulares. Elas estão presentes em todas as partes da célula e exibem uma

ampla variedade de tamanhos, estruturas e funções (Voet e Voet, 2011). Alguns exemplos

dos papéis que as proteínas podem desempenhar são os fatores de transcrição,

responsáveis pela expressão e regulação da informação genética; as enzimas, responsáveis

por permitir que as reações químicas do metabolismo sejam realizadas; os canais seletivos

que controlam a entrada e saída de substâncias nas células; hormônios e neutransmissores

que agem como sinalizadores de informação intra e intercelular; anticorpos, importantes

para o reconhecimento de antígenos, viabilizando a existência do sistema imune; ou ainda

apresentam função estrutural, como colágeno e elastina (Marzzoco e Torres, 2011).

Na maioria dos casos, a função de uma proteína está intimamente relacionada

com a aquisição de uma estrutura tridimensional específica. Assim, para serem capazes de

executar tantas funções diferentes, as proteínas apresentam estruturas complexas e

sofisticadas que dependem fundamentalmente da sequência de aminoácidos que as

compõe, ou seja, de sua estrutura primária. A infinita possibilidade de combinações dos 20

aminoácidos que podem compor uma proteína possibilita essa imensa diversidade de

conformações tridimensionais, de forma que cada proteína possui uma sequência de

aminoácidos única que culmina em uma conformação específica, responsável por

determinar uma função em particular (Voet e Voet, 2011).

Até atingirem essa conformação nativa funcional, as proteínas se organizam em

diferentes níveis de estrutura. A estrutura primária, como foi dito, consiste apenas da

sequência de aminoácidos, os quais são ligados pela formação da ligação peptídica. Essa

ligação ocorre entre o grupamento amina de um aminoácido e o grupamento carboxila de

outro e apresenta um caráter planar (com ressonância como em ligações duplas), pelo qual

não é possível haver rotação do polipeptídeo. Apesar disso, as ligações que ocorrem entre o

grupo amina e o Cα e entre o Cα e a carbonila são ligações simples que podem rotacionar

em diferentes ângulos de torções, permitindo que as cadeias polipeptídicas assumam várias

orientações. Devido à possibilidade de torção dessas ligações e também a interações locais,

13

especialmente ligações de hidrogênio, entre os grupamentos amino e carbonila de um

resíduo com os mesmos grupamentos de resíduos próximos, são formadas as estruturas

secundárias. Hélices-α e folhas-β são as estruturas secundárias típicas formadas nas

proteínas, mas muitas outras podem existir, inclusive estruturas desordenadas (Voet e Voet,

2011).

A estrutura terciária ocorre pela organização tridimensional da cadeia

polipeptídica completa, neste caso predominam interações não locais das cadeias laterais

dos resíduos de aminoácidos que resultam no dobramento das estruturas secundárias.

Ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e interações hidrofóbicas são muito

importantes para determinação da estrutura terciária. Finalmente, quando as proteínas são

formadas por mais de uma cadeia polipeptídica, seja pela organização em oligômeros ou

pela interação com outras proteínas, acontece a formação da estrutura quaternária (Voet e

Voet, 2011).

Dessa maneira, a conformação correta de uma proteína só pode ser alcançada

sob um conjunto particular de condições celulares através do processo denominado

enovelamento, o qual leva à formação de uma estrutura estável, com energia livre de Gibbs

mínima (Anfinsen, 1973). O enovelamento geralmente é um processo espontâneo que

ocorre devido a um fenômeno conhecido como colapso hidrofóbico, pelo qual os resíduos

hidrofóbicos de uma proteína são internalizados no cerne da estrutura, ao passo que os

resíduos polares e carregados se localizam na superfície da estrutura, expostos ao contato

com o solvente aquoso. O isolamento dos resíduos hidrofóbicos desse ambiente aquoso

estabiliza energeticamente a proteína e compensa termodinamicamente pela entropia

desfavorável causada pela formação de uma estrutura organizada (Levitt e Warshel, 1975;

Goloubinoff, 2014).

A complexidade envolvida no processo de enovelamento pode ser mais bem

compreendida através de um esquema de energia em forma de funil (Baldwin, 1995; Hartl et

al., 2011). Neste esquema (Figura 1), as proteínas desenoveladas encontram-se na região de

máxima energia livre. Durante o enovelamento, os polipeptídeos devem se organizar e

atingir níveis mais baixos de energia livre, pelo processo favorecido pelo colapso hidrofóbico

e definido pela sequência primária de cada proteína. Para isso, eles podem seguir diferentes

vias de enovelamento, atingindo diferentes estados intermediários. Para alcançar o estado

14

nativo enovelado, cada intermediário deve ultrapassar barreiras energéticas que muitas

vezes é possibilitada pelo auxílio das chaperonas moleculares.

Uma vez que o enovelamento depende de um ambiente aquoso

termodinamicamente favorável, a conformação de uma proteína pode não ser atingida ou

ainda pode ser perdida pelo seu desenovelamento completo ou parcial, causado por

mudanças nas condições ambientais. O ambiente celular é altamente concentrado e

populoso em termos de quantidade de proteína e, por isso, pode facilitar o

desenovelamento proteico e a formação de agregados. Essa condição pode ser ainda mais

estimulada sob situações de estresse que perturbam a homeostase da célula, como

variações osmóticas, de pH ou temperatura, por exemplo. (Ferreira e De Felice, 2001; Ramos

e Ferreira, 2005). Quando isso acontece, as proteínas expõem seus resíduos hidrofóbicos

que estavam internalizados, o que facilita a formação de agregados amorfos e/ou fibrilas

amilóides, que apesar de termodinamicamente favoráveis, geralmente são muito grandes e

bastante tóxicos para as células. Nestes casos, formas intermediárias de enovelamento (mal

enoveladas ou parcialmente desenoveladas) se tornam muito numerosas, favorecendo a

formação e deposição de agregados. O acúmulo intracelular de proteínas mal enoveladas

pode ser uma séria ameaça para a saúde dos organismos. A deposição de grandes agregados

provoca perda de função proteica e toxicidade, que pode culminar em diversos distúrbios,

como doenças neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer e fibrose cística), câncer e até

indução de apoptose (Ferreira e De Felice, 2001; Ramos e Ferreira, 2005; Tipping et al.,

2015).

15

Figura 1: Esquema de energia livre de Gibbs em forma de funil para o processo de enovelamento proteico. Proteínas desenoveladas encontram-se na região de máxima energia livre. Durante o enovelamento, os polipeptídeos devem atingir níveis mais baixos de energia livre, favorecido pelo colapso hidrofóbico e por sua sequência primária. Para isso, eles podem seguir diferentes vias de enovelamento, representadas pelas enrugações na superfície de energia do funil, atingindo diferentes estados intermediários. Para alcançar o estado nativo enovelado, cada intermediário deve ultrapassar barreiras energéticas, muitas vezes só possíveis através do auxílio das chaperonas moleculares. Em condições de estresse, o processo de agregação pode predominar, gerando espécies como agregados amorfos ou fibrilas amilóides, cuja formação, apesar de termodinamicamente favorável, pode ser muito tóxica e danosa para as células (adaptado de Gonçalves e Ramos, 2016).

Chaperonas moleculares e sua importância para homeostase celular

Uma complexa rede de proteínas, capaz de preservar a homeostase proteica

(proteostase) e evitar a deposição de agregados, está presente nas células de todos os seres

vivos constituindo o chamado Controle de Qualidade Proteico (protein quality control - PQC).

Esse sistema é responsável pela manutenção da proteostase maximizando o enovelamento

de polipeptídeos e eliminando aqueles danificados ou mal enovelados. Para isso, o PCQ é

formado pelo sistema de chaperonas moleculares e pelo sistema ubiquitina-proteosomo

(ubiquitin-proteasome system - UPS), os quais funcionam em conjunto, estabelecendo o

balanço perfeito entre enovelamento e degradação de proteínas celulares.

16

O funcionamento do UPS será discutido com mais detalhes no próximo capítulo,

então aqui serão exploradas as principais características e funções do sistema de chaperonas

moleculares. Por definição, uma chaperona molecular é “uma proteína que se liga e

estabiliza a conformação de outra proteína cliente instável, possibilitando seu correto

destino in vivo e facilitando os processos de enovelamento, oligomerização, transporte para

um compartimento subcelular e regulação da conformação em estados ativos e inativos”

(Hendrick e Hartl, 1993). Neste sentido, as chaperonas são capazes de realizar muitas

funções celulares fundamentais, entre elas: assegurar que polipeptídeos recém-sintetizados

atinjam o enovelamento correto do estado nativo, auxiliar a associação e dissociação de

complexos multiproteicos, translocação através de membranas de proteínas destinadas a

diferentes compartimentos celulares, prevenção da formação de agregados proteicos,

reenovelamento de polipeptídeos mal enovelados e ressolubilização de agregados formados

em situações de estresse (Hartl et al., 1992; Hartl e Hayer-Hartl, 2002; Tiroli-Cepeda e

Ramos, 2011).

Para que todas essas funções possam ser realizadas eficientemente existem

diversos tipos de chaperonas moleculares, organizadas em cinco famílias principais que são

nomeadas de acordo com a massa molecular do monômero em Hsp60, Hsp70, Hsp90,

Hsp100 e sHsps (Figura 2). O termo Hsp (de Heat shock protein) é derivado do fato de que as

primeiras chaperonas foram identificadas por terem sua expressão altamente elevada em

condições de estresse térmico. De fato, muitas chaperonas são altamente expressas em

diversas condições de estresse, mas também durante condições de alta síntese proteica,

como em divisão celular, por exemplo. Muitas delas ainda são expressas constitutivamente

durante o metabolismo normal das células, o que faz com que nem todas as chaperonas

sejam Hsps e vice-versa (Lindquist e Craig, 1988; Aldea et al., 2007).

Na grande maioria dos casos, as chaperonas funcionam sendo auxiliadas pelas

co-chaperonas. Interessantemente, as chaperonas são relativamente bem conservadas nos

diferentes organismos, tanto em sequência primária como em número de genes, de modo

que organismos unicelulares possuem um número de chaperonas semelhante ao de

organismos mais complexos. Em contrapartida, o número e a variedade das co-chaperonas

aumenta significativamente de acordo com a complexidade do organismo, o que

provavelmente foi necessário evolutivamente para que o PQC fosse capaz de lidar com a

17

maior complexidade intracelular dos organismos superiores. Dessa forma, as co-chaperonas

interagem de forma mais específica com proteínas clientes desenoveladas, prevenindo sua

agregação e entregando-as para a chaperona adequada. A interação entre chaperonas, co-

chaperonas e proteínas clientes forma grandes complexos, muito importantes para o

funcionamento adequado desse sistema (Bukau e Horwich, 1998; Taipale et al., 2014).

Figura 2: Esquema das principais famílias de chaperonas e suas funções nas células. Polipeptídeos nascentes desenovelados apresentam seus resíduos hidrofóbicos expostos e interagem com as chaperonas holders (geralmente as sHsps e as Hsp40). Estas entregam o substrato para o sistema da Hsp70 que pode enovelá-lo até seu estado nativo através do consumo de ATP, redistribuí-lo para outras enovelases como Hsp90 ou Hsp60, ou ainda enviá-los para degradação pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Durante situações de estresse, podem ser formados agregados proteicos que são dissociados por desagregases como as Hsp100 e então direcionados para reenovelamento ou degradação (adaptado de Gonçalves e Ramos, 2016).

18

As chaperonas ainda podem ser classificadas de acordo com suas funções e

mecanismos de interação com o substrato em três classes principais (Figura 2): as

enovelases (ou foldases), as desagregases e as holders (Mayer, 2010; Tiroli-Cepeda e Ramos,

2011). Atualmente já se sabe que uma mesma chaperona ou um complexo multichaperona

pode apresentar mais de uma ou até todas essas funções, de forma que essa classificação

deva ser considerada de forma mais geral. Assim, as enovelases clássicas são as proteínas

das famílias Hsp60 (também chamadas chaperoninas), Hsp70 e Hsp90, responsáveis por

estabelecer o ambiente propício para aquisição da conformação correta do substrato,

processo que normalmente envolve gasto de energia através de ciclos de atividade ATPásica

(Wegele et al., 2004; Boshoff, 2015). As desagregases são as chaperonas capazes de interagir

com substratos agregados e auxiliar na remoção de polipeptídeos desses agregados,

também de forma ATP-dependente. Primariamente as desagregases eram representadas

pela família Hsp100 (chaperonas ClpB/Hsp104/Hsp101) de bactérias, fungos e plantas, mas

evidências recentes mostraram que o sistema formado de Hsp70 e outras co-chaperonas

também desempenham esta função. As desagregases podem trabalhar em conjunto com as

enovelases para desagregação e reenovelamento de substratos (Zietkiewicz et al., 2004;

Rampelt et al., 2012; Nillegoda et al., 2015). Por fim, as holders interagem com proteínas

clientes e as entregam para outras chaperonas, prevenindo sua agregação e enovelamento

incorreto, de maneira independente da hidrólise de ATP. As sHsps e co-chaperonas, como as

Hsp40 e as proteínas TPR, são as principais holders conhecidas (Summers et al., 2009; Tiroli-

Cepeda e Ramos, 2011; Garrido et al., 2012; Haslbeck e Vierling, 2015).

Uma vez que as chaperonas funcionam em grandes complexos proteicos, com

co-chaperonas e proteínas clientes, o bom entendimento do sistema PQC depende do

estudo dos múltiplos processos orquestrados pelas diversas chaperonas expressas nas

células em diferentes condições. Dessa forma, a seguir será apresentado um breve resumo

com informações gerais sobre as principais famílias importantes para compreensão das

motivações que levaram aos objetivos propostos neste trabalho.

19

- A maquinaria de enovelamento da Hsp70

As proteínas da família Hsp70 são as chaperonas mais importantes e conhecidas

devido ao papel central que desempenham no sistema PQC. Elas são proteínas expressas em

todos os organismos, encontradas em diferentes compartimentos celulares e constituem o

principal centro funcional de enovelamento e direcionamento de proteínas clientes, sendo

extremamente importantes para determinação do destino apropriado de substratos

proteicos. Dentre os diversos processos biológicos com os quais estão envolvidas, incluem-

se: enovelamento de proteínas recém-sintetizadas para o estado nativo, prevenção de

agregação, solubilização e reenovelamento de agregados e de proteínas mal enoveladas e

transporte através da membrana. Estruturalmente, as Hsp70 são formadas por dois

domínios conservados, ligados por um linker flexível: na porção N-terminal está o domínio

de ligação a nucleotídeo (nucleotide-binding domain - NBD) e na porção C-terminal

encontra-se o domínio de ligação ao substrato (substrate-binding domain - SBD) (Hartl et al.,

1992; Young, 2010; Silva e Borges, 2011; Mayer e Kityk, 2015). As proteínas dessa família

apresentam alta identidade de sequência nos ortólogos encontrados em diferentes espécies,

sendo que sua estrutura tridimensional e o mecanismo de ação também parecem ser

conservados em eucariotos (Young, 2010).

O sistema da Hsp70 é composto pelas proteínas Hsp70, pelas co-chaperonas

Hsp40 e por fatores de troca de nucleotídeos (nucleotide exchange factors - NEFs), das

famílias Hsp110 ou Bag. Em conjunto, essas proteínas estão no centro no sistema PQC

porque recebem e distribuem proteínas não nativas para outras chaperonas e para o UPS. As

co-chaperonas Hsp40 são conhecidas como DnaJs (ou J-proteins) devido à presença do

domínio J, conservado e específico dessa família. Essas co-chaperonas são muito diversas e

importantes, pois propiciam uma diversidade funcional para o sistema que não seria possível

apenas com as Hsp70 conservadas (Vos et al., 2008; Kakkar et al., 2012; Cyr e Ramos, 2015).

Em outras palavras, a diversidade das Hsp40 explica como o sistema conservado das Hsp70

pode atuar nos mais diferentes substratos proteicos existentes nas células, especialmente de

organismos mais complexos.

Por esse motivo, as Hsp40 são classificadas em três classes A, B e C (DnaJA,

DnaJB e DnaJC), de acordo com os domínios que as compõem, além do domínio J. As DnaJA

apresentam o domínio J na região N-terminal, seguido de uma região flexível rica em glicinas

20

e fenilalaninas (região GF), de um motivo zinc-finger e do domínio C-terminal (CTD). As

DnaJB possuem os mesmos domínios, com exceção do motivo zinc-finger, que é substituído

por uma região flexível, desordenada e rica em glicinas e metioninas (região GM). Já as

DnaJC são as mais diversas por conterem apenas o domínio J em alguma posição da

proteína, e dependendo da proteína ele está anexado a diversos tipos de domínios

especializados (Kampinga e Craig, 2010).

O mecanismo de funcionamento das Hsp70 ocorre através de ciclos consecutivos

de ligação, enovelamento e liberação de substrato, que acontecem no SBD e que são

regulados pela atividade de hidrólise de ATP no NBD. O ciclo acontece da seguinte maneira

(Figura 3): quando o NBD está ligado a ATP, o SBD encontra-se no estado aberto e com baixa

afinidade pelo substrato. Neste estado, as Hsp40s interagem com o NBD e induzem a

hidrólise de ATP. Diferentes Hsp40s são capazes de entregar diferentes substratos proteicos

e estimular atividade ATPásica da Hsp70. Uma vez que o NBD passa a ter ADP ligado a ele,

ocorre mudança conformacional e o SBD fica no estado fechado, apresentando alta

afinidade pelo substrato. Após a ação de enovelamento do substrato pela Hsp70, os fatores

de troca de nucleotídeos (NEFs) entram em ação, promovendo troca de ADP por ATP no NBD

e a liberação do substrato, ao reverter a mudança conformacional do SBD para o estado

aberto. O ciclo é então reiniciado e pode se repetir diversas vezes até que o enovelamento

adequado do substrato seja atingido (Borges e Ramos, 2005; Young, 2010).

Diferentemente de Hsp70 e Hsp40, os NEFs não são bem conservados em

bactérias (GrpEs) e eucariotos; em humanos e leveduras, os mais abundantes são

provenientes da família Hsp110/Sse, estruturalmente relacionada aos domínios NBD e SBD

das Hsp70, e da família Bag, que apresenta o domínio BAG conservado que interage com

NBD e tem a função NEF (Oh et al., 1999; Vos et al., 2008; Bracher e Verghese, 2015).

21

Figura 3: Esquema do sistema de enovelamento formado por Hsp70, Hsp90 e co-chaperonas. Polipeptídeos desenovelados são reconhecidos pelas co-chaperonas Hsp40, as quais entregam o substrato para Hsp70. Quando o NBD da Hsp70 está ligado a ATP, o SBD encontra-se no estado aberto e com baixa afinidade pelo substrato. Então, as Hsp40 interagem com o NBD e induzem a hidrólise de ATP. Uma vez que o NBD está ligado a ADP, este induz a mudança conformacional do SBD para o estado fechado de alta afinidade pelo substrato. Após a ação de enovelamento da proteína cliente, Hsp110 (NEF) promovendo troca de ADP por ATP no NBD da Hsp70, revertendo a mudança conformacional do SBD para o estado aberto e estimulando a liberação do substrato. Alguns substratos precisam ser entregues para Hsp90. Neste caso, a co-chaperona Hip medeia a interação de Hsp70 e Hsp90 e a transferência do substrato. A co-chaperona Hop é importante para estabilizar a dimerização de Hsp90 e para promover a troca de nucleotídeos, regulando a interconversão do estado aberto e fechado de Hsp90, o enovelamento e a liberação do substrato na forma nativa (adaptado de Gonçalves e Ramos, 2016).

- A família Hsp90

O sistema da Hsp70 também coopera com as chaperonas moleculares da família

Hsp90, gerando uma complexa maquinaria que realiza diversas funções essenciais durante o

(re)enovelamento proteico. A interação com Hsp70 é muito importante para a entrega de

substratos para Hsp90, uma vez que esta não se liga a polipeptídeos récem sintetizados

(Wegele et al., 2004). Diferentemente das Hsp70 que possuem atividade promíscua, as

Hsp90 parecem ser mais seletivas; apesar de reconhecerem um grande número de

substratos diferentes, eles são preferencialmente fatores de transcrição e proteínas kinases.

Essa característica faz das Hsp90 chaperonas essenciais durante o desenvolvimento e

crescimento de células eucaróticas e na manutenção da conformação de proteínas

22

envolvidas na transdução de sinal, controle do ciclo celular e apoptose. Além disso, as Hsp90

apresentam sequência de aminoácidos altamente conservada e estão distribuídas em fungos

(Hsp82), animais (Hsp90 α e β) e plantas (Buchner, 1999; Silva e Ramos, 2012).

Estruturalmente, Hsp90 é composta de um domínio N-terminal conservado e

com atividade ATPásica, seguido de um domínio central flexível (domínio M) e do domínio C-

terminal, responsável pel dimerização da proteína e pela interação com co-chaperonas. O

homodímero forma uma estrutura em forma de “V”, ligado pelo C-terminal, que pode se

abrir ou fechar de acordo com a ligação ao nucleotídeo no N-terminal (Buchner, 1999; Silva e

ramos, 2012). Em um mecanismo semelhante ao visto para Hsp70, a ligação com

nucleotídeos afeta a conformação de Hsp90 e a interação com substratos, além disso, a

interação com co-chaperonas específicas também é importante para regulação desse ciclo

(Figura 3). Assim, quando não há nucleotídeos ligados ao domínio N-terminal do

homodímero de Hsp90, este se encontra na conformação aberta, podendo receber

substratos de outras co-chaperonas ou do sistema da Hsp70. A interação com substrato e

com co-chaperonas induz a ligação de ATP e a mudança para a conformação fechada, a qual

propicia o ambiente adequado para o enovelamento do substrato. Ocorre então a hidrólise

do ATP, que muda novamente a conformação para o estado aberto e libera o substrato,

podendo reiniciar o ciclo de enovelamento (Young et al., 2001).

Desse modo, as co-chaperonas de Hsp90 desempenham um papel fundamental

para a regulação de sua atividade enovelase. As principais co-chaperonas são Hip, Hop,

Aha1, p23 e CHIP e são responsáveis por acelerar e estabilizar o enovelamento, promover a

interconversão do estado aberto e fechado (ligado a ATP ou ADP), modular a formação de

complexos com proteínas cliente específicas e também mediar a transferência de substrato

de Hsp70 para Hsp90. A maioria dessas co-chaperonas possuem um domínio TPR, o qual

será abordado com mais detalhes no próximo capítulo, mas que é conservado e capaz de se

ligar no motivo MEEVD presente no C-terminal das Hsp90 (Blatch e Lässle, 1999; Scheufler et

al., 2000; Wandinger et al., 2008).

23

- As desagregases da família Hsp100

As proteínas da família Hsp100, também conhecidas como Hsp101, Hsp104 ou

ClpB em plantas, leveduras e bactérias respectivamente, são chaperonas com atividade

ATPásica intrínseca e que pertencem à superfamília das AAA+ ATPases (Snider e Houry,

2008; Hodson et al., 2012). Em situações de estresse muito intenso, agregados proteicos

podem ser formados mesmo na presença das chaperonas Hsp70 e Hsp90, especialmente em

organismos muito sujeitos às mudanças do ambiente, como bactérias, fungos e plantas.

Dessa forma esses organismos apresentam as chaperonas Hsp100 que são responsáveis pela

atividade de desagregase, removendo polipeptídeos da superfície de substratos agregados e

permitindo que eles sejam reenovelados ou enviados para degradação; a colaboração das

Hsp100 com o sistema da Hsp70 é essencial para que isso ocorra. Visto que Hsp70 e Hsp100

constituem os dois principais centros funcionais do sistema de desagregação nesses

organismos, este sistema foi denominado bichaperona, apesar de diversas outras co-

chaperonas também estarem envolvidas nesse processo (Glover e Lindquist, 1998). Além da

atividade de desagregase, as proteinas Hsp100 ainda desempenham diversas outras

atividades nas células, como tolerância ao estresse, tráfico intracelular de proteínas,

regulação do ciclo celular, regulação gênica e transposição de DNA (Schirmer et al, 1996).

Detalhes sobre o mecanismo de ação desse sistema serão abordados no capítulo 2.

Com relação à conformação, todas as Hsp100 se associam em uma estrutura em

forma de anel. Mudanças nessa conformação ocorrem devido a um ciclo de ligação e

hidrólise de ATP, desencadeando a desagregação do substrato através de sua translocação

através do poro central presente na estrutura. Dependendo de cada Hsp100 a conformação

de anel pode variar, mas elas geralmente compartilham alguns domínios conservados. O

domínio N-terminal (NTD) contribui para a alta afinidade de interação que as Hsp100 tem

por substratos agregados; além disso, elas apresentam um ou dois domínios de ligação a

nucleotídeo (NBD), os quais ligam ATP e ADP e são responsáveis pela atividade ATPásica.

Formando o NBD, existem os motivos canônicos walker A e walker B e os motivos sensor-1 e

sensor-2, que são importantes para ligação e hidrólise de ATP. O número de NBDs que as

Hsp100 apresentam permite sua classificação em classe I (dois NBDs) ou classe II (um NBD).

As proteínas de classe I se associam em hexâmeros na presença de ATP, enquanto as de

classe II geralmente são menores (Mokry et al., 2015).

24

As Hsp100 podem ainda ser divididas de acordo com a presença de um domínio

M (middle domain), normalmente situado após o primeiro NBD. Embora este domínio seja

dispensável para a atividade ATPásica, ele é essencial para reativação de agregados

proteicos (Desantis e Shorter, 2012). Há ainda a região C-terminal que está envolvida com a

oligomerização e interação com co-chaperonas (Mackay et al., 2008).

- A família das small Heat shock proteins (sHsps)

As chaperonas da família sHsp são assim denominadas por apresentarem

monômeros com baixa massa molecular (12 a 43 kDa). Assim como as Hsp70, elas estão

presentes em todos os organismos, procariotos e eucariotos, entretanto elas evoluíram

independentemente nesses organismos e são as chaperonas menos conservadas entre as

diferentes espécies; mesmo em uma mesma espécie, diferentes membros desta família

apresentam baixa identidade de sequência. Isso provavelmente ocorreu ao longo da

evolução, porque as sHsps constituem a primeira defesa das células contra condições

estressantes. Nessas situações, essas chaperonas têm sua expressão muito aumentada e sua

principal função é reconhecer, de maneira promíscua, resíduos hidrofóbicos expostos de

uma ampla diversidade de substratos desenovelados, se ligar a eles e prevenir sua agregação

independentemente da hidrólise de ATP. Dessa forma, a diversidade de sequências das

sHsps reflete a diversidade de susbtrato com as quais elas devem interagir. Por esse motivo,

quando essas chaperonas são expressas, elas frequentemente são endereçadas para

compartimentos celulares específicos, como citosol, mitocôndria, cloroplastos e retículo

endoplasmático (Buchner et al., 1998; Halsbeck et al., 1999; Waters, 2013; Halsbeck e

Vierling, 2015).

Apesar de não serem conservadas, as sHsps estão agrupadas numa mesma

família pela presença do domínio α-cristalino na região central da proteína (α-crystallin

domain - ACD). Este domínio, formado de cerca de 90 resíduos de aminoácidos, é

conservado, rico em folhas-β antiparalelas e responsável pela dimerização das sHsps. Os

domínios N-terminal (NTD) e C-terminal (CTD) flanqueiam o ACD e apresentam sequência e

tamanho altamente variáveis, além disso, são regiões hidrofóbicas de estrutura desordenada

e que estão envolvidas com oligomerização e ligação de substrato. Pouco se sabe sobre o

mecanismo de ligação das sHsps ao substrato se comparado com o conhecimento que se

25

tem sobre o mecanismo de chaperonas ATP-dependentes como Hsp70 e Hsp90, por

exemplo (Sudnitsyna et al., 2012; Haslbeck e Vierling, 2015; Arbach et al., 2017).

Apesar do monômero de baixa massa molecular, sHsps podem formar enormes

complexos oligoméricos e adquirir estrutura quaternária com diferentes arranjos, muitas

delas formam discos achatados com uma cavidade central, onde os substratos ficam

protegidos quando interagem com o N-terminal das proteínas. Os dímeros de sHsps são

considerados as unidades básicas para a formação dos oligômeros e, como a dimerização se

dá através do conservado ACD, podem ser formados homo ou heterodímeros que podem

originar heteroligômeros. A oligomerização é uma característica bastante importante dessas

chaperonas e bastante discutida na literatura. Esse assunto será abordado com mais

detalhes no capítulo 2, mas em resumo, entende-se que a oligomerização das sHsps existe

como um processo dinâmico, regulado por modificações pós-traducionais e que está de

alguma forma relacionada com a função dessas proteínas (MacDonald et al., 2012; Heibaut

et al., 2016).

26

Capítulo 1. Caracterização da co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP)

1.1. Introdução

1.1.1. O sistema ubiquitina-proteosomo (UPS) e seu papel na degradação de

substratos proteicos

A integridade dos processos celulares depende da manutenção da homeostase

proteica. Assim, as proteínas devem permanecer em suas conformações nativas funcionais

enquanto necessário, porque caso isso não ocorra, polipeptídeos mal enovelados podem

gerar agregados tóxicos que se acumulam e ocasionam doenças e morte celular (Hartl et al.,

1992; Hartl e Hayer-Hartl, 2002).

A principal função das chaperonas moleculares para contribuir com a

manutenção da proteostase é prevenir a formação de agregados e propiciar um ambiente

favorável para o (re)enovelamento de polipeptídeos. Outro lado também essencial nesse

contexto é a degradação de polipeptídeos, que deve acontecer caso o enovelamento correto

não possa ser atingido ou não haja mais necessidade de proteínas que foram altamente

expressas em determinada condição. A degradação das proteínas não apenas auxilia a

manter a célula saudável como também ajuda a manter um balanço de energia e um pool de

aminoácidos no citosol. A síntese de aminoácidos no metabolismo é um processo de alto

custo, então reciclá-los foi a melhor maneira encontrada pelos organismos para manter a

homeostase celular com o menor custo energético possível (Myung et al., 2001).

As duas vias de degradação proteica mais importantes descritas para a maioria

das células eucarióticas são o sistema ubiquitina-proteosomo (UPS) e a autofagia. A

autofagia é realizada pelos lisossomos e envolve principalmente a degradação de organelas

celulares (mitocôndrias, peroxissomos, ribossomos, etc), organismos infecciosos e grandes

agregados proteicos. Já o UPS é responsável pela degradação de 80 a 90% das proteínas em

geral, incluindo proteínas com expressão temporariamente regulada, de curta meia-vida ou

danificadas, estando mais intimamente relacionado com o sistema chaperona no controle de

qualidade proteico (Lilienbaum, 2013).

O UPS apresenta um mecanismo altamente conservado através do qual as

células eucarióticas regulam seu nível de proteínas citosólicas e nucleares. O proteosomo é

um grande complexo multiproteico de mais de 2 MDa cuja estrutura se assemelha a de um

barril com uma cavidade proteolítica central onde os substratos são degradados (Tanaka,

27

2009). Uma vez que a via do UPS degrada uma ampla gama de substratos proteicos, os

organismos desenvolveram uma maneira de dividir esse processo em duas etapas

consecutivas: a primeira em que o reconhecimento de substrato é específico e seletivo,

através da cascata de ubiquitinação; e a segunda em que ocorre a degradação

indiscriminada do substrato, mediada pelo centro proteolítico do proteosomo.

Para que a degradação de proteínas aconteça pelo UPS, elas devem ser

primeiramente marcadas pela ligação de múltiplas moléculas de ubiquitina através de uma

série de reações enzimáticas sequenciais. A ubiquitina é uma pequena proteína globular de 8

kDa composta de 76 resíduos de aminoácidos altamente conservados desde leveduras até

mamíferos (Vijay-Kumar et al., 1987). A ubiquitinação não sinaliza apenas para degração, a

adição de apenas uma molécula de ubiquitina pode sinalizar o endereçamento para uma

localização subcelular ou ainda pode servir para indução de atividade de algumas proteínas.

Assim, é necessária a ligação de uma cadeia de poli-ubiquitina para que o substrato seja

sinalizado para degradação pelo proteosomo (Johnson et al., 1992).

A cascata de conjugação de ubiquitina acontece da seguinte forma (Figura 4):

primeiramente ocorre a ativação da ubiquitina por uma enzima E1 (enzima de ativação da

ubiquitina). Nessa etapa, o grupamento carboxila da glicina 76 da ubiquitina é conjugado

num resíduo de cisteína da enzima E1 através de uma ligação tioéster e da hidrólise de ATP.

Em seguida, a ubiquitina ativada é transferida para um resíduo de cisteína da enzima E2

(enzima de conjugação da ubiquitina). No último passo ocorre a transferência da ubiquitina

da enzima E2 para enzima E3 (E3 ubiquitina ligase) e então a ubiquitina é conjugada na

proteína substrato pela formação de uma ligação amida isopeptídica entre o grupamento

carboxila da glicina 76 da ubiquitina e o grupamento amina da cadeia lateral de um resíduo

de lisina do substrato. Em alguns casos, não é observada a ligação covalente entre ubiquitina

e a enzima E3 e a transferência de ubiquitina para o substrato ocorre diretamente da enzima

E2 em um complexo formado por E2-E3-substrato. Após a conjugação de uma molécula de

ubiquitina, a cadeia de poliubiquitina é formada pela repetição da mesma cascata de

reações, através da ligação covalente do grupo carboxila da glicina 76 da ubiquitina com a

um resíduo de lisina de outra ubiquitina já ligada no substrato (Scheffner et al., 1995;

Hershko e Ciechanover, 1998; Myung et al., 2001).

28

Figura 4: Esquema de funcionamento do sistema ubiquitina-proteosomo (UPS). Para que a degradação de proteínas aconteça pelo UPS, elas devem ser marcadas pela ligação de múltiplas moléculas de ubiquitina através de uma série de reações enzimáticas sequenciais. O primeiro passo da cascata de ubiquitinação envolve a ativação da ubiquitina por uma enzima E1 (enzima de ativação da ubiquitina). Nessa etapa, o grupamento carboxila da glicina 76 da ubiquitina é conjugada num resíduo de cisteína da enzima E1, através de uma ligação tioéster e da hidrólise de ATP. Em seguida, a ubiquitina ativada é transferida para um resíduo de cisteína da enzima E2 (enzima de conjugação da ubiquitina). No último passo ocorre a transferência da ubiquitina da enzima E2 para enzima E3 (E3 ubiquitina ligase) e então a ubiquitina é conjugada na proteína substrato pela formação de uma ligação amida isopeptídica entre o grupamento carboxila da glicina 76 da ubiquitina e o grupamento amina da cadeia lateral de um resíduo de lisina do substrato. Após a conjugação de uma molécula de ubiquitina, a cadeia de poliubiquitina é formada pela repetição da mesma cascata de reações, através da ligação covalente do grupo carboxila da glicina 76 da ubiquitina com a um resíduo de lisina de outra ubiquitina já ligada no substrato.

