universidade de sÃo paulo faculdade de ciÊncias … · 2013-09-05 · felicidade, por dividir...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Ciência dos AlimentosÁrea de Bromatologia

Teores de benzilglicosinolato, benzilisotiocianato e expressão da

mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão

papaia (Carica papaya L. , var. Sunrise Solo)

Maria Rosecler Miranda Rossetto

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientador.

Prat-'. Drª. Beatriz Rosana Cordenunsi

Co- orientador:

Praf. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento

SÃO PAULO

2005

DEDALUS - Acervo - CQ

1111.11111111130100011116

Ficha CatalográficaElaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

1. Enzima : Mamão: Bioquímica dos alimentos 2. Caricapapaya: Ciências dos alimentos 3. Expressão gênica 4. Biologiamolecular I. T. 11. Cordenunsi, Beatriz Rosana, orientador.III. Nascimento, João Roberto Olivei ra do, co-orientador

Rossetto, Maria Rosecler MirandaR829t Teores de benzilglicosinolato, benzilisotiocianato e expressão

da mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento domamão papaia (Carica papaya L., varo Sunrise solo) / MariaRosecler Miranda Rossetto. São Paulo, 2005.

115p.J} 1-

Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas daUniversidade de São Paulo. Departamento de Alimentos e NutriçãoExperimental

Orientador: Cordenunsi, Beatriz RosanaCo-orientador: Nascimento, João Roberto Oliveira do

CDD641.34651

Maria Rosecler Miranda Rossetto

Teores de benzilglicosinolato, benzilisotiocianato e expressão da

mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão

papaia (Carica papaya L., varo Sunrise Solo)

Comissão Julgadorada

Tese para obtenção do grau de Doutor

Prafa. Dr<;Í. Beatriz RosaniCOrdenunsi o~entador/presidente

João Roberto Oliveira do Nascimento1°. examinador

Giuseppina Pace Pereira Lima2°. examinador

Ricardo Alfredo Kluge3°. examinador

Marco Aurélio Tiné4°. examinador

São Paulo, junho de 2005.,1.1

t -- ~ -- ------ ------

P,~efênciada caridade:

Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver caridade, sou

como o bronze que soa, ou como o címbalo que retine. Mesmo que eu tivesse o dom da

profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência; mesmo que tivesse toda afé, a

ponto de transportar montanhas, se não tiver caridade não sou nada. Ainda que

distribuísse todos os meus bens em sustento dos pobres, e ainda que entregasse o meu

corpo para ser queimado, se não tiver caridade, de nada valeria!

A caridade é Paciente, Bondosa. Não tem inveja. Não é orgulhosa. Não é

arrogante. Nem escandalosa. Não busca seuspróprios interesses, não se irrita, não guarda

rancor. Não se alegra com a injustiça, mas se rejubila com a verdade. Tudo desculpa, tudo

crê, tudo espera, tudo suporta. A caridade jamais acabará.

As profecias desaparecerão, o dom das línguas cessará, o dom da ciênciafindará.

A nossa ciência é parcial, a nossa profecia imperfeita. Quando chegar o que é perfeito o

imperfeito desaparecerá. Quando éramos crianças falávamos, pensávamos e

raciocinávamos como criança. Desde que nos tornamos homens, eliminamos as coisas de

criança. Hoje vemos como por um espelho, confUsamente, mas então veremosface a face.

Hoje conheço em parte; mas conhecerei totalmente, como eu sou conhecido. Por ora

subsistem a fé, a esperança e a caridade - as três. Porém a maior delas é a caridade.

(I Coríntios 13: 1-13)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por muitas bênçãos derramadas em minha vida, por ter me conservado e

me dado uma família maravilhosa, e pela oportunidade de mais esta formação acadêmica.

Obrigada Deus pela saúde, pela paz, harmonia e muita perseverança, por me dar essa certeza de

acreditar deque sem o Seu amparo nada somos e como diz o salmista: "eu tudo posso Naquele

que me fortalece".

Agradeço especialmente à minha mãe Marlene, pelo seu imenso amor e dedicação, aqui

não caberiam palavras para explicar a grande mãe guerreira e dedicada que temos. Agradeço à

minha irmã Andréa pelo grande apoio sentimental e moral, pelos seus sábios conselhos,

contagiando-me com sua grande força interior, otimismo e muita garra e também pela imensa

ajuda financeira (obrigada querida irmã). Quero agradecer ao meu marido, Alexandre, por ter me

proporcionada mais alegria na vida, por compartilharmos juntos muitos momentos de alegria e

felicidade, por dividir comigo todos os meus problemas me dando força e coragem. Agradeço-o

especialmente porter me dado um filho, o João Victor, que nos trará muita alegria. Aos meus avós

Pedro e Lourdes que me mostraram o poder de Deus nas nossas vidas, ensinando-nos que a

felicidade anda de mãos dadas com a humildade, e que esse sentimento abstrato, aumenta, a

partir do momento em que temos compaixão de nossos irmãos menos favorecidos, e quando

estamos sempre dispostos a perdoar.

Um agradecimento especial aos meus queridos tios Luís Fernando e Tere que desde o

meu mestrado confiaram plenamente em mim, sendo os fiadores do meu apartamento, peço a

Deus que os cubra de bênçãos. Aos meus outros tios e tias (João e Inês, Edvaldo e Selma, Rita e

Marcos) por tanto carinho, afeto e por estarem sempre presentes no amor e na união. Aos meus

sobrinhos e primos que os amo de paixão como se fossem meus filhos verdadeiros, obrigada por

vocês existirem, e fazerem a minha vida mais feliz, Vinnícius, Rafhaela e Isabela (sobrinhos),

Talita, Caio, Leonardo, Ivanka, Samantha e Xandinho (primos).

Quero agradecer também à minha sogra Adair e a meu sogro Flávio pela grande

dedicação e apoio sentimental, moral e financeiro no nosso casamento e também pelo

companherismo.

Agradeço aos meus primeiros orientadores, Professora 0(' Giuseppina P. P. Lima e

Professor José Pedro S. Valente, por tanta paciência, bondade e dedicação nos primeiros passos

da iniciação científica, e por despertar em mim, o grande desejo de ser pesquisadora.

Ao Professor Dr. Rogério L. Vieites, pela grande amizade, pela orientação, pelas aulas

maravilhosas e grande incentivo na área de Alimentos.

Agradeço especialmente à minha orientadora Professora Dr" Beatriz Rosana Cordenunsi

por tantos anos de amizade, paciência, por sua grande dedicação e ajuda em todos os momentos,

principalmente nas correções de muitos relatórios, trabalhos, qualificação e tese, também por sua

preocupação e delicadeza neste meu momento especial de gravidez.

Agradeço também de modo especial, ao Professor Dr. João Roberto O. Nascimento, por

me aceitar como sua co-orientada, pelo seu ânimo e incentivos contagiantes, por sua grande

amizade em todos estes anos de mestrado e doutorado, pelos vários bons momentos de alegria e

descontração, pela imensa ajuda e participação em todos os resultados produzidos neste trabalho,

desde as análises do laboratório, acompanhando cada análise da biomol (obrigada por sua imensa

disposição e paciência de muitas vezes fazer comigo e me ensinar todas estas análises, e me

ensinar a ler os manuais), até as infindáveis correções de trabalhos, relatórios, tese, etc. Quero

agradecê-lo também pelo imenso carinho que teve comigo na gravidez.

Agradeço, com carinho ao Professor Dr. Eduardo Purgatto que também foi um pouco meu

co-orientador, principalmente na área cromatográfica, agradeço por sua grande amizade nos seis

anos que passei aqui, por sua acessibilidade e dedicação, por sua imensa ajuda na elaboração

dos métodos destas análises, cálculos e ajuda na conferência dos mesmos.

Ao Prof. Dr. Franco Maria Lajôlo também quero anexar os meus agradecimentos não só

pela amizade, mas por seus sábios e preciosos conselhos e por me incluir no seu núcleo de

pesquisa, quero agradecer especialmente pelo senhor e sua equipe terem me favorecido o grande

avanço científico, cheguei aqui sem saber quase nada e hoje posso dizer que aprendi muito de

pesquisa com vocês, obrigada.

Os meus agradecimentos aos grandes novos amigos do laboratório, por tornarem a nossa

vida mais agradável e feliz e pelo apoio nas horas difíceis da vida: Andréia (pela sua grande

amizade e companheirismo), Amanda, Malu, Fernanda, Graciele, Janaína, Eliana, Denise, Ana

Cris, Adriana, Milana, Marcinha, Aderuza, aos amigos Adair (por sua imensa ajuda), Renato (por

sua grande ajuda), Maurício, Ricardo, João Paulo, Marcelo, adoro todos vocês, às técnicas Lúcia e

Tania, à querida Marcia que tanto me ajudou a congelar os mamões, junto da professora Beatriz e

do professor João, quero agradecer pela amizade também a professora Inês Genovese.

Às meninas da secretaria, Mônica e Tânia, e ao pessoal da secretaria de pós-graduação

(Jorge, Elaine e Majô) meus agradecimentos pela amizade e pela imensa atenção.

Meus agradecimentos muito além de especial à FAPESP, órgão financiador desta

pesquisa, por custear todos os reagentes, pela ajuda na divulgação dos trabalhos científicos

(principalmente em congressos), pelo auxílio tese, pela bolsa generosa, sem um dia de atraso, por

ter confiado muito em meu trabalho desde a iniciação científica, mestrado e, agora, doutorado,

muito obrigada aos relatores científicos e administrativos e a toda equipe FAPESP.

Dedico

Marlene

Alexandre

este trabalho à minha mãe

e irmã Andréa, ao meu marido

e especialmente ao meu filho

João Victor.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 3 )J

1.1 Classificação botânica do mamão papaia 6 S

1.2 Ponto de colheita 9

1.3 Variedades e cultivares 10

1.4 Metabolismo das plantas 12

1.5 Glicosinolatos 17

1.5.1 Benzilglicosinolatos •••••••••.••••••••••••••••••.••.•••..••.••••••••.••••••..••..•••..••••••••••••••••••....••••••••• 19

1.5.2 Fatores que influem na composição dos glicosinolatos em plantas ••••••••••••••..••••••• 21

1.5.3 Biossíntese dos glicosinolatos em geral•••••••••....•••••••.•.•••••••.••.•.•••••••••••••................. 24

1.5.4 Evolução da biossíntese dos glicosinolatos••••.••••••.••.••••..•••.•••••••••••••••••••••...••.••••••••• 30

1.6 Degradação dos glicosinolatos 32

1.7 Mirosinases 34

1.8 Sistema glicosinolato - mirosinase no mamão 37

2. OBJETiVOS 39

3. MATERIAL E MÉTODOS 40

3.1 Material 40

3.2 Métodos 42

3.2.1 Determinação de Açúcares solúveis•.•••••••••.••••••••.•..•••••.•••••••••.••••••••••••••.••••....••••••••• 42

3.2.2 Determinação de Etileno e CO2 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 43

3.2.3 Análise do benzilglicosinolato em mamão por HPLC••.•.•••••••••••••••••.•••••.•••••••••••••...•• 44

3.2.4 Análise do BITC durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão •••••••• 46

3.2.5 Preparo do extrato enzimático e atividade da p-tioglicosidase em mamão papaia 50

3.2.6 Proteínas ••.....•••••••••••••...••••••••••••••.•••••••••••••.•••.....•••••••••.••••••••••••••••••••••..........•••.•••••... 51

3.2.7 Extração de RNA total••••••••••••••••••••••••••••..•.•••.•.••.•••••••••••.•••••••••••••••••••••..•••.....••••••••.• 51

3.2.8 Obtenção do cDNA ........•...••••••••••••••..••••••••••..••••••••••••.•••••••••••••••...•••.••.••••••••••••••.•••••• 53

3.2.9 Síntese de oligonucleotídeos•••••••••••.•••••••.••••..•...;..•.•••............................................. 53

- - _.- --

2

3.2.10 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ••••••.••••.•••••••••.••••••.•.••••••••••.•...•••••••••..•.••••. 55

3.2.11 Clonagem e expressão do produto de PeR•••.•.•••••••.••.•••••••••••••••••••.••••••••••••.•••••••••• 55

3.2.12 Mini-preparação de DNA plasmidial e sequenciamento••••••••••••••••••.••••••••••••...••••.• 56

3.2.13 Expressão em sistema heterólogo da mirosinase em Escherichia colí e purificação

da proteína recombinante•.•••••..•••••.••••••••••.•.••••••••••..•••••••••.•••••••.•••••••••••••••••...••••.•••.•..•••••.. 57

3.2.14 Eletroforese de RNA e northem blot •••..••••..•••••••••••••••.••••••••••••••••••••..•.•..•••..•••...•••• 59

4. RESULTADOS 60

4.1 Perfis de açúcares solúveis 62

4.2 Respiração e Etileno durante o amadurecimento de mamão papaia 63

4.3 Avaliação da atividade das mirosinases em diferentes estádios de maturação e

diferentes regiões da polpa do mamão 64

4.4 Otimização da metodologia de análise de benzilglicosinolato (BG) e do

benzilisotiocianato (BITC) 66

4.5 Teores de benzilglicosinolatos, BITC e atividade das mirosinases na polpa, casca e

semente durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão papaia 70

4.6 Teores de benzilglicosinolato, BITC e atividade da mirosinase em mamões submetidos

a tratamento com etileno e 1-MCP 77

4.7 Determinação e quantificação relativa do BITC na cavidade interna do mamão durante

o amadurecimento 83

4.8 Extração de RNA total 85

4.9 Amplificação por PCR 85

4.10 Clonagem e seqüenciamento 87

4.11 Expressão heteróloga do cDNA da mirosinase de semente de mamão em E.co/i. 94

4.12 Expressão gênica da mirosinase de mamão papaia 96

-5. CONCLUSOES 99

6. BIBIOGRAFIA CITADA 100

-- . -- _ __ ._~ -~_. ~.-,..=.o.~_ -= - "--- _

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Gradiente de eluição utilizado para determinação de benzilglicosinolato

por HPLC com detecção no U.v. (228 nm) .46

Tabela 2: Condições de trabalho do CG/MS para análise de BITC 48

Tabela 3: Relação das sequências de primers utilizados em PCR para

amplificação de fragmentos de mirosinases 54

Tabela 4: Códigos Ambíguos IUPAC 54

Tabela 5: Sequência de bases dos primers usados nos ensaios de expressão...57

-_.- - -.-

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Balança comercial de frutas frescas do Brasil (Informativo Ibraf, 2005).4

Figura 2: Flor de mamoeiro já fecundada 7

(yNNi.botany.hawaii.edulfacu!tylwebb/BOT41 O/AngiosoermlPlacentation-2.htm)

Figura 3: Carta de cores do System Approach. 1O

Figura 4: Vias metabólicas primária e secundária de plantas (VICKERY &

VICKERY, 1981; DEY & HARBORNE, 1977) 16

Figura 5: Exemplos de glicosinolatos indólicos, aromáticos e alifáticos 25

Figura 6: Biossíntese dos glicosinolatos por DEY & HARBORNE (1977) FAHEY

et aI. (2001); CHEN & ANDRÉASSON (2001); WITTSTOCK & HALKIER (2002)28

Figura 7: Biossíntese do benzilglicosinolato WITTSTOCK & HALKIER (2000);

WITTSTOCK & HALKIER (2002); WITTSTOCK & HALKIER (2004) 29

Figura 8: Via metabólica, comum às plantas produtoras de glicosinolatos e

glicosídeos cianogênicos baseados nos derivados da família gência descrita como

CYP79s (KVL-Department of Plant Biology: www.plbio.kvl.dk). Met, Phe, Trp, I1e,

Vai, correspondem aos aminoácidos, metionina, fenilalanina, triptofano, isoleucina

e valina 31

Figura 9: Degradação do glicosinolato pela mirosinase (FAHEY et aI., 2001;

CHEN & ANDRÉASSON, 2001 ) 33

Figura 10: Estádios de desenvolvimento (30, 60, 90 e 120 dpa) e ponto de

colheita (150 dpa) de mamão papaia (Carica papaya L., v. Sunrise soI0) .42

~~----

Figura 11: A. Sistema de captura do BITC volátil na cavidade interna do mamão

papaia. B. Frutos, com as cânulas plásticas e com as ponteiras vedadas, aos 5

dias pós-colheita, utilizados para medida do BITC dentro da cavidade interna do

mamão 50

Figura 12: Subdivisão das regiões do mamão papaia (1 a amostragem) para

análise dos açúcares solúveis na polpa. 61

Figura 13: Teor de açúcares solúveis (%) em três diferentes regiões da polpa do

mamão papaia do "CEASA" (var. Sunrise solo) com 2 dias após a colheita da 1a

amostragem (-D-verde e maduro) 62

Figura 14: Curvas de respiração e etileno (2a amostragem) em frutos de mamão

papaia (var. Sunrise Solo) durante o amadurecimento, colhidos com 150 dias

após a antese (triplicata de injeção ± desvio padrão) 64

Figura 15: Atividade da mirosinase relativa a 1a amostragem em diferentes

regiões da polpa (P1 = apical , P2=mediana e P3 = próxima ao pedúnculo) e nos

tecidos da semente e da sarcotesta (triplicata de extração ± desvio padrão) 65

Figura 16: Análise por HPLC de benzilglicosinolatos (BG) em mamão papaia. A.

