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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI
MARIVANE LEMOS
ESTUDO DO PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO, FRAÇÕES
E SUBFRAÇÕES DAS FOLHAS DE COUVE (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)
Itajaí - 2010
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
MARIVANE LEMOS
ESTUDO DO PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO, FRAÇÕES
E SUBFRAÇÕES DAS FOLHAS DE COUVE (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)
Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade Co-orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero
Itajaí, julho de 2010.
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L544e
Lemos, Marivane, 1984- Estudo do perfil fitoquímico e avaliação da atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações das folhas de couve [manuscrito] : Brassica oleracea L. var. acephala DC. / Marivane Lemos. – 2010. 114 f. : il. ; 30 cm
Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2010. “Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade”. Bibliografia: f. 100-113.
1. Produtos naturais. 2. Alimentos funcionais. 3. Fitoquímica. 4. Plantas medicinais. 5. Farmacologia. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
CDU: 615 Cristina M. V. Porciúncula – CRB 14/966
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos, que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente: Ao Prof. Dr. Sérgio, pela orientação sempre amiga, pelos ensinamentos sábios e éticos, pelo profissional de respeito, pela dedicação ao estudo, que por todos esses anos, vem acompanhando e incentivando meu crescimento profissional, ajudando-me a superar inúmeras dificuldades. Seus ensinamentos são inestimáveis por toda a minha vida... Ao Prof. Dr. Rivaldo Niero, que sempre com um sorriso me recebeu, e assim como recebe a todos, com uma alegria imensa ao ensinar, que apesar das dificuldades, sempre me orientou a seguir confiante: “No final tudo dá certo. Se não deu certo é porque não chegamos no final ainda”... Aos professores: Dra. Angela Malheiros, Dra. Marcia Maria de Souza, Dra. Nara L. M. Quintão, Dra. Cristiani Bürguer, Dra. Christiane M. da S. Bittencourt, Dra. Fátima de Campos Buzzi, Dr. Rilton Alves de Freitas, Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Dr. Valdir Cechinel Filho, Dr. Rogério Correa, Dr. Telmo José Mezadri... pelos ensinamentos nos corredores dos blocos 17 e 27, que sempre se propuseram a ajudar e esclarecer, que me acompanharam, sempre aconselhando os melhores caminhos a serem seguidos... Pelos risos e conversas, pela amizade proporcionada durante esse tempo... Ao Prof. Dr. David Rivero Tames, pela orientação durante a confecção dos cortes histológicos, pela aula em histologia, dada de maneira fascinante... À técnica do laboratório de farmacologia, Maria Angélica, a Maggie, pelo cuidado com os animais, meu imenso carinho... À técnica do laboratório de histologia do curso de Odontologia, Maria, pelo cuidado com os animais, pela amizade, pelo carinho e dedicação... Ao Joel, técnico do laboratório de fitoquímica, pela paciência em ajudar, pelas risadas e pela companhia durante os estudos fitoquímicos. Aos técnicos do laboratório de histologia do curso de Odontologia, pela disponibilização das instalações para a confecção dos cortes histológicos, Beatriz e Vanessa, minha gratidão e minha admiração pela dedicação com que vocês realizam esse trabalho... Aos técnicos e professores do laboratório de algas do curso de Oceanografia, pela disponibilização e orientação no uso do microscópio para a realização das fotomicrografias dos cortes histológicos, em especial à Renata, ao Prof. Dr. Matias e ao Prof. Dr. Luis Antonio.
Ao aluno de Doutorado da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – FCFRP-USP, Me. João Paulo Barreto de Sousa e ao Prof. Dr. Jairo Kenupp Bastos, pela disponibilização de seu tempo para as análises cromatográficas realizadas... Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UNIVALI, Prof. Dr. Tania Mari Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenize Heyse Moreira. Aos meus colegas de mestrado... como é bom conviver com vocês... se hoje me pedirem se valeu a pena... sim... conheci pessoas especiais... que fazem a minha vida mais feliz... adoro vocês: Isabel, Rosana, Gislaine, Ana Paula, Juliana, José Roberto, Luiz Carlos, Philipe, Alessandro, Nicole, Silvia, Lilian, Thaisa, Vanessa, Fernanda, Jaqueline, Thaís... só podia ser Deus para colocar a amizade e o carinho de vocês no meu caminho... Aos colegas da farmácia... alunos de Pibic e Probic, Francielle, Crislaine e Renan... que me acompanharam e foram acompanhados nos experimentos... pela ajuda e amizade dentro e fora da universidade... Aos alunos de Aracajú, da Universidade Tiradentes – UNIT, Ana Roseli e Gabriel, pela colaboração nos experimentos durante seu estágio... e pela amizade... pela hospitalidade com que me receberam... À minha família, ao meu pai Alterino e minha mãe Lurdes, aos meus irmãos André e William, e ao meu filho, Luiz Miguel, por compreender a minha ausência... ao meu tio Camilo e a minha tia Janete, pelo carinho com que me apoiaram esse tempo que estive aqui... Ao Isaac... por fazer parte da minha vida com seu sorriso, seu jeito alegre... por compartilhar comigo as horas intermináveis dos experimentos, e pelos momentos de “happy hour”, merecidos após o trabalho... por hoje estar comigo em mais uma etapa... À Universidade do Vale do Itajaí, por disponibilizar instalações e materiais para a realização deste trabalho. E por fim, agradeço à Programa de Suporte a Pesquisa de Instituições Particulares – PROSUP/CAPES, que fomentou meus esforços para a realização desta dissertação de Mestrado.
Muito obrigada...
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ESTUDO DO PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO, FRAÇÕES
E SUBFRAÇÕES DAS FOLHAS DE COUVE (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)
Marivane Lemos (Dissertação) Junho/2010
Orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor. Co-orientador: Rivaldo Niero, Doutor. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas. Número de Páginas: 113. Relatos populares indicam que a couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC., quando tomada em jejum, sob a forma de suco, produz alívio dos sintomas das desordens gástricas. Estudos demostraram que alguns compostos presentes nas plantas deste gênero apresentam atividade antioxidante, cicatrizante, antimicrobiana, anti-inflamatória e anticancerígena. Sendo assim, este trabalho estudou a atividade gastroprotetora da Brassica oleracea L. var. acephala DC. através dos métodos de úlceras agudas (induzidas por etanol associado a ácido clorídrico, AINE associado a parassimpaticomimético), e úlceras crônicas (induzida por ácido acético), alterações dos parâmetros do suco gástrico (avaliação da secreção gástrica ácida e determinação de muco) e avaliação dos possíveis mecanismos de ação envolvidos (determinação dos papéis do óxido nítrico e compostos sulfidrilas in vivo), além de procurar estabelecer o perfil fitoquímico preliminar. Foram observadas gastroproteção nos tratamentos com o extrato hidroalcoólico, fração clorofórmica e subfrações, e fração aquosa e subfrações. A gastroproteção com o tratamento do extrato hidroalcoólico foi mais pronunciada do que a observada nos tratamentos com fração clorofórmica e fração aquosa, omeprazol e cimetidina, em todos os experimentos realizados. Outro dado importante é que, quando realizado o fracionamento do extrato, suas frações e subfrações não perderam a gastroproteção, porém mostraram-se menos eficientes. Além disso, os mecanismos de ação podem estar relacionados com fatores antioxidantes (participação do NO e GSH), fatores anti-inflamatórios (participação da PGE2) ou a inibidores da secreção ácida (bloqueio da (H+-K+)-ATPase). O estudo crônico permitiu avaliar o efeito curativo do extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC, sendo que foram observadas a diminuição do tamanho da úlcera, bem como alterações histopatológicas. A fração clorofórmica pode apresentar compostos fenólicos responsáveis pela atividade gastroprotetora ligada a fatores anti-inflamatórios e/ou antioxidantes. Já a fração aquosa pode apresentar flavonóides glicosilados que podem interferir aumentando a resistência ao dano produzido pelos agentes indutores de úlcera, e glicosinolatos, que após hidrólise, se convertem em isotiocianatos, que interferem na secreção ácida (bloqueio da (H+-K+)-ATPase). No modelo de ligadura de piloro, podemos observar que tanto o extrato quanto as frações tem a capacidade de interferir na secreção ácida, aumentando o pH, diminuindo o volume estomacal e diminuindo a concentração dos íons hidrogênio, e aumentando a secreção de muco. Já no estudo de úlceras crônicas induzidas por ácido acético, o extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC. tem a capacidade de regenerar o dano produzido pelo ácido acético, re-
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organizando todas as estruturas celulares e restabelecendo a integridade da mucosa e do tecido muscular do estômago. De acordo com os resultados obtidos nos modelos experimentais utilizados, o extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC. apresenta atividade gastroprotetora, confirmando seu uso na medicina popular e reforçando seu papel como alimento funcional. Palavras-chave: Úlcera. Alimentos funcionais. Gastroproteção. Antioxidante. Fitoquímica. Brassica oleracea.
PRELIMINARY PHYTOCHEMICAL PROFILE AND EVALUATION OF GASTROPROCTIVE ACTIVE OF HIDROALCOHOLIC EXTRACT,
FRACTIONS AND SUBFRACTIONS OF KALE LEAVES (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)
Marivane Lemos (Dissertation) June/2010
Advisor: Sérgio Faloni de Andrade, Doctor. Co-advisor: Rivaldo Niero, Doctor. Area of concentration: Natural products and bioactive substances. Number of pages: 113. Popular reports indicate that kale, Brassica oleracea L. var. acephala DC., when taken while fasting, in the form of a juice, relieves the symptoms of gastric disorders. Studies show that some compounds present in plants of this genus exhibit antioxidant, wound healing, antimicrobial, anti-inflammatory and anticancer activity. Thus, this study investigates the gastroprotective activity of Brassica oleracea L. var. acephala DC. through the methods of acute ulcers (induced by ethanol combined with hydrochloric acid, NSAID associated with parasympathomimetic), and chronic ulcers (acetic acid induced), changes in parameters of gastric juice (evaluation of gastric acid secretion and determination of mucus) and evaluation of the possible mechanisms involved (determination of the roles of nitric oxide and sulfhydryl compounds in vivo). It also seeks to establish the preliminary phytochemical profile. Different forms of gastroprotection were observed in treatments with hydroalcoholic extract, chloroform fraction and subfractions, and aqueous fractions and subfractions. Gastroprotection with the treatment of hydroalcoholic extract was more pronounced than that observed in treatments with chloroform fraction and aqueous fraction, omeprazole and cimetidine in all the experiments. Another important finding is that, when fractionation of the extract was performed, its fractions and subfractions did not lose the gastroprotection, but were less efficient. Furthermore, the mechanisms of action may be related to antioxidant factors (involvement of NO and GSH), anti-inflammatory factors (participation of PGE2) or acid secretion inhibitors (blockade of (H+-K+)-ATPase). The chronic study evaluated the curative effect of extract of B. oleracea L. var. acephala DC, and revealed a decrease in size of the ulcer, as well as histopathological changes. The chloroform fraction may exhibit phenolic compounds which are responsible for the gastroprotective activity linked to anti-inflammatory factors and/or antioxidants. Meanwhile, the aqueous fraction may present in flavonoid glycosides that can interfere by increasing resistance to the damage produced by agents that induce ulcer, and glucosinolates, which after hydrolysis, are converted into isothiocyanates that interfere in acid secretion (blocking (H+-K+)-ATPase). In the pylorus ligature model, we observed that both the extract and the fractions have the ability to interfere with acid secretion, raising pH, decreasing the volume of the stomach, decreasing the concentration of hydrogen ions, and increasing mucus secretion. In the study of chronic ulcers induced by acetic acid extract of B. oleracea L. var. acephala DC. has the ability to regenerate the damage caused by acetic acid, re-organizing all the cell structures and restoring the integrity of the mucosa and muscle tissue of the stomach. According to the results obtained in experimental models used, the extract of B. oleracea L. var. acephala
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DC. displays gastroprotective activity, confirming its use in folk medicine and enhancing its role as a functional food. Keywords: ulcer. Functional foods. Gastroprotective. Antioxidant. Phytochemistry. Brassica oleracea.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Detalhe das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. .............. 35
Figura 2. Diagrama geral mostrando os principais produtos da degradação
enzimática dos glicosinolatos. Em detalhe, o "rearranjo de Lossen" do
qual resulta os isotiocianatos. ................................................................ 37
Figura 3. Modo de uso popular: suco das folhas de Brassica oleracea L.var.
acephala DC. .......................................................................................... 39
Figura 4. Secção longitudinal, face ventral do estômago. ..................................... 41
Figura 5. Imagem esquemática das camadas musculares e mucosas do
estômago. ............................................................................................... 42
Figura 6. Representação esquemática dos tipos celulares presentes na mucosa
gástrica . ................................................................................................. 43
Figura 7. Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo
estômago. ............................................................................................... 46
Figura 8. Fluxograma do processo de partição líquido-líquido para a obtenção das
frações.................................................................................................... 49
Figura 9. Perfil cromatográfico: A) 1: α-β-amirina; 2: lupeol; 3: FC; 4: espinasterol;
5: estigmasterol. Revelador: cloreto férrico. B) 1: α-β-amirina; 2: lupeol;
3: FC; 4: espinasterol; 5: estigmasterol. Revelador: anisaldeído sulfúrico.
C) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador:
cloreto férrico. D) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5:
sacarose. Revelador: anisaldeído sulfúrico. E) 1: quercetina; 2: rutina; 3:
FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: ácido p-aminobenzoico. ...... 63
Figura 10. Perfil cromatográfico: A) CCD da SFC (6) (111-150), eluída com Hex: Ac
(7:3) revelado com anisaldeído. B) CCD da SFAQ (6) (41-46) eluída com
CHCl3:MeOH (7:3) revelado com anisaldeído. C) CCD da SFAQ (6) (41-
46) eluída com CHCl3:MeOH (7:3) revelado com ácido p-aminobenzoico.
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............................................................................................................... 64
Figura 11. Perfil cromatográfico por CGAR-DIC obtido das frações hexânica,
clorofórmica e acetato de etila obtidas do extrato hidroalcoólico de B.
oleracea L. var. acephala DC. A) Fração hexânica. B) Fração
clorofórmica. C) Fração acetato de etila. 1: Sinal em 9,00 min. 2: Sinal
em 11,60 min. ......................................................................................... 65
Figura 12. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30
mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B.
oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em
úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. . 67
Figura 13. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30
mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de
B. oleracea L. var. acephala DC.(hexânica, clorofórmica, acetato de etila
e aquosa, na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas
por etanol/HCl em camundongos. .......................................................... 68
Figura 14. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30
mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das
folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e
100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em
camundongos. ........................................................................................ 70
Figura 15. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30
mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de
Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100
mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em
camundongos. ........................................................................................ 70
Figura 16. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30
mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da
fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de
Brassica oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em
úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. . 72
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Figura 17. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30
mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da
fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica
oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em úlceras
gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. .............. 73
Figura 18. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100
mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B.
oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em
úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em
camundongos. ........................................................................................ 74
Figura 19. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100
mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das
folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e
100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
indometacina/betanecol em camundongos. ........................................... 76
Figura 20. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100
mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de
Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100
mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
indometacina/betanecol em camundongos. ........................................... 76
Figura 21. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100
mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var.
acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em
úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em
camundongos. ........................................................................................ 78
Figura 22. Detalhes de cortes histológicos do efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica
oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa
(100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético
(30%) em camundongos. ....................................................................... 80
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Figura 23. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica
oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa
(100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em
camundongos, associado a administração de L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e
salina (0,1 mL/10 g de peso de animal).................................................. 85
Figura 24. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica
oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa
(100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em
camundongos, associado a administração de NEM (10 mg/kg, i.p.) e
salina (0,1 mL/10 g de peso de animal).................................................. 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da
fração clorofórmica. ................................................................................ 61
Tabela 2. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da
fração aquosa. ........................................................................................ 62
Tabela 3. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes
doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala
DC. (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por
etanol/HCl em camundongos. ................................................................ 66
Tabela 4. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes
frações do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea L. var.
acephala DC. (hexânica, clorofórmica, acetato de etila e aquosa, na
dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em
camundongos. ........................................................................................ 68
Tabela 5. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das frações
clorofórmica e aquosa obtidas do extrato hidroalcoólico das folhas de
Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100
mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos. ............ 69
Tabela 6. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes
subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta da fração
clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica
oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas
por etanol/HCl em camundongos. .......................................................... 71
Tabela 7. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes
subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta das
frações clorofórmica e aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de
Brassica oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras
gástricas por etanol/HCl em camundongos. ........................................... 72
17
Tabela 8. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes
doses do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var.
acephala (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas
por indometacina/betanecol em camundongos. ..................................... 74
Tabela 9. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes
frações do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var.
acephala (clorofórmica e aquosa, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em
úlceras gástricas por indometacina/betanecol em camundongos. ......... 75
Tabela 10. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato
hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg)
e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas
agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos................ 77
Tabela 11. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato
hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg)
e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) na espessura da mucosa
gástrica de úlceras induzidas por ácido acético (30%) em camundongos.
............................................................................................................... 79
Tabela 12. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea
var. acephala DC. (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da
secreção gástrica ácida de camundongos submetidos à ligadura de
piloro....................................................................................................... 81
Tabela 13. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg)
obtidas a partir do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea
var. acephala nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica ácida de
camundongos submetidos à ligadura de piloro. ..................................... 82
Tabela 14. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e
indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidralcoólico
das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) nos
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parâmetros bioquímicos da secreção de muco de camundongos
submetidos à ligadura de piloro. ............................................................. 83
Tabela 15. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e
indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses das diferentes doses
das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg) obtidas do
extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25,
50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção de muco de
camundongos submetidos à ligadura de piloro. ..................................... 83
Tabela 16. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato
hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg)
e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por
etanol/HCl associado a inibição da NO-sintase em camundongos. ....... 84
Tabela 17. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato
hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg)
e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por
etanol/HCl associado a alquilação de grupamentos sulfidrilas em
camundongos. ........................................................................................ 86
LISTA DE ABREVIATURAS
ABS – Absorbância
AINE – Anti-inflamatório não-esteroidal
ATP – Adenosina Tri-Fosfato
CCA – Cromatografia em coluna aberta
CCD – Cromatografia de camada delgada
CCK - Colecistocinina
CGAR-DIC – Cromatografia gasosa de alta resolução associada a detector de
ionização de chama
COX – Ciclo-oxigenase
DC. – Augustin Pyrame de Candolle
DI50 – Dose inibitória
EGF - Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidérmico)
EHA – Extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala DC.
