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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)
ANTONIO CARLOS MANUCCI
Identificação das proteínas interagentes de Yes-
Associated Protein (YAP), um efetor da via Hippo, em
células epiteliais mamárias expostas à matriz
extracelular rica em laminina
Versão corrigida da dissertação defendida conforme resolução CoPGr 5890
A original se encontra disponível na Secretaria de Pós-Graduação do IQ-USP
São Paulo
Data do Depósito na SPG:
09/01/2019
ANTONIO CARLOS MANUCCI
Identificação das proteínas interagentes de Yes-Associated
Protein (Yap), um efetor da via Hippo, em células epiteliais
mamárias expostas à matriz extracelular rica em laminina
São Paulo
2019
Dissertação apresentada ao Instituto de
Química da Universidade de São Paulo
(campus Capital) como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Bioquímica
Orientação: Alexandre Bruni-Cardoso
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meioconvencional ou eletronico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Ficha Catalográfica elaborada eletronicamente pelo autor, utilizando oprograma desenvolvido pela Seção Técnica de Informática do ICMC/USP e
adaptado para a Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP
Bibliotecária responsável pela orientação de catalogação da publicação:Marlene Aparecida Vieira - CRB - 8/5562
M294iManucci, Antonio Carlos Identificação das proteínas interagentes de Yes-Associated Protein (Yap), um efetor da via Hippo,em células epiteliais mamárias expostas à matrizextracelular rica em laminina / Antonio CarlosManucci. - São Paulo, 2019. 139 p.
Dissertação (mestrado) - Instituto de Química daUniversidade de São Paulo. Departamento deBioquímica. Orientador: Bruni-Cardoso, Alexandre
1. Hippo. 2. YAP. 3. Matrix extracelular. 4.Membrana basal. 5. Glândula mamária. I. T. II. Bruni-Cardoso, Alexandre, orientador.
MANUCCI, A. C. Identificação das proteínas interagentes de Yes-Associated Protein
(Yap), um efetor da via Hippo, em células epiteliais mamárias expostas à matriz
extracelular rica em laminina. Dissertação apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Nome: ____________________________________ Instituição: ________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________________
Nome: ____________________________________ Instituição:________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________________
Nome: ____________________________________ Instituição:________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________________
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Alexandre Bruni-Cardoso pela oportunidade de trabalhar neste
projeto e em seu laboratório, por toda a orientação, ensinamentos e, sobretudo, por toda a
paciência.
Aos demais membros e ex-membros do Laboratório de Sinalização da Matriz
Extracelular, (E-signal Lab): Ana Zen, Pedro Ribeiro, Renato Magri, Mayara Botelho, Giovani
Genesi e Rebeka Tomasin.
Aos membros e ex-membros do Laboratório de Bioquímica de Parasitas (LBP) com os
quais eu convivi: Prof. Dra. Maria Júlia Manso Alves, Eliciane Matos, Paloma Sousa, Carol
Manchola e Samantha Lucciola.
Às técnicas do laboratório Célia Ludio e Maria Luiza Baldini, sem as quais o nosso
trabalho não seria possível.
Aos professores Dr. Giuseppe Palmisano (ICB-USP), Dra. Letícia Labriola (IQ-USP) e
Dra. Graziella Ronsein (IQ-USP) e às pós-doutorandas Ana Zen, Letícia Terra e Rebeka
Tomasin pelo apoio tanto do ponto de vista técnico quanto intelectual.
Ao Laboratório de Pesquisas Integradas em Câncer (LAPIC/IQ-USP), coordenado pelos
Profs. Dr. Eduardo Moraes Rego Reis, Dra. Deborah Schechtman e Dra. Daniela S. Bassères,
e ao Laboratório de Processos Fotoinduzidos e Interfaces (LPFI/IQ-USP), coordenado pelo
Prof. Dr. Maurício S. Baptista, pelo acesso à infraestrutura dos seus espaços para a realização
deste trabalho.
Ao CEPID Redoxoma e à facility CEFAP-BIOMASS, que foram fundamentais para as
análises de espectrometria de massas, e em especial à técnica Izaura N. Toma.
Ao Instituto de Química e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Bioquímica), seus docentes e funcionários.
Às agências de fomento. À CAPES, ao CNPq, à FAPESP e ao Instituto Serrapilheira
pelo suporte financeiro ao laboratório. Ao CNPq (Processo n. 132844/2016-8 – 03/2016 a
06/2016), à FAPESP (Processo n. 2016/09561-3 – 07/2016 a 02/2018) e ao Instituto
Serrapilheira (Processo 3832 – 06/2018 a 08/2018) pelas bolsas concedidas.
RESUMO
MANUCCI, A. C. Identificação das proteínas interagentes de Yes-Associated Protein (Yap)
em células epiteliais mamárias expostas a matriz extracelular rica em laminina. 2019.
137p. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas; área de concentração: Bioquímica) –
Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.
A sinalização da matriz extracelular (MEC) é essencial para a determinação do destino e
comportamento de células epiteliais da glândula mamária. Entretanto, pouco é conhecido sobre
os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A via Hippo, uma cascata de
sinalização que participa da regulação de diversos comportamentos celulares, incluindo o
tamanho de órgãos, parece ser uma importante candidata a mediadora sinalização da MEC.
Resultados preliminares do laboratório indicam que a arquitetura tecidual e a membrana basal,
componente da MEC de epitélios e outros tecidos, influenciam a localização, concentração e
atividade de YAP, uma proteína efetora da via Hippo, em células epiteliais mamárias. Neste
contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas que interagem com Yap (ortólogo
de YAP em camundongo) nas células epiteliais da glândula mamária em resposta à membrana
basal. Foram utilizadas células EpH4, uma linhagem mamária não-tumoral murina, como
modelo de diferenciação funcional e formação de ácinos em um ensaio de cultura
tridimensional (3D). O tratamento de estruturas multicelulares 3D pré-formadas em placas não-
adesiva com uma matriz rica em laminina (lrECM) alterou a localização e o padrão subcelular
de Yap, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e dos alvos de Yap, mas não
alterou a expressão das proteínas da via em nível de proteína. O ensaio de co-imunoprecipitação
(CoIP) seguida de análise por espectrometria de massas identificou um conjunto diferencial de
proteínas que interagem com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 cultivadas na
ausência ou na presença de lrECM em um modelo de ECM-overlay. Uma análise realizada
junto à database KEGG Pathways revelou que os possíveis interagentes Yap nas células
cultivadas não-tratadas com lrECM participam de processos relacionados à proteólise mediada
por ubiquitina, enquanto nas células expostas à lrECM os possíveis interagentes estão
associados a processos metabólicos e são especialmente proteínas-chave do metabolismo de
lipídios. A busca na plataforma de redes de interação STRING não identificou trabalhos que
destaquem a interação de Yap com estas proteínas. A plataforma Vizit indica a participação de
Yap em processos relacionados à síntese e atividade de lipídios e hormônios, o que reforça as
evidências de que está pode ser uma nova função de Yap ainda não explorada em detalhes. A
fim de se obter resultados complementares à CoIP, padronizamos o ensaio de identificação por
biotinilação dependente de proximidade (BioID) em células embrionárias de rim humano da
linhagem 293FT. As proteínas isoladas por pulldown foram identificadas por espectrometria de
massas e uma análise junto à database Gene Ontology indicou que os possíveis interagentes de
Yap nestas células são em sua maioria proteínas relacionadas à via Hippo, o que reforça a
robustez do ensaio. Nós pretendemos transpor este sistema para as células EpH4. A expectativa
é que, em conjunto, estes resultados nos orientem em projetos futuros para compreender os mecanismos de sinalização da MEC na morfogênese e diferenciação da glândula mamária.
Palavras-chave: Hippo. Yap. Matriz extracelular. Membrana basal. Glândula mamária.
ABSTRACT
MANUCCI, A. C. Identification of interacting proteins of Yes-Associated Protein (Yap) in
mammary epithelial cells exposed to laminin-rich extracellular matrix. 2019. 137p. Thesis
(Msc) (Master’s Degree in Biological Sciences; area of concentration: Biochemistry) – Institute
of Chemistry, University of São Paulo, São Paulo, Brazil.
Extracellular matrix (ECM)-signaling is crucial for determination of epithelial cell fate and
behavior in the mammary gland. However, little is known about the molecular mechanisms
involved in these processes. The Hippo pathway, a signaling cascade involved in the regulation
of several cellular processes, including organ size, seems to be an important candidate as a
mediator of this signaling. Our preliminary results indicate that the tissue architecture and the
basement membrane, an ECM component of epithelia and other tissues, influence the location,
level and activity of YAP, an effector of the Hippo pathway. In this context, the goal of this
work was to identify the proteins that interact with Yap (ortholog of YAP in mouse) in
mammary epithelial cells in response to the basement membrane. We used EpH4 cells, a non-
tumoral murine mammary cell, in a functional differentiation and acini-forming in
tridimensional (3D) culture assay. Treatment of 3D multicellular structures pre-formed on non-
adhesive plates with a laminin-rich extracellular matrix (lrECM) altered the subcellular
localization and pattern of Yap, as well as gene expression of Hippo pathway proteins and Yap
targets, but did not altered the expression of the pathway members at the protein level. Co-
immunoprecipitation (CoIP) followed by mass spectrometry analysis identified a differential
set of proteins interacting with Yap in cytoplasmic fractions of EpH4 cells in the absence or
presence of lrECM in an ECM-overlay culture model. An analysis performed with the KEGG
Pathways database revealed that putative Yap interactors in non-treated cells participate in
processes related to ubiquitin-mediated proteolysis, whereas in cells exposed to lrECM Yap
interactors are associated to metabolic processes and are mainly key-proteins of metabolism of
lipids and carbohydrates. A search in interaction networks platform STRING did not identify
previous works that showing the interaction of Yap with these proteins. Vizit platform indicated
the participation of Yap in processes related to the synthesis and activity of lipids and hormones,
which reinforces the evidences that Yap can play a novel poorly explored role. To obtain
complementary results to CoIP, we devised the proximity-dependent biotinylation
identification (BioID) assay on embryonic renal cells of 293FT cell line. Pulldown-isolated
proteins were identified by mass spectrometry and an analysis performed with Gene Ontology
database revealed that putative Yap interactors are Hippo pathway-related proteins, which
reinforces the robustness of the assay. We intend to transpose this system to the EpH4 cells.
We expect that, together, these results will guide us in future projects to understand the
signaling mechanisms of ECM in mammary gland morphogenesis and differentiation.
Keywords: Hippo. Yap. Extracellular matrix. Basement membrane. Mammary gland.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras
Figura 1 - Esquema simplificado da organização da matriz extracelular................. 26
Figura 2 - Modelo simplificado da transdução dos sinais da matriz extracelular..... 29
Figura 3 - Macro e microestrutura da glândula mamária......................................... 31
Figura 4 - Desenvolvimento pós-natal da glândula mamária em camundongo....... 33
Figura 5 - Esquema da região de um terminal end bud (TEB) da glândula
mamária de camundongo........................................................................ 35
Figura 6 - Esquema da via de sinalização Hippo..................................................... 38
Figura 7 - Comparação estrutural entre YAP e TAZ humanos e o seu ortólogo
Yorkie em Drosophila............................................................................ 40
Figura 8 - Modulação da localização de YAP de acordo com sinais do
microambiente........................................................................................ 41
Figura 9 - As assinaturas Yap/Taz(b) e NFκB estão suprarrepresentadas em TEB
e não estão estatisticamente representadas no ducto............................... 44
Figura 10 - As células do TEB apresentam Yap localizado prefrerencialmente no
núcleo, enquanto em células ductais Yap é mais concentrado no
citoplasma.............................................................................................. 45
Figura 11 - Um ambiente 3D rico em laminina-111 induz a translocação de Yap
do núcleo para o citoplasma em células EpH4........................................ 46
Figura 12 - Esquema simplificado do cultivo tridimensional sobre matriz não-
aderente de PolyHEMA.......................................................................... 70
Figura 13 - Estruturas tridimensionais de células EpH4 assumem morfologia
acinar qunado cultivadas em ambiente rico laminina.............................. 71
Figura 14 - O tratamento com lrECM aumenta a expressão de β-caseína em células
EpH4 quando na presença de hormônios lactogênicos........................... 72
Figura 15 - O tratamento de estruturas epiteliais 3D com lrECM diminui a taxa de
proliferação celular, tornando-as mais quiescentes................................. 74
Figura 16 - O tratamento de estruturas epiteliais 3D com lrECM reduz a razão
núcleo/citoplasma de Yap....................................................................... 76
Figura 17 - O tratamento com lrECM modifica o padrão de localização de Yap no
núcleo..................................................................................................... 77
Figura 18 - O tratamento com lrECM influencia no padrão de expressão gênica de
membros da via Hippo e alvos de Yap, mas a expressão proteica da via
não se altera............................................................................................ 79
Figura 19 - Esquema simplificado do ensaio de ECM-overlay................................. 80
Figura 20 - Padronização do ensaio de coimunoprecipitação (CoIP)........................ 81
Figura 21 - Um conjunto diferencial de proteínas imunoprecipitam com Yap na
presença de lrECM................................................................................. 82
Figura 22 - Os processos celulares que os possíveis interagentes de Yap no
citoplasma estão envolvidos são alterados com o tratamento com
lrECM..................................................................................................... 84
Figura 23 - Os processos celulares que os possíveis interagentes de Yap no núcleo
estão envolvidos são alterados com o tratamento com lrECM................ 85
Figura 24 - Yap interage com um complexo de proteínas relacionadas à proteólise
mediada por ubiquitina via proteína Ube2c na ausência de lrECM........ 87
Figura 25 - Não há indícios na literatura de que Yap interaja diretamente com
proteínas relacionadas à vias metabólicas.............................................. 90
Figura 26 - Mapa de interação de Yap com processos relacionados à lipídios......... 91
Figura 27 - Esquema simplificado da técnica de BioID (identificação por
biotinilação dependete de proximidade)................................................. 92
Figura 28 - Alinhamento das sequências de BirA e BirA*........................................ 94
Figura 29 - Esquema simplificado da proteína de fusão BirA*-Yap1....................... 95
Figura 30 - Esquema das duas construções projetadas para o ensaio de BioID......... 96
Figura 31 - Teste de indução da expressão do sistema BioID.................................... 98
Figura 32 - Teste de localização subcelular do sistema BioID.................................. 99
Figura 33 - Um conjunto diferencial de proteínas interagem com Yap fusionado à
BirA* nas duas construções testadas...................................................... 100
Figura 34 - Os processos celulares que os possíveis interagentes de Yap no
citoplasma.............................................................................................. 101
Quadros
Quadro 1 - Componentes da via Hippo..................................................................... 36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Primers utilizados na análise de expressão gênica..................................... 53
Tabela 2 - Primers utilizados para a clonagem de BirA*-Myc................................... 58
Tabela 3 - Primers utilizados para o PCR de colônia.................................................. 58
Tabela 4 - Anticorpos utilizados nas análises por imunofluorescência....................... 64
Tabela 5 - Anticorpos utilizados nas análises por Western Blotting........................... 67
Tabela 6 - Proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática de
células EpH4 não-tratadas com lrECM relacionadas à proteólise
mediada por ubiquitina............................................................................. 86
Tabela 7 - Proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática de
células EpH4 tratadas com lrECM relacionadas à vias
metabólicas............................................................................................... 88
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ankrd1 Gene codificador de Ankyrin repeat domain-containing protein 1
B2m Gene codificador da beta-2-microglobulina
BioID Proximity-dependent biotin identification = Identificação por biotinilação
dependente de proximidade
BirA* Biotina [acetil-CoA-carboxilase] ligase de Aquifex aeolicus com mutação no
resíduo 40 (R→G)
BSA Soroalbumina bovina
CAF Cancer-associated fibroblast = fibroblasto associado ao câncer
Cdc45 Proteína Cell division cycle 45
cDNA DNA complementar
CID Dissociação induzida por colisão
CoIP Coimunoprecipitação
Csn2 Gene codificador de β-caseína
CT Cycle Threshold
DAPI 4’,6-diamidino-2-fenilindol
DDR Discoidin domain receptor = receptor com domínio discoidina
DMEM Dulbecco’s Modified Engle’s Medium, meio de cultura de células de
mamíferos
DNA Ácido desoxirribonucleico
DTT Diclorodifeniltricloroetano
ECM Extracellular matrix = matriz extracelular
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
Ect2 Gene codificador do fator transformante de célula epitelial do tipo 2
EdU 5-etinil-2’-deoxiuridina
EGF Epidermal growth factor = fator de crescimento epidermal
EHS Condrossarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm
ESI Ionização por eletrospray
F12 Ham’s F12 Nutrient Misxture, meio de cultura de células de mamíferos
FAK Focal adhesion kinase = quinase de adesão focal
FGF Fibroblast growth factor = fator de crescimento fibroblástico
GAG Glicosaminoglicano
GPCR G-protein coupled receptor = receptor acoplado à proteína G
GTP Trifosfato de guanosina
Hpo Quinase Hippo (Drosophila)
HRP Horseradish peroxidase = peroxidase de raíz-forte (Armoracia rusticana)
IgG Imunoglobulina do tipo G
INCA Instituto Nacional do Câncer
LATS1/2 Quinase Large tumor supressor do tipo 1/2
LB Luria-Bertani, formulação (em ágar ou broth) para o cultivo de bactérias
LFQ Label-free quantification = quantificação livre de marcação
LOX Enzima lisil oxidase
lrECM Laminin-rich extracelular matrix = matriz extracelular rica em laminina
Mats Proteína Mob as tumor supressor (Drosophila)
MEC Matriz extracelular
MOB1A/B Ativador de quinase MOB1 do tipo A/B
mRNA RNA mensageiro
MST1/2 Quinase Mammalian Ste-20 like do tipo 1/2
NCBI National Center for Biotechnology Information
NFκB Fator nuclear kappa B
ORF Open reading frame = fase aberta de leitura
PBS Tampão fosfato-salino
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDZ Motivo de ligação presente em algumas proteínas
PDZ-BM Ver PDZ
PFA Paraformaldeído
PolyHEMA poli(2-hidroxietil metacrilato)
PPI Interação proteína-proteína
PVDF Fluoreto de polivinilideno
qPCR PCR quantitativo
Rac1 Proteína Ras-related C3 botulinium toxin substrate do tipo 1
RAR Receptor de ácido retinoico
RASSF Família de proteínas Ras association domain -containing protein
RIPA Tampão de lise Radioimmunoprecipitation assay
RNA Ribonucleic acid = ácido ribonucleico
RTK Receptor tyrosine-kinase = receptor do tipo tirosina-quinase
Sav Proteína-scaffold Salvador (Drosophila)
SAV1 Proteína-scaffold SAV
Sd Fator de transcrição Scalloped
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS
SEM Erro padrão da média
SH3-BM Motivo de ligação de homologia a SRC 3
SID Domínio de interação com Scalloped
Src Proto-oncogene tyrosin-protein kinase Src = proteína-tirosina quinase proto-
oncogênica Src
SRF Fator de resposta ao soro
Stk3 Gene codificador de MST2
TAD Domínio de transativação
TAO1 Quinase Thousand-and-One do tipo 1
TAZ/Taz Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif = coativador de
transcrição com motivo de ligação PDZ
TBS Tampão Tris-salino
TBS-T Tampão Tris-salino contendo 0,1% de Tween 20
TEAD1-4 Transcriptional enhancer factor TEF 1-4 = fator de transcrição TEF 1-4
TEB Terminal end bud = broto terminal
TFA Ácido trifluoracético
TGF-β1 Transforming growth factor beta 1 = fator de crescimento transformante beta
do tipo 1
TID Domínio de interação com TEAD
Tm Temperatura de melting
TNF-α Tumor necrosis factor alpha = fator de necrose tumoral alfa
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
U.A. Unidade de medida arbitrária
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
Wts Quinase Warts
WW Domínio de interação presente em algumas proteínas
WW45 Ver SAV1
WWTR1 Ver TAZ
YAP/Yap Yes-associated protein = proteína associada a Yes, coativador de transcrição
Yki Yorkie, coativador de transcrição (Drosophila)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 23
1.1 A célula e o microambiente................................................................................ 23
1.1.1 A matriz extracelular e a membrana basal............................................................ 24
1.1.2 A sinalização da matriz extracelular.................................................................... 27
1.2 A glândula mamária........................................................................................... 30
1.2.1 Estrutura e desenvolvimento da glândula mamária.............................................. 30
1.2.2 A glândula mamária como modelo de estudo........................................................ 34
1.3 A via Hippo.......................................................................................................... 35
1.3.1 Mecanismo da via Hippo...................................................................................... 36
1.3.2 YAP e TAZ............................................................................................................. 39
1.4 Resultados preliminares que fundamentam este trabalho.............................. 43
2 OBJETIVOS....................................................................................................... 47
2.1 Objetivo geral...................................................................................................... 47
2.2 Objetivos específicos........................................................................................... 47
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 49
3.1 Linhagens celulares e condições de cultivo....................................................... 49
3.2 Ensaio tridimensional (3D) de acinogênese em ambiente rico em
laminina............................................................................................................... 50
3.2.1 Coating das placas de cultivo............................................................................... 50
3.2.2 Plaqueamento e cultivo 3D das células sobre matriz de PolyHEMA.................... 50
3.2.3 Análise morfológica das estruturas 3D formadas................................................. 50
3.3 Análise de expressão gênica por PCR quantitativo (qPCR)............................ 52
3.3.1 Extração do RNA total e síntese do cDNA............................................................. 52
3.3.2 Desenho dos primers, curva de eficiência de amplificação e PCR
quantitativo........................................................................................................... 52
3.3.3 Cálculo de eficiência de amplificação e de expressão gênica relativa.................. 54
3.4 Co-imunoprecipitação (Co-IP).......................................................................... 55
3.5 Ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade
(BioID)................................................................................................................. 56
3.5.1 Construção e síntese das open reading frames (ORFs)......................................... 56
3.5.2 Clonagem molecular............................................................................................ 57
3.5.3 Transfecção transiente e teste de expressão......................................................... 59
3.5.4 Purificação das proteínas biotiniladas................................................................. 60
3.6 Espectrometria de massas.................................................................................. 60
3.6.1 Preparação das amostras..................................................................................... 60
3.6.2 Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-
MS/MS)................................................................................................................. 61
3.6.3 Análise dos dados................................................................................................. 62
3.7 Imunofluorescência............................................................................................ 63
3.8 Ensaio de proliferação baseado na incorporação de 5-etinil-2’-deoxiuridina
(EdU)................................................................................................................... 65
3.9 Western Blotting.................................................................................................. 65
3.10 Análise estatística................................................................................................ 67
4 RESULTADOS................................................................................................... 69
4.1 O cultivo em ambiente rico em laminina reproduz em cultura o processo
de acinogênese..................................................................................................... 69
4.2 A localização subcelular de Yap é alterada em resposta ao ambiente rico
em laminina, assim como a expressão de membros da via Hippo e dos
genes-alvo de Yap.............................................................................................. 75
4.3 Diferentes proteínas precipitam com Yap na ausência e presença do
tratamento com lrECM...................................................................................... 80
4.4 O ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade
(BioID) como abordagem alternativa para a identificação das proteínas
interagentes de Yap............................................................................................ 91
4.4.1 Construção e síntese das ORFs............................................................................. 93
4.4.2 Transfecção transiente em células 293FT............................................................ 97
4.4.3 Identificação das proteínas interagentes de Yap em células 293FT..................... 100
5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 103
6 CONCLUSÃO.................................................................................................... 111
REFERÊNCIAS................................................................................................. 113
SÚMULA CURRICULAR................................................................................ 133
23
1 INTRODUÇÃO
1.1 A célula e o microambiente
Em um contexto de multicelularidade existem inúmeros fatores que influenciam na
biologia de uma célula. Alguns desses fatores, como a temperatura, pressão e luminosidade, são
variáveis ambientais e intuitivamente sabemos de sua importância pela maneira como afetam
nossas vidas cotidianamente. Em nível molecular, por exemplo, a temperatura pode afetar a
velocidade e direcionamento de processos metabólicos de uma célula e alterar seu
comportamento ou função. No entanto, existem também alguns fatores intrínsecos ao
organismo que podem influenciar a maneira com que as células que o compõem irão se
comportar e agem principalmente em nível de microambiente (Bhat e Bissell, 2014).