É interessante realçar que a etapa de ubiquitinação para degradação proteica

apresenta especificidade ao substrato. Essa especificidade não é determinada pelas enzimas

E1, pois existe apenas uma família altamente conservada destas proteínas, mas sim pela

diversidade das enzimas E3. Cada uma delas é capaz de ubiquitinar especificamente um ou

poucos substratos, através da interação também específica com uma ou algumas enzimas

E2, de forma que diferentes combinações de enzimas E2 e E3 permitem a marcação seletiva

de proteínas intracelulares específicas. As E3 ubiquitina ligases podem reconhecer

substratos de diferentes formas dependendo do tipo de substrato que será encaminhado

para degradação; para substratos mal enovelados, por exemplo, o reconhecimento de

29

substrato depende predominantemente da cooperação com o sistema de chaperonas

moleculares (Esser et al., 2004). A co-chaperona CHIP é a principal responsável pela

colaboração entre o sistema de chaperonas e o UPS.

1.1.2. A co-chaperona CHIP é o elo entre o sistema chaperona e o UPS

A proteína CHIP (do inglês Carboxyl terminus of Hsp70-Interacting Protein)

recebeu esse nome porque foi inicialmente identificada em experimentos de busca por

proteínas humanas que continham o domínio TPR (Tetratricopeptide Repeat) responsável

pela interação com as chaperonas Hsp70 e Hsp90. De fato, CHIP é uma co-chaperona que

interage tanto com Hsp70 quanto com Hsp90 e ainda modula sua atividade chaperona

(Ballinger et al., 1999). Além disso, CHIP também é uma E3 ubiquitina ligase capaz de

ubiquitinar substratos e marcá-los para degradação pelo proteosomo (Jiang et al., 2001), o

que a torna o principal elo entre os processos de enovelamento proteico, mediado pelo

sistema chaperona, e de degradação, mediada pelo UPS (McDonough e Patterson, 2003).

Devido a essas funções, CHIP é uma proteína fundamental para a manutenção da

proteostase celular ao estabelecer o balanço correto entre enovelamento e degradação, fato

que a diferencia de outras co-chaperonas, como as Hsp40 ou outras TPR, porque ela está

primariamente envolvida no direcionamento dos complexos de chaperonas para degradação

e não no estabelecimento da o (re)enovelamento proteico. Em células humanas, o RNAm de

CHIP foi encontrado altamente expresso em tecidos com alta taxa metabólica e de turnover

de proteína, como músculo estriado esquelético e coração. Em tecidos de pâncreas e

cérebro a expressão observada foi um pouco menor, mas ainda assim significativa (Ballinger

et al., 1999).

Estruturalmente, CHIP é uma proteína conservada e constituída de três regiões

principais: o domínio TPR, uma região de dimerização e o domínio U-box (Paul e Ghosh,

2014). O domínio TPR é composto de três repetições em sequência do motivo TPR, o qual

consiste de 34 resíduos de aminoácidos pouco conservados na sequência primária, mas

conservado na estrutura terciária formada de uma alça de duas hélices-α antiparalelas

separadas por um loop (Figura 5). Em CHIP e na maioria dos domínios TPR, os três motivos

presentes compreendem seis hélices-α que se dobram e formam um groove que acomoda a

interação com o motivo conservado EEVD situado na região C-terminal de Hsp70 e Hsp90

30

(Blatch e Lässle, 1999). Em experimentos de interação de CHIP com essas chaperonas

moleculares, foi relatado que CHIP bloqueia a estimulação da atividade ATPásica de Hsp70

mediada por Hsp40 e como consequência promove a acumulação dessa chaperona em seu

estado aberto, de baixa afinidade a substrato, prevenindo a ligação e reenovelamento de

substratos desenovelados (Ballinger et al., 1999). Além disso, há evidências de que CHIP

inibe a função de Hsp90 de regular a conformação de substratos dessa chaperona, como

receptores de glicocorticóides (Connel et al., 2001).

Detalhes sobre a estrutura quaternária da proteína CHIP foram obtidos para o

homólogo presente em camundongos (MmCHIP) através de difração de raios X (Zhang et al.,

2005). Nesta estrutura, observou-se que CHIP forma um homodímero assimétrico, sendo

que a região central da proteína consiste de um hairpin de hélices-α que é o principal

responsável pela interface de dimerização (Figura 5). A formação de dímeros não é

recorrente em outras E3 ubiquitina ligases, mas no caso de CHIP parece ser essencial para

sua atividade, visto que um mutante de CHIP humana sem o segmento do hairpin não foi

capaz de dimerizar e também perdeu sua atividade de ubiquitinação de substrato (Nikolay et

al., 2004).

O próximo domínio presente em CHIP é o U-box que foi primeiramente

reconhecido na proteína Ufd2 de levedura, capaz de produzir cadeias de poliubiquitina

através de cadeias de oligoubiquitinas previamente formadas (Koegl et al., 1999). O domínio

U-box é estruturalmente semelhante aos domínios RING-finger encontrados em muitas

outras E3 ubiquitinas ligases, mas é estabilizado por ligações de hidrogênio em vez de

ligações de zinco (Aravid e Koonin, 2000). Em CHIP, o domínio U-box apresenta um hairpin

curto de duas folhas-β separando duas hélices-α (Figura 5). Como uma E3 ubiquitina ligase,

CHIP utiliza esse domínio para interagir com enzimas E2, em uma interação altamente

específica que determina a identidade da proteína substrato e a natureza da ubiquitinação.

São duas famílias de E2 relatadas com as quais CHIP pode interagir: Ubc4/5 que envolve a

poliubiquitinação da lisina 48 da ubiquitina e promove degradação pelo proteosomo; e

Ubc13 que envolve a ubiquitinação da lisina 63 e tem papel regulatório (Edkins, 2015).

31

Figura 5: Esquema da estrutura primária e estrutura terciária de CHIP de camundongo (MmCHIP) obtida por difração de raios X. A proteína CHIP é composta por três domínios importantes: o domínio TPR de interação com outras chaperonas (tons de verde), o hairpin de dimerização (tons de azul) e o domínio U-box (tons de vermelho) de ubiquitinação do substrato (Zhang et al., 2005; PDB: 2C2L).

Ao interagir com as enzimas E2 e as chaperonas moleculares, CHIP ubiquitina

proteínas desnaturadas ou mal enoveladas que são substratos dessas chaperonas. Em

parceria com Hsp90, CHIP ubiquitina substratos desnaturados capturados pela porção C-

terminal do dímero dessa chaperona sem necessidade de auxílio da região N-terminal de

atividade ATPásica (Murata et al., 2001). Com relação à Hsp70, CHIP diminui afinidade pelo

substrato pela regulação da atividade ATPásica, mas tanto Hsp70 quanto Hsp40 são

necessários para que o substrato desenovelado seja ubiquitinado. Além de ubiquitinar

proteínas substratos das chaperonas, CHIP também ubiquitina as próprias Hsp70 e Hsp90,

mostrando que essa co-chaperona também desempenha um importante papel regulatório

ao reestabelecer os níveis basais dessas chaperonas após a indução de resposta ao estresse

(Kundrat e Regan, 2010a).

32

- O papel de CHIP em plantas e o modelo Sorghum bicolor

A grande maioria dos estudos sobre CHIP foi realizada com os homólogos de

animais, especialmente com a proteína humana, de camundongo, de Drosophila, C. elegans

e peixe zebra. Em plantas, já foi identificada por análise de sequência pelo menos uma cópia

do gene que codifica essa proteína em diversos genomas vegetais (Copeland et al., 2016). No

entanto, apesar de ter sido identificada há quase 20 anos, poucos são os trabalhos que

descrevem o papel de CHIP em plantas como macromolécula intermediadora entre o

sistema chaperona e o UPS na regulação da degradação proteica. Além disso, a maioria

desses estudos envolve experimentos funcionais in vivo de silenciamento e superexpressão

do homólogo de Arabidopsis thaliana (AtCHIP), não tendo sido relatado nenhuma

caracterização estrutural mais aprofundada sobre essa co-chaperona em vegetais.

Em A. thaliana foi identificada uma única cópia do gene que codifica AtCHIP e

que tem sua expressão aumentada em resposta a tratamentos de indução de estresses

térmico (a 7 ou 38 °C) e osmótico (na presença de NaCl e Na2SeO4). Porém, observou-se que

a superexpressão constitutiva induzida de AtCHIP tornou as plantas mais suscetíveis ao

estresse térmico (Yan et al., 2003). Também já foi confirmada a atividade de E3 ubiquitina

ligase de AtCHIP, assim como sua capacidade de interagir com Hsc70 e de enviar substratos

para degradação; a maioria dos substratos estudados estão relacionados com proteínas

precursoras endereçadas a cloroplasto (Shen et al., 2007; Lee et al., 2009). Estudos recentes

apontam que AtCHIP também pode contribuir para regulação da imunidade de plantas de

Arabidopsis, uma vez que mutantes knockout se mostraram mais susceptíveis à doença

causada por um fungo patógeno virulento (Hyaloperonospora arabidopsidis). Em

contrapartida, a superexpressão de AtCHIP na planta causou maior resistência à doença em

baixas temperaturas (Copeland et al., 2016).

Considerando as funções descritas para CHIP em Arabidopsis, percebe-se que

essa co-chaperona também está envolvida na manutenção da homeostase proteica celular

em plantas, contribuindo para regulação entre os sistemas chaperona e proteosomo. Devido

à falta de informação e à importância do controle de qualidade proteico em plantas, o

estudo do funcionamento de chaperonas moleculares nesses organismos torna-se muito

necessário e relevante, apresentando alto potencial de produção de espécies vegetais mais

tolerantes a estresses bióticos e abióticos. Nosso grupo de pesquisa já caracterizou algumas

33

das principais chaperonas moleculares presentes em cana-de-açúcar (Cagliari et al., 2011;

Silva et al., 2013; Tiroli-Cepeda et al., 2014). Dessa maneira, a principal motivação desta

etapa do trabalho é contribuir com informações funcionais e estruturais da proteína CHIP de

Sorghum bicolor (SbCHIP).

Sorghum bicolor é uma espécie monocotiledônea originária do nordeste da

África e pertencente à mesma família da cana (Poaceae). Atualmente, o sorgo é o quinto

cereal mais produzido do mundo, especialmente em regiões tropicais e subtropicais, atrás

do arroz, trigo, milho e cevada (Dillon et al., 2007). Seu cultivo extensivo se deve ao

consumo do grão como alimento humano, principalmente em regiões semi-áridas

subsaharianas, e também na produção de farinha, xarope, amido industrial e bebidas

alcoólicas; além disso, o sorgo é amplamente utilizado como forragem para alimentação de

animais e na produção de biocombustíveis.

Cientificamente, o sorgo é bastante utilizado como uma espécie modelo

representante das monocotiledôneas com metabolismo de fotossíntese C4, apresentando

propriedades bioquímicas e morfológicas que aumentam a assimilação de carbono a altas

temperaturas. Essa planta é capaz de crescer em diferentes temperaturas, altitudes

elevadas, solos contaminados e se recupera após períodos de seca, o que a torna espécie de

estudo interessante de resistência a vários tipos de estresse (Hamblin et al., 2005).

Geneticamente, o sorgo já teve seu genoma sequenciado e por ter um tamanho

relativamente pequeno (730 Mb) também o torna um bom modelo de plantas C4 para

estudos genômicos funcionais (Paterson et al., 2009).

Em resumo, o homólogo de CHIP de Sorghum bicolor foi escolhido por esta ser

uma planta de regiões tropicais semi-áridas, altamente tolerante a estresse térmico e que

pode contribuir significativamente para o entendimento mais aprofundado do controle de

qualidade proteico em vegetais. Ademais, também foi considerado o grau de parentesco de

sorgo com cana, espécie para qual o grupo já possui vários trabalhos com outras chaperonas

moleculares, facilitando o estudo, quando for o caso, de interação entre proteínas, mesmo

que cada proteína seja de uma dessas espécies.

34

1.2. Objetivos

A motivação deste trabalho provém da importância da co-chaperona CHIP no

controle de qualidade proteico como o principal elo de regulação entre o sistema chaperona

e o sistema de degradação do proteosomo. A falta de compreensão que se tem sobre esse

sistema em plantas e a relevância da contribuição que pode ser gerada foram consideradas,

fornecendo conhecimento na produção potencial de espécies vegetais mais tolerantes a

estresses bióticos e abióticos. Dessa forma, o objetivo principal deste trabalho é a

caracterização funcional e estrutural da proteína CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Para

isso, os objetivos específicos propostos foram:

(1) Otimizar a sequência que codifica a proteína SbCHIP para expressão ótima em E.

coli e estabelecer um protocolo para a purificação dessa co-chaperona.

(2) Caracterizar a proteína SbCHIP através de técnicas biofísicas, determinando

parâmetros hidrodinâmicos em solução e obtendo informações estruturais da proteína.

(3) Investigar a possível interação de SbCHIP com chaperonas moleculares importantes

para o controle de qualidade proteico celular, como Hsp70.

(4) Caracterizar a função de ubiquitinação de SbCHIP em substratos proteicos e

também nas chaperonas moleculares Hsp70.

35

1.3. Material e métodos

Exceto quando indicado, os experimentos desenvolvidos nesta etapa do trabalho

foram realizados sob orientação do Prof. Dr. Carlos Ramos nas dependências de seu

laboratório situado no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP).

1.3.1. Estratégia de clonagem

Para obtenção da proteína CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP) isolada em solução,

primeiramente foi necessário construir um clone para induzir a expressão dessa proteína

recombinante em E.coli. Para isso, foi realizada uma busca por alinhamento de sequências

(BLAST) contra um banco de dados (Altschul et al., 1990) usando como isca a sequência de

RNAm de CHIP de Arabidosis thaliana (AtCHIP, GI:145338228). Através dessa busca foi

encontrada a sequência de nucleotídeos que codifica SbCHIP (GI: 242077965), anotada como

E3 ubiquitin-protein ligase CHIP isoform X1 [Sorghum bicolor].

Para realizar uma análise de similaridade de sequência de SbCHIP, foi feito um

alinhamento com sequências de proteínas homólogas de camundongo (MmCHIP), humano

(HsCHIP), Drosophila (DmCHIP), peixe zebra (DrCHIP), C. elegans (CeCHIP) e Arabidopsis

thaliana (AtCHIP), usando o programa Clustal Omega (Goujon et al., 2010; Sievers et al.,

2011). O alinhamento obtido foi utilizado para a obtenção de uma matriz de similaridade

através do programa MEGA 7.0, o qual gerou um cladograma de topologia final com método

Neighbor-joining (Kumar et al., 2016).

Para expressão de SbCHIP em E. coli, a sequência de RNAm foi otimizada usando

o programa OPTIMIZER (Puigbò et al., 2007), que substitui os códons raros de E. coli (aqueles

para os quais a bactéria não possui RNAt em abundância) por códons mais frequentemente

encontrados nessa bactéria. Para verificar a eficácia da substituição dos códons também foi

usado o programa Rare Codon Analysis Tool (GenScript).

Para decidir quais enzimas de restrição seriam utilizadas para clonagem da

sequência de RNAm de SbCHIP em plasmídeo de expressão, foi usado o programa NEBcutter

v2.0 (Vincze et al., 2003) que informa as enzimas de restrição conhecidas para as quais há

sítios de clivagem na sequência de interesse e também as enzimas não clivam em nenhuma

região da sequência, podendo assim ser utilizadas para clonagem. O programa mostrou que

36

não havia sítios de restrição das enzimas NdeI (5’ - CATATG - 3’) e XhoI (5’- CTCGAG - 3’), logo

elas foram as eleitas para a inserção da sequência no vetor (Figura 6A). Outras

características da proteína foram verificadas através do programa ProtParam Tool (Gasteiger

et al., 2005).

O vetor escolhido para clonagem foi o pET28a (Novagen), que contém diversos

sítios para enzimas de restrição e é amplamente utilizado para indução da expressão de

proteínas recombinantes em E. coli. A inserção da sequência desejada nesse vetor foi

realizada pela empresa Epoch Life Science, que gerou o plasmídeo pET28a-His-SbCHIP. A

construção foi confirmada pelo sequenciamento de DNA, usando os primers propostos pelo

manual do vetor nos sentidos forward e reverse (T7 promoter primer e T7 terminator primer,

respectivamente, Figura 6A).

1.3.2. Expressão das proteínas recombinantes

A escolha do pET28a como vetor de expressão ocorreu devido à algumas

características importantes que ele apresenta. A inserção de sequências em determinada

região desse plasmídeo propicia que a proteína seja expressa contendo uma cauda de poli-

histidina (cauda poli-His) composta de 20 resíduos de aminoácidos

(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH), incluindo 6 resíduos de histidinas seguidos (Figura 6A). Essa

cauda facilita o processo de purificação da proteína, como será explicado a seguir com mais

detalhes.

Além da cauda, esse plasmídeo confere resistência ao antibiótico canamicina à

bactéria e permite também que se tenha controle sobre a indução da expressão da proteína

de interesse através da presença da sequência do promotor T7 (Figura 6A). Isso ocorre pela

adição de um indutor análogo a 1,6-aldolactose ao meio de cultura da bactéria, sendo o IPTG

(isopropril β-D-1-tiogalactopiranosideo) o indutor mais comumente usado. Essa molécula é

capaz de se ligar ao operador O, componente do promotor lacUV5 do operon lac do genoma

da bactéria (Figura 6B). Esse operador está normalmente reprimido pelo produto do gene

lac I, mas na presença de um indutor, o repressor se desliga do operador e permite a

expressão da T7 RNA polimerase. Essa polimerase é originária do prófago do bacteriófago

lisogênico T7 e foi integrada no genoma de algumas cepas de E. coli. Graças à presença da T7

RNA polimerase, é possível ativar o promotor T7 do plasmídeo pET28a e, assim, induzir a

37

expressão da proteína recombinante (Studier et al., 1990). A especificidade dos promotores

envolvidos é bastante alta, permitindo o controle do momento da expressão da proteína

recombinante logo após a adição do IPTG.

A expressão de proteínas pelo plasmídeo pET28a só ocorre caso sejam utilizadas

cepas específicas de E. coli, como a BL21(DE3). Essa cepa é ideal para uso com sistemas de

expressão baseados no promotor T7 porque, como mencionado, essas bactérias possuem o

prófago do bacteriófago T7 integrado em seu genoma, logo, na presença do agente indutor

IPTG, elas expressam a enzima T7 RNA polimerase que está sob controle do promotor

lacUV5 (Figura 6B). Além disso, essa linhagem é capaz de tolerar o grande acúmulo de RNAm

e proteínas recombinantes que pode ocorrer durante a indução, não propiciando a

degradação de proteínas porque não expressam determinadas proteases comuns em E. coli.

Dessa maneira, células de E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o

plasmídeo contendo a sequência de interesse. Para isso, células competentes descongeladas

a 4 °C em banho com gelo foram incubadas por 30 min após adição de 1 μL da solução

estoque do plasmídeo. Em seguida, as células foram submetidas a um choque térmico a 42

°C por 1,5 min e rapidamente incubadas no gelo por mais 2 min. Depois disso, 800 μL de

meio SOC (20 g/L de peptona; 5 g/L de extrato de levedura; 500 mg/L de NaCl; 2,5 mM de

KCl; 10 µM de MgCl2; 20 µM de glicose) foram adicionados e as células foram incubadas a 37

°C por 60 min. As células foram, então, plaqueadas em meio LB sólido (10 g/L de triptona; 5

g/L de extrato de levedura; 10 g/L de NaCl, ágar 1,5%) acrescido de 30 µg/mL de canamicina

e cultivadas a 37 °C, overnight.

38

Figura 6: Estratégia de clonagem e expressão de proteína recombinante no plasmídeo pET28a. (A) Mapa da região de clonagem e expressão do plasmídeo pET28a. A posição das enzimas de restrição, NdeI e XhoI, usadas para inserção da sequência otimizada de nucleotídeos que codifica SbCHIP está destacada em vermelho. Além disso, é mostrada a sequência que codifica a cauda de poli-histidina (His-tag), e as regiões do promotor T7 e do operador lac, responsáveis pela regulação do controle de indução de expressão pela adição do indutor IPTG. (B) Esquema do funcionamento do sistema pET para expressão de proteínas recombinantes. A presença do indutor IPTG impede a ligação do repressor lac e permite a transcrição do gene da T7 RNA polimerase. Esta, por sua vez, ativa o promotor T7 e induz a transcrição do gene da proteína de interesse (imagem adaptada da original, encontrada no manual da Novagen).

39

Para que a transformação seja bem-sucedida, as bactérias devem estar

competentes, isto é, capazes de internalizar o plasmídeo. Para isso, as células são cultivadas

em meio LB sólido a 37 °C overnight. Em seguida, uma colônia isolada é transferida para 20

mL de meio PSI (16 g/L de peptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 0,4 g/L de

KH2PO4, 0,5 g/L de Na2HPO4), onde é cultivada a 37 °C overnight, sob agitação de 200 rpm.

Após o crescimento, 5 mL do pré-inóculo foram transferidos para 200 mL de meio PSI e

cultivados nas mesmas condições até atingir A600nm entre 0,45 e 0,50, quando as células

foram incubadas no gelo por 10 min. Elas foram, então, centrifugadas a 3500 rpm por 10 min

a 4 °C, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 25 mL de

tampão I (30 mM KOH, 50 mM MgCl2, 100 mM RbCl2, 13 mM CaCl2, 30 mM ácido acético e

13,5%, glicerol pH 5,8) e incubado no gelo por 15 min. Após outra centrifugação, a 3500 rpm

por 15 min a 4 °C, o precipitado foi ressuspendido gentilmente em 8 mL de tampão II MOPS

(0,084 g/L [ácido 3-(Nmorfolino) propanosulfonico], 100 mM CaCl2, 10 mM RbCl2, 13,5 %

Glicerol). As células foram distribuídas em alíquotas de 100 µL, congeladas em nitrogênio

líquido e armazenadas a -80 °C.

Finalmente, para indução de expressão de proteínas recombinantes, células de E.

coli BL21(DE3) foram transformadas com o plasmídeo pET28a-His-SbCHIP e cultivadas em

100 mL de meio LB líquido contendo 30 µg/mL de canamicina a 37 °C overnight sob agitação

de 200 rpm. Em seguida, 25 mL foram transferidos para 500 mL de meio LB também

acrescidos de antibióticos e cultivadas a 37 °C até atingirem A600nm entre 0,6 e 0,8. Neste

momento, 0,5 mM de IPTG foram adicionados e as bactérias cresceram em diferentes

temperaturas por diferentes tempos. Para a proteína SbCHIP foram feitos testes para

determinação de tempo e temperatura de ótimos de expressão. Após esses períodos, as

células foram centrifugadas a 3500 rpm por 15 min a 4 °C e o precipitado foi armazenado a -

20 °C.

Outras chaperonas utilizadas neste trabalho foram expressas utilizando clones já

construídos de acordo com protocolos já estabelecidos pelo grupo (Silva et al., 2013; Tiroli-

Cepeda et al., 2014). A Tabela 1 resume as condições utilizadas para expressão das

chaperonas.

40

Tabela 1: Condições utilizadas para expressão das proteínas recombinantes em E. coli BL21(DE3).

Proteína Organismo Vetor Temperatura (°C) Tempo (h)

SbCHIP Sorghum bicolor pET28a 30 5

HsHsc70 Homo sapiens pET28a 37 4

1.3.3. Lise das células bacterianas

Os precipitados congelados, formados pelas bactérias que expressaram as

proteínas recombinantes, foram ressuspendidos em tampão de lise, composto de 20 mM de

Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 750 µM de PMSF, 20 ng/mL

de lisozima e 2,5 µL de RQ1 RNase-free DNase (Promega 1u/µL). Após incubação por 30 min

no gelo, as células foram lisadas por sonicação usando Misonix Ultrasonic Liquid Processor,

com 10 pulsos de 12 s intercalados por 1,5 min e amplitude de 40 W. A suspensão foi

centrifugada a 13000 rpm por 1 h a 4 °C, o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0,45 μM

(Millex® GV) e utilizado para posterior purificação.

1.3.4. Purificação das proteínas

- Cromatografia de afinidade ao níquel

A cromatografia de afinidade ao níquel foi a primeira etapa de purificação

utilizada neste trabalho devido à presença da cauda poli-His na porção N-terminal das

proteínas. Essa técnica se baseia na interação reversível entre uma proteína alvo e um

ligante específico presente na matriz de uma resina cromatográfica. Essa interação pode

ocorrer de várias formas, como com anticorpos ou sondas nos quais se liga a proteína de

interesse, receptores que ligam hormônios ou, como no caso aqui utilizado, por afinidade a

íons metálicos imobilizados (IMAC). Neste último caso, ocorre a interação entre espécies

doadoras de elétrons presentes na superfície de proteínas, como grupamentos tiol dos

resíduos de cisteína, indol do triptofano ou imidazol da histidina, com íons metálicos

coordenados em um suporte sólido (Porath, 1992).

Para isso, utilizou-se a coluna HisTrapTM HP (GE Healthcare) de 5 mL pré-

empacotada e coordenada com íons de Ni+2, os quais atuam como centros de adsorção e

interagem com os grupamentos imidazol existentes nos resíduos de histidina da cauda de

poli-His. Após a ligação na coluna e etapas de lavagem para eluição das proteínas

41

contaminantes presentes no extrato celular bacteriano, a proteína pode ser eluída da coluna

por competição com outras moléculas doadoras de elétrons, como o imidazol, por exemplo.

O processo de purificação foi feito com a coluna de afinidade acoplada ao

sistema de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) AKTA (Amershan Pharmacia Biotech).

Para isso, o lisado obtido da sonicação e centrifugação das células bacterianas foi aplicado na

coluna previamente equilibrada com tampão A (Tabela 2). Em seguida, 10 volumes de coluna

(CV) do mesmo tampão foram utilizados para eluição das proteínas contaminantes que não

interagem na coluna (flowthrough). A partir de então, iniciou-se um gradiente linear

crescente de tampão B, que contém maior concentração do competidor imidazol (500 mM)

até atingir 100% deste em 30 CV de eluição. A cromatografia foi feita sob fluxo de 3 mL/min

e pressão máxima de 0,3 MPa. Os tampões utilizados para este etapa da purificação para

cada proteína estão indicados na Tabela 2.

Tabela 2: Tampões utilizados para cromatografia de afinidade.

Proteína Tampões

SbCHIP e HsHsc70

A 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5; 250 mM NaCl; 20 mM imidazol

B 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5; 250 mM NaCl; 500 mM imidazol

- Cromatografia de exclusão por tamanho ou filtração em gel

A próxima etapa de purificação empregada para obtenção de proteínas puras foi

a cromatografia de exclusão por tamanho ou filtração em gel. Este tipo de cromatografia é

um método muito utilizado e bem conhecido de separação de moléculas dependendo de seu

tamanho e massa molecular. Para que a separação ocorra, a fase estacionária das colunas de

filtração em gel é formada por um material poroso, que pode consistir de uma matriz de

poliacrilamida, agarose ou dextran, pelo qual as moléculas de diferentes tamanhos são

filtradas (Duong-Ly e Gabelli, 2014). As moléculas podem entrar ou não nos poros da resina,

dependendo do seu tamanho e do tamanho dos poros formados. Moléculas maiores são

incapazes de entrar nesses poros, percorrem um caminho menor e são eluídas num volume

de eluição menor do que moléculas pequenas, cujas dimensões possibilitam que elas

percorram um caminho maior, passando pelo interior desses poros (Sepsey et al., 2014).

42

As colunas de exclusão por tamanho são caracterizadas pelas resinas que a

compõe, pelo seu volume morto e pelo volume final. O tipo de resina determina o tamanho

dos poros e a capacidade de separação da coluna, isto é, o tamanho máximo e mínino das

moléculas que podem ser separadas. Moléculas com tamanho maior ou igual ao máximo de

separação serão eluídas no volume morto da coluna, que também corresponde ao volume

não ocupado pela fase estacionária. Moléculas com tamanho menor ou igual ao mínimo de

separação serão eluídas no volume final da coluna. Além de ser usada na purificação de

proteínas, a cromatografia de exclusão por tamanho pode também ser usada como

ferramenta para caracterização de parâmetros hidrodinâmicos das proteínas, uma vez que

seu princípio de funcionamento está intimamente ligado ao tamanho das moléculas.

A coluna utilizada para purificação das proteínas deste trabalho foi a HiLoad

Superdex 200 XK 26/60 (GE Healthcare) acoplada ao sistema de FPLC (Fast Protein Liquid

Chromatography) ÄKTA (Amershan Pharmacia Biotech). O tampão utilizado para esta etapa

de purificação para SbCHIP e HsHsc70 é composto de 20 mM de Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5 e

250 mM de NaCl. Em todas as corridas de filtração em gel, a coluna foi primeiramente

equilibrada com pelo menos um CV de tampão, em seguida a amostra foi aplicada na coluna

e eluída com um CV de tampão, em fluxo de 2,5 mL/min e pressão máxima de 0,5 MPa.

Absorbância a 280 nm foi monitorada para determinar o volume de eluição das proteínas

eluídas.

1.3.5. Determinação da concentração e grau de pureza das proteínas

Durante a purificação, as frações coletadas nas etapas cromatográficas foram

analisadas por eletroforese de SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Para isso, as amostras foram

diluídas na proporção 1:1 com tampão de amostra para eletroforese (Tris-HCl 50 mM pH 6,8;

DTT 100 mM; SDS 2%; azul de bromofenol 0,1% e glicerol 10%) e aplicadas em gel de

poliacrilamida juntamente com um padrão de massa molecular (Broad Range Promega).

Para o gel: foram preparados o gel de empacotamento, contendo 6% de mix acrilamida/bis-

acrilamida, 150 mM Tris pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% de persulfato de amônio e TEMED e o gel de

separação contendo 10-15% de mix acrilamida/bis-acrilamida, 400 mM Tris pH 8,8, 0,1%

SDS, 0,1% de persulfato de amônio e TEMED. A eletroforese foi realizada no aparato Mini-

PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad) com corrente fixa de 15 A por gel. Os géis foram corados em

solução etanol:ácido acético:água 5:1:15 (v:v:v) e Coomassie Brilliant Blue R (Bio-Rad) 0,25%

43

e descorado em ácido acético:etanol:água 3:2:35 (v:v:v). As proteínas tiveram seu grau de

pureza avaliada pela análise quantitativa comparativa das bandas de interesse observadas

pelos SDS-PAGE através do programa ImageJ (Schneider et al., 2012).

Após o processo de purificação, a concentração das proteínas foi determinada

pelo método de Edelhock (Edelhoch, 1967), pelo qual foi medida absorbância das amostras a

280 nm, assumindo que os resíduos de triptofano e tirosina foram completamente expostos

na presença de 6M de cloreto de guanidina em tampão 25 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 6,5. As

amostras foram incubadas durante 10 min a temperatura ambiente e a absorbância foi

medida utilizando o espectrofotômetro GenesysTM 10S UV-Vis (Thermo Scientific). Os valores

de absorbância foram convertidos em concentração de proteína através da lei de Beer-

Lambert:

onde A é a absorbância, l é o comprimento do caminho ótico (cm), ε é o

coeficiente de absorbância molar (M-1.cm-1) e C é a concentração molar (mol/L).

O coeficiente de absorbância molar da proteína foi calculado, pela fórmula

abaixo (Pace et al., 1995), levando em consideração os coeficientes de absorbância molar

dos resíduos de triptofano, tirosina e cistina:

( ) ( ) ( )

1.3.6. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)

Dicroísmo circular é uma técnica espectropolarimétrica amplamente usada para

o estudo da conformação e estabilidade de proteínas, fornecendo informações sobre a

composição global de estrutura secundária. Esse método utiliza a luz circularmente

polarizada resultante da combinação de dois feixes de luz linearmente polarizados, um na

horizontal e outro na vertical. A luz circularmente polarizada à direita e à esquerda é incidida

na amostra e moléculas quirais com estruturas assimétricas são capazes de absorver essa

luz. A diferença de absorção à esquerda e à direita resulta em uma luz elipticamente

polarizada e o ângulo (θ) é a elipticidade medida em mdeg (Corrêa e Ramos, 2009).

44

As proteínas são moléculas quirais tanto pela característica assimétrica da

ligação peptídica quanto pelas interações formadas na estrutura secundária. Desse modo,

proteínas com diferente composição de estrutura secundária apresentam espectros de CD

característicos (Figura 7). Proteínas ricas em hélices-α apresentam bandas negativas a 222 e

208 nm e uma banda positiva a 193 nm; proteínas com folhas-β bem definidas apresentam

uma banda negativa a 217 nm e uma banda positiva a 195 nm; e proteínas com estrutura

desordenada apresentam baixa elipcidade acima de 210 nm e uma banda negativa a 200 nm

(Greenfield, 2006).

Para a obtenção dos espectros de CD de SbCHIP foi utilizado o

espectropolarímetro J-720 (JASCO) sob fluxo constante de 10 L/min de N2. As amostras de

proteínas em diferentes concentrações foram colocadas em cubetas de quartzo de 1 mm de

caminho óptico. Os espectros foram obtidos pela média acumulada de 16 espectros de 200 a

260 nm medidos a 20 nm/min com 1 s de tempo de resposta, subtraídos da média de sinal

obtido do tampão. A temperatura da cela foi mantida constante a 25 °C através de um

sistema interno de controle (Peltier Type Control System PFD 425S- Jasco).

Figura 7: Perfil de dicroísmo circular para estruturas secundárias de proteínas. Proteínas compostas majoritariamente por hélicea-α apresentam espectro com uma banda positiva em 190 nm e duas bandas negativas em 208 e 222 nm. As proteínas ricas em folhas-β apresentam uma banda positiva em torno de 195 nm e uma banda negativa em torno de 217 nm. E proteínas com estrutura desordenada apresentam banda negativa próxima de 200 nm.

45

Para o tratamento dos dados, o sinal de CD medido (mdeg) foi convertido para

elipticidade molar residual ([θ]) que é definida pela seguinte equação:

[ ]

onde θ é a elipticidade em miligraus (mdeg), MM é a massa molecular da

proteína (g/mol), C é a concentração da proteína (mg/mL), l é o comprimento do caminho

ótico (cm) e n é o número de resíduos de aminoácidos da respectiva proteína. Para calcular a

fração de hélices-α (fH) presente na estrutura de SbCHIP foi utilizada a equação abaixo e a

elipcidade molar residual a 222 nm (Morriset et al., 1973).

[ ]

Além de determinar a composição de estrutura secundária, pode-se utilizar o CD

como sonda para acompanhar o desenovelamento de proteínas induzido por temperatura

ou por agentes desnaturantes. Para desenovelamento induzido por temperatura o sinal de

CD a 222nm de 5 µM de SbCHIP foi monitorado em cubeta de quartzo de 2 mm ao longo do

aumento de temperatura de 20 até 90 °C; enquanto para o desenovelamento induzido por

ureia, o sinal foi monitorado em soluções contendo 5 µM de SbCHIP e concentrações

crescentes de ureia de 0 até 8 M. O valor da temperatura média no ponto de transição (Tm)

e concentração média de ureia no ponto de transição (Cm) foram obtidos pelo ajuste

sigmoidal da curva de desenovelamento de cada experimento.