EPM – Erro padrão da média
FAE – Fração acetato de etila
FAQ – Fração aquosa
FC – Fração clorofórmica
FDM – Franco Delle Monache
FGF - Fibroblast growth factor (Fator de crescimento de fibroblasto)
FH – Fração hexânica
GMPc – Guanosina monofosfato cíclico
GPS – Global Positioning System (Sistema de Posicionamento Global)
(H+-K+)-ATPase – bomba hidrogênio-potássio ATPase (bomba de prótons)
H2 – Receptor de histamina tipo 2
IC – Índice de cura
IL-1αααα – Interleucina tipo 1 alfa
IL-1ββββ – Interleucina tipo 1 beta
i.p. – Via intraperitonial
L. – Carl von Linné
L-NAME – N-nitro-L-arginina metil éster
LPS – Lipopolissacarídeo
20
MeOH - Metanol
mEq – Miliequivalente-grama
N – North
NO – óxido nítrico
NEM – N-etilmaleimida
PDGF - Platelet-derived growth factor (Fator de crescimento derivado de plaquetas)
PGE – Prostaglandina do tipo E
PPPM – Programa de Pesquisa em Plantas Medicinais
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
SFAQ – Subfração aquosa
SFC – Subfração clorofórmica
SUS – Sistema Único de Saúde
TGF – Transforming growth factor (Fator de crescimento tumoral)
TNF – Tumor necrosis factor (Fator de necrose tumoral)
ULI – Ulcer lesion index (Índice de lesão ulcerativa)
UV – Ultravioleta
v.o. – Via oral
var. – Variante
VEGF – Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento vascular
endotelial)
W – West
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 24
2 OBJETIVOS ........................................................................................... 27
2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 27
2.2 Objetivos específicos ............................................................................. 27
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................. 29
3.1 O uso de plantas como alimentos funcionais e fitoterápicos .................. 29
3.2 Brassica oleracea L. var. acephala ........................................................ 32
3.3 Fisiopatologia da úlcera e terapia antiúlcera .......................................... 40
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 48
4.1 Análise fitoquímica de Brassica oleracea L. var. acephala DC. ............. 48
4.1.1 Coleta e preparo do material vegetal ..................................................... 48
4.1.2 Preparação do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L. var.
acephala DC. .......................................................................................... 48
4.1.3 Fracionamento do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L.
var. acephala DC. ................................................................................... 48
4.1.4 Análise cromatográfica ........................................................................... 49
4.2 Animais e ensaios farmacológicos ......................................................... 51
4.2.1 Animais .................................................................................................. 51
4.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa ................. 52
22
4.4 Avaliação da atividade gastroprotetora .................................................. 53
4.4.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl ................................... 53
4.4.2 Modelo de úlcera aguda induzida por antiinflamatório não-esteroidal
associada à estimulação parassimpaticomimética ................................. 54
4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio curativo) .. 55
4.4.4 Análise histopatológica ........................................................................... 56
4.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica .................................. 57
4.5.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro) .............. 57
4.5.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica .......... 58
4.6 Mecanismos de ação antiúlcera ............................................................. 59
4.6.1 Avaliação do papel do Óxido Nítrico (NO) in vivo ................................... 59
4.6.2 Avaliação do papel dos grupos sulfidrílicos (SH) in vivo ........................ 60
5 RESULTADOS ....................................................................................... 61
5.1 Análise fitoquímica preliminar do extrato hidroalcoólico das folhas,
frações e subfrações de Brassica oleracea L. var. acephala DC. .......... 61
5.2 Análise fitoquímica ................................................................................. 62
5.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa ................. 65
5.4 Avaliação da atividade gastroprotetora .................................................. 66
5.4.1 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC., frações e subfrações em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl ...
............................................................................................................... 66
23
5.4.2 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações em úlceras agudas induzidas por
AINE/parassimpaticomimético ................................................................ 73
5.4.3 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético
(ensaio curativo) ..................................................................................... 77
5.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica .................................. 81
5.5.1 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro) ................. 81
5.5.2 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações sobre a secreção de muco em mucosa gástrica ............. 82
5.6 Mecanismos de ação antiúlcera in vivo .................................................. 84
5.6.1 Papel do óxido nítrico e do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L.
var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl
............................................................................................................... 84
5.6.2 Papel dos compostos sulfidrilas e do extrato hidroalcoólico de Brassica
oleracea L. var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas
por etanol/HCl ........................................................................................ 85
6 DISCUSSÃO .......................................................................................... 88
7 CONCLUSÕES ...................................................................................... 98
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 100
ANEXO A ............................................................................................................. 113
24
1 INTRODUÇÃO
Na última década, em todo o mundo, estudos focam sua atenção na saúde e
na manutenção da vida. Evidências crescentes apontam um aumento no consumo
de frutas e hortaliças levam a uma diminuição risco de câncer e outras doenças
crônicas. Os efeitos saudáveis de frutas, verduras, legumes e hortaliças na
prevenção de doenças têm sido investigados, focando os componentes funcionais
em alimento derivados de plantas (KIM, 2003).
A dieta é um dos fatores mais importantes na manutenção da saúde. Quando
inadequada, predispõe ao surgimento de doenças, por exemplo, diabetes mellitus
tipo 2, arteriosclerose, câncer, doenças cardiovasculares, desordens
gastrointestinais, entre outras (SCHIEBER, STINTZING, CARLE, 2001; HASLER,
2002; HAMAUZU et al., 2008).
Atualmente, muitas plantas usadas como alimentos têm seus efeitos que vão
muito além de seus benefícios nutricionais, sendo chamadas de alimentos
funcionais. Essas plantas, também são alvos de desenvolvimento de fitoterápicos,
pois apresentam fitoconstituintes responsáveis pela redução do risco de doenças,
melhorando a saúde e o bem-estar (HASLER, 1998; ASHWELL, 2001; LAJOLO,
2001; JONES 2002; O’CONNOR, WHITE, 2010).
O padrão alimentar e o estilo de vida da sociedade moderna são um dos
responsáveis pelo acometimento de patologias, que resultam em morbidade e
mortalidade. Essas patologias são resultado de uma dieta com alta ingestão de
gorduras totais e gorduras saturadas, colesterol, açúcar e sódio refinado, associado
a baixa ingestão de gordura insaturada, grãos integrais, legumes, frutas e verduras.
A má alimentação, fumo, estresse, ingestão de álcool, uso abusivo de fármacos
também acarreta em distúrbios na integridade da saúde, além de diminuir a
qualidade de vida (HASLER, 2002).
Com o avanço das indústrias, alimentícia e farmacêutica, houve um aumento
nos estudos de plantas com propriedades sobre a manutenção e recuperação da
saúde. A chamada “onda verde” marca o ressurgimento de pesquisas de plantas na
procura de substâncias com propriedades farmacológicas. Este é um dos grandes
acontecimentos responsáveis por essa mudança de foco industrial, ou seja, na
procura de plantas com propriedades farmacológicas que visem à prevenção e o
25
tratamento de patologias com menos efeitos colaterais (SILVA, 2002).
Os legumes pertencentes ao gênero Brassica apresentam grande importância
econômica, pois são produzidos e consumidos o ano todo, e em todo o mundo.
Estão presentes como ingredientes de saladas, refogados e caldos. Atualmente,
esse gênero pode ser considerado um alimento funcional, pois apresenta diversas
substâncias capazes de interferir em processos patológicos, sendo capazes de
promover a manutenção da saúde. Dentre as propriedades farmacológicas já
descritas estão as atividades antioxidante, cicatrizante, antimicrobiana, anti-
inflamatória e ancancerígena (LIN, LI, HWANG, 2008; SOUSA et al., 2008; ROY et
al., 2009; TOMOHIKO et al., 2009).
A couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.), também conhecida como
couve-manteiga, couve-branca, couve-galega e couve-mineira, sob a forma de suco
das suas folhas, é usada na medicina popular para desordens gástricas. Segundo
estudo etnofarmacológico conduzido por Silva et al. (2006), a couve é uma das
plantas mais utilizadas para o tratamento de úlceras e gastrites.
Como o padrão alimentar e o estilo de vida adotado pela população mundial
favorece ao aparecimento de doenças do trato digestório, as úlceras pépticas
tornaram-se presentes na sociedade moderna. Nos últimos 20 anos, houve um
aumento significativo no quadro de distúrbios gástricos. Em média, pelo menos 10%
da população mundial poderá sofrer um evento relacionado com o aparecimento de
úlceras gástricas no decorrer da vida. O aumento da secreção de ácido é um dos
fatores mais importantes envolvidos na fisiopatologia da úlcera, porém, outros
fatores envolvidos com a citoproteção e manutenção da integridade da mucosa
estão sendo estudados (BRZOZOWSKI, 2003).
Além disso, atualmente no Brasil existem políticas que favorecem o
desenvolvimento de novos medicamentos baseados em plantas. O Programa de
Pesquisas de Plantas Medicinais (PPPM) do SUS (Sistema Único de Saúde) elenca
74 espécies vegetais para novos estudos farmacológicos e toxicológicos. Dentre
essas espécies, a Brassica oleracea foi uma das espécies selecionadas, pois carece
de estudos científicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Com base nos dados dos fitoconstituintes presentes no gênero, dados
farmacológicos, estudos epidemiológicos e incentivo de políticas nacionais para o
desenvolvimento de novos medicamentos, além das evidências etnofarmacológicas,
tornou-se importante estudar a couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.)
26
quanto a sua atividade gastroprotetora e seus constituintes químicos, procurando
observar seu envolvimento nos mecanismos presentes na fisiopatologia das
desordens gástricas (SCHMEDA-HIRSCHAMANN, YESILADA, 2005).
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico, frações e
subfrações obtidas das folhas de couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.),
bem como determinar seu provável mecanismo de ação.
2.2 Objetivos específicos
1. Obter extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var.
acephala DC. Através da maceração em etanol 50% a frio.
2. Obter as frações hexano, clorofórmio, acetato de etila e aquosa através
do processo de partição líquido-líquido.
3. Das frações mais ativas, obter subfrações através de cromatografia em
coluna aberta.
4. Determinar o perfil fitoquímico, e comparar com os padrões da
literatura, através de testes cromatográficos preliminares.
5. Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico, frações e
subfrações através modelo de indução de úlcera aguda induzida por etanol
associado a ácido clorídrico em camundongos.
6. Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico e frações
através modelo de indução de úlcera aguda induzida por AINE associado a
parassimpaticomimético em camundongos.
28
7. Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato hidroalcoólico e frações
através do modelo de indução de úlcera crônica (ensaio curativo): ácido acético,
avaliando sua histopatologia.
8. Verificar o efeito do extrato e frações sobre a secreção gástrica ácida e
produção de muco, no modelo de ligadura de piloro em camundongos
9. Investigar os possíveis mecanismos de ação pelos quais o extrato e
frações de Brassica oleracea L. var. acephala DC. através do modelo de indução de
úlcera aguda induzida por HCl/etanol associado a L-NAME e NEM.
10. Comparar a atividade antiúlcera do extrato hidroalcoólico, frações e
subfrações de Brassica oleracea L. var. acephala DC. com fármacos utilizados na
terapia antiúlcera (omeprazol e cimetidina).
29
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 O uso de plantas como alimentos funcionais e fitoterápicos
Nas últimas décadas é notável o aumento de trabalhos na literatura citando o
papel dos metabólitos secundários presentes nos alimentos e seus potenciais efeitos
benéficos na saúde humana. Isso se deve a conscientização das pessoas de que a
manutenção de sua saúde é, em grande parte, determinada por uma dieta
balanceada (SCHIEBER, STINTZING, CARLE, 2001).
O aprimoramento da indústria de alimentos e da indústria de fitoterápicos
proporcionou o avanço nos estudos com plantas medicinais e alimentícias. O
desenvolvimento da indústria farmacêutica nos proporcionou a praticidade de formas
farmacêuticas prontas, porém, muitos medicamentos ainda apresentam efeitos
colaterais, e nem sempre cumprem o seu papel terapêutico. Por volta de 1960,
houve um aumento de estudos em plantas na busca de novos medicamentos e seus
possíveis efeitos terapêuticos e preventivos. A chamada “onda verde” impulsionou
os estudos de vegetais em busca de novos medicamentos que apresentassem
menos efeitos colaterais (SILVA, 2002).
Nesta mesma década, percebeu-se a relação entre algumas enfermidades
com o tipo da dieta, como por exemplo, doenças cardiovasculares associadas à
ingestão exagerada de gorduras totais e saturadas. As pesquisas desta época
enfatizavam os aspectos negativos da alimentação e como ela poderia provocar
doenças (HASLER, 2002).
Atualmente, existe a preocupação de se buscar nas plantas ingredientes que
possam ser bioativos capazes de beneficiar as funções fisiológicas do corpo, tanto
sob a forma de fitoterápicos, como na forma de alimentos.
Os alimentos funcionais ou alimentos nutracêuticos são alimentos ou
componentes cujos benefícios vão além das necessidades nutricionais básicas,
proporcionando aos consumidores as propriedades de reduzir o risco de doenças,
melhorando a saúde e o bem-estar, tendo aplicações medicinais, terapêuticas e
cosméticas (HASLER, 1998; ARRABI, 2001; ASHWELL, 2001; LAJOLO, 2001;
JONES 2002; O’CONNOR, WHITE, 2010).
Já os fitoterápicos, de acordo com a RDC n. 14, de 31 de março de 2010, em
30
seu capítulo I, artigo 1°, parágrafos 1°, 2° e 3° são descritos como:
“§ 1º São considerados medicamentos fitoterápicos os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências. clínicas. § 2º Os medicamentos fitoterápicos são caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. § 3º Não se considera medicamento fitoterápico aquele que inclui na sua composição substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as associações dessas com extratos vegetais” (BRASIL, 2010).
Os fitoterápicos são provenientes de plantas, e têm funções terapêuticas que
visam a manutenção e promoção da saúde humana. Além disso, os fitoterápicos
constituem um ramo do mercado farmacêutico que, no ano de 2000, apresentou um
rendimento em torno de 22 bilhões de dólares (YUNES, REDROSA, CECHINEL
FILHO, 2001; MALHEIROS et al., 2010).
Em todo o mundo, a população percebeu que evitar o consumo de alimentos
prejudiciais poderia contribuir para uma maior expectativa e melhor qualidade de
vida. Porém, não apenas os consumidores estavam interessados na qualidade e nos
benefícios dos alimentos e plantas. A indústria e a comunidade científica começaram
incentivar pesquisas, levantando informações sobre as substâncias presentes nas
plantas alimentícias, que podem melhorar e promover a saúde (KROUS, WALKER,
2004).
Pesquisas e estudos epidemiológicos demonstram que os micronutrientes
presentes em frutas, legumes e verduras reduzem o risco de doenças. Compostos
fenólicos, por exemplo, tem propriedades anti-inflamatórias, anticarcinogênica,
antialérgica, antioxidante, gastroprotetora, entre outras. A fibra dietética, também
chamada de polissacarídeos de pectina é um componente funcional importante das
frutas. Além de ser hipocolesterolêmica e hipoglicêmica, diminui o risco de várias
doenças do trato digestório, como a melhora do trânsito gastrointestinal (SCHIEBER,
STINTZING, CARLE, 2001; HAMAUZU et al., 2008).
Na grande maioria, os componentes presentes em plantas e alimentos
interferem nos processos oxidativos, que são responsáveis pelo envelhecimento,
câncer, arteriosclerose, artrite, neurodegeneração, desordens inflamatórias, diabetes
31
mellitus, entre outras. O estudo do papel desses componentes antioxidantes
presentes nos alimentos e plantas é de grande interesse, pois atualmente a maioria
dos antioxidantes conhecidos são componentes naturais presentes nos alimentos.
Esses podem ser classificados em dois grupos: os essenciais para a alimentação
(vitaminas e carotenóides) e os não essenciais (polifenóis e flavonóides) (TORRES
et al, 2008).
Essa tendência, de se melhorar a saúde com a ingestão de ingredientes
alimentícios é confirmada no 10º relatório anual da Food Marketing Institute and
Prevention Magazine, onde revela que 76% dos consumidores concordam que
comer de forma saudável é melhor do que usar medicamentos para combater
doenças (SLOAN, 1994; SLOAN, 2000; HASLER, 2002).
Além disso, apesar da grande evolução da indústria farmacêutica, existem
carências quanto ao acesso aos medicamentos por uma parcela da população. Este
é um motivo pelo qual a população recorre às plantas (GARCIA, 1995; VERLI,
BARREIRO, 2005).
A OMS estima que 80% da população nos países em desenvolvimento, de
algum modo usam plantas medicinais na busca de alívio de alguma sintomatologia
dolorosa ou desagradável, isso em números significa que cerca de 4 bilhões de
pessoas confiam nas plantas como fonte de medicamentos (GARCIA, 1995; VERLI,
BARREIRO, 2005).
O uso de medicamento nem sempre resolve todos os problemas, e muitas
vezes, não previne, apenas atenua as doenças já instaladas. Por isso, novas
terapias têm sido buscadas pela população e pela comunidade científica, a fim de
melhorar a qualidade de vida das pessoas. Essas terapias são chamadas de
terapias complementares, e podemos dar destaque ao uso de fitoterápicos e de
nutracêuticos (alimentos funcionais). Nestes dois, o uso de plantas é um fator muito
importante (MACIEL, PINTO, VEIGA, 2002; SILVA, 2002).
Em 2009, nos EUA, a American Dietetic Association reconheceu que
alimentos funcionais são mais bem aceitos pela população do que suplementos
nutricionais em forma de medicamentos, e que prevenir doenças através da
alimentação é melhor do que recorrer aos tratamentos convencionais (O’CONNOR,
WHITE, 2010).
No Brasil, nota-se um crescente interesse das indústrias em desenvolver e
divulgar alimentos e plantas com propriedades funcionais. Há interesse de centros
32
de pesquisa e instituições de ensino em estudarem as características destes
(TORRES, 2001).
Sob a forma de alimentos, as pessoas ingerem uma grande diversidade de
compostos farmacologicamente ativos, sendo que plantas ditas como alimentos
funcionais constituem uma prioridade de pesquisa em todo o mundo, sendo uma
tendência futurista a nível mundial. A vitamina C. vitamina E, carotenóides e
flavonóides, por exemplo, podem estar desempenhando importantes papéis na dieta
humana, sendo compostos necessários na constituição de uma dieta ideal,
constituintes importantes tanto de alimentos funcionais quanto de fitoterápicos
Estudos com a finalidade de elucidar as propriedades e os efeitos que destas
substâncias sobre a saúde são necessários para a identificação e isolamento destes
compostos quimiopreventivos presentes em alimentos funcionais a base de plantas
(OLIVEIRA et al., 2002; MORENO et al., 2006; VRCHOVSKÁ et al., 2006).
3.2 Brassica oleracea L. var. acephala
A família Brassicaceae (também conhecida como Cruciferae), possui
aproximadamente 350 gêneros, organizado em 13 tribos e apresentando 3200
espécies, destacando-se o gênero Brassica, que é o mais importante
economicamente. A origem do gênero Brassica provavelmente é a região da Costa
Norte Mediterrânica, Ásia Menor e Costa Ocidental Européia, atualmente sendo
difundido em todo o mundo. A palavra deriva do celta antigo (bressic), que significa
repolho. Há registros de amplo consumo de repolhos e couves pelos egípcios,
romanos e outros povos antigos, em períodos anteriores a 2500 a. C., considerada
uma fina iguaria. Sua introdução na Europa é atribuída aos celtas por volta do século
IX, de onde foi trazido para o continente americano no século XV (KOWALSKY et
al., 1994; JOLY, 1998; SINGH, JAUHAR, 2007).
Os antigos a consideravam como um remédio universal. Hipócrates a
prescrevia cozida com mel contra cólicas. Durante a gravidez, as mulheres
atenienses comiam abundantes pratos de couves. A urina das pessoas que se
alimentavam de couves era atribuída a cura do herpes, fistulas e até câncer. As
dores lombares e reumáticas desapareciam com a aplicação das folhas cozidas, em
33
cataplasma, e as sementes eram utilizadas como vermífugo (PARACELSO, 1976).