O primeiro deles, e talvez o mais clássico, são os fatores químicos solúveis. Dentro dessa
denominação estão hormônios, fatores de crescimento e outras moléculas que agem diretamente
sobre células distantes no organismo, em células adjacentes ou mesmo sobre a própria célula
que o produziu, sinalizando para uma mudança em sua atividade ou mantendo a sua atual função
ou estado (Porter, 1974; Forsyth et al., 1985; Brisken e O'malley, 2010; Brisken e Ataca, 2015).
Outro fator é a arquitetura tecidual, ou como os componentes celulares e acelulares estão
dispostos em um determinado tecido. Como um exemplo, durante o desenvolvimento
embrionário, a posição ocupada por um determinado conjunto de células é o que determina qual
folheto ou linhagem germinativa elas darão origem (Tam e Zhou, 1996; Jones e Jones, 2000;
Tada et al., 2005). Neste caso a fonte do sinal pode tanto advir de fatores secretados pelas
células vizinhas como originar-se da interação física com outras células ou com os componentes
acelulares adjacentes (Bissell, 2007).
O terceiro e último fator é a composição e o arranjo da matriz extracelular, no qual os
24
seus constituintes, a sua rigidez ou suas propriedades físicas podem interferir em como a célula
percebe o seu ambiente (Mammoto e Ingber, 2010; Reilly e Engler, 2010; Gattazzo et al., 2014).
O interesse do nosso laboratório é focado nesse último fator, e buscamos entender os
mecanismos e os efeitos da sinalização da matriz extracelular na função e destino da célula.
Mas o que é a matriz extracelular e como os seus sinais são percebidos pela célula?
1.1.1 A matriz extracelular e a membrana basal
A matriz extracelular (MEC) é um conjunto complexo de moléculas produzidas e
secretadas pelas células nos espaços intercelulares, fornecendo um suporte físico e atuando
como um arcabouço para que as células se agreguem para formar tecidos e órgãos. Apesar dessa
função clássica, a MEC também é crucial para fornecer sinais bioquímicos e biomecânicos
necessários em processos celulares como a morfogênese, diferenciação e homeostase (Frantz
et al., 2010; Iozzo e Gubbiotti, 2018; Jena e Janjanam, 2018; Walker et al., 2018), bem como
atuar na regulação da disponibilidade de fatores químicos para as células, como Transforming
growth factor beta 1 (TGF-β1) e Tumor necrosis factor alpha (TNF-α), capazes de se ligar
respectivamente à fibronectina e biglicanas (Mooradian et al., 1989; Tufvesson e Westergren-
Thorsson, 2002).
Essencialmente, a MEC é composta por água, proteínas e polissacarídeos. Dada a sua
importância em processos biológicos relevantes, no entanto, é de se esperar que a sua
constituição e organização sejam dinâmicos e variem entre os diferentes tecidos e órgãos,
refletindo um microambiente em constante evolução (Frantz et al., 2010). Apesar deste
dinamismo em sua composição, as macromoléculas presentes na MEC podem ser agrupadas
em duas classes principais: os proteoglicanos e as proteínas fibrosas (Järveläinen et al., 2009;
Schaefer e Schaefer, 2010).
25
Os proteoglicanos são associações de glicosaminoglicanos (GAGs) com proteínas
presentes na matriz. São moléculas capazes de reter água e íons devido à presença de grupos
carregados em sua estrutura, ajudando a manter a hidratação e o balanço iônico do
microambiente. Entre os GAGs estão os sulfatos de heparano, dermatano, condroitina,
queratano e o ácido hialurônico, sendo este último o único que não é encontrado associado a
proteínas na forma de proteoglicana (Järveläinen et al., 2009).
As proteínas fibrosas são compreendidas pelos colágenos, elastinas, fibronectinas e as
lamininas. O colágeno é a proteína mais abundante da matriz e a principal responsável pela
manutenção da rigidez dos tecidos (Rozario e Desimone, 2010), enquanto a elastina confere
elasticidade a tecidos submetidos repetidamente à força de estiramento (por exemplo, ao redor
de vasos sanguíneos) (Wise e Weiss, 2009). O colágeno e a elastina se associam covalentemente
através da ação da enzima lisil oxidase (LOX), o que é essencial para a resposta adequada da
MEC às forças de tensão (Lucero e Kagan, 2006). A fibronectina é primariamente relacionada
à organização da matriz e na ligação célula-MEC, funcionando como um link entre receptores
de membrana e fibras de colágeno (Smith et al., 2007). Todas essas moléculas se dispõem em
uma malha desordenada formando nos tecidos um tipo de matriz dito intersticial, preenchendo
o espaço entre as células (Figura 1).
Além do interstício, no entanto, existe também um tipo específico da MEC,
característico dos epitélios, denominado membrana basal. A membrana basal é uma fina
deposição de proteoglicanos e glicoproteínas unidas por laminina e por uma rede interligada de
fibras de colágeno, com funções de ancoragem, compartimentalização e regulação da biologia
epitelial. (Muschler e Streuli, 2010). As lamininas são proteínas heterotriméricas de alto peso
molecular formadas pelo entrelaçamento de três cadeias polipeptídicas variáveis, α, β e γ. Cada
uma das cadeias são encontradas respectivamente em 5, 4 e 3 variantes gênicas e a nomenclatura
de cada tipo de laminina é dada de acordo com a composição do trímero formado (Aumailley
26
et al., 2005). Por exemplo, a laminina formada pelas cadeias α1, β1 e γ1 é denominada laminina-
111. Dada a sua capacidade de interagir com a célula via receptores de membrana, as lamininas
contribuem com a adesão, diferenciação, movimento e forma celular e com a manutenção dos
tecidos, estendendo sua função para além de apenas servir como suporte mecânico (Colognato
e Yurchenco, 2000). Diferentes tipos de lamininas são encontrados na membrana basal de
diferentes tecidos e a sua presença em quantidades anormais ou em uma forma não-funcional
pode acarretar em um quadro patológico. Na glândula mamária, por exemplo, são encontradas
predominantemente as lamininas-111, -332, -511 e 521 (Muschler e Streuli, 2010), e alterações
nos seus padrões de expressão já foram associadas à progressão do câncer de mama
(Gudjonsson et al., 2002; Fujita et al., 2005; Kim et al., 2011; Kim et al., 2012). A laminina-
Figura 1 – Esquema simplificado da organização da matriz extracelular. A membrana basal é uma
deposição organizada formada principalmente por colágeno tipo IV, lamininas e proteoglicanos, ancorando os
epitélios. A matriz intersticial é formada por uma malha desorganizada de colágeno e outras proteínas fibrosas,
sendo encontrada, por exemplo, no tecido conjuntivo subjacente ao epitélio. Esquema elaborado pelo próprio
autor.
27
211 disfuncional é a causa de uma forma de distrofia muscular congênita (Hall et al., 2007),
enquanto a laminina-521 anormal no rim leva a um quadro de síndrome nefrótica (Yurchenco
e Patton, 2009). Estes exemplos são evidências não apenas da importância da membrana basal
ou da sua comunicação com as células adjacentes, mas que também falhas na expressão e
deposição de lamininas podem afetar a homeostase do tecido e levar a doenças.
1.1.2 A Sinalização da matriz extracelular
Os sinais bioquímicos e biomecânicos da MEC são transmitidos para o interior da célula
através de receptores de adesão localizados na membrana da célula. Os principais receptores
que intermedeiam essa sinalização são os receptores DDR (discoidin domain receptors), as
sindecans e as integrinas (Heino e Käpylä, 2009).
Os DDR são receptores transmembrana do tipo tirosina quinase (RTK) cujo nome vem
de uma região (o domínio discoidina) que eles possuem em homologia com a proteína
discoidina I da ameba terrestre Dictyostelium discoideum (Fu et al., 2013). Estes receptores
estão presentes na célula nas isoformas DDR1 e DDR2 como produtos de dois genes diferentes,
ainda que variantes por splicings alternativos já tenham sido relatadas (Grither e Longmore,
2018; Oh et al., 2018). A sua ativação por autofosforilação acontece com a sua ligação a
moléculas de colágeno presentes na matriz, o que desencadeia uma cascata de ativação
intracelular (Matsuyama et al., 2003; Fu et al., 2013). Também já foi demonstrado que o
receptor DDR2 interage com algumas integrinas para promover a adesão destas a moléculas de
colágeno (Xu et al., 2012).
As sindecans também são proteínas transmembrana, mas agem como correceptores de
outros receptores de membrana, como os GPCRs (G-protein-coupled receptors) (Slimani et al.,
2003; Maillard et al., 2014; Pasqualon et al., 2016). São caracterizadas pela presença de GAGs
28
(sulfato de heparano e de condrotina) ligados a ela, sendo essenciais para a sua função ao
permitir a sua interação com ligantes extracelulares tais como fatores de crescimento (EGF,
FGF e VEGF), moléculas da matriz ou moléculas presentes na superfície de outras células
(Bernfield et al., 1992; Choi et al., 2005; Cheng et al., 2016).
Apesar da importância dos receptores DDR e das sindecans no intermédio da sinalização
da célula com a MEC, as integrinas são classicamente as mais estudadas. As integrinas são
proteínas heterodiméricas transmembrana compostas por uma cadeia α e uma β unidas de
maneira não-covalente. Em mamíferos existem 18 subunidades α e 8 subunidades β frutos de
splicing alternativo que podem formar até 24 combinações de dímeros (Alam et al., 2007). A
especificidade ao substrato com o qual a integrina se liga vai depender da combinação dessas
subunidades (Humphries, 2000; Hynes, 2002), enquanto que o padrão de expressão de
integrinas determina a qual substrato determinado a célula consegue se ligar (Hemler e Lobb,
1995). As integrinas são capazes de responder à composição molecular e às propriedades físicas
da MEC e integrar esses sinais através da associação direta com o citoesqueleto (Critchley et
al., 1999). Elas interagem principalmente por meio de motivos arginina-glicina-ácido aspártico
(RGD) presentes nas proteínas da MEC, sendo que a especificidade ao substrato é determinada
em parte pelos aminoácidos próximos ao motivo RGD1 (Ruoslahti, 1996). Em células epiteliais,
por exemplo, a integrina α6β4 compõe os hemidesmossomos e reconhece isoformas de
lamininas, intermediando a ligação da laminina aos filamentos intermediários de citoqueratina
(Spinardi et al., 1993; Mercurio et al., 2001; Hynes, 2002; Matlin et al., 2003; Gilcrease, 2007).
Por intermédio desses receptores, existem 3 formas pelas quais a informação da matriz
extracelular é percebida pela célula, chega até o núcleo e alteração o padrão de expressão de
genes (Figura 2):
1 Apesar da especificidade por determinado substrato, as integrinas frequentemente podem ser indistintas e se
ligar a mais de um tipo de substrato.
29
1. sinalização mecânica, na qual existe uma ligação praticamente direta entre a matriz e o
núcleo através dos receptores de matriz e o citoesqueleto da célula (pela natureza da
sinalização, é um tipo de sinalização bem rápida, que ocorre na escala de milissegundos)
(Fletcher e Mullins, 2010; Spencer et al., 2010);
2. sinalização bioquímica, na qual a transmissão do sinal é feita de maneira indireta através
de proteínas presentes no citoplasma em forma de uma cascata de sinalização (ocorre
mais lentamente, com respostas geradas na escala de segundos ou minutos);
3. sinalização mecânica e bioquímica, que une as duas formas de sinalização anteriores
através de vias de sinalização que são ativadas por modificações do citoesqueleto. Como
exemplo existe a família Rho de pequenas GTPases, como RhoA, Rac1 e Cdc45
(Boureux et al., 2007; Heasman e Ridley, 2008).
Figura 2 – Modelo simplificado da transdução dos sinais da matriz extracelular. Receptores localizados
na membrana celular detectam estímulos/alterações da MEC e os transmite até o núcleo. Estes sinais podem
ser transmitidos: i) via sinalização mecânica mediada pelo citoesqueleto; ii) via sinalização bioquímica
mediada por cascatas de fosforilação (como representado na imagem) ou outras modificações covalentes; ou
iii) ou via sinalização mista, através de vias de sinalização ativadas por modificação do citoesqueleto.
Adaptado de MBINFO. Disponível em: <https://www.mechanobio.info>. Acesso em: 19/10/18.
30
1.2 A glândula mamária
De arquitetura e função complexas, a glândula mamária é o órgão responsável pela
produção de leite, amamentação e, portanto, por grande parte do sucesso evolutivo dos
mamíferos (Forsyth, 1986). É, inclusive, alvo de inúmeros trabalhos sobre biologia do
desenvolvimento e biologia evolutiva (Oftedal, 2002; Capuco e Akers, 2009; Oftedal e
Dhouailly, 2013), além do grande interesse comercial por questões relacionadas ao
aprimoramento da produção de leite no setor agropecuário (Martignani et al., 2014). Sua
relevância, no entanto, vai além dos pontos de vista evolutivo e econômico: é um órgão de
interesse de saúde pública por ser frequentemente afetado por neoplasias (Instituto Nacional do
Câncer, INCA).
O câncer de mama é um sério problema de saúde pública, sendo o tipo com maior
prevalência em mulheres no Brasil e em todo mundo depois do câncer de pele não-melanoma.
É responsável por cerca de 28% dos novos diagnósticos de câncer no país a cada ano e por cerca
de 15400 mil mortes de mulheres apenas em 2015 (INCA). Para 2018, a estimativa é de 59700
novos casos. Apesar do aumento da sobrevida de 5 anos com pequena melhora na sobrevida
geral das pacientes (INCA), a cura completa para o câncer de mama ainda está distante de ser
alcançada e são necessários esforços para o esclarecimento de detalhes moleculares da gênese
e progressão da doença, decisivos para a criação e aprimoramento de novos métodos de
diagnóstico, prognóstico e tratamento.
1.2.1 Estrutura e desenvolvimento da glândula mamária
A glândula mamária é uma glândula pluricelular exócrina formada por um sistema
arborescente de ductos que conectam o componente secretório com o meio externo e é envolta
31
por um tecido estromal típico. O componente secretório é formado por estruturas globulosas
denominadas alvéolos ou ácinos, os quais são responsáveis pela maior parte da síntese e
secreção dos componentes do leite (Richert et al., 2000). O leite produzido flui dos ácinos
através de pequenos ductos, que coalescem uns aos outros até ductos coletores maiores e
terminam no mamilo, estrutura externa por onde o leite é ejetado durante a amamentação
(Figura 3A). O estroma que envolve a estrutura secretória é formado por um tecido conjuntivo
fibroso rico em adipócitos e por onde passam vasos sanguíneos e linfáticos necessários à
manutenção da glândula. Apesar de não ser responsável pela atividade secretora, o estroma é
reconhecidamente importante tanto para o desenvolvimento quanto para o funcionamento do
componente secretório (Wiseman e Werb, 2002; Pavlovich et al., 2010).
Em um corte transversal de um ácino, correspondente à porção secretória, pode-se
identificar uma organização em bicamada de dois principais tipos celulares (Figura 3B). Na
Figura 3 – Macro e microestrutura da glândula mamária. A, esquema da macroestrutura arborescente da
glândula mamária humana, composta por uma série de ductos que se ramificam a partir do mamilo em direção
estroma mamário. Durante o período gestacional, as porções terminais desses ductos se desenvolvem nos
ácinos,as estruturas funcionais produtoras de leite durante a lactação. Adaptado de American Cancer
Reasearch (2009). B, esquema transversal simplificado da microestrutura em bicamada de um ácino mamário.
A camada luminal (marrom) é composta pelas células epiteliais luminais, responsáveis pela síntese e secreção
do leite. A camada basal, subjacente (laranja), é composta pelas células mioepiteliais, que auxiliam na
condução do leite durante a amamentação. Envolvendo completamente o epitélio encontra-se a membrana
basal, um componente especializado da matriz extracelular. Modificado de Adriance et al. (2005).
32
primeira camada, voltada para o lúmen, encontram-se as células epiteliais luminais,
responsáveis pela síntese e secreção do leite. Na segunda camada, subjacente, encontram-se as
células mioepiteliais2, um tipo celular com capacidade contráctil que auxilia na ejeção do leite
durante a amamentação. Todo esse componente epitelial é envolvido pela membrana basal, que
ancora as células e as separa do estroma, além de influenciar fortemente o desenvolvimento e
a fisiologia da glândula (Adriance et al., 2005). Essa organização em bicamada se repete em
toda extensão da glândula, desde os ácinos até os ductos, os quais se diferenciam das estruturas
acinares pela reduzida ou inexistente capacidade secretória. Apesar dessa caracterização
generalizada, a organização celular da glândula mamária também conta com outros tipos
celulares, como as células progenitoras específicas luminais e específicas mioepiteliais ou a
população transiente composta principalmente por macrófagos e linfócitos (Macias e Hinck,
2012; Visvader e Stingl, 2014).
Na Figura 4 é possível ver um esquema simplificado do desenvolvimento da glândula
mamária em camundongo. A glândula se origina durante o período embrionário, e ao
nascimento um pequeno sistema ductal rudimentar está formado (Richert et al., 2000).
Diferente dos outros órgãos, a glândula mamária cessa o seu desenvolvimento com o fim do
período intrauterino e permanece em um estado latente até o início da puberdade. Com a
chegada deste período, o sistema ductal rudimentar cresce em resposta aos hormônios estrógeno
e progesterona, invade o mesênquima e se ramifica, ao mesmo tempo em que ocorrem a
expansão do lúmen, a polarização e diferenciação do epitélio e o desenvolvimento do fat pad,
um tecido conjuntivo adiposo característico da glândula mamária de camundongos (Inman et
al., 2015). Ao final da puberdade, está formado um epitélio ramificado complexo e
relativamente quiescente. Durante a gravidez, a produção sustentada de progesterona e de
2 Apesar da similaridade com células musculares devido à sua atividade contrátil, as células mioepiteliais possuem
origem embrionária diversa (são derivadas da ectoderme) e expressam marcadores epiteliais característicos
(citoqueratinas).
33
prolactina permite ainda mais a proliferação do epitélio mamário e a sua diferenciação funcional
nas estruturas terminais acinares. A amamentação durante o período pós-parto garante que toda
a glândula funcione para a produção de leite enquanto este for fonte de nutrientes para o
neonato. Ao término da lactação, o desmame desencadeia o processo de involução da glândula
e morte apoptótica do epitélio até um estágio estrutural próximo ao visto antes da gravidez.
Esse estado se mantém até o próximo período gestacional, quando um novo período de
desenvolvimento se inicia (Brisken et al., 1999; Richert et al., 2000; Russo et al., 2001).
Todo o desenvolvimento e homeostase da glândula são finamente regulados por sinais
hormonais e microambientais (Brisken et al., 1999; Xu et al., 2010; Halder et al., 2012; Barry
e Camargo, 2013). Essa regulação pode se tornar aberrante devido a desorganização da
arquitetura tecidual, estabelecendo condições para o surgimento doenças como o câncer (Russo
et al., 2001; Gilgenkrantz, 2011).
Figura 4 – Desenvolvimento pós-natal da glândula mamária em camundongo. Representação
esquemática do desenvolvimento ao longo da vida da glândula mamária de camundongo mostrando os seus
vários estágios: pós-nascimento; puberdade; estro (período fértil feminino); gravidez; lactação (secreção
de leite e outros produtos); e involução (fim da produção e secreção de leite). Modificado de Brisken et al.,
2016.
34
1.2.2 A glândula mamária como modelo de estudo
Além da sua relevância, a glândula mamária possui outras características que a tornam
um bom modelo de estudo. Como exemplo, a mama é um órgão cujo desenvolvimento mais
proeminente ocorre no período pós-natal, durante a puberdade, e atinge o seu ápice durante a
gravidez e lactação. Além disso, ao término da lactação a sua estrutura involui a um estádio
próximo ao do início da gravidez e se desenvolve novamente com o início de um novo período
gestacional.
Esse desenvolvimento cíclico envolve uma etapa de crescimento e outra de regressão
tecidual. Durante o seu crescimento, a glândula mamária exibe altas taxas de proliferação
celular e de invasão no tecido adjacente, processos presentes durante a morfogênese e que são
reconhecidamente desregulados no câncer. Além disso, mecanismos que ocorrem na
morfogênese da glândula, como diferenciação celular e interações célula-célula e célula-matriz,
também tem relevância para a origem do câncer (Russo et al., 2001; Inman et al., 2015).
Na glândula mamária de camundongo observamos que nas porções distais dos túbulos
em desenvolvimento existem pequenos bulbos, denominados “terminal end buds” (TEBs).
Essas regiões são microambientes extremamente dinâmicos e caracterizados pela pluripotência,
altas taxas de proliferação, invasão celular e remodelação da MEC (Wiseman et al., 2003).