Cromatograma do padrão de benzilglicosinolatos cedido por Richard Bennett

(Institute of Food Research-Inglaterra). B. Cromatograma da semente no ponto de

colheita (150 dpa) 67

Figura 17: Análise por CG/MS do padrão de benzilisotiocianato (BITC) (Aldrich)

(pico relativo a 110,69 ng de BITC pela curva de calibração) com respectivo

espectro de massa 68

Figura 18: Análise por CG/MS, cromatograma e espectro de massa da semente

de mamão papaia no ponto de colheita 69

~"*-".-._- -~--- -~-,.. -~- ---~-- -----~ - --- -----

Figura 19: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e teores

de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e

amadurecimento da Polpa (-0-) do mamão papaia relativo a 2a amostragem

(triplicata de extração ± desvio padrão) 70



amadurecimento na Casca ( ) do mamão papaia relativo à 2a amostragem




amadurecimento na Semente ( ) do mamão papaia relativo à 2a amostragem


Figura 22: Teores de benzilglicosinolatos (-O- Polpa; -Dl-Casca e

___Semente) durante o amadurecimento do mamão papaia na 3a amostragem


Figura 23: Teores de BITC (-o-Polpa; -M-Casca e Semente) do mamão

papaia, submetidos aos tratamentos com etileno e 1-MCP, comparados aos frutos

controle, durante o amadurecimento na 3a amostragem (duplicata de extração ±

desvio padrão) 79

Figura 24: Atividade da mirosinase relativa a 4a amostragem em sementes de

mamões submetidos aos tratamentos com 100 ppm de etileno(~), 100 ppb de

1-MCP (-0-) comparados aos frutos controle(-a-) (triplicata de extração ±

desvio padrão) 80

Figura 25: Teores de benzilisotiocianato na cavidade interna do mamão papaia

durante o amadurecimento ( Controle; 100 ppm Etileno e -0- 100 ppb 1-

MCP) (triplicata de injeção ± desvio padrão) : 84

-- -- ;-- -

Figura 26: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo,

de RNA total de mamão papaia. Padrão Low mass DNA ladder (P), polpa com 30

e 60 dpa ( P1 e P2), casca com 90 e 150 dpa (C1 e C2), sementes com 150 e 156

dpa ( 81 e 82) 85

Figura 27: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo

das amplificações com os primers 81 e R6 (1), com os primers 81 e R2 (2), e com

os primers 85 e R6 (3). Padrão Low mass DNA Ladder ( P) 86

Figura 28: Alinhamento das sequências parciais de aminoácidos (códigos IUPAC)

obtidas a partir da semente de mamão, comparadas a dezesseis seqüências de

mirosinases depositadas no Genebank. As sequências de mamão estão

representadas como miropep1000 (miro 1), miropep1030 (miro 2) e miropep400

(miro 3) e as demais representam Arabidopsis thaliana: Arab12 (AAK62412),

Arab24 (AAF14024), Arab37 (NP187537), Arab21 (857621), Arab02(P37702),

Arab53 (856653), Arab 91 (BT002458); Brassica napus (canola): BN89

(CAA79989), B50 (839550), BN26 (Q00326); Sinapis alba (mostarda branca):

MB36 (P293736), MB49 (819149), MB92 (P29092), MB38 (P29738) e também

mirosinase de Brevycore brassicae (inseto afídeo de brassicas): BR99

(AAL25999). Os códigos entre parênteses representam o número de acesso da

sequência no Genebank 91

Figura 29: Eletroforese de proteínas de mamão em sistema dissociante 8D8

PAGE, gel a 9%. Padrão de peso molecular (1); polpa com 120dpa (2); casca com

150 dpa (3); semente com 150dpa (4) 94

Figura 30: Eletroforese de extratos protéicos de E. coli em gel de poliacrilamida

9% da expressão piloto de mirosinase. Padrão de peso molecular (P); indução da

colônia 1 (IC1 ); bactérias não-induzidas com IPTG (NI); indução da colônia 2

(IC2) 95

--'" -- ~~

Figura 31: Análise de northem blot em diferentes tecidos do mamão papaia A.

Eletroforese de RNA total em gel de agarose (1,2%). POLPA com 30 dpa (1), 60

dpa (2),90 dpa (3), 120 dpa (4), 150 dpa (5); CASCA com 30 dpa (6), 60 dpa (7),

90 dpa (8), 120 dpa (9), 150 dpa (10) e SEMENTE com 60 dpa (11), 90 dpa (12),

120 dpa (13), 150 dpa (14), 153 dpa (15), 155 dpa (16), 156 dpa (17), 157 dpa

(18); L Autoradiografia de RNA hibridizado com a sonda específica para

mirosinase do mamão. B. Eletroforese de RNA total em gel de agarose (1,2%).

CASCA com 30 dpa (1), 60 dpa (2), 90 dpa (3), 120 dpa(4), 150 dpa (5) e

SEMENTE com 30 dpa(6), 60 dpa(7), 90 dpa(8), 120 dpa (9), 150 dpa(10), 153

dpa(11), 155 dpa (12), 156 dpa (13), 157 dpa(14); iL Autoradiografia de RNA

hibridizado com a sonda específica para mirosinase 97

3

TEORES DE BENZILGLlCOSINOLATO, BENZILlSOTIOCIANATO E

EXPRESSÃO DA MIROSINASE DURANTE O DESENVOLVIMENTO E

AMADURECIMENTO DO MAMÃO PAPAIA (Carica papaya L., varo Sunrise

Solo)

-1. INTRODUÇAO

o mamoeiro (Carica papaya, L.) é uma planta frutífera típica de regiões tropicais

e seus frutos tem grande aceitação no mercado internacional. O Brasil destaca-se como

um dos maiores produtores de mamão em escala internacional, concentrando 29% da

oferta mundial, seguido da índia (24%), Tailândia (8,8%), México (7,4%) e Indonésia

(5,9%). No Brasil, o mamão é cultivado em praticamente todo o território nacional à

exceção de algumas regiões com invernos rigorosos. As regiões Sudeste e Nordeste

somam em média 87,5% da produção nacional com destaque para os estados do

Espírito Santo e Bahia (Barretto et a!., 2002).

A exportação de frutas no Brasil vem crescendo muito nos últimos anos. Pelo

sexto ano consecutivo, a fruticultura brasileira se mantém superavitária e a balança

comercial de frutas frescas (Figura 1) fechou o ano de 2003 com um saldo de US$ 267

milhões (US$ 335 milhões de exportações e US$ 68 milhões de importações), 39% a

mais que em 2002 (Informativo IBRAF n. 19, fevereiro 2003). O incremento aconteceu,

basicamente, devido a significativos aumentos nas exportações de uva (77%), limão

(71%), abacaxi (59%), melão (54%), manga (44%) e mamão (35%). De janeiro a junho

de 2004 o aumento das vendas externas bateu em 23% o mesmo período de 2003. Até

o final de 2004, a meta de exportação do projeto Brazilían Fruit era de US$ 357,2

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Faculdade de Ciências F3r:nacêu\lCa~universidade de São Paulo

~._-=--

4

milhões (Informativo IBRAF n. 32, Junho 2004). Superando as expectativas, o Brasil

fechou o ano de 2004 com um superávit de US$ 369 milhões (Figura 1).

---.- Saldo

241

99 2000 2001 2002 2003 2004

.-J Importações

~ 'cial de Frutas Frescas

_ Exportações

400 1 Balanca Comel 337 3300

200

100

o

-100

-200

-300 ~!f~~~~~~~======~=:=;===~=========================:=ll

Figura 1: Balança comercial de frutas frescas do Brasil

(Informativo Ibraf, 2005)

Os números não são maiores porque vários países da Europa, o Japão e os

Estados Unidos continuam a dificultar as exportações de frutas frescas do Brasil,

através de imposições de barreiras conhecidas como "não - alfandegárias", alegando a

presença de fonte de inóculos patogênicos e a falta de um tratamento fitossanitário

adequado e efetivo para os frutos.

Um dos principais problemas fitossanitário da fruticultura brasileira é a infestação

por mosca-das-frutas (SAUL e SEIFERT, 1990) e os gêneros de maior relevância são:

Ceratitis capitata Wild e Anastrepha spp. Os frutos podem ser infestados por outros

5

gêneros igualmente importantes, porém estes dois são os de maior disseminação. Por

muitos anos foi usada a fumigação com brometo de metila, para ovos, larvas e insetos

adultos, mas por ter efeito deletério para os seres humanos, o seu uso foi proibido pelo

ministério da agricultura do Brasil e pelo USDA (ministério da agricultura dos Estados

Unidos), o que levou à busca de novas alternativas para substituir, com eficiência, os

métodos de desinfestação destes dípteros. Uma das tecnologias viáveis foi o

tratamento quarentenário, que consiste no tratamento hidrotérmico dos frutos,

mantendo-os em água a 46,1 cC por 70 a 90 minutos.

Um dos problemas do tratamento térmico, é que o aquecimento prolongado pode

provocar alterações na textura e no sabor dos frutos. Afeta também o equilíbrio entre a

relação interna de oxigênio e gás carbônico, o que provoca um estresse adicional nos

frutos que foram submetidos a este tipo de tratamento. Devido aos fatores citados, o

tempo de armazenamento e conservação também são prejudicados, diminuindo a vida

de prateleira destes frutos (WILLS et aI., 1995; SHELLlE et ai, 2000).

Para amenizar estes problemas, estudos vêm sendo realizados desde a década

de 1940, com plantas que produzem substâncias tóxicas denominadas fitoalexinas, as

quais são responsáveis por sua própria defesa. Desde 1970, já se sabe que o mamão

produz um composto tóxico, o benzilisotiocianato, capaz de combater alguns tipos de

fungos e diminuir a infestação por ovos e larvas de mosca das frutas (PATIL & TANG,

1970). Atualmente, o mecanismo de defesa das plantas tem sido melhor abordado e já

se sabe que um deles é o sistema glicosinolato-mirosinase, que está presente

principalmente nas brássicas. O mamão parece ser o único fruto portador deste

sistema. Estudos realizados na Itália mostraram que plantas produtoras de

6

glicosinolatos, que foram submetidas à secagem e incorporadas ao solo, foram eficazes

no combate a dois importantes patógenos: Pythium spp. e Rhizoctonia so/ani, que

substituiu a fumigação deste solo com brometo de metila (LAZZERI et aI., 2004). Estes

estudos mostraram que estas plantas podem seNir como biocidas naturais para o

controle de certos tipos de pragas, principalmente do solo (LAZZERI et aI., 2004).

A literatura relata que o sistema-glicosinolato-mirosinase pode ser de grande

importância para as plantas, para o ambiente, na nutrição dos seres humanos e

animais. A manipulação deste sistema de defesa pode ser uma das alternativas para

melhorar as qualidades organolépticas e a fitossanidade de frutos e hortaliças.

1.1 Classificação botânica do mamão papaia

Reino: Plantae

Subreino: Tracheobionta

Superdivisão: Spermatofita

Divisão: Magnoliofita

Classe: Magnoliopsida

Subclasse: Dilleniidae

Ordem: Violales

Família: Caricaceae

Gênero: Canca

Espécie: Carica papaya

li

O mamoeiro é uma planta herbácea com altura entre 2 e 10m, que pode viver até

20 anos. Tem um sistema radicular superficial com raízes brancas e pouco abundantes,

8

Nas plantas femininas, as flores são amarelas, isoladas ou em grupo de 2 a 3

que se inserem diretamente no caule. Os frutos decorrentes são arredondados a

ligeiramente ovais. Um pomar com plantas femininas necessita de 10-12% de

mamoeiros masculinos, uniformemente distribuídos para assegurar a produção.

As plantas hermafroditas apresentam flores com órgãos masculinos e femininos

na mesma flor e não dependem de outras para a fecundação. Tem forma alongada

(elongata) ou arredondada (pentandrica) e seus frutos podem ser cilíndricos (preferidos

comercialmente) ou arredondados.

Vários fatores genéticos induzem a variabilidade nas flores ao longo do ciclo da

planta; em decorrência disso, os frutos podem apresentar-se em formas diversas

(BARRETO et aI., 2002). Assim, flores hermafroditas podem tomar-se femininas, e

masculinas tomarem-se hermafroditas, produzindo o mamão-macho, sendo as flores

femininas as mais estáveis. O sexo da planta é identificado após a emissão das flores.

O mamoeiro pode ser propagado por sementes, estaquia e enxertia, sendo que

comercialmente é multiplicado por sementes. As plantas fornecedoras de sementes

devem ter bom estado sanitário com baixa altura de inserção das primeiras flores,

precocidade e alta produtividade e serem hermafroditas em plantações distantes das

de outras variedades.

Quanto à classificação do fruto: o mamão é um fruto simples (os carpelos são

unidos entre si no início do desenvolvimento) do tipo baga, nasce do caule ou do

pedúnculo longo (macho), são arredondados, cilíndricos ou periformes, apresentam cor

amarela ou alaranjada quando maduros; possuem polpa de consistência suave e

sucosa, cor salmão, avermelhada e também amarela, contendo até 1.000 sementes

que se inserem na cavidade interna do fruto.

11

9

1.2 Ponto de colheita

o ponto de colheita do mamão depende muito do genótipo utilizado. A colheita é

realizada com base na idade da planta quando da ocorrência da primeira flor aberta

(pelo menos 5 plantas floradas), na primeira frutificação (pelo menos 5 plantas com

frutos seguros), que pode ser aos 90, 150, 180, 270 e 360 dias após o plantio das

mudas (BARRETO et aI., 2002) .

A colheita pode ser realizada o ano todo, mas para que o fruto tenha o padrão de

qualidade desejado, se faz necessário o conhecimento da maturação e

amadurecimento. O mamão faz parte da classe de frutos climatéricos, ou seja, continua

o processo de amadurecimento após a colheita. Nos frutos climatéricos, o

amadurecimento é sinalizado através de uma produção máxima de etileno (hormônio

do amadurecimento), diferente dos frutos não climatérios, que mantem um nível basal

deste hormônio. No mamão, o pico de etileno parece ocorrer antes do pico respiratório

(GOMEZ et aI., 2002).

Além do climatério, outro parâmetro importante para identificar o estádio de

maturação é a cor da casca, que pode ser medida por escalas visuais subjetivas, assim

como a descrita no System Approach (VIEIRA et aI. 2000), o mais utilizado (Figura 3),

ou por colorímetro de Hunter (OLIVEIRA et aI., 2002).

11'

10

Estádio O- fruto crescido e desenvolvido

Estádio 1 - fruto com até 15% da superfície amarela

Estádio 2 - fruto com até 25% da superfície amarela (1/4 madura)

Estádio 3 - fruto com até 50% da superfície amarela

Estádio 4 - fruto com 50 a 75% da superfície amarela

Estádio 5 - fruto com 100% da superfície amarela

o 2 3 4 5

Figura 3: Carta de cores do System Approach

Os frutos destinados à exportação são colhidos no estádio 2, principalmente os

destinados aos EUA, enquanto para a Europa, considera-se até o estádio 4. Para o

mercado interno, varia conforme a distância do mercado consumidor e o tempo de

comercialização da fruta (FRUTISERIES, 2000)

1.3 Variedades e cultivares

A cultura dt> mamoeiro está difundida em regiões que apresentam clima tropical,

pluviosidade elevada, solos férteis e bem drenados. A cultura retomou sua importância

econômica no Brasil, devido à introdução de cultivares havaianas do grupo Solo e dos

híbridos chineses do grupo Formosa, nos Estados da Bahia, Pará e Espírito Santo.