As couves e repolhos, brássicas ou crucíferas, como são conhecidas,
descendem de uma única planta, a Brassica oleracea L. var. sylvestris. Nas
brássicas existem inúmeras complicações quanto a uma classificação botânica mais
precisa. A classificação com base na morfologia, além de volumosa, é difícil, não
refletindo exatamente as suas relações evolutivas. Porém, a tribo Brassiceae está
com seus limites morfológicos mais claramente reconhecidos. Essas alterações
morfológicas são influenciadas pelo seu polimorfismo genético, sendo o seu
mapeamento um desafio para a Botânica moderna. A Brassica oleracea L. var.
oleracea é uma planta cuja a descrição é difícil, pois possui diversas variantes em
termos morfológicos. Mas em geral são plantas herbáceas, com algumas variedades
sublenhosas em torno da base do caule (KOWALSKY et al., 1994; JOLY, 1998;
SINGH, JAUHAR, 2007).
As principais espécies são B. oleracea L. var. acephala (couve), B. oleracea
L. var. capitata (repolho), B. oleracea L. var. botrytis (couve-flor), B. oleracea L. var.
italica (brócolis), B. oleracea L. var. gemmifera (couve-de-Bruxelas), B. oleracea L.
var. gongylodes (couve-rábano) e B. campestris L. var. pekinensis (couve-chinesa)
(JOLY, 1998).
A couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC. é a espécie que mais se
assemelha com a couve silvestre. É uma planta de ciclo bianual, mas pode se tornar
perene. Seu caule é ereto, as folhas da base podem diferir das folhas terminais,
apresentando-se basilares, que podem ser lirado-penatipartidas, enquanto que as
folhas superiores podem ser oblongas, obovadas, onduladas e denteadas. As folhas
geralmente variam de verde escuro a verde amarelado, são grossas, mas não
chegam a ser carnudas, sendo emitidas continuamente. São distribuídas em forma
de roseta, ao redor do caule, havendo também emissão de numerosos rebentos
laterais utilizados na propagação. As flores são dispostas em racimos terminais
eretos, podem ser brancas ou amarelas, com sépalas eretas e corola composta por
quatro pétalas obovadas, ungüiculadas, sendo que a polinização é cruzada, feita
principalmente por abelhas. Os frutos são silíquas cilíndricas ou subcompridas
rostradas (JOLY, 1998; FILGUEIRA, 2003).
A cultura da couve é típica do outono-inverno, sendo que são plantas bem
adaptadas ao frio e resistem à geada, geralmente cultivada no sul do Brasil. É uma
planta bienal, e apresenta certa tolerância ao calor, permanecendo produtiva durante
34
meses. O seu plantio pode se estender ao longo de todo o ano, e as plantas
pertencentes a este gênero são de grande importância econômica e nutricional,
também amplamente utilizadas para a extração óleos, sendo a quarta fonte de
extração de óleos, estando atrás apenas para a soja, a semente de palma e o
algodão. A família Brassicaceae é uma das 10 famílias de plantas ecomomicamente
mais importantes no mundo (TROYER, STEPHESON, FAHEY, 2001; FILGUEIRA,
2003; PEDROCHE et al., 2004).
Os legumes pertencentes ao gênero Brassica são consumidos em todo o
mundo, como ingrediente de saladas, refogados e caldos. A atenção crescente ao
papel dos alimentos funcionais, tanto no fornecimento de nutrientes, quanto no de
substâncias bioativas, está incentivando estudo mais detalhados dos legumes,
sendo eles agora observados do ponto de vista fitoquímico. Atualmente, o gênero
Brassica é considerado um alimento funcional muito promissor, pois diversas
substâncias (vitaminas antioxidantes, compostos fenólicos, carotenóides, polifenóis
e ácidos orgânicos) encontradas nestas plantas apresentam atividades
antioxidantes, cicatrizantes, anti-inflamatórias e antimicrobianas (SINGH et al., 2007;
LIN, LI, HWANG, 2008; SOUSA et al., 2008; ROY et al., 2009; TOMOHIKO et al.,
2009).
As folhas da couve, Brassica oleracea L. var. acephala DC. (Figura 1), são as
partes utilizadas na alimentação, porém são altamente perecíveis perdendo a
coloração verde, quando mal conservadas, de modo que sua aparência visual reflete
seu teor em constituintes, sendo estes claramente passíveis de processo de
degradação por oxidação (TOMOHIKO et al., 2009).
35
Figura 1. Detalhe das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC.
(Fonte: http://www.google.com.br/imagens)
Compostos fitoquímicos presentes em frutas e legumes neutralizam os danos
causados por agentes oxidativos. Acredita-se que esse efeito benéfico seja
alcançado por vários mecanismos, dentre eles, a estimulação do sistema
imunológico, modulando a expressão do gene e do metabolismo dos hormônios,
resultando na quelação de metais e fornecendo substâncias antibacterianas e
antivirais. O brócolis (Brassica oleracea L. var. italica), por exemplo, apresenta
considerados níveis de glicosinolatos, flavonóides, carotenóides, antocianinas,
cumarinas, ácidos fenólicos, monoterpenos, vitaminas (A, B1, B2 e B6) e minerais
(ROY et al., 2009).
Nesta família, os fitoconstituintes que mais chamam a atenção são os
glicosinolatos, que são compostos do metabolismo secundário, encontrados em
mais 16 famílias de plantas. São compostos quimicamente definidos, todos
compartilhando de uma estrutura básica similar, constituído por um grupo β-D-
tioglicose, um grupo oxima sulfonado e uma cadeia derivada de metionina,
fenilalanina, triptofano ou de uma cadeia ramificada de aminoácidos. O grupo
sulfato de uma molécula de glicosinolato é fortemente ácido e as plantas o
36
acumulam sequestando-os como sais de potássio em vacúolos vegetais (TROYER,
STEPHESON, FAHEY, 2001; MORENO et al., 2006).
Mais de 120 glicosinolatos já foram identificados, e embora sua função na
planta não seja clara, provavelmente são responsáveis pela defesa da planta contra
o ataque de insetos, herbívoros e micro-organismos. Essas substâncias são
liberadas na forma de isotiocianatos, apresentam sabor e odor pungente, sendo
estes característicos das mostardas (Brassica alba, B. juncea e B. nigra). E mesmo
que o tecido vegetal não seja lesionado, esses compostos se volatilizam, sendo
reconhecidos pelos insetos a longas distâncias (AGERBIRKA, ØRGAARDB,
NIELSENA, 2003; MORENO, et al., 2006).
O consumo médio de glicosinolatos por humanos é estimado em 16 mg/dia no
Canadá, 30 mg/dia no Reino Unido e 112 mg/dia no Japão, sendo que no restante
do mundo, esse consumo varia, geralmente inferior a esses índices. Existem
pesquisas para a produção de alimentos ricos em glicosinolatos, que apesar de
apresentar efeitos ora benéficos, ora tóxicos, a sua ingestão é de grande
importância, devido ao seu alto poder quimiopreventivo (TROYER, STEPHESON,
FAHEY, 2001).
Esses compostos atuam sobre enzimas hepáticas que estão associadas ao
metabolismo de xenobióticos e atuam protegendo o DNA contra dano. A alta
ingestão de brássicas está associada à diminuição do risco de câncer,
principalmente no pulmão e trato gastrointestinal. Atualmente, a epidemiologia
também aponta para a redução de risco em câncer de próstata. Um uso incomum é
o suco das folhas de brócolis para doenças de pele e verrugas (MORENO, et al.,
2006).
Quando consumidos, os glicosinolatos não são bioativos, porém são
enzimaticamente hidrolizados pela enzima mirosinase, uma enzima presente na
própria célula vegetal, que é liberada mediante a ruptura mecânica. Esta enzima
converte os glicosinolatos em isotiocianatos, que são substâncias formadas através
de um rearranjo, chamado de “rearranjo de Lossen”, além de outros produtos (Figura
2). Existem grandes dificuldades de isolamento, purificação de glicosinolatos, em
parte devido ao processo de hidrólise, e em parte devido a polaridade destes
compostos (TROYER, STEPHESON, FAHEY, 2001; BONES, ROSSITER, 2006;
MORENO, et al., 2006).
37
Figura 2. Diagrama geral mostrando os principais produtos da degradação enzimática dos
glicosinolatos. Em detalhe, o "rearranjo de Lossen" do qual resulta os isotiocianatos. Fonte: adaptado de BONES, ROSSITER, 2006.
In vivo e in vitro, os isotiocianatos afetam diversas etapas no desenvolvimento
do câncer, incluindo a modulação antioxidante direta ou indireta. Também podem
atuar na redução das infecções por Helicobacter pylori. No entanto, os efeitos das
combinações fitoquímicas e quimiopreventivas presentes nas brássicas ainda não
estão completamente elucidados. Muitos grupos de pesquisa estão estudando os
mecanismos de ação destes compostos de forma individual, porém existem poucos
estudos que correlacionam as atividades destes componentes em conjunto
(MORENO, et al., 2006).
Além dos isotiocianatos, outros compostos presentes nas brássicas estão
envolvidos com as mais diversas atividades. Lin, Li e Hwang (2008) recentemente
provaram que os pigmentos responsáveis pela coloração roxa do repolho (Brassica
oleracea L. var. capitata) apresentam atividade anti-inflamatória. Tais pigmentos
mostraram-se ativos contra a inflamação produzida por lipopolissacarídeo (LPS).
Heo e Lee (2006) relataram que o repolho roxo (Brassica oleracea L. var.
capitata DC) também é uma boa fonte de compostos fenólicos, principalmente
38
antocianinas (responsáveis pela coloração). Estes compostos promovem um
aumento da viabilidade de células de feocromocitoma de ratos PC12. Estas células
passam por uma diferenciação celular quando tratadas com fator de crescimento
neuronal, sendo útil em estudos de diferenciação de células nervosas. As ações
estão associadas às propriedades antioxidantes, protegendo contra a citotoxicidade
induzida pela proteína β-amiloide e aumentando a viabilidade celular neuronal,
podendo atuar em efeitos quimiopreventivos de doenças neurodegenerativas, como
o Alzheimer.
Já as inflorescências da Brassica oleracea L. var. acephala DC. apresentam
grandes quantidades de ácidos orgânicos, principalmente ácido aconítico, cítrico,
pirúvico, málico, fumárico e chiquímico, além de apresentar compostos fenólicos
derivados do campferol e fenólicos glicosilados. O extrato liofilizado das
inflorescências da B. oleracea L. var. acephala DC. apresentou atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (Bacillus cereus, Bacillus subtilis e
Staphylococcus aureus) e grande atividade antioxidante (SOUSA et al., 2008).
Já nas folhas da B. oleracea L. var. acephala DC., estudos apontam para a
presença dos ácidos fenólicos: gálico, protocatecuico, p-hidroxibenzóico, vanílico,
salicílico, p-cumárico, cafeico, ferúlico e chiquímico, que são ativos contra bactérias
Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, e Bacillus subtilis),
bactérias Gram-negativas (Moraxella catarrhalis) e contra fungos (fungos Candida
tropicali e Candida albicans) (AYAZ et al., 2008).
Também é possível observar a presença de vários aminoácidos: glutamato,
prolina, aspartato, leucina, lisina, valina, arginina, alanina, tirosina, fenilalanina,
treonina, histidina, serina, glicina e metionina, confirmando a presença de proteínas
na planta. Outro aminoácido, S-metilmetionina, conhecida também como vitamina U,
ocorre normalmente nas brássicas, sendo fisiologicamente ativa atuando com um
fator anti-ulceroso, atuando como agente protetor em úlceras gástricas (KIM, 2003;
PEDROCHE et al., 2004; LISIEWSKA, KMIECIK, KORUS, 2008).
Quanto à presença de flavonóides, podem-se encontrar na couve
principalmente quercetina e campferol, principalmente na forma glicosilada. Tais
flavonóides estão descritos para as mais diversas atividades, principalmente como
antimutagênico e anticarcinogênico. Além disso, Zhang et al. (2003) também aponta
para a presença de um novo flavonóide, um composto desconhecido que parece ser
uma forma metilada da quercetina.
39
O SUS (Sistema Único de Saúde) em seu Programa de Pesquisas de Plantas
Medicinais (PPPM) definiu 74 espécies vegetais destinadas a estudos
farmacológicos pré-clínicos e toxicológicos. O PPPM tem por objetivos, constituir
uma parte essencial das políticas públicas de saúde, meio ambiente,
desenvolvimento econômico e social como um dos elementos fundamentais de
transversalidade na implementação de ações capazes de promover melhorias na
qualidade de vida da população brasileira. Dentre as plantas selecionadas, a
Brassica oleracea é uma das espécies alvo para os estudos do PPPM (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2006).
Figura 3. Modo de uso popular: suco das folhas de Brassica oleracea L.var. acephala DC.
(Fonte: http://www.google.com.br/imagens)
A couve (Brassica oleracea L. var. acephala), também conhecida como
couve-manteiga, couve-branca, couve-galega e couve-mineira, é usada
popularmente contra distúrbios gástricos na forma do suco de suas folhas, se
tomado em jejum (Figura 3). Segundo estudo etnofarmacológico realizado por Silva
et al. (2006), a couve é uma das plantas mais utilizadas para o tratamento de úlceras
e gastrites. Além disso, podemos verificar a crescente utilização da couve através de
uma busca rápida na internet com a palavra chave “suco de couve”. Através desta
busca, podemos observar que aproximadamente 11000 sites relacionam-se com
esse tema.
40
Sendo assim, com base nos dados fitoquímicos e famacológicos
apresentados no gênero, com o incentivo de políticas nacionais para o
desenvolvimento de novos medicamentos e baseado em evidências
etnofarmacológicas, torna-se importante o estudo da atividade gastroprotetora da
Brassica oleracea L. var. acephala DC.
3.3 Fisiopatologia da úlcera e terapia antiúlcera
A humanidade convive com úlceras pépticas desde tempos mais remotos. A
primeira descrição de úlceras pépticas data do século IV a. C., inscrita nos pilares do
templo de Esculápido, em Epidaurus (Grécia), descrevendo de forma mitológica a
origem da doença. Outro fato histórico foi a morte de Marco Aurélio, ilustre
imperador romano, cujo médico, Galeano, concluiu ser por perfuração de úlcera
péptica. A terapia mais antiga contra a úlcera gástrica data do século IX, cuja uma
mistura de solos ricos em sais e leite era responsável pela neutralização do ácido
(BRUNTON, LAZO, PARKER, 2005).
Atualmente, úlceras gástricas e duodenais afetam pessoas em todo o mundo.
Aproximadamente 10% da população mundial são afetadas por esta patologia. O
estilo de vida moderno (estresse, fumo, uso de drogas, má alimentação), colabora
para o aumento da incidência de úlceras pépticas. Somente nos EUA
aproximadamente 4 milhões de pessoas tem úlceras pépticas (duodenal e gástrica)
e, a cada ano, 350 mil novos casos são diagnosticados. Cerca de 100 mil pacientes
são hospitalizados e 3000 morrem anualmente devido à úlcera péptica. Nos EUA,
esta patologia acarreta gastos anuais para o tratamento em torno de 3 bilhões e
meio de dólares. A úlcera péptica gera altos custos aos sistemas de saúde, e muitas
vezes impossibilitam o paciente de manter suas atividades normais (MCINTOSH et
al., 1991; BERSTAD, BERSTAD, BERSTAD, 2002; PETERSEN et al., 1995;
CONTRAN, KUMAR, ROBBINS, 2000; BELAICHE et al., 2002; BRUNTON, LAZO,
PARKER, 2005).
A função do sistema digestório é de obter nutrientes para manter o
funcionamento das células do corpo. O estômago é um reservatório em forma de “J”,
no qual o alimento é embebido pelo suco gástrico, que contém enzimas e ácido
41
clorídrico. Este suco gástrico desdobra os alimentos em substâncias químicas mais
simples, que podem ser absorvidas pela mucosa intestinal (GUYTON, 1988;
KUTCHAI, 1996; FLOCH et al., 2007).
O estômago (Figura 4) é um reservatório composto por uma túnica mucosa,
de cor cizento-avermelhado, composta de uma única camada superficial de células
epiteliais que começa na região da cárdia e se estende até a região do piloro. A
capacidade do estômago é de aproximadamente 1200 mililitros (Enciclopédia
Multimídia do Corpo Humano, 2000; FLOCH et al., 2007).
Figura 4. Secção longitudinal, face ventral do estômago. (Fonte: Enciclopédia Multimídia do Corpo Humano, 2000)
Segundo Crawford (2000), o estômago está dividido em quatro regiões
anatômicas:
a) cárdia: representa a região próxima à junção esofagogástrica;
b) fundo: é a região bulbosa subdiafragmática do estômago, localizado à
esquerda do esôfago, em direção cefálica à entrada do esôfago para o estômago;
c) corpo: é a maior região anatômica interposta entre o fundo e o antro
mais caudal. O início do antro é demarcado por uma linha vertical traçada através da
incisura angular da pequena curvatura do estômago;
d) antro ou porção pilórica: se estende desde o corpo do estômago até o
42
esfíncter pilórico.
Na mucosa (Figura 5), estão associadas diversas células responsáveis pela
produção do suco gástrico, que é formado por secreções parietais ou oxínticas
(ácido clorídrico e fator intrínseco) e não parietais (pépticas ou principais) (muco,
bicarbonato, Na+, K+ e pepsinogênio) (Figura 6) (GUYTON, 1991; JOHNSON,
JOHNSON, 1997; RANG, DALE, RITTER, 2001).
Figura 5. Imagem esquemática das camadas musculares e mucosas do estômago.
(Fonte: Enciclopédia Multimídia do Corpo Humano, 2000)
Por dia, o estômago secreta cerca de dois litros e meio de suco gástrico. As
secreções estomacais dependem de um importante gasto energético e são
reguladas pela via nervosa, via humoral e via hormonal (GUYTON, 1991;
Enciclopédia Multimídia do Corpo Humano, 2000).
A secreção gástrica é responsável por iniciar o processo de digestão de
proteínas. Porém, o estômago é constituído da maior parte de músculo liso, que é
formado por proteínas, fazendo com que toda a superfície do estômago seja
recoberto por uma mucosa, com a função de proteger o estômago da própria ação
digestiva (GUYTON, 1988).
43
Figura 6. Representação esquemática dos tipos celulares presentes na mucosa gástrica .
(Fonte: SCHAUF, MOFFETT, MOFFETT, 1998)
O surgimento de úlceras pépticas e desordens gástricas é um processo que
não é totalmente compreendido. Acredita-se que quando este sistema de proteção
se torna deficiente, a mucosa e o epitélio ficam expostos aos fatores agressivos
(secreção do suco gástrico), que geram lesões, inflamação e necrose. Ocorre um
desequíbrio entre os fatores agressivos e os mecanismos protetores da mucosa
(BRZOZOWSKI, 2003; TULASSAY, HERSZE’NYI, 2010).
Segundo o National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
(2004), a úlcera péptica é definida como uma ferida no revestimento do estômago ou
do duodeno. Esta lesão, pode se estender da camada mucosa até a camada
muscular, porém, geralmente são lesões crônicas e solitárias. As desordens
gástricas também envolvem dispepsias e gastrites, que podem ser tanto agudas
quanto crônicas. A dispepsia é um grupo de sintomas do trato digestório, geralmente
associado a causas orgânicas, mas em geral é caracterizada pelo aumento da
secreção ácida. Já a gastrite é caracterizada como a inflamação do revestimento do
estômago, podendo ser aguda ou crônica, podendo também evoluir para um quadro
ulcerativo (LIPOF, SHAPIRO, KOZOL, 2006; MAHADEVA; GOH 2006).