Essas características também são encontradas em tumores mamários. Dessa forma, os TEBs
podem ser ótimos modelos fisiológicos para o estudo da regulação da comunicação entre a
MEC e a célula não somente durante a morfogênese, mas também na tumorigênese. Em
oposição, nos ductos proximais encontramos células quiescentes e em processo de
diferenciação. Em um esquema de uma secção de uma porção terminal da glândula mamária
em desenvolvimento (Figura 5) podemos ver uma estrutura bulbosa correspondente ao TEB, à
direita, e uma região ductal, à esquerda (Sternlicht, 2006). Essa região exibe uma lamina basal
35
com altas concentrações de laminina-111, que como já mencionado é uma proteína essencial
da membrana basal e fonte de sinais que inibem a proliferação e regulam sobrevivência e
diferenciação funcional do epitélio, inclusive mamário (Nelson et al., 2006). No entanto, apesar
de conhecermos a influência na laminina na diferenciação dos epitélios, parte dos mecanismos
sobre os quais os seus sinais são interpretados pela célula ainda carecem de mais informações.
1.3 A via Hippo
A via Hippo é uma via de sinalização que foi inicialmente descrita como responsável
pelo controle do tamanho de órgãos em Drosophila melanogaster por meio da regulação das
taxas de proliferação celular e apoptose (Zhao et al., 2008). Seu nome provem de sua proteína-
Figura 5 – Esquema da região de um terminal end bud (TEB) da glândula mamária de camundongo. À
esquerda está a região ductal, com células relativamente quiescentes e em processo de diferenciação, enquanto
à direita está o TEB, com células indiferenciadas e proliferativas. Em vermelho está a membrana basal, cuja
principal constituinte é a laminina-111. A ponta-de-seta preta indica uma ramificação lateral. Extraído de
Sternlicht (2006).
36
chave – a quinase Hippo (Hpo) –, batizada desta forma pois mutações em seu gene levam a um
crescimento tecidual exagerado e o indivíduo portador apresenta um fenótipo macrossômico,
semelhante a um “hipopótamo” (em inglês, hippopotamus ou hippo) (Huang et al., 2005; Lei
et al., 2008; Zhang et al., 2008). O core da via Hippo é composto por uma cascata de sinalização
altamente conservada e com funções similares tanto em Drosophila quanto em mamíferos
(Quadro 1), existindo inúmeras evidências da sua participação na regeneração tecidual, na
biologia de células-tronco e na tumorigênese (Chen, C. L. et al., 2012; Chen, D. et al., 2012;
Liu et al., 2012; Barry e Camargo, 2013; Ma et al., 2015).
Quadro 1 – Componentes da via Hippo
Drosophila Mamíferos* Função na via Hippo
Hippo (Hpo) Mammalian Ste-20-like kinases 1/2
(MST1 / Mst1, MST2 / Mst2) Quinase que fosforila e ativa Warts/LATS
Salvador
(Sav)
SAV1 / Sav1 (também denominada
WW45 / Ww45)
Proteína contendo domínio WW que age como uma
proteína-scaffold, facilitando a fosforilação de
Warts/LATS por Hippo/MST
Warts (Wts) Large tumor suppressor 1/2
(LATS1 / Lats1, LATS2 / Lats2) Quinase que fosforila e inativa Yorkie/YAP/TAZ
Mob as tumor
supressor
(Mats)
MOB / Mob kinase activator 1 A/B
(MOB1A / Mob1A, MOB1B /
Mob1B)
Quinase que se associa com Warts/LATS e
potencializa sua atividade catalítica
Yorkie (Yki)
Yes-associated protein (YAP /
Yap), Transcriptional co-activator
with PDZ-binding motif (TAZ /
Taz, também denominado WWTR1
/ Wwtr1)
Coativador de transcrição que se liga a fatores de
transcrição (como Scalloped/TEAD) quando está em
sua forma ativa e não-fosforilada para promover a
transcrição de alvos relacionados ao crescimento
celular, à proliferação e à prevenção da apoptose
Scalloped (Sd) Transcriptional enhancer factor
TEF 1-4 (TEAD1-4 / Tead1-4)
Fator de transcrição que se liga a Yorkie/YAP/TAZ
para regular a expressão de genes-alvo
* As siglas/abreviações grafadas apenas com a primeira letra em maiúscula referem-se ao ortólogos murinos, de
acordo com a nomenclatura oficial.
Fonte: Zhao et al. (2008) e Liu et al. (2012).
37
1.3.1 Mecanismo da via Hippo
Em mamíferos, os principais membros da via são MST1/2, SAV1, LATS1/2 e
MOB1A/B (Gumbiner e Kim, 2014). Quando Hippo está ativa, MST1/2 fosforila e se complexa
a SAV1; esse complexo então fosforila MOB1A/B, a qual se complexa a LATS1/2 e a recruta
para que também seja fosforilada por MST1/2 em seus resíduos de tirosina (Tir1079 para
LATS1 e Tir1041 para LATS2)3. SAV1 e MOB1A/B, dessa forma, atuam como scaffolds para
que MST1/2 seja capaz de ativar LATS1/2 através de fosforilação. LATS1/2 ativada então
fosforila YAP (Ser127) (Oka et al., 2008) e TAZ (Ser 89) (Lei et al., 2008) para promover
retenção citoplasmática ao aumentar a interação entre YAP/TAZ e a proteína 14-3-3 (Kanai et
al., 2000; Dong et al., 2007). Uma vez retidos no citoplasma, YAP e TAZ podem ser
ubiquitinados pelo complexo E3 ligase SCFβ-TrCP e degradados via proteassoma 26S (Liu et al.,
2010; Zhao et al., 2010). Quando a via Hippo está inativa, YAP e TAZ não são fosforilados e
podem ser translocados para o núcleo, onde atuam principalmente como co-ativadores da
família de fatores de transcrição TEAD (TEAD1/2/3/4; do inglês Transcriptional Enhancer
Factor Domain) e estimulando a expressão de genes relacionados a proliferação e diferenciação
celular (Zhao et al., 2008; Hilman e Gat, 2011) (Figura 6).
A via Hippo é descrita na literatura como uma das vias pelas quais a célula percebe
sinais do microambiente, mas, apesar de os aspectos gerais da via já serem conhecidos, diversos
pontos a respeito da sua ativação ainda não estão claros. Já foi demonstrado em células de
mamífero que Hippo é responsiva a sinais inibitórios de proliferação por contato célula-célula
(Zhao et al., 2007). Em Drosophila esses sinais são recebidos pela protocaderina Fat e
transduzidos até Hippo pelas proteínas Kibra, Merlin e Expanded (Bennett e Harvey, 2006;
Silva et al., 2006; Willecke et al., 2006; Yu et al., 2010; Su et al., 2017), mas ainda não existem
3 Os sítios de fosforilação fazem referência sempre ao ortólogos humanos, exceto quando especificado.
38
indícios concretos de que os seus ortólogos em mamíferos desempenhem da mesma maneira
essa função. Adicionalmente, Hippo também pode ser ativada com participação de RASSF
(Bitra et al., 2017) e da quinase TAO1 (Boggiano et al., 2011; Chung et al., 2016), fosforilando
Figura 6 – Esquema da via de sinalização Hippo. A fosforilação de MST1/2 e LATS1/2 leva à fosforilação
de YAP/TAZ, que são retidos no citoplasma por proteínas 14-3-3. YAP/TAZ citoplasmáticos são reconhecidos
pelo complexo E3 ligase SCFβ-TrCP, poliubiquitinados e degradados via proteassoma. YAP/TAZ não-
fosforilados são translocados para o núcleo, onde atuam como co-ativadores de transcrição. Esquema
elaborado pelo autor.
39
e ativando MST1/2 de maneira diferente ao mecanismo anteriormente proposto, ou então
através de autofosforilação de MST1/2 por homo- ou heterodimerização das duas proteoformas
(Glantschnig et al., 2002; Praskova et al., 2004).
1.3.2 YAP e TAZ
Como mencionado anteriormente, YAP e TAZ são os dois efetores elucidados da via
Hippo em mamíferos e ortólogos de Yorkie, o efetor da via em Drosophila. Em sua isoforma
canônica, YAP é uma proteína de 504 aminoácidos e 54,5kDa (488 aminoácidos e 52,4kDa em
camundongo) e é codificado pelo gene Yap1, localizado no cromossomo 11 (Overholtzer et al.,
2006). Em humanos, YAP possui oito isoformas como resultado de splicing alternativo,
enquanto em camundongo existem duas isoformas confirmadas (Gaffney et al., 2012; Sudol,
2013; Scavuzzo et al., 2018). Ainda que essas isoformas sejam expressas diferencialmente entre
os vários tecidos, a literatura científica ainda carece de trabalhos que aprofundem na função e
estrutura dessas isoformas. Por outro lado, TAZ possui apenas uma isoforma conhecida, embora
existam algumas isoformas mapeadas por bioinformática (Verma et al., 2018). Também
denominado WWTR1, TAZ é uma proteína paráloga de YAP e surgiu no curso da evolução
como resultado de um evento de duplicação gênica (Hilman e Gat, 2011; Varelas, 2014). Possui
400 aminoácidos e 44,1kDa (395 aminoácidos e 43,6kDa em camundongo) e é codificado pelo
gene Wwtr1, localizado no cromossomo 3 (Sundell et al., 2018; Verma et al., 2018).
Estruturalmente, tanto YAP quanto TAZ possuem três domínios importantes para a sua
atividade (Figura 7) (Hong e Guan, 2012; Sudol et al., 2012): i) domínio C-terminal de
transativação (TAD), onde se localiza o motivo de ligação PDZ (PDZ-BM) necessário para
interação com proteínas de membrana e componentes do citoesqueleto (Lee e Zheng, 2010); ii)
domínio WW, necessário para a interação com outras proteínas (presente em uma cópia em
40
TAZ e em duas em YAP) (Bork e Sudol, 1994); iii) domínio de interação com TEAD (TID),
onde se localiza a maioria dos sítios de fosforilação necessários para a interação e fosforilação
por LATS1/2 (Li et al., 2010). YAP se diferencia de TAZ pela presença de um domínio N-
terminal rico em prolina e do motivo de ligação de homologia a SRC 3 (SH3-BM), encontrado
em proteínas reguladoras do citoesqueleto, fosfolipases e tirosina quinases como YES e SRC
Figura 7 – Comparação estrutural entre YAP e TAZ humanos e o seu ortólogo Yorkie em Drosophila.
TAD corresponde ao domínio de transativação; WW corresponde ao domínio de interação WW; PRO
corresponde a um domínio rico em prolina, presente apenas em YAP; TID e SID correspondem aos domínios
de interação com TEAD e Scalloped, respectivamente; SH3-BM corresponde ao motivo de ligação de
homologia a SRC 3; PDZ-BM corresponde ao motivo de ligação PDZ; P corresponde aos sítios de fosforilação
necessários para a interação com LATS1/2 para YAP e TAZ ou com Warts para Yorkie. Baseado em Hong et
al. (2012).
41
(Sudol, 1994; Mayer, 2001). Comparativamente, Yorkie possui apenas dois domínios WW e
um domínio de interação com Scalloped (SID) (Hong e Guan, 2012).
Apesar de YAP e TAZ possuírem funções celulares que se sobrepõem (Plouffe et al.,
2018), as mais importantes observações vieram do estudo de YAP e de como o seu padrão de
localização e de fosforilação se alteram de acordo com a densidade celular (Zhao et al., 2007).
Em seguida vieram trabalhos indicando que tanto a rigidez da matriz extracelular quanto a
geometria celular também podem regular YAP de maneira independente da via Hippo via
Figura 8 – Modulação da localização de YAP de acordo com os sinais do microambiente. Sinais
mecânicos e topológicos do microambiente, como rigidez, superfície, confluência e estiramento, regulam a
localização de YAP, proteína efetora da via Hippo. Modificado de MBINFO (Disponível em
https://mechanobio.info. Acesso em: 19/10/18).
42
atividade da Rho GTPase a da tensão do citoesqueleto de actina (Dupont et al., 2011). Estudos
mais recentes mostram que, apesar do estímulo inibitório da proliferação por contato célula-
célula, quando células confluentes sofrem tensão por estiramento, este estímulo é suficiente
para promover a entrada de YAP no núcleo e estimular novamente a proliferação celular
(Aragona et al., 2013), o que pode ser particularmente importante no câncer (Figura 8).
Ainda que se saiba que alterações na MEC podem influenciar a localização celular (e
consequentemente a atividade) de YAP (Halder et al., 2012; Schroeder e Halder, 2012), há
pouca informação na literatura sobre quais receptores ou moléculas participam dessa
modulação. Estudos recentes mostram que sinais transduzidos pelo citoesqueleto como a
densidade celular, a tensão de estiramento, a rigidez do microambiente no qual as células estão
inseridas e a sinalização por receptores acoplados à proteína G podem alterar a capacidade e o
padrão proliferativo de epitélios através do controle da translocação e ativação de YAP/TAZ
(Halder et al., 2012; Schroeder e Halder, 2012; Gaspar e Tapon, 2014; Gumbiner e Kim, 2014;
Low et al., 2014). É importante ressaltar que neste contexto de sinalização mecânica a regulação
de YAP/TAZ pode ocorrer de maneira dependente ou não da via Hippo canônica (eixo MST1/2-
LATS1/2). Também já foi demonstrado que, em tumores, YAP é necessário para que
fibroblastos associados ao câncer (CAF; em inglês “cancer associated fibroblast”) promovam
aumento da rigidez da matriz extracelular, invasão de células malignas e angiogênese. O
aumento da rigidez da matriz, por sua vez, ativa YAP, estabelecendo um feedback que mantem
o fenótipo de CAF (Calvo et al., 2013). Esta influência do microambiente indica o quanto a
regulação de YAP/TAZ por sinais mecânicos pode ser multifacetada.
Estas observações são importantes para o nosso entendimento de como pistas do
microambiente pode alterar a sinalização celular, em especial na transformação maligna onde
Hippo está desregulada e a rigidez da matriz tem profunda implicância. Embora trabalhos
prévios evidenciem o envolvimento do microambiente na regulação da via Hippo em diferentes
43
modelos biológicos, ainda não está completamente elucidado se a via Hippo intermedeia a
modulação de YAP pelo microambiente ou se outras vias de sinalização participam deste
processo, e ainda quais seriam as moléculas e receptores da MEC que estariam envolvidos.
1.4 Resultados preliminares que fundamentam este trabalho
Como já pontuado, a glândula mamária em desenvolvimento é um ótimo modelo para
estudos de proliferação e invasão devido às características do microambiente encontrado nas
suas porções distais (Wiseman et al., 2003), os TEBs, quando comparado com o os ductos
proximais, nos quais as células estão em processo de diferenciação e são encontradas altas
concentrações de laminina-111 (Nelson et al., 2006). Assim, como uma análise exploratória
inicial, nosso laboratório utilizou um banco de dados já publicado que compara o perfil de
expressão gênica entre TEB e ductos quiescentes (Kouros-Mehr e Werb, 2006) e, com o uso de
ferramentas de bioinformática, avaliou nestes dois perfis a representação de assinaturas
gênicas4 de fatores de transcrição e co-ativadores de transcrição que são reconhecidamente
influenciados por sinais microambientais (Descot et al., 2009; Zhang, H. et al., 2009; Zhang,
X. et al., 2009; Delacroix et al., 2010; Cordenonsi et al., 2011; Lund et al., 2013). Os resultados
desta análise mostram que somente as assinaturas YAP/TAZ(b) e NFκΒ estão
suprarrepresentadas no TEB (p<0,01) e não estão estatisticamente representadas no ducto
(Figura 9). Entretanto, YAP/TAZ(b) é representada no TEB por 26% dos genes da assinatura,
enquanto somente 15% dos genes da assinatura NFκΒ estão representados no TEB. A maioria
dos genes regulados por Yap/Taz presentes no perfil de expressão do TEB codifica proteínas
que regulam a proliferação, a dinâmica do citoesqueleto e a invasão celular. É importante
4 Assinaturas gênicas são aqui definidas como uma lista de genes que tem expressão regulada por uma
determinada proteína.
44
ressaltar que a assinatura Yap/Taz também está suprarrepresentada no perfil de expressão
gênica de estruturas 3D malignas cultivadas em gel rico em laminina-111 e que a expressão de
vários genes da assinatura que são encontrados no perfil maligno também está relacionada com
uma pobre sobrevida dos pacientes com câncer de mama (dados do laboratório ainda não
publicados). Estes resultados preliminares, em conjunto com o fato de a laminina-111 estar
altamente concentrada ao redor dos ductos quiescentes, sugerem que a via Hippo pode estar
envolvida no controle de ramificação e crescimento da glândula mamária e que Yap esteja
predominantemente no núcleo em células do TEB, microambiente no qual a concentração de
laminina-111 é baixa.
Figura 9 – As assinaturas YAP/TAZ(b) e NFκΒ estão suprarrepresentadas em TEB e não estão
estatisticamente representadas no ducto. No esquema simplificado do epitélio mamário em
desenvolvimento estão evidenciados os microambientes TEB e ducto. O TEB apresenta baixa concentração
de laminina-111 (em rosa), além de uma grande quantidade de células proliferativas, progenitoras e invasivas.
A tabela apresenta o resumo da análise de representação das assinaturas nos perfis de expressão de TEB e
ducto. Os dados dos perfis de expressão na glândula mamária em desenvolvimento são oriundos de Kouros-
Merch e Werb (2006)33. As assinaturas gênicas também são oriundas de outros trabalhos (YAP/TAZ ((a)
Zhang et al., 2009; (b) Cordenonsi, 2011); SRF (Descot et al., 2010); RAR (Delacroix, 2010); NFκΒ (Park et
al., 2008); Lamina A/C (Lund et al., 2013)).
45
Para checar se esta hipótese é coerente, nosso grupo verificou por imunofluorescência
seguida de microscopia confocal a localização de Yap e de laminina-111 na glândula mamária
de camundongos Balb/C fêmeas de 5 semanas de vida, idade em que há grande número de
TEBs. Consistente com a hipótese, as células do TEB apresentaram Yap predominantemente
nuclear. No entanto, de forma inesperada, apesar de as células do ducto serem negativas para
Yap nuclear, aparentemente a concentração total de Yap não é reduzida; Yap é mantido no
citoplasma das células ductais (Figura 10).
Com a finalidade de estudar se a laminina-111 é capaz de regular a localização e
atividade nuclear de Yap no TEB e no ducto, foram utilizados modelos de cultura de células
que mimetizam algumas características destes dois microambientes. As células epiteliais
mamárias murinas da linhagem EpH4 em cultura 2D (em monocamada) subconfluentes
expressam níveis reduzidos de laminina-111, são indiferenciadas e altamente proliferativas,
Figura 10 – As células do TEB apresentam Yap localizado preferencialmente no núcleo, enquanto em
células ductais Yap é mais concentrado no citoplasma. Criocorte de uma glândula mamária de
camundongo fêmea Balb/C de 5 semanas submetido à imunofluorescência para Yap (vermelho) e laminina-
111 (verde) e analisadas no microscópio confocal. Os núcleos marcados com DAPI (azul). Barra de aumento
= 20µm (resultados obtidos pela pós-doutoranda Ana Zen no desenvolvimento do seu projeto – FAPESP
2014/25832-1).
46
características que são também encontradas nos TEBs. Neste modelo, Yap está
preferencialmente localizado no núcleo, assim como nos TEBs. Para modelar as regiões ductais,
as mesmas células EpH4 foram cultivadas num meio 3D rico em laminina-111 (3D-lrECM).
Neste ensaio, as células EpH4 formam estruturas esferoides, polarizadas, quiescentes, com uma
membrana basal organizada e que se assemelham morfologicamente a um ducto mamário
seccionado transversalmente. Similar ao visto nos ductos quiescentes da glândula mamária, as
estruturas formadas por células EpH4 em meio 3D rico em laminina-111 apresentaram Yap
concentrada no citoplasma (Figura 11).
Esses resultados indicam, assim, que a arquitetura tecidual e a membrana basal
influenciam a localização e atividade de Yap, proteína efetora da via Hippo, nas células
epiteliais da glândula mamária. Explorando a hipótese que a via Hippo esteja envolvida em
processos cruciais do desenvolvimento e biologia da glândula mamária e que possa intermediar
Figura 11 – Um ambiente 3D rico em laminina-111 induz a translocação de Yap do núcleo para o
citoplasma em células EpH4. A, imagem confocal de imunofluorescência de células EpH4 subconfluentes
cultivadas em monocamada (2D). Nesta condição, Yap (verde) encontra-se predominantemente no núcleo;
B, imagem confocal de criocorte de uma estrutura formada por células EpH4 cultivada em gel 3D rico em
laminina-111 e submetido a reações de imunofluorescência para Yap (verde) e para colágeno tipo IV
(vermelho), evidenciando a organização de uma membrana basal. Neste ensaio Yap encontra-se
predominantemente no citoplasma. Os núcleos foram marcados com DAPI (azul). Barra de aumento = 10µm
(resultados obtidos pela pós-doutoranda Ana Zen no desenvolvimento do seu projeto – FAPESP 2014/25832-
1).
A B
47
os sinais da MEC que regulam esses processos e com o intuito de compreender como os sinais
da membrana basal influenciam Yap, decidimos investigar quais proteínas estariam interagindo
com Yap em células epiteliais da glândula mamária e um contexto de diferenciação mediada
pela membrana basal.
48
49
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho é investigar como os sinais da membrana basal
influenciam a atividade de Yap e a sua interação com outras proteínas em células epiteliais da
glândula mamária.
2.2 Objetivos específicos
Os dois objetivos específicos deste trabalho são direcionados ao entendimento do papel
da via Hippo-Yap na transdução de sinais da matriz extracelular.
Objetivo específico 1: Investigar como os sinais da membrana basal influenciam a via
Hippo-Yap em um modelo de acinogênese em cultura de células mamárias murinas.
Objetivo específico 2: Identificar as proteínas interagentes de Yap por co-
imunoprecipitação seguida por espectrometria de massas nas frações citoplasmática e nuclear
de células epiteliais murinas da glândula mamária em resposta à membrana basal.
Objetivo específico 3: Padronizar o ensaio de identificação por biotinilação dependente
de proximidade (BioID) para a determinação das proteínas interagentes de Yap.
50
51
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Linhagens celulares e condições de cultivo
Para o modelo utilizado neste trabalho foram utilizadas células epiteliais da glândula
mamária de camundongo da linhagem EpH4, gentilmente cedidas pela Dra. Mina J. Bissell do
Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley, CA, EUA). Esta linhagem exibe
características morfológicas e funcionais típicas de células normais (não-tumorais) do epitélio
mamário murino. Para a sua expansão, as células foram cultivadas em meio DMEM/F12 1:1
(Gibco) suplementado com 5µg/mL de insulina de pâncreas bovino (Sigma-Aldrich), 2% de
soro bovino fetal inativado (Gibco) e 50µg/mL de gentamicina (Gibco), e mantidas em estufa
umidificada sob temperatura constante de 37°C e atmosfera contendo 5% de CO2. Em todos os
experimentos foram utilizadas células entre as passagens 14 e 19 e cultivadas por ao menos
duas passagens após o descongelamento.