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11

Desde 1995, o Brasil, se tomou um dos maiores produtores mundiais de mamão

papaia, sendo as cultivares Sunrise Solo, Improved Sunrise Solo Line 72/12 e Tainung

n01" as mais difundidas no país (MENDES et aI., 1996).

A variedade comercial é caracterizada por haste vigorosa com pequena distância

entrenós, que entra em floração de 3 a 6 meses após o plantio. São precoces, de porte

baixo e a maturação do fruto ocorre entre 5 e 6 meses após a floração, com ausência

de ramificação lateral. As variedades de maior interesse comercial estão descritas

abaixo.

O Sunrise Solo é procedente do Hawaí. São plantas precoces que fornecem

frutos periformes ou arredondados, pesando entre 400 e 600 g. Tem polpa laranja

avermelhada de excelente sabor, indicada para consumo in natura. A produção média é

de até 37 toneladas por hectare por ano (Uha/ano).

O Tainung nO 1 é um híbrido (mamão da Costa Rica X Sunrise Solo), altamente

produtivo. Os frutos são redondos ou alongados com polpa laranja-avermelhada, de

ótimo sabor, com produtividade média de 60 Uha/ano.

O Improved Sunrise Solo CV. 72112 é precoce (8 meses pós plantio), com

produtividade menor que a do Sunrise Solo. Produz frutos com formato periforme a

ovalado, pesando em média 450 g, com polpa vermelho-alaranjada.

O Formosa é um híbrido de origem chinesa com frutos pesando entre 0,8 a 2,5

kg. A polpa é amarela ou avermelhada, com produção acima de 70 Uha/ano.

O Estado do Espírito Santo, principalmente a região litorânea, é considerado o

principal produtor e exportador de mamão do grupo Solo do país, ocupando uma

posição de destaque no mercado interno e externo, pois além de utilizar as melhores

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12

variedades, investiu muito no melhoramento genético e na propagação das plantas,

além de ser uma região privilegiada quanto às exigências edafoclimáticas da cultura

(MENDES et aI., 1996).

1.4 Metabolismo das plantas

As plantas são organismos fotoautotróficos, ou seja, obtém energia livre através

da fotossíntese, processo no qual a energia luminosa transfere elétrons para o C02,

produzindo carboidratos, que posteriormente serão oxidados para liberarem a energia

livre. O metabolismo é um processo por meio do qual os sistemas vivos adquirem e

usam energia livre para realizarem suas funções, sendo tradicionalmente dividido em

catabolismo (ou degradação de nutrientes e constituintes celulares) e anabolismo

(síntese de compostos a partir de substâncias mais simples) (VOET et aI., 2000).

O processo de geração de compostos pelas plantas tem sido separado

arbitrariamente em dois metabolismos: o primário e o secundário (VICKERY & VIKERY,

1981). Os compostos produzidos pelo metabolismo primário são encontrados em toda

parte da planta e são essenciais no desenvolvimento e crescimento das mesmas. Estas

substâncias são produzidas através dos processos fotossintéticos e respiratório, sendo

representadas pelos carboidratos, proteínas, nucleotídeos, aminoácidos, lipídeos e

ácidos orgânicos (BUCHANAN et aI., 2000).

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13

o metabolismo secundário é formado através da transformação de substâncias

precursoras do metabolismo primário. Ao contrário do que relatava a literatura em 1981,

hoje se sabe que o metabolismo secundário é tão essencial à planta quanto o primário,

pois os hormônios vegetais (fitohormônios) e as vitaminas (VICKERY & VIKERY, 1981;

BRUNETON, 1999; BUCHANAN et aI., 2000), são produzidos pelas vias alternativas

dos metabólitos secundários. Há muito tempo se sabe que os fitohormônios (etileno,

auxinas, giberelinas, citocininas, ácido abscísico, jasmonatos, etc.) são os metabólitos

responsáveis pela sinalização do desenvolvimento e crescimento de todas as plantas.

São eles que irão sinalizar as células vegetais na diferenciação dos tecidos, assim

como a formação da raiz e da parte aérea (DAVI ES, 1995).

Além dos fatores de crescimento, o metabolismo secundário é reconhecido pela

síntese de uma diversidade de compostos de baixo peso molecular denominados

fitoquímicos, que apesar de não participarem de forma direta do crescimento e

desenvolvimento da planta, são muito importantes, pois protegem as plantas no seu

habitat natural. Os fitoquímicos são reconhecidos como substâncias de defesa contra

pragas e agentes patogênicos, estimulando a atração de insetos ligados à polinização e

atuando como agentes antioxidantes, substâncias protetoras de raios UV. Além disso

atuam na produção de aleloquímicos, que são substâncias liberadas pela planta que

inibem o crescimento de outras, fenômeno conhecido como alelopatia (VICKERY &

VIKERY, 1981 BRUNETON, 1999; BUCHANAN et aI., 2000).

Os fitoquímicos estão diferentemente distribuídos no reino vegetal em apenas

alguns grupos taxonômicos e apesar da descoberta da função de muitos destes

compostos, não se sabe ainda a função de vários dos metabólitos secundários

produzido pelas plantas (BUCHANAN et aI., 2000).

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14

Uma das principais funções do metabolismo secundário é o papel que ele

desenvolve no sistema de defesa das plantas. Na década de 40, foram estudadas

algumas cultivares de batata que eram atacadas pelo fungo da requeima. Os resultados

mostraram que em plantas resistentes havia um acúmulo de substâncias que inibiam o

crescimento do fungo, o que não ocorria com cultivares susceptíveis à doença

(MÜLLER & BÓRGER, 1940). Essas substâncias foram denominadas de fitoalexinas

(do grego phyton =planta e alexin =composto que repele) e sua descoberta causou

profundas mudanças no conceito de resistência de plantas a patógenos.

Diversas classes de produtos naturais como alcalóides, compostos fenólicos,

flavonóides, glicosinolatos, têm sido descritas como fitoalexinas (MIKKELSEN et aI.,

2003). Essas substâncias têm sido utilizadas como marcadores químicos, permitindo

traçar laços de parentesco entre as espécies vegetais, pois algumas plantas têm como

característica a produção de certas fitoalexinas (HARBORNE, 1999). Acredita-se que a

maioria das plantas são capazes de sintetizar estes compostos, mas alguns vegetais o

fazem de maneira muito lenta, permitindo que o microorganismo complete a infecção

antes do acúmulo da substância em quantidades efetivas para a inibição (BUCHANAN

et aI., 2000). Foi demonstrado que a velocidade de acúmulo das fitoalexinas é um dos

fatores decisivos para o estabelecimento ou não da infecção, a partir de vários estudos

de interações planta-patógeno (BUCHANAN et aI., 2000).

A família Caricaceae, da qual o mamão é um dos representantes, tem como

característica a produção de quantidades expressivas de benzilglicosinolato, metabólito

secundário de defesa ligado à planta. Baseados em um precedente do Hawaí há alguns

anos os produtores de mamão de uma região do Espírito Santo obtiveram liberação do

tratamento fitossanitário para exportar os frutos para. os Estados Unidos, com a

,'I

!;.1

15

argumentação de que os níveis de infestação por mosca das frutas nos pomares de

mamão estariam diretamente relacionados aos estádios de maturação do fruto e à

concentração de glicosinolatos presente no látex (SEO et aI., 1982; SEO et aI., 1983). O

raciocínio seria que monitorando o estádio de maturação, através da carta de cores

(SEO et aI., 1983), poder-se-ia garantir que o glicosinolato presente seria suficiente

para evitar a infestação do fruto, tomando desnecessário o tratamento térmico.

Um resumo do metabolismo primário e secundário das plantas está apresentado

na Figura 4.

16

- Proteínas- Ácidosnucleicos

~

Via do ácidochiquímico

Ir

AminoácidosAromáticos

EritrosÍ!

-6PglicóliseI Carboidratos 1"1 I

i

ácido pirúvico

Fotossíntese(Ciclo de Calvin

'C02

+H20 •

,I,

Ciclo dq ácidotricarbdlxílico

Ir

AminoácidosAlifáticos

... ... ,I,SubstânciasFenólicas

wI Esteróis I

Metabólitos

Secundários

Nitrogenados

Exemplos:

./ Glicosinolatos

./ Alcalóides

./ Betaínas, etc

•Metabólitos

Secundários

Nitrogenados

Exemplos:

./ Glicosinolatos

./ Alcalóides

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••

,I,ProteínasÁcidosnucleicos

Figura 4: Adaptação de vias metabólicas primária e secundária das plantas

(VICKERY & VICKERY, 1981; DEY & HARBORNE, 1977)

-- -- --- ----

17

1.5 Glicosinolatos

Os glicosinolatos são N-hidrossulfatos de J3-tioglicosídeos, constituindo uma

família de compostos, com mais de 110 estruturas identificadas. São encontrados em

diversos órgãos e em diferentes estádios de desenvolvimento da planta (CHEN &

ANDRÉASSON 2001). São sintetizados no citoplasma e acumulados dentro dos

vacúolos das células vegetais, podendo ser translocados através do floema, desde a

parte aérea até o sistema radicular (BRUDENELL et aI., 1999, CHEN & ANDRÉASSON,

2001). Foi demonstrado, por técnicas de imunocitoquímica, que a sinigrina, um

glicosinolato alifático, além de localizado no vacúolo, estavam ligados a células de

aleurona (ANDRÉASSON et aI., 2001). Em Arabidopsis thaliana os glicosinolatos foram

encontrados também em regiões denominadas como células-S, ou amido da bainha

(KOROLEVA et aI., 2000). As células-S são células gigantes, portadoras de substâncias

de reserva enriquecidas com enxofre que estão localizadas entre a linha do f10ema e a

endoderme, do lado externo do sistema vascular (KOROLEVA et aI., 2000;

ANDRÉASSON et aI., 2001).

Os compostos sulfurosos, os glicosinolatos, ocorrem predominantemente na

ordem Capparales, na família das Crucíferas, principalmente em brássicas e estão

presentes quase que exclusivamente nas plantas dicotiledôneas. Eles são responsáveis

pelo aroma característico e pelo sabor "pungente" de muitas plantas consumidas "in

natura", como rabanete, nabo, mostarda, couve, repolho, brócolis (Crucíferas), alho,

cebola (Liliaceas), entre outras.

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18

Os glicosinolatos são substâncias oriundas do metabolismo do nitrogênio e têm

uma grande importância do ponto de vista agronômico, devido ao seu papel protetor no

sistema geral de defesa das plantas. A literatura descreve vários casos em que os

produtos de hidrólise dos glicosinolatos tiveram ação bactericida, fungicida, inseticida e

nematicida, tanto nos solos como nas plantas (CHEN & ANDRÉASSON, 2001; BROWN

et aI., 1994)

No caso do mecanismo de defesa contra os insetos generalistas, verificou-se

que estes insetos possuem células quimioreceptoras responsáveis pela atração dos

mesmos para as plantas produtoras de glicosinolatos, levando-os a morte. Em insetos

especialistas, assim como os que atacam a couve e o nabo, observou-se que através

dos seus diferentes quimioreceptores, havia resposta a diferentes tipos de

glicosinolatos que eram responsáveis pela dos mesmos (ROESSING et aI., 1994;

SIMMONDS et aI., 1995; REYMOND et aI., 2004).

Os glicosinolatos podem agir também no sentido contrário à defesa, ou seja,

estimular a ovoposição de certos insetos, como é o caso do glicosinolato indólico: -

glucobrassicina. Além disso, alguns dípteros já foram modificados para adaptar-se a

certos tipos de glicosinolatos, como é o caso da sinigrina, sugerindo a coevolução deste

sistema com os insetos (RASK et aI. 2000).

Além dos benefícios para a agricultura, há muitas pesquisas na área destes

fitoquímicos com relação à prevenção de doenças em seres humanos, principalmente

às relacionadas com o câncer (FENWICK et aI., 1983), introduzindo esses compostos

na área dos alimentos funcionais. Entretanto, alguns estudos mostram que com o alto

consumo dos vegetais e frutas produtores de glicosinolatos por pessoas que

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faculdade de CiênCIas Farmacêullcas

Universidade de São Paulo

19

apresentam predisposição ao câncer de bexiga, podem ter a situação agravada

(HIROSE et al., 1998).

Como conseqüência da ampla atividade biológica, o estudo das famílias de

compostos que contenham estas fitoalexinas tem sido abordada em diversas áreas,

incluindo a entomologia, fitopatologia, nutrição de plantas, química, nutrição humana,

genética e também na medicina.

Além das possibilidades já mencionadas, a síntese de glicosinolatos constitui

uma das mais rápidas respostas metabólicas das plantas. A análise da produção

dessas substâncias de defesa representa uma oportunidade única de estudar eventos

metabólicos e novas rotas de biossíntese de produtos naturais e de compreender como

os vegetais resistem ao ataque de microrganismos causadores de doenças e

sobrevivem em um ambiente altamente competitivo. Além disso, surgem as

oportunidades de se obter vários modelos estruturais, assim como a síntese de

pesticidas naturais, elementos anti-carcinogênicos, alimentos funcionais, entre outros.

1.5.1 Benzilglicosinolatos

A família Caricaceae é a única na ordem Violales que produz glicosinolatos,

especialmente o benzilglicosinolato que é típico da ordem Capparales. No caso do

mamão papaia (Carica papaya) há também a ocorrência de glicosídeos cianogênicos e

fenilpropanóides, entretanto em quantidades bem menos expressivas (RODMAN, 1981;

BENNETT et aI., 1997; FAHEY et aI., 2001).

Atualmente, muitos estudos têm focalizado o benzilglicosinolato e seu produto de

hidrólise, o benzilisotiocianato (BITC), principalmente devido a sua ação contra mosca

- -~~ - --

20

das frutas em papaia (SEO et aI., 1982; SEO et aI., 1983), lagarta das folhas e traças

das crucíferas em mostarda (LI et aI., 2000), ovos de pragas em mudas de videira

(BOREK et aI., 1998), fungicida natural contra Alternaria alternata em tomate (ROJAS-

TRONCOSO et aI., 200S).

o modo de ação dos isotiocianatos ocorre através da reação com compostos

nucleofílicos (espécies ricas em elétrons), uma vez que são substâncias eletrofílicas de

caráter polar. Os isotiocianatos são capazes de reagir e formar ligações covalentes com

os grupamentos -SH, -NH2 e -OH das enzimas e outras macromoléculas

biológicamente importantes. Estas interações podem causar sérios danos bioquímicos,

sendo que altas concentrações de isotiocianatos são suficientes para levar o organismo

alvo à morte (BORECK et aI., 1998).

Outros estudos mostram que concentrações adequadas de isotiocianatos, assim

como o BITC, podem agir no sistema de prevenção do câncer em mamíferos. O BITC

isolado de papaia foi um potente indutor das enzimas GST (glutationa S-transferase),

responsáveis pela detoxificação de elementos carcinogênicos (NAKAMURA et aI.,

2000; MORIMITSU et aI., 2000). Outros estudos reforçam que o BITC é um potente e

seletivo inibidor de carcinogênese, atribuindo esse efeito às modificações favoráveis

nas enzimas envolvidas no metabolismo de carcinogênicos (GOOSEN et aI., 2000).

Observações feitas com os subprodutos de glicosinolatos, o feniletilisotiocianato (PEIT)

e BITC mostraram que em baixas concentrações (~ 10 I!M) houve indução da apoptose

de células tumorais e que concentrações mais altas destas substâncias (2SI!M)

necrosaram estas células (KUANG & CHEN, 2004). Além da sua atividade

anticancerígena, o BITC, extraído e purificado a partir de sementes de papaia,

11'

- -- -----~ --- ---o

21

apresentou atividade anti-helmíntica nos mamíferos (Ascaris lumbricoides e

Carenorhabdifis elegans), segundo estudos realizados por KERMANSHAI et aI. (2001).