As desordens gástricas, gastrites e úlceras podem estar associada a fatores
endógenos, tais como predisposição genética, ácido, pepsina, secreção biliar, e
44
fatores endógenos, relacionados com as condições de vida, tais como estresse,
fumo, álcool, uso de drogas e medicamentos, uso de alimentos nocivos ou infecção
por Helicobacter pylori (HIRSCHOWITZ et al., 1995; WOLFE, SANCHS, 2000;
WALLACE, MILLER, 2000; BRUNTON, LAZO, PARKER, 2005).
A infecção crônica da mucosa gástrica pela bactéria Helicobacter pylori é a
infecção mais comum no mundo inteiro, apresentando uma taxa de 40% em países
desenvolvidos e 80% nos países em desenvolvimento. Atualmente, grandes
esforços científicos estão sendo realizados para o controle da Helicobacter pylori,
visto que a sua infecção é de difícil tratamento, por muitas vezes recorrente,
utilizando-se antibióticos específicos e inibidores de bomba, como por exemplo
amoxicilina e claritromicina, associada a esomeprazol (LEE et al., 1995; SIQUEIRA
et al., 2007; SOUZA et al., 2009).
A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes potencialmente
irritantes, tais como ácidos, pepsina, ingredientes alimentares, bactérias e drogas.
Estes implicam na patogênese da úlcera, incluindo aumento da secreção gástrica,
diminuição do fluxo sangüíneo gástrico, supressão de produção de prostaglandinas
endógenas, inibição da proliferação de células da mucosa e alteração da motilidade
gástrica (KONTUREK et al.,1998; PESKAR, MARICIC, 1998; KWIECIEN,
BRZOZOWSKI, KONTUREK, 2002; TULASSAY, HERSZE’NYI, 2010).
O fluxo sanguíneo protege a mucosa gástrica por fornecer oxigênio,
bicarbonato e nutrientes, além de remover o dióxido de carbono, íons hidrogênio e
difundir toxinas do lúmen gástrico. A diminuição do fluxo sanguíneo leva a hipóxia e
hipersecreção ácida, devido ao acúmulo de íons hidrogênio, sendo este um fator
importante da patogênese da úlcera gástrica. Além disso, EROs e o NO podem estar
envolvidos nas condições fisiopatológicas das desordens gástricas. Produtos do
metabolismo do ácido araquidônico, elementos celulares e eventos relacionados
com as reações de oxidação (formação de peróxidos) são responsáveis pelo
aumento da inflamação, nitração de resíduos de proteínas (principalmente no
aminoácido tirosina), depleção de reservas energéticas mitocondriais e dano sobre a
estrutura do DNA (SORBYE, SVANES, 1994; BECKMAN, KOPPENOL, 1996;
REPETTO, LLESUY, 2002).
O muco é secretado por células secretoras encontradas entre as células
superficiais, por toda a mucosa gástrica (Figura 5). No muco estão presentes íons
bicarbonato, que geram um gradiente de pH 6-7 na mucosa gástrica, protegendo-a
45
do pH 1-2 presente na luz estomacal, formando uma camada inerte, como se fosse
um gel, protegendo a mucosa do suco gástrico. Acredita-se que os distúrbios nas
funções secretórias descritas acima estejam envolvidos na patologia da úlcera. As
células parietais são estimuladas pela histamina que provém de mastócitos (ou
células semelhantes), e esta, atua em receptores H2, ocorrendo um aumento da
ação da gastrina e da acetilcolina (TULASSAY, HERSZE’NYI, 2010).
Além do muco e do fluxo sanguíneo, o ácido gástrico também constitui uma
defesa da mucosa, pois reduz a possibilidade de colonização por bactérias. O
epitélio, que se encontra logo após a camada de muco é uma barreira protetora
capaz de se reparar rapidamente, possuindo células de rápida proliferação. Existem
ainda a linha de defesa do sistema imune, como mástócitos, macrófagos e
imunoglobulinas que reconhecem a entrada de invasores na mucosa e produzem
uma resposta inflamatória (WALLACE, GRANGER, 1996; WALLACE 2001).
Uma das mais importantes funções do estomago é a produção de ácido,
responsável pela digestão de proteínas, absorção de ferro, cálcio e vitamina B12. A
secreção de ácido (Figura 7) é mediada por gastrina, um hormônio peptídico
produzido pelas células G encontradas no antro gástrico e no duodeno atua sobre os
receptores CCK-2, estimulado a secreção de HCl pelas células parietais, e
aumentando indiretamente a secreção de pepsinogênio, estimulando o fluxo
sanguíneo e a motilidade gástrica. A gastrina regula também o crescimento de
células gástrica responsáveis na manutenção da integridade do tecido estomacal. A
acetilcolina estimula receptores muscarínicos específicos, já a histamina estimula
receptores histaminérgicos do tipo H2 presentes na superfície das células parietais,
também estimulando a secreção de ácido (POMMIER et al., 2003; SCHUBERT,
2004).
46
Figura 7. Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo estômago.
(Fonte: OLBE, CARLSSON, LINDBERG, 1998)
O tratamento das desordens gástricas, gastrites e úlceras, por muitos anos,
foi baseada na supressão da secreção ácida. Porém, pesquisas recentes revelam
que os fatores envolvidos na defesa participam do controle da acidez, sendo que
atualmente há um grande interesse pelos mecanismos reguladores e cicatrizantes
envolvidos na resolução do quadro ulcerativo (DAJANI, KLAMUT, 2000; WALLACE,
2005).
Assim, fármacos utilizados no tratamento da úlcera gástrica agem por um dos
seguintes mecanismos:
1) Fármacos que inibem ou neutralizam a secreção de ácido gástrico (terapia
anti-secretória). Nesta classe estão agrupados:
a) antagonistas de receptores H2 da histamina (cimetidina, ranitidina);
b) inibidores da bomba de prótons, (H+-K+)-ATPase, que constitui a fase final
da secreção ácida (omeprazol, pantoprazol);
c) antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio,
trissilicato de magnésio, bicarbonato de sódio).
2) Fármacos que protegem a mucosa (quelato de bismuto, sucralgato)
(RANG, DALE, RITTER, 2001; BRUNTON, LAZO, PARKER, 2005).
47
Na terapia, recomenda-se a associação de uma droga que atue inibindo a
secreção de ácido e/ou protegendo a mucosa e associações de antibióticos, tais
como amoxicilina e clindamicina, para o tratamento desta patologia (RANG, DALE,
RITTER, 2001).
Porém, a importância clínica das úlceras pépticas e a inexistência de um
medicamento eficaz, ausente de efeitos colaterais, levam a procura e
desenvolvimento de novas terapias capazes de aliviar os sintomas e até mesmo
curar as desordens gástricas (LA VECCHIA, TAVANI, 2002; RAGHUNATH et al.,
2005).
Assim, tornam-se necessários estudos para uma melhor compreensão da
fisiopatologia envolvida nos distúrbios do sistema digestório, onde observou-se que
uma grande variedade de substâncias químicas derivadas de produtos vegetais
ativas em diversos modelos de indução de úlceras, são provenientes alimentos,
podendo ser uma fonte promissora na descoberta de seus princípios ativos,
possibilitando a descoberta de novas fontes terapêuticas para as úlceras pépticas,
onde a terapia possa estar baseadas em mecanismos reguladores da homeostase
do tecido estomacal (SCHMEDA-HIRSCHAMANN, YESILADA, 2005).
48
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Análise fitoquímica de Brassica oleracea L. var. acephala DC.
4.1.1 Coleta e preparo do material vegetal
As folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. foram coletadas em
setembro de 2008, no município de Rio das Antas, SC, em horta na propriedade do
Sr. Alterino Lemos ( 26 ° 57'31 .96 "N, 51 ° 0'23 .76" W, a 968 metros acima do nível
do mar). Um exemplar foi submetido à análise botânica no Herbário Barbosa
Rodrigues, depositada e registrada sob o número 52747, sendo sua taxonomia
validada pelo botânico Dr. Amaury Antônio Silva Junior, da Empresa de Pesquisa
Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina – EPAGRI – Itajaí, SC.
As folhas foram secas em estufa de ar quente e circulante a 40°C, e após
secagem foram moídas em triturador para fornecer um pó fino, para posterior
determinação do peso seco.
4.1.2 Preparação do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L.
var. acephala DC.
O pó das folhas (700 g) foi submetido à maceração em solução hidroalcoólica
a 50%, durante 10 dias. Após filtração, a solução foi submetida à evaporação do
solvente em rota-evaporador à pressão reduzida (50 ºC), submetido à secura sob
sílica ativada e determinado o seu rendimento.
4.1.3 Fracionamento do extrato hidroalcoólico das folhas Brassica oleracea L.
var. acephala DC.
O fracionamento do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var.
acephala DC. (EHA) foi realizado através da partição líquido-líquido com solventes
orgânicos de polaridade crescente, obtendo-se as seguintes frações: hexânica (FH),
clorofórmica (FC), acetato de etila (FAE) e aquosa (FAQ) (NIERO et al., 2003;
49
SIMÕES et al., 2003; MALHEIROS et al., 2010). O processo de partição líquido-
líquido foi realizado conforme demonstrado na Figura 8.
Figura 8. Fluxograma do processo de partição líquido-líquido para a obtenção das frações.
(Fonte: adaptado de MALHEIROS et al., 2010)
4.1.4 Análise cromatográfica
a. Cromatografia em camada delgada
Para avaliação fitoquímica preliminar dos principais constituintes químicos
presentes no EHA, amostras do extrato e das frações foram analisadas através
cromatografia de camada delgada (CCD), utilizando-se sílica gel 60 F254 (Merck)
como fase estacionária, e uma mistura de solventes (hexano:acetato de etila e
clorofórmio:metanol, em diferentes proporções, metanol 100% e FDM (acetato de
etila, 25%: acetona 8%: metanol 3%: água 1%)), como fase móvel.
Cerca de 10 µL das amostras foram aplicadas nas cromatoplacas com auxílio
de um capilar, sendo reveladas em câmara de UV (254/365 nm) e/ou com reagentes
50
cromóforos específicos, como anisaldeído sulfúrico, cloreto férrico e ácido p-
aminobenzoico. Para efeito comparativo, alguns padrões de terpenos, flavonóides,
esteróides e açúcares foram utilizados.
b. Cromatografia em coluna aberta
Na tentativa de isolar as substâncias bioativas, as frações mais ativas
farmacologicamente (FC e FAQ) foram submetidas a purificação através de
cromatografia em coluna aberta (CCA).
Neste aspecto, a FC (740 mg) foi preparada em forma de “pastilha” e
empacotada em sílica gel (0,063-0,200 mm, Merck) como fase estacionária e eluida
inicialmente com hexano 100% (200 mL), com 5% de aumento da polaridade
adicionando-se acetato de etila, a cada 100 mL, até eluir com acetato de etila 100%
(200 mL). Neste ponto, a polaridade foi aumentada adicionando-se 10% de metanol
até a eluição completa com metanol 100%. As subfrações foram recolhidas em
frascos de 10 mL e reunidas de acordo com o perfil semelhante em CCD. As
subfrações três a sete foram testadas farmacologicamente.
De maneira similar, da FAQ (6 g) foi empacotada conforme descrito acima e
eluida inicialmente com clorofórmio 100% (200 mL), aumentando-se a polaridade
adicionando-se metanol (20%) a cada 100 mL até a proporção CHCl3:MeOH 1:1.
Neste ponto, a fase móvel foi alterada para uma mistura de solventes chamado de
FDM (acetato de etila, 25%: acetona 8%: metanol 3%: água 1%). Foram eluidos 300
mL desta mistura. As subfrações foram recolhidas em frascos de 10 mL e reunidas
através do perfil semelhante em CCD, determinada sua massa e testadas
farmacologicamente.
c. Análise em cromatografia gasosa acoplado a detector de ionização de chama
(CGAR-DIC)
Para a análise cromatográfica em cromatógrafo gasoso de alta resolução
associado a detector por ionização de chama (CGAR-DIC) das FH, FC e FAE, as
amostras foram preparadas na concentração de 1mg/mL, filtrada através de filtro
analítico millipore de 0,45 micrometros e 10 µL destas soluções foram injetados
diretamente no sistema cromatográfico no modo split 1:3. O equipamento utilizado
51
foi um cromatógrafo Hewlett Packard, modelo CG 6890N, provido de um detector de
ionização de chama (DIC) e equipado com uma coluna capilar HP-5, com um
diâmetro interno de 0,32 mm, comprimento de 30 m, espessura do filme de
dimetilpolioxano de 0,25 mm.
A programação que possibilitou melhor resolução cromatográfica dos picos de
interesse foi a seguinte condição de análise: fluxo de hidrogênio de 2mL/min, de 120
°C até 150 °C, aumentando a temperatura em 1,5 °C/min; de 150 °C até 180 °C,
aumentando a temperatura em 20 °C/min; e mantendo-se a temperatura em 180 °C
por 5 min. A temperatura do injetor e do detector foram de 210 e 250 °C,
respectivamente.
4.2 Animais e ensaios farmacológicos
As concentrações estabelecidas nos experimentos para a avaliação da
atividade gastroprotetora foram baseadas em estudos preliminares realizados em
nosso Laboratório. No estudo farmacológico de plantas utilizam-se normalmente
concentrações crescentes correlacionadas para possível observação da relação
dose-resposta. Neste estudo foi avaliado o efeito do EHA utilizando-se as
concentrações de 25, 50 e 100 mg/kg, sendo que, após a observação das respostas
do extrato e frações, foram ajustadas as concentrações de 25, 50 e 100 mg/kg para
o FC e FAQ, e de 50 mg/kg para as subfrações.
4.2.1 Animais
Os animais foram mantidos segundo as normas e cuidados com animais de
laboratório, bem estar e biossegurança na experimentação, conforme descritas na
Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as diretrizes da Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Os experimentos foram autorizadas
e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade do Vale do
Itajaí, sob o número de parecer CEP 0369/09a (Anexo A) (BRASIL, 2008;
SBCAL/COBEA, 1991).
Nos ensaios biológicos foram utilizados ratos fêmeos Wistar, pesando 180-
52
280 g e camundongos machos e fêmeos Swiss, pesando entre 25-50 g provenientes
do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram
mantidos em caixas de polipropileno, em sala com temperatura (25 ºC) e ciclo
controlados (claro/escuro 12 horas cada), tendo ração e água ad libitum. Vinte horas
anteriores aos experimentos, os animais foram mantidos em jejum e livre acesso à
água, sendo adicionada a caixa uma grade para inibir a coprofagia.
4.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa
A toxicidade aguda do EHA for realizada conforme descrito no Guideline for
Testing of Chemicals – Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure (OECD 420,
2001) e desenvolvido seguindo normas de cuidados com animais de laboratório,
bem estar e biossegurança na experimentação animal descritas na Lei n. 11.794, de
8 de outubro de 2008, e segundo as diretrizes pela Sociedade Brasileira de Ciência
em Animais de Laboratório (BRASIL, 2008; SBCAL/COBEA, 1991).
Os animais (ratos Wistar fêmeas, 180-300 g) foram divididos em 02 grupos de
03 animais cada e mantidos em jejum de 12 horas. O EHA foi administrado por via
oral na dose de 2 g/kg. O grupo controle recebeu salina (3 mL/kg).
Após a administração do EHA os animais foram observados individualmente,
nos períodos de 10 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h e 24 h, e, a partir de então,
periodicamente, até o décimo quarto dia, sendo pesados nos tempos 0, 7 e 14 dias
após administração do EHA.
As observações das alterações comportamentais sistemáticas foram
realizadas de acordo com o “screening” hipocrático: atividade geral, frêmito vocal,
irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto cauda, contorção, posição do trem
posterior, reflexo de endireitamento, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia,
reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia,
lacrimação, ptose, micção, defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose,
hiperemia e morte (MALONE, ROBICHAUD, 1962; MALONE, 1977).
A intensidade dos eventos foi semi-quantificada de zero a 4, correspondendo,
respectivamente a: ausente, raro, pouco, moderado e intenso de acordo com o
modelo proposto por Malone e Robichaud 1962 e Malone 1977.
No 14º dia, os animais foram anestesiados e mortos por deslocamento
53
cervical. Em seguida, foi realizada a necropsia com avaliação das características
macroscópicas dos principais órgãos, tais como pulmões, rins, intestinos, fígado,
útero, baço e coração, e quando observadas alterações macroscópicas, os órgãos
foram encaminhados para exames histopatológicos.
4.4 Avaliação da atividade gastroprotetora
Na avaliação da atividade gastroprotetora, foram utilizados experimentos que
procurassem mimetizar os distúrbios gástricos em humanos, baseados em fatores
etiológicos da doença no homem, como por exemplo, o aumento do suco gástrico,
uso de drogas anti-inflamatórias não esteroidais e uso abusivo de bebidas
alcoólicas. Cada experimento apresenta seus respectivos controles positivos
(omeprazol, cimetidina ou carbenoxolona) e negativo (veículo ou indometacina),
dependendo da necessidade de cada modelo.
4.4.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl
A metodologia utilizada neste experimento foi a descrita por Mizui e Doteuchi
(1983), com algumas modificações. Os camundongos foram submetidos inicialmente
a jejum de vinte horas e, após esse período, divididos em diferentes grupos (n=6),
pré-tratados por via oral com omeprazol (controle positivo – 30 mg/kg), veículo
(controle negativo – água destilada), ou EHA nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg. Para
avaliação da fração mais ativa, inicialmente testou-se a FH, a FC, a FAE e a FAQ na
dose de 50 mg/kg. Após a comprovação que as frações mais ativas foram a FC e a
FAQ, estas foram testadas na dose de 25, 50 e 100 mg/kg. As subfrações SFC(3),
SFC(4), SFC(5), SFC(6), SFC(7), SFAQ(3), SFAQ(4), SFAQ(5), SFAQ(6) e
SFAQ(7), que apresentaram melhor perfil fitoquímico também foram testadas na
dose de 50 mg/kg.
Após uma hora e meia dos tratamentos, foram administrados por via oral aos
animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) uma solução de EtOH/HCl (60%/0,3 M) (agente
lesivo). Uma hora e meia após a administração do agente lesivo, os animais foram
mortos por deslocamento cervical, em seguida, os estômagos foram retirados e
abertos ao longo da curvatura maior, sendo esticados em placas de parafina. As
54
imagens foram digitalizadas e analisadas por software de análise de imagens
específico, a fim de determinar-se o número de lesões e o seu tamanho.
Posteriormente, foi realizada a determinação da área total de lesão (mm2), área
relativa lesada (%) e índice de lesão ulcerativa (ULI) calculado através da
severidade das lesões da mucosa gástrica, classificadas como:
a) tipo 1 (T1): área da úlcera < 1 mm2;
b) tipo 2 (T2): área da úlcera de 1-3 mm2; e
c) tipo 3 (T3): área da úlcera > 3 mm2.
O índice lesão ulcerativa (ULI) foi determinado como:
��� � �1 � � ��2 � �� � �3 ���
O índice de cura (IC) foi determinado como:
�� � 100 ������������ � 100�̅���������� !