1.3.7. Espectroscopia de fluorescência intrínseca do triptofano

A técnica de espectroscopia de fluorescência é baseada na capacidade de uma

substância de emitir luz quando excitada por radiações como a luz ultravioleta (UV), por

exemplo. A fluorescência ocorre quando um elétron de uma molécula retorna ao seu estado

fundamental, emitindo fótons de luz, depois de ser excitado para um estado quântico mais

elevado por algum tipo de energia. Esta técnica pode ser usada no estudo de proteínas

porque existem três aminoácidos capazes de emitir fluorescência quando excitados por luz

UV: o triptofano (W), a tirosina (Y) e a fenilalanina (F), todos com anéis aromáticos em sua

46

estrutura. Em comparação com os outros resíduos, o sinal de fluorescência do W é o mais

intenso quando há excitação a 280 ou 295 nm e a medida de seu espectro de emissão

apresenta intensidade máxima de fluorescência em comprimentos de onda (λ) diferentes de

acordo com a polaridade do meio que se encontra. Por esse motivo, essa técnica permite

utilizar os resíduos de triptofano como sonda local para obtenção de informações sobre a

conformação de proteínas. Quando a proteína está enovelada, os resíduos de triptofano

geralmente estão localizados no interior na proteína, num ambiente apolar não exposto ao

solvente, e fluorescem em λ < 340 nm. No entanto, quando a proteína é desenovelada, pela

adição de um agente desnaturante como ureia, por exemplo, este resíduo é exposto ao

solvente, encontra-se em um ambiente polar e fluoresce em λ >340 nm (Lakowicz, 2006).

Dessa forma, os experimentos para medir emissão de fluorescência de triptofano

foram conduzidos a 25 °C com amostras de SbCHIP a 4 µM em tampão 20 mM

Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, na ausência e presença de 8M de ureia, em

cubetas de quartzo de quatro faces polidas de 1 x 1 cm de caminho ótico. Os espectros de

emissão foram medidos com excitação a 280 nm, os dados foram coletados a cada 1 nm

dentro do intervalo de 300 a 400 nm usando fluorímetro Cary Eclypse (Varian). A análise dos

dados foi realizada através da observação do comprimento de onda máximo (λ máx) e do

cálculo do centro de massa espectral (<λ>), pela equação abaixo, onde λi corresponde a cada

comprimento de onda e Fi à intensidade de fluorescência em λi.

∑

∑

1.3.8. Fluorimetria de varredura diferencial (DSF)

Além da medida de CD, utilizou-se o DSF para analisar a estabilidade térmica de

SbCHIP. Essa técnica utiliza uma sonda que fluoresce quando se liga em resíduos

hidrofóbicos são expostos pelo desenovelamento da proteína induzido por temperatura.

Para tal, ao longo da rampa de temperatura de 25 a 97 °C a 1,8 °C/min, a emissão de

fluorescência da sonda excitada a 575 nm foi monitorada em tempo real através do

equipamento StepOne Plus real-time PCR System (Applied Biosciences). O experimento foi

realizado em quadruplicata para cada concentração de proteína utilizada (2,5, 5 ou 10 µM).

As reações foram preparadas com volume final de 20 µL em tiras de 8 poços, como descrito

47

no manual do fabricante Protein Thermal Shift Dye Kit (Thermo Fisher Scientific).

Resumidamente, cada reação continha: 5 µL de tampão Protein Thermal Shift™, 2,5 µL da

sonda Diluted Protein Thermal Shift Dye™ (10x) e 12,5 µL de proteína SbCHIP de forma que a

concentração final fosse uma das indicadas. Os brancos continham 12,5 µL de tampão. As

tiras foram tampadas e centrifugadas por 1 min a 1000 rpm (4 °C). O programa utilizado para

a obtenção dos dados foi StepOne Software 2.3 e o programa utilizado para o tratamento

dos dados e cálculo das derivadas das curvas foi Protein Thermal Shift Software 1.1.

1.3.9. Calorimetria de varredura diferencial (DSC)

A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é uma técnica termo analítica

utilizada para a determinação da estabilidade térmica de uma proteína através da medida de

mudanças de calor associadas à desnaturação proteica induzida por aumentos de

temperatura constantes. Normalmente, proteínas em solução estão em equilíbrio entre suas

formas nativa e desenovelada, o aumento de temperatura desloca o equilíbrio induzindo a

desnaturação da molécula e o DSC mede a entalpia do processo de desenovelamento

resultante dessa desnaturação (Bruylants et al., 2005).

Basicamente, o sistema do DSC consiste de uma célula de referência e uma

célula de amostra que devem permanecer na mesma temperatura enquanto elas são

aquecidas. A célula de referência deve ser preenchida com tampão e a célula de amostra

com a proteína de interesse em solução. Conforme ocorre o aumento de temperatura nas

duas células, a absorção de calor que acontece quando a proteína desenovela causa

diferença de temperatura entre a célula de amostra e a célula de referência. O sistema do

DSC é programado para igualar a diferença de temperatura entre as células, através da

liberação de diferença de potencial (DP) usada para manter a temperatura igual entre as

células (Figura 8). Essa medida é convertida na quantidade de calor que compreende a

mudança de calor gerada pelo desenovelamento proteico (Bruylants et al., 2005; Johnson,

2013).

48

Figura 8: Esquema ilustrando a composição do sistema de DSC. O sistema é composto por uma célula de referência e uma célula de amostra que devem permanecer na mesma temperatura enquanto elas são aquecidas. A célula de referência deve ser preenchida com o tampão e a célula de amostra com a proteína de interesse em solução. Conforme ocorre o aumento de temperatura nas duas células, a absorção de calor que acontece quando a proteína desenovela causa diferença de temperatura entre a célula de amostra e a célula de referência. O sistema, então, é programado para igualar a diferença de temperatura entre as células, através da liberação de diferença de potencial (DP) que é convertida na quantidade de calor que compreende a mudança de calor que gerou o desenovelamento ou interação entre as proteínas (esquema adaptado do site do fabricante Malvern).

Os experimentos foram realizados com amostras de SbCHIP a 50 e 200 µM em

tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, o mesmo tampão foi utilizado

como referência. Inicialmente, para calibração do equipamento foram realizadas 20

varreduras de 20 a 90 °C utilizando tampão na célula de referência e na célula de amostra.

Para a determinação da estabilidade térmica da SbCHIP, foram realizadas duas varreduras de

20 a 35 °C e em seguida duas varreduras de 20 a 90 °C. A média das varreduras de tampão-

tampão foi subtraída da primeira varredura (20 a 90 °C) obtida com as amostras de proteína.

Os experimentos foram realizados em MicroCal VP-DSC (Malvern) e a análise dos dados foi

feita pelo programa Origin® 7.0 VP-DSC pelo qual foi possível subtrair as varreduras do

tampão, gerar uma linha base e calcular parâmetros calorimétricos temperatura no ponto

médio de transição (Tm), variação de entalpia (ΔH).

49

1.3.10. Cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a um detector multi-ângulo

de espalhamento de luz (SEC-MALS)

Para determinação da massa molecular de SbCHIP, e consequentemente seu

estado oligomérico em solução, foi utilizada a técnica de SEC-MALS. Essa técnica acopla o

detector de absorbância a 280 nm monitorada de uma cromatografia analítica de exclusão

por tamanho (SEC) com detectores de espalhamento de luz em diferentes ângulos (MALS) e

um detector de índice de refração (RI), fornecendo uma medida de massa molecular

absoluta de moléculas em solução (Wyatt, 1993).

Os experimentos de SEC-MALS foram realizados em coluna Superdex 200 10/300

GL (GE Healthcare) de 25 mL, conectada ao sistema ÄKTA FPLC (Amershan Pharmacia

Biotech) para medição de absorbância a 280 nm. Esse sistema está acoplado aos

equipamentos: miniDAWN TREOS (Wyatt Technologies), que possui os três detectores de

espalhamento de luz localizados em 3 ângulos diferentes em relação à amostra; e Optilab T-

rEX (Wyatt Technologies), que mede o índice de refração (IR) da amostra, corrigindo assim

sua concentração para o calculo da massa molecular. A análise dos dados foi realizada pelo

software ASTRA (Wyatt Technologies).

A cromatografia analítica foi feita sob fluxo constante de 0,5 mL/min, com

pressão máxima de 1,5 Mpa com coluna previamente equilibrada com tampão 20 mM

Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, com do detector de espalhamento de luz acusando

valores inferiores a 0,02 V e a leitura do índice de refração acusando valores inferiores a

0,001 RIU. Foram aplicados 500 μL de SbCHIP em diferentes concentrações, previamente

centrifugadas por 15 minutos a 13.000 x g e filtradas em 0,22 μM. A massa molecular média

de SbCHIP foi determinada pela média da triplicata dos experimentos realizados.

A técnica de SEC-MALS também foi utilizada para determinação da interação

entre SbCHIP e HsHsc70. Para isso, as proteínas SbCHIP e HsHsc70 foram incubadas por 4 h a

4 °C separadamente ou em conjunto em três proporções de concentração diferentes: 50 µM

SbCHIP e 25 µM HsHsc70; 25 µM SbCHIP e 50 µM HsHsc70 e 50 µM SbCHIP e 50 µM

HsHsc70. Após incubação, as amostras foram aplicadas na coluna Superdex 200 Increase

10/300 GL (GE Healthcare) de 22 mL, conectada aos detectores acima mencionados de

absorbância, espalhamento de luz e índice de refração. Ao longo da cromatografia foram

coletadas frações de 0,5 mL, as quais foram analisadas por SDS-PAGE 12%. Os perfis

50

cromatográficos, o SDS-PAGE e as massas medidas em cada pico obtido foram utilizados

para caracterização da formação de complexos entre as proteínas.

1.3.11. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)

O espalhamento de luz dinâmico (DLS) foi utilizado para a determinação do

coeficiente de difusão de SbCHIP. Essa técnica mede as flutuações da intensidade de

espalhamento de luz das partículas em solução ao longo do tempo. Essas flutuações são

decorrentes do movimento Browniano ao qual as partículas estão sujeitas em solução,

sendo que a intensidade de movimentação é inversamente proporcional ao tamanho das

partículas, ou seja, moléculas pequenas movem-se mais rapidamente e espalham menos luz

do que moléculas maiores (Bloomfield, 1981; Banachowicz, 2006; Jachimska et al., 2008). A

análise das flutuações de intensidade de espalhamento de luz ao longo do tempo permite a

determinação do coeficiente de difusão da proteína, que pode ser convertido em

distribuição de tamanho pela equação de Stokes-Einstein (Edward, 1970).

As medidas foram realizadas em equipamento Zetasizer Nano ZS-Zen 3600

(Malvern) a 25 °C usando cubetas de plástico de 1 cm contendo 50 µM de SbCHIP em

tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. A curva de distribuição de

coeficiente de difusão foi obtida pela média de 50 leituras de 60 s e o valor médio de

coeficiente de difusão (D) foi obtido pela média de experimentos em quadruplicata.

1.3.12. Filtração em gel analítica (GFA) para determinação de raio hidrodinâmico

Além de auxiliar na purificação e caracterização da massa molecular absoluta de

proteínas, a GFA também pode ser utilizada para determinação do raio hidrodinâmico (Rh)

das proteínas em solução. Utilizando proteínas modelos globulares com massa e Rh

conhecidos é possível construir uma curva padrão que associa o Rh com o coeficiente de

distribuição dessas proteínas pela eluição na coluna de filtração em gel utilizada. O

coeficiente de distribuição (Kav) é determinado com base no volume de eluição (Ve) de cada

proteína, no volume morto (Vo) e no volume total (Vt) da coluna cromatográfica, segundo a

fórmula abaixo:

51

Dessa forma, para os experimentos de filtração em gel analítica foi utilizada a

coluna de Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) de 25 mL, previamente equilibrada com

tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl e conectada ao sistema ÄKTA FPLC

(Amershan Pharmacia Biotech). O fluxo da corrida foi de 0,5 mL/min, pressão máxima de 1,5

MPa e absorbância a 280 nm foi monitorada para determinação do volume de eluição de

cada proteína. Para determinar o volume morto da coluna foram utilizados 2 mg/mL de azul

de dextran e para a curva padrão foram utilizadas 1 mg/mL das proteínas indicadas na

Tabela 3 obtidas do Gel Filtration Calibration Kit (GE Healthcare). O volume de eluição da

proteína SbCHIP a 50 µM também foi utilizado para obter seu coeficiente de distribuição na

GFA, nas mesmas condições utilizadas. Com o coeficiente de distribuição das proteínas

modelo construiu-se um gráfico de Rh em função de (-log Kav)1/2 e a partir do ajuste linear

dos pontos obteve-se uma equação de reta utilizada para estimar o Rh de SbCHIP.

Tabela 3: Proteínas modelos utilizadas na GFA para determinação de Rh.

Proteína MM (kDA) Rh (Å)

Ribonuclease A 13,7 16,4

Anidrase carbônica 29,0 23,0

Ovalbumina 43,0 30,5

Conalbumina 75,0 36,5

Aldolase 158,0 48,1

Ferritina 440,0 61,0

52

1.3.13. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos

A fim de comparar os parâmetros de massa molecular, coeficiente de difusão (D)

e raio hidrodinâmico (Rh) obtidos pelas técnicas biofísicas com parâmetros teóricos

calculados considerando a proteína como uma esfera rígida não hidratada de mesma massa,

as seguintes equações foram utilizadas, sendo a primeira conhecida como equação de

Stokes-Einstein:

(

)

onde D é o coeficiente de difusão (cm2/s), Kb é constante de Boltzman (1,38 x 10-

23 J/K), T é a temperatura (K), π é 3,14, η é a viscosidade do solvente (da água, 1,002 x 10-2

Poise), Rh é o raio hidrodinâmico (m), MM é a massa molar (g/mol), Vbar é o volume parcial

específico (da água 0,7269 cm3/g) e N é o número de avogrado (6,023 x 1023 Da/g).

Para obter informações sobre o formato da proteína foi utilizado o fator de

Perrin (f/f0), definido como a razão da medida do coeficiente friccional da proteína (f) com o

de uma esfera de mesma massa (f0). O coeficiente fricional está relacionado com o

coeficiente de difusão da proteína, de acordo com a fórmula abaixo. Considerando uma

mesma temperatura e a constante de Boltzman, o fator de Perrin pode ser calculado pela

razão entre coeficiente de difusão (D) da proteína e o D teórico (Harold e Erickson, 2009).

1.3.14. Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS)

Espalhamento de raios X a baixo ângulo é um método bastante utilizado para a

caracterização estrutural em baixa resolução (até 8 nm) de proteínas em solução,

fornecendo informações a respeito do seu tamanho e formato. O experimento consiste de

uma solução de moléculas aplicada em um porta-amostra sobre a qual incide um feixe de

raios X monocromático, onde a intensidade de luz espalhada é detectada por um detector

de raios X. O padrão de espalhamento do tampão também é medido e subtraído do

53

espalhamento obtido para a solução de amostra e o padrão resultante está relacionado ao

tamanho e formato intrínseco da proteína de interesse em solução (Kikhney e Svergun,

2015). Os experimentos de SAXS são geralmente realizados em fontes de luz síncrotron que

geram raios X de alta intensidade, dessa maneira a coleta de dados foi conduzida no

Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS) encontrado no Centro Nacional de Pesquisa em

Energia e Materiais (CNPEM) na linha de luz D11A – SAXS1. As medidas foram realizadas a 20

°C em célula de mica de 1 mm com um feixe de raios X monocromático de comprimento de

onda igual a 1,488 Å. A amostra permanece a uma distância de cerca de 1000 mm,

resultando em uma faixa do vetor de espalhamento efetivo de 0,015 < q < 0,32 Å-1, onde s é

a magnitude do vetor de espalhamento definido por q = (4π/λ)sinθ (θ é o ângulo de

espalhamento).

Durante a coleta, as curvas de intensidade de espalhamento foram corrigidas

para a resposta do detector, pela intensidade do feixe incidente e absorção da amostra. De

acordo com a tolerância da amostra à exposição aos raios X, foram determinados os tempos

de exposição de cada coleta, sendo realizadas 10 coletas em cada tempo (20, 60 ou 100 s).

As coletas foram realizadas com amostras de SbCHIP em diferentes concentrações (10 a 60

µM) em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl.

Várias características da amostra podem ser obtidas diretamente pela curva de

espalhamento, como dimensão máxima (Dmax), raio de giro (Rg) e o formato da proteína em

estudo, em especial nos casos em que as amostras são monodispersas, onde todas as

partículas em solução são idênticas (Kikhney e Svergun, 2015). O processamento de dados

foi realizado através dos programas contidos no ATSAS (Franke et al., 2017). Através da

aproximação de Guinier, foi possível obter o raio de giro (Rg) da proteína (Guinier, 1939); a

dimensão máxima de partícula (Dmáx) foi obtida através da função P(r). Outra análise

realizada a partir das curvas de espalhamento é a análise de Kratky pela qual se tem

informações sobre o grau de enovelamento, rigidez e flexibilidade da estrutura proteica

(Glatter e Kratky, 1982; Mertens e Svergun, 2010).

54

1.3.15. Ensaio de ubiquitinação

Com a finalidade de determinar a atividade de ubiquitinação da proteína SbCHIP

foram feitos ensaios de ubiquitinação in vitro usando o kit E2-Ubiquitin Conjugation (Abcam

139472) e seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante com ligeiras modificações. Com

exceção da enzima E3 (SbCHIP), da pirofosfatase (Sigma-Aldrich® I1643) e dos alvos de

ubiquitinação (SsHsp70, SsHsp90, HsHsc70 e luciferase), todos os componentes da reação

foram fornecidos pelo fabricante. As seguintes enzimas E2 de conjugação à ubiquitina foram

utilizadas: UbcH1 (UBE2K), UbcH3 (UBE2R1), UbcH5a,b,c (UBE2D1/2/3), UbcH6 (UBE2E1),

UbcH7 (UBE2L3), UbcH8 (UBE2E2), UbcH10 (UBE2C) e UbcH13/Mms2 (UBE2N).

Em resumo, foram preparadas reações de 20 µL contendo: 1x tampão de

ubiquitinação, 2,5 µM de ubiquitina biotinilada, 20 U/mL de pirofosfatase, 1 mM de DTT, 5

mM Mg-ATP, 100 nM de enzima E1 (enzima de ativação da ubiquitina), 2,5 µM de enzima E2

e 5 µM de SbCHIP (E3 ubiquitina ligase). As reações para avaliar a ubiquitinação de

substratos proteicos continham todos esses componentes e também 5 µM de um dos alvos

utilizados: SsHsp70, SsHsp90, HsHsc70 ou luciferase; nesses casos a concentração de SbCHIP

foi de 2,5 µM. Como controles negativos foram preparadas reações na ausência de SbCHIP e

de enzima E2.

As reações foram, então, incubadas por 4 h a 37 °C. Nos tempos de 1 e 4 h foram

coletadas alíquotas de 10 µL das reações, às quais foram adicionados 10 µL de tampão não-

redutor para SDS-PAGE (2x Non-reducing gel loading buffer). As amostras foram então

separadas por SDS-PAGE gradiente de 10 a 15% e analisadas por Western Blotting. Para

detecção das proteínas ubiquitinadas foi usada Streptavidin-HRP (Sigma-Aldrich® S9420),

que tem alta afinidade pela biotina fusionada na ubiquitina utilizada nas reações. Além disso,

também foram usados anticorpos específicos para detecção de HsHsp70 e SsHsp70

(HSP70/HSC70 Plant antibody SPC-312D – StressMarq), da Myc-Luciferase (c-Myc tag

antibody 9E10 – Invitrogen) e da His-SsHsp90 (Anti-His Antibody 27-4710-01 – GE

Healthcare).

55

1.4. Resultados

1.4.1. Análise de similaridade de sequências e obtenção do clone que codifica

SbCHIP

Para a sequência que codifica a proteína SbCHIP e, então, obtê-la pura em

solução, a sequência otimizada foi inserida em plasmídeo de expressão pET28a, entre os

sítios de clivagem das enzimas NdeI e XhoI, o que permitiu a inserção de uma sequência que

codifica uma cauda de poli-histidina na região N-terminal da proteína. As sequências de

nucleotídeos e aminoácidos obtidas a partir do sequenciamento confirmatório da clonagem

estão mostradas na Figura 9.

O clone é constituído por 888 nucleotídeos que codificam 295 resíduos de

aminoácidos, que incluem a cauda de poli-His (resíduos 1-21), seguida pelo domínio TPR

(resíduos 21-133), da região de dimerização (137-213) e do domínio U-box (resíduos 220-

284). Considerando resíduos da sequência primária, calculou-se a massa molecular de 33

kDa e o pI teórico de 6,7. Existem 5 resíduos de triptofano na sequência de SbCHIP, os quais

facilitam a determinação da concentração da proteína em solução, pela medida de

absorbância a 280 nm, e permitem que os experimentos de fluorescência intrínseca sejam

realizados, levando em conta a polaridade do meio do ambiente do fluoróforo.

56

Figura 9: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos da proteína His-SbCHIP. A proteína é formada por 295 resíduos de aminoácidos, totalizando 33 kDa e incluindo uma cauda de poli-histidina na região N-terminal (cinza), o domínio TPR de interação com chaperonas (verde), o hairpin de dimerização (azul) e o domínio U-box de ubiquitinação de proteínas clientes (vermelho).

Com o intuito de determinar as relações de similaridade entre a sequência de

aminoácidos da SbCHIP com outras proteínas homólogas de outras espécies, foi realizado

um alinhamento de sequências (Figura 10A). Nele, é possível observar que alguns resíduos

são conservados na proteína, especialmente no domínio U-box na região C-terminal. Em

termos de identidade, obteve-se que a proteína CHIP de Arabidopsis thaliana (AtCHIP) é a

mais similar à SbCHIP, com 58% de identidade; as demais proteínas provenientes de animais

apresentaram identidade de cerca de 35% em relação à SbCHIP (Figura 10C). Como

consequência, o cladograma de similaridade realça a proximidade de AtCHIP com SbCHIP,

formando um clado isolado; enquanto que as CHIP de animais formam outro clado. A

proteína Ufd2 de levedura, a primeira proteína identificada com domínio U-box e conhecida

por ser uma E4 ubiquitina ligase, foi utilizada como grupo externo.

57

Figura 10: Análise de similaridade de sequência da proteína SbCHIP. (A) Alinhamento da sequência de aminoácidos de SbCHIP com proteínas homólogas de camundongo (MmCHIP), humano (HsCHIP), Drosophila (DmCHIP), peixe zebra (DrCHIP), C. elegans (CeCHIP) e Arabidopsis thaliana (AtCHIP). (B) O alinhamento obtido foi utilizado para a obtenção de uma matriz de similaridade que gerou um cladograma pelo método de Neighbor-joining. (C) Matriz de porcentagem de identidade das sequências utilizadas no alinhamento. Pode-se perceber que vários resíduos que compõem os domínios TPR (N-terminal) e U-box (C-terminal) são altamente conservados em todas as espécies. A proteína de A. thaliana foi a que apresentou maior identidade (~60%) enquanto as demais apresentaram cerca de 35% de identidade.

1.4.2. Padronização da expressão e purificação de SbCHIP

O plasmídeo contendo a sequência que codifica a proteína SbCHIP foi

transformado em células competentes de E. coli BL21(DE3) para padronização das condições

ótimas de expressão. Para isso, foram realizados testes em pequena escala usando

diferentes temperaturas (20, 25, 30 e 37 °C) e tempos de indução (2 h, overnight), através da

análise por SDS-PAGE de amostras dos lisados totais de bactérias (Figura 11A) e das frações

58

solúveis e insolúveis resultantes da centrifugação desses lisados (Figura 11B a E). Como é

possível observar no SDS-PAGE, destaca-se uma banda mais intensa que migrou com massa

molecular entre 31 e 45 kDa, correspondendo à expressão da proteína SbCHIP. Percebe-se

ainda que para todas as temperaturas testadas, maior foi a quantidade de proteína expressa

conforme maior o tempo de indução (Figura 11A), porém também aumentou a quantidade

de SbCHIP presente na fração insolúvel (P) (Figuras 11B a E). Dessa forma, considerando o

menor tempo de indução para maior quantidade de proteína solúvel (S), determinou-se que

a melhor condição de expressão ocorreu a 30 °C por 5 h (Figura 11D).

Após a determinação da condição ótima para expressão de SbCHIP em E. coli,

essa condição foi repetida em larga escala (500 mL de meio de cultura) para as etapas de

purificação. A presença da cauda de poli-histidina permitiu que a cromatografia de afinidade

ao níquel fosse a primeira etapa utilizada (Figura 12A e B). Após a lise das células bacterianas

que expressaram SbCHIP, o lisado foi aplicado na coluna cromatográfica, seguido de

lavagens com tampão A para remoção das proteínas com pouca ou nenhuma interação com

o níquel da resina. Em seguida, a proteína foi eluída através de um gradiente linear

crescente de tampão B em três picos principais (Figura 12A e B). No primeiro pico, eluído

com 25% de tampão B (125 mM de imidazol), a proteína SbCHIP foi observada juntamente

com uma banda de menor massa molecular. No segundo e no terceiro picos, eluídos com

40% e 50% de tampão B (200 e 250 mM de imidazol) respectivamente, a proteína foi eluída

já com alto grau de pureza.

59

Figura 11: Teste de expressão da proteína His-SbCHIP em diferentes tempos e temperaturas. O plasmídeo pET28a-His-SbCHIP foi transformado em E. coli BL21(DE3) e as células foram cultivadas a 37 °C em meio LB contendo 30 µg/mL de canamicina até atingir A600nm entre 0,6 e 0,8. A expressão da proteína foi induzida pela adição de 0,5 mM de IPTG nas temperaturas e tempos indicados. Em seguida, as células foram centrifugadas, ressupendidas em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 8,0; 200 mM NaCl; 20 mM imidazol e lisadas por sonicação. (A) O lisado obtido foi analisado por SDS-PAGE 12% ou foi centrifugado gerando as frações solúvel (S) e insolúvel (P) de indução a (B) 20 °C, (C) 25 °C, (D) 30 °C e (E) 37 °C. As frações de cada condição também foram analisadas por SDS-PAGE 12%. (M) padrão de massa molecular; (NI) fração não induzida, antes da adição de IPTG; (P) precipitado fração insolúvel; (S) lisado solúvel. Verificamos que a proteína foi expressa em maior quantidade na fração solúvel se induzida a 30 °C por 5h.

60

As frações do pico dois da cromatografia de afinidade ao níquel foram utilizadas

para a cromatografia de exclusão por tamanho (Figuras 12C e D), que poderia separar

diferentes estados oligoméricos da proteína e também impurezas não observáveis no SDS-

PAGE, como açúcares e ácidos nucléicos. No entanto, a proteína foi predominantemente

eluída em um único pico, com volume de ~200 mL, indicando uma única espécie em solução.

Também foi observado um pico menos intenso em 130 mL, mas que não mostrou bandas

visíveis no SDS-PAGE.

Através destas etapas cromatográficas, a proteína SbCHIP foi obtida pura, com

grau de pureza acima de 95% e com rendimento de aproximadamente 85 mg/L de indução.

Após a determinação da concentração das frações contendo a proteína pura, esta foi

armazenada a 4 °C para uso posterior. O processo de purificação foi repetido a cada 30 dias,

tempo em que se garantiu estabilidade da proteína, sem que houvesse desenovelamento,

degradação e/ou agregação.

A concentração máxima de SbCHIP obtida diretamente após a purificação foi de

cerca de 60 µM. A fim de obter maiores concentrações de amostra, necessária para alguns

experimentos, inicialmente foi testada a concentração da proteína através do uso de

concentradores com filtro para centrífuga Amicon®, porém, verificou-se precipitação da

proteína nos concentradores. Dessa forma, a evaporação no vácuo (utilizando Eppendorf

Concentrator Plus) foi utilizada como método alternativo para obtenção de SbCHIP em

solução em alta concentração. Através desse método, a concentração máxima alcançada foi

de até cerca de 450 µM, permanecendo solúvel quando dialisada em tampão 20 mM

Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 500 mM NaCl.

61

Figura 12: Purificação da proteína His-SbCHIP por cromatografia de afinidade ao níquel e de exclusão por tamanho. Após a indução de expressão proteica a 30 °C por 5h, as células foram centrifugadas e ressuspendidas em tampão A. Em seguida, as células foram lisadas por sonicação e o lisado foi centrifugado. O sobrenadante resultante foi aplicado em coluna HisTrapTM HP (GE Healthcare) de 5 mL com fluxo de 3 mL/min. (A) Cromatograma da afinidade ao níquel obtido na purificação, no qual observa-se que depois da etapa de lavagem com 10 volumes de coluna (CV) de tampão A, SbCHIP foi eluída em três picos, um primeiro com 25% de tampão B (125 mM de imidazol), onde são observadas outras impurezas, um segundo predominante com 40% de tampão B (200 mM de imidazol) e um terceiro com 50% de tampão B (250 mM de imidazol). (B) As frações coletadas durante a cromatografia de afinidade ao níquel foram analisadas por SDS-PAGE 12%. (M) padrão de massa molecular; (I) input aplicado na coluna; (FT) flowthrough; (W) lavagem. (C) Cromatograma da exclusão por tamanho. Nesta etapa, as frações do pico 2 da etapa anterior foram aplicadas na coluna HiLoad Superdex200 XK 26/60 (GE Healthcare) de 360 mL pré-equilibrada em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, sob fluxo constante de 2,5 mL/min. Observa-se a eluição majoritária de SbCHIP no volume de ~200 mL. (D) As frações coletadas durante a cromatografia de exclusão por tamanho foram analisadas por SDS-PAGE 12%. (M) padrão de massa molecular; (I) input aplicado na coluna. Através destas etapas observa-se que a proteína foi obtida em alto grau de pureza (> 95%) e com rendimento de ~85 mg/L de indução.

62

1.4.3. Caracterização da composição de estrutura secundária e estabilidade térmica

Ensaios de dicroísmo circular foram realizados para verificar o enovelamento de

SbCHIP purificada e para caracterizar sua composição de estrutura secundária. A forma do

espectro de CD obtido (Figura 13A), com dois mínimos de sinal de -21000 e -19000

deg.cm2.dmol-1 em 222 e 208 nm respectivamente, indica uma proteína com estrutura

composta predominantemente por hélices-α. O cálculo de fração de hélices-α (fH) indicou

uma quantidade aproximada de 55% de hélices-α.

Outra técnica empregada para avaliar o estado de enovelamento da proteína

SbCHIP foi a fluorescência intrínseca do triptofano, utilizada para investigar alterações locais

nos domínios onde este resíduo é encontrado na proteína. Através da excitação a 280 nm de

amostras de SbCHIP na ausência e presença de ureia e da medida dos espectros de emissão

de fluorescência, observou-se λ máximo de emissão de 335 nm para SbCHIP sem ureia e de

357 nm para a proteína na presença de ureia. O centro de massa (<λ>) calculado para os

espectros foi de 344 e 356 nm, na ausência e presença de ureia, respectivamente.

Figura 13: Espectros de dicroísmo circular e de emissão de fluorescência intrínseca do triptofano obtido para SbCHIP. (A) Os espectros de CD foram medidos usando 10 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, usando cubeta de quatzo de 1 mm a 20 °C. Após subtração do espectro do tampão, os dados convertidos para elipcidade molar [θ] e estão representados como uma média de 16 espectros para cada proteína. A forma do espectro, com mínimos em 208 e 222 nm nm, indica composição de estrutura secundária composta majoritariamente de hélices-α. (B) Espectros de emissão de fluorescência foram obtidos com SbCHIP a 4 μM em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl na ausência e presença de 8 M de uréia, pela excitação da amostra a 280 nm em cubeta de 1 cm. Os dados foram coletados a cada 1 nm no intervalo de 300 a 400 nm. São mostradas a média de 4 espectros acumulados. Para SbCHIP nativa observou-se um máximo de emissão a 335 nm, enquanto na presença de 8 M de ureia, o máximo de emissão foi alterado para 357 nm.

63

O dicroísmo circular também foi utilizado para caracterização da estabilidade

térmica de SbCHIP, através da medida a 222 nm e com aumento de temperatura de 20 a 90

°C. Na curva de desenovelamento induzido por temperatura (Figura 14A), pode-se observar

que o sinal de CD manteve-se estável em cerca de -20000 deg.cm2.dmol-1 no aquecimento

de 20 até 42 °C. De 42 a 50 °C, o sinal diminuiu drasticamente atingindo valores de -2500

deg.cm2.dmol-1 e permaneceu dessa forma até 90 °C (quadrados pretos, Figura 14A). A

temperatura média no ponto de transição (Tm) obtida pelo ajuste sigmoidal da curva de

desenovalemanto foi de 46 ± 1 °C.

Após o aumento de temperatura, a amostra foi resfriada de 90 para 20 °C.

Durante todo o resfriamento (círculos vermelhos, Figura 14A) o sinal de CD permaneceu em

torno de -2500 deg.cm2.dmol-1, indicando que a proteína não foi capaz de se reenovelar

espontaneamente após o desenovelamento térmico. Além disso, foi possível observar

agregação e precipitação da amostra na cubeta após o aquecimento da amostra até 90 °C.

Ademais, quando SbCHIP foi aquecida até a Tm (46 °C) e depois resfriada (círculos azuis,

Figura 14A) o sinal de CD também não retornou ao valor inicial.

A técnica de DSF também foi realizada para obter informações sobre a

estabilidade térmica de SbCHIP. Através do aquecimento da amostra de 20 a 90 °C e de uma

sonda que fluoresce quando se liga em regiões hidrofóbicas foi possível caracterizar o

processo de desenovelamento da proteína. Pela derivada da emissão de fluorescência em

função da temperatura (Figura 14B) determinou-se a temperatura média no ponto de

transição de SbCHIP a 2,5, 5 e 10 µM. A Tm obtida foi de 46 °C e não houve variação em

função das concentrações testadas de SbCHIP.

Através de DSC foi possível realizar uma análise térmica da proteína SbCHIP,

obtendo-se informações complementares de sua estabilidade. Pelo termograma obtido da

variação de capacidade calorífica (Cp) em função da temperatura de 20 a 75 °C (Figura 14C),

foram observados dois picos de detecção de variação de calor entre as células do

equipamento. O primeiro pico, que se inicia a 40 °C e termina em 48 °C, é endotérmico com

valor máximo de Cp de 33,2 kCal/mol/°C. Já o segundo (de 48 °C a 55 °C), mostrou-se

exotérmico com Cp máximo a 51 °C de -13,5 kCal/mol/°C. Pelo ajuste não linear do primeiro

pico terminou-se a temperatura média no ponto de transição (Tm) igual a 46 ± 1 °C.