Estas sementes vêm sendo utilizadas há séculos como vermífugo na índia (LAL et aI.,

1976).

r"

1.5.2 Fatores que influem na composição dos glicosinolatos em

plantas

1.5.2.1 Genéticos

o perfil de benzilglicosinolatos depende da espécie em estudo. As plantas que

sintetizam estes compostos têm características que são peculiares a cada uma das

famílias envolvidas. O genótipo para a produção de glicosinolatos é segregado

independentemente de outros, sendo que esta característica permite que sejam

utilizados como marcadores genéticos, diferenciando, portanto, as famílias que

produzem estes metabólitos entre elas mesmas e também de plantas não produtoras

de glicosinolatos (KLlEBENSTEIN et aI., 2001).

A variabilidade genética ocorre principalmente no instante da modificação e

extensão da cadeia lateral dos aminoácidos precursores. Estudos conduzidos em li

Arabidopsis fhaliana mostraram que em relação à variabilidade estrutural dos

glicosinolatos, aqueles derivados de metionina são os que sofrem maiores modificações

(CHEN et aI., 2001) o que pode ser explicado por vários polimorfismos gênicos

(KLlEBENSTEIN et aI., 2001). Nas folhas, a regulação da composição e concentração

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J;,!

~ -- -- -----=- -~ --

--"--~ - - -.........-- "- --

22

dos glicosinolatos alifáticos (derivados de metionina) parece estar localizada

basicamente em quatro loei gênicos, denominados GS-enlong que controla a produção

de glicosinolatos com três ou quatro carbonos na cadeia lateral: o GS-Alk, responsável

pela produção do alquenil glicosinolato; o GS-OHP, que catalisa a produção do

glicosinolato 3-hidroxipropil e finalmente o GS-OH, que controla a produção do

glicosinolato 2-hidroxi-3-butenil (progoitrina e epiprogoitrina que tem propriedades

antinutricionais) (KLlEBENSTEIN et aI., 2001).

As recentes identificações dos genes envolvidos no prolongamento e

modificação da cadeia lateral em A. thaliana fornecem uma oportunidade para a sua

modificação em outras espécies com o objetivo de aumentar a diversidade química,

ampliando o conhecimento das vias metabólicas para uma eventual manipulação

genética destas espécies (CHEN & ANDRÉASSON, 2001). Através da manipulação

genética dos glicosinolatos, um perfil mais adequado destes compostos pode ser usado

para determinados fins, como a otimização do "f1avour". Por exemplo, poderiam ser

utilizadas técnicas de superexpressão do gene para aumentar quantitativamente os

glicosinolatos e seus subprodutos de hidrólise, com a finalidade de se obter maior

resistência a pragas e doenças e ampliar a diversidade de propriedades nutracêuticas

para os mamíferos. No sentido contrário, seria o silenciamento destes genes,

principalmente no caso de vegetais e/ou frutos, que produzem altas quantidades de

determinados tipos de glicosinolatos com propriedades antinutricionais (substâncias

que se complexam com elementos, ou enzimas, importantes a saúde), ou que sejam

tóxicos para o consumo.

-~-~---------------- ~-=----

23

1.5.2.2 Ambientais

Fatores como luz, temperatura, disponibilidade de água, fotoperíodo e nutrição

do solo influenciam na síntese e degradação dos glicosinolatos (HASEGAWA et aI.,

2000, VISVALlNGAM et aI., 1998; BLAKE-KALFF et aI., 1998). Foi observado que o

nível de expressão e a atividade da mirosinase em mostarda branca (Sinapis alba) ,

foram moduladas através dos níveis de micronutrientes no solo (ferro, cobre, zinco e

manganês) e de um macronutriente, o enxofre. A remoção destes nutrientes suprimiu a

atividade e expressão dessas enzimas (VISVALlNGAM et aI., 1998). Além dos fatores

ambientais e injúrias mecânicas, as doenças e pragas podem aumentar sensivelmente

o teor de glicosinolatos nas plantas. Em nabo, a injúria mecânica e o ataque de insetos

induzem a biossíntese de glicosinolatos indólicos e diminuem a dos glicosinolatos

alifáticos (ROSA et aI., 1997).

1.5.2.3 Processamento

A lavagem de vegetais anterior ao consumo pode causar a ruptura de algumas

células, particularmente em folhas novas, o que desencadeia a degradação dos

glicosinolatos. O corte, a cocção, o branqueamento, a secagem e o congelamento

podem influenciar também no mecanismo de degradação dos glicosinolatos, alterando

a composição, sabor e aroma dos alimentos. A cocção e o branqueamento nas

brássicas reduzem significativamente o nível de glicosinolatos devido à clivagem

térmica e enzimática destes compostos. O congelamento a -18 DC elimina a produção

-._- - -- -_.~-_._-~-~

24

de odores indesejáveis, mas altera as características originais do produto (ROSA et aI.,

1997)

1.5.3 Biossíntese dos glicosinolatos em geral

Vários genes ligados à via de biossíntese dos glicosinolatos têm sido

identificados (WITTSTOCK & HALKIER 2004). Estudos da biossíntese in vivo mostram

que o N-hidroxiaminoácidos, aldoximas, tiohidroximatos e desulfoglicosinolatos são

precursores dos glicosinolatos (HALKIER, 1999). Os glicosinolatos em geral são

derivados basicamente de sete aminoácidos: alanina, leucina, isoleucina, valina,

fenilalanina, tirosina e triptofano e, especificamente, o benzilglicosinolato é derivado da

fenilalanina e da tirosina (HALKIER, 1999; DU et aI., 1995; DU et aI., 1997; BENNET et

aI., 1997 CHEN & ANDRÉASSON, 2001). Baseados nas estruturas dos diferentes

aminoácidos precursores, esses compostos podem ser agrupados em três diferentes

classes: os glicosinolatos alifáticos, os aromáticos e os indólicoso A maioria dos

glicosinolatos possui cadeias alifáticas que, após a hidrólise, formam isotiocianatos em

pHs que variam de 5 a 70 Nesta mesma faixa de pH, os glicosinolatos aromáticos em

geral, também produzem isotiocianatos hidroxialquílicos que possuem alta instabilidade

e sofrem ciclizaçãoo Quando a cadeia lateral é um grupo alquenila, formam-se nitrilas

heterocíclicas, enquanto uma alila ou benzila produz tiocianatos. Já os glicosinolatos

indólicos geram, via um isotiocianato instável, o correspondente indol-3-carbinol e o íon

tiocianato. Exemplos destes tipos de glicosinolatos podem ser visualizados na Figura 5.

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CH3I .O

. N -0- SOj glicosinolato indólico

/",,11 "I I" . I t )/ ."\ CH2 -C (4-metoxi-3-indolilmetl 9 ICOSlno a o .

I I I Formação do AIA (ácido indol acético)

g. .. S-Gluc...... N. .

OH

O···..

Hü .... . . .. S glicosinolato aromático

OH . - 2· ...J .. _'I G

OS03Figura 5: Exemplos de glicosinolatos indólicos, aromáticos e alifáticos

----------~ --------- ---- ------- _----:=- - - - ~._-~ --~----

26

A biossíntese é iniciada pela N-hidroxilação de aminoácidos precursores

proteicos ou não protéicos (OEY & HARBORNE, 1997) e pelo prolongamento da cadeia

destes aminoácidos para aldoximas. O estudo em microssomas isolado de Sinapis alba

L. (mostarda branca), Tropaeolum majus L. (agrião do méxico) e Carica papaya L.,

mostrou que os aminoácidos precursores, tirosina e fenilalanina, são convertidos a

correspondente aldoxima pelo complexo citocromo P450-monooxigenase, na iniciação

da biossíntese do benzilglicosinolato (HALKIER, 1999; OU et aI., 1995; OU et aI., 1997;

BENNET et aI., 1997 CHEN & ANORÉASSON, 2001). No caso do benzilglicosinolato,

somente uma das enzimas do citocromo é atuante, a monooxigenase (CHEN &

ANORÉASSON, 2001). Em outros modelos, o citocromo pode ser dependente também

de f1avina contendo monooxigenase e de peroxidases ligadas à membrana plasmática

(CHEN & ANORÉASSON, 2001). A natureza das enzimas que catalisam a conversão

dos aminoácidos tem sido objeto de muitos estudos. A CYP79A2 foi a primeira enzima

encontrada no processo de catálise da conversão do aminoácido para a aldoxima na

biossíntese dos glicosinolatos. A caracterização da proteína recombinante da CYP79A2

mostrou que ela é uma N-hidroxilase com a função de converter a L-fenilalanina em

fenilacetaldoxima, o precursor do benzilglicosinolato. A enzima CYP79A2 apresentou

um Km de 6.7IlmoI.L-1 com alta afinidade pelo substrato L-fenilalanina (WITTSTOCK &

HALKIER, 2000). Ensaios com plantas de A. thaliana modificadas para a

superexpressão da CYP79A2, mostraram altos níveis de acúmulo de benzilglicosinolato

(WITTSTOCK & HALKIER, 2000).

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27

As enzimas doadoras de enxofre para a aldoxima, as glutationa S- transferases

(GST), não foram ainda bem caracterizadas, mas experimentos com animais mostram

que a cisteína seria a maior responsável pela doação de enxofre nesta etapa (MATSU,

1968, In: WITISTOCK & HAlKIER, 2000).

As enzimas que catalizam as duas próximas etapas da via de biossíntese dos

glicosinolatos são a tiohidroximato glicosiltransferase (S-GT), que transfere uma

molécula de glicose para o ácido tiohidroxímico, a partir da uridinadifosfato glicose

(UDPG) e a desulfoglicosinolato sulfotransferase, que tem a função de transferir o

grupamento sulfato, a partir do doador ativo de sulfato: 3'- fosfoadenosina 5'-

fosfosulfato (PAPS), formando a estrutura geral dos glicosinolatos (DEY & HARBORNE,

1997). Estas duas enzimas foram purificadas e parecem não ser tão específicas quanto

as enzimas da primeira etapa, as responsáveis pela primeira conversão dos

aminoácidos (WITISTOCK & HAlKIER, 2000; GUO & POUlTON, 1994).

A via de biossíntese dos glicosinolatos em geral, descrita na Figura 6, foi

resumida a partir de vias parciais sugeridas por DEY & HARBONE (1997), FAHEY et aI.

(2001), CHEN & ANDRÉASSON (2001) e WITISTOCK & HAlKIER (2002). Ela é

iniciada pela prolongação da cadeia de aminoácidos, seguida da descarboxilação

oxidativa para a correspondente aldoxima e conversão da oxima para uma estrutura

básica de glicosinolato. Na sequência ocorrem as modificações secundárias, assim

como oxidação, hidroxilação, metoxilação, desnaturação, sulfatação e glicosilação que

dão origem às diferentes classes desses compostos (HAlKIER, 1999; BENNETI et aI.,

1997; BAK et aI., 1998; FAHEY et aI., 2001).

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28

N-hidroxiaminoácido

P450CY79s

(entra 02 + NADPH) sai +H20 + NADP

COOtt I éOOM ~ t ..0 oHler. I o .+/J . . /.~ -. tt-e, ..J. R-CM:=~.... .~J>.\:; It-QI!!:, ~

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CisteÍDa

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4

Glutatio (GST)

S-Transferase

(~lC

'fI.. I~.····~~_-Clt '. *

"desulfoglicosinola o 'lt-t)io)

SulfotransferaseGlicosiltransferase

desulfoglicosinolato

iIt . . tiohid..ximalo 'V .....I ~.SII 'V] ~HÀ-Qf' ..I.$H H\" lIIl' - 11-.. ... ... I UDP4lt; •.tl;.;.;./ .,f\\ . ~~ I $ QtfI;:') '.1 Iló _ ...l .. H

~ ~~ ,M tiohidroxiamino Tiohi roximato M_Q»

(S-GT)Glicosinolato

Figura 6: Biossíntese dos glicosinolatos adaptada de DEY & HARBORNE (1977)

FAHEY et aI. (2001); CHEN & ANDRÉASSON (2001); WITTSTOCK & HALKIER (2002)

PAPS: fosfoadenosinafosfosulfatase: doadora do grupamento sulfato

UDP-Glc: uridinadifosfato-glicose

A via de biossíntese do benzilglicosinolato, mostrada na Figura 7, foi adaptada a

partir das vias descritas por WITTSTOCK & HALKIER (2000), WITISTOCK & HALKIER

(2002) e WITTSTOCK & HALKIER (2004).

~ --= '- -..-...=.=.-.--=--

30

1.5.4 Evolução da biossíntese dos glicosinolatos

Os glicosídeos cianogênicos são amplamente distribuídos dentro do reino

vegetal e estão presentes nas pteridófitas, gimnospermas e angiospermas, fazendo

parte também do organismo dos insetos, indicando que a ciànogênese surgiu como um

evento precoce (SAUPE, 1981). Até a década de 1980, as plantas eram classificadas

entre as que produziam glicosídeos cianogênicos e as que sintetizavam os

glicosinolatos. Atualmente, considera-se que as plantas produtoras de glicosinolatos

evoluíram a partir de espécies produtoras de glicosídeos cianogênicos, justamente por

conter em comum genes homólogos denominados como CYP79s (Figura 8). Estes

genes estão ligados ao complexo protéico caracterizado como sistema citocromo P450

dependente de monooxigenases, que estão envolvidos na biossíntese dos

glicosinolatos (BENNETI et aI., 1997). As CYP79s são responsáveis pela conversão do

aminoácido precursor às suas correspondentes aldoximas, portanto, para cada tipo de

aminoácido precursor parece haver uma aldoxima correspondente (WITISTOCK &

HALKIER,2000).

Alguns estudos mostram grandes avanços na descoberta dos genes da família

CYP79, como a superexpressão do gene CYP79A1 em Sorghum bic% r, que cataliza a

conversão da tirosina para a oxima correspondente (na biossíntese do glicosídeo

cianogênico), resultando na produção de altas quantidades de p

hidroxibenzilglicosinolatos (p-OHBG). A superexpressão dos genes CYP79A2 e

CYP79B2, em A. thaliana resultou na produção de altas quantidades de

benzilglicosinolatos e glicosinolatos indólicos, respectivamente (BAK et aI., 2000;

I~

----------------------------------------

31

MILKKELSEN et aI., 2000; WITTSTOCK et aI., 2000). Todos estes dados sustentam a

hipótese de que o sistema de formação da aldoxima pelo citocromo P450 em plantas

produtoras de glicosinolatos está ligado ao sistema de produção de glicosídio

cianogênico (Rask et aI., 2000).

A similaridade estrutural e a distribuição entre os glicosídios cianogênicos e

glicosinolatos, indicam que a biossintese de glicosinolatos provavelmente está

envolvida baseada na "predisposição cianogênica" dos vegetais (RODMAN et aI.,

1998). Pelos dados obtidos na literatura, o mamão parece ser uma planta intermediária

na evolução destas espécies produtoras de glicosinolatos, pois mantêm as duas vias de

biossíntese, o que poderia ser uma ferramenta interessante para o estudo de

taxonomistas (BENNET et aI., 1997; BAK et aI., 1998).

cianogênicos

OXIMAi CYP79S

Trp

VaI

Met ~prOlongaçãOPhe da cadeia '"~~----i

Figura 8: Via metabólica, comum às plantas produtoras de glicosinolatos e glicosídeos

cianogênicos baseados nos derivados da fam í1ia gência descrita como CYP79s (KVL-

Department of Plant Biology: www.plbio.kvl.dk).Met.Phe.Trp.I1e.Val. correspondem aos

aminoácidos, metionina, fenilalanina, triptofano, isoleucina e valina, respectivamente.

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32

1.6 Degradação dos glicosinolatos

A degradação dos glicosinolatos (Figura 9) ocorre através das mirosinases que

catalisam a hidrólise dos S-glicosídeos da estrutura intacta dos glicosinolatos em geral,

liberando um resíduo de D-glicose e um fragmento de aglicona, formando o sistema

descrito na literatura como sistema-glicosinolato-mirosinase.