Os resultados foram expressos em quantidade total de área lesada (mm2),
quantidade relativa de área lesada (%), índice de lesão ulcerativa (ULI) e índice de
cura (IC – %).
4.4.2 Modelo de úlcera aguda induzida por antiinflamatório não-esteroidal
associada à estimulação parassimpaticomimética
A metodologia utilizada foi descrita por Rainsford (1980), com algumas
modificações. Após vinte horas de jejum, os camundongos foram divididos em
diferentes grupos (n=6), e pré-tratados por via oral com cimetidina (controle positivo
– 100 mg/kg), veículo (controle negativo – água destilada), EHA nas doses de 25, 50
ou 100 mg/kg; e FC ou FAQ nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg.
Após uma hora e meia da administração dos tratamentos, os animais
receberam 100 mg/kg de indometacina (v.o.), associada com a administração
intraperitonial (i.p.) de um estimulante parassimpaticomimético, o betanecol, na dose
55
de 5 mg/kg, preparada em solução fisiológica antes do uso.
Passadas doze horas após a administração de indometacina os animais
foram mortos por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao
longo da grande curvatura e esticados. As imagens foram digitalizadas e analisadas
por software de análise de imagens específico, a fim de determinar-se o número de
lesões e o tamanho destas.
Posteriormente, foi realizada a determinação da quantidade total de área
lesada (mm2), quantidade relativa de área lesada (%), índice de lesão ulcerativa
(ULI) e índice de cura (IC - %), conforme descrito no item 4.4.1.
4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético (ensaio curativo)
A metodologia utilizada foi descrita por Takagi, Okabe e Saziki, (1969), com
algumas modificações. Antes da indução da úlcera, os camundongos sofreram um
período de adaptação contra o estresse que a administração das doses e a
manipulação causa. Os animais foram submetidos a restrição alimentar por 1 hora
diária (16:00 às 17:00), sendo mantido o livre acesso à água. Após esse período de
restrição alimentar, foi administrado aos animais 0,1 mL/10 g (peso de animal) de
água durante três dias.
Após o período de adaptação, os animais foram mantidos em jejum de vinte
horas com livre acesso à água. Posteriormente, os animais foram anestesiados com
uma mistura anestésica de xilazina (5 mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10g de
peso de animal) e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise
xifóide. Após a exposição do estômago, foi injetado na camada subserosa da parede
externa do estômago 20 µL de solução de ácido acético 30%. Um grupo normal foi
operado, e injetado 20 µL de salina (falso operado).
O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do
líquido injetado e lavado delicadamente com salina, sendo que a parede abdominal
foi posteriormente suturada. Após dois dias de recuperação dos animais, iniciou-se o
tratamento. Os animais operados com a administração o ácido ácético foram
divididos em diferentes grupos (n=6), classificados de acordo com o seu tratamento:
veículo (controle negativo – água destilada), cimetidina (controle positivo – 100
mg/kg), EHA (100 mg/kg), FC (100 mg/kg) ou FAQ (100 mg/kg). Aos animais falso
56
operados (controle normal, n=6) também foi administrado o veículo.
Diariamente, os animais foram pesados para a determinação da dose
administrada por via oral. No oitavo dia, ao final do período de tratamento, os
animais foram mortos, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande
curvatura e esticados. Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas
por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se se houve
regressão da lesão nos tratamentos quando comparados com o controle, sendo
realizada a determinação da quantidade total de área lesada (mm2), quantidade
relativa de área lesada (%), e índice de cura (IC – %), calculado de acordo com a
equação a seguir:
�� � 100 ��"�������� � 100�̅"�������� !
Onde:
ATLTratado: Área total de lesão no grupo tratado
ATLControle: Área total de lesão no grupo controle
4.4.4 Análise histopatológica
Além de analisar a regressão das lesões de forma macroscópica no
tratamento das úlceras crônicas induzidas por ácido acético, é importante analisar
de forma microscópica os aspectos histológicos e o processo de cicatrização
envolvido. Para isto, depois da digitalização das imagens dos estômagos, a área
onde a lesão se encontrava foi separada das demais partes do estômago, e
submetida à fixação em formalina (10%) durante o período mínimo de vinte e quatro
horas. As amostras foram submetidas à técnica histológica clássica, onde os blocos
foram cortados em 4 µm de espessura em micrótomo (Bright 5040) de maneira
semi-seriada, onde foi coletado todo o corte múltiplo de 10. As lâminas cortadas por
esse método semi-seriado foram submetidas à coloração de hematoxilina e eosina,
de acordo com o método descrito por Junqueira e Carneiro (1995) e Junqueira e
57
Junqueira (1985). Foram obtidas 5 lâminas de cada peça.
A análise morfométrica foi determinada através do método descrito por
Ishihara e Ito (2002), com algumas modificações. A média em 10 campos diferentes
da distância entre a camada submuscular da mucosa até o lúmen do estômago foi
determinada em microscópico óptico de sistema invertido Olympus IX51, acoplado a
câmera digital Olympus DP-25, controlado por software Olympus DP2-BSW, versão
2.2, para cada lâmina. Durante a determinação da distância, cada corte recebia uma
classificação, baseada nos critérios de análise histológica, realizada de acordo com
o método descrito por Dokmeci et al. (2005), onde:
0: mucosa normal;
1: dano em célula epitelial;
2: rompimento glandular, vasoconstrição ou edema em mucosa superior;
3: rompimento de mucosa, vasoconstrição ou edema em mucosa mediana;
4: dano na mucosa extenso, vasoconstrição ou edema em toda a mucosa.
A moda (o valor de maior repetição) para cada grupo foi considerado como o
índice de úlcera histológico.
4.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica
4.5.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro)
Este experimento foi realizado de acordo com o método descrito por Shay et
al. (1945), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum por
vinte horas com livre acesso a água, e divididos em diferentes grupos (n=6). Em
seguida foram anestesiados com uma mistura anestésica a base de xilazina (5
mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10g de peso de animal) e submetidos a uma
incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a
administração por via intraduodenal dos diferentes tratamentos: cimetidina (controle
positivo – 100 mg/kg), veículo (controle negativo – salina), EHA (25, 50 ou 100
mg/kg); FC ou FAQ (25, 50 e 100 mg/kg).
Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que quatro horas
58
após a cirurgia, os animais foram mortos por deslocamento cervical. As incisões
foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do
conteúdo gástrico), o estômago foi retirado para determinação do conteúdo
estomacal, pH e concentração de íons hidrogênio.
Após a determinação do volume, foram adicionados 5 mL de água destilada à
amostra, sendo posteriormente centrifugada por 10 min a 3000 rpm. No
sobrenadante foi determinado o pH e titulado com solução de hidróxido de sódio a
0,01 N, utilizando-se fenolftaleína como indicador.
Os resultados foram expressos em mL (volume), pH e mEq/L/4h
(concentração de íons hidrogênio).
4.5.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica
O modelo utilizado neste experimento foi descrito por Sun, Matsumoto e
Yamada (1991), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum
por vinte horas com livre acesso a água, e divididos em diferentes grupos (n=6). Em
seguida foram anestesiados com uma mistura anestésica a base de xilazina (5
mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) (0,1 mL/10g de peso de animal) e submetidos a uma
incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e
administração intraduodenal dos diferentes tratamentos: carbenoxolona (controle
positivo – 200 mg/kg), indometacina (controle negativo – 100 mg/kg), EHA (25, 50 e
100 mg/kg); ou FC ou FAQ (25, 50 e 100 mg/kg).
Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que quatro horas
após a cirurgia os animais foram mortos por deslocamento cervical. As incisões
foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia (para evitar a perda do
conteúdo gástrico) o estômago foi retirado, cuidadosamente lavado em salina, foi
pesado em balança analítica, sendo posteriormente acondicionado em 10 mL de
solução de Alcian Blue (Alcian Blue 0,02%, sacarose 0,16 M, acetato de sódio 0,05
M; pH 5,8 a 20 ºC) por 24 horas.
Após este período, o tecido estomacal foi retirado, e o líquido foi submetido a
centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos. A leitura do sobrenadante foi realizada
através de leitor de microplaca Asys Expert Plus UV (no comprimento de onda a 620
nm), em triplicata. As leituras foram interpoladas em equação da curva padrão de
59
solução de Alcian Blue (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128 µg/mL), sendo os resultados
calculados sobre a média das leituras. Os resultados foram expressos em
quantidade de corante aderido ao muco (mg) por grama de tecido (g).
4.6 Mecanismos de ação antiúlcera
4.6.1 Avaliação do papel do Óxido Nítrico (NO) in vivo
O método utilizado foi descrito primeiramente por Arrieta et al. (2003), com
algumas modificações. O L-NAME (N-nitro-L-arginina metil éster), é uma substância
que tem a capacidade de bloquear a enzima óxido nítrico sintase (NOS),
responsável pela produção de óxido nítrico (NO), que pode estar relacionado com os
processos gastroprotetores.
Após vinte horas de jejum, foram separados nos seguintes grupos: veículo
(água destilada) + L-NAME, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200
mg/kg) + L-NAME, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, EHA (100 mg/kg) + L-
NAME, EHA (100 mg/kg) + salina, FC (100 mg/kg) + L-NAME, FC (100 mg/kg) +
salina, FAQ (100 mg/kg) + L-NAME e FAQ (100 mg/kg) + salina.
Os animais foram tratados com L-NAME na dose de 70 mg/kg, via i. p., sendo
que os outros animais receberam salina por via também por via i. p.. Após trinta
minutos dos tratamentos, administraram-se aos diferentes grupos os seus
respectivos tratamentos por v. o.. Passadas uma hora e meia após a administração
dos tratamentos foi dado aos animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) uma solução de
EtOH/HCl (60%/0,3 M) (agente lesivo).
Após uma hora e meia da administração do agente lesivo, os animais foram
mortos, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura; esticados.
Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de
análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho
destas, conforme descrito anteriormente no item 4.4.1, porém também comparando-
se os tratamentos entre o L-NAME e salina através de teste t.
60
4.6.2 Avaliação do papel dos grupos sulfidrílicos (SH) in vivo
Para a avaliação dos grupamentos sulfidrilas na gastroproteção foi adotado o
modelo de Matsuda, Yoshikawa (1999). O NEM (N-metil-maleimida), é uma
substância que tem a capacidade de quelar os compostos sulfidrilas, que participam
dos mecanismos antioxidantes relacionados com a gastroproteção.
Após vinte horas de jejum, foram separados nos seguintes grupos: veículo
(água destilada) + NEM, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200
mg/kg) + NEM, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, EHA (100 mg/kg) + NEM, EHA
(100 mg/kg) + salina, FC (100 mg/kg) + NEM, FC (100 mg/kg) + salina, FAQ (100
mg/kg) + NEM e FAQ (100 mg/kg) + salina.
Os animais foram tratados com NEM na dose de 10 mg/kg, via i. p., sendo
que os outros animais receberam salina por via i. p.. Após trinta minutos,
administraram-se aos diferentes grupos os seus respectivos tratamentos por v. o..
Passadas uma hora e meia após a administração dos tratamentos foi dado aos
animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) uma solução de EtOH/HCl (60%/0,3 M) (agente
lesivo).
Após uma hora e meia da administração do agente lesivo, os animais foram
mortos, e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura; esticados.
Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de
análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho
destas, conforme descrito anteriormente no item 4.4.1, porém também comparando-
se os tratamentos entre o NEM e salina através de teste t.
61
5 RESULTADOS
5.1 Análise fitoquímica preliminar do extrato hidroalcoólico das folhas,
frações e subfrações de Brassica oleracea L. var. acephala DC.
O pó fino das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (700 g)
apresentou um rendimento de 43,78% (306,47 g) de extrato úmido. Este extrato
úmido apresentou um percentual de massa seca de 55,45% (165,94 g). 150 g de
extrato úmido foram submetidos ao processo de partição líquido-líquido para a
obtenção das frações hexânica (FH), clorofórmica (FC), acetato de etila (FAE) e
aquosa (FAQ). Após esse procedimento, os rendimentos obtidos foram de 2,65 g
(1,76%), 2,32 g (1,55%), 2,16 g (1,44%) e 136,75 g (91,16%), respectivamente. A
fração aquosa apresentou um percentual de massa sólida de 77,99% (106,65 g). As
frações que se apresentaram mais ativas nos ensaios farmacológicos (FC e FAQ)
foram submetidas à cromatografia em coluna aberta.
Da coluna da FC (740 mg) foram coletadas 205 frações, que após
comparação de seu perfil fitoquímico através de CCD, foram reunidas por sua
similaridade, resultando em sete novas subfrações. Os rendimentos podem ser
observados na Tabela 1.
Tabela 1. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da fração clorofórmica.
Subfrações Reunião Massa (mg) Rendimento (%) Subfração SFC (1) 1-20 4,90 0,66 Subfração SFC (2) 21-30 12,00 1,62 Subfração SFC (3) 31-65 10,18 1,37 Subfração SFC (4) 66-85 8,80 1,19 Subfração SFC (5) 86-110 16,80 2,27 Subfração SFC (6) 111-150 16,30 2,20 Subfração SFC (7) 151-205 282,50 38,17
Da mesma forma, a cromatografia de coluna aberta da FAQ (6 g) rendeu 69
frações, que após comparação através de CCD de seu perfil fitoquímico, foram
reunidas por sua similaridade, resultando em sete novas subfrações. Os
rendimentos podem ser observados na Tabela 2.
62
Tabela 2. Rendimentos das subfrações da cromatografia em coluna aberta da fração aquosa.
Subfrações Reunião Massa (mg) Rendimento (%) Subfração SFAQ (1) 1-20 41,73 0,69 Subfração SFAQ (2) 21-24 76,53 1,27 Subfração SFAQ (3) 25-30 515,80 8,60 Subfração SFAQ (4) 31-27 374,90 6,24 Subfração SFAQ (5) 28-40 590,90 9,85 Subfração SFAQ (6) 41-46 185,40 3,05 Subfração SFAQ (7) 47-69 1975,70 32,92
5.2 Análise fitoquímica
Buscando-se verificar a presença de classes de compostos nas FC e FAQ de
B. oleracea L. var. acephala DC., diferentes sistemas de eluentes e reveladores
específicos juntamente com alguns padrões como α-β-amirina, lupeol, estigmasterol,
espinasterol, quercetina, rutina, luteolina e sacarose foram utilizados. Como
reveladores específicos o cloreto férrico (compostos fenólicos), anisaldeído sulfúrico
(esteróides e terpenóides) e ácido p-aminobenzoico (açúcares). Como fase móvel
foram utilizados os sistemas de solventes hexano: acetona (7:3), ou
clorofórmio:metanol (9:1) e (6:4).
Como pode ser observado na Figura 9 A, não foi evidenciada a presença de
nenhum dos padrões de flavonóides na fração clorofórmica e aquosa. No entanto, é
possível observar a presença de outros compostos fenólicos, tendo em vista a
coloração específica observada quando utilizado o cloreto férrico como revelador
(Figura 9 A e C). Da mesma forma, não foi possível observar a presença de nenhum
dos padrões de terpenóides e esteróides. Por outro lado, é observada a presença de
outros compostos desta classe quando revelados com anisaldeído sulfúrico (Figura
9 B e D). Além disso, foi possível verificar a presença de açúcares na FAQ quando
utilizado o revelador ácido p-aminobenzoico (Figura 9 E) (UGAZ, 1994).
63
Figura 9. Perfil cromatográfico: A) 1: α-β-amirina; 2: lupeol; 3: FC; 4: espinasterol; 5: estigmasterol. Revelador: cloreto férrico. B) 1: α-β-amirina; 2: lupeol; 3: FC; 4: espinasterol; 5: estigmasterol. Revelador: anisaldeído sulfúrico. C) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: cloreto férrico. D) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: anisaldeído sulfúrico. E) 1: quercetina; 2: rutina; 3: FAQ; 4: luteolina; 5: sacarose. Revelador: ácido p-aminobenzoico.
Considerando que as FC e FAQ apresentaram promissora atividade
gastroprotetora, foram submetidas à cromatografia em coluna aberta, na tentativa de
buscar as possíveis substâncias responsáveis pela gastroproteção. Neste aspecto,
as subfrações SFC(3), SFC(4), SFC(5), SFC(6) e SFC(7), obtidas da fração
clorofórmica, e as SFAQ(3), SFAQ(4), SFAQ(5), SFAQ (6), e SFAQ(7) obtidas da
fração aquosa, apresentaram melhor perfil fitoquímico e foram posteriormente
submetidas aos testes farmacológicos. A Figura 10 A-C mostra o perfil fitoquímico
das SFC (6) e SFAQ (6), onde pode ser observado um bom grau de pureza,
sugerindo que estas substâncias podem ser responsáveis pelo efeito gastroprotetor
encontrado. Neste sentido, estas frações encontram-se em fase de elucidação
estrutural.
A B C D E
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
64
Figura 10. Perfil cromatográfico: A) CCD da SFC (6) (111-150), eluída com Hex: Ac (7:3) revelado com anisaldeído. B) CCD da SFAQ (6) (41-46) eluída com CHCl3:MeOH (7:3) revelado com anisaldeído. C) CCD da SFAQ (6) (41-46) eluída com CHCl3:MeOH (7:3) revelado com ácido p-aminobenzoico.
Levando-se em consideração que todas as frações obtidas do EHA
apresentaram pequena atividade gastroprotetora, uma análise por cromatografia
gasosa foi efetuada na tentativa de observar diferenças no perfil fitoquímico das
frações mais apolares. Conforme pode ser observado na Figura 11, a fração
clorofórmica apresenta diferenças significativas, com sinais em tempo de retenção,
em 9 e 11,6 min, sugerindo que tais substâncias podem ser responsáveis, em parte,
pela atividade encontrada.
A B C
1 2 1 2 1 2
65
Figura 11. Perfil cromatográfico por CGAR-DIC obtido das frações hexânica, clorofórmica e acetato de etila obtidas do extrato hidroalcoólico de B. oleracea L. var. acephala DC. A) Fração hexânica. B) Fração clorofórmica. C) Fração acetato de etila. 1: Sinal em 9,00 min. 2: Sinal em 11,60 min.
5.3 Avaliação da Toxicidade – Ensaio toxicológico de dose-fixa
Verificou-se neste estudo que a administração oral na dose de 2 g/kg de EHA
não foi capaz de induzir toxicidade aguda nos animais, uma vez que não foram
observadas alterações comportamentais sistemáticas no screening hipocrático. Não
ocorreram óbitos, os animais não apresentaram perda de peso, sendo classificados
com o índice “zero” (ausente), de maneira semi-quantitativa, de acordo com o
método proposto por Malone e Robichaud (1962), e Malone (1977). Na análise
min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
pA
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FID1 A, (OECL\FRHCOUV1.D)
min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
pA
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FID1 A, (OECL\FRCLCOU1.D)
min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
pA
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FID1 A, (OECL\FRACOUV.D)
1 2
A
B
C
66
macroscópica dos órgãos realizada a partir da necropsia não foram constatadas
alterações nos principais órgãos, não sendo necessária a remoção dos mesmos
para exame histopatológico, como preconizado segundo a OECD 420 (2001).
Porém, estudos toxicológicos crônicos são necessários para se complementar os
dados de segurança no uso de produtos derivados da B. oleracea L. var. acephala
DC.