64

Figura 14: Caracterização da estabilidade de SbCHIP. (A) Desenovelamento térmico monitorado por CD. As curvas de desenovelamento induzido por temperatura foram obtidas com 5 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl através da medida de CD a 222 nm em cubeta de quartzo de 2 mm sob aumento de temperatura de 1 °C/min de 20 a 90 °C (quadrados pretos). A capacidade de reenovelamento espontânea foi avaliada pela medida de CD nas mesmas condições durante o resfriamento de 90 a 20 °C (círculos vermelhos) e de 46 °C a 20 °C (círculos azuis). O ajuste sigmoidal da curva (linha preta) foi utilizado para obtenção da Tm de 46 ± 1 °C. (B) Caracterização da estabilidade térmica por DSF. A proteína SbCHIP a 2,5, 5 e 10 µM foi incubada com tampão Protein Thermal Shift™, e a sonda Diluted Protein Thermal Shift Dye™ ao longo de uma rampa de temperatura de 25 a 97 °C a 1,8 °C/min. A emissão de fluorescência da sonda excitada a 575 nm foi monitorada e a curva representa a derivada da fluorescência em cada reação em função da temperatura para concentração de proteína testada. (C) Análise térmica por DSC. Amostras da proteína SbCHIP a 50 µM em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl foram utilizadas para realização de quatro varreduras sequenciais sob aumento constante de temperatura, duas primeiras de 20 a 35 °C e as duas últimas de 20 a 75 °C. A medida de diferença de potencial gerada da terceira varredura foi subtraída do tampão e normalizada para concentração de SbCHIP. Após a determinação manual de uma linha base, o termograma obtido (linha preta) foi ajustado através de um modelo não linear (linha vermelha), a partir do qual se obteve Tm = 46 ± 1 °C. (D) Desenovelamento e reenovelamento induzido por ureia monitorado por CD. A curva de desenovelamento (quadrados pretos) foi obtida através da medida de CD a 222 nm com 5 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, em concentrações crescentes de ureia (0 a 8 M) em cubeta de quartzo de 2 mm. Pelo ajuste da curva obteve-se a Cm de 3,4 ± 0,1 M. A curva de reenovelamento (círculos vermelhos) foi obtida pela leitura de CD nas mesmas condições, mas partindo de uma solução da proteína em 8M de ureia e diminuindo até 1 M. Observa-se que quando desenovelada por um agente desnaturante, SbCHIP foi capaz de readquirir a estrutura secundária perdida.

65

Além disso, também foi caracterizado o desenovelamento de SbCHIP induzido

por um agente desnaturante (ureia). A proteína foi submetida à incubação com

concentrações crescentes de ureia e seu sinal de CD foi monitorado em 222 nm (quadrados

pretos, Figura 14D). É possível observar que o sinal permaneceu estável até a concentração

de 2,5 M de ureia, em seguida o sinal diminui drasticamente até 5 M de ureia, indicando que

em concentrações maiores essa a proteína está pelo menos parcialmente desenovelada,

com sinal de aproximadamente -2500 deg.cm2.dmol-1. A concentração de ureia no ponto

médio de transição (Cm) foi de 3,4 ± 0,1 M. Também foi analisado o reenovelamento de

SbCHIP, partindo de uma solução da proteína em 8M de ureia e diminuindo até 1 M (círculos

vermelhos, Figura 14D). Observa-se que a proteína readquire a estrutura secundária perdida,

atingindo a partir de 1,5 M de ureia o valor inicial de sinal de CD.

1.4.4. Caracterização de parâmetros hidrodinâmicos

Pelos experimentos de SEC-MALS foi possível determinar a massa absoluta da

proteína em solução. Através da medida de absorbância, espalhamento de luz e índice de

refração obteve-se um perfil cromatográfico com a distribuição de massa molecular em

função do volume de eluição para SbCHIP em diferentes concentrações, de 15 a 60 µM

(Figura 15A). Por este experimento, confirmou-se que a proteína encontra-se como uma

única espécie em solução, sendo eluída em um único pico com volume de eluição de

aproximadamente 18 mL. A massa molecular absoluta média medida para SbCHIP foi de 65 ±

4 kDa, indicando que a proteína é um dímero em solução, uma vez que a massa teórica do

monômero é de 33 kDa. Tanto volume de eluição quanto a massa molecular não foram

afetados pela variação de concentração, nas condições testadas.

Para determinação do coeficiente de difusão (D) da SbCHIP foram realizados

experimentos de DLS. Pela curva de distribuição de D em função da intensidade de luz

espalhada, obteve-se um D de 4,9 ± 0,5 cm2/s. Corroborando os dados de filtração em gel,

um único pico estreito de distribuição de D sugere uma amostra monodispersa, com apenas

uma espécie em solução. Foram testadas diferentes concentrações de SbCHIP, mas não

foram observadas mudanças no coeficiente de difusão em função da concentração, por isso

aqui está representada a distribuição de D obtida com SbCHIP a 50 µM (Figura 15B).

66

Figura 15: Caracterização de parâmetros hidrodinâmicos de SbCHIP. (A) Determinação da massa molecular absoluta de SbCHIP em solução por SEC-MALS. Diferentes concentrações da proteína foram aplicadas na coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) de 25 mL, equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl e conectada ao sistema ÄKTA FPLC (Amershan Pharmacia Biotech), para detecção de absorbância a 280 nm, ao miniDAWN TREOS (Wyatt Technologies), para detecção de espalhamento de luz em 3 ângulos diferentes, e ao Optilab T-rEX (Wyatt Technologies) para detecção do índice de refração. A partir da análise desses dados, obteve-se uma massa molecular média de 65 ± 4 kDa, não houve variação da massa em função das concentrações de proteína testadas. Os dados indicam a presença de dímeros em solução. (B) Determinação do coeficiente de difusão (D) de SbCHIP por DLS. As medidas foram realizadas em equipamento Zetasizer Nano ZS-Zen 3600 (Malvern) a 25 °C usando cubetas de plástico de 1 cm contendo 50 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. A curva de distribuição de coeficiente de difusão foi obtida pela média de 50 leituras de 60 s e o valor médio obtido foi de 4,9 ± 0,5 x 10-7 cm2/s. (C) Determinação do raio hidrodinâmico (Rh) de SbCHIP por GFA. Perfil cromatográfico de 50 µM de SbCHIP e de 1 mg/mL de cada proteína modelo (a) ferritina, (b) aldolase, (c) conalbumina, (d) ovalbumina, (e) anidrase carbônica e (f) ribonuclease A, aplicadas na coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) de 25 mL, equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl e conectada ao sistema ÄKTA FPLC (Amershan Pharmacia Biotech) para monitoramento da absorbância 280 nm. (D) Curva de calibração construída através dos valores de Rh e dos coeficientes de distribuição (-logKav)1/2 das proteínas modelo. A reta obtida do ajuste linear foi usada para determinar o valor de Rh de SbCHIP de 36 ± 4 Å. Esse valor representa a média de três experimentos independentes.

67

Para medir experimentalmente o raio hidrodinâmico (Rh) da proteína foi usada a

filtração em gel analítica (GFA). Primeiramente, foram obtidos os perfis cromatográficos de

proteínas modelo globulares de massa molecular e Rh conhecidos (Figura 15C e Tabela 4).

Através dos volumes de eluição obtidos para cada proteína modelo e dos coeficientes de

distribuição (Kav) calculados a partir deles, construiu-se uma curva de calibração de Rh em

função de (-logKav)1/2. A equação de reta gerada do ajuste linear dessa curva foi utilizada

para obtenção do Rh de SbCHIP (Figura 15D), através do volume de eluição e coeficiente de

distribuição obtidos no experimento de cromatografia com essa proteína. Como se pode

observar, SbCHIP foi eluída em torno de 18 mL, muito próximo à conalbumina, e o Rh obtido

foi de 36 ± 4 Å.

Tabela 4: Resultados obtidos da GFA com SbCHIP e as proteínas modelo utilizadas.

Proteína Volume de eluição (mL) Rh (Å) Kav (-logKav)1/2

(a) Ferritina 21,87 61,0 0,23 0,79

(b) Aldolase 20,18 48,1 0,41 0,62

(c) Conalbumina 18,64 36,5 0,51 0,54

(d) Ovalbumina 17,44 30,5 0,58 0,48

(e) Anidrase carbônica 15,79 23,0 0,67 0,41

(f) Ribonuclease A 12,86 16,4 0,78 0,32

SbCHIP 18,37 36 ± 4 0,57 0,49

Através da equação de Stokes-Einstein foi possível calcular os parâmetros

hidrodinâmicos preditos para uma esfera rígida não hidratada com a mesma massa de um

dímero de SbCHIP (66 kDa) e comparar esses valores com aqueles obtidos

experimentalmente (Tabela 5). A partir desses dados, calculou-se o fator de Perrin (f/fo) pela

razão entre o fator friccional medido da proteína (f) e o fator friccional de uma esfera rígida

não hidratada (fo). Os cálculos realizados com os valores de D e Rh medidos para a SbCHIP

resultaram em fatores de Perrin no valor de 1,6 e 1,3, respectivamente, sugerindo que a

proteína não apresenta formato esférico.

68

Tabela 5: Parâmetros hidrodinâmicos medidos e calculados pela equação de Stokes-Einstein.

Parâmetro Medido Calculadoa

Rh (Å) 36 ± 4 27

D (cm2/s) 4,9 ± 0,5 x 10 -7 8,2 x 10 -7

a, calculados considerando uma esfera rígida não hidratada de massa igual ao dímero (66 kDa) de

SbCHIP.

1.4.5. Determinação de estrutura de baixa resolução por SAXS

Para caracterização da estrutura de SbCHIP em baixa resolução foram obtidas

curvas de SAXS com amostras da proteína em diferentes concentrações. Nas menores

concentrações analisadas (10 e 20 µM) não foram obtidos bons resultados, pois o sinal de

espalhamento foi semelhante ao do tampão, com alta relação sinal-ruído que impossibilitou

o tratamento adequado dos dados.

As curvas de espalhamento de raios X obtidas para as demais concentrações (30,

40, 50 e 60 µM) são mostradas no gráfico da intensidade de espalhamento em função do

vetor q de espalhamento (Figura 16A). Pode-se observar pela sobreposição das curvas

normalizadas que as diferentes concentrações utilizadas apresentaram o mesmo perfil de

espalhamento e que não houve agregação da proteína durante exposição aos raios X nas

condições analisadas.

Através da aproximação de Guinier (LnI(q) x q2) obteve-se o coeficiente angular

do ajuste da reta, pelo qual calculou-se o raio de giro (Rg) de SbCHIP de 4,1 ± 0,3 nm (canto

inferior esquerdo da Figura 16A). O mesmo valor de Rg foi determinado para as quatro

concentrações de proteína utilizadas. As curvas de espalhamento também foram analisadas

pelo programa ATSAS, pelo qual se obteve o gráfico de distribuição de distância P(r) em

função do Rg, aqui apresentado para a concentração de 50 µM (Figura 16B). Pelo formato da

curva de função de distribuição foi possível verificar que a proteína em solução apresenta

formato globular, com regiões alongadas, uma vez que difere de uma curva simétrica

característica para proteínas esféricas.

Através dos resultados obtidos das curvas de SAXS é possível gerar modelos de

envelope de proteína que contribuem para o entendimento de sua estrutura em baixa

resolução. Os modelos mais condizentes podem ser validados através dos parâmetros

69

hidrodinâmicos medidos e apresentados acima. A análise dos dados para gerar envelopes da

proteína SbCHIP está em andamento, sendo realizada em colaboração com a pesquisadora

de pós-doutorado Dra. Gláucia Pinheiro e com o Prof. Leandro Barbosa (IF-USP).

Figura 16: Curvas de SAXS da proteína SbCHIP em diferentes concentrações. (A) Curvas de espalhamento de raios X da SbCHIP em diferentes concentrações em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. A curva apresentada para cada concentração refere-se à média normalizada de 10 coletas com tempos de exposição aos raios X de 100 s. Os pontos iniciais da curva de 50 µM foram utilizados para realizar a análise de Guinier e cálculo de Rg da proteína (canto inferior esquerdo). A análise comparativa do Rg da SbCHIP em diferentes concentrações mostrou que a proteína apresentou Rg de ~4,1 ± 0,3 nm. (B) Função de distribuição de distância P(r) para a SbCHIP na concentração de 50 µM, pela qual podemos observar que a proteína apresenta formato parcialmente globular, com regiões alongadas em solução.

1.4.6. Caracterização da interação entre SbCHIP e a chaperona Hsp70

A chaperona Hsp70 humana (HsHsc70) foi utilizada para caracterização da

interação com SbCHIP através da técnica de SEC-MALS. Para isso, as duas proteínas foram

incubadas por 4 h a 4 °C separadamente ou em conjunto em diferentes proporções de

concentração (Figura 17). Quando SbCHIP e HsHsc70 foram incubadas e aplicadas

isoladamente na coluna, elas foram eluídas nos volumes de 14,0 e 14,2 mL,

respectivamente. A eluição em volume próximos é esperada, visto que o monômero de

HsHsc70 tem cerca de 71 kDa e o dímero de SbCHIP apresenta cerca de 66 kDa.

Nos casos em que as proteínas foram incubadas juntas e, então, aplicadas na

coluna de separação, foram observados diferentes perfis cromatográficos dependendo da

razão de concentração entre elas. Quando SbCHIP esteve em concentração superior (50 µM)

em relação a HsHsc70 (25 µM) foi observada a eluição de 3 picos, o primeiro com 12,0 mL,

70

um ombro com 13,3 mL, seguido de outro pico eluído com 14,0 mL (Figura 17A). Em situação

contrária, em que SbCHIP está em concentração menor (25 µM) do que HsHsc70 (50 µM),

também foram observados 3 picos bem definidos: o primeiro com 12,0 mL, o segundo com

13,3 e o terceiro com 14,2 mL (Figura 17B). Quando houve incubação com concentrações

equimolares das proteínas (50 µM de cada) foi observada a eluição das proteínas em apenas

dois picos majoritários, com 12,0 mL e 13,3 mL (Figura 17C).

A análise dos cromatogramas obtidos para todas as condições sugere a formação

de complexos entre SbCHIP e HsHsc70 nos picos 1 e 2 (P1 e P2), uma vez que volumes de

eluição menores indicam a presença de moléculas maiores em solução. Esses resultados

foram confirmados através da análise por SDS-PAGE das frações coletadas durante a eluição

desses picos. Para todas as proporções testadas, observou-se nos géis que as proteínas

isoladas estão presentes em sua maioria no pico 3, ao passo que quando incubadas em

conjunto há um deslocamento tanto de HsHsc70 mas principalmente de SbCHIP para os

picos 1 e 2. Nos casos em que há excesso de HsHsc70 ou SbCHIP, a permanência do terceiro

pico (P3) indica que não houve formação de complexos de interação por parte da molécula

de maior concentração (Figura 17 A e B).

A distribuição de massa molecular absoluta das moléculas eluídas em cada pico

também foi determinada, com o objetivo de corroborar a hipótese da formação de

complexos e também inferir a estequiometria dos complexos formados (Tabela 6). Em todas

as condições, a massa obtida para o pico 1 foi de cerca de 135 kDa, indicando a interação de

um dímero de SbCHIP (66 kDa) com um monômero de HsHsc70 (70 kDa). Curiosamente, a

massa obtida para o pico 2 foi de ~100 kDa, o que corresponde à massa de um complexo de

um monômero de SbCHIP (33 kDa) com um monômero de HsHsc70 (70 kDa). Para o pico 3, a

massa obtida foi em torno de 75 kDa, indicando o excesso de SbCHIP ou HsHsc70, que não

formaram complexos entre si.

71

Figura 17: Interação de SbCHIP com HsHsc70 determinada por GFA. As proteínas SbCHIP e HsHsc70 foram incubadas a 4 °C por 4 h isoladamente (curvas vermelhas e azuis) ou em conjunto (curvas pretas) em diferentes concentrações: (A) 50 µM SbCHIP e 25 µM HsHsc70, (B) 25 µM SbCHIP e 50 µM HsHsc70, (C) 50 µM SbCHIP e 50 µM HsHsc70. Após incubação, as amostras foram separadas em uma cromatografia de exclusão por tamanho, usando coluna Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. Durante a eluição das amostras, foram coletadas frações a cada 0,5 mL e aquelas que correspondem aos picos observados nos cromatograma (de 10 a 16 mL) foram analisadas por SDS-PAGE 12%. As curvas e os géis com as proteínas isoladas (azul e vermelho) foram repetidas nos painéis A, B e C para facilitar a comparação dos resultados.

72

Tabela 6: Massas moleculares absolutas medidas por SEC-MALS para cada pico obtido da eluição de amostras contendo SbCHIP e HsHsc70 em diferentes proporções de concentração.

Concentração (µM) Massa molecular (kDa)

SbCHIP HsHsc70 Pico 1 Pico 2 Pico 3

50 25 133 ± 4 94 ± 2 78 ± 1

25 50 133 ± 1 102 ± 16 75 ± 1

50 50 137 ± 2 100 ± 3 -

A técnica de GFA foi empregada novamente a fim de obter mais informações

sobre a formação de complexos entre SbCHIP e HsHsc70. Para isso, as amostras contendo o

complexo formado por SbCHIP e HsHsc70 (P1, Figura 17) foram reaplicadas na mesma

coluna de exclusão por tamanho. Pode-se observar que parte das proteínas foram eluídas

em um pico com mesmo volume de eluição do P1 (cerca de 12 mL), mas que também houve

eluição de proteínas com 14 mL, sugerindo a presença de moléculas de SbCHIP e HsHsc70

dissociadas (Figura 18). Esses resultados indicam que o complexo está em equilíbrio na

solução e que sua formação pode ser dependente da concentração das proteínas.

73

Figura 18: Caracterização da estabilidade da interação entre SbCHIP e HsHsc70. Cromatogramas obtidos a partir da eluição da amostra contendo o mix de SbCHIP e HsHsc70 (linha preta) e da eluição da reinjeção do complexo isolado (pico 1) formado na condição anterior (linha vermelha). Na primeira condição as proteínas foram incubadas a 4 °C por 4 h e separadas em uma cromatografia de exclusão por tamanho, usando coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. O primeiro pico obtido, que corresponde ao complexo formado por um monômero de HsHsc70 e um dímero de SbCHIP foi reaplicado na coluna, nas mesmas condições mencionadas.

1.4.7. Caracterização da atividade de ubiquitinação de SbCHIP

Para determinar a atividade de ubiquitinação da SbCHIP foram realizados ensaios

usando proteínas humanas purificadas a fim de reconstituir o sistema de ubiquitinação in

vitro. Primeiramente, para avaliar a especificidade de interação de SbCHIP com diferentes

enzimas E2 para conjugação de ubiquitina foram utilizadas oito diferentes enzimas E2

(UbcH1, UbcH3, UbcH5a,b,c, UbcH6, UbcH7, UbcH8, UbcH10 e UbcH13/Mms2) na ausência e

presença de SbCHIP.

Para maioria das enzimas E2 testadas (UbcH1, UbcH3, UbcH6, UbcH7, UbcH8 e

UbcH10) observou-se que, tanto na ausência como na presença de SbCHIP, a ubiquitina

permaneceu conjugada na própria enzima E2, fato evidenciado pelas bandas intensas de

proteínas que migraram entre 17 e 32 kDa, indicando que essas enzimas E2 não interagiram

com SbCHIP (Figura 19). A ubiquitina é uma molécula de 8 kDa, assim o padrão de migração

das enzimas E2 ubiquitinadas variou de acordo com a massa molecular de cada uma.

74

Em contraste, quando foram usadas as enzimas UbcH5 e UbcH13, foi observada

a conjugação de ubiquitina em SbCHIP (Ub-SbCHIP) através da detecção de bandas migrando

entre 32 e 46 kDa (Figura 19), que corresponde à massa esperada para um monômero de

SbCHIP (33 kDa) conjugado a uma (41 kDa) ou duas (49 kDa) moléculas de ubiquitina (8 kDa).

Nessas condições, nota-se também um arraste e bandas menos intensas entre 46 e 75 kDa,

que podem indicar a ligação de cadeias de poli-ubiquitina em SbCHIP. Não houve diferença

na conjugação de SbCHIP com ubiquitina após 1 ou 4 h de reação.

É interessante realçar que na ausência de SbCHIP, a ubiquitina permaneceu em

sua maioria conjugada às enzimas UbcH5 ou UbcH13, sendo detectada nas bandas que

migraram entre 17 e 25 kDa, uma vez que suas formas monoméricas tem cerca de 17 kDa.

Em todas as reações, pode-se observar também a presença de uma banda entre 100 e 135

kDa que provavelmente corresponde à enzima E1 (118 kDa) ubiquitinada.

Figura 19: Caracterização da atividade de ubiquitinação da proteína SbCHIP na presença de diferentes enzimas E2. Reações contendo 1x tampão de ubiquitinação, 2,5 µM de ubiquitina biotinilada, 20 U/mL de pirofosfatase, 1 mM de DTT, 5 mM Mg-ATP, 100 nM de enzima E1 de ativação da ubiquitina e 2,5 µM de enzima E2 de conjugação da ubiquitina, na ausência ou presença de 5 µM de SbCHIP (enzima E3) foram incubadas a 37 °C por 1 h. Em seguida, foi adicionado tampão não redutor para SDS-PAGE para parar as reações e para possibilitar a separação por SDS-PAGE gradiente (10 a 15%). A ubiquitinação foi verificada por Western Blotting pela detecção da ubiquitina biotinilada pelo uso de Streptavidin-HRP.

75

Sabendo que as enzimas E2, UbcH5 e UbcH13, foram capazes de interagir com

SbCHIP e conjugar ubiquitina, as mesmas foram utilizadas nos próximos experimentos para

avaliar a capacidade de SbCHIP de conjugar ubiquitina em outros substratos proteicos.

Foram usados como alvo de ubiquitinação as proteínas de planta SsHsp70 e SsHsp90, a

proteína humana HsHsc70 e também luciferase de Photinus pyralis, como uma proteína alvo

genérica (Figura 20).

Em todos os casos, independente do substrato ou da enzima E2 utilizada, é

possível observar na Figura 20, que na ausência de SbCHIP e de enzima E2, a ubiquitina

permenece conjugada na enzima E1, migrando com massa entre 100 e 135 kDa. E seguida,

quando UbcH5 ou UbcH13 estão presentes, foram detectadas bandas entre 17 e 25 kDa,

indicando que a ubiquitina permenece conjugada a elas. Entretanto, nas reações em que

tanto enzima E2 quanto SbCHIP estavam presentes, pode-se observar bandas fracas de

ubiquitina conjugada a SbCHIP (migrando entre 32 e 46 kDa), mas principalmente detecta-se

ubiquitina conjugada nos substratos SsHsp70 (73 kDa), SsHsp90 (82 kDa), HsHsc70 (72 kDa) e

luciferase (67 kDa). Isso pode ser notado pela migração de bandas entre 75 e 135 kDa, que

evidencia a atividade de SbCHIP de atuar E3 ubiquitina ligase. Não foram observadas

diferenças de padrão de ubiquitinação dos substratos ao utilizar UbcH5 ou UbcH13 como

enzima E2, umas vez que ambas foram eficientes em conjugar ubiquitina e interagir com

SbCHIP. Também não foram observadas diferenças de ubiquitinação das reações após

incubação por 1 ou 4h (dados não mostrados).

Curiosamente, houve diferença no padrão de ubiquitinação dependendo do

substrato utilizado. Para SsHsp70 e SsHsp90, pode-se observar pelo menos 5 bandas entre

75 e 135 kDa, indicando a conjugação de pelo menos 5 moléculas de ubiquitina.

Diferentemente, para HsHsc70 e luciferase, foram observadas apenas uma ou duas bandas,

sugerindo que menos moléculas de ubiquitina foram conjugadas nesses substratos.

76

Figura 20: Caracterização da atividade de ubiquitinação da proteína SbCHIP em diferentes substratos proteicos. Reações contendo 1x tampão de ubiquitinação, 2,5 µM de ubiquitina biotinilada, 20 U/mL de pirofosfatase, 1 mM de DTT, 5 mM Mg-ATP, 100 nM de enzima E1 de ativação da ubiquitina, 5 µM da proteína alvo (A e E) SsHsp70, (B e F) SsHsp90, (C e G) HsHsc70 ou (D e H) luciferase, na presença e ausência de 2,5 µM de enzima E2 de conjugação de ubiquitina (UbcH5 ou UbcH13) e 2,5 µM de SbCHIP (E3 ubiquitina ligase) foram incubadas a 37 °C por 1 h. Em seguida, foi adicionado tampão não redutor para SDS-PAGE para parar as reações e para possibilitar a separação por SDS-PAGE gradiente (10 a 15%). A ubiquitinação foi verificada por Western Blotting pela detecção da ubiquitina biotinilada pelo uso de Streptavidin-HRP e pela detecção das proteínas alvos através de anticorpos específicos.

77

1.5. Discussão

1.5.1. Análise da sequência, expressão e purificação de SbCHIP

A caracterização estrutural de chaperonas e co-chaperonas de plantas é recente

e menos vasta se comparada com o conhecimento já obtido para essas proteínas em outros

organismos. Nosso grupo está entre os pioneiros nessa área, com interesse particular em

proteínas de gramíneas (família Poaceae) de grande interesse comercial, como sorgo e cana-

de-açúcar. Dessa forma, visamos neste trabalho o estudo da co-chaperona CHIP de Sorghum

bicolor (SbCHIP).

A sequência que codifica a proteína foi clonada em vetor de expressão e a

análise do sequenciamento do clone pET28a-His-SbCHIP confirmou a presença da sequência

desejada. A sequência de aminoácidos de SbCHIP é formada por 295 resíduos, constituindo

uma proteína com massa molecular teórica de 33 kDa. Em outros organismos, CHIP

apresenta sequência primária variando de 280 a 305 resíduos e massa moleculares

semelhantes, em Arabidopsis, AtCHIP tem 32 kDa e em humanos, HsCHIP tem 35 kDa.

A análise de similaridade de sequência indicou que SbCHIP apresenta ~60% de

identidade com AtCHIP e cerca de 35% de identidade com os homólogos presentes em

animais. A região de maior identidade foi observada no domínio U-box. A baixa identidade

de sequência primária entre SbCHIP e os homólogos de animais pode ser explicada pelo

domínio TPR, responsável pela interação de CHIP com o motivo EEVD presente na região C-

terminal das chaperonas moleculares Hsp90 e Hsp70. Esse domínio pode apresentar

sequência primária bastante diferenciada entre homólogos de diferentes espécies, porém

sempre atinge uma conformação tridimensional conservada de hélices-α antiparalelas,

formando uma estrutura como um bolsão que comporta o motivo EEVD com alta afinidade.

Nessa estrutura, resíduos básicos, geralmente de lisina e asparagina (identificados como

“two-carboxylate clamp”) são conservados e essenciais para a interação com EEVD

(Scheufler et al., 2000).

Estudos recentes investigando a interação das proteínas humanas CHIP e Hsp70,

através da estrutura cristalográfica do complexo formado entre os domínios isolados TPR de

CHIP e C-terminal de Hsp70, identificaram os principais resíduos presentes na interface de

interação. No TPR de HsCHIP, os resíduos identificados foram: Q27, K30, N34, F37, V59, V61,

Y62, N65, L68, V94, K95, F99, L129, F131 e D134 (Zhang et al., 2015). Desses 15 resíduos,

78

observa-se no alinhamento aqui realizado que 10 são conservados entre SbCHIP e HsCHIP

(sublinhados). Isso indica que apesar do TPR de SbCHIP não apresentar grande identidade

com demais homólogos, provavelmente sua estrutura tridimensional deve ser conservada e

a maioria dos resíduos que compõem a interface de interação com as chaperonas foi

mantida evolutivamente.

Na região central de dimerização também não foi observada alta similaridade.

Apesar disso, SbCHIP foi encontrada como um dímero em solução, indicando que ainda

assim este domínio pode estar envolvido na dimerização. A estrutura conhecida dessa região

em MmCHIP e DrCHIP é a de um hairpin de hélices-α que mantém contato com a mesma

região na outra proteína para formar um homodímero (Zhang et al, 2005). No entanto, na

estrutura de MmCHIP, observou-se um dímero assimétrico, em que o hairpin de uma

proteína é prolongado e o da outra é truncado (Figura 5); em contrapartida, na estrutura de

DrCHIP a interface de dimerização é simétrica composta por dois hairpins completos (Xu et

al., 2006). Isso pode ser causado pelo fato de que estruturas cristalinas são estáticas e

representam apenas um estado da proteína, ou mesmo porque a estrutura de DrCHIP não

corresponde à proteína completa, mas sim com o domínio TPR deletado. Por outro lado,

também é plausível que haja mudanças dinâmicas na estrutura dimérica de CHIP que

permite a troca de conformação dos hairpins helicoidais entre prolongados e truncados, de

forma que a mesma conformação possa existir simultaneamente para ambos os

monômeros.

Para expressão de SbCHIP recombinante em E. coli, os testes com diferentes

condições de temperatura e tempos de ação do agente indutor (IPTG) mostraram que a

melhor condição para expressão da SbCHIP foi por 5 h após adição de IPTG, a 30 °C. Nessa

condição, foi observada melhor relação entre quantidade de proteína produzida e sua

presença na fração solúvel do lisado de células bacterianas.

SbCHIP foi obtida com alto grau de pureza (> 95%) e rendimento de 85 mg/L

após duas etapas cromatográficas. Na primeira, a cromatografia de afinidade ao níquel, a

proteína já apresentou alto grau de pureza, mas a segunda etapa, cromatografia de filtração

em gel, foi realizada ainda assim para eliminar possíveis contaminantes agregados,

contaminantes não visíveis no SDS-PAGE e separar possíveis diferentes estados oligoméricos.

79

Entretanto, a proteína foi eluída, na maioria das vezes, em um único pico, indicando que

apenas um estado oligomérico estava presente em solução.

1.5.2. Análise de estrutura secundária e estabilidade de SbCHIP

O espectro de dicroísmo circular medido para SbCHIP mostrou-se compatível

com o espectro de uma proteína enovelada com composição de estrutura secundária rica

em hélices-α, por apresentar dois mínimos de sinal em 208 e 222 nm. A análise do espectro

permitiu determinar que aproximadamente 55% da estrutura de SbCHIP é composta de

hélices-α. Essa predominância concorda com a quantidade de 60% de hélices-α medida para

HsCHIP em estudos anteriores (Millan et al., 2013) e também com o que já foi discutido

sobre a estrutura conhecida para CHIP de camundongo e de D. rerio (Zhang et al., 2005; Xu

et al., 2006). Tanto o domínio TPR quanto o hairpin de dimerização são formados

basicamente de hélices-α antiparalelas. Além disso, o domínio U-box também apresenta

duas hélices-α. A composição das folhas-β presentes no U-box não foi detectada,

provavelmente porque são apenas duas folhas-β curtas e porque a contribuição de sinal de

CD de hélices-α em geral é maior do que de folhas-β, o que pode mascarar sua detecção em

proteínas muito ricas em hélices-α.

Na sequência primária de SbCHIP podem ser encontrados cinco triptofanos, os

quais foram utilizados como sonda local da estrutura terciária em espectros de emissão de

fluorescência. Quatro desses triptofanos estão localizados nos domínios TPR, portanto são

úteis para monitorar o enovelamento desta região. O outro triptofano está localizado na

porção C-terminal. Contudo, é importante realçar que o espectro de fluorescência avalia a

soma da emissão de todos estes resíduos, permitindo uma análise geral e não individual dos

mesmos.

Os experimentos de fluorescência de triptofano confirmaram o estado

enovelado da proteína obtida após a purificação. Nos espectros medidos para SbCHIP o λ

máximo obtido foi de 335 nm e centro de massa (<λ>) de 344 nm, bastante semelhante com

o obtido para HsCHIP, com λmáx = 333 nm e <λ> = 342 nm (Millan et al., 2013). Quando os

espectros foram medidos com SbCHIP em solução com 8M de ureia, o λmáx e <λ> foram

deslocados para 357 e 356 nm, respectivamente. Esse deslocamento na emissão de

fluorescência está relacionado com a mudança de polaridade do ambiente em que os

resíduos de triptofano se encontram, de forma que na ausência de ureia pelo menos um

80

resíduo de triptofano estava localizado no interior da proteína, um ambiente hidrofóbico. Já

na presença de uréia, um ou mais resíduos de triptofano foram expostos ao solvente,

passando para um ambiente hidrofílico. Isso sugere mudança do estado enovelado para o

estado desenovelado, observado pelo deslocamento do λ máximo e <λ> (Ramos, 2004).

Quanto à estabilidade térmica de SbCHIP, os dados obtidos por CD, DSF e DSC

trouxeram informações complementares para caracterização da proteína. O modo de

obtenção da estabilidade térmica por essas técnicas é distinto, pois são sondas de processos

complementares que ocorrem durante o desenovelamento proteico. O CD mede a diferença

de absorção da luz circularmente polarizada a direita e a esquerda ao interagir com

estruturas quirais presentes nas estruturas secundárias formadas nas proteínas, ou seja, a

sonda são as estruturas secundárias dependentes de interações locais. O DSF monitora a

emissão fluorescência de uma sonda que fluoresce quando se liga em resíduos hidrofóbicos

expostos quando a proteína desnatura. Já o DSC mede a variação de calor proveniente do

rompimento de todas as interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio importantes para

manutenção da conformação.

Apesar disso, os resultados obtidos por CD, DSF e DSC foram muito coerentes

entre si; em todos os métodos, observou-se que a proteína se mantém estável até cerca de

40 °C. Acima dessa temperatura foi observada uma única transição cooperativa que pode

indicar desenovelamento de dois estados (enovelado e desenovelado), com temperatura no

ponto médio (Tm) medida de 46 °C. Por CD e DSC, também se verificou que esse

desenovelamento é irreversível, gerando agregação e precipitação. Isso pode ser avaliado no

CD porque o sinal não foi readquirido durante o resfriamento, e no DSC pela presença de um

pico exotérmico observado a 51 °C no termograma medido. Por serem técnicas que utilizam

sondas de processos diferentes do desenovelamento e pela semelhança no perfil de

desnaturação obtido por elas, pode-se concluir que a perda de conformação global dos

domínios que compõem SbCHIP ocorre simultaneamente à perda de estrutura secundária da

proteína.

Estudos da estabilidade térmica de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar,

como Hsp90 e Hsp100, realizados pelo nosso grupo mostraram essas proteínas são bastante

estáveis ao desenovelamento induzido por temperatura, apresentando Tm de

aproximadamente 60 °C (Cagliari et al., 2011; Silva et al., 2013). As sHsps citosólicas de cana

81

apresentam estabilidade térmica ainda maior, mostrando pouca perda de estrutura

secundária mesmo quando a proteína foi aquecida até 90 °C (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2010).