A hidrólise dos glicosinolatos intactos pode ocorrer em todos os indivíduos que

possuem a mirosinase. Elas estão presentes em algumas famílias de plantas e também

fazem parte da flora intestinal dos seres humanos e de animais (CHEN et aI., 2004).

Nas plantas, a hidrólise geralmente ocorre quando as células são rompidas através de

injúrias produzidas por ataque de patógenos, insetos, danos mecânicos e herbivoria

(RASK et aI., 2000).

A degradação é uma etapa importante, porque é através dela que ocorre a

liberação dos compostos com atividade biológica, gerando uma variedade de produtos

cuja natureza química e função bioquímica é determinada pelos fatores como pH,

presença de cofatores e principalmente pela estrutura das cadeias laterais dos

glicosinolatos envolvidos.

Observações in vivo mostram que as agliconas, intermediárias na via de

degradação dos glicosinolatos, são muito instáveis e rearranjam-se rapidamente para

formar o tiocianato e o álcool correspondente, dando origem também aos grupamentos

sulfatos (ex. oxazolidina-2-tionas), epitionitrilas e nitrilas (Figura 9), em pHs que variam

de 2 a valores acima de 8. Já os isotiocianatos são formados em pH 8.0, as nitrilas em

pHs que variam de 2 a 5 e faixas de pH acima de 8.0 origina os tiocianatos (FAHEY et

aI., 2001, CHEN & ANDRÉASSON 2001; WITTSTOCK & HALKIER, 2002)

BIBLIOTECAFaculdade de CiênCIas Farmacê<Jtic3S

Universidade de São Pal:lo

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33

Doughty et al.(1996) ao estudar plântulas de Brassica rapa (nabo) com relação

ao fungo patogênico Alternaria brassicae, observaram que os glicosinolatos intactos

são praticamente inativos e que os seus catabólitos, produtos de hidrólise da

mirosinase, particularmente os isotiocianatos, é que são altamente ativos. Esses

isotiocianatos parecem atuar em diversos organismos, pois além das plantas eles são

inibidores de mitose e estimulam a apoptose em células tumorais humanas, in vitro e in

vivo (JOHNSON, 2002).

(2001) e CHEN & ANDRÉASSON (2001)

Figura 9: Degradação do glicosinolato pela mirosinase adaptada de FAHEY et aI.

----II.~R-S - C - N Tiocianato

pH= > 8

J:0-

4pH= 5-8

R-N=C-S lsoliocianato

pH= 2-5 R-C -N Nitrilas

R J~Ii

N"""OS03

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Ol(.li~jne- O -{.,'2-thlooe lI, .

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Glicosinolato

R" ;\':.Yr: "<0Gr..,~C ~- . ~II IlU.rosinase

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34

1.7 Mirosinases

As mirosinases (J3-tioglicosidases, tioglicosídeo glicohidrolases, EC 3.2.3.1), são

enzimas que catalisam a hidrólise dos glicosinolatos em geral. Elas estão incluídas na

família das o-J3-glicosidases encontradas em eucariotos e procariotos. O que diferencia

as mirosinases de uma glicosidase comum é um número de resíduos de aminoácidos

altamente conservados, responsáveis pelo mecanismo catalítico e que estão envolvidos

na ligação da glicose com a aglicona (BURMEISTER et aI., 1997; RASK et aI., 2000).

A maior parte das mirosinases são proteínas solúveis (CHEN & ANDRÉASSON,

2001), mas certos tipos de mirosinases podem estar complexadas com outras proteínas

que as tomam insolúveis, como ocorre em em B. napus (canola) (RASK et aI., 2000).

Essas enzimas são altamente glicosiladas, e dependendo do número de glicosilaçóes

são encontradas em diferentes isoformas (CHEN & ANDRÉASSON, 2001). Os

carboidratos da cadeia lateral da mirosinase são constituídos principalmente por fucose,

manose e N-acetilglicosamina, somando cerca de 10 a 20% da massa molecular da

subunidade total (BURMEISTER et aI., 1997; RASK et aI., 2000).

A atividade das J3-tioglicosidases parece se diferenciar de acordo com a espécie,

com a cultivar e com relação ao tipo de órgão da planta avaliado (RASK et aI., 2000),

sendo as afinidades mais altas encontradas nas sementes e em plântulas (BONES,

1990). As mirosinases apresentam atividade ótima em pH de 4 a 7. Foi avaliada a

afinidade destas enzimas, extraídas de L. sativum, por 29 diferentes substratos

(glicosídeos) e apenas quatro foram classificados como sendo bons substratos e em

ordem decrescente de maior afinidade: sinigrina, benzilglicosinolato, p-nitrofenil-J3-D-

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35

glicosídeo (PNPG), e o o-nitrofenil-f3-D-glicosídeo (DURBAM & POUlTON, 1990;

BOTTI et aI., 1995).

Várias isoenzimas de mirosinase têm sido identificadas, isoladas e purificadas a

partir das plantas Lepídíum satívum L. (DURBAM & POUlTON, 1990), mostarda branca

(ERIKSSON et aI., 2001) e folhas de nabo (JWANNY etal., 1994). Foram também

seqüenciadas em várias espécies de brássicas, principalmente Brassíca napus (FAlK

et aI., 1992; XUE & RASK, 1995b; FAlK & RASK, 1995; CHEN & ANDRÉASSON,

2001) e também em Arabídopsís thalíana (BAK et aI., 1998). Porém, com relação à

purificação e sequenciamento da mirosinase do mamão ou em qualquer outro fruto,

nada foi descrito até o momento. As diferentes isoenzimas têm sido detectadas nos

diferentes órgãos da planta através de técnicas de focalização isoelétrica, por atividade

em gel nativo (PHELAN, 1980; PIHAKASKI& PIHAKASKI, 1978) e também porwestem

blot (lENMAN et aI., 1993).

Em B. napus e S. alba, as proteínas de mirosinase são diméricas com massa

molecular variando entre 135 e 150 kDa. Análises dos clones de cDNA que codificam

mirosinases de S. Alba (XUE et aI., 1992), B. napus (FAlK et aI., 1992; FAlK & RASK,

1995) e A. thalíana (CHADSHAWAN et aI., 1993) mostraram que a massa molecular da

cadeia protéica em uma subunidade da mirosinase é de cerca de 59 kDa.

Com relação à distribuição gênica e localização das isoenzimas de mirosinases,

o isolamento de clones de cDNAs e clones genômicos têm possibilitado a obtenção de

diversos dados (CHADCHAWAN et aI., 1993; FAlK et aI., 1992; FAlK & RASK, 1995;

lENMAN et aI., 1993; THANGSTAD et aI., 1991; XUE et aI., 1992; XUE & RASK, 1995,

XUE et aI., 1995). As mirosinases de Brassíca napus e Sínapís alba, por exemplo, são

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36

codificadas por três famílias gênicas que foram subdivididas e nomeadas como gene da

família "MA" (ou Myr1), onde estão presentes 5 genes que foram identificados por

técnicas de Southern bloting e parece codificar mirosinases com subunidades de

75 kDa de massa molecular, a família "MB" (ou Myr2), com estimativa de 10 a 15 genes

que codificam proteínas de massa molecular com subunidade de 65 kDa e a última

delas foi denominada como família "MC", composta por 5 genes que codificam

isoenzimas de 70 kDa. Os dados obtidos com B. napus e S. alba, mostraram diferenças

claras nos tamanhos das subunidades e diferentes graus de glicosilaçóes e que

algumas isoenzimas aparecem conjugadas a outros tipos de proteínas (RASK et aI.,

2000).

o sistema de defesa contra insetos pode estar ligado somente a certos

transcritos de algumas isoformas de mirosinase, como sugerem os resultados obtidos

com Brassica napus (CHEN & ANDRÉASSON, 2001). A mirosinase, que possivelmente

atuaria contra insetos, parece fazer parte da família gênica MBP, que são mirosinases

do grupo MB associadas à outros tipos de proteínas com motivos esterase/lipase que

codificam J3-tioglicosidases, com subunidades aproximadamente de 65 kDa (CHEN &

ANDRÉASSON, 2001).

Quanto à localização das mirosinases nos tecidos, foi demonstrado que elas

estão presentes em células especializadas, denominadas de "células de mirosinas"

que, quando agrupadas, formam os grânulos de mirosina (THANGSTAD, et aI., 1991).

Estes grânulos estão localizados nas células parenquimatosas do floema em estruturas

denominadas de idioblastos (estruturas vegetais que têm função secretora de diferentes

tipos de substâncias) (HOGLUND et aI., 1991; ANDREASSON et aI., 2001). Além disso,

37

como demonstrado por imunolocalização, as f)-tioglicosidases estão presentes também

nas células guarda e nas células adjacentes, fazendo parte dos elementos de seiva.

Estes testes foram realizados no pedúnculo floral de Arabdopisis, região altamente

produtora de glicosinolatos. O conjunto de resultados obtidos confirma a hipótese de

que as mirosinases estão localizadas em compartimentos separados dos glicosinolatos

e sugere que o transporte das mirosinases ocorre via plasmodesmos através das

células adjacentes (HUSEBYE et aI., 2002).

1.8 Sistema glicosinolato - mirosinase no mamão

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O mamão é o único fruto, identificado até o momento, que apresenta como

característica genética a produção de glicosinolatos, especificamente o

benzilglicosinolato, substrato para a mirosinase na produção do BITC. Em 1970, Tang

demonstrou que o B/TC tinha ação fungicida contra um dos principais fungos do

mamoeiro, o P. parasitica, sendo mais eficaz que a papaína, substância utilizada na

época para controle natural (TANG, 1970). Foi demonstrado que a concentração do

BITC era mais alta em frutos verdes, que nos maduros, e em tecido macerado ou

injuriado, sugerindo, que a enzima e o substrato poderiam estar em compartimentos

diferentes (PATIL E TANG, 1974; SEO et aI., 1983).

A concentração de BITC foi determinada em vários órgãos vegetativos da planta

de Canca papaya, tais como folhas, internódios caulinares e raízes. As folhas e os

tecidos jovens foram os locais de maior acúmulo de BITC (30-35 J..lM) com

concentrações decrescentes no estádio maturo e senescente (BENNETT et aI., 1997).

38

Os valores mais altos de BITC foram encontrados nas sementes (141,7 - 342,7 ppm) e

quantidades bem menores no pericarpo (23,3 - 45,1 ppm), na polpa (21,2 - 43,1 ppm) e

no látex (15,2 - 19,8 ppm), dependendo da variedade do mamão (SHEU E SHYU 1996).

Existem várias evidências que contribuem para a hipótese de que os

glicosinolatos são altamente eficazes contra agentes patogênicos (CHEN &

ANDRÉASSON, 2001). Além de inibir a ovoposição de larva de mosca das frutas, o

BITC encontrado nos vasos lactíferos do mamão parece agir como regulador endógeno

da produção de etileno (PATIL & TANG, 1974). Esta hipótese foi baseada em dados em

que a produção de etileno foi inibida no mamão, quando infiltrados com BITC (0,046

mM). Consequentemente, dependendo do nível de BITC presente no fruto, o

amadurecimento poderia ser retardado, através da inibição pelo etileno (PATIL &

TANG, 1974).

Não se sabe muito sobre o mecanismo de defesa no mamão, principalmente

com relação as mirosinases e com relação aos níveis de substrato (glicosinolatos) e

produtos (BITC) disponibilizados pela enzima no decorrer do desenvolvimento e

amadurecimento do fruto. Também não se sabe quais os níveis destas substâncias que

seriam suficientes para agir contra cada tipo de patógeno e/ou pragas, já que cada

espécie destes indivíduos parece ser capaz de reagir de maneira diferente ao substrato

e a disponibilização do composto ativo (BORECK et aI., 1998; LI et aI., 2000). A

disponibilização de substâncias tóxicas através do metabolismo secundário constitui

uma das mais rápidas respostas metabólicas na defesa das plantas (DEY &

HARBORNE, 1997). A produção destas substâncias na planta parece ser tão elevada

que há necessidade de um outro sistema de reparo que promova a detoxificação destas

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39

células, para que as mesmas não se autodestruam (MARRS et aI., 1996 DERRIDER et

al.,2002).

A análise da produção das substâncias de defesa representa uma oportunidade

única de estudar eventos metabólicos e novas rotas de biossíntese de produtos

naturais, e de compreender como os vegetais resistem ao ataque de uma ampla

variedade de pragas e microorganismos patogênicos, resistindo em ambientes

altamente competitivos. Além destes fatores, surge a oportunidade de se obter vários

modelos estruturais, assim como a síntese de defensivos naturais, controle biológico de

pragas, elementos anticarcinogênicos e alimentos funcionais.

2. OBJETIVOS

Este trabalho teve como objetivo verificar a relação entre benzilglicosinolatos,

mirosinase e benzilisotiocianato durante o desenvolvimento e amadurecimento do

mamão do mamão papaia (Carica papaya L., varo Sunrise solo) e a influência do etileno

e do 1-MCP sobre este sistema.

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40

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

Para a obtenção da primeira amostragem foram utilizados mamões (var. Sunrise

Solo) adquiridos na Central de Abastecimento de São Paulo (CEASA-SP), com cerca

de 4 dias pós-colheita (dpc). Foram classificados como verdes os mamões que

apresentaram casca verde, ausência de estrias amarelas (estádio 1 do System

Approach), sementes pretas e brancas e textura firme (30,16 ± 1,Oa N). Os maduros

foram classificados por apresentar de duas a três estrias amarelas na casca (estádio 2

do System Approach), sementes pretas e textura macia (3,49 ± 0.55 N). Em cada um

dos dois estádios, a polpa foi separada da semente e da casca e dividida em 3 regiões

diferentes: P1 (polpa da região apical do fruto); P2 (polpa da região mediana do fruto);

P3 (polpa próxima ao pedúnculo) que foram congeladas em nitrogênio líquido e

armazenadas em ultrafreezer a - ao°c .

Além disso, foi feita uma segunda amostragem com frutos da variedade Sunrise

Solo, em diferentes fases do desenvolvimento, adquiridos da empresa exportadora de

mamão a "Agrapapaya" na região de Unhares (ES). Esta região apresenta

temperaturas máximas entre 30°C e 32°C e mínimas entre 15°C e 1aoC, com

precipitação média anual em tomo de 1200 mm. Os frutos foram colhidos com 30, 60,

90, 120 e 150 dias pós-antese (dpa), sendo que o ponto de colheita comercial é

geralmente realizado aos 150 dpa (Figura 10). Os frutos vieram acondicionados em

caminhões refrigerados, chegando a São Paulo com um dia pós-colheita.

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41

As amostras de cada estádio foram separadas em casca, polpa e semente

sendo posteriormente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a - SO°C. Os

frutos com 150 dpa foram separados e armazenados em câmaras tipo 8.0.0 a 20°C

para acompanhar o amadurecimento, que foi monitorado através dos teores de C02 e

etileno. Durante o amadurecimento, três frutos foram separados, armazenados em

frascos de 1L durante 1 hora e o gás coletado com a seringa Gas Tight e injetado em

cromatógrafo a gás. Do restante dos frutos (150 dpa), foram coletados batoques que

consistiram de cilindros transversais de tecidos, retirados da porção equatorial do fruto

(5 cm de diâmetro), com o auxílio de um furador de rolhas esterelizado. Os batoques,

foram coletados durante todo o período de amadurecimento, congelados em nitrogênio

líquido e armazenados a - 80°C.

Uma terceira amostragem foi feita com mamões da mesma empresa e da

mesma variedade com 150 dpa (ponto de colheita). O amadurecimento foi

acompanhado através da respiração e produção de etileno e os frutos foram

submetidos a dois tipos de tratamento: (1) tratados com 100 ppm de etileno, durante 12

horas em câmara 8.0.0. e (2) tratados com 100 ppb de metilciclopropeno (1-MCP), um

potente inibidor da ação do etileno, nas mesmas condições. Os frutos controle foram

armazenados nas mesmas condições dos tratados. As amostras dos três grupos foram

coletadas e congeladas em nitrogênio líquido, diariamente, até o seu completo

amadurecimento, sendo em seguida, armazenados em ultrafreezer a - SO°C.