Para os experimentos preliminares do ensaio de BioID foram utilizadas células
embrionárias imortalizadas de rim humano da linhagem 293FT, também gentilmente cedidas
pela Dra. Mina J. Bissell. Esta linhagem é derivada da linhagem 293F (uma sublinhagem da
HEK293) e expressa de maneira estável o antígeno SV40 large T do plasmídeo
pCMVSPORT6TA.neo, o qual promove uma produção viral ótima ao facilitar a replicação
epissomal de vetores que contém promotor e origem de replicação derivados do vírus SV40.
Para a sua expansão, as células foram cultivadas em meio DMEM High Glucose (Gibco)
suplementado com 0,1mM de aminoácidos não-essenciais (GE Healthcare Life Sciences), 2mM
de L-glutamina (Gibco), 1mM de piruvato de sódio (Gibco), 10% de soro bovino fetal inativado
e 50µg/mL de gentamicina, e mantidas em estufa umidificada sob temperatura constante de
37°C e atmosfera contendo 5% de CO2. Pela sua aplicação neste trabalho e por ser uma
52
linhagem permanente de origem embrionária que não perde facilmente suas características após
sucessivas passagens em cultura, o número de passagens não foi considerado.
3.2 Ensaio tridimensional (3D) de acinogênese em ambiente rico em laminina
3.2.1 Coating das placas de cultivo
Todas as placas utilizadas para o ensaio 3D foram previamente tratadas com o polímero
poli(2-hidroxietil metacrilato) (PolyHEMA; Sigma-Aldrich), o qual forma um gel no fundo da
placa que não permite a adesão das células. O coating de PolyHEMA foi feito a uma densidade
de 0,8mg/cm² a partir de uma solução preparada em condições assépticas contendo 12mg/mL
do polímero diluídos em etanol 95%. Após a adição de PolyHEMA as placas foram colocadas
em estufa seca sob temperatura constante de 37°C até a secagem completa (em torno de 48
horas), quando então foram seladas com parafilme e mantidas sob refrigeração a 4°C até o
momento do uso.
3.2.2 Plaqueamento e cultivo 3D das células sobre matriz de PolyHEMA
O protocolo do ensaio de acinogênese estabelecido no laboratório é uma modificação
do descrito na literatura (Mroue e Bissell, 2013) (Figura 12, página 70). Essencialmente,
células EpH4 cultivadas em monocamada e com confluência máxima 5 de 80% foram
tripsinizadas com uma solução 0,05% de tripsina-EDTA (Gibco) por 5 minutos, coletadas por
centrifugação (200xg por 5 minutos em temperatura ambiente) e ressuspendidas em meio
DMEM/F12 1:1 suplementado com 5µg/mL de insulina de pâncreas bovino, 1µg/mL de
5 Mensurada por inspeção visual em microscópio óptico.
53
hidrocortisona (Sigma-Aldrich) e 50µg/mL de gentamicina. As células foram plaqueadas sobre
o coating de PolyHEMA a uma densidade de 10000 células/cm² em um volume suficiente para
formar uma coluna de meio de 3mm de altura e mantidas em estufa umidificada por um período
de 24 a 48 horas para a formação dos clusters. Após esse período, as estruturas formadas foram
coletadas por centrifugação (200xg por 2 minutos em temperatura ambiente) e em seguida
cultivadas novamente sobre um coating de PolyHEMA em meio DMEM/F12 1:1 suplementado
com 2% de matriz extracelular rica em laminina (Matrigel®, Corning), 5µg/mL de insulina de
pâncreas bovino, 1µg/mL de hidrocortisona e 50µg/mL de gentamicina, por um período de 48
a 72 horas.
3.2.3 Análise morfológica das estruturas 3D formadas
O sucesso na formação das estruturas 3D e no processo de acinogênese foi avaliado por
microscopia de luz utilizando o microscópio DMi1 (Leica Microsystems) e as imagens foram
capturadas com a câmera acoplada ao microscópio utilizando o software LAX (Leica
Microsystems). Foram analisados o número de estruturas com morfologia acinar (presença ou
ausência de lúmen), o tamanho das estruturas (através do cálculo da área expandida) e a
circularidade das estruturas, dada pela fórmula:
𝐶 = 4𝜋𝐴
𝑃²
Onde C é o valor de circularidade, A é a área do plano médio e P é o perímetro. As
análises foram feitas com o software ImageJ2 v1.52f oferecido na distribuição Fiji (Schindelin
et al., 2012; Rueden et al., 2017) e com o auxílio do plugin PHANTAST v0.2 (Jaccard et al.,
2014). Resumidamente, após a calibração para a escala micrométrica, as imagens foram
54
convertidas para o formato 32-bit e o delineamento das estruturas foi feito com o plugin
PHANTAST (parâmetros: sigma = 1.20; epsilon = 0.25; do halo correction = habilitado;
selection overlay on original image = habilitado; new mask image = habilitado). A máscara
gerada foi corrigida com a ferramenta Fill Holes e analisada com a ferramenta Analyze Particles
(parâmetros: size = 500-infinity; area = habilitado; shape descriptors = habilitado; perimeter =
habilitado). A presença de lúmen nas estruturas foi determinada por inspeção visual das
fotomicrografias de contraste de fase e a contagem foi feita manualmente.
3.3 Análise de expressão gênica por PCR quantitativo (qPCR)
3.3.1 Extração do RNA total e síntese do cDNA
O cultivo das células EpH4 foi feito como descrito no item 3.2.2. As estruturas foram
coletadas por centrifugação (200xg por 2 minutos em temperatura ambiente) e o RNA total foi
extraído utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do
fabricante. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total extraído (1µg/reação) utilizando a
enzima Superscript II (Invitrogen) como transcriptase reversa e sequências de oligo 20d(T)
(Invitrogen) de hexâmetros randômicos (Invitrogen) como primers.
3.3.2 Desenho dos primers, curva de eficiência de amplificação e qPCR
O desenho dos primers utilizados neste trabalho foi feito com o auxílio da ferramenta
online Primer-BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI;
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), tomando-se como base as sequências de
mRNA dos genes em estudo. A seleção dos pares de primers foi feita de maneira que: a) as
55
sequências cobrissem junções éxon-éxon do mRNA template; b) o produto da PCR possuísse
entre 70 e 120 pares de base de comprimento; c) as temperaturas de melting (Tm) estivessem
em valores próximos de 60°C; d) se evitasse quatro ou mais bases iguais em sequência; e) a
porcentagem de guanina e citosina (GC%) estivesse entre 50 e 60%; f) as sequências
preferencialmente terminassem em G ou C para maior estabilidade térmica; e g) as sequências
possuíssem valores altos de ΔG para a formação de homodímeros, heterodímeros e hairpins. A
análise destes parâmetros foi feita com o próprio Primer-BLAST ou com a ferramenta online
OligoAnalyser 3.1 (Integrated DNA Technologies; https://www.idtdna.com/calc/analyzer).
Uma vez definidos os pares de primers, os mesmos foram encaminhados para síntese química
por empresas especializadas. Os genes analisados neste trabalho foram Ankrd1 (Ankyrin repeat
domain-containing protein 1; NCBI Acession ID NM_013468.3), Csn2 (Casein beta; NCBI
Acession ID NM_001286020.1), Ect2 (Epithelial cell transforming 2; NCBI Acession ID
NM_001177625.1); Mst2 (ou Stk3, Serine/threonine-protein kinase 3; NCBI Acession ID
XM_011245368.2); e Yap (Yes-associated protein; NCBI Acession ID NM_001171147.1). O
gene B2m (beta-2-microglobulin; NCBI Acession ID NM_009735.3) foi utilizado como
controle de expressão gênica endógena para fins de normalização. As sequências dos primers
utilizados encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1 - Primers utilizados na análise de expressão gênica
Primer Fabricante Sentido Sequências (5’-3’)
Ankrd1 Invitrogen Forward GAGACACCCCACTGCATGAT
Reverse TTCCCAGCACAGTTCTTGACC
B2m Invitrogen Forward CACTGAATTCACCCCCACTGA
Reverse TGTCTCGATCCCAGTAGACGG
Csn2 Exxtend Forward CATTTACTGTATCCTCTGAGACTGA
Reverse TGTGACTGGATGCTGGAGTG
Ect2 Invitrogen Forward GCACATCATCCTTAGCAGGTAT
Reverse GTCAGCGTCTTGTTGAAGCAT
Mst2 (Stk3) Exxtend Forward GAGAAGCTTGGAGAAGGGTCTT
56
Reverse GCAACCACTTGACCAGATTCC
Yap Exxtend Forward TTCGGCAGGCAATACGGAAT
Reverse CATCCTGCTCCAGTGTAGGC
As reações foram montadas em placas específicas de 96 poços utilizando o reagente
Power™ SYBR™ Green Master Mix (Applied Biosystems) de acordo com as recomendações
do fabricante. Para a quantificação foram aplicados 20ng de cDNA por reação, enquanto para
a construção da curva de eficiência de amplificação dos primers foram utilizados 80ng, 8ng,
800pg, 80pg e 8pg6. As reações foram feitas no termociclador 7500 Real-Time PCR Systems
(Applied Biosystems).
3.3.3 Cálculo de eficiência de amplificação e de expressão gênica relativa
A quantificação da expressão gênica foi feita pelo método de Pfaffl (Pfaffl, 2001), no
qual calcula-se as razões de expressão gênica relativa (R) para os genes-alvo do estudo com
base na eficiência de amplificação (E) e nos desvios de Cycle Threshold (CT) de uma amostra
com relação ao controle, através da seguinte equação:
𝑅 =𝐸𝑎𝑙𝑣𝑜
∆𝐶𝑇𝑎𝑙𝑣𝑜(𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒−𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)
𝐸𝑟𝑒𝑓∆𝐶𝑇𝑟𝑒𝑓(𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒−𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)
Sendo que a eficiência de amplificação é dada por:
𝐸 = 10(−1∕𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒)
6 Especificamente para o par de primers para Csn2 foram utilizados 50ng, 5ng, 500pg, 50pg e 5pg
57
O valor de slope é o coeficiente angular da regressão linear da curva de eficiência de
amplificação do transcrito para cada gene analisado.
3.4 Co-imunoprecipitação (CoIP)
Para o experimento de CoIP utilizamos como modelo de cultura o ECM overlay (Streuli,
Schmidhauser, et al., 1995) (Figura 19, página 80). Brevemente, células EpH4 foram
plaqueadas a uma densidade de 2x10³/cm² e cultivadas overnight em meio de crescimento. No
dia seguinte o meio foi trocado por DMEM/F12 1:1 suplementado com 5µg/mL de insulina de
pâncreas bovino, 1µg/mL de hidrocortisona e 50µg/mL de gentamicina e as células foram
cultivadas nessas condições por 24 horas. Após esse período de cultivo, o meio foi trocado por
outro composto por DMEM/F12 1:1 suplementado com 2% de lrECM, 5µg/mL de insulina de
pâncreas bovino, 1µg/mL de hidrocortisona e 50µg/mL de gentamicina e as células foram
novamente incubadas em estufa por 48 horas, quando então foram levadas ao fracionamento
celular.
Para o fracionamento, as células foram lavadas 3 vezes com tampão fosfato salino (PBS)
gelado durante 5 minutos cada para a retirada do excesso de lrECM e raspadas na própria placa
com um scraper em tampão de fracionamento (tampão PBS, pH 7,4, e 0,5% de Nonidet P-40)
contendo inibidores de protease (Roche) e fosfatase (Sigma) nas concentrações sugeridas pelos
fabricantes. A suspensão celular foi transferida para microtubos e mantidas no gelo por 30
minutos para a lise das células, com agitação a cada 10 minutos. O lisado celular então foi
centrifugado a 14000xg por 20 minutos a 4°C e o sobrenadante (fração citoplasmática) foi
retirado e armazenado em ultrafreezer a -80°C até o momento do uso. O pellet resultante e o
interior do tubo foram lavados 2 vezes com o tampão de fracionamento e ressuspendido em
200µL deste mesmo tampão. Após a ressuspensão, o conteúdo dos microtúbulos foi sonicado
58
(3 vezes por 5 segundos, com intervalo de 30 segundos e amplitude de sonicação igual a 20)
com incubação no gelo e centrifugados a 14000xg por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante
resultante (fração nuclear) correspondente à fração nuclear, foi retirado e armazenado em
ultrafreezer a -80°C até o momento do uso.
Após a obtenção dos lisados, 275µg de proteína de cada amostra foram incubados
overnight sob refrigeração e agitação com 2µg do anticorpo monoclonal YAP (63.7) (Santa
Cruz Biotechnology). No dia seguinte, a mistura do lisado com o anticorpo foi incubada sob
refrigeração e agitação durante 2 horas com 100µL da suspensão de proteína G covalentemente
ligada a beads de agarose (GE Healthcare) previamente lavadas com 500µL de tampão de
fracionamento. Passado o tempo de incubação, as beads foram lavadas 3 vezes com 300µL de
tampão de fracionamento e as proteínas foram submetidas à preparação para espectrometria de
massas. Como condição controle da CoIP foi feita também a incubação do lisado com 2µg de
IgG total de camundongo, purificada diretamente do soro e gentilmente cedida pela Prof. Dra.
Maria Júlia Manso Alves.
3.5 Ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID)
3.5.1 Construção e síntese das open reading frames (ORFs)
Para a construção das ORFs foi utilizada como biotina ligase a sequência da biotina
[acetil-CoA-carboxilase] ligase do organismo Aquifex aeolicus, cepa VF5 (UniProtKB –
O66837_AQUAE; NCBI Acession ID – WP_010880335.1) com mutação em um resíduo de
arginina na posição 40 (R→G), denominada BirA*; para a sequência de Yap foi utilizada a
variante 1 (488 resíduos de aminoácidos) de Yap1 murino (UniProtKB – P46938; NCBI
Acession ID – NM_001171147.1). Foram feitas duas construções diferentes: uma para
59
expressão de BirA* ligada no N-terminal de Yap1 e outra para a expressão na extremidade C-
terminal; entre as sequencias codificadoras das duas proteínas foi inserida uma sequência para
um espaçador (GGGGS)3, e uma sequência Myc tag foi inserida para que o epítopo fosse
expresso fusionado à biotina ligase. As sequencias correspondentes ao espaçador, à BirA* e ao
Myc tag foram códon-otimizadas com a ferramenta Codon Optimization disponível no portal
da empresa Blue Heron Biotech (https://blueheronbio.com), utilizando como parâmetro a codon
usage table de Mus musculus fornecida pela própria plataforma. As duas construções, “Myc-
BirA*-(GGGGS)3-Yap1” e “Yap1-(GGGGS)3-BirA*-Myc”, foram montadas com o auxílio do
software ApE – A Plasmid Editor (http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/); a sequência
de Kozak 5’-gccaccATGG-3’ (onde ATG é o start codon) e um sítio de restrição para EcoRI
foram adicionados upstream de cada ORF e um sítio para BamHI foi adicionado após o stop
codon. Uma vez finalizadas, as sequências foram enviadas para síntese química junto à
GeneArt® Gene Synthesis, empresa subsidiária da Thermo Scientific.
3.5.2 Clonagem molecular
Para a clonagem das duas construções de Yap ligado à biotina ligase no vetor de
expressão final, os plasmídeos fornecidos pela GeneArt® Gene Synthesis contendo as ORFs
foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI-HF (New England Biolabs) e BamHI-HF
(New England Biolabs) para liberação das sequencias de interesse e com a enzima BglI
(Fermentas) para fragmentação do vetor no qual as ORFs vieram clonadas. Após a digestão as
duas sequências foram purificadas com o kit QIAquick® Gel Extraction (Qiagen) após
eletroforese em gel 1% de agarose e ligadas com a enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) no vetor lentiviral de expressão induzida por doxiciclina pLVX-TetOne-Puro
(Clontech), previamente digerido com as enzimas EcoRI-HF e BamHI-HF.
60
Para a criação de um vetor controle contendo apenas BirA*, foi utilizada a construção
“Yap1-(GGGGS)3-BirA*-Myc” para a amplificação por PCR apenas da sequência codificadora
para BirA*-Myc utilizando a polimerase Q5 High Fidelity DNA Polynerase (New England
Biolabs) e os primers descritos na Tabela 2. O produto da reação foi purificado com o kit
QIAquick® Gel Extraction após eletroforese em gel de agarose 1%, digerido com as enzimas
de restrição EcoRI-HF e BamHI-HF, novamente purificado em gel e ligado ao vetor lentiviral
pLVX-TetOne-Puro da mesma forma que as outras ORFs.
Tabela 2 - Primers utilizados para a clonagem de BirA*-Myc
Produto Fabricante Sentido Sequências (5’-3’)
BirA*-Myc Invitrogen Forward ATGCGAATTCGCCACCATGTTCAAGAACTTG
Reverse ATGCGGATCCTTAAAGGTCCTCCTCGGA
Nota: As sequências sombreadas correspondem aos sítios das enzimas de restrição.
As reações de ligação foram utilizadas para a transformação por choque térmico de
bactérias quimiocompetentes Subcloning Efficiency™ DH5α™ (Invitrogen). Após a
transformação as bactérias foram incubadas em meio LB (Invitrogen) sob agitação orbital a
37°C, e então semeadas e cultivadas overnight em placas de petri contendo LB ágar (Invitrogen)
e 50µg/mL de ampicilina (Gibco) a 37°C em estufa seca. No dia seguinte as colônias isoladas
foram testadas por PCR para a presença dos respectivos insertos utilizando a enzima OneTaq®
DNA Polymerase (New England Biolabs) e os primers descritos na Tabela 3:
Tabela 3 - Primers utilizados para o PCR de colônia
Produto Fabricante Sentido Sequências (5’-3’)
BirA*-Myc Invitrogen Forward ATGCGAATTCGCCACCATGTTCAAGAACTTG
Reverse ATGCGGATCCTTAAAGGTCCTCCTCGGA
Myc-BirA*-Yap1 Invitrogen Forward TCCTGTCTTAGGTTAGTGAA
Reverse TATGCGGATCCCTATAACCACGTGAGAAA
Yap1-BirA*-Myc Invitrogen Forward TATGCGGTACCATGGAGCCCGCGCAACA
Reverse ATGCGGATCCTTAAAGGTCCTCCTCGGA
61
As colônias positivas para a inserção dos respectivos insertos foram expandidas e o
DNA plasmidial foi extraído com o kit Qiagen Plasmid Mid (Qiagen) para ser posteriormente
utilizado no experimento de transfecção transiente.
3.5.3 Transfecção transiente e teste de expressão
Para o teste de expressão, os vetores pLVX_BirA*-Yap1, pLVX_Yap1-BirA*,
pLVX_BirA* e o controle pLVX-TetOne-Puro foram transientemente transfectados em células
da linhagem 293FT. Aproximadamente 1x105 células foram semeadas em placas de 6 poços e
cultivadas por 24 horas, quando foram transfectadas com 2500ng de DNA de cada vetor
utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine 3000 (Invitrogen) de acordo com as
instruções do fabricante e então mantidas em cultura até o dia seguinte. Após o período de
transfecção, o meio das células foi trocado por meio de crescimento suplementado com 3µM
de biotina e 100ng/mL de hiclato de doxicilina (Sigma-Aldrich) e as células foram retornadas
à estufa para cultivo overnight. No dia seguinte, as células foram tripsinizadas e ressuspendidas
em tampão RIPA (50mM de Tris-HCl, pH 8,0, 150mM de NaCl, 0,1% de dodecil sulfato de
sódio [SDS], 1% de desoxicolato de sódio, 1% de Nonidet-P40 e 0,5% de EDTA) contendo
inibidores de protease e fosfatase para a lise das células. Os lisados foram então sonicados (3
vezes por 5 segundos, com intervalo de 30 segundos e amplitude de sonicação igual a 20) com
os tubos no gelo e centrifugados a 14000xg por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante resultante
foi armazenado em ultrafreezer -80°C até o momento do uso.
Para o experimento de imunofluorescência, 2x104 células foram plaqueadas sobre
lamínulas de vidro em placas de 24 poços. O procedimento de transfecção e cultivo das células
foi realizado da mesma maneira que para extração de proteínas. A preparação das células para
62
imunofluorescência está descrita no item 3.7.
3.5.4 Purificação das proteínas biotiniladas
Após a obtenção dos extratos proteicos, 1mg de proteína de cada amostra foi incubado
overnight sob refrigeração e agitação por inversão juntamente com 100µL da suspensão de
streptavidina conjugada a beads magnéticas Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1
(Invitrogen), previamente lavadas em 1mL de tampão RIPA por 5 minutos. Uma vez passado
o tempo de incubação, as beads foram precipitadas com uma rack magnética por 3 minutos
para retirada do sobrenadante e lavadas 3 vezes sob inversão por 5 cinco minutos cada com
1mL de tampão RIPA para a retirada de proteínas inespecificamente ligadas. As beads foram
então lavadas outras 3 vezes sob inversão por 5 minutos cada com 1mL de tampão de lavagem
(50mM de Tris-HCl, pH 8,0, e 150mM de NaCl) para a retirada do excesso de detergentes das
amostras, e então submetidas a uma terceira etapa de lavagem com 500µL com uma solução de
50mM de bicarbonato de amônio. Após as lavagens, as amostras foram preparadas para
espectrometria de massas.
3.6 Espectrometria de massas
3.6.1 Preparação das amostras
As amostras oriundas do experimento de CoIP foram resolvidas em gel de gradiente de
poliacrilamida Bolt™ 4-20% Bis-Tris Plus (Invitrogen) e coradas com Colloidal Coomassie R-
250 para demarcação das lanes. Cada lane foi fracionada em 4 partes e cada parte foi processada
e analisada separadamente no espectrômetro de massas. De maneira resumida, os fragmentos
63
de gel foram lavados para a retirada do SDS com uma solução de 100mM de bicarbonato de
amônio e incubados em 10mM de diclorodifeniltricloroetano (DTT; 1 hora a 56°C) e 55mM de
iodoacetamida (45 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz) para redução e alquilação
das pontes dissulfeto (em volumes suficientes para cobrir os fragmentos de gel). Na sequência,
as proteínas foram digeridas in gel e overnight a 37°C com 20ng de tripsina Sequencing Grade
Modified Trypsin (cat. V5111; Promega) em um volume final de 200uL de tampão de digestão
(40mM de bicarbonato de amônio e 10% de acetonitrila pura [Merck]). Os fragmentos de gel
foram desidratados com acetonitrila pura e o sobrenadante recuperado foi concentrado em speed
vac por tempo suficiente para a secagem total da amostra. Os peptídeos desidratados foram
ressuspendidos em solução 0,1% de ácido trifluoracético (TFA) e então dessalinizados com
ponteiras ZipTips C18 (Millipore), eluídos, secos novamente em speed vac e armazenadas em
ultrafreezer -80°C até o momento da análise.