A significativa estabilidade observada nas chaperonas de plantas em alta temperatura é

muito condizente com a forma de sobrevivência desses organismos, uma vez que são sésseis

e estão expostos a condições extremas de estresses bióticos e abióticos. Sendo assim, as

chaperonas bastante potentes das plantas propiciam uma característica bem definida nesses

organismos que consiste em sua resposta ao estresse através de aclimatização e resistência

a essas condições (Vierling, 1991). Em comparação com essas chaperonas, a estabilidade

térmica de SbCHIP pode ser considerada baixa. Todavia, CHIP é uma co-chaperona e em

situações de estresse essas proteínas são geralmente encontradas em grandes complexos,

interagindo com outras chaperonas, o que pode ser importante para garantir sua

estabilidade (Breiman, 2014).

Com relação à estabilidade na presença de agente desnaturante, os

experimentos utilizando ureia revelaram que a proteína apresenta desenovelamento

também aparentemente de dois estados e com uma transição de concentração de ureia no

ponto médio de transição (Cm) de 3,5 M. Diferentemente do desenovelamento induzido por

temperatura, neste caso a desnaturação foi reversível. Estudos de estabilidade térmica e

química realizados com HsCHIP selvagem mostraram resultados bastante semelhantes, com

Tm de 46 °C e Cm de 3,5 M. Interessantemente, nesse estudo demonstrou-se que o domínio

TPR tem um papel muito importante na estabilidade de CHIP. Mutantes de deleção do TPR

(HsCHIP-ΔTPR) se mostraram menos estáveis (Tm = 36 °C e Cm = 1,1 M) ao passo que a

deleção do U-box (HsCHIP-ΔUbox) não causou tanta variação de estabilidade (Tm = 45 °C e

Cm = 3,3 M) (Millan et al., 2013).

1.5.3. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos

Os experimentos para caracterização estrutural da SbCHIP foram realizados com

o intuito de obter parâmetros hidrodinâmicos da proteína em solução. Através das técnicas

de SEC-MALS, DLS, GFA e SAXS foram medidos parâmetros como a massa molecular

absoluta, coeficiente de difusão (D), raio hidrodâmico (Rh) e raio de giro (Rg) de SbCHIP em

solução. Esses e outros parâmetros medidos estão sumarizados na Tabela 7. Para fins de

comparação, os mesmos parâmetros foram calculados pela equação de Stokes-Einstein

82

considerando uma esfera rígida não hidratada com a mesma massa do dímero (66 kDa) de

SbCHIP.

Tabela 7: Resumo das técnicas utilizadas e dos parâmetros hidrodinâmicos medidos para SbCHIP.

Técnica Parâmetro medido Valor obtido

CD Composição de hélice-α 55%

Fluorescência λmáx emissão (W) sem/com ureia 335/357 nm

CD, DSF, DSC Tm 46 ± 1 °C

CD Cm 3,4 ± 0,1 M

SEC-MALS MM em solução 65 ± 4 kDa

DLS Coeficiente de difusão (D) 4,9 ± 0,5 x 10-7 cm2/s

GFA Raio hidrodinâmico (Rh) 36 ± 4 Å

SAXS Raio de giro (Rg) 41 ± 3 Å

Nos experimentos de SEC-MALS o valor de massa molecular medido foi de 65

kDa e, a partir dele, foram calculados Rh de 26 Å e D de 8,2 x 10-7 cm2/s, esses valores são

muito próximos dos valores teóricos obtidos para uma esfera com a massa do dímero. Na

literatura há diversas evidências mostrando que CHIP de vários organismos forma

homodímeros em condições fisiológicas, sendo que a interface de dimerização já foi

caracterizada em estruturas cristalinas de HsCHIP e DrCHIP (Nikolay et al., 2004; Zhang et al.,

2005; Xu et al., 2006). Ambas as estruturas demonstram contribuição das hélices-α7 e α8 do

hairpin central e também do domínio U-box, apesar de discordarem em relação à dinâmica e

simetria de formação do dímero. Mutantes de HsCHIP construídos sem esse hairpin são

incapazes de dimerizar e ainda apresentam atividade de ubiquitinação inferior à da proteína

selvagem, evidenciando que a dimerização é essencial para a atividade ubiquitina E3-ligase

da CHIP (Nikolay et al., 2004).

As técnicas de DLS e GFA foram utilizadas para obter o coeficiente de difusão (D)

e o raio hidrodinâmico (Rh) de SbCHIP, que fornecem informação sobre o tamanho da

proteína em solução. Os valores de D e Rh medidos experimentalmente para SbCHIP em

solução foram de 4,9 x 10-7 cm2/s e de 36 Å, respectivamente. O Rh obtido para HsCHIP

utilizando a mesma técnica foi de 39 Å (Millan et al., 2013). Os valores de D e Rh medidos por

83

DLS e GFA diferem daqueles calculados usando a massa do dímero de SbCHIP (66 kDa). A

equação de Stokes-Einstein usada para calcular os parâmetros hidrodinâmicos considera

uma molécula esférica rígida e não hidratada com a massa do dímero. Dessa maneira, a

comparação dos valores medidos com os valores calculados permite inferir informações

sobre o formato da proteína em solução. Em outras palavras, se SbCHIP fosse uma proteína

com formato aproximadamente esférico, Rh e D obtidos experimentalmente seriam

semelhantes àqueles calculados levando em conta a massa de um dímero.

Matematicamente, pode-se utilizar o fator de Perrin (f/f0) para avaliar o formato

da proteína, ele é calculado pela razão do fator friccional experimental (f), obtido pela

medida de D e/ou Rh, com o fator friccional teórico (f0). Quanto mais a forma de uma

proteína se aproxima de uma esféra, mais semelhantes são f e f0, logo Perrin é mais próximo

de 1. Os valores obtidos para SbCHIP foram de 1,3 e 1,6 quando Rh e D foram usados,

respectivamente, o que indica a um formato não esférico para essa proteína.

Os resultados obtidos por SAXS concordam com a forma alongada observada

para SbCHIP. O raio de giro (Rg) medido por esta técnica foi de 41 Å. Por definição, o Rg é a

distância média do centro de massa de uma molécula até cada elemento de massa dessa

molécula. Já o Rh é definido como o raio de uma esfera rígida em solução com a mesma

massa da molécula de interesse. Normalmente, proteínas em solução não existem como

esferas rígidas, então o Rh geralmente reflete o tamanho aparente adotado pela proteína

solvatada. Ambos, Rg e Rh são usados para obter informação sobre o tamanho de uma

proteína e a razão Rg/Rh também fornece conhecimento sobre formato. O valor

característico de Rg/Rh para uma proteína globular esférica é 0,775, o que significa que Rg é

menor que Rh. Por outro lado, quando moléculas desviam desse formato, apresentando

estruturas não esféricas ou alongadas, a razão Rg/Rh tende a ser maior que 0,775, pois Rg

tende a ser maior que Rh (Smilgies e Folta-Stogniew, 2015).

A razão Rg/Rh obtida para SbCHIP é de 1,14, indicando novamente uma estrutura

que difere de uma esfera, sendo provavelmente alongada em solução. Como

complementação a esse resultado, a função de distribuição de distância P(r) obtida a partir

da curva de espalhamento do SAXS também sugere que a proteína em solução apresenta

estrutura globular, composta por regiões alongadas. Partículas globulares esféricas

normalmente apresentam perfis de função de distribuição de distância simétricos, em forma

84

de sino, enquanto partículas não esféricas frequentemente mostram perfis não simétricos,

com ombros e oscilações que correspondem às distâncias intra e inter subunidades

(Mertens e Svergun, 2010). Dessa forma, os resultados de SAXS corroboram os valores de

parâmetros hidrodinâmicos obtidos anteriormente, que também indicam a presença de

moléculas alongadas (fator de Perrin f/fo = 1,6).

É interessante notar que co-chaperonas frequentemente apresentam esse

formato alongado e formam interações flexíveis com as chaperonas, uma vez que muitas

vezes agem como pontes, possibilitando a interação do substrato no complexo formado pelo

sistema chaperona (Borges et al., 2005; Onuoha et al., 2008; Smith et al., 2013). A análise

dos dados para gerar a estrutura em baixa resolução da proteína SbCHIP ainda está em

andamento, sendo realizada em colaboração com a pesquisadora de pós-doutorado Dra.

Gláucia Pinheiro e o Prof. Dr. Leandro Barbosa (IF-USP).

Além do tratamento das curvas de SAXS, estão em andamento experimentos

para obtenção de cristais de SbCHIP a fim de adquirir informações sobre sua estrutura

tridimensional em alta resolução. Dessa forma, enviamos amostras de SbCHIP pura em

diferentes concentrações para o Laboratório Automatizado de Cristalização de Proteínas

(ROBOLAB) situado no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), no CNPEM (proposta:

23595). Análises preliminares indicam a formação de cristais de SbCHIP em algumas

condições testadas (Anexos - Figura A1) e, por isso, estamos em busca de colaboração para

realizar coletas de difração de raios X e resolver a estrutura da proteína.

1.5.4. Interação com chaperonas e função de ubiquitinação de SbCHIP

Além da caracterização conformacional, o estudo das interações formadas entre

CHIP e outras chaperonas, como Hsp90 e Hsp70, é essencial para o melhor entendimento de

sua função. Alguns detalhes sobre a interação entre CHIP e Hsp70 já foram descritos na

literatura. Resultados de ITC usando CHIP humana e um peptídeo da região C-terminal de

Hsp70 (contendo o motivo IEEVD), apontam que a afinidade de interação é forte,

apresentando Kd de aproximadamente 1 µM (Kundrat e Regan, 2010b). Além disso, a

interação foi observada por pull-down e GFA usando as proteínas completas, pelos quais

foram obtidos complexos de 210 kDa que indicam a ligação de um dímero de CHIP com dois

monômeros de Hsp70. O complexo formado é dinâmico e flexível, de modo que ambas as

85

proteínas podem se mover independentemente a fim de acomodar outras proteínas clientes

(Smith et al., 2013).

Como já foi discutido, o motivo IEEVD da Hsp70 é muito importante para

interação entre essas chaperonas. Apesar disso, a interface de interação ainda é discutida na

literatura porque alguns estudos apontam que IEEVD são os únicos resíduos envolvidos na

interação, o que conferiria mobilidade e flexibilidade ao complexo (Smith et al., 2013). Por

outro lado, experimentos de RMN sugerem que também há interação entre do TPR com

outras regiões do SBD (lid e tail) da Hsp70, uma vez que o mutante Hsp70-lid-tail-ΔGPTIEEVD

foi capaz de induzir pequenas perturbações de deslocamento químico no espectro de 15N-

CHIP-TPR (Zhang et al., 2015).

Apesar da alta afinidade de interação descrita para CHIP e Hsp70 humanas, não

conseguimos caracterizar a interação de SbCHIP com Hsp70 de cana (SsHsp70), então como

alternativa, foi utilizada a proteína humana HsHsc70. Através de SEC-MALS e SDS-PAGE

confirmamos a formação de dois tipos de complexos entre essas proteínas, um com massa

de ~136 kDa, possivelmente formado entre um monômero de HsHsc70 (72 kDa) e um

dímero de SbCHIP (66 kDa), e outro com massa de ~100 kDa, correspondendo à massa de

um monômero de HsHsc70 e um monômero de SbCHIP. Esses resultados divergem em certo

aspecto de estudos anteriores que indentificaram complexos de 210 kDa, em que um dímero

de CHIP se liga em dois monômeros de Hsp70 (Kundrat e Regan, 2010b). Além disso, a

formação de complexos com monômeros de SbCHIP implica na indução de separação do

dímero desta proteína. Outros experimentos são necessários para responder a essa questão,

mas a possibilidade de dissociação dos dímeros corrobora a idéia de que a dimerização pode

ser dinâmica e que pode haver mudança conformacional dos hairpins helicoidais, em

especial durante interação com Hsp70.

Nossos experimentos indicam ainda que há um equilíbrio, dependente da

concentração de cada proteína, para formação e dissociação desses dois tipos de complexos.

Os resultados indicam que em concentrações equimolares de HsHsc70 e SbCHIP o equilíbrio

é deslocado para a formação dos complexos, sendo que aproximadamente 50% deles

apresenta 136 kDa e os outros 50% tem 100 kDa. Quando há concentrações maiores de uma

ou outra proteína, ainda há formação de complexos, mas parte das moléculas da proteína

mais concentrada permanece dissociada. Além disso, a interação dos complexos formados

86

mostrou-se transiente, uma vez que foi possível observar sua dissociação quando foram

reaplicados na coluna de separação. Esses resultados são coerentes com o que já foi

relatado na literatura através de experimentos de RMN que indetificaram complexos

dinâmicos e bastante flexíveis, permitindo que CHIP pudesse identificar diferentes regiões

de Hsp70 para realizar a ubiquitinação (Smith et al., 2013).

Tão importante quanto a característica de interagir com chaperonas moleculares

é a capacidade de CHIP de ubiquitinar substratos proteicos. A ubiquitinação é uma

modificação pós-traducional que envolve em muitos aspectos a homeostase celular,

sinalização e regulação proteica, sendo um processo complexo que depende da ação

sequencial de três enzimas: uma enzima E1 de ativação da ubiquitina, dependente de ATP,

uma enzima E2 de conjugação da ubiquitina e uma enzima E3 de ligação da ubiquitina ao

substrato (Pickart, 2001).

Nossos resultados obtidos através dos ensaios in vitro de ubiquitinação

mostraram que SbCHIP foi capaz de conjugar ubiquitina na presença de duas das oito

enzimas E2 testadas, UbcH5 e UbcH13. UbcH5 já foi relatada em vários estudos como

interatora de HsCHIP, participando da reação de ubiquitinação inclusive em suas diferentes

isoformas UbcH5 a, b, c e d (Jiang et al., 2001; Murata et al., 2001; Kundrat e Regan, 2010b;

Soss et al., 2011; Soss et al., 2015). Além disso, a interação com outras enzimas E2, como

UbcH7 e UbcH13 também já foi observada em estudos anteriores (Murata et al., 2001;

Zhang et al., 2005), os quais sugerem que diferentes enzimas E2 produzem diferentes

produtos de ubiquitinação, de forma que a enzima E2 é que determina o resultado da

transferência de ubiquitina (Soss et al., 2011).

Estudos contemplando a estrutura do complexo formado entre CHIP e UbcH5 ou

Ubc13 mostraram que a especificidade de ligação de CHIP com alguma enzima E2 ocorre

através de determinantes similares, incluindo principalmente o motivo chave S-P-A presente

nas E2 entre os resíduos 90 e 100 (Xu et al., 2008). A interação de CHIP com UbcH5,

especificamente, ocorre através da hélice central e do longo loop do domínio U-box de CHIP

com a hélice N-terminal e os loops L4 e L7 da enzima E2 (Xu et al., 2008).

A auto-ubiquitinação de CHIP é uma característica já bastante descrita na

literatura (Murata et al., 2001; Kundrat e Regan, 2010b; Soss et al., 2011; Soss et al., 2015).

Os trabalhos usando diferentes enzimas E2 apontam que dependendo da enzima utilizada,

87

elas são responsáveis por estabelecer mono ou poli-ubiquitinação de CHIP (Soss et al., 2011).

Em nossos resultados, usando UbcH5, verificamos uma banda bastante intensa migrando

entre 32 e 46 kDa, o que indica atividade majoritária de mono e biubiquitinação. No entanto,

também observamos um arraste e bandas menos intensas de maior massa molecular (entre

46 e 75 kDa), que pode sugerir a extensão da cadeia de ubiquitina para 3 ou 4 moléculas.

Esses resultados convergem com o que já foi relatado na literatura, uma vez que a atividade

de UbcH5 ocasiona prioritariamente a poli-ubiquitinação de SbCHIP (Soss et al., 2011; Soss et

al., 2015). Atividade semelhante também foi observado utilizando UbcH13 nas reações de

ubiquitinação.

Além da auto-ubiquitinação, CHIP também deve ser capaz de ubiquitinar diversas

outras proteínas. Especificamente, o papel de regular a concentração celular de chaperonas,

como Hsp70 e Hsp90, já é bem documentada. Neste trabalho, foram utilizadas as

chaperonas de cana-de-açucar, SsHsp70 e SsHsp90, assim como a chaperona humana Hsc70

como chaperonas alvo da ubiquitinação de SbCHIP, em conjunto com UbcH5 e UbcH13.

Nossos resultados indicam que SbCHIP é uma proteína essencial para a transferência de

ubiquitina da enzima E2 para o substrato, atuando com uma E3 ubiquitina ligase. Além disso,

verificamos que na ausência de um substrato proteico, a ubiquitinação ocorre na própria

SbCHIP, no entanto, na presença de substrato, existe uma preferência para que nele ocorra

a conjugação da ubiquitina. É interessante ressaltar que as chaperonas de plantas possuem

um padrão de poli-ubiquitinação, pela adição de pelo menos 5 moléculas de ubiquitina tanto

em SsHsp70 como em SsHsp90, ao passo que em HsHsc70 apenas um ou duas moléculas de

ubiquitinas foram conjugadas.

Ensaios in vitro, usando UbcH5 como enzima E2, mostram que as chaperonas

humanas Hsp90, Hsp70 e Hsc70 são alvos de poli-ubiquitinação de CHIP, especialmente

quando não estão ligadas a proteínas clientes desenoveladas (Murata et al., 2001; Kundrat e

Regan, 2010b; Soss et al., 2015). Nesses estudos, foram descritos 12 resíduos de lisina em

Hsp70, 16 resíduos em Hsc70 e 13 resíduos em Hsp90 capazes de sofrer ubiquitinação

(Kundrat e Regan, 2010b; Soss et al., 2015). A existência de vários sítios de ubiquitinação

nessas chaperonas está de acordo com o modelo de interação entre essas proteínas, uma

vez que o domínio TPR de CHIP se liga ao motivo EEVD presente na região bastante flexível

88

de Hsp70 e Hsp90. Essa flexibilidade fornece a mobilidade necessária para que CHIP tenha

acesso para ubiquitinar diferentes regiões da chaperona alvo (Smith et al., 2013).

Além da regulação do nível celular das chaperonas, CHIP atua na ubiquitinação

de uma ampla gama de outros substratos proteicos. Assim, neste trabalho, a proteína

luciferase de Photinus pyralis também foi utilizada como proteína alvo genérica para

ubiquitinação com auxílio de SbCHIP. Nessas reações, também verificamos que essa co-

chaperona é capaz de ubiquitinar a luciferase, tanto com UbcH5 quanto com UbcH13. Já

foram reportados resultados usando luciferase como alvo de ubiquitinação de HsCHIP

(Murata et al., 2001), mas diferente do observado aqui, a luciferase só sofreu ubiquitinação

quando desenovelada a 45 °C por 5 min na presença de Hsp90, sugerindo que esse substrato

precisa ser reconhecido por uma chaperona para que CHIP tenha acesso para realizar a

ubiquitinação (Murata et al., 2001). Nossos experimentos foram realizados com luciferase

não desenovelada e na ausência de qualquer chaperona e pudemos observar luciferase

conjugada com uma ou duas moléculas de ubiquitina. Talvez se desenovelada, haja

possibilidade de ocorrer a poli-ubiquitinação desse substrato, no entanto, novos

experimentos devem ser realizados para respondermos a esta questão.

1.6. Conclusões

- A sequencia que codifica a proteína SbCHIP foi eficientemente clonada em

vetor de expressão pET28a. A melhor condição para expressão heteróloga foi a 30 °C por 5h.

A proteína foi obtida purificada em um único estado oligomérico com rendimento de 85

mg/L de indução e em alto grau de pureza (> 95%) após duas etapas de purificação.

- A análise de similaridade de sequências mostrou que SbCHIP apresenta maior

parentesco com AtCHIP (60%). Em relação aos homólogos de CHIP animais, cerca de 35% de

similaridade foi observada. Apesar da baixa similaridade de sequência primária, o domínio U-

box é bastante conservado e resíduos específicos do TPR importantes para interação com

chaperonas são conservados entre as espécies.

- A proteína purificada foi obtida no estado enovelado, confirmado por CD e

espectroscopia de fluorescência, com composição de estrutura secundária rica em hélices-α

(55%).

89

- A estabilidade térmica de SbCHIP foi avaliada por CD, DSF e DSC. Verificou-se

que a proteína é estável até 40 °C e apresenta desenovelamento com uma única transição

de Tm de 46 °C. O desenovelamento é irreversível e gera agregados precipitados a partir de

51 °C. Observou-se ainda que a perda de conformação global dos domínios que compõem

SbCHIP ocorre simultaneamente à perda de estrutura secundária da proteína.

- O desenovelamento induzido por ureia apresentou uma única transição de Cm

de 3,4 M, possivelmente de dois estados, sendo completamente reversível após a

diminuição da concentração de ureia.

- Foram obtidos parâmetros hidrodinâmicos para SbCHIP através de SEC-MALS,

DLS, GFA e SAXS. A proteína se apresenta como um dímero em solução (65 kDa), com

coeficiente de difusão (D) de 4,9 x 10-7 cm2/s, raio hidrodinâmico (Rh) de 36 Å e raio de giro

(Rg) de 41 Å.

- A análise dos parâmetros hidrodinâmicos, como f/f0 = 1,6, Rg/Rh = 1,1 e a

distribuição P(r), permitiu concluir que a proteína apresenta formato não esférico,

possivelmente alongado em solução. O tratamento dos dados de SAXS ainda precisa ser

realizado e possobilitará a obtenção de uma estrutura em baixa resolução de SbCHIP.

- Através de SEC-MALS e SDS-PAGE, caracterizamos a formação de dois tipos de

complexos entre SbCHIP e HsHsc70: um com ~136 kDa, formado por um monômero de

HsHsc70 e um dímero de SbCHIP, e outro com ~100 kDa, provavelmente composto por um

monômero de Hsc70 e um monômero de SbCHIP.

- Ensaios de ubiquitinação in vitro mostraram que SbCHIP, na presença das

enzimas E2, UbcH5 e UbcH13, é capaz de uma ou duas moléculas de ubiquitina. SbCHIP

também se mostrou capaz de conjugar ubiquitina em outros substratos proteicos, como as

chaperonas de planta SsHsp70 e SsHsp90, a chaperona humana HsHsc70 e a proteína

luciferase.

90

Capítulo 2. O papel da HspB1 humana na desagregação de substrato pelo

sistema da Hsp70

2.1. Introdução

2.1.1. O sistema da Hsp70 e seu papel na desagregação de substratos

Enfatizando os tópicos abordados anteriormente, é de extrema importância para

a manutenção da homeostase celular que as proteínas tenham seu destino devidamente

determinado, seja pelo seu correto enovelamento realizado pelo sistema chaperona ou por

sua degradação mediada pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Em condições de estresse, a

formação de agregados proteicos é facilitada nas células porque as proteínas tendem a

perder sua estrutura nativa e a expor seus resíduos hidrofóbicos, levando à formação de

grandes agregados amorfos e à perturbação proteostase. Nesses casos, o acúmulo de

proteínas mal enoveladas e agregadas pode ser muito grave, causando perda de função e

ganho de toxicidade, o que pode culminar em doenças neurodegenerativas como Parkinson,

Alzheimer e fibrose cística, câncer e morte celular (Ramos e Ferreira, 2005; Luheshi et al.,

2008).

Como forma de defesa contra essas situações, as células devem se livrar desses

agregados o mais rápido possível e o sistema chaperona é o responsável pela desagregação

desses substratos. Muitos organismos como bactérias, fungos e plantas estão sujeitos aos

vários tipos de estresses ambientais e por isso apresentam um sistema de desagregação

muito eficiente, denominado bichaperona (Glover e Lindquist, 1998; Nillegoda et al., 2017).

Esse sistema é composto de diversas proteínas, mas recebe este nome porque duas delas

compõem o centro funcional do complexo: as Hsp70 e as desagregases da família Hsp100

(superfamília AAA+ ATPases). As Hsp100s são chaperonas hexaméricas que apresentam um

poro central por onde os polipeptídeos de agregados são ligados e separados por um

mecanismo de rotação através desse poro. Quando isso acontece, o sistema da Hsp70 é

ativado pela desagregase Hsp100 e reenovela o substrato em sua conformação nativa (Mogk

et al., 2015).

Diferentemente desses organismos, os metazoários não expressam desagregases

da superfamília AAA+ ATPases, visto que as proteínas Hsp100 foram perdidas durante a

evolução. Até mesmo a existência da atividade de desagregação não era completamente

aceita, apesar de existirem evidências de que os agregados precisavam ser de alguma forma

91

resolubilizados nas células animais (Kampinga, 1993). Assim, por muito tempo o modo como

o processo de desagregação ocorre pernameceu desconhecido, até recentemente quando

estudos mostraram que as Hsp70 em cooperação com co-chaperonas específicas

apresentam essa tipo de atividade. Nesses trabalhos foi mostrado que, além de Hsp70, a

desagregação exige a presença de uma co-chaperona Hsp40 de classe B (DJB1) e um fator de

troca de nucleotídeo (NEF), Hsp110 ou a homóloga Apg2. A presença adicional de uma

Hsp40 de tipo A (DJA2) torna o processo mais eficiente por possibilitar a desagregação de

agregados de diferentes tamanhos. Os experimentos foram realizados in vitro com

chaperonas humanas purificadas e confirmados por experimentos in vivo em C. elegans

(Shorter, 2011; Rampelt et al., 2012; Nillegoda et al., 2015).

O papel de cada componente do sistema de desagregação durante esse processo

ainda não foi completamente descoberto. Evidências indicam que as Hsp70 atuam como a

principal proteína funcional do sistema. As Hsp40 provavelmente são responsáveis pelo

recrutamento dos substratos agregados e também da Hsp70, estimulando sua atividade

ATPásica e regulando o ciclo de funcionamento da Hsp70. Essas atividades já foram bem

documentadas em processos de (re)enovelamento e também de prevenção de agregação

(Tzankov et al., 2008; Nillegoda et al., 2017). Desse modo, a função da Hsp110 na

desagregação é a menos conhecida, uma vez que não se sabe ainda se apenas sua atividade

NEF ou também o domínio de ligação ao substrato estão envolvidos nos processo. Já foi

relatado que esta proteína é necessária apenas em reações de desagregação com DJB1, mas

alguma reativação de substrato já foi observada quando ambas DJB1 e DJA2 estavam

presentes formando heterocomplexos nas reações (Gao et al., 2015; Nillegoda et al., 2015).

Alguns modelos já foram propostos para explicar como o processo de

desagregação ocorre, sendo o primeiro deles nomeado de “clamp and walk”. Segundo este

modelo, Hsp110 teria um papel muito importante, não apenas de NEF, mas atuando

também como uma ATPase que controla o ciclo de ligação ao substrato, assim como Hsp70.

Dessa maneira, Hsp110 e Hsp70 formariam um heterodímero que alterna entre os estados

ligado ao ATP e ao ADP, ligando e liberando polipeptídeos da superfície dos agregados. Esse

processo de ligação e liberação sequencial de substrato promoveria que o complexo Hsp70-

Hsp110 se movimentasse ao longo da superfície do agregado, fornecendo a energia

necessária para a remoção dos polipeptídeos que fazem parte dele (Mattoo, 2013). Essa

92

hipótese é reforçada por evidências de que Hsp110 não atua só como NEF, mas também

pode se ligar a substratos (Goeckeler et al., 2008; Xu et al., 2012). No entanto, mutações no

domínio N-terminal de Hsp110, que eliminam sua atividade ATPásica, não afetaram o

processo de desagregação de substratos. Enquanto que mutantes que perderam atividade

de troca de nucleotídeo (NEF) foram deficientes no auxílio da desagregação proteica

(Rampelt et al., 2012). Isso pode sugerir que a ligação de substrato pela Hsp110 pode estar

envolvida na desagregação, mas não como parte do ciclo ATPase. Consistentemente, outra

NEF, Bag1, que é estruturalmente diferente de Hsp110 por não possuir domínio de ligação

ao substrato ou ATP apresentou baixa atividade de desagregação.

Embora a maquinaria da Hsp70 seja o centro funcional para desagregação em

metazoários, chaperonas da família sHsp também estão envolvidas. A proteína Hsp26 de

levedura foi a primeira sHsp associada com atividade de desagregação quando células de

levedura que não expressavam Hsp26 mostraram ser incapazes de desagregar luciferase

após choque térmico. Além disso, experimentos in vitro apontam que quando luciferase e

Hsp26 foram co-agregados, os agregados foram mais facilmente solubilizados pela

chaperona Hsp104 de levedura (AAA+ Hsp100), Ssa1 (Hsp70) e Ydj1 (Hsp40) (Cashikar et al.,

2005). Hsp26 também foi eficiente em auxiliar o sistema da Hsp70 humano em desagregar

luciferase in vitro (Nillegoda et al., 2015). A outra sHsp existente em leveduras, Hsp42, não

foi capaz de substituir Hsp26 nessas atividades (Ungelenk et al., 2016).

Chaperonas sHsps humanas provavelmente estão envolvidas na desagregação

proteica, ocupando o papel observado para Hsp26. Entretanto, a participação dessas

proteínas humanas ainda não havia sido estudada anteriormente. Um trabalho sugere que

HspB5 foi capaz de promover a desagregação de substratos amilóides por Hsp70, DJB1 e

Hsp110, mas as reações levaram cerca de 30 dias (Duennwald et al., 2012), o que é um

tempo muito longo em comparação com as 2 ou 3 horas que as células demoram para

ressolubilizar agregados (Gupta et al., 2011).

Apesar de ser provável que as sHsps humanas estão envolvidas na desagregação,

possivelmente o mecanismo de funcionamento dessas chaperonas é diferente, visto que

diferentes sHsps expressas em um mesmo organismo são pouco conservadas. E quando a

comparação é entre sHsps humanas e de levedura por exemplo, a divergência é tão grande

que o alinhamento delas é muito difícil. Devido a isso, não é possível usar a homologia com

93

Hsp26 para identificar quais das 10 sHsps humanas apresentariam papel no sistema de

desagregação e quais não estariam envolvidas, como Hsp42.

2.1.2. A família sHsp e HspB1 humana

As proteínas da família small Heat-shock proteins (sHsps) compõem a primeira

linha de defesa das células em condições de estresse, por serem chaperonas moleculares

ubíquas que exibem atividade independente de ATP para prevenir a agregação de proteínas

enoveladas incorretamente (Halsbeck e Vierling, 2015). Elas são caracterizadas por sua baixa

massa molecular (12 a 43 kDa) e por apresentarem em sua estrutura um domínio

conservado e rico em folhas-β denominado domínio α-cristalino (ACD). Em contraste com o

ACD, as regiões que o flanqueiam N-terminal (NTS) e C-terminal (CTS) são muito variáveis

entre as sHsps de uma mesma espécie e ainda mais entre espécies diferentes (Figura 21A),

de forma que elas evoluíram diferentemente em metazoários, plantas e fungos, pois

compartilham baixíssima identidade o que torna difícil inclusive encontrar homólogos por

alinhamento de sequências em buscas por BLAST, por exemplo (Carra et al., 2017).

Organismos unicelulares como bactérias e leveduras contêm apenas uma ou

duas sHsps (IbpA e IbpB em E. coli; Hsp26 e Hsp42 em S. cerevisiae). Por outro lado,

eucariotos multicelulares podem apresentar várias sHsps com diferentes funções e

afinidades por substratos e encontradas em diferentes compartimentos celulares (Mymrikov

et al., 2017); existem 16 genes que codificam sHsps em C. elegans e plantas superiores

comumente expressam no mínimo 12 delas (Waters, 2013; Haslbeck e Vierling, 2015). Além

do número, o estado oligomérico das sHsps varia muito em diferentes organismos. Em

bactérias e fungos, elas são descritas como dímeros funcionais, enquanto em organismos

superiores muitas sHsps podem ser encontradas como grandes complexos multiméricos de

diferentes tamanhos, dependendo do número de subunidades associadas (24 a 40). Dímeros

também já foram relatados e eles são formados mesmo nos grandes oligômeros,

constituindo a unidade de dissociação destes. Dessa forma, embora as sHsps apresentem

uma baixa massa molecular, elas são encontradas principalmente como oligômeros

polidispersos formados por 10 a 24 subunidades nas células (Haslbeck e Vierling, 2015;

Jovcevski et al., 2015). A atividade das sHsps é frequentemente modulada por modificações

pós-traducionais, especialmente fosforilação de resíduos específicos na região N-terminal

94

(Figura 21C) e há indícios na literatura de que a atividade está relacionada com a formação e

dissociação dos oligômeros (Jovcevski et al., 2015).

Figura 21: Estrutura tridimensional e mecanismo de regulação do estado oligomérico e da atividade de sHsps. Estrutura cristalográfica do (A) monômero e do (B) dodecâmero formado pela sHsp de trigo HSP16.9, exemplificando a estrutura dos domínios N-terminal, α-cristalino e C-terminal obtida para uma sHsp eucariótica (van Montfort et al., 2001; PDB: 1GME). (C) Resumo esquemático do efeito da fosforilação ou de mutações de substituição de serinas especifícas de HspB1 na oligomerização e na atividade chaperona dessa sHsp (adaptado de Jovcevski et al., 2015).

Em humanos existem 10 sHsps diferentes (HspB1 a HspB10) que podem ser

encontradas como grandes ou pequenos oligômeros e apresentam diferentes propriedades

bioquímicas e padrões de expressão, sendo algumas ubíquas e outras tecido-específicas

(Mymrikov et al., 2017). Como mencionado, os dímeros são as menores unidades funcionais

e em alguns casos se associam para formação de grandes oligômeros. O conservado ACD é

muito importante para sHsps uma vez que a dimerização ocorre pelo pareamento simétrico

antiparalelo das folhas-β7 desse domínio (Baranova et al., 2011). Porque o ACD é

conservado, não apenas homodímeros, mas heterodímeros podem ser formados entre

diferentes sHsps humanas e já foram relatados entre algumas delas, como HspB1 e HspB6

ou HspB4 e HspB5 (Skouri et al., 2012; Heirbaut et al., 2016).

95

HspB1 é a sHsp humana mais expressa em diferentes tecidos, principalmente em

condições estressantes, e é caracterizada por formar grandes oligômeros. Os homodímeros

são formados através de ligações de dissulfeto pelas folhas-β presentes no ACD. Embora o

CTS de sHsps não seja conservado, HspB1 e todas as outras sHsp que formam oligômeros

(HspB4, HspB5 e HspB7) contêm um motivo IxI/V altamente conservado nessa região

(Delbecq et al., 2012). O motivo IxI/V é responsável pela oligomerização, sendo que estudos

com sHsps de planta mutantes nessa região resultaram na dissociação de subunidades. Em

contraste, estudos com HspB4 e HspB5 mostraram que os mutantes IxI/V preservam sua

capacidade de oligomerizar, mas aumentam sua atividade chaperona de prevenção de

agregação. O mesmo estudo, no entanto, afirmou que o motivo IxI/V participa de interações

de subunidades com ACD ou com região IxI/V em outro monômero, sugerindo que ele

desempenha um papel na oligomerização, mas outras regiões também podem estar

envolvidas (Pasta et al., 2004).