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43

3.2.2 Determinação de Etileno e C02

o etileno e o C02 foram analisados por cromatografia gasosa (CG) e detectados

por ionização de chama (FIO) e condutividade térmica (TCO), respectivamente. Foi

utilizada uma coluna HP-PLOT, com as seguintes características: 30 m de

comprimento, espessura do filme de 40.0 mm e diâmetro interno de 0.53 mm. A injeção

do gás foi manual usando a seringa GAS Tígth, própria para injeção de gases. O gás de

arraste utilizado foi o hélio.

Condições de trabalho para o etileno:

• Temperatura isotérmica (fomo): 30°C

• Temperatura do injetor 200°C, detector: 250°C

• Fluxo: 1 mLlmin

• Modo de injeção: pulsed split, Taxa: 12,5: 1

• Volume de injeção: 5 mL

Condições de trabalho para o CO2 :

• Temperatura isotérmica (fomo): 30°C

• Temperatura do injetor e do detector: 250°C

• Fluxo: 4 mLlmin

• Modo de injeção: split, Taxa de split: 50: 1

• Volume de injeção: 1 mL

----------

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I.',

--------------------------:-::-:----- - '----=.:"

44

3.2.3 Análise do benzilglicosinolato em mamão por HPLC

o benzilglicosinolato foi isolado por HPLC (1100 da Hewlett - Packard) acoplado

a um injetor automático. O composto foi detectado com o auxílio de um detector de

arranjo de diodos (PDA) e monitorado na região do UV. A coluna utilizada foi a de

fase reversa, Luna C18(2) (250 x 4.6 mm, 5 J1.m) da Phenomenex, acoplada a uma

pré-coluna "Securityguard" também da Phenomenex. O método de análise foi o de

KIDLE et aI. (2001), com modificações.

3.2.3.1 Extração do benzilglicosinolato intacto

Cerca de 125 mg de casca, polpa e semente, nos estádios, 30, 60, 90, 120 e 150

dpa, previamente pulverizadas em nitrogênio líquido, foram homogeneizados em 1

mL de MeOH 70% + 0,1% de TFA com 50 J1.1 de sinigrina 12 mM (padrão interno) em

tubos de microcentrífuga com tampa de rosca. Os homogenatos foram agitados por

ZO minutos a 70°C. Logo após o resfriamento, foram centrifugados a 13000 rpm

(4°C) durante 10 minutos e filtradas em filtros Millex™ da Millipore (0.45 J1.m). A

sinigrina foi utilizada como padrão interno para teste de recuperação do composto na

amostra (50 J1.1 de sinigrina 12 mM em 1 ml de MeOH 70% + 0,1% de TFA).

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45

3.2.3.2 Condições utilizadas para análise de benzilglicosinolato no HPLC

Foi feito um gradiente de concentração da fase móvel, que era composta pelo

solvente A: 0.1 % (vlv) de TFA (ácido trifluoracético) em água e pelo solvente B:

0.1 %(vlv) de TFA em MeOH (tabela 1). No método cromatográfico, foi realizada uma

varredura de 200 a 400 nm e a detecção feita a 228 nm. O fluxo de passagem da

fase móvel foi de 1,0 mL.min-1, com pressão máxima de 300 bar. O volume injetado

foi de 20 IlL e a temperatura da coluna de 25 oCo Nestas condições de trabalho, o

tempo de retenção da sinigrina foi de aproximadamente 7 minutos e o do

benzilglicosinolato entre 19 e 20 minutos. O tempo de corrida para cada análise foi

de 55 minutos acrescido de 10 minutos para limpeza e reequilíbrio da coluna.

O padrão de benzilglicosinolato, utilizado na curva de calibração, foi cedido pelo

pesquisador Richard Bennett, do Institute of Food Research (UK). O padrão injetado

no HPLC nas condições descritas na tabela 1, forneceu um pico no tempo de

retenção que variou entre 19 e 20 minutos.

~-- - -- ~~-.. __-= a_.~ ~ ~,.".....--..-. _~~_

1

46

Tabela 1: Gradiente de eluição utilizado para determinação de benzilglicosinolato por

HPLC com detecção no U.V. (228 nm)

TEMPO % SOLVENTE A % SOLVENTE B % SOLVENTE O

;

Minutos 0.1 % (v/v) TFA em AGUA 0.1% (v/v) TFA em MeOH ACETONITRILA

0:0 100 O O

10:00 100 O O

15.00 80 20 O

25:00 50 50 O

35:00 O 100 O

45:00 O 100 O

45:01 O O 100

54:99 O O 100

55:00 100 O O

3.2.4 Análise do BITC durante o desenvolvimento e amadurecimento

do mamão

A determinação do benzilisotiocianato (BITC) no tecido e na cavidade interna de

todos os experimentos, foi realizada em cromatõgrafo a gás acoplado a um detector

seletivo de massas (GC/MS 5973 da Hewlett - Packard). Para ambas as análises, foi

utilizada uma coluna capilar Supelco 24181 SPB-50, com 30m de comprimento, 250 J.!m

de diâmetro, espessura do filme de 0.25 J.!m e temperatura máxima de uso de 310°C.

--- .- -----"~ -~. --=---=--=-----==---

47

3.2.4.1 Quantificação e identificação do BITC nos tecidos e na cavidade interna do

mamão por Cromatografia Gasosa acoplada a um espectrômetro de massas

(CG/MS)

Os métodos utilizados para análise de BITC nos tecidos e na cavidade interna

foram otimizados, separadamente, para as condições de trabalho, descritas na tabela 2.

A identificação do BITC foi feita em ambas as análises através do tempo de retenção,

do padrão analítico de BITC (Aldrich) para cada um dos métodos. A quantificação do

composto presente nos tecidos foi feita através da construção de uma curva de

calibração de BITC. Já na cavidade interna do fruto, a quantificação foi baseada em

valores relativos de área, calculados com base na resposta do aparelho, sendo assim,

os teores de BITC foram comparativos entre os tratamentos e não quantitativos.

As integrações dos picos em ambas as determinações, foram feitas pelo programa

data análise do software acoplado ao GC/MS .

=:::::::-~---~~=-~~-==-=--:---:--~-:-~-~----------

48

Tabela 2: Condições de trabalho do CG/MS para análise de BITC

Condições de trabalho BITCTecido Volátil

TO C inicial do fomo: 70°C 150°C

Modo de injeção: pulsed splitless splitless

Pressão: 30 psi 12.83 psi

TO C do detector: 250°C 250°C

Fluxo da purga: 25 mLl min 25 mLl min

Fluxo total: 28,8 mLlmin 28,8 mLlmin

Tempo de purga: 2 minutos 2 minutos

Volume de injeção: 1 J.!L Todo volume absorvido na resina

Tempo de corrida 63 minutos 13.17 minutos

Gás de arraste: Hélio hélio

Vmédia da coluna: 36 cm/segundo 36 cm/segundo

3.2.4.2 Extração do BITC nos tecidos

As condições de extração foram otimizadas com base no estudo da degradação dos

glicosinolatos em solos, segundo BROWN et aI. (1994). Dentre os solventes orgânicos,

o que forneceu melhor resultado, para as condições de trabalho, foi o hexano. A

extração foi feita em microtubos eppendorff vedados, com tampa de rosca e anel de

borracha. Cerca de 150 mg de casca, semente e polpa, previamente pulverizadas em

49

nitrogênio líquido, foram homogeneizados em 1 mL de hexano e agitadas à temperatura

ambiente durante 1 hora. O sobrenadante, após filtragem em filtros Millex™ (Millipore)

de 0.45 J.tm foi injetado no cromatógrafo gasoso.

3.2.4.3 Extração do BITC volátil

O BITC volátil, presente na cavidade interna do mamão, foi capturado por fibras de

polidimetilsiloxano (100 J.tm SPME Fiber Assembly, Supelco), acoplada a um suporte

específico. O acesso à cavidade interna do fruto foi alcançado pela retirada de batoque

da região peduncular do fruto em direção à região das sementes (com pipetas plásticas

e estéreis). Em seguida, foram introduzidas na região aberta do fruto, cânulas plásticas,

construídas com o mesmo tipo de pipeta (Figura 11).

As fibras foram colocadas na cânula sem que houvesse contato com as sementes e

a resina ficou exposta na cavidade interna do fruto por cerca de uma hora. Em seguida,

as fibras foram recolhidas e introduzidas diretamente no injetor, liberando a amostra

presa à resina. O conteúdo volátil do analito foi, portanto, encaminhado pela coluna

para ser analisado no CG/MS (Hewlett - Packard 5973). Para dar continuidade às

análises do dia seguinte, as cânulas foram fechadas com ponteiras plásticas vedadas,

para evitar o escape de gases (Figura 11 ítem B).

BIBLiOTECAFaculdade !j.~ ,.:>:~ ..:(;i;)s Fa!ina:eu:lcas

Uni'JNs;,j3d~ de S30 PaulO

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50

Figura 11: A. Sistema de captura do BITC volátil na cavidade interna do mamão

papaia. B. Frutos, com as cânulas plásticas e com as ponteiras vedadas, aos 5 dias

pós-colheita, utilizados para medida do BITC dentro da cavidade intema do mamão.

3.2.5 Preparo do extrato enzimático e atividade da jJ-tioglicosidase

em mamão papaia

A extração das proteínas para o doseamento da atividade da f3-tioglicosidase foi

otimizada com base nas metodologias descritas por BOTTI et aI. (1995), FOOL et aI.

(2000) e HARA et aI. (2001). Cerca de 0,5 9 de amostra foi homogeneizada em 2,0 mL

de solução extratora em homogeneizador Brinkman (tipo Turrax) por cerca de 30

segundos, em velocidade média. Os homogenatos foram centrifugados a 7650 x 9 por

30 minutos e os sobrenadantes obtidos da polpa e das sementes, foram dessalinizados

em mini-colunas de Sephadex G-25 HiTrap™ Oesalting (Amersham Pharmacia

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'tda casca cerca de 5 9 e para a semente 2 g, as amostra foram trituradas em

mM, 2% SOS, 1% de mercaptoetanol e EOTA 50 mM). Após a homogeneização do

nitrogênio líquido, adicionando-se 10 mL de solução extratora (Tris-borato pH 7,5 150

utilizadas e ao tempo de centrifugação. Foram utilizadas para a extração da polpa e

A atividade da mirosinase foi determinada pela liberação de glicose, a partir do

51

utilizando soro albumina bovina (BSA) como padrão.

A determinação da proteína foi realizada segundo método de Bradford (1976),

(1992), com pequenas modificações, com relação à quantidade de amostras

A extração do RNA total foi realizada segundo LÓPEZ-GÓMEZ E GÓMEZ-L1M

substrato, sinigrina, um alil-glicosinolato (1-tio-I3-0-glicopiranose) (PALMIERI et ai,

de extrato enzimático e 50 I-1L de sinigrina 10 mM, foi incubado a 30°C e a reação

pelo sistema glicose oxidase/peroxidase/ABTS, segundo método de Bergmeyer (1974).

1982; PALMIERI et ai, 1987; BOTTI et aI., 1995). O meio de reação, composto por 501-11

interrompida com 25 1-1L de ácido perclórico (0,6N). A glicose liberada foi determinada

e NaCI50 mM.

Biotech). A atividade da mirosinase na casca e na semente dos 30 aos 120 dpa, foram

3.2.6 Proteínas

mM, contendo L-cisteína 20 mM, Polivinilpirrolidona (40000) 1%, ditiotreitol (dTT) 5 mM

3.2.7 Extração de RNA total

medidas no extrato bruto. A solução extratora foi composta de Hepes-KOH pH 6,8 100

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52

material até o descongelamento, as amostras foram centrifugadas à 12.000 x g por

30 minutos e o sobrenadante coletado foi recentrifugado por mais 30 minutos, para

eliminar os debrís celulares. Em seguida, adicionou-se ao sobrenadante 0,25

volumes de etanol absoluto e 0,11 volumes de acetato de potássio 5M, a solução foi

agitada suavemente durante 1 minuto. Nesta mistura adicionou-se 1 volume de

clorofórmio gelado. As amostras foram novamente centrifugadas a 12.000 x g por 20

min, a fase aquosa (superior) foi recolhida, adicionada de 1 volume de

fenollclorofórmio (1 :1, v/v) agitada e centrifugada por 20 minutos a 12.000 x g. A fase

aquosa foi recolhida e 1 volume de clorofórmio gelado foi adicionado ao extrato. As

amostras foram agitadas e submetidas a uma nova centrifugação de 20 minutos e o

sobrenadante foi recolhido.

A fase aquosa foi cuidadosamente transferida para tubos de vidro e o RNA da

solução foi precipitado à -20°C com 0,43 volumes de cloreto de lítio 10 M. Após a

precipitação, o material foi centrifugado a 12.000 x g durante 1 hora, o sobrenadante

foi descartado e o RNA foi solubilizado em 2 mL de tampão TE (Tris-HCI 10mM +

EDTA 1mM pH 8,0). O RNA solúvel foi precipitado novamente à -20°C por 2 h pela

adição de 3 volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de potássio 5 M,

centrifugado por 1 hora a 12.000 x g e retomado em 200 Jl.L de tampão TE.

A quantificação do RNA foi feita por espectrofotometria a 260 nm. Os cálculos

foram baseados no princípio de que 40 Jl.g de RNA por mL correspondem a 1,0

unidade de O.D, segundo SAMBROOK et aI. (1989). O material foi dividido em

alíquotas, precipitado com 3 volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de potássio

5M e armazenado em ultrafreezer -80°C.

.1

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1;1

I.

53

3.2.8 Obtenção do cONA

A obtenção da primeira fita de cDNA, a partir do RNA total (amostras

armazenadas a -80°C) da polpa, casca e semente foi feita através da ação de uma

transcriptase reversa pelos Kits First-Strand cONA Synthesis (Amersham

Biosciences) ou pelo Superscript First-Strand Synth-50 RXN (Invitrogen),

utilizando como "primer" Oligo dT (12-18), segundo as instruções descritas nos manuais

dos fabricantes.

3.2.9 Síntese de oligonucleotídeos

Foram alinhadas seqüências de aminoácidos de mirosinases conhecidas em

outros vegetais e disponíveis no Genebank, através do acesso remoto da Embrapa

Centro de Recursos Genéticos e Biotecnologia - Bioinformática

(http://asparagin.cenargen.embrapaetelnet:llasparagin.cenargen.embrapa.br) pelos aplicativos

Pileup e Pretty (Wisconsin-Package, 1997). Os códigos ambíguos, que foram utilizados

na síntese dos oligos, estão descritos na tabela 4. Os oligonucleotídeos foram

sintetizados pela empresa Invitrogen do Brasil e as sequências estão descritas na

tabela 3. A partir de regiões de consenso da proteína, foram obtidas as sequências de

nucleotídeos para a construção dos "primers" .

- ~ -

54

Tabela 3: Relação das sequências de primers utilizados em PCR para

amplificação de fragmentos de mirosinases.

Primers Seqüência Tm(°C)

Sense 1 (81) 5' CCT TTY GTT AC W CTK TTY CAY TGG GA 3' 51

Sense 2 (82) 5' TTC GGW GGW AAG GTT AAR AAC TGG 3' 50

Sense 3 (83) 5' TTC GGW GGW AAG GTT AAR AAC TGG 3' 48

Sense 4 (84) 5' GAT TTT CTT GGW CTY AAY TAC TA 3' 43

Sense 5 (85) 5' GAT TTT CTT GGW CTY AAY TAT TA 3' 41

Anti-sense 1 (R1) 5' ATC YTC AAG AGM CCA WGC RAA RTA ACC 3' 53

Anti-sense 2 (R2) 5' ATC YTC AAG AGM CCA WGC RAA RTA TCC 3' 53

Anti-sense 3 (R3) 5' CCA ATT AAC RTA AGW CAR WCC AAA 3' 45

Anti-sense 4 (R4) 5' CCA ATT AAC RTA AGW CAR WCC GAA 3' 47

Anti-sense 5 (R5) 5' ATA TCC CTT RCA RAA YTC RTA RTT ATC 3' 48

Anti-sense 6 (R6) 5' ATA TCC CTT RCA RAA YTC RTA RTT GTC 3' 49

Tm (0C): temperatura média de reação dos primers

Tabela 4: Códigos Ambíguos IUPAC

N = qualquer base S = C ou G D = A ou G ou T

M = A ou C y= C ou T H = A ou C ou T

R = A ou G K= G ou T v= A ou C ou G

W= A ou T B = C ou G ou T

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..---.-..---::-~

55

3.2.10 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

As reações em cadeia da polimerase foram realizadas em meio contendo

tampão Tris-HCI pH 8.3 10mM, dNTP 2.5 mM, MgCb 10mM, prímers sintetizados nas

direções sentido (sense) e reversa (anti-sense) com 0.5 f.!Mde concentração final, na

presença de 2.5 U da enzima Taq Polimerase com a utilização de 0.5 a 1.0 f.!1 de

cDNA molde. As condições adotadas no termociclador foram: 94°C/30"; 50°C/30";

72°C/1,5-2,O minutos com 35 ciclos. Para visualização dos produtos de PCR, as

amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose (1,0 a 1,5%), contendo

0,5 f.!g/mL de brometo de etídio, a 80 V por 10-15 min, em tampão TPE (Tris-fosfato 90

mM e EDTA 2 mM, pH 8,0) (SAMBROOK, 1989).