Para as amostras do experimento-piloto de BioID, as beads foram precipitadas com a
rack magnética e ressuspendidas em 100µL de tampão de redução (50mM de bicarbonato de
amônio e 10mM de DTT) e incubadas por 1 hora a 65°C no banho seco. Após a incubação,
foram adicionados 11µL de tampão de alquilação (50mM de bicarbonato de amônio e 500mM
de iodoacetamida → concentração final: 55mM) às amostras resfriadas, que foram então
incubadas a temperatura ambiente por 45 minutos no escuro. As proteínas foram digeridas on
bead e overnight a 37°C com tripsina modificada à concentração de 0,1µg/µL. Após a digestão,
o sobrenadante foi retirado e as beads foram lavadas com 100µL de solução 50% de acetonitrila
pura e 5% de TFA, precipitadas e o sobrenadante resultante foi adicionado ao retirado
previamente. As amostras foram secas na speed vac, ressuspendidas em solução 0,1% de TFA
e dessalinizadas da mesma maneira que as amostras do experimento de CoIP.
64
3.6.2 Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS)
As amostras oriundas do experimento de CoIP foram analisadas no espectrômetro de
massas Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) acoplado ao sistema de cromatografia
líquida, instalado no Instituto de Química da USP e adquirido com recursos do CEPID
Redoxoma (FAPESP 2013/07937-8). Os peptídeos foram separados por cromatografia líquida
em coluna de fase reversa C18RP, submetidos à ionização por electrospray (ESI) e dissociação
induzida por colisão (CID).
As amostras obtidas no experimento de pulldown com streptavidina foram analisadas
no espectrômetro de massas LTQ-Orbitrap Velos ETD (Thermo Scientific) acoplado ao sistema
de cromatografia Easy nanoLC II (Thermo Scientific), pertencente à facility CEFAP BIOMASS
e instalado no Instituto de Ciências Biomédicas da USP. Os peptídeos foram separados por
cromatografia líquida em coluna de fase reversa C18RP com um gradiente de 115 minutos,
submetidos à ionização por ESI e dissociação por CID.
Para as duas análises as condições instrumentais foram checadas utilizando 100fmol de
um digerido tríptico de BSA como padrão. Vestígios de amostras foram completamente
removidos entre uma corrida e outra.
3.6.3 Análise dos dados
A partir dos espectros obtidos, foram feitas buscas no banco de dados UniProt com o
software MaxQuant (v. 1.6.2.10) para a identificação de proteínas de Mus musculus (proteoma
de referência UP000000589; organismo ID 10090) para o experimento de CoIP e a
identificação de proteínas de Homo sapiens(proteoma de referência UP000005640; organismo
ID 9606) para o experimento piloto de BioID. Como parâmetros específicos das buscas, foram
65
estabelecidas como modificações variáveis a oxidação da metionina e acetilação da porção N-
terminal (no experimento de BioID foi ainda considerada a possível biotinilação da lisina),
como modificação fixa a carbamidometilação da cisteína, o número máximo de modificações
por peptídeo igual a 5, digestão específica com tripsina (com o número máximo de
misscleavage igual a 2) e label-free quantification estabelecido com o parâmetro LFQ. Para o
restante dos parâmetros foram utilizadas as configurações default do software. Após a
identificação, foram filtrados os peptídeos reversos, os contaminantes comuns de
espectrometria de massas e as proteínas identificadas nas amostras imunoprecipitadas com IgG
inespecífica (experimento CoIP) ou nas amostras de células transfectadas com os vetores-
controle pLVX-TetOne-Puro e pLVX-BirA*. As proteínas restantes, consideradas como
potenciais interagentes de Yap, foram agrupadas em listas com o uso da ferramenta online
Venny (disponível em: http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/), definindo as proteínas
exclusivas e compartilhadas entre cada condição. A partir destas listas foram traçados os
diagramas de Euler usando o programa R v3.5.1 e o pacote VennDiagram v1.5. Em seguida,
com o uso da ferramenta online DAVID v6.8 (Database for Annotation, Visualization and
Integrated Discovery; disponível em: https://david.ncifcrf.gov/, utilizando as configurações-
padrão)(Huang et al., 2009a; b), foram avaliados os processos celulares nos quais as proteínas
podem estar envolvidas em cada uma das condições. Para o experimento de CoIP foram
utilizadas as anotações da database KEGG Pathway (KEGG_PATHWAY). Para o experimento
piloto de BioID, a anotação foi feita utilizando a lista total de proteínas identificadas para cada
condição (BirA*-Yap1 e Yap1-BirA*) e de acordo com as anotações do Gene Ontology
(GOTERM_BP_DIRECT). A construção das redes de interação foi feita com a plataforma
STRING v10.5 (Szklarczyk et al., 2015; Szklarczyk et al., 2017) e com a ferramenta de
exploração visual Biovista Vizit (Biovista) utilizando-se os settings padrões para as duas
ferramentas.
66
3.7 Imunofluorescência
Para os experimentos de cultura 3D, as estruturas foram coletadas por centrifugação em
temperatura ambiente a 100xg por 2 minutos e ressuspendidas em 50µL de tampão PBS gelado
contendo cloreto de cálcio e cloreto de magnésio (PBS Ca2+ Mg2+; Sigma-Aldrich).
Aproximadamente 20µL da suspensão foram espalhados sobre uma lâmina de vidro silanizada
para microscopia (StarFrost; Knittel) e deixados até secagem completa em uma estufa seca a
37°C. Uma vez secas, as estruturas foram fixadas com 4% da paraformaldeído (PFA) diluído
em PBS Ca2+ Mg2+ por 15 minutos, lavadas por 10 minutos com 0,1M de glicina diluído em
PBS para neutralização do PFA, permeabilizadas com solução 0,5% de Triton X-100 diluído
em PBS contendo 1% de BSA durante 30 minutos hora e bloqueadas por 1 hora com 1% de
BSA diluído em PBS. Após o bloqueio as estruturas foram incubadas overnight a 4°C com o
anticorpo primário diluído em PBS contendo 1% de BSA. No dia seguinte, as estruturas foram
lavadas 3 vezes com PBS, incubadas por 2 horas em temperatura ambiente com os anticorpos
secundários fluorescentes, novamente lavadas 3 vezes com PBS e incubadas com 5µg/mL de
4’,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) para marcação do DNA. Após lavagens, as lâminas foram
montadas com meio Prolong Gold Anti-fade (Molecular Probes) e seladas no dia seguinte. Para
os experimentos imunofluorescência do ensaio de BioID, as células crescidas sobre as
lamínulas foram lavadas 2 vezes com PBS gelado para retirada do meio de cultura e o restante
do procedimento foi feito da mesma maneira que nas estruturas 3D. A relação dos anticorpos
utilizados nas análises por imunofluorescência encontra-se na Tabela 4.
Tabela 4 - Anticorpos utilizados nas análises por imunofluorescência
Produto Fabricante Catálogo Diluição
Anticorpos primários
YAP (D8H1X) Cell Signaling Technology 4912S 1:400
MYC tag Cell Signaling Technology 2272S 1:400
67
Lamin B (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-6216 1:400
Anticorpos secundários fluorescentes
Donkey anti-goat Alexa-488 Molecular Probes A11055 1:400
Donkey anti-rabbit Alexa-555 Molecular Probes A31572 1:400
Goat anti-mouse Alexa-647 Molecular Probes A28181 1:400
Avidina
Avidin Alexa Fluor-488 Molecular Probes A21370 1:1000
As imagens de imunofluorescência das estruturas 3D foram capturadas como z-stacks
(parâmetros: magnification: 63x; number of stacks: ~100) em um microscópio DMi8 (Leica
Microsystems) e submetidas a deconvolução (parâmetros: deconvolution = blind; number of
iteractions = 10; resize to 16-bit = habilitado) com o software LAS-X (Leica Microsystems).
Os perfis de intensidade de fluorescência para os canais de fluorescência analisados foram
estimados ao longo de um transecto de 10µm traçado ao longo do núcleo de células das
condições testadas, sendo que os picos de fluorescência ao longo desses transectos foram
calculados e normalizados utilizando o próprio software do microscópio. As intensidades de
fluorescência para o cálculo das razões núcleo/citoplasma de Yap foram determinadas com o
software ImageJ2 v1.52f oferecido na distribuição Fiji (Schindelin et al., 2012; Rueden et al.,
2017). Resumidamente, a marcação com DAPI foi utilizada para a criação de uma máscara
expandida para o núcleo. Foi considerada como fluorescência de Yap nuclear aquela abrangida
pela máscara criada, enquanto que a fluorescência de Yap citoplasmático foi estimada pela
subtração da fluorescência de Yap nuclear a partir da fluorescência de Yap total da imagem. A
quantificação das intensidades de fluorescência foi feita com a ferramenta Analyse particle.
As imagens de imunofluorescência do experimento-piloto de localização do ensaio de
BioID foram capturadas apenas em um stack no mesmo microscópio e utilizando o mesmo
software.
68
3.8 Ensaio de proliferação baseado na incorporação de 5-etinil-2’-deoxiuridina
(EdU)
O ensaio proliferação por incorporação de EdU foi feito utilizando-se o kit Click-iT Plus
EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit (Thermo Scientific). Para o ensaio, células EpH4 foram
cultivadas como descrito no item 3.2.2. Após 48 horas de cultivo na presença de 2% de lrECM,
foram adicionados 10µM de EdU ao meio de cultivo e os clusters foram incubados por 2 horas
em estufa umidificada sob temperatura constante de 37°C e atmosfera contendo 5% de CO2.
Após o período de incubação, as estruturas foram coletadas, fixadas e permeabilizadas como
descrito no item 3.8 e a marcação do EdU incorporado com o fluoróforo Alexa Fluor 594 foi
feita de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez marcadas com o fluoróforo, as
estruturas foram então marcadas com DAPI e as lâminas foram montadas como descrito no
item 3.8.
3.9 Western Blotting
As análises por Western Blotting foram realizadas mediante a resolução dos extratos
proteicos (total, citoplasmático e nuclear) em géis de poliacrilamida a 10% por eletroforese
unidimensional na presença de SDS (SDS-PAGE). Os extratos resolvidos foram transferidos
para membranas de fluoreto de polivinilideno7 (PVDF; Millipore) a 15V durante 16 horas sob
refrigeração em tampão de transferência composto por 40mM de Tris, 200mM de glicina e 20%
de metanol. Após a transferência, as membranas foram equilibradas em tampão 50mM de Tris-
HCl (pH 7,4), 150mM de NaCl e 0,1% de Tween-20 (tampão TBS-T) durante 10 minutos e
7 As membranas foram previamente ativadas com lavagem em metanol puro durante 1 minuto e equilibradas em
tampão de transferência por 10 minutos.
69
então foram bloqueadas com uma solução 1% de BSA diluído em tampão TBS-T por 1 hora a
temperatura ambiente. Uma vez bloqueadas, as membranas foram incubadas overnight a 4°C
com os anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio, lavadas com tampão TBS-T (3
vezes durante 10 minutos cada) e finalmente incubadas por 2 horas a temperatura ambiente com
o anticorpo secundário conjugado à enzima horseradish peroxidase (HRP) diluído em tampão
TBS-T. Após lavagem para a retirada do excesso de anticorpo secundário (5 vezes durante 10
minutos cada, em tampão TBS-T), as proteínas marcadas foram reveladas em um
fotodocumentador utilizando os substratos SuperSignal West Dura Extended Duration
Substrate ou SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific),
seguindo as orientações do fabricante.
Para a análise de proteínas biotiniladas, as membranas foram lavadas com tampão TBS-
T (3 vezes durante 10 minutos cada) após o bloqueio com BSA e incubadas por 2 horas a
temperatura ambiente com streptavidina conjugada à HRP diluída em tampão TBS-T. Após a
incubação, as membranas foram lavadas e as proteínas marcadas foram reveladas do mesmo
modo que na detecção com anticorpos.
A relação dos anticorpos utilizados nas análises por Western Blotting encontra-se na
Tabela 5.
Tabela 5: Anticorpos utilizados nas análises por Western Blotting
Produto Fabricante Catálogo Diluição
Anticorpos primários
YAP (63.7) Santa Cruz Biotechnology sc-101199 1:1000
MYC tag Cell Signaling Technology 2272S 1:1000
α-tubulin Sigma T5168 1:2500
p-YAP (S127) (D9W2I) Cell Signaling Technology 13008P 1:1000
p-YAP (S397) (D1E7Y) Cell Signaling Technology 13619P 1:1000
LATS1 (C66B5) Cell Signaling Technology 3477P 1:1000
MST1 Cell Signaling Technology 3682P 1:1000
MST2 Cell Signaling Technology 3952P 1:1000
70
Lamin B (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-8746 1:1000
Anticorpos secundários
Mouse anti-goat-HRP Jackson Immunology 205-035-108 1:2000
Goat anti-rabbit-HRP light chain Jackson Immunology 211-032-171 1:20000
Goat anti-mouse-HRP light chain Jackson Immunology 115-035-174 1:20000
Streptavidina
Ultra-Streptavidin-HRP Thermo Scientific N504 1:3000
Para os extratos totais e citoplasmáticos foram aplicados 15µg de proteína por poço,
enquanto que para os extratos nucleares foram aplicados 5µg de proteína. Tanto a eletroforese
quanto a transferência foram feitas utilizando o sistema Mini Protean (Bio-Rad).
3.10 Análise estatística
Os resultados estão representados estatisticamente como a média ± erro padrão da média
(SEM) ou através de imagens representativas do experimento. A análise estatística foi realizada
com o software Graphpad Prism 7.0 (Graphpad Software). As diferenças entre os grupos,
quando calculadas, foram determinadas pelo teste t-Student. Foram consideradas diferenças
estatisticamente significativas aquelas que tiveram valor de p ≤ 0,05.
71
4 RESULTADOS
4.1 O cultivo em ambiente rico em laminina reproduz em cultura o processo de
acinogênese em células epiteliais murinas
A membrana basal é um componente determinante nos epitélios pois além de sua função
primordial de ancoragem e sustentação também é responsável por fornecer sinais às células
para a sua proliferação e diferenciação, o que é essencial para o desenvolvimento e homeostase
do órgão (Nelson et al., 2006). No caso da glândula mamária, esse desenvolvimento envolve o
crescimento do tecido glandular seguido de um estágio em que as células se tornam quiescentes
e se diferenciam funcionalmente (Russo et al., 2001; Inman et al., 2015).
Para reproduzir esse evento de diferenciação em cultura utilizamos células epiteliais
não-tumorais murinas e espontaneamente imortalizadas da linhagem EpH4, derivadas por
seleção clonal da linhagem parental morfologicamente heterogênea IM-2 (Reichmann et al.,
1989; López-Barahona et al., 1995). Embora sejam células imortalizadas, elas não são capazes
de formar tumores quando injetados em camundongos imunossuprimidos e também não são
funcionalmente diferenciadas, possuindo um fenótipo semelhante ao de células mamárias
progenitoras (Montesano et al., 1998).
Em nossos ensaios utilizamos uma matriz extracelular rica em laminina (lrECM)
comercial derivada do condrossarcoma Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (Swarm, 1963), o qual
se caracteriza pela intensa produção de uma matriz extracelular muito semelhante em
constituição à membrana basal produzida pelos epitélios, sendo a laminina-111 responsável por
cerca de 60% do conteúdo proteico dessa matriz (Orkin et al., 1977; Kleinman et al., 1982).
O cultivo das células EpH4 em ambiente rico em laminina foi feito de maneira
semelhante ao descrito por Mroue e Bissell (Mroue e Bissell, 2013), mas tivemos que fazer
72
algumas adaptações para os propósitos deste trabalho. De maneira resumida, as células são
plaqueadas sobre um substrato não-aderente composto por um hidrogel de PolyHEMA (poly[2-
hidroxietil metacrilato]) que impede a adesão das células no fundo da placa. As células, então,
são cultivadas em suspensão na coluna de meio definido contendo hidrocortisona e formam
pequenos clusters tridimensionais (3D) de algumas dezenas de células. Após 48 horas de cultivo
esses clusters são coletados e cultivados em meio contendo 2% de lrECM, hidrocortisona e
prolactina por 48-72 horas (Figura 12). Quando seguíamos o protocolo proposto por Mroue,
no qual instruía o plaqueamento a uma densidade de 30000 células/cm², as estruturas 3D
apresentavam muita heterogeneidade em tamanho, com formação de estruturas muito grandes
(300-500µm) que não eram responsivas ao tratamento com a matriz extracelular rica em
laminina. Isso é reflexo da natureza do ensaio, uma vez que os clusters de células não são
formados apenas por divisão celular, mas também por aglomeração de células com outras
células próximas. Assim, reduzimos a densidade para 10000 células/cm² a fim de se obter
estruturas mais homogêneas.
Figura 12 – Esquema simplificado do cultivo tridimensional sobre matriz não-aderente de PolyHEMA.
As células são plaqueadas em meio definido sobre uma placa previamente tratada com PolYHEMA e
mantidas em estufa por 48 horas para formação de clusters de células. Esses clusters são coletados e
cultivados em meio definido contendo prolactina e matriz extracelular rica em laminina (lrECM). Após um
período de 48-72 horas as estruturas acinares são formadas e podem ser colhidas para análise.
73
Como resultado, tivemos que as estruturas cultivadas por 48 horas na presença de lrECM
assumiram uma morfologia distinta (Figura 13): os clusters eram significativamente menores,
mais homogêneos em relação ao tamanho, apresentavam um formato mais esférico, suas células
aparentavam estar mais firmemente aderidas umas às outras e aproximadamente 60% das
estruturas possuíam lúmen (região central da estrutura, evidenciada por uma coloração mais
clara na microscopia de contraste de fase); as estruturas sem tratamento (nT), por outro lado,
Figura 13 – Estruturas tridimensionais de células EpH4 assumem morfologia acinar quando cultivadas
em ambiente rico em laminina. A, microscopia de contraste de fase de uma estrutura não-tratada e outra
tratada com lrECM após 48 horas, com detalhe para a demarcação do lúmen na estrutura que recebeu o
tratamento (tracejado branco). Barra de aumento = 100 µm. B, análise de tamanho (através do cálculo da área
projetada), circularidade e presença de lúmen das estruturas cultivadas na ausência (nT) ou presença (lrECM)
de matriz extracelular rica em laminina. NnT = 154 e NlrECM = 152; média +/- SEM; **** = p < 0.0001 (teste
t-Student). Este experimento foi realizado em triplicata biológica.
74
eram maiores, heterogêneas em relação ao tamanho e formato, não possuíam lúmen aparente e
suas células aparentavam estar mais frouxamente aderidas umas às outras. A morfologia
assumida pelas estruturas que receberam o tratamento é característica dos ácinos da glândula
mamária, porções distais onde ocorre a produção majoritária do leite durante a lactação; essa
morfologia também é conseguida em cultura com outros métodos de cultivo como o embedded,
no qual as células são cultivadas imersas em géis de lrECM ao longo de vários dias para
formação das estruturas, e também com outras células epiteliais mamárias não-tumorais, como
a linhagem humana MCF10A (Pal e Kleer, 2014; Qu et al., 2015; Stock et al., 2016; Abe et al.,
2018).
Com este mesmo ensaio testamos também por qPCR e Western Blotting a presença de
β-caseína, a proteína mais abundante do leite, na presença dos hormônios lactogênicos
Figura 14 – O tratamento com lrECM aumenta a expressão de β-caseína em células EpH4 quando na
presença de hormônios lactogênicos. A, expressão gênica relativa por qPCR para o gene da proteína do leite
β-caseína (Csn2) em relação ao controle endógeno (B2m) em estruturas 3D cultivadas sobre matriz não-
aderente de PolyHEMA, nas condições sem tratamento (nT) e tratado com matriz extracelular rica em
laminina (lrECM). As razões de expressão foram calculadas e transformadas para a escala logarítmica para
melhor visualização; média +/- SEM; **** = p < 0.0001 (teste t-Student). O experimento foi realizado em
duplicata biológica. B, expressão proteica por Western Blotting da proteína do leite β-caseína em dois tempos
de exposição nas condições sem tratamento (nT) e tratado com matriz extracelular rica em laminina (lrECM).
Como loading control foi utilizada a proteína α-tubulina. O experimento foi realizado uma única vez.
75
hidrocortisona e prolactina (Figura 14). Encontramos que tanto o mRNA quanto a proteína
estavam consideravelmente aumentados nas estruturas cultivadas em ambiente rico em
laminina quando comparadas com o controle sem tratamento, que não apresentou expressão
detectável de β-caseína por Western Blotting mesmo com uma exposição prolongada no sistema
de detecção de quimioluminescência. Considerando que as estruturas não-tratadas também
foram cultivadas na presença de hidrocortisona e prolactina, estes resultados indicam que as
células somente foram responsivas aos hormônios lactogênicos quando expostas a um ambiente
rico em laminina, conforme previamente documentado (Xu et al., 2009; Xu et al., 2010).
Além da diferenciação funcional, a laminina presente na membrana basal também é
capaz de induzir quiescência (Spencer et al., 2011; Fiore et al., 2017). Esse é um efeito esperado
pois classicamente temos que uma célula diferenciada tem a sua capacidade proliferativa
reduzida (Ruijtenberg e Van Den Heuvel, 2016). Para demonstrar esse efeito, submetemos as
estruturas a um ensaio de proliferação baseado na incorporação de 5-etinil-2’-deoxiuridina
(EdU), um análogo de timidina que é incorporado ao DNA quanto a célula está na fase S do
ciclo celular e que posteriormente pode ser marcado com um fluoróforo para evidenciar as
células que proliferaram durante o período de incubação (Salic e Mitchison, 2008; Gomes et
al., 2016). Como resultado, vimos uma redução significativa de 40% na taxa de proliferação
celular nas estruturas tratadas com lrECM quando comparadas com o controle sem tratamento
(Figura 15), indicando uma indução da quiescência promovida pelo tratamento. O fato de que
apenas uma pequena porcentagem das células estivesse replicando o DNA durante as 2 horas
em que foram incubadas com o EdU é consistente com a observação que células cultivadas em
2D replicam a uma taxa maior quando comparada com células cultivadas em 3D (Tsunoda et
al., 2010; Huyck et al., 2012; Riedl et al., 2017). Em experimentos futuros pretendemos testar
condições de tempo de incubação com EdU maiores para averiguar se a diferença entre
estruturas tratadas ou não com lrECM se torna ainda mais evidente.