5.4 Avaliação da atividade gastroprotetora
5.4.1 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC., frações e subfrações em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl
O EHA apresentou significativa atividade gastroprotetora, reduzindo a área
total lesada, a área relativa de lesão e o ULI para os tratamentos com as doses de
25, 50 e 100 mg/kg de EHA e omeprazol (30 mg/kg), quando comparados com o
controle negativo (Tabela 3).
Tabela 3. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala DC. (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose (mg/kg) Área total de
lesão (mm2)
Área relativa de
lesão (%)
Índice de Lesão Ulcerativa
(ULI)
Controle Veículo 62,41±22,53 13,20±4,25 33,16±4,57
EHA
25 13,03±2,65* 2,62±0,51** 17,00±0,70**
50 12,56±2,22* 2,23±0,40** 14,80±2,39**
100 4,88±1,33** 1,13±0,28** 5,00±1,34**
Omeprazol 30 14,83±4,90** 2,42±0,63** 9,00±1,21**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
O EHA apresentou um IC de 48,73±2,13% para a dose de 25 mg/kg;
55,37±7,22% para a dose de 50 mg/kg e 84,92±4,04% para a dose de 100 mg/kg,
sendo esta última, mais efetiva que o fármaco de escolha omeprazol, que
67
apresentou um IC de 72,86±3,65% (Figura 12). A DI50 calculada foi de 30,68 (23,21
– 40,54) mg/kg.
EHA 25 mg/kg EHA 50 mg/kg EHA 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
**
**
**
**
Tratamentos
Índ
ice
de
cura
(IC
- %
)
Figura 12. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Buscando-se os possíveis metábolitos secundários responsáveis pela
atividade gastroprotetora, realizou-se o fracionamento do extrato através do
processo de partição líquido-líquido. As FH, FC, FAE e FAQ obtidas foram avaliadas
no modelo de úlceras agudas induzidas por etanol/HCl na dose de 50 mg/kg, afim de
se determinar qual ou quais as frações mais ativas.
Neste modelo, a FH, a FC, a FAE e a FAQ apresentaram atividade
gastroprotetora. Todas as frações reduziram a área total lesada e a área relativa
lesada quando comparados com o grupo controle negativo. O ULI apresentou-se
menor com o tratamento das frações FC (19,60) e FAQ (23,00), porém, os
tratamentos com as frações FH (30,60) e FAE (25,16) não foram capazes de reduzir
o ULI quando comparadas com o controle negativo (Tabela 4).
68
Tabela 4. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea L. var. acephala DC. (hexânica, clorofórmica, acetato de etila e aquosa, na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose
(mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão
(%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Controle Veículo 72,95±19,49 16,28±1,98 33,75±3,96
FH 50 33,30±3,85* 7,67±0,77* 30,60±2,72
FC 50 18,04±1,53** 4,21±0,33** 19,60±1,32**
FAE 50 34,26±12,04* 7,24±2,59* 25,16±2,52
FAQ 50 24,61±3,68** 5,72±0,82** 23,00±1,14*
Omeprazol 30 12,93±2,54** 2,59±0,51** 9,40±0,92**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Assim, o índice de cura calculado foi de 24,44±16,51% para a FH;
51,60±10,19% para a FC; 25,43±7,47% para a FAE; 43,20±11,68% para a FAQ e
72,14±8,83% para o omeprazol (30 mg/kg) (Figura 13). De acordo com todos os
parâmetros avaliados, a fração clorofórmica na dose de 50 mg/kg apresentou-se
mais ativa contra o dano gástrico produzido pelo etanol/HCl, seguida pela fração
aquosa que também foi capaz de prevenir este dano.
FH 50 mg/kg FC 50 mg/kg FAC 50 mg/kg FAQ 50 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
**
*
**
Tratamentos
Índ
ice
de
cura
(IC
- %
)
Figura 13. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea L. var. acephala DC.(hexânica, clorofórmica, acetato de etila e aquosa, na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
69
Após concluir que as FC e FAQ são as mais ativas, realizou-se o mesmo
experimento a fim de determinar-se o perfil dose-resposta.
Ambas as frações foram testadas nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg. Neste
experimento, foi possível observar que tanto a fração FC quanto a FAQ apresentam
perfil dose-resposta, sendo capazes de inibir a área total lesada, a área relativa
lesada e o ULI, sendo que as doses de 50 e 100 mg/kg foram mais ativas quando
comparados com o grupo controle negativo (Tabela 5).
Tabela 5. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das frações clorofórmica e aquosa obtidas do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose (mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão
(%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Controle Veículo 90,33±6,17 19,65±3,99 43,28±3,77
FC
25 41,80±4,47** 11,35±1,49** 39,20±3,00
50 19,50±1,92** 5,27±1,75** 19,60±1,32**
100 15,77±2,30** 3,74±0,51** 16,80±1,28**
FAQ
25 69,46±3,45 16,82±1,97 32,80±3,89
50 22,80±2,44** 6,24±1,38** 24,33±1,25**
100 17,42±3,17** 4,68±0,70** 13,60±1,05**
Omeprazol 30 8,36±1,61** 1,19±1,15** 8,87±1,14**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
A partir da determinação do ULI foi possível calcular o índice de cura, onde os
tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FC apresentaram 9,42±5,39%, 54,71±1,72%
e 61,18±2,95% de cura, respectivamente. O omeprazol (30 mg/kg) apresentou um IC
de 79,50±2,63% (Figura 14). A DI50 calculada foi de 71,03 (67,59 – 74,65) mg/kg.
70
FC 25 mg/kg FC 50 mg/kg FC 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
**
**
**
Tratamentos
Índic
e de
cura
(IC
- %
)
Figura 14. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Os tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FAQ apresentaram um IC de
24,21±5,94%, 43,78±2,90% e 68,57±1,17%, respectivamente, e o tratamento com
omeprazol (30 mg/kg) apresentou um IC de 79,50±2,63% (Figura 15). A DI50
calculada foi de 57,68 (47,49 – 70,07) mg/kg.
FAQ 25 mg/kg FAQ 50 mg/kg FAQ 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
**
**
**
Tratamento
Índic
e de
cura
(IC
- %
)
Figura 15. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
71
Ainda neste mesmo modelo farmacológico, foi testada a atividade
gastroprotetora das subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta
das FC e FAQ.
Das sete subfrações obtidas da FC, cinco subfrações (da três a sete) foram
testadas na dose de 50 mg/kg. Neste experimento foi possível constatar que todas
as subfrações obtidas a partir da fração clorofórmica apresentam atividade
gastroprotetora (Tabela 6).
Tabela 6. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose
(mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão
(%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Controle Veículo 43,16±4,30 12,60±0,59 39,69±3,84
SFC (3) 50 17,17±2,22** 4,83±0,90** 25,65±0,76
SFC (4) 50 25,14±4,96** 8,85±2,03 32,20±3,68
SFC (5) 50 16,05±1,21** 5,39±1,67* 21,00±2,22*
SFC (6) 50 11,88±0,44** 3,74±0,46** 16,00±2,55**
SFC (7) 50 13,10±0,59** 5,16±0,90* 20,00±2,08*
Omeprazol 30 5,31±1,28** 3,22±1,56** 6,80±0,86**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
A partir do cálculo de ULI, foi possível calcular o IC, onde os tratamentos com
as subfrações 3, 4, 5, 6 e 7 obtidas da FC apresentaram um IC de 35,37±1,91%,
18,87±1,80%, 47,09±3,59%, 59,68±2,44 e 49,60±2,24%, respectivamente, e o
tratamento com omeprazol na dose de 30 mg/kg apresentou um IC de 82,86±1,84%.
Assim, a SFC (6) é a subfração mais ativa (Figura 16).
72
SFC (3) 50 mg/kg SFC (4) 50 mg/kg SFC (5) 50 mg/kg SFC (6) 50 mg/kg SFC (7) 50 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
**
*
**
*
*
Tratamentos
Índ
ice
de
cura
(IC
- %
)
Figura 16. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Da mesma maneira, das sete subfrações obtidas por cromatografia em coluna
aberta da FAQ, cinco subfrações (da três a sete) foram testadas na dose de 50
mg/kg. Todas as subfrações obtidas da fração aquosa testadas apresentam
atividade gastroprotetora (Tabela 7).
Tabela 7. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes subfrações obtidas através de cromatografia em coluna aberta das frações clorofórmica e aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose
(mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão
(%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Controle Veículo 43,16±4,30 12,60±0,59 39,69±3,84
SFAQ (3) 50 19,60±4,80** 5,67±1,20* 20,05±1,05*
SFAQ (4) 50 16,55±3,32** 5,58±1,21* 24,00±2,89*
SFAQ (5) 50 18,24±2,57** 6,45±0,79* 24,33±1,25*
SFAQ (6) 50 6,22±0,68** 2,59±0,74** 9,10±0,73**
SFAQ (7) 50 22,14±3,95** 5,49±1,82* 24,55±2,14
Omeprazol 30 5,31±1,28** 3,22±1,56** 6,80±0,86**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
73
O IC calculado para os tratamentos com as subfrações 3, 4, 5, 6 e 7 obtidas
da FAQ apresentaram um IC de 49,48±1,23%, 39,53±1,30%, 38,69±2,93%,
77,07±1,84% e 38,15±2,39% respectivamente, e o tratamento com omeprazol na
dose de 30 mg/kg apresentou um IC de 82,86±1,84%. A SFAQ que se apresentou
mais ativa é a SFAQ (6) (Figura 17).
SFAQ (3) 50 mg/kg SFAQ (4) 50 mg/kg SFAQ (5) 50 mg/kg SFAQ (6) 50 mg/kg SFAQ (7) 50 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80 ****
*
* * *
Tratamentos
Índ
ice
de
cura
(IC
- %
)
Figura 17. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das subfrações através de cromatografia em coluna aberta da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (na dose de 50 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
5.4.2 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações em úlceras agudas induzidas por
AINE/parassimpaticomimético
No experimento baseado no modelo de úlceras agudas induzidas por
AINE/parassimpaticomimético (indometacina/betanecol), foi possível observar que o
EHA apresentou atividade gastroprotetora, reduzindo a área total lesada, a área
relativa de lesão e o ULI para os tratamentos com as doses de 50 e 100 mg/kg de
EHA e cimetidina (100 mg/kg), quando comparados com o controle negativo. A dose
de 25 mg/kg de EHA não apresentou atividade gastroprotetora (Tabela 8).
74
Tabela 8. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos.
Tratamentos Dose
(mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão
(%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Controle Veículo 11,14±1,03 3,83±0,57 25,80±1,81
EHA
25 6,79±2,62 2,53±0,46 22,04±1,96
50 4,22±0,85* 1,16±0,23** 9,20±1,98**
100 4,15±1,25** 1,18±0,40** 8,66±2,45**
Cimetidina 30 1,91±0,74** 0,41±0,11** 4,83±1,51**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
O EHA apresentou um IC de 14,57±12,39% para a dose de 25 mg/kg;
64,34±9,92% para a dose de 50 mg/kg e 66,43±12,29% para a dose de 100 mg/kg,
e 81,27±7,57% para o tratamento com cimetidina na dose de 100 mg/kg (Figura 18).
A DI50 calculada foi de 62,26 (54,09 – 71,66) mg/kg.
EHA 25 mg/kg EHA 50 mg/kg EHA 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
****
**
Tratamentos
Índ
ice
de
cura
(IC
- %
)
Figura 18. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidroalcoólico das folhas de B. oleracea var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
75
Da mesma forma, a FC e a FAQ foram testadas nesse modelo, sendo que
apresentaram perfil dose-resposta, sendo capazes de inibir a área total lesada, a
área relativa lesada e o ULI, sendo que os efeitos observados nas doses de 50 e
100 mg/kg foram mais ativos quando comparados com o grupo controle negativo. A
dose de 25 mg/kg não apresentou atividade gastroprotetora (Tabela 9).
Tabela 9. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala (clorofórmica e aquosa, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas por indometacina/betanecol em camundongos.
Tratamentos Dose
(mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão
(%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Controle Veículo 12,99±2,13 3,86±0,63 35,40±2,64
FC
25 5,37±1,43 1,36±0,36 24,33±2,71
50 4,87±1,58** 1,25±0,48** 20,05±1,57*
100 3,95±0,81** 1,18±0,22** 13,00±2,03**
FAQ
25 6,91±1,92 1,85±0,59 27,00±1,14
50 5,87±0,54** 1,58±0,34** 23,05±1,56*
100 2,99±0,54** 1,12±0,24** 13,60±1,58**
Cimetidina 100 3,30±1,00** 0,85±0,27** 10,2±0,58**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
O IC calculado os tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FC foi de
31,27±2,75%, 41,88±4,87% e 63,27±5,65%, respectivamente, sendo que o
tratamento com cimetidina (100 mg/kg) apresentou IC de 71,18±1,98% (Figura 19).
A DI50 calculada foi de 59,39 (45,14 – 78,13) mg/kg.
76
FC 25 mg/kg FC 50 mg/kg FC 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70 ****
*
Tratamentos
Índic
e de
cura
(IC
- %
)
Figura 19. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e da fração clorofórmica obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Os tratamentos com 25, 50 e 100 mg/kg de FAQ apresentaram um IC de
23,72±4,97%, 34,88±2,04% e 61,58±5,33%, respectivamente, sendo que o
tratamento com cimetidina (100 mg/kg) apresentou IC de 71,18±1,98% (Figura 20).
A DI50 calculada foi de 72,98 (62,06 – 85,81) mg/kg.
FAQ 25 mg/kg FAQ 50 mg/kg FAQ 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70 ****
*
Tratamentos
Índ
ice
de
cura
(IC
%)
Figura 20. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e da fração aquosa obtida do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea L. var. acephala DC. (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
77
5.4.3 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético
(ensaio curativo)
A atividade gastroprotetora curativa do EHA (100 mg/kg), da FC (100 mg/kg),
e da FAQ (100 mg/kg) foi avaliada após 9 dias da indução da lesão com ácido
acético. O EHA, a FC e a FAQ foram capazes de diminuir o tamanho da úlcera em
comparação ao grupo de animais tratados com salina, sendo que o EHA mostrou-se
mais efetivo que a cimetidina (100 mg/kg) na cicatrização das lesões gástricas
(Tabela 10), e podemos observar que o EHA é mais ativo do que suas frações.
Tabela 10. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos.
Tratamentos Dose
(mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão (%)
Controle Veículo 24,45±2,07 6,15±0,62
EHA 100 3,67±0,53** 0,98±0,14**
FC 100 5,42±1,12** 1,97±0,37**
FAQ 100 6,65±0,55** 1,64±0,21**
Cimetidina 100 4,17±0,71** 1,12±0,19**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
A partir da determinação da área total lesada foi possível calcular o IC, onde o
tratamento com EHA (100 mg/kg) apresentou 84,96±2,07% de cura, sendo mais
efetivo que o tratamento com cimetidina (100 mg/kg), que apresentou um IC de
82,94±2,92%. A FC e a FAQ apresentaram 77,80±2,17% e 73,17±2,28% de cura,
respectivamente (Figura 21).
78
EHA 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 ****
**
**
Tratamento
Índ
ice
de
cura
(IC
- %
)
Figura 21. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
A partir da análise das lâminas histológicas é possível observar que o
tratamento com EHA, FC e a FAQ promoveu uma diminuição da espessura da
mucosa gástrica quando comprado com o grupo controle negativo, mantendo sua
espessura com valores próximos à espessura de uma mucosa normal (Tabela 11).
Quanto a classificação dos cortes por pontuação, o grupo normal recebeu a
pontuação “zero”, onde a mucosa apresenta-se normal. A mesma pontuação foi
observada para o grupo tratado com EHA. O grupo controle negativo recebeu a
pontuação “quatro”, onde observou-se um dano extenso na mucosa. O grupo FC,
FAQ e cimetidina recebeu a pontuação “um”, onde observaram-se pequenos danos
à mucosa gástrica (Tabela 11).
79
Tabela 11. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) na espessura da mucosa gástrica de úlceras induzidas por ácido acético (30%) em camundongos.
Tratamentos Dose (mg/kg) Espessura da mucosa
gástrica (µµµµm)
Classificação por pontuação
(0 – 4)
Normal Veículo 247,04±7,66 0
Controle Veículo 479,89±65,85 4
EHA 100 190,74±10,76** 0
FC 100 195,53±14,25** 1
FAQ 100 212,55±16,4** 1
Cimetidina 100 193,98±7,51** 1
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Na Figura 22, observamos os cortes histológicos dos grupos normal, controle
negativo, tratados com EHA, FC, FAQ e cimetidina (100 mg/kg). Quando comparado
a um corte histológico normal (Figura 22 A), a úlcera do grupo controle negativo,
apresentou a camada mucosa dilatada, sem organização celular definida e com
ausência de células principais no fundo da glândula gástrica, presentes em mucosa
totalmente regenerada. A camada submuscular da mucosa e a camada muscular
apresentam-se totalmente desorganizadas, com grande infiltrado inflamatório,
presença de linfócitos e fibroblastos (Figura 22 B). Já no tratamento com EHA foi
possível observar que todas as camadas do estômago estão completamente
regeneradas (Figura 22 C). De maneira similar, podemos observar um melhor
arranjo das estruturas celulares com os tratamentos de FC, FAQ e cimetidina (100
mg/kg) (Figura 22 D, E e F, respectivamente). Porém, o processo curativo ainda não
está totalmente estabelecido, sendo que ainda há presença de infiltrado inflamatório,
com linfócitos e fibroblastos.
80
Corte transversal em aumento de 1000 Corte transversal em aumento de 4000 Corte transversal em aumento de 4000 N
orm
al
Con
trol
e
EH
A
100
mg/
kg
FC
100
mg/
kg
FA
Q
100
mg/
kg
Cim
etid
ina
100
mg/
kg
Figura 22. Detalhes de cortes histológicos do efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por ácido acético (30%) em camundongos. mc: mucosa. sm: submuscular. ms: muscular. ss: subserosa. A) Grupo Normal. B) Grupo Controle Negativo. C) EHA (100 mg/kg). D) FC (100 mg/kg). E) FAQ (100 mg/kg). F) Cimetidina (100 mg/kg). 1: Detalhe do tecido no aumento de 1000 vezes. 2: Detalhe da mucosa no aumento de 4000 vezes. 3: Detalhe da camada muscular no aumento de 4000 vezes.
A1 A2 A3
B1 B2 B3
C1 C2 C3
D1 D2 D3
E1 E2 E3
F1 F2 F3
mc
ms
sm ss
mc
ms sm ss
mc
ms
sm
ss
ms
ss
sm
mc
ss
sm
ms
mc
mc
ms
sm
ss
81
5.5 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica
5.5.1 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro)
Os resultados apresentados na Tabela 12 demonstram que o EHA promoveu
a diminuição do volume na secreção gástrica, aumentando o pH nas doses de 50 e
100 mg/kg e no tratamento com cimetidina (100 mg/kg). A dose de 25 mg/kg não
causou alterações significativas no volume de secreção e pH, porém, promoveu
alterações na concentração de íons hidrogênio na secreção gástrica. As doses de 50
e 100 mg/kg de EHA e cimetidina (100 mg/kg) também promoveram uma diminuição
na concentração dos íons hidrogênio na secreção estomacal. A DI50 calculada foi de
46,04 (36,83 – 57,57) mg/kg.
Tabela 12. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala DC. (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica ácida de camundongos submetidos à ligadura de piloro.