3.2.11 Clonagem e expressão do produto de PCR

Os fragmentos de DNA obtidos com a amplificação foram excisados do gel

preparativo. Os DNAs foram eluídos e purificados, com o objetivo de eliminar a

agarose e o brometo de etídio, para isso foi utilizado o kit GFX™ PCR DNA and Gel

Band Purification (Amersham Biosciences). Os fragmentos de DNA purificados

foram introduzidos no vetor pCR® 4-TOPO. Cerca de 4 f.!L de DNA purificado foram

utilizados para fazer a ligação com 2f.!L do vetor, através da ação da topoisomerase

ligada neste vetor. Desta ligação, foram utilizados cerca de 2f.!L para transformação

de 50 f.!L de células competentes de E. calí (One shot® TOP10- invitrogen). Esta

reação foi incubada no gelo por 30 minutos, em seguida as bactérias foram

~ 1,

56

submetidas a um choque térmico a 42°C por 30 segundos exatos. Às bacterias

foram adicionados 250 flL de meio SOC, em seguida o meio foi submetido a

incubação por cerca de 1 hora a 37°C. As bactérias foram plaqueadas em meio LB

ágar contendo ampicilina (100 flg/mL), sendo que neste sistema, somente as células

transformadas cresceram.

As colônias de células transformadas foram transferidas individualmente para

tubos contendo cerca de 50 flL de meio LB e ampicilina (100 flg/mL) e incubadas por

2 horas a 3rC. Em seguida foram feitas PCR dessas colônias para verificar a

presença dos insertos, com primers específicos da mirosinase de mamão e primers

flanqueadores dos vetores (T3, M13 e M13 reverso).

3.2.12 Mini-preparação de DNA plasmidial e sequenciamento

A partir das colônias transformadas, contendo o inserto, foram feitos inóculos em

meio LB com antibiótico e o crescimento foi conduzido "overnigth" a 37°C, sob agitação

constante. A extração e a purificação do plasmídeo contendo os insertos de interesse

foram feitas seguindo o protocolo do kit QIA prep® Miniprep (Qiagen). A quantificação

do DNA plasmidial obtido, foi realizada em espectrofotômetro a 260 nm, considerando

se que uma solução de 50 ug de DNA/ml apresenta O.D.(densidade óptica) igual a 1,0.

O sequenciamento dos clones obtidos foi realizado em sequenciador automático

ALF Express, utilizando o kit Thermo Sequenase Cy5 Dye Terminator Cycle

Sequencing kit e ReproGel ™ Long Read (Amersham Biosciences). A eletroforese foi

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57

desenvolvida a 50°C, com potência constante de 25 W e tempo de corrida de 750

minutos.

As sequências obtidas foram analisadas pelos aplicativos Pileup, Tranlate e

Fasta (Wiscousin-Package, 1997), disponíveis para acesso remoto através da

Embrapa-Centro de Recursos Genéticos e Biotecnológia-Bioinformática

(http://asparagin.cenargen.embrapa.br) e também pelo Blast disponível no site do

NCBI (www.ncbLnml.nih.gov)

3.2.13 Expressão em sistema heterólogo da mirosinase em

Escherichia coli e purificação da proteína recombinante

Novas sequências de primers foram construídas nas regiões 5'(primers sense) e

3'(primer reverso) da maior sequência parcial de bases obtida com o cONA da semente

de mamão. A combinação foi semelhante à S1/R6, com algumas modificações,

eliminando as bases ambíguas, assim como descrito na tabela 5, a seguir.

Tabela 5: Sequência de bases dos primers usados nos ensaios de expressão.

Primer Seqüência Tm(°C)

Sense 1 5' "CCT nT Gn ACA CTT TTC CAC TGG GAT Gn" 3' 52

Sense 2 5' . "AGA AGA CAT GTA CGG AGG ACT" 3' 55

Reverso 1 5" " CAG TGG AAA AGT GTA ACA AAA GG" 3' 47

~- - - --=-----=- --=-- -=-----==--- -

58

Os testes de expressão parcial da mirosinase em E colí foram realizados com o

pCR-T7/TOPO-TA Expression Kit (Invitrogen). O produto da amplificação por "PCR",

através da combinação dos primers sense 1 e revers01 foi clonado no vetor de

expressão pCR-T7/NT-TOPO TA (Invitrogen) e usado na transformação de células de

Ecolí TOP1 OF', de acordo com as instruções descritas no manual. Cerca de 5 a 10 ng

de ONA plasmidial foram inseridos em células BL21 (OE3)pLysS de E colí para

expressão.

As reações foram incubadas em gelo por 30 minutos e em seguida submetidas

ao choque térmico a 42°C por 30 segundos. Ao meio foram adicionados 250 !-LL de SOC

seguido de incubação a 37°C durante 1 hora. O pré-inóculo foi preparado com o

volume total desta cepa de bactérias que foi transferida para 10 mL de meio LB,

adicionado de 100 ,...g/mL de ampicilina e 34 !-Lg/mL de cloramfenicol o qual foi incubado

por 12 horas a 37°C.

Cerca de 500 ,...L do pré-inóculo foi adicionado em 5 mL do mesmo meio LB e

incubados por 2 horas até o crescimento das bactérias que renderam a absorbância de

0.5-0.8 à 600 nm. Para acompanhar o nível de expressão da proteína recombinante

foram preparados dois inóculos, sendo que um deles foi acrescido de um agente indutor

de expressão, IPTG (isopropil tiogalactopiranosídeo) na concentração final de 1 mM. A

indução foi acompanhada em intervalos de duas horas até 6 horas. Alíquotas de 500 !-LL

da bactéria induzida e não-induzida foram coletadas desde o tempo zero em microtubos

que foram centrifugadas a velocidade máxima por 30 segundos.

O precipitado foi ressuspendido em 80 !-LL no tampão que continha: Tris-HCI

62,5 mM pH 6,8; SOS a 2%; f3-mercaptoetanol a 5%, glicerol a 10% e 0,05% de azul

BIBLIOTECAFae'Jldade de C,i:nCl3S Farll13céUlicas

Universidade de São PaulO

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59

de bromofenol, em seguida, as amostras foram submetidas a fervura por 5 minutos.

Uma alíquota de 10 I-lL foi separada para eletroforese em gel de poliacrilamida pelo

sistema SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970), sendo o restante foi armazenado em freezer a-

20°C.

Cerca de 50 mL do meio de LB contendo ampicilina (100 J..lg/mL), cloramfenicol

(34 I-lg/mL) e IPTG (1 mM), foi inoculado com 1 mL do pré-inóculo induzido e incubado

a 37°C durante 4 horas. A proteína recombinante foi recuperada por centrifugação a

3000xg durante 10 minutos e armazenada em freezer -20°C. A proteína induzida foi

quantificada com BSA (proteína soro albumina bovina) através de análises em

densitômetro.

3.2.14 Eletroforese de RNA e northern blot

Para o northern blot foram utilizados cerca de 20 I-lg de RNA durante o

desenvolvimento da polpa e da casca da segunda amostragem. A mesma quantidade

de RNA foi utilizada nos estádios de desenvolvimento e amadurecimento da semente

das mesmas amostras.

Os RNAs foram separados por eletroforese (4 volts/em) gel de agarose 1,2%

contendo formaldeído 2.2M, sob condições desnaturantes: (SAMBROOK, 1989), sendo

os mesmos transferidos sob vácuo para uma membrada de nylon (Hybond N+ da

Amershan Bioscienses).

Para pré-hibridização, a membrana foi bloqueada durante 2 horas, em meio

contendo SSC 5X (0,75 M NaCl, Citrato de sódio 75 mM, pH 7,0), Denhardt's 5X,

------- ---~--- ~ -

60

0.5% de SOS e ONA de salmão 1mg/mL, na proporção de 0.1 mL de solução I cm2 de

membrana. Em seguida, a membrana foi hibridizada com uma sonda específica de

mirosinase isolada da semente do mamão, produto da amplificação por PCR através

dos primers 1S (sentido) e 6R (reverso) contendo 975 pares de base. A marcação da

sonda foi feita com a.[32p]-dCTP, segundo manual de instrução do Megaprimer kit

(Amershan Bioscience).

A hibridização foi conduzida "overnighf' a 65°C. Para as lavagens a membrana

foi submetida às seguintes incubações: 2X SSC+ 0.1 % SOS durante 10 minutos à

temperatura ambiente; 2X SSC+0.1 %SOS a temperatura ambiente por 10 minutos,

1XSSC+0.1%SOS por 30 minutos 65°C e finalmente 0.1XSSC+0.1%SOS por 10

minutos a 65°C. A revelação foi feita por autoradiografia após três dias de exposição.

4. RESULTADOS

Um dos principais objetivos deste trabalho foi analisar os teores de glicosinolatos

e seu principal derivado, o BITC no mamão papaia. Pelo fato de serem análises

bastante elaboradas, era desejável que a amostragem resultasse no menor número

possível de amostras. A princípio, foi planejada a separação do fruto em três partes:

casca, polpa e semente, mas a dúvida de ser a polpa homogênea o suficiente nas

diferentes partes do fruto, originou um experimento extra no sentido de, com alguma

facilidade de metodologia de análise, verificar a homogeneidade da polpa. Considerou

se que o teor de açúcares solúveis poderia dar indicação segura sobre a

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61

homogeneidade da polpa e, além disso, a concentração de açúcares solúveis parece

ser um estimulante para o ovoposição por moscas-das-frutas (JOAQUIM-BRAVO et. aI.,

2001). Assim, a região de maior acúmulo de açúcares, seria o local mais provável de

depósito de ovos e larvas destes insetos, conseqüentemente, a principal zona para a

ativação do mecanismo de defesa. Para este experimento, a polpa dos mamões foi

separada em três partes (Figura 12), que foram analisadas quanto aos teores de

açúcares solúveis. Os resultados (Figura 13), mostraram ser a polpa homogênea o

suficiente para não ser separada em mais porções do que as inicialmente planejadas.

~ ~P1 Polpa da região peduncular

~ J-P2 Polpa da região mediana

11!!!1:::7';;; '} P3 Polpa da região apical

Figura 12: Subdivisão das regiões do mamão papaia (1 3 amostragem) para análise dos

açúcares solúveis na polpa.

62

4.1 Perfis de açúcares solúveis

A concentração de hexoses foi praticamente homogênea nas três regiões do

fruto (Figura 13) e a sacarose foi o açúcar predominante, tanto nos frutos classificados

como verdes quanto nos maduros, como já demonstrado por GOMEZ et ai (2002). A

polpa da região apical (P3) apresentou uma quantidade um pouco menor de açúcares,

sugerindo que a translocação dos carboidratos pode ser em direção à região apical do

fruto. Este mesmo direcionamento já foi descrito anteriormente por CHAN et aI. (1979)

no mamão.

Glicose

~ 3

oP3 P2 P1

Frutose

P3 P2 P1

Sacarose

P3 P2 P1

Figura 13: Teor de açúcares solúveis (%) em três diferentes regiões da polpa do

mamão papaia do "CEASA" (var. Sunrise solo) com 4 dias após a colheita da 1a

amostragem (-O-verde e maduro).

Frutos climatéricos, como a banana e maçã, acumulam sacarose através da

hidrólise do amido durante o amadurecimento pós-colheita, enquanto frutos

classificados como não climatéricos, assim como as frutas cítricas e a uva acumulam

m;1

i'.1

63

açúcares durante a parte final do seu desenvolvimento, ainda na planta. No caso do

mamão um fruto climatérico, sabe-se que existe a síntese de pequenas quantidades de

sacarose durante o amadurecimento pós-colheita, mas as fontes de carbono utilizadas

nesta síntese não podem ser creditadas ao amido, já que seu teor, à época da colheita,

é muito baixo no mamão (GOMEZ et aI., 2002). Como fontes alternativas de carbono,

poderiam ser considerados os monossacarídeos originados pela degradação da parede

celular, ou dos ácidos orgânicos (MANRIQUE, 2001).

4.2 Respiração e Etileno durante o amadurecimento de mamão

papaia

Com o objetivo de acompanhar o amadurecimento do mamão e caracterizar as

amostras, foram monitorados os níveis de C02 e de etileno nos frutos da segunda

amostragem (Figura 14). Os resultados obtidos foram semelhantes aos obtidos por

GOMEZ et ai (2002), com o pico de etileno ocorrendo no 5° dia pós-colheita (5dpc) e o

da respiração no 4° dpc. As amostras foram obtidas diariamente e imediatamente

congeladas.

64

100I

CO2

~~ I 1

20i

!"Etileno ~---I

!' /1o -e-

3 4 5 6 7

d ias após colh eita

Figura 14: Curvas de respiração e etileno (2a amostragem) em frutos de mamão papaia

(var. Sunrise Solo) durante o amadurecimento, colhidos com 150 dias após a antese

(triplicata de injeção ± desvio padrão)

4.3 Avaliação da atividade das mirosinases em diferentes estádios de

maturação e diferentes regiões da polpa do mamão

A atividade da mirosinase, enzima chave na síntese de BITC, utilizando como

substrato o benzilglicosinolato (BG), foi medida em três regiões da polpa, na semente e

no tecido que envolve a semente, a sarcotesta. A atividade da mirosinase foi alta na

semente e na sarcotesta, com valores semelhantes aos encontrados na região apical

da polpa madura, com diferenças não significativas em relação ao estádio de

amadurecimento (Figura 15). Para a polpa, as diferenças foram significativas entre

estádios de amadurecimento e entre as três regiões consideradas. Enquanto nos frutos

_ ~_~--~ ....:-~ ---.o-_~. -=~ _ _ _ _ _ _ __

P1 Semente sarcotestaP2

IIVerde

[]]Maduro

P3

o

~120.'0>

EQ)rno.~ 60O>

oEc

·'c

180 I I

65

verdes a atividade da mirosinase foi praticamente constante nas regiões apical,

diferenciado quanto à região da polpa. Do estádio verde para o maduro houve um

destes frutos foram compatíveis com os encontrados para os frutos da segunda

vezes, respectivamente. Os valores de atividade específica da mirosinase na polpa

amadurecimento.

amostragem (dados ilustrados a seguir), que aumentaram até o fim do

regiões mediana (P2) e peduncular (P3) tiveram um aumento de atividade de 2 e 4

aumento de atividade de aproximadamente 10 vezes na região apical (P1), enquanto as

Figura 15: Atividade da mirosinase relativa a 1a amostragem em diferentes

regiões da polpa (P1 = próxima ao pedúnculo, P2=mediana e P3 = apical) e nos tecidos

da semente e da sarcotesta (triplicata de extração ± desvio padrão).

mediana e peduncular, nos frutos maduros, houve um aumento de atividade

66

4.4 Otimização da metodologia de análise de benzilglicosinolato (BG)

e do benzilisotiocianato (BITC)

A metodologia para análise de BG e de BITC foi otimizada para análise nas amostras

de mamão papaia. As Figuras 16, 17 e 18 mostram cromatogramas relativos aos

resultados obtidos ao final da otimização, que foi considerada satisfatória depois das

amostras serem adicionadas de padrões de BG e de BITC. A resolução dos picos

cromatográficos foi considerada boa em todas as fases do desenvolvimento do

mamão. O tempo de retenção do BG foi de 20 minutos (Figura 16) e de 23:47

minutos para o BITC (Figura 17). O perfil de espectro de massas relativo ao BITC foi

comparado ao espectro cadastrado na biblioteca N18T98. O íon de maior abundância

observado para o BITC fomeceu uma relação massa! carga (m/z) de 91 J como

verificado nas Figuras 17 e 18.