76
Juntos, esses resultados apontam as células EpH4 como um ótimo modelo para estudos
de diferenciação do epitélio glandular, além de reforçar os resultados obtidos anteriormente no
laboratório e os descritos na literatura sobre a função da laminina no epitélio mamário. Assim,
Figura 15 - O tratamento de estruturas epiteliais 3D com lrECM diminui a taxa de proliferação celular,
tornando-as mais quiescentes. A, fotomicrografias de estruturas 3D cultivadas por 48 horas com (lrECM)
ou sem (nT) tratamento com matriz extracelular rica em laminina (lrECM) e submetidas ao ensaio de
proliferação por incorporação de 5-etinil-2’-deoxiuridina (EdU, vermelho) e coloração com DAPI (azul).
Barra de aumento = 50µm. B, quantificação de células positivas para a marcação com EdU; NnT = 12 campos
e NlrECM = 12 campos; média +/- SEM; * = p < 0.05 (teste t-Student). O experimento foi realizado em duplicata
biológica.
77
pode-se inferir que a lrECM provem sinais para a organização, diferenciação e função durante
a acinogênese, reforçando o papel crucial da membrana basal no desenvolvimento e homeostase
da glândula mamária.
4.2 A localização subcelular de Yap é alterada em resposta ao ambiente rico em
laminina, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e de alvos de Yap
Os resultados preliminares obtidos pelo nosso laboratório indicam que Yap é
predominantemente citoplasmática em células EpH4 de estruturas 3D cultivadas na presença
de lrECM. Em células EpH4 de culturas em monocamada subconfluentes (em fase de
crescimento exponencial) Yap é predominantemente nuclear. Estes resultados são relevantes,
mas como o nosso objetivo não é uma comparação 2D versus 3D, mas sim entender o papel da
sinalização da lâmina basal na localização e atividade de Yap num sistema mais próximo ao in
vivo, o mais apropriado seria comparar células já na constituição de estruturas 3D na presença
ou ausência de lrECM.
O experimento de cultivo 3D sobre matriz não-aderente foi feito de acordo com o
descrito na seção anterior, com tempo de cultivo de 72 horas na presença de lrECM. Seguimos
então para análise por imunofluorescência para avaliar o padrão de localização de Yap nessas
estruturas, utilizando anticorpos para Yap e lamina-B e coloração com DAPI. Os resultados
observados reforçaram os obtidos anteriormente no laboratório: estruturas cultivadas na
ausência de lrECM possuem Yap predominantemente nuclear, enquanto as que foram
cultivadas na presença de lrECM apresentam Yap distribuído entre o núcleo e o citoplasma
(Figura 16A). Considerando o papel de Yap na regulação de genes relacionados à proliferação,
a diminuição da razão núcleo/citoplasma de Yap nas células tratadas com lrECM (Figura 16B)
indica uma menor atividade na regulação da expressão desses genes, o que entra em
78
concordância com a indução de quiescência pela laminina-111 (principal componente da
lrECM) em células epiteliais (Spencer et al., 2011; Fiore et al., 2017). A diferença na razão
núcleo/citoplasma de Yap só não foi mais evidente pois, apesar da predominância
citoplasmática de Yap nas estruturas tratadas com lrECM, em algumas células Yap ainda é
mantido no núcleo, mas restrito apenas à região cortical (Figura 17A). Diante disso, nós temos
algumas hipóteses para explicar este padrão de localização nuclear nas células tratadas: i) É
possível que Yap ainda desempenhe sua função canônica nestas células e regule de forma
positiva (porém em uma intensidade menor) os mesmos genes expressos durante a proliferação,
mas que estes genes podem ter mudado de posição dentro do núcleo por uma alteração na
arquitetura nuclear e nos territórios de cromatina (Cremer et al., 2000; Cremer e Cremer, 2001);
ii) Yap poderia estar participando da ativação de um conjunto de genes diferentes daqueles que
regula na ausência de lrECM e que se localizam próximos à lâmina nuclear, ou; iii) Yap poderia
Figura 16 - O tratamento de estruturas epiteliais 3D com lrECM reduz a razão núcleo/citoplasma de
Yap. A, fotomicrografias de estruturas 3D cultivadas por 72 horas na ausência (nT) ou presença (lrECM) de
matriz extracelular rica em laminina e submetidas à imunofluorescência para lamina-B (verde) e Yap
(vermelho) e coloração com DAPI (azul) Barra de aumento = 10µm. B, quantificação da razão
núcleo/citoplasma de Yap; NnT = 184 e NlrECM = 141; média +/- SEM; **** = p < 0.0001 (teste t-Student). O
experimento foi realizado em duplicata biológica.
79
estar desempenhando um papel na repressão desses ou de outros genes. Essa ideia pode ser
sustentada por trabalhos que já apontaram o papel de TAZ (parálogo de YAP) em células
humanas como repressor de genes (Kim et al., 2015; Valencia-Sama et al., 2015).
A ideia de que Yap ainda regula a transcrição de genes nessas células pode ser reforçada
pelo perfil de intensidade de fluorescência (Figura 17B) da marcação de Yap no núcleo. O
padrão de localização de Yap não se sobrepõe ao de fluorescência de DAPI. Assim,
considerando-se que DAPI em células murinas colocaliza com marcadores de cromatina não-
ativa (heterocromatina) (Chiolo et al., 2011), Yap pode estar atuando em genes acessíveis do
ponto de vista transcricional. É importante salientar que alguns experimentos preliminares do
Figura 17 - O tratamento com lrECM modifica o padrão de localização de Yap no núcleo. A,
fotomicrografias vistas na Figura 14, com núcleo demarcado em branco, em maior aumento. Barra de
aumento = 10µm; barra de aumento (núcleo em destaque) = 3µm. B, gráfico do perfil de intensidade de
fluorescência para as três marcações (lamina-B, Yap e DAPI), baseado no transecto feito em A. A marcação
com a lamina-B permitiu determinar que Yap está presente no córtex nuclear em algumas células de estruturas
tratadas com lrECM.
80
nosso laboratório, já comparando estruturas 3D tratadas ou não com lrECM, nós havíamos
realizado marcações apenas para Yap e DAPI. Observamos em algumas células que a marcação
de Yap apresentava um padrão de halo ao redor da marcação de DAPI. Baseado nestas duas
marcações não sabíamos se este halo estava dentro ou fora do núcleo, e por este motivo
decidimos marcar concomitantemente Yap, DAPI e lamina-B (um marcador da lâmina nuclear),
justamente para precisar a localização de Yap.
Na tentativa de conseguir alguma pista sobre a expressão de genes-alvo de Yap,
realizamos uma análise de qPCR para os genes da via Hippo Mst2 e Yap1 e para os genes-alvo
de Yap Ankrd1 e Ect2. Ankrd1 (Ankyrin repeat domain-containg protein 1) é um gene-alvo de
YAP humano já descrito na literatura (Jiménez et al., 2017) e codifica um fator de transcrição
reconhecidamente importante para a ativação de células endoteliais e para regular
negativamente a expressão de genes no músculo cardíaco (Chu et al., 1995). O gene Ect2
codifica o fator Epithelial cell transforming 2 e foi descoberto como gene-alvo de YAP através
das análises de bioinformática feitas preliminarmente a este trabalho (dado ainda não
publicado), ainda que a literatura tenha dado indícios de uma relação entre a expressão dos dois
genes (Lange et al., 2015; Miyamura et al., 2017). Com a análise, encontramos nas estruturas
tratadas com lrECM por 48 horas uma diminuição na expressão relativa de todos os genes,
indicando uma possível regulação de genes da via Hippo e genes-alvo de Yap pela membrana
basal (Figura 18A). Quando analisamos os componentes da via Hippo por Western Blotting
(Figura 18B), não vemos diminuição significativa nos níveis de expressão proteica; no entanto,
vemos uma diminuição sútil nos níveis de fosforilação de Yap no resíduo Ser382 (Ser397 no
ortólogos humano), a qual marca a proteína para a sua via de degradação. Este achado está de
acordo com os resultados observado por imunofluorescência, onde não há mudança aparente
nos níveis totais de Yap.
No conjunto, os resultados da localização de Yap e laminina-111 no epitélio mamário
81
em desenvolvimento, indicam que na quiescência fisiológica induzida pela laminina a
localização e atividade de Yap talvez não seja regulada por Hippo. Não há diminuição
expressiva nos níveis totais de Yap como ocorre no processo de inibição por contato. Uma
hipótese plausível seria que, assim como demonstrado em modelos de mecanotransdução de
sinais do microambiente, os sinais provenientes da laminina podem chegar até Yap por
intermédio do citoesqueleto de actina (Dupont et al., 2011).
Figura 18 – O tratamento com lrECM influencia no padrão de expressão gênica de membros da via
Hippo e alvos de Yap, mas a expressão proteica da via não se altera. A, expressão gênica relativa por
qPCR para os genes Mst2 e Yap1 (membros da via Hippo) e Ankrd1 e Ect2 (alvos de Yap) com relação ao
controle endógeno (B2m) em estruturas 3D cultivadas sobre matriz não-aderente de PolyHEMA, nas
condições sem tratamento (nT) e tratado com matriz extracelular rica em laminina (lrECM). Média +/- SEM;
**** = p < 0.0001 (teste t-Student). O experimento foi realizado duas vezes. B, expressão proteica de
membros da via Hippo e padrão de fosforilação de Yap por Western Blotting nas condições sem tratamento
(nT) e tratado com matriz extracelular rica em laminina (lrECM). Como loading control foi utilizada a
proteína α-tubulina. O experimento foi realizado uma vez.
82
4.3 Diferentes proteínas precipitam com Yap na ausência e presença do tratamento
com lrECM
Especulamos que, em um contexto de ambientes ricos em laminina, Yap pode ter papeis
desconhecidos no compartimento citoplasmático durante o desenvolvimento do epitélio
mamário. Como estratégia para a identificação das proteínas interagentes de Yap escolhemos
inicialmente a coimunoprecipitação (CoIP) seguida de espectrometria de massas. Para um
maior rendimento na extração de proteínas utilizamos o ensaio de ECM overlay (Figura 19),
no qual as células são primeiramente cultivadas em monocamada em meio de crescimento por
24 horas, em meio definido por outras 24 horas e então tratadas com lrECM por 48 horas
(Streuli, Schmidhauser, et al., 1995). No ECM overlay, após o tratamento com lrECM, as
células adquirem uma morfologia arredondada, proliferam numa menor taxa, sintetizam
proteínas do leite e o padrão de localização de Yap é semelhante ao observado no ensaio de
acinogênese sobre matriz não-aderente de PolyHEMA (Spencer et al., 2011; Fiore et al., 2017).
Uma das limitações da CoIP diz respeito à sua sensibilidade. Interações fortes entre duas
proteínas são facilmente detectadas pela técnica, mas a detecção é comprometida quando as
interações são fracas ou transitórias. Por isso, nós testamos algumas condições para o
Figura 19 – Esquema simplificado do ensaio de ECM overlay. As células são semeadas em meio completo
e mantidas em estufa por 24 horas para que espraiem. Após este tempo as células são cultivadas por 24 horas
em um meio definido e então são adicionados prolactina e lrECM, quando elas retornam pra estufa por mais
48 horas de cultivo. Após esse período de tratamento são observadas alterações nítidas na morfologia dos
clusters de células que cresceram aderidos à placa.
83
fracionamento celular e tampões (resultados não mostrados) e decidimos utilizar um tampão de
fracionamento pouco estringente à base de PBS e 0,5% do detergente Nonidet P-40. O
fracionamento resultou em pureza bastante satisfatória das frações celulares, conforme Western
Blot para tubulina (proteína citoplasmática) e lamina-B (proteína nuclear) (Figura 20A). Uma
vez definidos o tampão de extração a ser utilizado, realizamos um experimento piloto de CoIP
para fins de padronização do ensaio. Para imunoprecipitar Yap utilizamos um anticorpo
monoclonal contra YAP e proteína G covalentemente ligada a uma matriz de sefarose e 100µg
de proteína de cada uma das frações. O resultado da CoIP foi verificado por SDS-PAGE seguido
por coloração por impregnação por nitrato de prata (Figura 20B).
Figura 20 - Padronização do ensaio de coimunoprecipitação (CoIP). A, Western Blotting para tubulina
(marcador citoplasmático) e lamina-B (marcador nuclear) para verificação do enriquecimento dos extratos
nuclear (nuc) e citoplasmático (cito) após o procedimento de fracionamento. B, CoIP piloto para Yap de
extratos total (T), citoplasmático (C) e nuclear (N) de células EpH4 separada em gel de poliacrilamida 10% e
revelado por impregnação por nitrato de prata. O gel foi superexposto à reação de impregnação para que fosse
possível a visualização das bandas das proteínas coimunoprecipitadas. “Lisado” corresponde às amostras do
lisado antes da CoIP; “Sobrenadante CoIP” corresponde ao sobrenadante após Co-IP, onde estão as proteínas
que teoricamente não foram coimunoprecipitadas; “Eluído” corresponde às proteínas que foram eluídas das
beads de sefarose após adição de um tampão de ureia; “Beads” corresponde às proteínas que permaneceram
ligadas às beads após a adição do tampão de ureia, e que foram eluídas apenas após a adição do tampão de
amostra para eletroforese, contendo SDS e β-mercaptoetanol. Abaixo, Western Blotting para Yap com cada
uma das amostras.
Yap
84
Uma vez estabelecido todo o procedimento experimental, fizemos a CoIP nas condições
de células EpH4 tratadas ou não com lrECM, com frações nuclear e citoplasmática e
encaminhamos para análise por espectrometria de massas. Como resultados, obtivemos 2716
hits de famílias de proteínas após uma busca na base de dados do UniProt para proteínas do
organismo Mus musculus. É importante salientar que algumas proteínas identificadas na análise
já foram reportadas como parceiras moleculares de Yap, o que nos dá confiança sobre a robustez
do experimento. Após filtragem para excluir peptídeos reversos, contaminantes comuns de
Figura 21 – Um conjunto diferencial de proteínas imunoprecipitam com Yap na presença de lrECM.
A, diagramas de Euler mostrando a quantidade e proporção de proteínas que imunoprecipitaram com Yap na
ausência (nT) e na presença (lrECM) de matrix extracelular rica em laminina nas frações citoplasmática,
nuclear e juntando-se os resultados obtidos das duas frações (Total). B, gráficos da quantificação relativa dada
pelo valor de LFQ (label free quantification) das proteínas encontradas nas frações citoplasmática e nuclear
com os dois tratamentos (ausência e presença de lrECM). Cada ponto representa uma proteína e a proximidade
com a linha de tendência central indica que a diferença em termos de quantificação entre os dois tratamentos
foi mínima.
85
espectrometria de massas e as proteínas identificadas nas amostras imunoprecipitadas no
controle com a IgG inespecífica, restaram 1565 hits, os quais foram submetidos à ferramenta
Figura 22 – Os processos celulares que os possíveis interagentes de Yap no citoplasma estão envolvidos
são alterados com o tratamento com lrECM. Gráfico de barras indicando a significância estatística da
análise feita com a ferramenta DAVID contra a database KEGG Pathways para os processos celulares nos
quais estão envolvidas as proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática exclusivamente na
condição (não-tratada [nT] ou tratada com matriz extracelular rica em laminina [lrECM]). Os valores na frente
das barras indicam o número de proteínas que foram agrupados em cada processo celular descrito.
86
online Venny para agrupar as proteínas exclusivas de cada condição. Nós encontramos um
número grande de hits que foram exclusivas de uma ou outra condição (nT ou lrECM), o que
nos indica que o tratamento com lrECM resulta em um conjunto diferencial de proteínas que
possivelmente interagem com Yap (Figura 21A). Por outro lado, as proteínas compartilhadas
entre os dois tratamentos não estão diferencialmente presentes em termos de quantificação
relativa quando são comparados os seus valores de LFQ (label-free quantification) (Figura
21B).
Figura 23 – Os processos celulares que os possíveis interagentes de Yap no núcleo estão envolvidos são
alterados com o tratamento com lrECM. Gráfico de barras indicando a significância estatística da análise
feita com a ferramenta DAVID contra a database KEGG Pathways para os processos celulares nos quais estão
envolvidas as proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração nuclear exclusivamente em cada condição (não-
tratado [nT] ou tratado com matriz extracelular rica em laminina [lrECM]). Os valores na frente das barras
indicam o número de proteínas que foram agrupados em cada processo celular descrito.
87
Com o uso da ferramenta online DAVID (Database for Annotation, Visualization and
Integrated Discovery) nós avaliamos os processos celulares nos quais as proteínas exclusivas
de cada condição e potenciais proteínas parceiras de Yap podem estar envolvidas. Como
previsto, proteólise mediada por ubiquitina foi o processo celular com maior significância
estatística na fração citoplasmática de células não-tratadas (Figura 22). Metabolismo de purina
e metabolismo de pirimidina são outros processos celulares identificados cuja relação com Yap
foi relatada recentemente (Santinon et al., 2018), mas indícios sobre as interações proteicas
envolvidas não haviam sido apresentados. Por outro lado, de forma inesperada, a maioria das
proteínas interagentes de Yap no citoplasma das células expostas a lrECM estão envolvidas em
processos de vias metabólicas, principalmente os relacionados ao metabolismo de carboidratos
e de ácidos graxos. Quanto à fração nuclear, apesar de termos encontrado proteínas nucleares,
os resultados não foram satisfatórios por contaminação com componentes mitocondriais e de
membrana, evidenciada pela presença de processos relacionados ao metabolismo mitocondrial
ou vias de outras organelas membranosas (Figura 23).
No processo celular proteólise mediada por ubiquitina identificado entre as proteínas
imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática das células não tratadas com lrECM foram
agrupadas 14 proteínas (Tabela 6).
Tabela 6 - Proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 não-tratadas
com lrECM relacionadas a proteólise mediada por ubiquitina
Uniprot Acession Nome da proteína
Q9WTX5 S-phase kinase-associated protein 1A (Skp1a)
E9Q4K9 SMAD specific E3 protein ligase 1 (Smurf1)
Q9WUD1 STIP1 homology and U-Box containing protein 1 (Stub)
Q9JLV5 Cullin 3 (Cul3)
E9PXY1 Cullin 4B (Cul4b)
E9PXB7 Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene 4-like (Nedd4l)
Q9CR50 Ring finger and CHY zinc finger domain containing 1 (Rchy1)
P62878 Ring-box 1 (Rbx1)
88
A0A087WQE6 Transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 1 (Tceb1)
P62869 Transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 2 (Tceb2)
Q9D1C1 Ubiquitin-conjugating enzyme E2C (Ube2c)
P61082 Ubiquitin-conjugating enzyme E2M (Ube2m)
D3Z061 Ubiquitin-like modifier activating enzyme 6 (Uba6)
G3UZD6 Ubiquitination factor E4B (Ube4b)
A partir de uma busca na plataforma STRING, uma database de interações proteína-
proteína conhecidas ou preditas, pudemos estabelecer uma rede de interação para as proteínas
listadas (Figura 24), com um coeficiente médio de clustering local igual a 0,611 e um p-valor
de enriquecimento PPI (protein-protein interaction) menor que 1,0.1016, indicando que as
proteínas listadas possuem mais interações entre si do que seria de se esperar de um set de
Figura 24 – Yap interage com um complexo de proteínas relacionadas à proteólise mediada por
ubiquitina via proteína Ube2c na ausência de lrECM. Uma busca na database STRING revelou que a
maioria das proteínas listadas no processo celular proteólise mediada por ubiquitina interagem entre si
conforme dados curados de outras databases ou por evidências experimentais. Yap se relaciona com esse
provável complexo através da interação com a proteínas Ube2c. O coeficiente médio de clustering local da
rede é de 0,611 e o p-valor de enriquecimento PPI (protein-protein interaction) é menor que 1,0.1016.
89
proteínas de tamanho similar gerado aleatoriamente do genoma, além de sugerir que as
proteínas estão pelo menos parcialmente e biologicamente conectadas como um grupo. De
acordo com a análise, a maioria das proteínas possuem interações entre si já descritas na
literatura ou preditas. Yap é destacado como interagente identificado experimentalmente da
proteína Ube2c (Ubiquitin-conjugating enzyme E2C) em um trabalho que envolve os níveis de
expressão dessa proteína e os de fosforilação de Yap em linhagens e amostras de paciente com
câncer de pulmão do tipo NSCLC (non-small cell lung cancer) (Zhang et al., 2015). Além disso,
a presença da proteína Stub1 (também conhecida como Chip) e dos processos celulares
fagossomo e lisossomo na anotação funcional sugerem a interação de Yap com proteínas
relacionadas à degradação via lisossomal. Não foram identificadas na database interações de
Nedd4l, Smurf1 e Rchy1 com as demais proteínas listadas.
No processo celular vias metabólicas identificado entre as proteínas imunoprecipitadas
com Yap na fração citoplasmática das células tratadas com lrECM foram agrupadas 46
proteínas (Tabela 7). A busca feita na database STRING também identificou uma rede de
interações bem documentadas entre as proteínas listadas, com um coeficiente médio de
clustering local igual a 0,365 e um p-valor de enriquecimento PPI (protein-protein interaction)
menor que 1,0.1016; no entanto, não foram identificadas interações documentadas de Yap com
nenhuma outra proteína (Figura 25).