Assim como o papel do motivo IxI/V na oligomerização das sHsps, não há

consenso na literatura sobre a função dos estados diméricos ou oligoméricos de HspB1. No

entanto, é bem aceito que a fosforilação de resíduos de serina específicos seja importante

para a regulação funcional do HspB1. Experimentos com mutações que mimetizam

fosforilação, pela substituição das serinas por aspartatos, mostraram que os mutantes

apresentam menor atividade chaperona que a proteína selvagem (Rogalla et al., 1999). No

entanto, outros estudos apontam que a fosforilação leva à dissociação de oligômeros em

dímeros, aumentando a atividade da chaperona (Hayes et al., 2009; Jovcevski et al., 2015). A

fosforilação de HspB1 por MAPKAPK-2 e MAPKAPK-3 foi detectada in vivo em inúmeros

resíduos de serina, com serinas 15, 78 e 82 sendo as mais predominantemente modificadas

(Figura 21C; Arrigo, 2011).

Funcionalmente, as sHsps humanas mais estudadas são HspB1, HspB5 (αB-

crystallin), HspB6 e HspB8 e a maior parte do conhecimento que se tem sobre elas baseia-se

em ensaios in vitro de prevenção de agregação usando proteínas modelo como substrato

(Mymrikov et al., 2017). A função de prevenção de agregação, entretanto, pode não estar

relacionada com a capacidade de promover desagregação de substrato em conjunto com o

sistema da Hsp70. O papel das sHsps na desagregação foi descrito apenas para as proteínas

de bactérias e leveduras, organismos que dependem do sistema de desagregação

96

bichaperona (com Hsp70 e Hsp100). O modelo aceito para esse sistema sugere que as sHsps

ativadas por temperatura se ligam aos substratos desenovelados independentemente de

ATP para formar complexos que são morfologicamente diferentes dos agregados de

proteínas formados na ausência de sHsps. Esses complexos consistem de um núcleo

formado pelo substrato e pela sHsp e uma superfície dinâmica rica em sHsps que permite

que o substrato seja resgatado eficientemente pelo sistema de desagregação e

reenovelamento Hsp70-Hsp100 (Żwirowski et al., 2017).

Levando essas informações em consideração, uma das principais motivações

deste trabalho é aumentar o conhecimento existente sobre o mecanismo do processo de

solubilização de grandes agregados pelo sistema humano de desagregação. O acúmulo

desses agregados gerado por diversas condições celulares causa perda de função proteica,

provocando diversas doenças degenerativas e câncer. Sendo assim, a ampliação do

conhecimento sobre esse processo torna-se muito relevante, uma vez que consiste no

principal método de defesa celular contra essas situações danosas. A compreensão do

mecanismo desse sistema envolvendo sHsps e sua manipulação apresenta alto potencial de

gerar novas abordagens terapêuticas contra doenças causadas pelo acúmulo de agregados

proteicos.

97

2.2. Objetivos

Devido a sua importância como embasamento para futuros processos

terapêuticos e biotecnológicos, o conhecimento sobre o processo de desagregação de

substratos em metazoários é um tópico de grande interesse. Por sua complexidade

envolvendo diversas chaperonas, esse processo só foi identificado recentemente e

permanece como principal alvo de descoberta dos maiores grupos mundiais focados no

estudo das chaperonas moleculares. O papel das sHsps humanas nesse processo ainda

permanece desconhecido e por isso o objetivo geral desse trabalho foi fornecer maior

conhecimento da atividade de desagregação da maquinaria da Hsp70 e investigar o papel de

uma sHsp humana neste processo. Para tal, nossos objetivos específicos foram:

(1) Clonar a sequência que codifica a chaperona humana HspB1 em vetor de expressão

em E. coli, expressar e estabelecer um protocolo para a purificação dessa proteína.

(2) Caracterizar a atividade de desagregação da maquinaria da Hsp70 humana in vitro,

estabelecendo os requisitos mínimos das chaperonas necessárias para que a atividade

aconteça.

(3) Caracterizar funcionalmente a interação de HspB1-WT e seus mutantes funcionais

com agregados proteicos.

(4) Investigar o papel de HspB1-WT e seus mutantes funcionais como potenciais

parceiros de Hsp70/Hsp40/Hsp110 no processo de desagregação.

98

2.3. Material e métodos

Para atingir os objetivos propostos para esta etapa deste trabalho, um projeto

foi desenvolvido em colaboração com o grupo de pesquisa do Dr. Jason C Young. Assim,

alguns experimentos foram realizados no laboratório do Prof. Dr. Carlos Ramos, mas a maior

parte deles foi realizada durante estágio no exterior, sob orientação do Dr. Young, nas

dependências de seu laboratório na McGill University (Montréal, Canadá).

2.3.1. Clonagem, expressão e purificação das proteínas

Uma pequena base teórica sobre as principais técnicas usadas para obtenção das

proteínas puras em solução já foi abordada no capítulo anterior, então, aqui serão

apresentadas de forma geral como foram obtidas as proteínas utilizadas nesta etapa do

trabalho.

Para a obtenção da chaperona HspB1, o vetor contendo a sequência que codifica

essa proteína (Frt-V5-HspB1) foi adquirido da compania Addgene. A fim de clonar essa

sequência em vetor específico para indução de expressão heteróloga em E. coli, o gene de

HspB1 foi amplificado por PCR utilizando o par de primers HspB1_WT 1 e 2 (Tabela 8) e

inserido no plasmídeo pPROEX-Hta usando as enzimas de restrição BamHI e XhoI (New

England Biolabs). A construção foi verificada através de sequenciamento. Assim como o

vetor pET28a, pPROEX permite que proteína seja expressa fusionada com uma cauda de

poli-histidina em sua porção N-terminal e a indução de expressão pode ser controlada pela

adição de IPTG no meio de cultura.

Para construção de mutantes funcionais de HspB1 foi utilizada a metodologia de

mutagênese sítio dirigida QuikChange (Agilent Technologies) com pequenas adaptações. Em

resumo, o clone contendo a sequência que codifica a proteína selvagem (pPROEX-His-HspB1-

WT) foi amplificado por PCR usando os primers com as mutações desejadas (Tabela 8) e uma

DNA polimerase de alta fidelidade (Pfu). Em seguida, os produtos da PCR foram tratados

com a enzima de restrição DpnI para digestão do DNA metilado parental e, então, usados na

transformação de células de E. coli supercompetentes da cepa XL10-Gold. Para construção

dos triplos mutantes esse processo foi repetido usando o clone já com a sequência de um

mutante e outra combinação de pares de primers. Todas as mutações foram confirmadas

por sequenciamento dos plasmídeos.

99

Tabela 8: Primers utilizados para clonagem em vetor de expressão e mutagênese

Nome Sequência

HspB1-WT-1 5’- GGCCCCGGATCCGATGACCGAGCGCCGCGTC -3’

HspB1-WT-2 5´- GGCCGGCTCGAGTTACTTGGCGGCAGTCTCATC -3’

HspB1-S15D-1 5'- CCTGCGGGGCCCCGACTGGGACCCCTTC -3'

HspB1-S15D-2 5'- GAAGGGGTCCCAGTCGGGGCCCCGCAGG -3'

HspB1-S78D-S82D-1 5'- GCCGCGCGCTCGACCGGCAACTCGACAGCGGGGTCT -3'

HspB1-S78D-S82D-2 5'- AGACCCCGCTGTCGAGTTGCCGGTCGAGCGCGCGGC -3'

HspB1-GPG-1 5'- CGCGACTCGAAGGTGCCTGGGCCGGTGATCTCGTTGGA -3'

HspB1-GPG-2 5'- TCCAACGAGATCACCGGCCCAGGCACCTTCGAGTCGCG -3'

A Tabela 9 mostra os mutantes construídos para mimetizar a fosforilação de

resíduos específicos de serinas através da substituição das serinas 15, 78 e 82 por

aspartatos. Além disso, usando o triplo mutante também foi construído um mutante de

dissociação do oligômero pela substituição do motivo IPV da região C-terminal pela

sequência GPG.

Tabela 9: Mutantes funcionais construídos para HspB1

Nome do mutante Aminoácidos mutados

HspB1-1D HspB1-S15D

HspB1-2D HspB1-S78D-S82D

HspB1-3D HspB1-S15D-S78D-S82D

HspB1-3D-GPG HspB1-S15D-S78D-S82D-I181G-V183G

A fim de expressar as proteínas em larga escala para purificação, células de E. coli

BL21(DE3) transformadas com o plasmídeo que codifica a proteína de interesse foram

cultivadas em 1 L de meio LB com 100 µg/mL de ampicilina ou 50 µg/mL de canamicina a 37

°C até atingir A600nm entre 0,6 e 0,8. A indução de expressão foi iniciada com a adição de 1

mM de IPTG ao meio de cultura. A expressão de HspB1-WT foi inicialmente testada a 37 °C

por 1, 2 e 4h; 30 °C por 2 e 4h; e 18 °C overnight. Depois disso, as células foram

100

centrifugadas usando Avanti® J-26 XP (rotor JLA-8.1000) a 4500g por 20 min e os pellets

resultantes foram ressuspendidos em Tampão de Equilíbrio (tampão EQ, Tabela 12),

congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80 °C para uso posterior. Para purificação, as

células foram descongeladas e lisadas em um homogeneizador de alta pressão (Emulsiflex

Avesti), o lisado foi centrifugado a 50000 rpm por 1 h a 4 °C em ultracentrífuga Optima L-90K

(rotor type 70 Ti).

Outras proteínas utilizadas nesta etapa do trabalho já haviam sido clonadas pelo

grupo do Dr. Jason Young, tendo seu protocolo de expressão e purificação já padronizado

(Tzankov et al., 2008; Baaklini et al., 2012). Os plasmídeos utilizados e as condições de

expressão das proteínas são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10: Plasmídeos de clonagem e condições de expressão das proteínas utilizadas

Proteína Vetor Temperatura (°C) Tempo (h)

His-HspB1-WT e mutantes pPROEX 37 4

His-Hsp70, His-Hsc70, His-Hsp110 pPROEX 30 4

His-DJA2 pPROEX 37 1

His-DJB1 pET28a 37 2

His-Myc-Luciferase pET3a 30 3

Uma vez que todas as proteínas expressas continham a cauda de poli-histidina

em sua sequência, a primeira etapa de purificação envolveu uma cromatografia de afinidade

ao níquel em coluna contendo 5 mL de resina Ni Sepharose (Nuvia IMAC Ni-charged resin).

Para HspB1-WT e os mutantes, esta foi a única etapa cromatográfica seguida apenas de uma

diálise overnight em tampão G (Tabela 12). As purificações de outras chaperonas

envolveram outras etapas, como cromatografia de exclusão por tamanho (HiPrep 16/60

Sephacryl S-300 HR – GE Healthcare) e/ou cromatografia de troca iônica (HiTrapQ HP – GE

Healthcare). Essas etapas cromatográficas foram realizadas usando sistema ÄKTA FPLC

(Amersham Bioscience) a 4 °C. As frações coletadas de cada etapa foram analisadas por SDS-

PAGE 10 ou 15%. Após a purificação, a concentração das proteínas foi determinada através

da medida de sua absorbância a 280 nm, foram congeladas em nitrogênio líquido e mantidas

101

a -80 °C. Quando necessário, as proteínas foram concentradas usando concentradores de

centrífuga (Amicon®). Os tampões e etapas de purificação usadas para cada proteína estão

detalhados nas Tabelas 11 e 12.

Tabela 11: Condições de purificação das proteínas utilizadas

Proteína HspB1, mutantes

e luciferase Hsp70, Hsc70, Hsp110 e DJB1

DJA2

Afinidade ao níquel

Tampão EQ A A C

Tampão EL A B C

Troca iônica Tampão EQ - D -

Tampão EL - D -

Exclusão por tamanho - Tampão G Tampão H

Diálise Tampão G - -

Tabela 12: Tampões utilizados para purificação das proteínas utilizadas

Nome Composição

Tampão de Equilíbrio A (Tampão EQ A) 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 500 mM NaCl; 20 mM imidazol

Tampão de Eluição A (Tampão EL A) 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 100 mM NaCl; 500 mM imidazol

Tampão EL B 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 300 mM imidazol

Tampão EQ C 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 750 mM NaCl; 60 mM imidazol

Tampão EL C 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 500 mM NaCl; 1 M imidazol

Tampão EQ D 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 50 mM NaCl

Tampão EL D 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 600 mM NaCl

Tampão G 20 mM Hepes-KOH pH 7,5; 100 mM KOAc; 5 mM MgOAc2

Tampão H 20 mM Hepes-KOH pH 7,5; 500 mM NaCl; 5 mM MgOAc2

Tampão CD 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 100 mM NaCl

102

2.3.2. Dicroísmo circular

Para a espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD), amostras de HspB1 e seus

mutantes foram primeiramente dialisadas em Tampão CD (Tabela 12) e centrifugadas a

20000 x g por 15 min a 4 °C. As medições foram realizadas usando 500 µL de proteína a 10

µM em cubetas de quartzo de 1 mm no espectropolarímetro Chirascan, com fenda de 1 nm

e intervalos de 0,5 s. Os espectros foram obtidos de 200 a 260 nm e os sinais em mdeg

foram convertidos para elipcidade molar [θ], sendo representados como uma média de 16

espectros para cada proteína. A fim de auxiliar a interpretação dos resultados de CD, o

programa IUPred foi utilizado para predição de tendência de estrutura desordenada das

proteínas (Dosztányi et al., 2005).

Para obtenção de curvas de desenovelamento induzido por temperatura,

amostras de HspB1 a 30 µM tiveram seu sinal de CD monitorado a 217 e 208 nm, em cubetas

de quartzo de 1 mm sob aumento de temperatura de 1 °C/min de 20 a 90 °C. Além disso,

durante o aumento da temperatura, espectros foram medidos a cada 10 °C.

2.3.3. Filtração em gel analítica

O estado oligomérico de HspB1 e dos mutantes funcionais foram verificados por

filtração em gel analítica usando coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL

(Ge Healthcare) previamente equilibrada com Tampão G. Através do sistema ÄKTA FPLC,

amostras de 500 µL de HspB1 a 10 µM foram aplicadas na coluna com fluxo de 0,5 mL/min a

4 °C. Absorbância a 280 nm foi monitorada durante a eluição para detectar a presença de

proteína e seu volume de eluição.

2.3.4. Espalhamento de luz dinâmica (DLS)

O tamanho dos oligômeros formados por HspB1 e também dos agregados de

luciferase formados na presença de HspB1 foram estimados através da medida de

coeficiente de difusão por DLS e convertidos para raio hidrodinâmico (Rh) e diâmetro pela

equação de Stokes-Einstein (Edward, 1970). As medidas foram realizadas em equipamento

Zetasizer Nano ZS-Zen 3600 (Malvern) a 25 °C usando cubetas de plástico de 1 cm contendo

as proteínas HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG a 20 µM em solução em tampão G. Para

a medida de tamanho dos agregados, 2 µM de luciferase nativa foram incubados na

ausência ou na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG a 45 °C por

103

15 min. As curvas de distribuição de tamanho representam a média obtida de 10 leituras de

60 s em cada condição.

2.3.5. Ensaio de agregação térmica da luciferase

A fim de determinar a capacidade de HspB1 e seus mutantes de interagir e co-

agregar com substrato, foram realizados ensaios de agregação térmica da luciferase. Para

tal, reações de 360 µL de volume final, em Tampão G, foram preparadas com 2 µM de His-

Myc-luciferase purificada na forma nativa e 1 mM de DTT na presença de diferentes

concentrações de HspB1. As reações foram então incubadas a 37 °C por 60 min, sendo que

nos tempos de 0, 5, 10, 15, 30 e 60 min, alíquotas de 50 µL foram transferidas para cubetas

de quatzo e a agregação da luciferase foi acessada pela medida do espalhamento de luz

detectada a 320 nm em espectrofotômetro DU730 UV-Vis (Beckman Coulter). A agregação

espontânea da luciferase na ausência de sHsps foi monitorada como controle.

2.3.6. Ensaio de enovelamento da luciferase pelo sistema da Hsp70

A fim de determinar a atividade de reenovelamento de substrato do sistema da

Hsp70 e de padronizar a quantidade de luciferase ativa, foram realizados ensaios de

enovelamento da luciferase. Para isso, 2 µM de His-Myc-luciferase foram desnaturados em

Tampão G contendo 6 M de cloreto de guanidina (Gdn-Cl) e 1 mM de DTT por 10 min em

temperatura ambiente. Em seguida 1 µL de luciferase desnaturada foi adicionado em 99 µL

de reações de reenovelamento contendo 2 mM de ATP e as chaperonas purificadas e

incubados a 30 °C por 60 min. Nos tempos 0, 5, 15, 30 e 60 min, alíquotas de 2 µL das

reações foram adicionados a 25 µL de luciferina (Luciferase Assay Reagent – Promega) para

medir a recuperação da atividade da luciferase em luminômetro de tubo SIRIUS (Berthold). A

concentração final de proteínas nas reações foi: 20 nM de luciferase, 4 µM de Hsp70, 1 µM

de Hsp110, 4 µM de DJA2 e 4 µM de DJB1 (Tzankov et al., 2008).

104

2.3.7. Ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase pelo sistema

da Hsp70

O conceito usado neste ensaio é muito similar ao do ensaio de enovalemanto da

luciferase, porém em vez de luciferase desnaturada, aqui o substrato utilizado foram

agregados de luciferase induzidos por temperatura. Para tal, 2 µM de His-Myc-luciferase

nativa foram inicialmente agregadas pela incubação a 45 °C por 15 min em Tampão G

contendo 1 mM de DTT na ausência ou presença de 20 µM de HspB1. Em seguida, 1 µL de

luciferase agregada foi adicionada em 99 µL das reações de desagregação seguida de

reenovelamento, contendo 2 mM de ATP e um mix com as chaperonas indicadas. As reações

foram, então, incubadas a 30 °C por 180 min (Rampelt et al., 2012). Nos tempos 0, 15, 30,60,

90, 120 e 180 min, alíquotas de 2 µL de reação foram adicionados em 25 µL de luciferina

(Luciferase assay reagent – Promega) e a recuperação de atividade da luciferase foi medida

em luminômetro em tubo SIRIUS (Berthold). As concentrações finais de proteínas nas

reações, salvo indicação contrária, foram: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1, 2 µM de

Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1.

2.3.8. Ensaio de desagregação da luciferase

A quantificação da recuperação de atividade dos agregados de luciferase para

detectar desagregação é uma forma indireta de verificar esse processo porque é necessário

que a luciferase esteja em sua forma nativa para que sua atividade seja medida, em outras

palavras, é preciso que os agregados sejam desagregados e em seguida reenovelados, visto

que ambos os processos são realizados pela mesma maquinaria da Hsp70.

Como forma de detectar a desagregação mais diretamente, desvinculada do

reenovelamento da luciferase, esse ensaio de desagregação foi desenvolvido com objetivo

de verificar a dissociação dos grandes agregados em monômeros de luciferase, não

necessariamente enovelados. Para isso, 2 µM de His-Myc-luciferase foram inicialmente

agregadas pela incubação a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na

ausência ou presença de 20 µM de HspB1. Em seguida, 6 µL da luciferase agregada foram

adicionadas em 594 µL de reações de desagregação contendo 2 mM de ATP e as chaperonas

indicadas com incubação a 30 °C. Nos tempos 0 e 180 min, 200 µL das reações foram

aplicados em coluna de separação por tamanho Superose 12 10/300 GL (GE Healthcare) a

0,5 mL/min a 4 °C. Frações de 1 mL dos volumes de eluição de 6 a 18 mL foram coletadas e

105

as proteínas de cada fração foram precipitadas. Para precipitação, foram adicionados em

cada fração 500 µL de solução 50% de ácido tricloroacético (TCA) e 1,5 µL de 10 mg/mL de

ovalbumina (proteína carreadora). Após incubação no gelo por 15 min, as amostras foram

centrifugadas a 20000 x g por 30 min a 4 °C e o sobrenadante foi descartado. Logo após, os

precipitados foram lavados com 200 µL de acetona gelada seguida de centrifugação a 20000

x g por 20 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram descartados novamente e as amostras foram

secas na capela em temperatura ambiente por 15 min. Os precipitados formados foram

ressuspendidos em 30 µL de tampão de amostra para SDS-PAGE com 1 µL de 1M Tris-base

pH 11. Finalmente, as amostras foram agitadas vigorosamente a 1300 rpm por 15min a 37 °C

usando um agitador (Thermomixer R – Eppendorf). As amostras de proteína precipitada de

cada fração foram aplicadas em SDS-PAGE 12% e detectadas por Western Blotting usando

um anticorpo específico para reconhecer a cauda Myc da luciferase (c-Myc tag antibody

9E10 – Invitrogen) e anticorpo específico para reconhecer HspB1 (anti-Hsp27 5D12-A12 –

StressMarq Biosciences).

2.3.9. Estatística

Os experimentos foram feitos em replicatas pelo menos 3 vezes. Em todas as

figuras, as barras de erro representam desvios padrão da média dos experimentos. A

significância foi determinada por testes t de Student não pareados com p < 0,05. Se as barras

de erro não foram mostradas, n < 3 e a análise estatística não foi calculada.

106

2.4. Resultados

2.4.1. Clonagem, expressão e purificação da HspB1-WT e seus mutantes

O primeiro objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para obtenção

da proteína HspB1 isolada em solução. Para isso, o gene que a codifica foi clonado em

plasmídeo de expressão pPROEX-Hta que permitiu a inserção de uma cauda de poli-histidina

na região N-terminal da proteína, antes da primeira metionina. A clonagem foi confirmada

por sequenciamento e as sequências de nucleotídeos e aminoácidos obtidas são mostradas

na Figura 22.

Figura 22: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos da proteína His-HspB1-WT. Os resíduos de nucleotídeos alvos de mutações estão destacados em vermelho. Para obter a proteína ativa, mutações sítio específicas que mimetizam a fosforilação foram realizadas; as serinas 15, 78 e 82 foram então substituídas por aspartatos. Para obtenção de mutantes de dissociação do oligômero, mutações foram feitas no motivo IPV encontrado na região C-terminal da proteína, para isso, a isoleucina 181 e a valina 183 foram substituídas por glicinas. A sequência da cauda que inclui a poli-histidina está destacada em azul.

107

Após a obtenção do clone pPROEX-His-HspB1-WT, o mesmo foi usado como

molde para construção de mutações sítio dirigidas de substituição de resíduos específicos de

serina por aspartatos, mimetizando assim a fosforilação que ocorre nessa proteína para

regulação de sua atividade nas células. As serinas 15, 78 e 82 foram substituídas (Figura 22) e

foram gerados clones para o mutante simples (HspB1-1D ou S15D), mutante duplos (HspB1-

2D ou S78D-S82D) e mutante triplo (HspB1-3D) em que as três serinas sofreram mutação.

Posteriormente, o clone do mutante triplo foi usado como molde para construção de um

mutante ativo com dissociação do oligômero pela substituição do motivo IPV por GPG.

Os plasmídeos codificando as proteínas de interesse foram então utilizados para

expressão recombinante em E. coli. Inicialmente foram feitos testes de expressão em

pequena escala da HspB1-WT para determinação da melhor temperatura e tempo de

indução da proteína solúvel. Foram testadas as condições de 37 °C por 1, 2 e 4 h; 30 °C por 2

e 4 h; e 18 °C overnight. Os lisados obtidos em cada condição foram aplicados em resina com

níquel coordenado para determinar se as proteínas expressas tem afinidade a essa resina e

para avaliar com maior clareza, sem a presença de todas as proteínas do lisado, qual a

condição ótima de expressão. As frações insolúveis (precipitado) e solúveis (sobrenadante)

do lisado das células bacterianas em cada condição, assim como as frações da eluição da

afinidade ao níquel, foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 23). Pode-se observar que a

proteína foi expressa em grande quantidade em todas as condições testadas, assim, a

condição ótima de expressão foi determinada pela menor quantidade de HspB1-WT

observada na fração insolúvel (P) e maior quantidade da proteína solúvel sem outras

impurezas (L, E1 e E2). A indução de expressão em grande escala para HspB1-WT ocorreu a

37 °C durante 4 h, considerada a melhor condição.

108

Figura 23: Teste de expressão da proteína His-HspB1-WT em diferentes tempos e temperaturas. O plasmídeo pPROEX-His-HspB1-WT foi transformado em E. coli BL21(DE3) e as células foram cultivadas a 37 °C em meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina até atingir A600nm entre 0,6 e 0,8. A expressão da proteína foi induzida pela adição de 1 mM de IPTG nas temperaturas e pelos tempos indicados. Em seguida, as células foram centrifugadas, ressupendidas em Tampão EQ A e lisadas com nitrogênio por congelamento seguido de descongelamento três vezes consecutivas na presença de 1 mg/mL. O lisado obtido foi tratado com 0,3 mg/mL de DNase e centrifugado; o sobrenadante resultante foi aplicado em coluna contendo resina carregada com níquel. Após etapas de lavagem com Tampão EQ A, a proteína foi eluída com tampão EL B. As frações foram então analisadas por SDS-PAGE 15%. (M) padrão de massa molecular; (P) precipitado; (L) lisado solúvel; (FT) flowthrough; (W) lavagem; (E) eluição. Verificamos que a proteína foi expressa em grande quantidade na fração solúvel em todas as condições testadas, mas decidimos que 37 °C por 4h foi a melhor condição de expressão.

Uma vez determinada condição ótima de expressão, a mesma foi realizada em

larga escala (6 L de meio de cultura) para obtenção de HspB1-WT pura. Como mencionado

anteriormente, as proteínas recombinantes possuem uma cauda de poli-histidina que

permite a utilização da cromatografia de afinidade níquel como primeira etapa de

purificação (Figura 24). Para tal, após a aplicação do lisado na coluna com resina Ni

Sepharose (FT) e lavagem com Tampão EQ A para evitar ligação inespecífica de proteínas

(W), impurezas foram removidas pela eluição com ~25% de Tampão EL A (125 mM de

imidazol), essa porcentagem foi determinada previamente através de cromatografia com

gradiente linear com o tampão de eluição. A proteína HspB1-WT foi eluída com 100% de

109

Tampão EL A. É possível observar que parte da proteína foi eluída logo após a injeção (FT),

seja porque a quantidade de proteína aplicada saturou a resina ou porque não houve ligação

dessas moléculas na resina. No entanto, nesta etapa cromatográfica a proteína foi obtida

com rendimento de ~30 mg/L de indução e com alto grau de pureza. As frações obtidas da

eluição de HspB1-WT foram então dialisadas em Tampão G e tiveram sua concentração

determinada antes de serem congeladas e armazenadas a -80 °C.

Inicialmente, durante o estabelecimento do protocolo de purificação, uma etapa

de cromatografia de exclusão por tamanho foi testada após a afinidade ao níquel, usando

coluna HiLoad 16/600 Superdex 200. No entanto, como será mostrado adiante, essa etapa

não foi eficiente na separação de nenhuma impureza ou de diferentes estados oligoméricos

de HspB1-WT.

Figura 24: Purificação da proteína His-HspB1-WT por cromatografia de afinidade ao níquel. Após a indução de expressão proteica a 37 °C por 4h, as células foram centrifugadas e ressuspendidas em tampão EQ A. Em seguida, as células foram lisadas usando homogeneizador de alta pressão e o lisado foi centrifugado. O sobrenadante resultante foi aplicado em coluna contendo 5 mL de resina Ni Sepharose com fluxo de 1 mL/min. (A) Cromatograma obtido na purificação, no qual observa-se que depois da etapa de lavagem com 10 volumes de coluna (CV) de Tampão EQ A, impurezas inespecíficas foram eluídas com 5 CV usando 20% de Tampão EL A (pico 1). A proteína HspB1-WT foi eluída com 100% de Tampão EL A (pico 2). (B) As frações coletadas durante a cromatografia foram analisadas por SDS-PAGE 15%. (M) padrão de massa molecular; (I) input aplicado na coluna; (FT) flowthrough; (W) lavagem. Através desta etapa cromatográfica a proteína foi obtida em grande quantidade (~30 mg/L de indução) e com alto grau de pureza.

110

Todos os outros mutantes funcionais de HspB1 tiveram sua expressão induzida

nas mesmas condições da proteína selvagem. A purificação também foi realizada com a

mesma metodologia descrita e eles se comportaram de maneira muito parecida ao que foi

mostrado na Figura 24. Impurezas foram removidas com 25% de Tampão EL A, a proteína foi

eluída com 100%, o rendimento e grau de pureza também foram semelhantes.

2.4.2. Caracterização conformacional da HspB1-WT e seus mutantes

Após a purificação das proteínas, algumas técnicas biofísicas foram utilizadas

para obtenção de informações sobre características conformacionais dessas moléculas em

solução. Inicialmente, a filtração em gel analítica foi usada para determinação do estado

oligomérico da HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG em solução (Figura 25). Pode-se

observar nos cromatograma obtidos que HspB1-WT e HspB1-3D apresentaram basicamente

o mesmo padrão de eluição, sendo totalmente eluídas no volume morto da coluna (entre 7 e

8 mL). A eluição no volume morto da coluna implica que as moléculas apresentam tamanho

grande demais para a resolução de separação da coluna. No caso da Superdex 200 10/300

GL, a resolução varia de 10 kDa a 1 MDa, o que indica que essas proteínas apresentam

tamanho igual ou superior a 1 MDa, ou seja, são grandes oligômeros em solução. Para o

mutante de dissociação do oligômero, HspB1-3D-GPG observa-se que a maior parte das

moléculas também foi eluída como grande oligômero, no entanto, cerca de 20% foi eluída

com ~14 mL, sugerindo a presença de dímeros em solução.

111

Figura 25: Determinação do estado oligomérico de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG por GFA. Amostras das proteínas a 10 µM foram aplicadas na coluna analítica de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrada com Tampão G. Observa-se que toda HspB1-WT foi eluída no volume morto da coluna indicando a presença de grandes oligômeros em solução. HspB1-3D também exibiu o mesmo padrão, o que sugere que a fosforilação dos resíduos não é suficiente para regular a oligomerização dessa proteína. Já HspB1-3D-GPG foi eluída em sua maior parte no volume morto, indicando a presença de oligômeros, porém cerca de 20% foi eluída próximo de 14 mL, indicando a presença de moléculas diméricas em solução. Nas curvas de eluição de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG foram somados os valores de 0,2 e 0,4, respectivamente, na absorbância relativa a fim de facilitar a visualização, evitando a sobreposição das curvas.

Para confirmar se as proteínas foram expressas e purificadas corretamente

enoveladas e também para determinar sua composição de estrutura secundária, foram

realizados experimentos de espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD). Os espectros de

CD obtidos para HspB1-WT e HspB1-3D, nas mesmas concentrações, apresentam formato

muito semelhante (Figura 26A), praticamente sobrepostos. O mínimo de sinal obtido em 217

nm indica uma estrutura secundária composta majoritariamente de folhas-β. O espectro de

HspB1-3D-GPG também apresentou mínimo em 217 nm, no entanto, pode-se observar um

vale de sinal positivo em torno de 230 nm, o que sugere composição rica tanto em folhas-β

quanto em estruturas desordenadas.

A predição de tendência de desordem realizada pelo programa IUPred para as

proteínas HspB1-WT e HspB1-3D-GPG mostra que para as duas proteínas as regiões N-

terminal e ACD tem baixa tendência de apresentarem estrutura desordenada (< 0,5). Por

outro lado, a região C-terminal, contendo o motivo de oligomerização IPV, mostrou ter alta

112

tendência de ser desordenada (> 0,5), sendo maior ainda para o mutante HspB1-3D-GPG,

especialmente na região da mutação I181G e V183G (Figura 26E). Combinados com os

resultados de CD, esses dados podem sugerir que a oligomerização, pelo motivo IPV,

estabiliza a região C-terminal. Mas no mutante GPG, que apresenta dímeros em solução, a

oligomerização não acontece e a região fica estruturada desordenadamente em solução.

Para determinação da estabilidade térmica das proteínas, seu enovelamento foi

monitorado por CD a 217 nm ao longo do aumento de temperatura de 20 a 90 °C (Figura

26B). As curvas de desenovelamento foram similares para HspB1-WT e os mutantes, para os

quais não se observou perda de sinal de CD nesse comprimento de onda, sugerindo que

essas proteínas podem ser altamente estáveis ao aumento de temperatura. Para avaliar essa

estabilidade, o desenovelamento de HspB1 foi monitorado a 217 e também a 208 nm e

espectros de CD foram medidos a cada 10 °C enquanto a temperatura aumentava (Figuras

26C e D). Novamente, em 217 nm não foi observada perda de sinal de CD, porém em 208 nm

percebe-se que ocorre um ganho intenso de sinal a partir dos 60 °C. Observando os

espectros medidos a cada 10 °C, pode-se perceber que os espectros mantem seu formato

até 60 °C e depois disso ele muda, apresentando um mínimo em 200 nm, o que sugere perda

das estruturas de folha-β e ganho de estrutura desordenada. Apesar disso, mesmo com

aquecimento até 90 °C, não foi detectada agregação ou precipitação das amostras.

113

Figura 26: Espectroscopia de dicroísmo circular de HspB1-WT e seus mutantes funcionais. (A) Espectros de CD das proteínas HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG foram medidos usando as proteínas a 10 µM em cubeta de quatzo de 1 mm. Os sinais obtidos em mdeg foram convertidos para elipcidade molar [θ] e estão representadas como uma média de 16 espectros para cada proteína. A forma dos espectros, com mínimo em 217 nm, indica composição de estrutura secundária rica em folhas-β. (B) Curvas de desenovelamento térmico de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG foram obtidas com 30 µM de proteína pela medida de sinal de CD a 217 nm em cubeta de quartzo de 1 mm sob aumento de temperatura de 1 °C/min de 20 a 90 °C. Não foi observada perda de sinal de CD nesse comprimento de onda para nenhuma das proteínas. (C) Espectros de CD da proteína HspB1-WT a 15 µM foram medidos a cada 10 °C durante o aumento de temperatura de 20 a 90 °C. (D) Curvas de desenovelamento da HspB1-WT obtida pela detecção de sinal de CD a 217 e 208 nm. Esses resultados indicam que a proteína é estável até 60 °C, a partir da qual sua estrutura começa a se desestabilizar em estruturas desordenadas, sugerida pelo mínimo de sinal a 208 nm. (E) Predição teórica da tendência de desordem das proteínas HspB1-WT e HspB1-3D-GPG realizada através do programa IUPred (Dosztányi et al., 2005).