Tratamentos Dose (mg/kg) pH Volume de secreção
(mL)
[H+] (mEq.g-1/L)
Controle Veículo 3,15±0,21 0,54±0,09 99,15±12,32
EHA
25 4,21±0,51 0,49±0,04 51,36±5,21**
50 4,16±0,16* 0,40±0,05 46,62±0,58**
100 4,27±0,32* 0,37±0,06* 44,16±3,60**
Cimetidina 100 4,97±0,51** 0,35±0,02* 34,00±4,30**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
Para complementar os resultados, as frações mais ativas (FC e FAQ) foram
submetidas ao teste de ligadura de piloro, nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg.
Tanto a FC e quanto a FAQ foram capazes de alterar todos os parâmetros
analisados, porém a FAQ mostrou-se mais ativa. Quanto ao pH, a administração de
FC e FAQ promoveu alterações somente nas doses de 50 e 100 mg/kg. O volume
de secreção foi alterado somente com a administração da dose de 100 mg/kg de FC
e das doses de 50 e 100 mg/kg de FAQ. A concentração de íons hidrogênio
encontrou-se diminuída com a administração da dose de 100 mg/kg de FC e com as
82
doses de 25, 50 e 100 mg/kg de FAQ. A cimetidina (100 mg/kg) mostrou-se eficiente
como controle positivo, pois apresentou atividade em todos os parâmetros
observados (Tabela 13). A DI50 calculada para o tratamento com FC foi de 83,31
(68,38 – 101,49) mg/kg, e para o tratamento com FAQ foi de 51,99 (43,31 – 62,42)
mg/kg.
Tabela 13. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg) obtidas a partir do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala nos parâmetros bioquímicos da secreção gástrica ácida de camundongos submetidos à ligadura de piloro.
Tratamentos Dose (mg/kg) pH Volume de secreção
(mL)
[H+] (mEq.g-1/L)
Controle Veículo 2,99±0,14 0,57±0,03 113,44±14,53
FC
25 3,45±0,28 0,35±0,04 74,53±4,73
50 4,25±0,32* 0,34±0,04 67,20±4,75
100 4,93±0,31** 0,31±0,02** 50,13±0,88*
FAQ
25 3,49±0,19 0,32±0,05 59,31±3,15*
50 4,00±0,11* 0,29±0,03** 56,40±2,40*
100 5,05±0,17** 0,25±0,05** 39,11±5,64**
Cimetidina 100 5,33±0,23** 0,24±0,03** 35,19±5,09**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
5.5.2 Efeito do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea L. var. acephala
DC. e frações sobre a secreção de muco em mucosa gástrica
Os resultados apresentados na Tabela 14 demonstram que a administração
de EHA das doses de 25, 50 e 100 mg/kg foi capaz de aumentar a quantidade de
muco presente na mucosa gástrica. A carbenoxolona (200 mg/kg) mostrou-se efetiva
como controle positivo, pois promoveu o aumento de muco. A indometacina (100
mg/kg) também mostrou-se efetiva como controle negativo, pois diminuiu a
quantidade de muco presente na mucosa gástrica. A DI50 calculada foi de 56,32
(37,72 – 84,09) mg/kg.
83
Tabela 14. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção de muco de camundongos submetidos à ligadura de piloro.
Tratamentos Dose
(mg/kg) pH
Volume de secreção
(ML)
Quantidade de Alcian Blue ligado
(mg/g tecido)
Salina Veículo 3,15±0,21 0,54±0,09 3,19±0,62
Indometacina 100 2,53±0,15 0,43±0,04 1,44±0,18
EHA
50 4,21±0,51 0,49±0,04 3,93±0,12*
250 4,16±0,16* 0,40±0,05 4,59±0,31**
500 4,27±0,32* 0,37±0,06* 4,17±0,25**
Carbenoxolona 200 4,43±0,49* 0,30±0,03** 4,30±0,32**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. (ABS = 0,0035 + 0,0081 * Conc; R2: 0,998)
Complementando os resultados obtidos com EHA, as FC e FAQ também
foram submetidas ao modelo de ligadura de piloro. A Tabela 15 demonstra que as
doses de 25, 50 e 100 mg/kg de FC e de 50 e 100 mg/kg de FAQ foram capazes de
aumentar a quantidade de muco presente na mucosa gástrica. A dose de 25 mg/kg
de FAQ não apresentou alterações significativas. A carbenoxolona (200 mg/kg) e a
indometacina (100 mg/kg) foram usados como controles. A DI50 calculada para o
tratamento com FC foi de 13,58 (6,61 – 27,89) mg/kg, e para o tratamento com FAQ
foi de 9,87 (4,20 – 23,18) mg/kg.
Tabela 15. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200 mg/kg) e indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses das diferentes doses das frações clorofórmica e aquosa (25, 50 e 100 mg/kg) obtidas do extrato hidralcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (25, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos da secreção de muco de camundongos submetidos à ligadura de piloro.
Tratamentos Dose
(mg/kg) pH
Volume de secreção
(g)
Quantidade de Alcian Blue ligado
(mg/g tecido)
Salina Veículo 2,99±0,14 0,57±0,03 3,95±0,39
Indometacina 100 3,45±0,28 0,65±0,12 2,98±0,53
FC
25 4,25±0,32* 0,35±0,04 6,02±0,33*
50 4,93±0,31** 0,34±0,04 6,68±0,90*
100 4,93±0,31** 0,31±0,02** 10,61±0,94**
FAQ
25 3,49±0,19 0,32±0,05 5,64±0,21
50 4,00±0,11* 0,29±0,03** 6,76±0,11*
100 5,05±0,17** 0,25±0,05** 8,50±1,56**
Carbenoxolona 200 5,16±0,30* 0,24±0,04** 7,04±0,53**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. (ABS = 0,0035 + 0,0081 * Conc; R2: 0,998)
84
5.6 Mecanismos de ação antiúlcera in vivo
5.6.1 Papel do óxido nítrico e do extrato hidroalcoólico de Brassica oleracea
L. var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas por
etanol/HCl
O L-NAME é uma substância capaz de inibir a enzima NOS. Em modelos de
avaliação da atividade gastroprotetora ligada a fatores antioxidantes verifica-se a
participação do NO através da pré-administração de L-NAME. Neste modelo,
quando administrado o L-NAME aos animais antes dos tratamentos com EHA, FC e
FAQ (100 mg/kg), verificou-se que estes perderam sua atividade gastroprotetora,
quando comparado com animais tratados somente tratados com EHA, FC e FAQ
(100 mg/kg) (Tabela 16).
Tabela 16. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl associado a inibição da NO-sintase em camundongos.
Tratamentos
L-NAME (70mg/
kg)
Dose (mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Índice de Cura (%)
L-NAME
Controle + Veículo 48,83±4,68 40,57±4,45 -
- Veículo 35,51±2,06 38,30±4,06 5,59±4,06
EHA + 100 36,70±4,80 37,60±6,40 7,32±3,09
- 100 8,33±3,07*## 9,60±2,24**## 76,33±5,54##
FC + 100 32,22±6,18 35,00±5,14 13,72±1,45
- 100 17,41±2,42*## 15,80±2,95**## 61,05±3,78##
FAQ + 100 35,65±6,30 35,60±3,54 12,25±4,19
- 100 19,88±1,65*## 16,80±1,42**# 58,59±3,52#
Carbenoxolona + 200 39,91±5,94 34,70±3,45 14,46±4,72
- 200 6,31±1,93**## 11,20±2,17**## 72,39±5,77##
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle L-NAME (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos L-NAME e salina (+p<0,05).
Quanto a área relativa lesada, observou-se que o tratamento com EHA (100
mg/kg) promove gastroproteção (1,34%) contra o dano produzido pelo etanol/HCL,
sendo que esta foi perdida quando pré-administrado L-NAME aos animais (12,82%).
Observa-se que o tratamento com as FC (2,59%) e FAQ (3,08%) também
85
apresentou gastroproteção, que foi perdida com o pré-tratamento de L-NAME (FC:
12,51% e FAQ: 13,37%). A carbenoxolona (200 mg/kg) apresentou-se efetiva como
controle positivo pois promoveu uma diminuição no dano gástrico produzido pelo
etanol/HCl (1,58%), que também foi perdida com a pré-administração do L-NAME
(11,68%). No grupo controle negativo, não observamos alterações significativas
entre o grupo tratado com salina (13,08%) e o grupo tratado com L-NAME (15,97%).
Também foi possível observar que o EHA promove maior gastroproteção do que as
suas frações (FC e FAQ). Estes resultados podem ser observados na Figura 23.
Cont. Neg. EHA 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg Cont. Neg. EHA 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg0
10
20
30
*##
*##*##
*##
+
+
+
+
L-NAME SalinaTratamentos
Áre
a R
elat
iva
Les
ada
(%)
Figura 23. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos, associado a administração de L-NAME (70 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g de peso de animal). Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle L-NAME (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos L-NAME e salina (+p<0,05).
5.6.2 Papel dos compostos sulfidrilas e do extrato hidroalcoólico de Brassica
oleracea L. var. acephala DC. e frações em úlceras agudas induzidas por
etanol/HCl
O NEM é uma substância capaz de quelar os grupamentos sulfidrilas
presente na mucosa gástrica, que também participam dos processos antioxidantes
ligados a gastroproteção. Em modelos de avaliação da atividade gastroprotetora,
86
verifica-se a participação desses grupamentos através do pré-tratamento dos
animais com NEM. Antes do tratamento com EHA, FC e FAQ (100 mg/kg), o pré-
tratamento com NEM promoveu a perda da atividade gastroprotetora, quando
comparados com animais tratados somente com EHA, FC e FAQ (100 mg/kg)
(Tabela 17).
Tabela 17. Efeito da administração oral de carbenoxolona (200 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas por etanol/HCl associado a alquilação de grupamentos sulfidrilas em camundongos.
Tratamentos NEM
(10mg/kg)
Dose (mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ULI)
Índice de Cura (%)
NEM
Controle + Veículo 153,89±6,77 41,00±2,42 -
- Veículo 43,70±4,85## 25,80±1,30## 37,07±1,30
EHA + 100 106,01±15,94## 19,80±2,31*## 51,80±7,45
- 100 4,95±1,62**## 11,60±1,20**## 71,70±3,89##
FC + 100 100,23±8,24## 15,83±2,07*## 61,39±6,47
- 100 10,57 ±3,78*## 16,20±2,87*## 60,48±3,26##
FAQ + 100 100,84±10,79## 17,83±1,70*## 56,51±2,26
- 100 13,45±2,63*## 16,83±1,16*# 58,95±3,76#
Carbenoxolona + 200 105,11±9,14## 18,60±2,80*## 54,63±7,04
- 200 6,90±3,10**## 13,20±1,88**## 67,80±8,12##
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle NEM (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos NEM e salina (+p<0,05).
Quanto a área relativa lesada, observou-se que o tratamento com EHA (100
mg/kg) promove gastroproteção (1,59%) contra o dano produzido pelo etanol/HCL,
sendo que esta foi perdida quando pré-administrado NEM (41,92%). Também se
observou que o tratamento com as FC (2,03%) e FAQ (2,95%) apresentou
gastroproteção, que foi perdida com o pré-tratamento com NEM (FC: 42,19% e FAQ:
39,04%). A carbenoxolona (200 mg/kg), usada como controle positivo, promoveu
uma diminuição no dano gástrico produzido pelo etanol/HCl (1,77%), que também foi
perdida com a pré-administração do NEM (40,36%). No grupo controle negativo, foi
possível observar alterações entre o grupo tratado com salina (22,83%) e o grupo
tratado com NEM (52,08%), sugerindo que o dano produzido por etanol/HCl foi mais
severo quando associado com a pré-administração de NEM. Neste experimento,
também foi possível observar que o EHA promove maior gastroproteção do que as
suas frações (FC e FAQ). Estes resultados podem ser observados na Figura 24.
87
Cont. Neg. EHC 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg Cont. Neg. EHC 100 mg/kg FC 100 mg/kg FAQ 100 mg/kg Carb. 200 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
+++
+++
+++
+++
**##**##
**## **##
##
+++
NEM SalinaTratamentos
Áre
a re
lati
va l
esad
a (%
)
Figura 24. Porcentagem de área lesada obtida pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e do extrato hidroalcoólico das folhas de Brassica oleracea var. acephala (100 mg/kg) e frações clorofórmica e aquosa (100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos, associado a administração de NEM (10 mg/kg, i.p.) e salina (0,1 mL/10 g de peso de animal). Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), e controle L-NAME (#p<0,05 e ##p<0,01) ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. Resultados do teste t de Student comparando as médias dos tratamentos NEM e salina (+p<0,05).
88
6 DISCUSSÃO
Para o sucesso de pesquisas farmacológicas com plantas são necessários
alguns critérios de investigação. A escolha baseada em conhecimentos
etnofarmacológicos é, sem dúvidas, a alternativa que apresenta maior possibilidade
de descoberta de novos compostos, com a comprovação da atividade farmacológica
desejada. O progresso, o sucesso nas pesquisas e os conhecimentos de plantas
medicinais e alimentos funcionais é determinado, em grande parte, pelo
conhecimento popular (HASLAM, 1996; HOLETZ et al., 2002; HASLAM, 2007).
Dentro dos métodos modernos de análise fitoquímica, a cromatografia se
destaca devido a sua facilidade com que se efetua a separação, identificação e
quantificação de substâncias químicas (COLLINS, 2006).
O processo de fracionamento de extratos vegetais visa à separação dos
prováveis metabólitos secundários presentes na planta. É utilizado geralmente
quando não se conhece a natureza dos compostos presentes (NIERO et al., 2003;
SIMÕES et al., 2003; MALHEIROS et al., 2010).
As brássicas são um grupo de vegetais amplamente distribuídos e
consumidos em todo o mundo. O seu consumo está relacionado com a redução dos
riscos de doenças crônicas, como problemas cardiovasculares, câncer, diabetes
mellitus tipo 2, entre outras. Estes atividades estão relacionadas com os metabólitos
secundários, mais especificamente, glicosinolatos, compostos fenólicos e
flavonóides. Além disso, estes metabólitos possuem alta capacidade antioxidante,
controlando os mecanismos apoptóticos e necróticos presentes nas células
(FRANCISCO et al., 2009).
Os glicosinolatos são compostos que apresentam várias características,
contém em sua molécula, nitrogênio e enxofre, e são responsáveis pelo odor forte e
pungente das brássicas, especialmente a mostarda (Brassica nigra), nabos
(Brassica rapa), repolhos (Brassica oleracea var. capitata), etc. Estudos in vitro
demonstram principalmente atividades antitumorais e atuação sobre enzimas
hepáticas envolvidas em processos de desintoxicação (BRUNETON, 1991;
FRANCISCO et al., 2009).
Os compostos fenólicos e flavonóides são o grupo de metábolitos secundários
mais abundantes e mais amplamente estudado do reino vegetal. Em plantas do
89
gênero Brassica, esses metabólitos secundários são complexos, podendo
apresentar até cinco resíduos de açúcar ou serem associados com resíduos do
ácido hidroxicinâmico. Estes compostos apresentam alta capacidade antioxidante,
seja por inibir diretamente o radical, ou por induzir a expressão de enzimas
metabolizadoras, reduzindo o risco de diferentes doenças (ZHANG et al., 2003;
FRANCISCO et al., 2009). Além disso, os benefício na saúde humana e os efeitos
sinérgicos podem aparecer entre essas classes de metabólitos (FRANCISCO et al.,
2009).
Além disso, estudos em plantas do gênero Maytenus, conhecidas
popularmente no Brasil como “espinheira-santa”, apontam que terpenos e
flavonóides presentes na planta são as substâncias responsáveis pela atividade
gastroprotetora (YARIWAKE, et al., 2005). Em outro estudo, os flavonóides, ácidos
fenólicos e orgânicos presentes na própolis apresentam atividade antiúlcera
(SOUSA et al., 2007).
De acordo com o perfil fitoquímico observado nas cromatoplacas, dados
presentes na literatura, e na comparação com diferentes padrões de terpenos e
esteróides é possível sugerir que Brassica oleracea L. var. acephala DC. apresentou
diferentes compostos destas classes, tendo em vista a coloração específica quando
revelado com o anisaldeído sulfúrico. Isto também pode ser confirmado quando se
analisa o perfil cromatográfico obtido através de CGAR-DIC, onde foram observadas
nítidas diferenças entre as frações mais apolares analisadas. Considerando que as
diferenças mais significativas encontram-se na fração clorofórmica e que esta fração
foi a que apresentou melhor atividade gastroprotetora, sugere-se que estas
substâncias podem ser responsáveis, em parte, pela atividade encontrada.
O estudo fitoquímico preliminar desta fração (FC), através de cromatografia
em coluna aberta, foi possível obter algumas subfrações com um bom grau de
pureza e que no momento encontram-se em processo de elucidação estrutural.
Da mesma forma, a análise da fração aquosa através de cromatografia em
camada delgada utilizando como padrões flavonóides e açúcares mostraram
coloração característica quando utilizados os reveladores cloreto férrico e ácido p-
aminobenzoico, sugerindo a presença de glicosinolatos ou flavonóides glicosilados.
B. oleracea L. var. acephala DC. é uma espécie que apresenta perfil
fitoquímico bastante polar, de grande complexidade e quantidade de metabólitos,
necessitando de técnicas fitoquímicas mais específicas.
90
Estudos pré-clínicos são importantes para se determinar a eficácia, potência e
a toxicidade de um extrato em estudo (SANTOS, 2008). Levando em consideração
que a couve (Brassica oleracea L. var. acephala DC.) é um alimento muito
consumido pela população, é de extrema importância complementar estudos sobre
toxicologia desta planta, garantindo a segurança na utilização terapêutica da couve.
De acordo com o Guideline for Testing of Chemicals – Acute Oral Toxicity –
Fixed Dose Procedure (OECD 420, 2001), no modelo de toxicidade aguda, é
possível observar a capacidade de um extrato ou substância em causar danos nas
estruturas celulares e no conteúdo genético pouco tempo depois de uma única
exposição, mesmo sendo de curta duração.
Neste estudo, a administração do EHA, os animais não apresentaram
nenhum sinal de toxicidade significativo durante o período de observação. A
ausência de efeitos tóxicos agudos permitiu prosseguir com os ensaios
farmacológicos.
A atividade gastroprotetora do EHA, frações e subfrações foi inicialmente
avaliada nos modelos de indução de úlceras agudas induzidas por etanol, que é um
agente necrosante, e por AINE, que inibe a proteção normal do estômago
(diminuição de síntese de prostaglandinas constitutivas). Apesar de não representar
integralmente a patologia humana, esses dois modelos são clássicos no screening
para o estudo de fármacos com atividades gastroprotetoras. Estes modelos
fornecem importantes indicativos de possíveis mecanismos de ação dos extratos,
que podem estar associados a fatores antioxidantes e/ou fatores anti-inflamatórios,
ou ainda a diminuição da secreção ácida. O uso de substâncias como álcool e
AINES estão entre as principais causas envolvidas na etiologia de úlceras gástricas
no homem (RAIHA et al, 1998; SCHMASSMANN, 1998; LEVENSTEIN, 1998).
No modelo de úlceras agudas induzidas por etanol, as lesões ulcerativas são
decorrentes da ação necrosante do etanol sobre a mucosa gástrica, com menor
participação da secreção ácida, sendo de etiologia bastante ampla e complexa,
envolvendo a depleção dos fatores protetores (muco e bicarbonato, por exemplo) e
aumentando os fatores agressores (ácido clorídrico, por exemplo) (SIKIRIC et al.,
1999; REPETTO, LLESUY, 2002; VAZQUEZ-RAMIREZ et al., 2006).