Tabela 7 - Proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 tratadas com
lrECM relacionadas a vias metabólicas
Uniprot Acession Nome da proteína
P38060 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A lyase (Hmgcl)
D3Z6F9 3-oxoacyl-ACP synthase, mitochondrial (Oxsm)
Q9CQ60 6-phosphogluconolactonase (Pgls)
Q9D1K2 ATPase, H+ transporting, lysosomal V1 subunit F (Atp6v1f)
Q922H4 GDP-mannose pyrophosphorylase A (Gmppa)
Q91ZJ5 UDP-glucose pyrophosphorylase 2 (Ugp2)
90
Q921H8 acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1A (Acaa1a)
Q14DH7 acyl-CoA synthetase short-chain family member 3 (Acss3)
O55137 acyl-CoA thioesterase 1 (Acot1)
D3YTT4 acyl-Coenzyme A dehydrogenase family, member 8 (Acad8)
Q07417 acyl-Coenzyme A dehydrogenase, short chain (Acads)
P50544 acyl-Coenzyme A dehydrogenase, very long chain (Acadvl)
Q8CHT0 aldehyde dehydrogenase 4 family, member A1 (Aldh4a1)
P47739 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A1 (Aldh3a1)
A0A0R4J050 aminoacylase 1 (Acy1)
A0A1B0GX27 branched chain aminotransferase 2, mitochondrial (Bcat2)
Q3U3J1 branched chain ketoacid dehydrogenase E1, alpha polypeptide (Bckdha)
Q6P3A8 branched chain ketoacid dehydrogenase E1, beta polypeptide (Bckdhb)
P08074 carbonyl reductase 2 (Cbr2)
Q8BJ64 choline dehydrogenase (Chdh)
Q9QY93 dCTP pyrophosphatase 1 (Dctpp1)
O08749 dihydrolipoamide dehydrogenase (Dld)
P21550 enolase 3, beta muscle (Eno3)
Q8R059 galactose-4-epimerase, UDP (Gale)
Q9WTN0 geranylgeranyl diphosphate synthase 1 (Ggps1)
P70699 glucosidase, alpha, acid (Gaa)
H3BJA3 glutamate-cysteine ligase, modifier subunit (Gclm)
G3UVV4 hexokinase 1 (Hk1)
Q924B0 inositol (myo)-1(or 4)-monophosphatase 1 (Impa1)
Q91VA7 isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) beta (Idh3b)
Q9CPY7 leucine aminopeptidase 3 (Lap3)
Q3THS6 methionine adenosyltransferase II, alpha (Mat2a)
Q99LB6 methionine adenosyltransferase II, beta (Mat2b)
A2A845 mitochondrial trans-2-enoyl-CoA reductase (Mecr)
Q9D0F9 phosphoglucomutase 2 (Pgm2)
P63005 platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform 1b, subunit 1 (Pafah1b1)
D3Z7C6 prostaglandin E synthase 3 (cytosolic) (Ptges3)
Q543K9 purine-nucleoside phosphorylase (Pnp)
P35486 pyruvate dehydrogenase E1 alpha 1 (Pdha1)
Q8BKZ9 pyruvate dehydrogenase complex, component X (Pdhx)
G3UXX3 sepiapterin reductase (Spr)
G3UZ26 serine hydroxymethyltransferase 1 (soluble) (Shmt1)
Q64442 sorbitol dehydrogenase (Sord)
P32020 sterol carrier protein 2, liver (Scp2)
P23591 tissue specific transplantation antigen P35B (Tsta3)
A0A1B0GSD0 urate (5-hydroxyiso-) hydrolase (Urah)
91
A plataforma STRING é bastante robusta, mas as redes de interação que constrói são
baseadas apenas em resultados e evidências de interações diretas entre proteínas. Interações
também podem ocorrer de maneira indireta, por intermédio de uma via metabólica, de
Figura 25 – A busca na database STRING não encontrou indícios que Yap interaja diretamente com
proteínas relacionadas a vias metabólicas. Uma busca na database STRING revelou que a maioria das
proteínas listadas no processo celular vias metabólicas interagem entre si conforme dados curados de outras
databases ou por evidências experimentais. Yap não se relaciona com nenhuma dessas proteínas, de acordo
com as informações disponíveis nas databases. O coeficiente médio de clustering local da rede é de 0,365 e
o p-valor de enriquecimento PPI (protein-protein interaction) é menor que 1,0.1016.
92
sinalização ou outro processo celular em comum. Apesar do resultado negativo obtido,
decidimos por uma abordagem reversa e investigar em quais processos celulares Yap está
envolvido. Sendo assim, fizemos uma busca com a ferramenta de exploração Biovista Vizit,
relacionando o termo “Yap” com o termo “Lipid”, que nos retornou 10 termos da literatura
relacionados a lipídios com indícios de envolvimento de Yap (Figura 26).
Apesar dos indícios na literatura, antes das validações referentes às proteínas parceiras
de Yap identificados no ensaio de CoIP nós planejamos finalizar o ensaio de BioID, pois este
pode, além de complementar os resultados obtidos até então, revelar interações mais
transitórias, dada a natureza deste ensaio.
Figura 26 – Mapa de interação de Yap com processos relacionados a lipídios. Uma busca com a
ferramenta de exploração Biovista Vizit indica na literatura a associação do termo “YAP” com o termo
“Lipid”.
93
4.4 O ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID)
como abordagem alternativa para a identificação das proteínas interagentes de Yap
A CoIP é um ensaio bastante utilizado em estudos de interação proteína-proteína por
permitir que se faça de maneira relativamente simples, rápida e pouco dispendiosa o
levantamento do perfil de interações moleculares de determinada proteína; no entanto, as
próprias limitações da técnica podem gerar alguns artefatos: interações muito fracas ou
transientes podem não ser identificadas, enquanto que a interação entre duas proteínas nativas
de compartimentos celulares diferentes pode ser forçada quando são colocadas no mesmo lisado
(Le Sage et al., 2016; Roux et al., 2018).
Assim, para reforçar nossos resultados obtidos com a CoIP, decidimos também realizar
Figura 27 – Esquema simplificado da técnica de BioID (identificação por biotinilação dependente de
proximidade). Representação esquemática do ensaio de identificação por biotinilação dependente de
proximidade (BioID) para identificação de interações proteína-proteína. A expressão de uma proteína de
interesse fusionada a uma biotina ligase mutante leva à biotinilação de proteínas próximas. Após a lise das
células e desnaturação em condições estringentes, as proteínas biotiniladas podem ser isoladas por afinidade
à streptavidina e identificadas por espectrometria de massas. Modificado de Roux et al., 2012.
94
um ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) (Roux et al.,
2012). De maneira simplificada, este ensaio se baseia na utilização de uma biotina ligase
mutante para a identificação das interações proteína-proteína; enquanto a versão wild type da
biotina ligase possui alta seletividade pelo seu substrato (em geral são carboxilases que utilizam
a biotina como grupo prostético), a versão mutante é capaz de ligar uma molécula de biotina à
cadeia lateral de resíduos de lisina de outras proteínas próximas de maneira inespecífica.
Quando uma proteína de interesse é fusionada a uma biotina ligase mutante, as proteínas com
as quais ela interage são biotiniladas pela enzima e então é possível recuperá-las pela afinidade
da streptavidina pela biotina. Uma vez recuperadas, essas proteínas podem ser identificadas por
espectrometria de massas (Figura 27). Nesta subseção descrevemos nossos esforços para o
planejamento e os resultados preliminares obtidos até então.
4.4.1 Construção e síntese das ORFs
Para o ensaio de BioID idealizamos a construção de duas sequências codificadoras para
duas proteínas de fusão: uma com a biotina ligase fusionada na extremidade N-terminal de Yap
e outra com a biotina ligase na extremidade C-terminal. O motivo de usarmos duas construções
é evitar a perda de informação caso a presença da biotina ligase em uma determinada
extremidade de Yap interfira em sua interação com as demais proteínas da célula.
Inicialmente, para a construção das ORFs, fizemos uma busca nos bancos de dados do
UniProt (https://uniprot.org) e do NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank)
pela biotina [acetil-CoA-carboxilase] ligase do organismo Aquifex aeolicus 8 , cepa VF5
(UniProtKB – O66837_AQUAE, NCBI Acession ID – WP_010880335.1), denominada BirA.
8 Bactéria termofílica quimiotrófica, encontrada nas fontes termais no Yellowstone National Park, EUA, e nas
ilhas vulcânicas Eolie, Itália.
95
Com 233 resíduos de aminoácidos, esta é uma das menores biotina ligases descritas cujo uso já
foi relatado para este ensaio em outros trabalhos encontrados na literatura (Kim et al., 2016). A
cadeia polipeptídica da biotina ligase mutante, denominada BirA*, diferencia-se da versão wild
type apenas pela substituição de uma arginina9 por uma glicina (R→G) no resíduo 40, o que
permite a sua atividade inespecífica de biotinilação (Figura 28).
Na etapa seguinte definimos a sequência de Yap a ser utilizada para a construção da
proteína de fusão. Em uma busca no banco de dados UniProt recuperamos duas sequências de
variantes de Yap murino (UniProtKB – P46938), variante 1 (488 resíduos de aminoácidos) e
variante 2 (472 resíduos de aminoácidos), sendo que para a construção da proteína de fusão
escolhemos a variante 1 por ser considerada a proteoforma canônica.
9 Esse resíduo de arginina é altamente conservado entre as inúmeras biotina ligases encontradas na natureza e é
essencial para a sua especificidade.
Figura 28 – Alinhamento das sequências de BirA e BirA*. O alinhamento entre as duas sequências foi feito
com a ferramenta Clustal O, disponibilizada pelo European Bioinformatics Institute, European Molecular
Biology Laboratory (EMBL-EBI; disponível em https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo) e visualizado com
o software Jalview 2.10.5. Em laranja está evidenciado o domínio catalítico da biotina ligase, em verde estão
as regiões de ligação da molécula de biotina no domínio catalítico e em vermelho está destacada a mutação
responsável pela atividade inespecífica de BirA*.
96
Além das sequências de Yap1 e da biotina ligase mutante, nos preocupamos também
com o espaçador, ou linker, a ser inserido em os dois. Existem inúmeros trabalhos indicando a
importância dos linkers na atividade de proteínas de ocorrência natural e nas proteínas de fusão
possíveis graças à tecnologia do DNA recombinante (Chen et al., 2013; Reddy Chichili et al.,
2013). Em uma revisão da literatura feita por Chen e colaboradores (Chen et al., 2013), o autor
apontou três principais classes de linkers existentes: i) os linkers flexíveis, formados
majoritariamente por aminoácidos com baixa propensão a formar estruturas secundárias juntos
a aminoácidos polares, os quais contribuem para diminuir a hidrofobicidade do linker; ii) os
linkers rígidos, cujos aminoácidos assumem uma estrutura secundária do tipo alfa-hélice,
isolando dois domínios de uma proteína por uma estrutura rígida, o que diminui a flexibilidade
da proteína como um todo e evita o contato entre os dois domínios; e iii) os linkers cliváveis,
cujas sequências são reconhecidas por proteases no interior das células e então clivados,
fragmentando a proteína. Devido à natureza do ensaio, em que BirA* deve ter mobilidade
suficiente para biotinilar as proteínas que interagem com Yap no interior da célula, optamos por
Figura 29 – Esquema simplificado da proteína de fusão BirA*-Yap1. Representação gráfica em escala da
proteína de fusão BirA*-Yap1 Mus musculus, baseado nos cálculos feitos pela ferramenta online CalcTool.
Acima estão os diâmetros teóricos de cada proteína nas extremidades e o estiramento médio do linker
(GGGGS)3 ao centro. Abaixo estão o número de resíduos de aminoácidos que compõe cada segmento da
proteína de fusão. O comprimento do linker e a sua flexibilidade são importantes para o alcance de BirA* em
sua atividade de biotinilação (quanto maior o linker, maior será a quantidade de proteínas próximas a Yap que
serão biotiniladas).
97
utilizar o linker (GGGGS)3, composto por 3 repetições do motivo glicina-glicina-glicina-
glicina-serina e que já foi descrito (Argos, 1990) como um espaçador bastante flexível devido
ao alto conteúdo de resíduos de glicina e ao mesmo tempo bastante solúvel devido à presença
do aminoácido polar serina, evitando assim a interação do linker com aminoácidos hidrofóbicos
dos domínios adjacentes e impedindo problemas durante o enovelamento da proteína logo após
a sua síntese dentro da célula. Utilizando a ferramenta online CalcTool
(http://www.calctool.org/CALC/prof/bio/protein_size), que estima o diâmetro de uma proteína
baseando-se em resultados de modelos estruturais disponíveis em banco de dados, pudemos
elaborar um modelo simples da proteína de fusão (Figura 29).
Como não existem anticorpos comerciais específicos para BirA* de A. aeolicus, foi
necessária a inserção de um epítopo tag em cada uma das construções. Optamos pelo Myc tag
por ser um epítopo amplamente utilizado, por não interferir no enovelamento da proteína de
fusão, não ser alvo de proteases dentro da célula, ter alta solubilidade e por possuir inúmeros
anticorpos validados e disponíveis no mercado. Sendo assim, as construções feitas para a
biotina ligase inserida no N- e no C-terminal de Yap foram “Myc-BirA*-(GGGGS)3-Yap1” e
“Yap1-(GGGGS)3-BirA*-Myc”, respectivamente.
Para a otimização de códons utilizamos a ferramenta Codon Optimization disponível no
portal da empresa Blue Heron Biotech (https://blueheronbio.com). Dentre os parâmetros
utilizados definimos a tabela de uso de códons10 (codons usage table) para o organismo Mus
musculus, marcamos para a não-inserção dos sítios de restrição EcoRI e BamHI (pois
subsequentemente serão usados para a clonagem das sequências no vetor de expressão) e
protegemos os trechos que codificam Yap1 para que a otimização fosse feita apenas nas
sequências de BirA*, do linker (GGGGS)3 e do Myc tag. Após a otimização, foram adicionados
10 Corresponde à proporção de cada códon que codifica para determinado aminoácido presente em um conjunto
de genes de um dado organismo. Para esse cálculo pode-se utilizar um conjunto definido de genes (por exemplo,
de genes housekeeping), genes codificadores de proteínas ou todos os genes no geral (codificadores e reguladores).
98
a sequência de Kozak upstream da construção (para aumentar a eficiência da expressão da
proteína de fusão) e os sítios de restrição EcoRI e BamHI nas extremidades (Figura 30).
Uma vez finalizado o projeto das duas construções, as sequências foram enviadas para
síntese química.
4.4.2 Transfecção transiente em células 293FT
Após a inserção das construções no vetor de expressão, realizamos os testes iniciais em
células 293FT para a validação do sistema de expressão e de atividade de biotinilação das
construções (Figura 31). As duas construções (BirA*-Yap1 e Yap1-BirA*) apresentam
atividade de biotinilação, conforme mostrado no blot revelado com streptavidina-HRP. Células
transfectadas com o vetor controle contendo somente BirA* apresentou um aumento sútil na
Figura 30 - Esquema das duas construções projetadas para o ensaio de BioID, nas quais a biotina ligase
estará ligada à extremidade C-terminal e N-terminal de Yap1. Na figura, YAP1 (em azul) corresponde à sequência
codificadora da variante 1 de Yap1 de Mus musculus, (GGGGS)3 (em laranja) corresponde à sequência
codificadora do linker composto por 3 repetições do motivo glicina-glicina-glicina-glicina,serina, BirA* (em
verde) corresponde à sequência codificadora para a biotina ligase mutante de Aquifex aeolicus e Myc (em
vermelho) corresponde à sequência codificadora do tag Myc. No início de cada construção foi colocada uma
sequência de Kozak (em vinho), para aumentar a eficiência da expressão da proteína de fusão, e flanqueando toda
a construção foram colocados dois sítios de restrição (EcoRI e BamHI, em amarelo) utilizados na clonagem da
sequência no vetor de expressão.
99
intensidade das bandas biotiniladas; este resultado já era esperado já que a biotina ligase
encontra-se provavelmente difusa na célula. Todas as construções tiveram expressão induzida
Figura 31 - Teste de indução da expressão do sistema BioID. Análise por Western Blotting do extrato
proteico de células 293FT transfectadas com os vetores de expressão de Yap1 fusionado à biotina ligase
mutante BirA* na ausência ou presença de doxiciclina (agente indutor de expressão) e de biotina. Na imagem:
293FT corresponde às células da linhagem 293FT transfectadas com o vetor vazio; BirA* corresponde ao vetor
contendo a sequência codificadora de BirA* fusionada ao Myc tag; BirA*-Yap1 e Yap1-BirA* correspondem
às sequências codificadoras de BirA* contendo um Myc tag fusionada no N- e no C-terminal de Yap1 de Mus
musculus. A marcação para Myc tag permite a detecção das proteínas de fusão (BirA*-Yap1 e Yap1-BirA*,
com 80,9kDa) e do controle (BirA*, com 27,7kDa). A marcação com streptavidina permite averiguar a
atividade catalítica da biotina ligase nas construções testadas. A marcação para Yap1 também permite detectar
as proteínas de fusão e comparar com a marcação para Yap1 endógeno (54,3kDa).
100
com sucesso na presença de doxiciclina conforme Western Blot para Yap e Myc tag. É
importante ressaltar também que a biotinilação foi mínima na condição de expressão induzida
e na ausência de biotina, indicando uma possível interferência do background devido à presença
de biotina endógena dentro da célula.
Para averiguar o padrão de localização das construções dentro da célula, fizemos um
experimento de imunofluorescência com as células 293FT transientemente transfectadas com
os vetores, marcando Yap e Myc tag com anticorpos e a biotina dentro da célula com
streptavidina conjugada a um fluoróforo (Figura 32). Como resultado, vimos a localização
preferencial das proteínas de fusão dentro do núcleo, indicando que elas conseguem translocar
apesar do tamanho aumentado pela fusão com a biotina ligase (adição de 27,7kDa) e que esta
Figura 32 - Teste de localização subcelular do sistema BioID. Análise por imunofluorescência de células
293FT transfectadas com os vetores de expressão de Yap1 fusionado à biotina ligase mutante BirA* na
presença de doxiciclina e biotina. Na imagem: BirA* corresponde ao vetor contendo a sequência codificadora
de BirA* fusionada ao Myc tag; BirA*-Yap1 e Yap1-BirA* correspondem às sequências codificadoras de
BirA* contendo um Myc tag fusionada no N- e no C-terminal de Yap1 de Mus musculus.
101
localização está de acordo com a função biológica de Yap; a marcação das células expressando
apenas BirA* se mostrou mias difusa, uma vez que a proteína se encontra espalhada por toda a
célula.
Juntos, esses resultados demonstram que as construções são expressas a partir dos
vetores clonados na presença do agente indutor, possuem o tamanho esperado e a biotina ligase
também possui a sua atividade catalítica inespecífica preservada, fator essencial para o sucesso
deste ensaio. Além disso, as proteínas de fusão também conseguem translocar para o núcleo
apesar do tamanho aumentado, evento fundamental para que Yap desempenhe sua função
biológica. O próximo ensaio que planejamos é analisar através de qPCR se Yap fusionado à
BirA* mantem a sua atividade canônica como co-ativador de transcrição. Para isso,
pretendemos induzir a expressão das proteínas de fusão com diferentes doses de doxiciclina e
verificar se a expressão dos genes-alvos de Yap aumenta proporcionalmente. É importante
ressaltar, contudo, que estas validações serão repetidas com as células EpH4 assim que as
linhagens com os vetores integrados estiverem estabelecidas.
4.3.2 Identificação das proteínas interagentes de Yap em células 293FT
Para fins de padronização de protocolo, realizamos também a identificação por
espectrometria de massas das proteínas interagentes de Yap nas células 293FT transientemente
transfectadas. Como resultado, obtivemos 663 hits de famílias de proteínas após uma busca na
base de dados do UniProt para proteínas do organismo Homo sapiens. Após a retirada dos
peptídeos reversos e contaminantes comuns de espectrometria de massas, subtraímos o valor
de LFQ dos hits identificados no controle BirA* das construções testadas, BirA*-Yap1 e Yap-
BirA*; os hits cuja quantificação resultou em negativa foram excluídos das análises seguintes.
Os 374 hits restantes foram submetidos à ferramenta online Venny para agrupar as proteínas
102
exclusivamente identificadas em cada construção (Figura 33A). Nós encontramos 134
proteínas foram exclusivas de cada construção, sendo que 106 foram compartilhadas entre as
duas, o que pode ser um indício de que pode haver uma interferência da posição de BirA* na
proteína de fusão, reforçando a necessidade de se realizar o ensaio com as duas construções. As
proteínas compartilhadas entre as duas construções não estão diferencialmente presentes de
acordo com a quantificação relativa (Figura 33B).
Com o uso da ferramenta online DAVID, avaliamos os processos celulares nos quais as
proteínas exclusivas identificadas em cada construção podem estar envolvidas (Figura 34).
Como esperado, via Hippo é o processo celular com maior significância estatística. De maneira
interessante, o processo proteólise mediada por ubiquitina identificado no ensaio de CoIP de
Yap em células EpH4 não foi identificado neste caso. A principal hipótese é de que isto possa
estar relacionado com a própria natureza das células utilizadas, uma vez que a 293FT é uma
linhagem humana embrionária não-susceptível à inibição de proliferação por contato e,
portanto, as vias de degradação de Yap podem estar suprimidas.
Uma vez padronizado o ensaio de BioID, pretendemos estabelecer uma linhagem
Figura 33 – Um conjunto diferencial de proteínas interagem com Yap fusionado à BirA* nas duas
construções testadas. A, diagramas de Euler mostrando a quantidade e proporção de proteínas que
interagiram com Yap fusionado à BirA* no C-terminal (BirA*-Yap1) e no N-terminal (Yap1-BirA*). B,
gráficos da quantificação relativa dada pelo valor de LFQ (label free quantification) das proteínas
identificadas para as construções BirA*-Yap1 e Yap1-BirA*. Cada ponto representa uma proteína e a
proximidade com a linha de tendência central indica que a diferença em termos de quantificação entre as duas
construções foi mínima.
103
estável de células EpH4 expressando as duas construções de Yap fusionado à BirA* e o controle
BirA* sob indução de doxiciclina. O objetivo é repetir as mesmas condições de cultivo e de
fracionamento que as utilizadas na CoIP.
Figura 34 – Os processos celulares que os possíveis interagentes de Yap no citoplasma estão envolvidos
são alterados com o tratamento com lrECM. Gráfico de barras indicando a significância estatística da
análise feita com a ferramenta DAVID contra a database KEGG Pathways para os processos celulares nos
quais estão envolvidas as proteínas imunoprecipitadas com Yap na fração citoplasmática exclusivamente na
condição (não-tratada [nT] ou tratada com matriz extracelular rica em laminina [lrECM]). Os valores na frente
das barras indicam o número de proteínas que foram agrupados em cada processo celular descrito.
104
105
5 DISCUSSÃO
Apesar de sua função clássica na regulação de órgãos e na supressão tumoral, ainda são
se sabe quais são os mecanismos de regulação de Hippo. Os resultados prévios do laboratório
e outros obtidos no decorrer do projeto apontam para os sinais do microambiente como um
ponto-chave para essa questão e para uma possível nova função da via, além da canônica, no
desenvolvimento e homeostase da glândula mamária.