114

Para caracterização do tamanho dos oligômeros formados por HspB1-WT e pelos

mutantes funcionais foram feitas medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS). Os

valores de coeficiente de difusão obtidos foram convertidos em raio hidrodinâmico (Rh) e

depois em diâmetro, pelos quais se obteve a distribuição de tamanho de cada proteína

(Figura 27). As curvas indicam a presença de grandes moléculas em solução, com diâmetros

de 28, 38 e 33 nm para HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG, respectivamente. Além

disso, para HspB1-WT e HspB1-3D, os picos mais estreitos sugerem que as amostras são

monodispersas. No caso de HspB1-3D-GPG, o pico largo indica que a amostra é polidispersa,

provavelmente devido à presença de moléculas de diferentes tamanhos em solução, ou seja,

os oligômeros e dímeros observados pela GFA.

Figura 27: Caracterização do tamanho dos oligômeros de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG pelo diâmetro obtido por DLS. As proteínas HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG a 20 µM em tampão G foram utilizadas para medida de coeficiente de difusão em equipamento Zetasizer Nano (Malvern) a 25 °C usando cubeta de plástico de 1 cm. Foram realizadas 10 leituras de 60 s e a média da distribuição de coeficiente de difusão obtida dessas leituras foi convertida para distribuição de tamanho (diâmetro, em nm) pela equação de Stokes-Einstein. Observou-se que a proteína selvagem e os mutantes apresentam tamanhos similares, com diâmetro médio estimado de aproximadamente 35 nm (ou raio hidrodinâmico, Rh = ~17 nm).

115

2.4.3. Ensaio de agregação da luciferase

O primeiro ensaio realizado para caracterização funcional de HspB1-WT e dos

mutantes de fosforilação foi o de agregação de substrato, no caso luciferase. Para isso,

diferentes concentrações de HspB1-WT, HspB1-1D, HspB1-2D ou HspB1-3D foram incubadas

com luciferase a 37 °C. A agregação espontânea da luciferase, na ausência de HspB1, foi

monitorada como controle e BSA foi utilizada como controle negativo. Pode-se observar que

a proteína selvagem e o mutante simples (HspB1-1D) não foram eficazes na prevenção de

agregação, uma vez que houve aumento de espalhamento de luz em todas as concentrações

testadas (Figura 28A e B). No entanto, quando luciferase foi aquecida na presença de HspB1-

2D, na razão de 1:10, o espalhamento de luz medido foi reduzido para 70% (Figura 28C).

HspB1-3D foi mais eficiente, visto que concentrações crescentes dessa proteína resultaram

na diminuição do espalhamento de luz de luciferase, de forma que nas razões 1:2,5, 1:5 e

1:10 o espalhamento foi de 75, 55 e 45%, respectivamente, em relação ao controle (Figura

28D). Maiores concentrações de HspB1-3D testadas não mostraram maior efeito do que a

razão 1:10. Esses dados sugerem que as mutações que mimetizam a fosforilação da HspB1

foram capazes de torná-la ativa, capaz de interagir com o substrato agregado. Além disso,

quanto maior o número de resíduos fosforilados, mais a proteína se torna ativa, de modo

que HspB1-3D provavelmente pode interagir com regiões hidrofóbicas de luciferase

expostas pelo choque térmico. Esses resultados mostram ainda que a fosforilação é

importante para a ativação de HspB1, mas que esse processo é independente do estado

oligomérico da proteína, uma vez que HspB1-3D foi a mais ativa, mas ainda assim encontra-

se como oligômero em solução.

116

Figura 28: Ensaio in vitro de agregação da luciferase com HspB1-WT e os mutantes de fosforilação. Luciferase nativa a 2 µM foi incubada em Tampão G contendo 1 mM de DTT e diferentes concentrações de (A) HspB1-WT, (B) HspB1-1D, (C) HspB1-2D e (D) HspB1-3D a 37 °C por 60 min. Nos tempos 0, 5, 10, 15, 30 e 60 min, agregação da luciferase foi medida pelo espalhamento de luz detectado a 320 nm. A agregação espontânea da luciferase na ausência de HspB1 foi monitorada em cada caso como controle. (E) Representação comparativa da agregação da luciferase após 60 min na presença de diferentes concentrações de HspB1-WT, mutantes e BSA.

117

Para compreender melhor a relação entre HspB1 e o substrato durante

agregação induzida pelo choque térmico, o tamanho das moléculas formadas foi avaliado

por DLS usando luciferase agregada na ausência ou presença de HspB1-WT e dos mutantes

funcionais, na proporção de 1:10 (Figura 29). Pela distribuição de tamanho obtida em cada

caso, pode-se observar que luciferase nativa, encontrada como um monômero de cerca de

67 kDa, apresentou diâmetro de ~11 nm. Quando a mesma foi aquecida na ausência de

HspB1, os agregados formados são muito grandes, com diâmetro de cerca de 1600 nm,

tamanho muito próximo do obtido se a luciferase é aquecida na presença de HspB1-WT. No

entanto, quando há HspB1-3D durante o choque térmico, os agregados de luciferase

formados apresentaram tamanho de 150 nm. Esses resultados indicam que as moléculas

formadas ainda são grandes, maiores do que os grandes oligômeros de HspB1 (de ~35 nm,

Figura 29), mas bem menores que os agregados formados apenas por luciferase.

Esse tipo de experimento envolvendo espalhamento de luz é clássico para

caracterização da atividade de sHsps e é muitas vezes chamado de ensaio de atividade de

prevenção da agregação. No caso de luciferase e HspB1, observa-se que a sHsp não está

necessariamente prevenindo a agregação da luciferase, uma vez que o tamanho das

moléculas formadas após o choque térmico ainda é grande, mas é bem menor que na

agregação espontânea da luciferase, sugerindo que HspB1-3D está sendo responsável pela

formação de agregados diferentes daqueles formados em sua ausência.

118

Figura 29: Caracterização do tamanho dos agregados de luciferase formados com HspB1 pelo diâmetro obtido por DLS. Luciferase nativa a 2 µM foi incubada na ausência ou na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG em tampão G a 45 °C por 15 min. Os agregados foram utilizados para medida de coeficiente de difusão em equipamento Zetasizer Nano (Malvern) a 25 °C usando cubeta de plástico de 1 cm. Foram realizadas 10 leituras de 60 s e a média da distribuição de coeficiente de difusão obtida dessas leituras foi convertida para distribuição de tamanho (diâmetro, em nm) pela equação de Stokes-Einstein. É possível perceber que os agregados formados na ausência de HspB1 ou com HspB1-WT são muito grandes (diâmetro de ~1600 nm), enquanto os agregados formados na presença de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG são menores, com diâmetro de 41 e 148 nm, respectivamente.

2.4.4. Ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase

Uma vez que se observou que HspB1-3D é ativa e capaz de formar agregados

com a luciferase, o próximo passo foi investigar o seu papel na desagregação de substrato.

Nos ensaios de desagregação seguida de reenovelamento, agregados de luciferase foram

usados como substrato e foram gerados pelo aquecimento a 45 °C na ausência ou presença

de HspB1-WT e HspB1-3D. Em seguida, os co-agregados foram incubados na presença de

diferentes combinações de chaperonas moleculares, incluindo Hsp70, Hsp110 e duas Hsp40

das classes A e B (DJA2 e DJB1) e atividade da luciferase foi medida para avaliar a

desagregação do substrato. É importante enfatizar que para que a atividade de luciferase

seja medida é necessário que a luciferase tenha sida desagregada e em seguida reenovelada,

atingindo sua conformação nativa para ter atividade. Como a maquinaria da Hsp70 é

119

responsável por ambos os processos, esse método analisa desagregação e reenovelamento

intrinsicamente relacionados.

Para efeito de comparação com os resultados do ensaio de desagregação

seguido de reenovelamento, também foram realizados ensaios de reenovelamento da

luciferase. Os dois são ensaios muito similares e a diferença está no tipo de luciferase

fornecida como substrato para as chaperonas. Enquanto no ensaio de desagregação seguida

de reenovelamento, a luciferase foi agregada por aumento temperatura; no ensaio de

reenovelamento, a luciferase foi apenas desenovelada em solução contendo 6 M de cloreto

de guanidina. Dessa forma, em um ensaio são utilizados agregados proteicos e no outro são

utilizadas proteínas desenoveladas como substrato. Em ambos, a regeneração da atividade

da luciferase é monitorada para avaliar o reenovelamento ou a desagregação seguida de

reenovelamento.

Quando luciferase foi agregada na presença de HspB1-WT, as chaperonas não

foram capazes de desagregar e reativar mais do que 5% do substrato, independente da

combinação (Figuras 30A). O mesmo foi observado para quando luciferase foi agregada na

ausência de proteínas e também na presença de BSA (Figura 30C). No entanto, o triplo

mutante de fosforilação, HspB1-3D parece desempenhar um papel importante no processo

de desagregação, uma vez que foi observada reativação da luciferase quando estas proteínas

foram co-agregadas durante o choque térmico.

Em termos dos requisitos de chaperonas necessários para que a desagregação

ocorra, observou-se que a presença de Hsp70 foi absolutamente necessária. Quando Hsp70,

Hsp110 e ambas as Hsp40 (DJA2 e DJB1) estavam presentes foi obtido o máximo de

reativação da luciferase (~25%). O NEF Hsp110 mostrou-se fundamental para o processo,

visto que nas condições em que estava ausente a reativação da luciferase não foi maior que

7%. As co-chaperonas também são requisitos essenciais, na sua ausência apenas 1% da

luciferase foi reativada. Quando DJA2 e DJB1 foram usadas separadamente, obteve-se

reativação de 15% e 9% da luciferase, respectivamente, sendo que a máxima reativação de

25% foi observada quando ambas estavam presentes ao mesmo tempo, sugerindo que os

tipos A e B de Hsp40 devem apresentar funções diferentes e complementares nos agregados

(Figura 30C).

120

O ensaio de reenovelamento foi realizado por duas razões importantes (Figura

30D). Primeiro porque a atividade máxima de luciferase reativada nesse ensaio foi usada

como 100% no ensaio de desagregação, representando o total de atividade de luciferase

nativa reenovelável. Esse total, obtido na presença de Hsp70 e DJA2, foi muito próximo

(96%) da atividade medida da luciferase nativa, aquela que não sofreu agregação ou

desenovelamento, na mesma concentração. Além disso, é interessante comparar a diferença

dos requisitos de chaperonas necessários para o processo de desagregação e de

reenovelamento (Figura 30D). Para o reenovelamento, a presença de apenas uma Hsp40 foi

essencial, a DJA2 da classe A, visto que o máximo de reativação foi obtido na presença de

Hsp70 e DJA2 (96%); a adição de Hsp110 não influenciou significativamente no

reenovelamento alcançado (92%). Mais que isso, DJB1 parece inibir o reenovelamento da

luciferase, porque quando DJA2 e DJB1 são adicionados na reação ao mesmo tempo, a

reativação foi inferior a DJA2 sozinha (53%). A presença de Hsp110 novamente não se

mostrou muito eficiente, sendo 92% com DJA2, comparado com 40% se DJB1 estava

presente e 63% se ambas Hsp40 foram adicionadas.

Outro aspecto que merece ser considerado é o tempo necessário para atingir a

máxima reativação de luciferase nos dois processos. Enquanto a desagregação leva de 2 a 3

h para acontecer, o reenovelamento mostrou máxima reativação entre 30 e 60 min de

reação, depois dos quais a atividade de luciferase começa a diminuir.

121

Figura 30: Ensaio in vitro de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase com HspB1-WT e HspB1-3D. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na presença de (A) HspB1-WT ou (B) HspB1-3D. A ausência de HspB1 e a presença de BSA foram usadas como controle negativo. Em seguida, luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. A concentração final de proteína nas reações foi: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1, 2 µM de Hsp70, 0,5 µM Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (C) Representação comparativa da regeneração da atividade da luciferase após 180 min quando a mesma foi agregada na ausência (controle) ou presença de HspB1-WT, HspB1-3D ou BSA. (D) Ensaio de reenovelamento da luciferase na presença das chaperonas indicadas. Luciferase nativa a 2 µM foi desnaturada em Tampão G contendo 6 M de cloreto de guanidina e 1 mM de DTT por 10 min em temperatura ambiente. A luciferase desnaturada foi diluída 1:100 em reações de reenovelamento contendo 1 mM de ATP e o mix das chaperonas indicadas. As reações foram incubadas a 30 °C por 60 min, durante os quais a atividade da luciferase foi medida. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).

A concentração final de chaperonas presente nos experimentos mostrados acima

foram de 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. Estas

concentrações foram otimizadas através da titulação de cada chaperona individualmente

(Figura 31), com exceção de Hsp70 e Hsp110 que foram tituladas juntas mantendo sempre a

122

razão de 4:1, visto que esta é a razão ótima já observada em experimentos de

reenovelamento (Tzankov et al., 2008). Pode-se observar que na titulação de Hsp70 e

Hsp110 (Figura 31A) atinge-se um platô de reativação da luciferase nas concentrações de 2 e

0,5 µM, respectivamente, sendo que as concentrações de 4 e 1 µM foram apenas

ligeiramente superiores. Para DJA2 (Figura 31B), o máximo de reativação foi atingido na

concentração de 2 µM, concentrações maiores ou menores foram menos eficientes nos

processos de desagregação e reenovelamento. E por fim, a titulação de DJB1 (Figura 31C)

revelou que as concentrações de 0,5 e 1 µM foram as mais eficientes, ligeiramente superior

para 1 µM da co-chaperona.

Figura 31: Titulação das chaperonas no ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT e 20 µM de HspB1-3D. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. (A) Hsp70 e Hsp110 foram tituladas mantendo uma razão de 4:1 (Hsp70:Hsp110). A concentração final de DJA2 e DJB1 foi de 2 e 1 µM, respectivamente. (B) Titulação de DJA2. A concentração final das chaperonas foi: 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110 e 1 µM de DJB1. (C) Titulação de DJB1. A concentração final das chaperonas foi: 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110 e 2 µM de DJA2. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).

123

A desagregação seguida de reenovelamento da luciferase também foi realizada

utilizando outra isoforma abundante de Hsp70 e outro tipo de NEF. Hsp70 (HSPA1A/B) é

expressa durante condições celulares normais, mas é regulada para aumentar sua expressão

sob condições de estresse, enquanto Hsc70 (HSPA8) é constitutivamente expressa (Gething

e Sambrook, 1992). Quando Hsp70 e Hsc70 foram utilizadas (juntamente com Hsp110, DJA2

e DJB1) nas reações de desagregação de agregados formados com HspB1-3D (Figura 32A),

Hsp70 foi capaz de reativar ~25% da luciferase e Hsc70 apenas 10%. Além disso, para Hsc70

a combinação de DJA2 e DJB1 não se mostrou mais eficiente do que quando as co-

chaperonas foram usadas separadamente, visto que a reativação de luciferase foi a mesma

(~10%) quando apenas DJA2 ou ambas estavam presentes na reação. Quando apenas DJB1

foi adicionada a reativação foi de cerca de 3%.

Outra família abundante de NEF no citosol de células humanas são as proteínas

Bag (Bag1 a Bag5). Elas não são estruturalmente relacionadas com Hsp110 ou Hsp70 e não

podem ligar substratos diretamente, visto que apresentam um domínio conservado BAG que

interage com NBD de Hsp70 e os outros domínios são bastante variáveis entre as proteínas

da família. Bag1 é a proteína mais estudada e possui um domínio ubiquitin-like e o domíno

BAG na região C-terminal. Assim como Hsp110, Bag1 promove o enovelamento de substrato

pela ação de troca de nucleotídeo na Hsp70, numa razão ótima de 1:1 (Tzankov et al., 2008).

Além da proteína Bag1 completa, também foi utilizado o domínio Bag isolado (C-

Bag1) no ensaio de desagregação seguido de reenovelamento com HspB1-3D, Hsp70 e as

Hsp40, a razão 1:1 com Hsp70 foi mantida (Figura 32B). Observou-se nos experimentos que

na presença de Hsp70, Bag1, DJA2 e DJB1 a reativação da luciferase foi de aproximadamente

15%, sendo menos eficiente se comparada com Hsp110 (~25%). No entanto, na presença de

do domínio C-Bag1 nas mesmas condições cerca de 20% da luciferase foi reativada. Como

observado anteriormente, nas condições sem Hsp40 ou quando DJA2 e DJB1 foram usadas

separadamente, a reativação da luciferase não é mais eficiente.

124

Figura 32: O efeito de Hsc70 e outros NEFs no ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT e 20 µM de HspB1-3D. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. (A) Representação comparação da atividade de desagregação da luciferase obtida para Hsp70 e Hsc70 após 180 min. A concentração final de chaperonas foi 2 µM de Hsp70 ou Hsc70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (B) O efeito de Hsp110, Bag1 e C-Bag1 na desagregação seguida de reenovelamento da luciferase após 180 min. A concentração final de chaperonas foi 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110 ou 2 µM de Bag1 ou 2 µM de C-Bag1, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).

2.4.5. O mutante de dissociação do oligômero HspB1-3D-GPG

Uma vez que se observou que HspB1 fosforilada (HspB1-3D) é um oligômero

ativo e desempenha um papel importante na formação de agregados capazes de serem

ressolubilizados e reenovelados pelas chaperonas, o mutante HspB1-3D-GPG também foi

utilizado nos experimentos. Essa mutação perturba o motivo IPV presente na região C-

terminal que é responsável pela oligomerização de HspB1. Como foi mostrado pela

cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 25) cerca de 20% das moléculas foram

eluídas em volume diferente do volume morto do oligômero, pelo menos logo após a

purificação. Assim como realizado com HspB1-WT e os mutantes de fosforilação, o primeiro

ensaio realizado com HspB1-3D-GPG foi o de agregação térmica da luciferase (Figura 33A).

Pode-se observar que esse mutante foi mais eficiente do que os demais na prevenção de

aumento do espalhamento de luz da luciferase (Figura 33B), sendo que um mínimo de 20%

125

do espalhamento foi observado nas razões de 1:10 de luciferase para HspB1-3D-GPG,

seguido de 23, 26 e 55% nas razões 1:5, 1:2,5 e 1:1, respectivamente.

O experimento de DLS realizado para determinar o tamanho dos agregados

formados na presença de HspB1-WT e dos mutantes funcionais mostrou que os agregados

formados na presença de HspB1-3D-GPG foram os menos, apresentando Rh de 41 nm (Figura

29).

Figura 33: Ensaio in vitro de agregação térmica da luciferase usando HspB1-3D-GPG. Luciferase nativa a 2 µM foi incubada em Tampão G contendo 1 mM de DTT e diferentes concentrações de (A) HspB1-3D-GPG a 37 °C por 60 min. Nos tempos 0, 5, 10, 15, 30 e 60 min, agregação da luciferase foi medida pelo espalhamento de luz detectado a 320 nm. A agregação espontânea da luciferase na ausência de HspB1 foi monitorada como controle. (B) Representação comparativa da agregação da luciferase após 60 min na presença de diferentes concentrações de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG. Pode-se observar que HspB1-3D-GPG foi mais eficiente que a proteína selvagem e que os outros mutantes na co-agregação com o substrato, reduzindo para 20% o espalhamento de luz da luciferase na proporção 1:10.

A desagregação seguida de reenovelamento da luciferase também foi mais

eficiente quando os agregados foram formados na presença de HspB1-3D-GPG (35%)

quando comparado com HspB1-3D (25%), se Hsp70, Hsp110, DJA2 e DJB1 estavam presentes

na reação (Figura 34A e C). Os requisitos de chaperonas foram muito similares, sendo que

Hsp70, Hsp40 e Hsp110 foram essenciais. Apesar da presença de ambas Hsp40 também

tenha resultado na melhor condição de reativação, é interessante apontar que os agregados

gerados na presença de HspB1-3D-GPG foram mais reativados quando DJB1 (26%) estava

presente separadamente, se comparado com DJA2 (20%), diferentemente do que foi

observado para os agregados com HspB1-3D.

126

Figura 34: Ensaio in vitro de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase com HspB1-3D-GPG. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT e (A) 20 µM de HspB1-3D-GPG. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. A concentração final de proteína nas reações foi: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1, 2 µM de Hsp70, 0,5 µM Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (B) Titulação de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG durante agregação da luciferase. O experimento foi realizado conforme descrito acima, mas luciferase nativa foi agregada na presença de diferentes concentrações de HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG. As concentrações finais das chaperonas foram: 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (C) Representação comparativa da regeneração da atividade da luciferase após 180 min quando a mesma foi agregada na ausência (controle) ou presença de HspB1-WT, HspB1-3D, HspB1-3D-GPG ou BSA. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%). As barras correspondentes à agregação da luciferase sozinha (controle), ou luciferase agregada na presença de BSA, HspB1-WT e HspB1-3D foram repetidas da Figura 30C para facilitar a comparação dos resultados.

127

A filtração em gel analítica mostrou que HspB1-3D-GPG apresenta dois estados

em solução, grandes oligômeros e dímeros, e os resultados acima mostram que os

agregados formados com este mutante foram mais eficientemente reativados que aqueles

formados com HspB1-3D. Por isso, a próxima questão que surge desses resultados é se os

dímeros de HspB1 seriam a forma mais ativa desta proteína. Para responder esta questão,

HspB1-3D-GPG altamente concentrada foi aplicada em coluna de cromatografia de exclusão

por tamanho para que os oligômeros e dímeros fossem isolados (Figura 35A). Como

esperado, os dois picos que correspondem a esses estados oligoméricos foram observados, a

maior parte sendo eluída no volume morto (oligômeros) e o restante eluindo em cerca de 14

mL (dímeros). As frações de cada pico foram concentradas para o volume original e, após

incubação de 3 h no gelo, foram reaplicadas na mesma coluna individualmente. As

cromatografias realizadas com as formas isoladas fornecem informação sobre se os

oligômeros e dímeros podem ser isolados ou se as formas estão em equilíbrio, deslocando-o

para um ou outro estado dependendo de sua quantidade em solução. A cromatografia dos

oligômeros isolados mostrou que uma pequena parte das moléculas permanece podendo se

dissociar em dímeros, uma vez que um pequeno pico eluído em 14 mL foi observado. Em

contraste, os dímeros não foram capazes de se reorganizar em oligômeros, permanecendo

neste estado após seu isolamento pela primeira cromatografia.

O dicroísmo circular realizado com oligômeros e dímeros isolados adicionou

informações interessantes relacionadas com a conformação dessas moléculas (Figura 35B).

O espectro de HspB1-3D-GPG mostrado na Figura 26A apresenta mínimo em 217 nm,

indicando a composição rica em folhas-β assim como HspB1-WT e HspB1-3D, mas também

um vale de sinal positivo em torno de 230 nm, sugerindo composição de estruturas

desordenadas. Os oligômeros isolados de HspB1-3D-GPG apresentam espectro de CD muito

similar ao visto para HspB1-WT e HspB1-3D sem o vale de sinal positivo em 230 nm; este

padrão foi observado apenas nos dímeros isolados, sugerindo que os dímeros apresentam

domínios desordenados que provavelmente se organizam durante a oligomerização.

Funcionalmente, o ensaio de desagregação seguido de reenovelamento (Figura

35C e D) mostrou que os agregados formados com os oligômeros foram reativados tão

eficientemente (37%) quanto aqueles formados com HspB1-3D-GPG total (35%) na presença

128

de Hsp70, Hsp110, DJA2 e DJB1. Por outro lado, quando luciferase foi agregada na presença

dos dímeros apenas 13% de reativação foi observada na melhor condição.

Figura 35: Caracterização conformacional e funcional de oligômeros e dímeros isolados de HspB1-3D-GPG. (A) 500 µL de HspB1-3D-GPG a 500 µM foram aplicados em coluna de filtração em gel analítica Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrados com Tampão G. Frações dos picos 1 e 2 foram coletadas e concentradas separadamente para o volume de 500 µL. Após incubação de 3 h no gelo, as amostras isoladas dos picos 1 e 2 foram reaplicadas na mesma coluna de separação a fim de verificar se oligômeros e dímeros encontravam-se em equilíbrio em solução. (B) Espectros de CD da proteína HspB1-3D-GPG total e dos oligômeros e dímeros isolados foram medidos usando 10 µM de proteína em cubeta de quartzo de 1mm. Os sinais obtidos em mdeg foram convertidos para elipcidade molar [θ] e estão representadas como uma média de 16 espectros para cada proteína. (C) Ensaio in vitro de desagregação seguida de reenovelamento da luciferase. Os experimentos foram realizados como descrito anteriormente, mas luciferase nativa foi agregada na presença de 20 µM de HspB1-3D-GPG total ou 20 µM de oligômeros (pico 1) ou dímeros (pico 2) isolados. A concentração final de proteínas nas reações foi: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1_3D_GPG, 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (D) Representação comparativa da regeneração da atividade da luciferase após 180 min quando a mesma foi agregada na presença de HspB1-3D-GPG total ou oligômeros (pico 1) e dímeros (pico 2) isolados. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).

129

2.4.6. Ensaio de desagregação da luciferase

Nos experimentos mostrados até aqui, a desagregação da luciferase foi

observada pela medida de sua atividade, o que implica que desagregação e reenovelamento

deveriam necessariamente estar ocorrendo nas reações. A fim de mensurar a atividade de

desagregação desvinculada da atividade de reenovelamento, o ensaio de desagregação foi

modificado de forma que a retirada de luciferase dos agregados pelas chaperonas fosse

detectada sem a necessidade da mesma readquirir sua forma nativa. É interessante

investigar a desagregação mais diretamente porque mais luciferase poderia estar sendo

desagregada do que reenovelada, então a medida de atividade da luciferase poderia não

representar a verdadeira desagregação de substrato. Sendo assim, as reações de

desagregação foram preparadas da mesma forma, mas em vez de medir a atividade de

luciferase ao longo de 180 min, elas foram analisadas por cromatografia de exclusão por

tamanho e Western Blotting, nos tempos 0 e 3 h. A ideia por traz desta metodologia é que os

agregados de luciferase e HspB1 formados no choque térmico no início da reação são

grandes e eluídos no volume morto da coluna. Quando a desagregação é promovida pelas

chaperonas após 3 h de reação, moléculas monoméricas de luciferase são removidas destes

agregados e seriam então eluídas em volume de eluição que corresponderia a 67 kDa.

Estes experimentos foram realizados na presença (Figura 36) e na ausência

(Figura 37) das chaperonas moleculares. A luciferase nativa foi eluída como monômero nas

frações entre 12 e 14 mL, enquanto os agregados formados e utilizados no início da reação

foram eluídos no volume morto da coluna (entre 7 e 8 mL), independente do tipo de HspB1

usada na co-agregação com luciferase, como esperado.

Quando luciferase foi agregada na presença de HspB1-WT, sua detecção foi de

4% relativa ao total de proteína aplicada na cromatografia de filtração em gel. A baixa

detecção pode ser resultado da perda de proteína ocasionada porque mais etapas

experimentais foram adicionadas para detecção da desagregação, como filtração em gel,

precipitação das proteínas das frações coletadas e Western Blotting. Especialmente grandes

agregados podem ser resistentes ao SDS ou ficarem acumulados no filtro das colunas

cromatográficas, não sendo assim detectados pelo Western Blotting. Diferentemente, a

detecção de luciferase foi de cerca de 50% do total aplicado quando agregada na presença

de HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG, sugerindo, como já foi observado, que os agregados

130

formados com estas sHsps são menores e diferentes dos formados espontaneamente ou

com HspB1-WT.

Neste contexto, ~15% da luciferase foi observada eluída como monômero (12 a

14 mL) após 3 h de reação quando agregada com HspB1-3D-GPG e na presença de

chaperonas. Nestas condições, se a agregação ocorreu com HspB1-3D, cerca de 7% da

luciferase foi desagregada e menos de 1% quando HspB1-WT foi utilizada (Figura 36A e B).

Quando esses experimentos foram realizados na ausência de chaperonas como controle,

luciferase foi eluída no volume morto independente da HspB1 usada durante a agregação

(Figura 37). Esses resultados indicam que o processo de desagregação é realmente

dependente de chaperonas e que os mutantes HspB1-3D e HspB1-3D-GPG são necessários

na co-agregação com luciferase para que os agregados formados possam ser

ressolubilizados.

131

Figura 36: Ensaio in vitro de desagregação da luciferase detectada por Western Blotting na presença de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG. (A) Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas (2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1) e incubada a 30 °C. Nos tempos 0 e 3 h as reações foram aplicadas em coluna de filtração em gel analítica Superose 12 10/300 GL. Frações de 1 mL foram coletadas do volume morto até 18 mL de volume de eluição e cada fração teve suas proteínas precipitadas usando BCA. As amostras foram então aplicadas em SDS-PAGE 12% e o conteúdo de luciferase e HspB1 de cada fração foi detectado por Western Blotting usando anticorpos específicos. A quantidade total de proteína antes da cromatografia de filtração em gel foi aplicada no SDS-PAGE diluída 1:10. Quantificação da intensidade das bandas para (B) luciferase e (C) HspB1 foi realizada, a banda da quantidade total de proteína (T) multiplicada por 10 foi considerada como 100%.

132

Além da detecção do substrato luciferase, a detecção de HspB1 também revelou

informações interessantes sobre o papel dessa sHsp na desagregação. Na presença de

chaperonas (Figura 36A e C) observou-se que HspB1-WT foi eluída no volume morto nos

tempos 0 e 3 h. HspB1-3D também foi eluída no volume morto no início da reação, como já

observado, mas curiosamente cerca de 5% foi observada entre 12 e 14 mL de eluição após 3

h de reação, indicando que este mutante foi dissociado em dímeros. Já HspB1-3D-GPG,

como esperado para o tempo 0 h, teve cerca de 20% detectada como dímero e o restante

como oligômero, porém, após 3 h de reação a porcentagem de dímeros detectada

aumentou para 45%.

Em contraste, nos experimentos na ausência de chaperonas (Figura 37A e C),

HspB1-3D não foi observada eluindo como dímero e HspB1-3D-GPG aumentou a quantidade

de dímeros de 25 para 30% apenas. Esses resultados sugerem que os oligômeros de HspB1

são necessários para desagregação, mas que após o processo ocorrer monômeros de

luciferase e dímeros de HspB1 são liberados como produtos; os dímeros liberados são então

reorganizados em oligômeros a menos que o motivo IPV tenha sido perturbado. Além disso,

chaperonas são essenciais para que a desagregação de substrato e a dissociação dos

oligômeros aconteçam.

Para determinar se a ligação de HspB1 ao substrato ou às chaperonas é

importante para dissociação dos oligômeros em dímeros, o mesmo ensaio mostrado acima

foi realizado na ausência de luciferase e a eluição de HspB1 foi detectada na presença

(Figura 38A e B) e ausência (Figura 38C e D) das chaperonas moleculares. Observou-se que

HspB1-WT foi majoritariamente eluída no volume morto na presença ou ausência de

chaperonas. Quando chaperonas estavam presentes nas reações, 6% da HspB1-3D foi

detectada como dímeros após 3 h de reação. Para HspB1-3D-GPG, a porcentagem de

dímeros aumentou entre o início até 3 h de reação, de 25% para 48% na presença de

chaperonas comparado com 15% para 30% na ausência delas. Esses dados sugerem que a

presença de chaperonas e não do substrato apresenta um papel importante na liberação de

HspB1 como dímeros em solução.

133

Figura 37: Ensaio in vitro de desagregação da luciferase detectada por Western Blotting na ausência de chaperonas. (A) Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo apenas 2 mM de ATP e incubada a 30 °C. Nos tempos 0 e 3 h as reações foram aplicadas em coluna de filtração em gel analítica Superose 12 10/300 GL. Frações de 1 mL foram coletadas do volume morto até 18 mL de volume de eluição e cada fração teve suas proteínas precipitadas usando BCA. As amostras foram então aplicadas em SDS-PAGE 12% e o conteúdo de luciferase e HspB1 de cada fração foi detectado por Western Blotting usando anticorpos específicos. A quantidade total de proteína antes da cromatografia de filtração em gel foi aplicada no SDS-PAGE diluída 1:10. Quantificação da intensidade das bandas para (B) luciferase e (C) HspB1 foi realizada e a banda da quantidade total de proteína (T) multiplicada por 10 foi considerada como 100%.

134

Figura 38: Eluição de HspB1-Wt, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG após choque térmico na ausência e presença de chaperonas. As proteínas a 20 µM foram incubadas a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT. Após o choque térmico, as amostras foram diluídas 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e incubadas na (C) ausência ou (A) presença de 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1 a 30 °C. Nos tempos 0 e 3 h as reações foram aplicadas em coluna de filtração em gel analítica Superose 12 10/300 GL. Frações de 1 mL foram coletadas do volume morto até 18 mL de volume de eluição e cada fração teve suas proteínas precipitadas usando BCA. As amostras foram então aplicadas em SDS-PAGE 12% e o conteúdo de HspB1 de cada fração foi detectado por Western Blotting usando anticorpo específico. A quantidade total de proteína antes da cromatografia de filtração em gel foi aplicada no SDS-PAGE diluída 1:10. Quantificação da intensidade das bandas na (B) presença (D) ausência de chaperonas foi realizada e a intensidade obtida da banda da quantidade total de proteína (T) multiplicada por 10 foi considerada como 100%.

135

2.5. Discussão

2.5.1. Caracterização conformacional de HspB1-WT e dos mutantes funcionais

As small Heat shock proteins (sHsps) são chaperonas extremamente importantes

para as células em condições estressantes, cuja principal função é a prevenção de agregação

de polipeptídeos mal enovelados gerados nessas condições (Haslbeck e Vierling, 2015).

Recentemente, também foi relatada a possível participação dessas chaperonas (Hsp26 de

levedura) no processo de desagregação em organismos unicelulares e multicelulares

(Rampelt et al., 2012; Nillegoda et al., 2015). Uma vez que nenhuma sHsp humana foi

caracterizada nesse sentido, neste trabalho utilizamos uma abordagem in vitro para

demostrar que HspB1 está ativa na sua forma fosforilada e, assim, está envolvida no

processo de desagregação de substratos em conjunto com a maquinaria da Hsp70 humana.

Para isso, a sequencia que codifica HspB1 selvagem foi clonada em vetor de

expressão e então utilizado para construção de mutantes (HspB1-3D) que mimetizam a

fosforilação em resíduos específicos de serinas (S15, S78 e S82). Esses resíduos foram

identificados em trabalhos anteriores através de experimentos in vivo pela fosforilação

causada pelas kinases MAPKAPK-2 e MAPKAPK-3 (Arrigo, 2011). Além da fosforilação, outra

característica importante para o estudo de HspB1 é sua associação em grandes oligômeros,

devido à presença do motivo IPV (Delbecq et al., 2012) e por este motivo, também foi

construído o mutante HspB1-3D-GPG de desestabilização dos oligômeros.