Os efeitos do etanol sobre a mucosa gástrica podem estar associados com a
formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), que causam um desequilíbrio
entre o processo antioxidante e oxidante celular. A administração de etanol resulta
91
em lesões no plexo vascular, ocasionando ruptura dos vasos, favorecendo a
hemorragia e necrose, retrodifusão de íons hidrogênio, causando esfoliação nas
células epiteliais, rompendo a barreira protetora da mucosa e alterando a
permeabilidade da membrana (LEWIS, HANSON, 1991; SIKIRIC et al., 1999).
Mecanismos antioxidantes de defesa são eventos fisiológicos normais, porém,
em condições patológicas, os EROs causam peroxidação lipídica e dano oxidativo. A
primeira enzima antioxidante da mucosa gástrica é a superóxido dismutase (SOD),
que catalisa a dismutação do O2• em peróxido de hidrogênio (H2O2), que apesar de
ser menos nocivo, ainda causa danos celulares. O H2O2 é reduzido pela enzima
glutationa peroxidase (GPx) em água. Esta reação é acompanhada pela conversão
da glutationa reduzida (GSH) em glutationa oxidada (GSSG), sendo convertida
novamente em GSH pela glutationa redutase (GR) (EL-HABIT et al., 2000;
KWIECIÉN, BRZOZOWISK, KONTUREK, 2002).
Como as membranas apresentam grande quantidades de complexos
enzimáticos redutores de O2•, são alvos constantes das EROs, que atacam as
insaturações dos ácidos graxos poli-insaturados, ocasionando a formação de radical
lipídicos peroxil e alcoxil (ROO• e RO•), captação de O2 e rearranjo de ligações
duplas, resultando na alteração da integridade e fluidez das membranas. Esse
processo é chamado de lipoperoxidação lipídica, que é mantido pela formação de
hidroperóxidos e aldeídos (BUEGE; AUST, 1978; JOURD’HEUIL; GUTTERIDGE,
1995; MCCORD, 2000; ANDREOLI, 2000; CHATTOPADHYAY et al., 2006).
Além de causar mudanças na seletividade, alterações no volume e
metabolismo celular, os hidroperóxidos e aldeídos são citotóxicos, promovendo a
quimiotaxia e regulando a produção de citocinas. A lipoperoxidação lipídica pode ser
interrompida por antioxidantes, como por exemplo o α-tocoferol (vitamina E) e o
óxido nítrico (NO) (CHEN et al., 1996; AW, 1998; JAYATILLEKE, SHAW, 1998;
HOGG, KALYANARAMAN, 1999).
Segundo Vrchoská et al. (2006), legumes pertencentes a família Brassicaceae
apresentam glicosinolatos e seus derivados, flavonóides e outros compostos
fenólicos que tem alta capacidade antioxidante in vitro comprovada (VRCHOVSKÁ
et al., 2006).
Considerando a possível presença destas classes de compostos quando
analisados fitoquimicamente e, os resultados obtidos no modelo de úlcera induzida
por etanol/HCl, sugerem que o EHA, as frações e as subfrações apresentam efeito
92
gastroprotetor por aumentar a citoproteção favorecendo os processos antioxidantes.
Porém, estudos complementares sobre os processos de estresse oxidativo in vivo e
in vitro, serão necessários para comprovar seu envolvimento nos processos
antioxidantes.
A obtenção das frações e subfrações foi uma tentativa de buscar os possíveis
metabólitos responsáveis pela atividade gastroprotetora. À medida que o extrato foi
sendo fracionado, o mesmo apresentou uma diminuição na capacidade de inibir as
úlceras, porém, a capacidade gastroprotetora foi mantida. Esses resultados sugerem
um efeito sinérgico entre as substâncias presentes no extrato, ou seja, estes efeitos
podem ser associados a compostos fenólicos, flavonóides glicosilados e
glicosinolatos. Dados da literatura indicam que as brássicas apresentam seus efeitos
gastroprotetores por mecanismos de maneira sinérgica entre seus constituintes
(FRANCISCO et al., 2009).
A gastroproteção pode estar relacionada com a manutenção da integridade
da mucosa gástrica, que depende da integridade da microcirculação, secreção de
muco e atividade de enzimas antioxidantes (KWIECIÉN et al., 2004).
A atividade antiulcerogênica do EHA, frações FC e FAQ foi avaliada no
modelo de úlcera induzida por AINE/parassimpaticomimético
(indometacina/betanecol). Os anti-inflamatórios não esteroidais apresentam como
efeito adverso. A ulceração da mucosa gástrica, resultado principalmente da
diminuição da síntese de prostaglandinas, devido a inibição da enzima ciclo-
oxigenase. As prostaglandinas são responsáveis pela secreção de muco e
bicarbonato na mucosa gástrica. Sua diminuição acarreta em perda da citoproteção
e redução do fluxo sanguíneo local (CRYER, 2000).
O contato direto de AINEs com a mucosa gástrica ataca os fosfolipídios
presentes tanto no muco quanto no epitélio gástrico, o que reduz a hidrofobicidade
do muco e causando retrodifusão de íons hidrogênio. A redução do nível de
prostaglandinas na mucosa gástrica, ao mesmo tempo que diminui a inflamação,
acarreta a diminuição da defesa natural do estômago (BJORKMAN, 1996;
BERSTAD, BERSTAD , BERSTAD, 2002).
As prostaglandinas exercem seus efeitos via receptores específicos de
membrana, que são acoplados a proteínas-G, denominados de receptores EP. A
PGE2, especificamente quando interage com receptores EP1, resultando na
liberação de IP3 e DAG, quando interage com receptores EP2 e EP4, ativam a via
93
adenilato-ciclase-AMPc, sendo que quando interage com os receptores EP3, inibem
a via adenilato-ciclase-AMPc. Assim, as prostaglandinas exercem seus efeitos
aumentando a secreção de muco e bicarbonato, a resistência epitelial, a
citoproteção e mantêm o fluxo sanguíneo na mucosa (HAWKEY, RAMPTON, 1985;
SUGIMOTO, NARUMIYA, ICHIKAWA, 2000; PAWLIK et al., 2002; DEY et al., 2006).
Neste modelo, as maiores doses de EHA apresentaram atividade
gastroprotetora, sendo que a FC apresentou atividade gastroprotetora mais
pronunciada do que a FAQ. Isto indica que provavelmente o EHA apresenta
componentes com efeitos sinérgicos, sendo que os componentes presentes na FC
são capazes de promover um efeito protetor sobre a mucosa, podendo estar
relacionado com o aumento de síntese de prostaglandinas.
Os resultados nesses dois experimentos sugerem que as substâncias
presentes no EHA promovem a participação coordenada de mediadores na resposta
gastroprotetora. Podem estar havendo influência da PGE2 e NO, os quais podem
modular a defesa da mucosa, estimulando a secreção de muco e bicarbonato,
elevando o fluxo sanguíneo, promovendo o tamponamento da acidez ou inibindo a
secreção ácida, e citoproteção, favorecendo os mecanismos de reparo tecidual
(WALLACE; MILLER, 2000).
O modelo de indução de úlceras crônicas por ácido acético desenvolvido por
Takagi, Okabe e Saziki, (1969) é o que apresenta maior similaridade com a
patologia em humanos. Os autores observaram que o ácido acético é capaz de
produzir uma lesão bem definida envolvendo a camada muscular, de cicatrização
demorada, semelhante à úlcera péptica humana. Por esse motivo, neste estudo foi
selecionado este modelo para a avaliação da atividade curativa da Brassica oleracea
L. var. acephala DC. sobre úlceras crônicas produzidas por ácido acético.
Neste modelo, há três fases distintas de cicatrização, onde ocorre o
desenvolvimento da úlcera com necrose do tecido, infiltração inflamatória e
formação de margem da úlcera; início do processo de cicatrização, com uma fase
rápida, envolvendo migração rápida de células epiteliais e contração da base da
úlcera, e fase lenta de cicatrização, com angiogênese, remodelação dos tecidos de
granulação e completa re-epitelização da cratera da úlcera (SCHMASSMANN, 1998;
TARNAWSKI, 2000).
A úlcera gástrica é resultante de um processo necrótico e isquêmico. Como
ocorre dano microvascular, o tecido em necrose não recebe mais nutrientes,
94
liberando mediadores que causam quimiotaxia de leucócitos e macrófagos. Estes,
fagocitam os restos celulares liberando citocinas pró-inflamatórias como por exemplo
o TNFα, a IL-1α e a IL-1β, envolvendo a enzima COX-2 na defesa da mucosa
gástrica e no processo de cicatrização do tecido. A expressão de COX-2 parece
controlar os mecanismos de re-epitelização, angiogênese, citoproteção e
proliferação celular epitelial (mediada por EGF) (TISUJI et al., 2002; TARNAWSKI,
2005; WALLACE, 2005; POONAM, VINAY, GAUTAN, 2005; SCHMASSMAN et al.,
2005).
As prostaglandinas possuem um papel fundamental na renovação do epitélio
gástrico, mantendo os fatores defensivos da mucosa gástrica. Além de proteger as
células o estômago contra úlceras provocadas nos modelos agudos, o EHA é capaz
de promover a cicatrização de úlceras no modelo crônico. Isso sugere que os
compostos presentes no EHA favorecem os mecanismos anti-inflamatórios e
antioxidantes, provavelmente induzindo a síntese de PGE2 e liberação de NO,
favorecendo os mecanismos de reparo e cicatrização da lesão ulcerativa.
Nos cortes histológicos dos animais tratados com EHA, FC ou FAQ é possível
observar a regeneração do tecido e células funcionais do estômago, o que sugere
que os compostos presentes atuam promovendo os mecanismos de reparo e
cicatrização, reforçando os dados obtidos macroscopicamente. Novamente, é
possível observar que as substâncias atuam em sinergismo, pois os animais
tratados com EHA apresentam organização celular mais evidente do que os tratados
com FC, FAQ e cimetidina.
Histologicamente é possível observar cicatrização da mucosa gástrica, quanto
a migração e proliferação celular, re-epitelização, angiogênese, presença de
fibroblastos e formação de tecido conjuntivo de sustentação, que são processos
controlados por fatores de crescimento (TGFβ, PDGF, EGF, FGF e VEGF) e
citocinas (TNFα, IL-1α, IL-1β) (CONTRAN, KUMAR, ROBBINS, 2000; TARNAWSKI,
2000; TARNAWSKI et al., 2001).
No modelo de ligadura de piloro foi avaliada a atividade do EHA, FC e FAQ
sobre a secreção de ácido, uma das mais importantes funções do estômago.
Quando os mecanismos homeostáticos estão prejudicados, o volume e a acidez
gástrica podem aumentar desproporcionalmente, superando assim as defesas da
mucosa gástrica, levando a formação de úlceras gástricas (LAPA et al., 2008).
95
A via de administração no modelo de ligadura de piloro é a via intraduodenal,
que permite investigar as ações do extrato por via sistêmica, excluindo as interações
do contato direto com a mucosa gástrica. O EHA, FC e FAQ causa alterações no pH,
no volume gástrico e na concentração de íons hidrogênio, sugerindo que os
compostos presentes no extrato e frações possam estar atuando sobre a secreção
ácida gástrica. De acordo com Takeguchi et al (1983), os isotiacianatos, produtos de
degradação dos glicosinolatos, tem atividade antisecretória, inibindo a (H+-K+)-
ATPase in vitro. Estes produtos de degradação podem estar atuando in vivo, pois os
mesmos podem estar presentes FAQ, e esta apresentou uma atividade
antisecretória ácida mais pronunciada do que a FC.
Após a verificação da redução na secreção ácida, um agente agressor da
mucosa, a produção de muco foi investigada. O muco é um dos fatores protetores
da mucosa gástrica, criando uma barreira física contra bactérias, ácidos, toxinas,
além de agir como um lubrificante, reduzindo o atrito e os efeitos abrasivos sobre a
mucosa. O muco tem a capacidade de sequestrar radicais livres, devido a sua
composição glicoprotéica (MOJZIS, HEGEDUSOVA, MIROSSAY, 2000; WALLACE
et al., 2000; NAM et al., 2005; WALLACE, 2007).
A proteção criada pelo muco ligado ao tecido pode ser observada devido a
formação de mucopolissacarídeos solúveis. Estes mucopolissacarídeos são
quantificados de acordo com sua ligação ao Alcian Blue, um corante específico para
mucinas ácidas (LAPA et al., 2008).
Os resultados obtidos neste modelo demonstram que além de diminuir a
secreção ácida gástrica, os componentes presentes no EHA, FC e FAQ estimulam a
produção de muco gástrico, ou seja, favorecem o aparecimento dos fatores
defensivos da mucosa, que pode estar relacionado com o aumento do potencial
antioxidante do muco (HAMAISHI, KOJIMA, ITO, 2006).
Visto que o EHA, FC e FAQ apresentam ação gastroprotetora, provavelmente
por atuar aumentando os mecanismos antioxidantes, deste modo, testes na tentativa
de elucidação do mecanismo de ação (L-NAME e NEM) foram realizados.
O óxido nítrico (NO) tem um importante papel na modulação da defesa da
mucosa gástrica, como: regulador na secreção de muco, vasodilatador produzindo
aumento de fluxo sanguíneo local, inibidor da agregação de neutrófilo e auxiliando
no processo de cicatrização da úlcera gástrica (LAPA et al., 2008).
O bloqueio da síntese de NO aumenta o estresse oxidativo, levando a
96
ativação de mastócitos, que se encontraram em grande quantidade no trato
digestório. O NO exerce seus efeitos atuando sobre a guanilato ciclase, na via da
guanosina-3’,5’-monofosfato cíclico (GMPc) ou atuando diretamente sobre canais de
potássio dependentes de cálcio, gerando hiperpolarização nas células endoteliais
dos vasos, resultando em vasodilatação. Essas células são responsáveis pela
liberação de mediadores que causam o aumento da permeabilidade epitelial. Esses
eventos são rapidamente revertidos pela liberação de NO (ODABASOGLU et al.,
2006; LAPA et al., 2008).
Na mucosa gástrica, o NO é produzido pela enzima óxido nítrico sintase
constitutiva e endotelial (NOSc e NOSe), que mantém a integridade da mucosa. O L-
NAME bloqueia a produção de NO através da inibição da enzima NOS. Como a
gastroproteção do EHA, FC e FAQ é revertida com o pré-tratamento com L-NAME,
estes resultados sugerem que a atividade seja dependente de NO (LAPA et al.,
2008).
Os grupamentos sulfidrílicos são compostos que contribuem para a
integridade da mucosa, com a finalidade básica de reduzir a formação de radicais
livres derivados de oxigênio relacionando-se com proteção celular. São elementos
gastroprotetores capazes de manter o fluxo sanguíneo possibilitando a redução da
lesão tecidual (CHATTOPADHYAY et al., 2006; LAPA et al., 2008).
A redução dos níveis normais de grupos sulfidrílicos torna a mucosa gástrica
susceptível ao ataque de substâncias ulcerogênicas, afetando o mecanismo
defensivo da mucosa. A N-etilmaleimida (NEM), é uma substância capaz de quelar
as pontes de dissulfeto que são responsáveis pela conformação da barreira mucosa,
promovido pelos compostos sulfidrílicos (LAPA et al., 2008).
O NEM, ao diminuir a concentração de SH na mucosa, potencializa os danos
gástricos induzidos pelo etanol, danos estes associados à diminuição significativa
nos níveis de grupos sulfidrílicos, especialmente glutationa reduzida (GSH), em
animais de experimentação e no homem. Essa redução pode ser devida à oxidação
da glutationa, após a geração de metabólitos tóxicos, ou devido à ligação da
glutationa ao acetaldeído gerado através da oxidação de agentes necrotizantes pela
atividade gástrica da enzima álcool desidrogenase (DEVI et al., 2007; LAPA et al.,
2008).
O pré-tramento com NEM mostrou que o EHA, FC e FAQ pode possuir
atividade gastroprotetora dependente de GSH.
97
Em parte, os metabólitos presentes no EHA exercem atividade semelhante
aos fármacos utilizados na clínica (cimetidina e omeprazol), interferindo na secreção
de ácido. Em parte, atua interferindo nos mecanismos citoprotetores, aumentando a
secreção de muco (mecanismo de ação da carbenoxolona). Tanto nos modelos
agudos quanto nos modelos crônicos, os mecanismos gastroprotetores podem
apresentar mecanismos de ação semelhantes. A atividade antioxidante foi
responsável pelos efeitos gastroprotetores in vivo, mostrando-se importante apontar
os compostos presentes no extrato e responsáveis pela atividade farmacológica.
Esses dados colaboram para a comprovação dos dados etnofarmacológicos, sendo
necessários estudos in vitro, na determinação das enzimas e vias envolvidas nos
processos gastroprotetores.
98
7 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos nos modelos experimentais utilizados e
baseando-se nos relatos da literatura, pode-se concluir que:
1. O EHA apresenta atividade gastroprotetora, confirmando seu uso na
medicina popular e reforçando seu papel como alimento funcional.
2. O perfil fitoquímico apresentado pela planta demonstra que o EHA
pode conter compostos fenólicos, flavonóides glicosilados e glicosinolatos. As SFC
(6) e a SFAQ (6) apresentam bom grau de pureza e serão submetidos a elucidação
estrutural.
3. A CGAR-DIC demonstra que a FC apresenta substâncias que podem,
em parte, estarem ligadas a atividade gastroprotetora.
4. No modelo de úlceras induzidas por etanol/HCl, todas as frações
apresentam pequena atividade gastroprotetora, porém as FC e FAQ são mais
efetivas.
5. A gastroproteção observada no tratamento EHA é mais pronunciada do
que a observada nos tratamentos com FC, FAQ, omeprazol e cimetidina, nos
modelos de úlceras agudas induzidas por etanol/HCl e indometacina/betanecol.
6. Das subfrações obtidas através de cromatografia de coluna aberta das
FC e FAQ, a SFC (6) e a SFAQ (6) apresentam atividade protetora gástrica no
modelo de úlcera induzida por etanol/HCl.
7. O EHA atua sobre a secreção ácida e sobre a secreção de muco, bem
como suas frações (FC e FAQ), sendo porém, a FAQ mais efetiva que a FC.
8. O estudo crônico permitiu avaliar o efeito curativo do EHA. O extrato
99
tem a capacidade de regenerar o dano produzido pelo ácido acético, apresentando
organização de todas as estruturas celulares responsáveis pela integridade da
mucosa e do tecido muscular do estômago.
9. Avaliando-se o papel do NO e dos compostos sulfidrilas, pode-se
sugerir que a atividade gastroprotetora esteja ligada a fatores antioxidantes.
10. De acordo com os resultados observados, os compostos podem
exercer seu efeito farmacológico por sinergismo. Além disso, os mecanismos de
ação podem estar relacionados com fatores antioxidantes (participação do NO e
GSH), fatores anti-inflamatórios (participação da PGE2) ou a inibição da secreção
ácida (bloqueio da (H+-K+)-ATPase).
11. Estudos posteriores in vitro e in vivo devem ser realizados para a
determinação das enzimas envolvidas nos processos antioxidantes e anti-
inflamatórios relacionados com a gastroproteção.
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ANEXO A