Em nosso modelo de cultura com células de camundongo da linhagem EpH4, fomos
capazes de reproduzir o processo de acinogênese mamária mediada pelo tratamento com uma
matriz extracelular rica em laminina (lrECM), a qual possui constituição muito parecida com a
membrana basal típica dos epitélios desenvolvidos. As células também não apenas assumiram
uma arquitetura acinar como também se diferenciaram funcionalmente e produziram β-caseína
na presença de hormônios lactogênicos. Trabalhos prévios também evidenciaram a importância
da matriz extracelular para a diferenciação funcional de células epiteliais mamárias, apontando
a aquisição da polaridade celular mediada pela MEC em um contexto tridimensional como o
ponto fundamental para a responsividade das células aos hormônios lactogênicos (Xu et al.,
2009; Xu et al., 2010). Como os resultados preliminares de bioinformática do nosso laboratório
indicaram uma subrregulação dos genes-alvos de YAP/TAZ em células ductais mamárias,
suspeitamos de uma possível relação negativa entre a atividade da via Hippo e o estágio de
diferenciação funcional celular. Isso já era algo esperado dada a função de YAP/TAZ na
manutenção do estado de pluripotência celular e fenótipo tronco e na indução de proliferação e
sustentação da tumorigênese em estados iniciais do câncer (Chen, C. L. et al., 2012; Chen, D.
et al., 2012). No entanto, a observação de que Yap se mantinha no citoplasma das células
epiteliais de ductos da glândula mamária de camundongo em desenvolvimento nos fez
questionar se a via Hippo seria apenas importante para o desenvolvimento da glândula mamária
106
ou se poderia desempenhar algum papel fundamental também na diferenciação funcional do
órgão.
A análise por qPCR indicou uma diminuição nos níveis de expressão de Mst2 e Yap em
estruturas tratadas com lrECM, mas os níveis proteicos dos principais membros da via Hippo
(Mst1/2, Lats1 e Yap) não diminuíram. O tratamento com lrECM não impacta, pelo menos a
curto prazo, nos níveis da via Hippo, o que sugere que a sua regulação neste caso não se dá pelo
controle da sua expressão, mas sim pela sua atividade. A análise por Western Blotting não
indicou diminuição nos níveis de fosforilação de Yap no resíduo Ser149 (o qual promove a
retenção citoplasmática de Yap), apenas uma diminuição muito discreta nos níveis de
fosforilação no resíduo Ser382 (marca a proteína para interação com o complexo E3 e,
consequentemente, para a sua via de degradação). Apesar de não termos analisado os níveis de
fosforilação de Mst1/2 e Lats1/2 para inferir sobre a ativação da via, o resultado de que não
houve alteração significativa na fosforilação de Yap nos dois principais resíduos é mais um
indicativo de que a localização e atividade de Yap pode ser regulada por um mecanismo
independente de Hippo. Essa ideia pode ser reforçada pela diminuição na expressão gênica de
Ect2 e Ankrd2, dois genes-alvo de Yap, apesar da não alteração dos níveis proteicos do efetor
da via Hippo. Para obtermos resultados mais conclusivos, pretendemos seguir com um
experimento de cinética com estruturas tratadas com lrECM para análise tanto de expressão
gênica, proteica e de fosforilação da via Hippo.
O padrão de localização de Yap nas estruturas tratadas com lrECM foi semelhante ao
observado nos ductos da glândula em idade pubertal, o que nos indica que nosso modelo está
reproduzindo algo próximo do que realmente acontece in vivo. Um resultado que não
esperávamos, no entanto, é o padrão e de localização de Yap dentro do núcleo, assumindo um
arranjo cortical, o que difere da distribuição nuclear relativamente homogênea geralmente
observado. Dentre as hipóteses levantadas, consideramos uma alteração no padrão de regulação
107
de seus genes-alvos, modificação de territórios de cromatina dentro do núcleo ou um possível
papel na repressão gênica, como já foi demonstrado em um trabalho com o parálogo/ortólogo
TAZ (Kim et al., 2015; Valencia-Sama et al., 2015). No entanto, apesar dessas hipóteses, um
outro ponto a se considerar diz respeito à própria natureza das células. Ainda que a linhagem
EpH4 tenha sido formada por seleção de clones com determinada característica a partir da
linhagem IM-2, suas células ainda são muito heterogêneas e podem ser separadas em
subpopulações com propriedades morfogenéticas distintas (Montesano et al., 1998). Como in
vivo existe uma hierarquia de células mamárias com funções diferentes, com níveis diferentes
de células progenitoras originando células diferenciadas distintas (Visvader e Stingl, 2014;
Bach et al., 2017), é possível que o padrão diferencial de localização de Yap seja um reflexo
disso. Mas apesar das especulações, novos experimentos são necessários e esses
questionamentos levantados nos guiarão nos próximos passos para entender mais sobre o
comportamento de Yap induzido pelo tratamento com lrECM. Pretendemos, em projetos
futuros, utilizar experimentos de DamID (DNA methyltransferase identification) ou ChIP
(chromatin immunoprecipitation) sequencing para mapear os genes que podem ser regulados
por Yap em diferentes condições. Pretendemos também repetir o ensaio de proliferação por
incorporação de EdU para verificar se, nas estruturas tratadas com lrECM, as células em estado
proliferativo apresentam Yap cortical ou se este padrão se relaciona com determinado tipo
celular através de marcadores (como citoqueratinas) de subpopulações da glândula mamária.
Ainda, como o padrão de Yap cortical foi observado em um modelo de cultivo 3D na presença
de lrECM e de hormônios lactogênicos, precisamos avaliar também se este padrão também se
repete in vivo.
Para o experimento de CoIP, tivemos que adaptar o tratamento com lrECM para
obtermos um rendimento proteico minimamente satisfatório para realizar o ensaio,
principalmente considerando o rendimento de extração de proteínas nucleares. Em um outro
108
modelo convencional de cultura 2D as células são plaqueadas sobre um coating de lrECM e
cultivadas pelo tempo necessário para o ensaio, mas já foi demonstrado que células mamárias
tratadas neste desta forma falham em responder à prolactina por mislocation dos receptores de
prolactina e desencadear sinais intracelulares para a expressão de genes específicos para a
função da mama (Streuli, Edwards, et al., 1995; Xu et al., 2007). Por isso utilizamos o modelo
de ECM-overlay descrito previamente (Streuli, Schmidhauser, et al., 1995), no qual o
tratamento com lrECM é feito com as células já aderidas, as quais também alteram sua
morfologia (células assumem um padrão tendendo a uma estrutura tubular), a taxa de
proliferação e o padrão de localização de Yap (dados não mostrados neste trabalho), se
assemelhando bastante ao cultivo sobre matriz não-aderente de PolyHEMA. Uma condição de
fracionamento sob baixa estringência (PBS + 0,5% Nonidet P-40) foi fundamental para que se
preservasse o quanto possível a estrutura das proteínas e os complexos por elas formados, o que
se refletiu na grande quantidade de hits obtidos com a análise.
Os resultados obtidos por espectrometria de massas indicam que no contexto da lrECM
Yap poderia estar participando de eventos importantes ao metabolismo intermediário da célula,
especialmente ao relacionado à biossíntese de lipídios. Podemos relacionar este achado com
dois eventos importantes do desenvolvimento da glândula mamária: em maior evidência temos
a lactação, na qual ocorre não só a produção de β-caseína como também a síntese de lipídios e
de açúcares (especialmente a lactose) para compor o leite; e em um segundo plano temos o
próprio evento de diferenciação celular, uma vez que já se sabe que a composição lipídica da
membrana celular (e consequentemente a sua fluidez) se altera com o estágio do
desenvolvimento da célula e é específico do tipo e função celular. Tal conclusão seria relevante
pois na hipótese de que Yap tenha uma função relacionada à própria lactação a sua atividade
citoplasmática seria restrita apenas à glândula mamária, mas caso haja indícios de seu papel na
diferenciação celular, é possível que as observações feitas sobre sua localização e atividade
109
também se estendam a outros órgãos do corpo. Em um trabalho publicado em 2011, Dupont e
colaboradores observaram que YAP e TAZ são importantes para a diferenciação dependente da
rigidez da matriz em células tronco-mesenquimais (MSCs) (Dupont et al., 2011). Neste modelo,
MSCs se diferenciam em osteoblastos quando estão em uma matriz rígida ou em adipócitos
quando estão em uma matriz frouxa, o que não ocorre quando YAP/TAZ são silenciados por
tratamento com siRNA. Os autores argumentam uma sinalização mediada por YAP/TAZ
independente de Hippo através da via Rho GTPase, mas não discutem sobre a localização
celular de YAP/TAZ neste experimento ou de possíveis outras funções dos co-ativadores de
transcrição.
Com relação ao metabolismo, é lógico pensar que ele seja alterado com o
desenvolvimento da glândula mamária; afinal, as suas células precisam adaptar um estado
metabólico voltado à proliferação para outro voltado à quiescência e síntese de compostos
durante a lactação, e já existem alguns trabalhos na literatura que relacionam o metabolismo
com o estado proliferativo durante a formação de ácinos mamários e que observamos na análise
por espectrometria de massas. Coloff e colaboradores (Coloff et al., 2016), por exemplo,
demonstraram que glutamato é diferencialmente metabolizado em células epiteliais mamárias
em estado proliferativo ou quiescente; células proliferativas catabolizam o glutamato via
transaminases para sintetizar aminoácidos para síntese proteica, enquanto em células
quiescentes a síntese de aminoácidos é reduzida e a expressão de glutamato desidrogenase é
induzida. Mas não existem indícios de uma possível participação de YAP no metabolismo de
aminoácidos. Por outro lado, já foi demonstrado que YAP e TAZ podem interferir diretamente
no metabolismo de nucleotídeos através de sinais mecânicos do microambiente (Santinon et al.,
2018) e que o metabolismo aeróbico da glicose é capaz de modular a atividade transcricional
de YAP/TAZ (Enzo et al., 2015), mas em nenhum dos dois casos foram apresentados resultados
sobre quais proteínas estariam envolvidas nestes processos. Dessa forma, a partir de nossos
110
resultados de proteômica e do ensaio, pretendemos validar as possíveis interações de YAP e
aprofundar o estudo da participação de YAP em importantes processos citoplasmáticos.
A análise por espectrometria de massas também revelou resultados interessantes de
possíveis interações de Yap no citoplasma de células não-tratadas com lrECM. O processo
proteólise mediada por ubiquitina já era esperado dado os trabalhos já feitos revelando a sua
via canônica de degradação. No entanto, a presença da proteína Stub1 e dos processos celulares
fagossomo e lisossomo podem indicar também que a degradação de Yap pode ocorrer via
lisossomal ou microautofágica, como a autofagia seletiva assistida por chaperona (CASA) ou a
autofagia mediada por chaperona (CMA). Recentemente, Wang e colaboradores descobriram
que in vivo YAP regula negativamente a resposta imune inata antiviral ao impedir a dimerização
e a translocação nuclear do fator de transcrição IRF3 após uma infecção viral, e que a quinase
IKKε impede essa inibição ao fosforilar YAP no resíduo Ser403 e o marcando para degradação
via lisossomal (Wang et al., 2017). Esse resultado nos faz levantar uma importante consideração
em relação à atividade de Yap e o funcionamento da via Hippo como um todo: YAP possui um
total de 24 possíveis sítios de fosforilação (a maioria são resíduos de serina), sendo que alguns
são preditos por análises de bioinformática e outros são validados experimentalmente. No
entanto, não se sabe ao certo qual a função ou a implicação de cada uma dessas possíveis
modificações (ou a combinação delas) para a atividade da proteína. Estudos recentes baseados
em espectrometria de massas tem trazido achados importantes sobre a atividade de inúmeras
proteínas ao explorar modificações pós-traducionais (entre elas a fosforilação). Ainda falta na
literatura trabalhos que busquem estudar o impacto dessas modificações na via Hippo, ainda
mais um contexto de diferenciação mediada pela matriz extracelular como o visto neste
trabalho.
Apesar dos resultados de CoIP terem nos fornecido pistas importantes sobre um possível
novo papel de Yap em células da glândula mamária, eles estão longe de serem conclusivos.
111
Além das validações necessárias, pretendemos seguir com a identificação de possíveis parceiros
de Yap através do ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID),
o qual padronizamos neste trabalho. Apesar de ser bastante utilizado na literatura, o uso da CoIP
como ferramenta para elucidar interações proteína-proteína implica em algumas limitações,
como a incapacidade em se detectar interações fracas ou transientes (mesmo se utilizando de
condições pouco estringentes, como fizemos em nossos experimentos) ou interações da
proteína-alvo com outras proteínas pouco solúveis dentro da célula (como proteínas de
membrana ou do envoltório nuclear). Acreditamos que o ensaio de BioID nos servirá para
complementar os resultados obtidos até então ou até para indicar interações que não foram
detectadas pela técnica de CoIP. Para esse fim, desenvolvemos duas proteínas de fusão, Yap1-
BirA* e BirA*-Yap1, e clonamos a sua sequência codificadora em um vetor lentiviral de
expressão induzida. A escolha desse sistema de expressão é importante pois: i) esperamos criar
uma linhagem que expresse de maneira estável a proteína de fusão com a ORF integrada ao
genoma da célula; ii) para que a indução da expressão da proteína de fusão ocorra apenas após
o tratamento com lrECM, evitando assim a identificação de proteínas que interagiram com Yap
fora do contexto de diferenciação.
A análise por Western Blotting indica que as proteínas de fusão estão sendo expressas
de maneira satisfatória, sem indícios significativos de degradação por um possível misfolding,
e mantem a atividade de biotina ligase, fundamental para o resultado do ensaio. Além disso, a
detecção das proteínas de fusão por imunofluorescência no núcleo das células transfectadas nos
indica que as proteínas de fusão conseguem translocar do citoplasma para o núcleo, onde Yap
desempenha sua função canônica. Apesar disso, temos ainda que avaliar se Yap fusionado à
BirA* ainda mantem a sua atividade como coativador de transcrição.
A análise por espectrometria de massas das proteínas biotiniladas no experimento-piloto
com células 293FT indica que o sistema BioID que padronizamos foi capaz de identificar alguns
112
interagentes de Yap já descritos, como por exemplo proteínas associadas à via Hippo. Além
disso, proteínas diferentes foram identificadas por cada uma das duas construções que fizemos.
Este é um dado interessante pois nos trabalhos disponíveis na literatura os autores utilizam a
biotina ligase mutante fusionada apenas a uma das extremidades da proteína de interesse, e em
nosso experimento a posição de BirA* exerceu influência no padrão de interação de Yap com
outras proteínas dentro da célula. Ainda que não seja possível afirmar de maneira segura e que
seja necessário experimentos de validação, é possível que proteínas identificadas
exclusivamente pela proteína de fusão BirA*-Yap1 interajam com Yap preferencialmente com
a porção C-terminal, a qual não está comprometida com a inserção de BirA*, enquanto as
proteínas exclusivas para Yap1-BirA* podem interagir preferencialmente com Yap pela
extremidade N-terminal. Agora nossos futuros passos incluem transpor o sistema para as células
EpH4.
Por fim, apesar dos resultados promissores em relação aos putativos interagentes de
Yap, poucos trabalhos apontam a participação de TAZ/Taz no processo de diferenciação
induzida pela matriz extracelular. Em grande parte dos trabalhos na literatura científica
abordam Taz como participativo no desenvolvimento embrionário neuronal de órgãos como
rim e fígado (Varelas et al., 2008). Em um trabalho recente, no entanto, Denson e colaboradores
utilizam um modelo de camundongos transgênicos expressando Taz constitutivamente ativo na
glândula mamária para demonstrar que essa indução estava associada a um aumento glandular
mamário como resultado de uma hipertrofia adipocítica do fat pad (Denson et al., 2018). Por
esses resultados, por seu papel conhecido em outros órgãos de arquitetura tubular/arborescente
e dada a importância e influência do tecido adiposo adjacente na homeostase mamária (Hovey
e Aimo, 2010), seria também relevante investigar mais detalhadamente o possivel papel de Taz
e da via Hippo não apenas no desenvolvido do epitélio glandular, mas também na glândula
mamária como um todo.
113
6 CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que:
1. O tratamento com a matriz extracelular rica em laminina reproduz em cultura o processo
de acinogênese em células epiteliais da glândula mamária de camundongo cultivadas
em 3D;
2. A matriz extracelular rica em laminina altera a localização de Yap e o padrão de
expressão de seus genes-alvo;
3. As interações moleculares de Yap se alteram no citoplasma após o tratamento com a
matriz extracelular rica em laminina;
4. As proteínas que possivelmente interagem com Yap participam de inúmeras vias
importantes relacionadas ao metabolismo que serão exploradas em trabalhos futuros.
5. O ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) mostrou-
se promissor para a identificação de possíveis parceiros moleculares de Yap.
114
115
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134
135
SÚMULA CURRICULAR
1. Dados pessoais
Nome completo: Antonio Carlos Manucci Pereira Júnior
Local de nascimento: Morungaba, SP, Brasil
Data de nascimento: 15/08/1990
2. Formação acadêmica
2016-2018 Mestrado em Ciências Biológicas (Bioquímica)
Instituição: Instituto de Química – Universidade de São Paulo, USP – São
Paulo, SP, Brasil
Orientação: Prof. Dr. Alexandre Bruni-Cardoso
Projeto: Identificação das proteínas interagentes de Yes-Associated Protein
(YAP), um efetor da via Hippo, em células epiteliais mamárias expostas à matriz
extracelular rica em laminina
Fomento: CNPq (Processo n. 132844/2016-8 – 03/2016 a 06/2016), Fapesp
(Processo n. 2016/09561-3 – 07/2016 a 02/2018), Instituto Serrapilheira
(Processo n. 3832 – 06/2018 a 08/2018)
2010-2016 Bacharelado em Ciências Biológicas
Instituição: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP,
Brasil
Orientação: Prof. Dra. Heloísa Sobreiro Selistre-de-Araújo
Corientação: Sabrina Peviani Messa
Projeto: Análise da expressão de moléculas da matriz extracelular por
fibroblastos tratados com DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante
Fomento: Fapesp (Processo n. 2015/08760-0 – 06/2015 a 12/2015)
Período-sanduíche: Biologia Molecolare della Cellula/Molecular Cell Biology
Instituição: Università degli Studi di Milano, UniMi – Milão, MI, Itália
Orientação: Lucia Colombo
Duração: 09/2013 a 07/2014
136
Fomento: Capes (Processo n. 88888.021847/2013-00 – 09/2013 a 07/2014)
2005-2007 Ensino Médio
Instituição: ETE Rosa Perrone Scavone – Centro Estadual de Educação
Tecnológica Paula Souza, CEETEPS – Itatiba, SP, Brasil
3. Formação complementar
2017 Proteômica Avançada Baseada em Espectrometria de Massas para Análise de
Modificações Pós-traducionais (PTMs), SBBq (Duração: 8h)
2015 Cronofarmacologia: Integrando Ambiente, Tempo e Saúde, SBPC (Duração: 8h)
2013 Oncologia Molecular – Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, ICESP
(Duração: 30h)
2013 Ômicas – Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, ICESP (Duração: 8h)
2013 Fundamentos de Cultura Celular – Instituto do Câncer do Estado de São Paulo,
ICESP (Duração: 8h)
2012 Tópicos em Genética Médica, Universidade Federal de São Carlos, UFSCar
(Duração: 60h)
2012 Câncer x Inflamação, Universidade Federal de São Carlos, UFSCar (Duração:
8h)
2012 Imunologia: Conceitos Fundamentais e Avançados, Universidade Federal de
São Carlos, UFSCar (Duração: 8h)
4. Participação em eventos científicos
2018 II Congreso Internacional de Ciencias Básicas e Ingeniería
Local: Villavicencio, Meta, Colômbia
Condição: Avaliador de abstracts
2017 46ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
Local: Águas de Lindoia, SP, Brasil
Condição: Participante
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2016 XVIII Congresso da Sociedade Brasileira de Biologia Celular
Local: São Paulo, SP, Brasil
Condição: Participante
2015 67ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência
Local: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP. Brasil
Condição: Participante/Monitoria científica
5. Produção científica
Publicação em anais de eventos
2017 Manucci, A. C.; Fiore, A. P. Z. P.; Terra, L.; Palmisano, G.; Labriola, L.; Bruni-Cardoso,
A. The extracellular matrix influences the cellular localization and molecular
interactions of Yes-Associated Protein (YAP) in a 3D culture model for mammary
acinogenesis. In: 46th Annual Meeting of Brazilian Society for Biochemistry and
Molecular Biology. Jul 27-30, 2017; Águas de Lindóia, São Paulo, SP, Brazil
2016 Manucci, A. C.; Fiore, A. P. Z. P.; Bruni-Cardoso, A. The basement membrane alters
the subcellular localization of Yes-Associated Protein (YAP) in a 3D culture model for
mammary gland acinogenesis. In: XVIII Congress of Brazilian Society for Cell Biology;
Jul 13-16, 2016; Maksoud Plaza Hotel, São Paulo, SP, Brazil.
2015 Oliveira, C. R.; Marquetti, R. C.; Peviani, S. M.; Manucci, A. C.; Selistre-de-Araújo, H.
S. Recombinant RGD disintegrin DisBa-01improves would healing in rat model of
incisional hernia. In: XIII Congress of the Brazilian Society of Toxinology; Nov 09-11,
2015; Campos do Jordão, SP, Brazil. SBTx.
2013 Montenegro, C. F.; Durante, A. C.; Micocci, K. C.; Manucci, A. C.; Selistre-de-Araújo,
H. S. A role for endothelial αvβ3 integrin in breast tumor cell migration. In: Third
AACR International Conference on Frontiers in Basic Cancer Research; Set 18-22,
2013; National Harbor, MD. Philadelphia (PA), USA. AACR.
138
6. Outras atividades acadêmicas e científicas
Monitoria acadêmica
2017 Curso de Inverno em Bioquímica e Biologia Molecular
Instituição: Instituto de Química – Universidade de São Paulo, USP – São
Paulo, SP, Brasil
Supervisão: Prof. Dr. Alexandre Bruni-Cardoso
Duração: 03/07/2016 – 14/07/2016
2016 Curso de Inverno em Bioquímica e Biologia Molecular
Instituição: Instituto de Química – Universidade de São Paulo, USP – São
Paulo, SP, Brasil
Supervisão: Prof. Dr. Alexandre Bruni-Cardoso
Duração: 04/07/2016 – 15/07/2016
2015 Bioquímica e Biofísica
Instituição: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP.
Brasil
Supervisão: Prof. Dra. Mônica Rosas da Costa Iemma
Duração: 09/2015 - 12/2015
2014 Biologia do Desenvolvimento
Instituição: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP.
Brasil
Supervisão: Prof. Dr. Ivã de Haro Moreno
Duração: 08/2014 - 12/2014
Educação e popularização de Ciência & Tecnologia
2015 67ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência
Local: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP. Brasil
Condição: Participante/Monitoria científica
139
2012 VII Circo da Ciência: Os Cinco Sentidos
Local: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP. Brasil
Condição: Monitoria/Organização
2011 X Bio na Praça
Local: São Carlos, SP. Brasil
Condição: Monitoria
Organização de eventos acadêmicos
2015 IX Semana Acadêmica da Biologia
Local: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP. Brasil
2013 VII Semana Acadêmica da Biologia
Local: Universidade Federal de São Carlos, UFSCar – São Carlos, SP. Brasil