Após a purificação de HspB1-WT e desses mutantes funcionais, algumas técnicas

foram utilizadas para verificação dessas características conformacionais já descritas

anteriormente na literatura. A associação de HspB1 em oligômeros foi verificada através dos

experimentos de cromatografia de filtração em gel, nos quais as proteínas HspB1-WT e

HspB1-3D foram eluídas no volume morto da coluna, indicando a eluição de moléculas de

alta massa molecular. De fato, estudos demonstram que os oligômeros de HspB1 podem

atingir até 1 MDa (Rogalla et al., 1999; Mymrikov et al., 2016). A eluição das HspB1 no

volume morto da cromatografia provavelmente sugere que as proteínas são grandes

oligômeros, mas também há possibilidade de serem apenas agregados em solução. Esses

agregados poderiam ser formados durante a expressão heteróloga e purificação etambem

seriam eluidos no volume morto, devido ao seu grande tamanho.

136

A fim de abordar essa questão, a técnica de DLS foi utilizada para estimar o

tamanho das partículas de HspB1-WT e dos mutantes em solução. Devido ao grande

tamanho dos oligômeros e à estrutura desordenada das regiões NTD e CTD, existe uma

dificuldade técnica do estudo estrutural de sHsps humanas que explica a pouca informação

sobre a conformação de HspB1 encontrada na literatura. Os diâmetros obtidos para as

proteínas foram semelhantes entre si, variando entre 30 e 35 nm (Rh de 15 a 17 nm),

tamanho que pode ser considerado grande para a maioria das proteínas. Apesar de

apresentarem diversos tamanhos e estruturas, a grande maioria das proteínas possui massa

molecular entre 20 e 300 kDa, com Rh entre 3 e 10 nm; a proteína BSA, por exemplo, tem 66

kDa e Rh de 3,5 nm (Axelsson, 1978). Assim, em comparação com outras proteinas, as HspB1

purificadas se mostraram bastante grandes, mas não atingem tamanhos tão grandes quanto

agregados proteicos podem apresentar. A medida do tamanho de agregados de luciferase,

por exemplo, resultou em Rh de aproximadamente 1600 nm. Dessa forma, confirmamos que

as HspB1 não foram purificadas como agregados, mas sim como grandes oligômeros cujo

tamanho se assemelha ao de pequenas organelas, como ribossomos eucarióticos, por

exemplo, que tem diâmetro de 25 a 30 nm (Wilson e Doudna Cate, 2012).

Para o mutante HspB1-3D-GPG foram observados oligômeros, mas a

cromatografia de filtração em gel da HspB1-3D-GPG indicou também que esse mutante é

capaz de dissociar cerca de 20% das moléculas em dímeros. Apesar de ser bem estabelecido

que HspB1 sofre oligomerização e que pode se dissociar, o mecanismo de regulação

envolvido nesse processo e a função fisiológica desses estados oligoméricos ainda não são

completamente conhecidos. Alguns resultados sugerem que os oligômeros correspondem à

forma inativa da proteína e que a dissociação em dímeros, estimulada pela fosforilação, é

importante para ativação de HspB1. No entanto, a caracterização in vitro da atividade

chaperona de sHsps humanas é bastante controversa; alguns grupos foram capazes de

observar a atividade de prevenção de agregação com sHsps selvagens usando diferentes

substratos (Mymrikov et al., 2016), enquanto outros autores concluíram que as proteínas

selvagens são oligoméricas e não funcionais, necessitando de algum tipo de ativação

(Jovcevski et al., 2015). Em nossos experimentos verificamos que o mutante HspB1-3D, que

mimetiza a fosforilação, não foi capaz de se dissociar em dímeros, o que indica que a

fosforilação é importante para ativação da proteína, mas não necessariamente que isso

137

depende da formação de dímeros. Alguns indícios ainda sugerem que o aumento da

temperatura resulta no deslocamento do equilíbrio de oligômeros para dímeros (Stengel et

al., 2010), no entanto, isso não foi observado em nossos experimentos de cromatografia de

filtração em gel.

A fim de obter mais informações sobre a estrutura dessas proteínas, espectros

de dicroísmo circular foram medidos para HspB1-WT e para os mutantes. Eles revelaram que

apesar da alta massa molecular, as proteínas foram purificadas enoveladas, o que também

corrobora a presença de oligômeros em solução, em vez de grandes agregados amorfos

como poderia-se imaginar a princípio. Os espectros de CD mostram que HspB1-WT e os

mutantes apresentam composição de estrutura secundária rica em folhas-β, condizendo

com a estrutura conhecida do domínio α-cristalino (ACD) conservado nesta família de

chaperonas (Baranova et al., 2009; Baranova et al., 2011). Nos espectros do mutante HspB1-

3D-GPG, além das folhas-β, também foi possível detectar a contribuição de estruturas

desordenadas na proteína, pela presença de uma banda positiva a 230 nm. A estrutura das

regiões do NTD e CTD não é conhecida, mas predições indicam que esses domínios são

flexíveis e desordenados (Sudnitsyna et al., 2012), então, possivelmente eles estão

contribuindo no espectro de HspB1-3D-GPG. Quando espectros dos oligômeros e dímeros

isolados foram obtidos, percebeu-se que nos dímeros ainda é possível detectar a

contribuição de estrutura desordenada, enquanto nos oligômeros o espectro é semelhante

aos das HspB1-WT e HspB1-3D. Isso pode fornecer informações sobre a importância da

oligomerização na estabilidade conformacional dessa chaperona. Esses resultados sugerem

que a interação dos motivos IPV de duas moléculas de HspB1 pode tornar a região C-

terminal mais estruturada, o que não acontece nos dímeros, nos quais essa região está solta.

Essa hipótese foi reforçada pela nossa análise de tendência de desordem, que estimou

grande tendência de estruturas desordenadas, principalmente para região C-terminal, para

HspB1-WT e HspB1-3D, mas que é ainda maior no mutante HspB1-3D-GPG.

As proteínas HspB1 foram produzidas com intenção de caracterizar seu papel em

ensaios de agregação induzida por temperatura, então é interessante obter informações

sobre sua estabilidade térmica através da medida de curvas de desenovelamento térmico

por CD. Nas curvas obtidas para HspB1-WT e os mutantes funcionais, monitoradas a 217 nm,

não foi observada perda de estrutura secundária mesmo quando as temperaturas atingiram

138

90 °C, o que poderia indicar que essas proteínas permanecem estáveis até essa temperatura.

No entanto, quando o sinal de CD de HspB1-WT foi monitorado a 217 e 208 nm verificou-se

que essas proteínas permanecem estáveis até 65 °C e que perdem sua estrutura de folhas-β

em temperaturas superiores. Apesar disso, os espectros obtidos ao longo do aumento de

temperatura, mostraram que HspB1-WT não desenovela completamente mesmo a 90 °C, em

vez disso torna-se rica em estruturas desordenadas, com mínimo de sinal próximo de 200

nm. Não foi observada agregação das amostras durante o processo e as proteínas

readquirem a conformação inicial após o resfriamento. Esses resultados indicam que essas

proteínas são bastante estáveis à variação de temperatura e permitiram que as proteínas

fossem utilizadas nos ensaios de agregação de luciferase realizados a 37 e 45 °C.

2.5.2. O papel de HspB1 de co-agregar com substrato e possibilitar sua desagregação

Os primeiros experimentos para investigar a função de HspB1-WT e dos

mutantes foram os ensaios de agregação com luciferase a 37 °C. Os resultados indicam que

os mutantes de fosforilação duplos e triplos de HspB1 apresentam atividade de co-

agregação com substrato. A razão 1:10 entre luciferase e os mutantes de HspB1 foi a mais

eficiente, diminuindo em 30, 60 e 80% o espalhamento de luz da luciferase na presença de

HspB1-2D, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG, quando comparados com o controle na ausência de

HspB1. Este ensaio é clássico para caracterização de sHsps e normalmente é denominado

ensaio de prevenção de agregação do substrato. Nesse caso, as sHsps interagiriam com o

substrato e impediriam o colapso hidrofóbico, protegendo a formação de agregados. Nossos

resultados sugerem que em vez de prevenir a agregação, HspB1 co-agrega com o substrato e

o prepara para desagregação pelo sistema da Hsp70.

Dessa maneira, a diminuição de espalhamento de luz da luciferase observada no

ensaio de agregação seria reflexo da formação de co-agregados menores formados por

luciferase e HspB1. Essa hipótese foi corroborada tanto nos ensaios de desagregação quanto

nos experimentos de DLS. Por DLS, foi determinado o tamanho das partículas formadas por

luciferase após choque térmico de 45 °C na ausência e na presença de HspB1-WT e dos

mutantes funcionais. No estado nativo, a luciferase apresentou diâmetro de 11 nm e,

quando exposta ao choque térmico, formou agregados de cerca de 1600 nm. No entanto,

quando luciferase foi agregada na presença de HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG, as moléculas

formadas foram de 148 e 41 nm respectivamente, o que sugere que não houve prevenção

139

de agregação da luciferase, mas sim formação de co-agregados ainda bastante grandes se

comparados com o tamanho da luciferase nativa. A atividade de formação de co-agregados

com o substrato também já foi relatada recentemente para as sHsps diméricas de bactérias,

IbpA e IbpB, e de levedura, Hsp26 e Hsp42 (Ungelenk et al., 2016; Żwirowski et al., 2017).

Ainda sobre o ensaio de co-agregação com a luciferase, é interessante o fato de

que o mutante HspB1-3D-GPG é o mais eficiente nesse processo. Esse mutante foi o único

capaz de formar dímeros em solução, o que pode sugerir que a mudança de estado

oligomérico está relacionada com a ativação de HspB1, mas não é estritamente necessária

para que isso ocorra, visto que o mutante oligomérico HspB1-3D também se mostrou

funcional na co-agregação com luciferase. Esses resultados indicam que os processo de

fosforilação e dissociação podem estar ocorrendo em mecanismos complexos para

regulação funcional de HspB1. Reitera-se, no entanto, que a fosforilação dessa proteína não

está estimulando necessariamente a dimerização para regular sua ativação funcional, como

discutido na literatura (Rogalla et al., 1999; Mymrikov et al., 2017; Mogk e Bukau, 2017).

Uma vez estabelecida a função de co-agregação de HspB1 fosforilada, estas

proteínas foram usadas em ensaios para investigar a atividade de desagregação da

maquinaria da Hsp70. Os resultados revelaram que a ausência de HspB1 ou a presença de

HspB1-WT não foi suficiente para criar agregados de luciferase que as chaperonas pudessem

ressolubilizar e reenovelar no estado nativo, condizendo com o que foi observado por DLS.

Contudo, os mutantes de fosforilação parecem desempenhar um papel importante no

processo de desagregação, ao gerar agregados com a luciferase que fossem susceptíveis à

reativação pelas chaperonas. HspB1-3D-GPG foi um pouco mais eficiente do que HspB1-3D

na reativação da luciferase (35 e 25 %, respectivamente), quando utilizadas durante choque

térmico na proporção 1:10 com o substrato.

Com relação às chaperonas requeridas para formar o sistema de desagregação,

verificamos que a reativação do substrato agregado foi a maior quando as chaperonas

presentes na reação foram Hsp70, DJA2, DJB1 e Hsp110. Diferentemente do que foi

observado no ensaio de reenovelamento, no qual luciferase desenovelada foi

completamente reenovelada apenas pela presença de Hsp70 e DJA2. Além de mais

chaperonas necessárias para a desagregação, o tempo de reação também chama a atenção.

O processo de desagregação parece ser um processo mais complexo e demorado, levando

140

pelo menos 120 min para acontecer, ao passo que o reenovelamento de quase 100% da

luciferase ocorreu em 30 a 60 min.

Em nossos experimentos, Hsp70 foi confirmada como a principal chaperona

funcional do sistema de desagregação, visto que na sua ausência a atividade de luciferase

não é reativada. Duas proteínas da família Hsp70 foram testadas: Hsp70 (HSPA1A), que tem

sua expressão aumentada durante condições de estresse celular, e Hsc70 (HSPA8) que é

expressa constitutivamente (Gething e Sambrook, 1992). Além do padrão de expressão,

essas proteínas apresentam funções biológicas e mecanismos de regulação diferentes (Seo

et al., 2016). Não foram observadas diferenças significativas na função de reenovelamento

de luciferase por Hsp70 e Hsc70, porém a reativação de agregados foi mais eficiente quando

mediada por Hsp70. Isso pode ser reflexo do (re)enovelamento de polipeptídeos ser um

processo que deve acontecer em todas as células em diversas situações, tanto em condições

de metabolismo normal quanto em condições de estresse. Dessa forma, é compreensível

que ambas Hsp70 e Hsc70 sejam capazes de realizá-lo eficientemente. No entanto, a

formação de agregados ocorre mais comumente sob condições estressantes, o que poderia

explicar porque Hsp70 tem melhor atividade de desagregação que Hsc70.

A presença concomitante de duas Hsp40 de classes diferentes (classes A e B) foi

a melhor combinação para desagregação, corroborando trabalhos anteriores que mostraram

que DJA2 e DJB1 possuem funções complementares em diferentes tamanhos de agregados.

Os resultados de seus experimentos in vitro mostram que na presença de baixas

concentrações de DJB1 e excesso de DJA2 não há ressolubilização de agregados de luciferase

muito grandes, enquanto que agregados menores foram solubilizados completamente. Em

contraste, em baixas concentrações de DJA2 e excesso de DJB1, não foi observada a

solubilização de agregados pequenos (Nillegoda et al., 2015). Esses resultados sugerem que

as proteínas Hsp40 das classes A e B operam em diferentes tamanhos de substratos e sua

presença concomitante é a melhor condição para solubilizar todos os tamanhos de

agregados. O mesmo grupo também demonstrou que as proteínas Hsp40 são capazes de

agir dessa maneira porque formam heterocomplexos que modulam a função de Hsp70

(Nillegoda et al., 2015; Nillegoda et al., 2018).

A titulação de DJA2 e DJB1 nos ensaios de desagregação seguidos de

reenovelamento revelou que a razão 2:1 foi a condição ótima para reativar luciferase. Esses

141

resultados podem sugerir outra diferença de função de DJA2 e DJB1 além da atuação em

diferentes tamanhos de agregados. Isso porque observamos que nos ensaios de

reenovelamento Hsp70 e DJA2 são suficientes para reenovelar a luciferase, ao passo que a

presença de DJB1 inibe essa atividade. Já na desagregação seguida de reenovelamento

ambas DJA2 e DJB1 são necessárias, mas com DJA2 em maior concentração (razão 2:1). Isso

pode indicar que DJA2 está envolvida nos processos, de desagregação e reenovelamento, ao

passo que DJB1 é importante apenas para desagregação.

Além disso, não conseguimos observar a atuação de DJA2 e DJB1 em diferentes

tamanhos de agregados, porque a co-agregação com os oligômeros de HspB1 não gerou

agregados pequenos. Em todos nossos experimentos, os agregados foram maiores que 40

nm e foram eluídos no volume morto da coluna. Essa diferença provavelmente foi causada

porque nos experimentos de Nillegoda e colaboradores foi utilizada Hsp26 que é dimérica e

deve ter possibilitado a formação de agregados menores e maiores, ao passo que a co-

agregação com HspB1 gerou apenas agregados grandes.

A co-chaperona Hsp110 foi outro requisito fundamental para que a

desagregação fosse bem-sucedida, diferindo novamente do reenovelamento que requer

apenas Hsp70 e DJA2. Para desagregação seguida de reenovelamento, a reativação máxima

na ausência de Hsp110 foi de apenas 7%, o que corrobora outros estudos de desagregação

mostrando que Hsp110 é necessária para a solubilização de agregados de proteínas in vitro

(Rampelt et al., 2012). Nesses estudos a desagregação de substrato só foi possível com a

atividade de NEF de Hsp110 e seus ortólogos, sendo que NEFs como Bag1 não foram capazes

de auxiliar nesse processo, o que indicaria que Hsp110 poderia ter uma atividade maior na

desagregação de substrato além de trocar nucleotídeo para Hsp70 (Rampelt et al., 2012).

No entanto, em nossos experimentos verificamos que a reativação do substrato

foi sim mais eficaz com Hsp110 (27%), mas também ocorreu na presença de Bag1 (15%).

Neste caso, luciferase foi co-agregada com HspB1-3D e as chaperonas Hsp70, DJA2 e DJB1

estavam presentes na reação. Pode haver uma relação entre as proteínas DnaJ e os

diferentes NEFs usados para desagregação. Como dito, experimentos comparando a

atividade de Hsp110 e Bag1 na presença de Hsc70, mostraram que Bag1 não auxiliou a

solubilização de agregados de luciferase ou malato desidrogenase (MDH) formados com

Hsp26 quando DJB1 foi usada, mas teve um efeito parcial para desagregar luciferase se DJA2

142

estava presente (Rampelt et al., 2012). Em nossos experimentos nos quais os agregados

foram formados com HspB1-3D, Bag1 teve efeito tanto quando DJB1 quanto DJA2 estavam

nas reações. O domínio C-Bag1 que compreende a parte C-terminal de Bag1, incluindo

apenas o domínio Bag, responsável pela ligação ao NBD da Hsp70 e pela troca de

nucleotídeos no ciclo ATP/ADP também foi testado no ensaio de desagregação. C-Bag1 foi

menos eficiente (20%) do que Hsp110 (25%) na desagregação e reativação da luciferase,

porém mais eficiente do que Bag1 completa (15%), sugerindo que não há especificade das

Hsp110 para desagregação e que a atividade NEF dessas proteínas é a única função

necessária para que o processo aconteça.

A função de HspB1-3D-GPG na desagregação foi inicialmente testada usando um

mix de oligômeros e dímeros em solução. Contudo, os estados oligoméricos isolados co-

agregados com luciferase no ensaio de desagregação mostraram resultados interessantes.

Diferentemente do observado na literatura, de que os dímeros compreendem a forma ativa

de HspB1, foram os oligômeros de HspB1-3D-GPG os mais eficazes no auxilio às chaperonas

para solubilização de agregados. Isso sugere que a capacidade de dissociação em dímeros de

HspB1 é importante para auxiliar a desagregação do substrato, não os dímeros em si.

Para aprofundar o entendimento do mecanismo de atuação de HspB1 na

formação de agregados e também para desenvolver um método para detecção direta da

desagregação de luciferase, independente do reenovelamento, o ensaio de desagregação foi

adaptado e acoplado com uma filtração em gel analítica. Através deste método, verificou-se

que o choque térmico da luciferase na ausência ou presença de HspB1 a 45 °C gerou sempre

agregados grandes, eluídos no início da reação no volume morto. Esta confirmação é muito

importante porque elimina a possibilidade de que uma pequena parte da luciferase

permanece monomérica e desenovelada após o choque térmico, o que implicaria que sua

reativação estivesse sendo causada unicamente pela atividade de reenovelamento das

chaperonas.

Os resultados obtidos a partir deste ensaio também corroboram os dados

obtidos pelo ensaio de desagregação seguido de reenovelamento, pois confirma a

importância da presença de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG na co-agregação com substrato.

Nesse sentido, observou-se que os agregados formados com HspB1-WT foram pouco

desagregados, enquanto que com HspB1-3D e HspB1-3D-GPG a desagregação foi mais

143

eficiente, auxiliando as chaperonas a tornar grandes agregados em monômeros de luciferase

(~62 kDa). Na ausência do sistema da Hsp70 não houve desagregação de luciferase.

Além disso, observou-se que, após 3 h da reação na presença de chaperonas,

houve estimulação de mudança no estado oligomérico de HspB1-3D-GPG e,

interessantemente, também de HspB1-3D. Em todas as condições, isso não foi observado

para HspB1-WT. Para o mutante HspB1-3D, foi dectectado deslocamento da eluição de uma

pequena parte das moléculas, de forma que a maior parte das moléculas ainda foi eluída

principalmente como oligômero, mas uma pequena porcentagem foi eluída dissociada em

dímeros. Essa dissociação, foi observada para HspB1-3D apenas nas reações onde as

chaperonas moleculares estavam presente e foi independente da presença ou não de

luciferase (substrato da reação). Se a maquinaria da Hsp70 não estava na reação, mas o

substrato foi adicionado, essa dissociação não foi observada. Em contraste, quando as

reações foram realizadas na ausência de luciferase e na presença do sistema da Hsp70, a

dímeros de HspB1 foram detectados, sugerindo que a interação de HspB1 com outras

chaperonas é uma exigência para que os mutantes de fosforilação de HspB1 se dissociem em

dímeros. De maneira semelhante, a dissociação em dímeros de HspB1-3D-GPG, que já era

observada mesmo no início das reações, foi estimulada após 3 h de reação na presença das

chaperonas, sendo eluído principalmente como dímero e apenas uma pequena parte

permaneceu no estado de oligômero. Dessa forma, esses resultados sugerem que a

presença de chaperonas não foi importante apenas para a solubilização da luciferase, mas

também para estimular a dissociação de HspB1 ativa.

Considerando todos nossos resultados em conjunto, eles suportam um modelo

de desagregação no qual polipeptídeos agregados durante estresse térmico co-agregam com

oligômeros de HspB1 ativados por fosforilação. Hsp70 e as co-chaperonas do sistema são

capazes de extrair peptídeos dos agregados e também promover a dissociação de HspB1 em

dímeros, sendo que processo permite uma desagregação mais eficiente (Figura 39). A

ativação de HspB1 pela fosforilação é importante para desestabilizar oligômeros, mas não

para a formação imediata de dímeros, a qual é estimulada durante o processo de

desagregação pelo sistema da Hsp70. Os dímeros de HspB1 se reorganizam

espontaneamente em oligômeros, permitindo o recomeço do ciclo para uma nova rodada de

desagregação, exceto para o mutante GPG onde a desestabilização foi forçada

144

artificialmente. Isso explicaria por que HspB1-3D é majoritariamente oligomérica após as

reações de desagregação e porque a atividade de desagregação de HspB1-3D é apenas

ligeiramente menor do que a de HspB1-3D-GPG, embora a quantidade final de dímeros

HspB1-3D seja muito menor.

Figura 39: Modelo de desagregação de substrato envolvendo HspB1 e a maquinaria da Hsp70 humana. Os resultados apresentados suportam um modelo de desagregação no qual polipeptídeos desenovelados co-agregam com oligômeros de HspB1 ativados por fosforilação. Hsp70 e as co-chaperonas do sistema são capazes de extrair o substrato dos agregados, mas também auxiliar a dissociação de HspB1 em dímeros. Após essa dissociação, os dímeros HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros, permitindo o recomeço do ciclo para uma nova rodada de desagregação.

Estudos recentes envolvendo as sHsps diméricas de E. coli (IbpA e IbpB) sugerem

que os dímeros são extraídos dos agregados durante a solubilização. Os agregados formados

na presença de IbpA/B foram mais facilmente solubilizados pela DnaK (Hsp70 bacteriana) e

pelo chaperona ClpB (da família Hsp100), do que na sua ausência. Além disso, DnaK teve um

papel específico de ligar em IbpA/B e liberá-las dos agregados, como um primeiro passo da

reação de desagregação (Żwirowski et al., 2017). No entanto, IbpA/B são constitutivamente

dímeros e não podem formar oligômeros como HspB1 e outras sHsps humanas sHSPs, dessa

forma, é provável que IbpA/B permaneçam como dímeros nos agregados e promovam a

desagregação alterando a disposição dos polipeptídeos do substrato. No nosso modelo o

mecanismo de funcionamento de HspB1 deve ser diferente porque os dímeros HspB1 co-

145

agregados com o substrato se mostraram inativos na desagregação, sugerindo que a co-

agregação com oligômeros é um passo necessário. Essa hipótese é nova e contraria o

pensamento mais aceito atualmente de que a conversão de oligômeros de sHsps em

espécies menores é parte do seu mecanismo de ativação, suportado principalmente por

experimentos de prevenção de agregação com HspB1-WT e HspB1-3D (Rogalla et al., 1999;

Jovcevski et al., 2015). Contudo, a diferença de função de desagregação entre dímeros e

oligômeros é marcante e não esta relacionada com a capacidade de ligar substrato. A

principal função de dissociação do oligômero de Hspb1 pode, portanto, ser a solubilização de

agregados, em vez da ativação de ligação ao substrato.

Em células humanas, grandes agregados podem ser eliminados por autofagia,

sem serem necessariamente dissociados em peptídeos individuais (Gamerdinger et al., 2009;

Arndt et at., 2010). A importância da solubilização de agregados ainda precisa ser

determinada, mas pode haver vantagens desse processo em comparação com autofagia. A

desagregação parece ser um processo mais rápido e, se os substratos não forem

reenovelados, a degradação pelo sistema proteosomo também é relativamente rápido.

Solubilização seguida por degradação pode então ser um modo mais eficiente de utilização

dos recursos celulares.

146

2.6. Conclusões

- A sequencia que codifica a proteína HspB1 foi clonada em vetor de expressão,

expressa e purificada com rendimento de ~30 mg/L de indução e em alto grau de pureza (>

95%) após uma etapa de purificação. Também foram obtidos mutantes funcionais que

mimetizam a fosforilação de resíduos específicos de serina (HspB1-1D, 2D e 3D) e um

mutante que induz a dissociação dos oligômeros. Esses mutantes foram construídos,

expressos e purificados usando o mesmo protocolo estabelecido para a proteína selvagem.

- A proteína HspB1-WT e o mutante HspB1-3D foram purificados como

oligômeros em solução. A maior parte de HspB1-3D-GPG também estava no estado

oligomérico, mas cerca de 20% das moléculas foram eluidas como dímeros.

- As proteínas obtidas foram purificadas enoveladas com composição de

estrutura secundária rica em folhas-β (~40%). Os dímeros obtidos pelo mutante HspB1-3D-

GPG também mostraram contribuição de estruturas desordenadas. Uma vez que a

oligomerização ocorre pela região C-terminal (motivo IPV), podemos especular que no

oligômero essa região permanece estruturada, não sendo detectada nos espectros de CD de

HspB1-WT, HspB1-3D ou os oligômeros de HspB1-3D-GPG.

- Tanto a proteína selvagem como os mutantes funcionais apresentaram

estabilidade térmica semelhante. A estrutura secundária não foi perdida até 65 °C; em

temperaturas superiores as proteínas adquirem estrutura desordenada, mas não agregam e

nem precipitam.

- Os mutantes de fosforilação de HspB1 confirmaram que esse tipo de

modificação é essencial para ativação da proteína, tornando-a capaz de interagir com o

substrato e formar agregados proteicos capazes de serem ressolubilizados pelo sistema da

Hsp70. HspB1-2D e HspB1-3D foram eficientes nessa co-agregação, formando co-agregados

de menor tamanho se comparados com aqueles formados na presença de HspB1-WT ou na

ausência de sHsps.

- A co-agregação do substrato com uma HspB1 ativada é essencial para que a

maquinaria da Hsp70 tenha acesso aos agregados e possa realizar a atividade de

desagregação.

- A maquinaria de desagregação é mais eficiente quando composta pela proteína

central Hsp70, um NEF e as co-chaperonas Hsp40. Quando estavam presentes DJA2 (classe

147

A) e DJB1 (classe B), a reativação do substrato foi mais eficiente. Hsp70 se mostrou mais

eficiente que Hsc70 e Hsp110 foi mais eficaz que Bag1 ou C-Bag1.

- Apesar de menos eficientes, Bag1 e C-Bag1 foram capazes de atuar na

maquinaria de desagregação de substrato, indicando que a atividade de troca de

nucleotídeo parace ser a única função dessa co-chaperonas no sistema.

- A mutação no motivo IPV torna HspB1 mais eficiente e promove a

desestabilização do oligômero, dissociando mais facilmente a proteína em dímeros. Tanto a

co-agregação quanto a desagregação foram mais eficientes com o mutante HspB1-3D-GPG.

- A presença de chaperonas não foi importante apenas para a solubilização da

luciferase, mas também para estimular a dissociação de HspB1 fosforilada.

- No modelo proposto, sugerimos que a etapa de co-agregação de polipeptídeos

agregados durante estresse térmico com HspB1 ativada por fosforilação é essencial para

garantir acesso do sistema da Hsp70. Hsp70 e as co-chaperonas do sistema são capazes de

extrair peptídeos dos agregados e também promover a dissociação de HspB1 em dímeros,

sendo que processo permite uma desagregação mais eficiente. Os dímeros de normalmente

HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros, permitindo o recomeço do ciclo

para uma nova rodada de desagregação.

148

Considerações finais

A regulação da homeostase celular realizada pelo sistema de controle de

qualidade proteico é muito complexa e depende da ação de múltiplos processos

orquestrados tanto pelas chaperonas moleculares quando pelo sistema ubiquitina-

proteosomo. Em condições metabólicas normais, mas principalmente em situações de

estresse celular, é extremamente importante que todos esses processos ocorram

eficientemente, evitando o acúmulo de proteínas não funcionais que podem gerar graves

consequências para as células. Sendo assim, o estudo estrutural e funcional das proteínas

que compõem o sistema PQC torna-se bastante relevante por produzir conhecimento com

alto potencial de gerar inovações terapêuticas e biotecnológicas, seja no entendimento de

doenças neurodegenerativas e câncer ou na produção de espécies vegetais mais tolerantes a

diferentes tipos de estresses abióticos.

Neste trabalho, conduzimos nossos estudos para a compreensão de duas

proteínas muito importantes, cujas funções estão diretamente relacionadas com o

direcionamento do destino de substratos proteicos. No capítulo 1, o objeto de investigação

foi a co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Primeiramente, sua sequência gênica

foi identificada através da homologia com o ortólogo de Arabidopsis, clonada e utilizada

para superexpressar a proteína em E. coli. Um protocolo de purificação foi estabelecido, o

que possibilitou a determinação de parâmetros conformacionais para SbCHIP. Nossos

resultados indicam que essa co-chaperona é um dímero alongado em solução, com estrutura

rica em hélices-α e relativamente bem estável em situações de estresse térmico. Além disso,

observamos a formação de complexos entre ela e outra chaperona essencial, a Hsc70, e

caracterizamos sua atividade de auto-ubiquitinação e de ubiquitinação de outros substratos

proteicos. Desse modo, acreditamos que nossos resultados contribuem para o melhor

entendimento da regulação da homeostase proteica em plantas, através do maior

conhecimento da relação entre estrutura e função de CHIP a fim de mediar o enovelamento

e a degradação de proteínas.

Apesar do avanço obtido até aqui, outras questões ainda precisam ser

esclarecidas. Dessa forma, ainda estamos trabalhando no tratamento dos dados de SAXS

para a obtenção de uma estrutura em baixa resolução. Além disso, temos experimentos em

andamento para obtenção de cristais de SbCHIP a fim de podermos determinar sua

149

estrutura tridimensional por difração de raios X (Anexos – Figura A1). Em relação à interação

de SbCHIP com chaperonas moleculares, é importante caracterizar a formação de complexo

também com a chaperona Hsp90, visto que é uma das principais parceiras de CHIP para

regulação da ubiquitinação de substratos. Alguns indícios dessa interação já foram obtidos

por ITC (dados não apresentados), mas a característica dinâmica e transiente da interação

dificulta a reprodutibilidade desta técnica. Também é interessante o estudo de Hsp90 como

substrato de ubiquitinação de SbCHIP, como sugerido em alguns trabalhos com proteínas

humanas. Ainda nesse sentido, é pertinente realizar experimentos de screening com outras

enzimas E2 com as quais SbCHIP pode interagir e ubiquitinar substratos, determinando

assim o espectro de funcionalidade de SbCHIP em relação à proteina homóloga humana.

No capítulo 2, o alvo de investigação foi o papel da sHsp HspB1 no sistema

humano de desagregação de proteínas. O estudo da desagregação em metazoários é um

tópico atual de grande interesse terapêutico e que permanece como principal alvo de

pesquisa dos maiores grupos mundiais focados no estudo das chaperonas moleculares.

Devido à sua complexidade, envolvendo um complexo com múltiplas chaperonas, esse

processo só foi identificado recentemente e este trabalho é o pioneiro na caracterização do

envolvimento de uma sHsp. Com nossos resultados, sugerimos um modelo de desagregação

no qual HspB1 ativada por fosforilação é responsável por co-agregar com polipeptídeos

desenovelados durante estresse térmico. Quando isso ocorre, o sistema da Hsp70, formado

por Hsp70, Hsp40 e Hsp110, é capaz de extrair peptídeos dos agregados e também

promover a dissociação de HspB1 em dímeros, sendo que esse processo permite uma

desagregação mais eficiente. Dessa forma, a fosforilação de HspB1 é importante para

ativação da proteína, desestabilização dos oligômeros, mas não para a formação imediata de

dímeros, a qual ocorre durante o processo por estimulação das chaperonas. Os dímeros de

HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros permitindo o recomeço do ciclo

para uma nova rodada de desagregação, exceto para o mutante GPG onde a

desestabilização foi forçada artificialmente. Entendemos que nossos resultados são bastante

relevantes e contribuem para a compreensão do mecanismo de solubilização de agregados

em células humanas e por isso estamos trabalhando em um manuscrito para publicação

desses dados.

150

Apesar da nossa contribuição, ainda existem aspectos do mecanismo de

desagregação que precisam ser esclarecidos. Neste trabalho a luciferase foi utilizada como

proteína cliente modelo, devido à facilidade experimental de medir sua atividade e,

portanto, de detectar seu reenovelamento e desagregação. Seria interessante, no entanto,

testar outros substratos, especialmente proteínas humanas, a fim de ampliar o espectro de

atuação de sistema no ambiente celular.

Além disso, a HspB1 foi a primeira sHsp humana com papel descrito neste tipo

de complexo. Sabemos que há pelo menos outras 9 proteínas dessa família que são

expressas nas células e que também podem contribuir neste processo para manutenção da

proteostase. É particularmente intrigante investigar o papel de mais de uma sHsp ao mesmo

tempo na desagregação, uma vez que já foi relatada a existência de heterocomplexos dessas

chaperonas, que podem ter sua eficiência ainda mais realçada em condições de estresse

celular. Mecanismos mais específicos, como por exemplo, de reconhecimento de substratos

pelas sHsps ou mesmo de entrega desses substratos para Hsp40 e o sistema Hsp70 também

permanecem desconhecidos e precisam ser investigados para ampliar o conhecimento sobre

esse processo tão importante nas células de diversos organismos.

151

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Anexos

Figura A1: Formação de possíveis cristais de SbCHIP em diferentes condições ao longo do tempo. Foram testados seis kits comerciais de cristalização, os quais consistem de placas de 96 poços contendo uma condição de tampão e de precipitante diferente em cada poço. Foi observada a formação de cristais em diversas condições, sendo algumas delas mostradas aqui: usando 210 µM de SbCHIP nas condições de (A) 100 mM NaH2PO4/K2HPO4 pH 6,2; 2,5 M de NaCl, (B) 100 mM MES pH 6,0; 1M de tartarato de sódio de potássio. E usando 470 µM de SbCHIP nos tampões (C) 240 mM de malonato de disódio; 20% de polietilenoglicol 3,35, (D) 100 mM de BIS-TRIS pH 5,5; 3 M de NaCl e (E) 100 mM de BIS-TRIS pH 5,5; 1M sulfato de amônio. A última imagem de cada condição representa o imageamento por incidência de luz UV. As imagens foram obtidas no ROBOLAB, LNBio (proposta: 23595).

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