- - - - -=-=--~ =-~~ - -------- ..... --~-- - - - --""'- -~~-~~- -~-

67

600

400

=>«E

200~ BG

oi "Jr- ~ I ..r---'i I i I i I

O 10 20 30

minutos

B 800~ BG

700

600

500

~ 400<t:E 300

2001 SinigrinaI

100

oI i i I I i i

o 10 20 30

minutos

A

Figura 16: Análise por HPLC de benzilglicosinolatos (BG) em mamão papaia. A.

Cromatograma do padrão de benzilglicosinolatos cedido por Richard Bennett (Institute

of Food Research-Inglaterra). B. Cromatograma da semente no ponto de colheita

(150 dpa).

J

~'::--.r---------.:~~_~~~--.....__ --=_ _ ~_ _ ,~ ~.~. ~_ • __~~_ ~_ _----=..

68

Abundância

9000000

..000000

7000000

6000000

SOOOOOO

4000000BITC

:!OOOOOO

ZOOOOOO

1 000000

oi i' i; , , , 'i 'i i • ,I, i' , , 'i ; i' i , i , , i' 'i i , , 'i' , , . i : : L L i i i

tempo1 O:OC 1 S:OO ZC:OO 2S: co :3 o:00 :3 S:OO 41J:1J1J 4S:1J1J SIJ: IJIJ SS: IJIJ -61J:1J1J

Abundância

1:!OIJIJIJIJ

1201J1J1J1J

111J1J1J1J1J

1 IJIJCCCC

9IJCIJIJIJ

'!IJIJCIJIJ

7IJCCIJIJ

60CCCC

SOCIJIJIJ

41J1J1J1J1J

30CIJIJIJ

ZOCIJIJIJ

10CIJIJIJ

IJS

massa/carga

65

SC"Z:In 31.60 (23.46~ n-lln)9~

Espectro de massas do BITC

Figura 17: Análise por CG/MS do padrão de benzilisotiocianato (BITC) (Aldrich)

(pico relativo a 110,69 ng de BITC pela curva de calibração) com respectivo espectro de

massa.

69

Abundância

_semente 150 dpa:9000000

'lDDDDDD

7000000

6000000

5000000

4000000

1000000

2000000

1000000

BITC

tempo 10:00 1s:ee 2D:ee 2S:ee mimM 3S:ee 4e:ee4S:ee Se:DD SS:DD 6D:ee

Abundância

Figura 18: Análise por CG/MS, cromatograma e espectro de massa da semente

de mamão papaia no ponto de colheita.

massa/carga

:51:5

c

UI"

semente 150 dpa

,;;l1A!.e:CCCCC

A!<:ICCCCC

A!A!CCCCC

A!CCCCCC

1,~CCCCC

1.e:CCCCC

14CCCCC

iA!CCCCC

iCCCCCC

J:!:'CCCCC

~C"'CCI e:~

I<:ICCCCC

~1

A!CCCCC

C

-- -.. --_-'_ L._ ~ =~~~_.,~~,~~~~~~~

mirosinase

o I r=-"--+"'"'' 'I " ," ",, IBITC

50

25

0,75

C)

EQ)(J)

o.ºC)

oEc

~

'c'E

0,00 I ' ", ',' ," ",' , , ,I30 60 90 120 150 153154155 156157

Dias pós-antese

C)

ÜI- 0,25l1l

oE::1.

";- 2,251

BGIqJ -

C>l1lo 1,50E::1.

As Figuras 19, 20 e 21, mostram os resultados obtidos com os frutos da segunda

70

Figura 19: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e

teores de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e

amadurecimento da Polpa (-O-) do mamão papaia relativo a 2a amostragem

(triplicata de extração ± desvio padrão)

amostragem. Foram analisados os teores de benzilglicosinolato (BG), BITC e atividade

da mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão papaia.

4.5 Teores de benzilglicosinolatos, BITC e atividade das mirosinases

na polpa, casca e semente durante o desenvolvimento e

amadurecimento do mamão papaia.

71

mirosinasel

30 60 90 120 150

Dias pós-antese

"0)6

~m4oE:i2

o

2

~:s 12E

BG8 I

"O>

~ 8Q)(/)

o.S:20>4oEc::

"O) 6

o(!]

o 4E:i



amadurecimento na Casca ( ) do mamão papaia relativo à 23 amostragem

(triplicata de extração ± desvio padrão)

- - -- - - ~~ --=-- __ o

72

o30 60 90 120 150153154155 156 157

Dias pós-antese

BITC

5

c·El50

mirosinase

'o)

~100Q)l/l

8"Õl50oEc

'7 20Ol

~ 15mo 10E:1

25 j BG-

'7 20Ol

C>m 15oE:110

5



amadurecimento na Semente ( ) do mamão papaia relativo à 23 amostragem

(triplicata de extração ± desvio padrão).

73

Na POLPA do mamão, os teores de BG que eram de cerca de 1,8 flmol/g (737

fl9/g) aos 30 dpa, diminuíram ao longo de todo o desenvolvimento do fruto, chegando a

0,263 flmol/g (107 fl9/9) no ponto de colheita (150dpa) e 0,033 flmol/g (1;3fl9/9) ao final

do amadurecimento (157 dpa) (Figura 19). Ao mesmo tempo, os teores de BITC

aumentaram até os 90 dpa mas, surpreendentemente, houve um aumento de atividade

da mirosinase só a partir dos 120 dpa. Não houve correlação também entre os teores

totais de BG que desapareceram e de BITC disponibilizado em teores bem menores.

Uma primeira hipótese é que parte do BITC produzido tenha se volatilizado, outra

possibilidade é que o BG tenha sido utilizado por outras vias metabólicas que

prescindem de atividade da mirosinase.

Na CASCA (Figura 20), não houve a discrepância entre os teores de BG que

desapareceram e de BITC formado, sendo que ambos foram diminuindo desde o início

do desenvolvimento do fruto (30 dpa), até a colheita. A atividade da mirosinase

manteve-se nos mesmos patamares durante todo o desenvolvimento, diminuindo

bastante à época da colheita e, apesar dos teores de BG e BITC terem sido maiores

que na polpa (1,8 flmol e 6 flmol, polpa e casca, respectivamente), os valores máximos

de atividade da mirosinase foram bem maiores na polpa que na casca (50 e 10 nmol,

polpa e casca).

O teor de BG na SEMENTE foi de 20flmol/g, em média, sendo este o tecido que

mais acumulou glicosinolatos (Figura 21), com uma concentração cerca de 4 vezes

maior do que na casca (Figuras 20 e 21). À semelhança da polpa e da casca, os teores

de BG também diminuíram na semente ao longo do desenvolvimento do fruto, mas

tiveram um acúmulo a partir do ponto de colheita (150 dpa), voltando aos teores

74

semelhantes aos do início do desenvolvimento do fruto. Ao final do amadurecimento, a

semente continha cerca de 400 vezes mais BG que a polpa garantindo a manutenção

do sistema glicosinolato-mirosinase para a espécie (Figuras 19 e 21). O aumento dos

teores de BG nesta fase do fruto deve ter a função de proteger a semente a ser

disseminada para reprodução. Durante todo o desenvolvimento do mamão, os níveis de

BITC na semente foram sempre muito altos, em torno de 10 a 12 Ilmol. Por outro lado,

de maneira semelhante à polpa, a atividade da mirosinase na semente foi muito mais

baixa durante o desenvolvimento do que na fase de amadurecimento pós-colheita, mas

comparável à atividade da mirosinase na casca e na polpa. Ou seja, mesmo tendo

atividade 10 vezes menor durante o desenvolvimento do que no amadurecimento, esta

atividade foi equivalente à maior atividade da enzima na casca.

No geral, a atividade da mirosinase na polpa de mamão, foi similar à atividade da

mirosinase da raiz forte (HARA et aI., 2001) e muito maior que da mostarda oriental

(0.49-0.73 nmol). Nesta espécie de mostarda, a alta atividade da mirosinase foi

correlacionada à diminuição da infestação por traça das crucíferas (Plutella xylostella)

(LI et aI., 2003). Já para o mamão não há dados de ensaios biológicos, para que se

possa fazer este tipo de correlação. Aqui, como em outros estudos que isolaram e

caracterizaram a mirosinase, não foi encontrada nenhuma sincronia entre o conteúdo

de glicosinolatos e a atividade da mirosinase (BONES, 1990; RASK et aI., 2000).

Pensando em termos da proteção que o BG ofereceria ao fruto em relação à

mosca de frutas, a casca seria o tecido mais importante por seu contato mais imediato

com o inseto, porém não se sabe ainda qual seria a concentração ideal do glicosinolato

na casca do mamão e se o glicosinolato intacto teria algum efeito sobre a proteção

-------=::

75

efetiva dos frutos contra os patógenos e/ou insetos, já que glicosinolatos intactos

parecem ser inativos (CHEN & ANDRÉASSON, 2001; FAHEY et aI., 2001;

WITTSTOCK et aI., 2004). Porém, o trabalho de LI et a!. (2000) contradiz esta teoria,

demonstrando que os teores de glicosinolatos, variando de 6.8 a 21.3 Ilg/ grama de

peso fresco de mostarda oriental (Brassica juncea), estavam associados à diminuição

da incidência de lagartas das folhas (Spodoptera eridania) , sendo que a dose tóxica

letal determinada para esse organismo foi de 6.7~ Ilmol/g. Para efeito de comparação,

os teores de BG na casca do mamão foram de aproximadamente 6,3 Ilmol/g (-2 mg/g),

no início do desenvolvimento, chegando a valores próximos de 2,3 Ilmol/g (0,9 mg/g)

no ponto de colheita (Figura 20).

Comparando os teores de BITC utilizados em um ensaio com uma praga da videira

(Otiorhynchus sulcatus), com a produção deste composto na casca do mamão, pode-se

especular que o fruto ficaria mais protegido na fase do desenvolvimento (30 a 90 dpa),

pois contém entre 5 e 3 Ilmol de BITC, já que foi mostrado que concentrações de

31lmol de BITC, foram suficientes para causar cerca de 28% de mortalidade dos ovos

deste coleóptero praga da videira (BORECK et aI., 1998). Tendo em vista este

experimento, surge a hipótese de que, a partir da colheita, o mamão ficaria mais

susceptível ao ataque dos patógenos, uma vez que estes teores caem para 1,6 Ilmol.

Porém esta hipótese só poderia ser confirmada por ensaios biológicos. Além disso,

assim como sugerido por SEO et aI. (1983) parece existir a interferência de outros

voláteis que são liberados durante o amadurecimento que contribuem para atrapalhar o

mecanismo de defesa do mamão. Não se sabe ainda qual seria a concentração ideal

de BITC liberado a partir da casca, para que o mamão fique protegido dos patógenos.

BIBLIOTECAFaculdade de Ciências ~armacêulicas

Universidade de São Paulo

___--=~-::::::::II'" - ~"

76

Os dados obtidos neste trabalho mostraram que o BITC parece ser muito mais retido na

casca do que na polpa, mas não se sabe se durante o amadurecimento essa

capacidade é mantida, uma vez que não foram medidos, nesta amostragem, os teores

de BITC na casca durante o amadurecimento (Figuras 19 e 20).

Alguns ensaios biológicos com o látex (exudado que ao ser liberado envolve a

região da casca) mostram que 6,7 x 10-4 moles de BITC IKg de ágar (0,67 Ilmollg) elou

1,9 x 10-10 mollL (BITC volátil), reduziram em 57, 93 e 93 % a ovoposição de três

espécies de moscas das frutas: Dacus dorsalis, Ceratitis capitata e Dacus curcubitae,

respectivamente. Concentrações de BITC acima deste valor reduziram em 99 % a

ovoposição destes dípteros. Em frutos amadurecidos foi necessária uma concentração

10 vezes acima da mencionada para se obter o mesmo efeito (SEO et aI., 1983). Os

isotiocianatos parecem ser altamente tóxicos tanto para insetos generalistas como para

os especialistas, e são os bioativos mais eficazes contra os diversos tipos de agentes

patogênicos, uma vez que os glicosinolatos intactos não têm, ou têm pouca ação na

defesa da planta (WITTSTOCK et aI., 2004).

Um outro lado a ser considerado da presença do BG e BITC na polpa do mamão

seria o relativo ao consumo do fruto. Sabe-se que a ingestão excessiva de alimentos

que contenham glicosinolatos pode induzir o carcinoma de bexiga em pessoas que

apresentem a predisposição (HIROSE et aI., 1998). Por outro lado, a maioria dos

trabalhos focaliza positivamente o consumo destes alimentos, justamente por prevenir

diversos tipos de câncer (ZHANG et aI., 1992; NAKAMURA et aI., 2000; MORIMITSU et

aI., 2000; GOOSEN et aI., 2000; ZHANG et aI., 2003; KUANG & CHEN, 2004). A ação

do BITC ocorre através da inibição e ativação das enzimas da fase I e II do sistema

t~

77

citocromo P450, respectivamente, que estão ligadas ao metabolismo do câncer em

mamíferos. O BITC pode atuar inibindo as enzimas de fase I, que é a fase da

biotranstransformação dos xenobióticos (qualquer substância estranha ao organismo

vivo, incluindo drogas e elementos tóxicos para a célula), assim como a enzima

glutationa redutase. Em paralelo, foi demonstrado que o BITG aumentou a atividade da

glutationa S-transferase e quinona redutase (enzimas da fase li), responsáveis pela

detoxificação destes xenobióticos (ZHANG et aI., 1992; NAKAMURA et aI., 2000;

MORIMITSU et aI., 2000 GOOSEN; et aI., 2000; ZHANG et aI., 2003; KUANG & CHEN,

2004).

Este mecanismo de detoxificação de xenobióticos não é exclusivo das células de

mamíferos, pois ocorre também nas plantas (MARSS et aI., 1996). Foi mostrado que as

glutationa S-transferases detoxificaram, através da conjugação, moléculas de

herbicidas em plantas de Arabidopsis fhaliana e que elas também foram responsáveis

pelo seqüestro de muitas outras substâncias tóxicas desencadeadas pelo estresse

oxidativo e por toxinas endógenas. Além disso, foi observado que o BITC também

aumentou a atividade destas enzimas nas plantas (DERRIDER et aI., 2002).

4.6 Teores de benzilglicosinolato, BITC e atividade da mirosinase em

mamões submetidos a tratamento com etileno e l-MCP

Este experimento foi realizado no sentido de observar qual o efeito do etileno e

do seu antagonista, o 1-MCP, sobre os teores de BG, BITC e atividade da mirosinase,

durante o amadurecimento do mamão. As Figuras 22 e 23 mostram os dados relativos

78

ao BG e do BITC da polpa, casca e semente e a Figura 24 mostra a atividade da

mirosinase na semente (terceira amostragem).

1

1-MCP 100 ppb

3 4 5 6 7 8 9 10

1

Etileno-1 00 ppm

3 4 5 678 9

Dias pós-Colheita

1

3 4 5 6 7 8 9 10

4

2

8

Controle

o

12

12I.casca

12

1polpa

0,04o

~(J)

"O'o)

o-tUoc'iij

8O)

'Nc(J).o(J)

"O

oE::t

Figura 22: Teores de BG f-D- Polpa; ~Casca e __-Semente) no mamão

papaia, submetidos aos tratamentos com etileno e 1-MCP, comparados aos frutos

controle, durante o amadurecimento na 3a amostragem (duplicata de extração ± desvio

padrão).

~ - - - ------------- --- - - - -- --~ ---- --~- _. --

79

J

1-MCP 100 ppb

3 4 5 6 7 8 9 10

J

Etileno 100 ppm

3 456 7 8 9

Dias pós-colheita

1

3 4 5 6 7 8 9 10

casca

2

4

o

8

12

12

Controle

121po,Pa

Q)"'C

0,004o"5 0,002.1::

O'l

.9coc:co·õo

:.;=;o.!fl·Nc:Q)..cQ)

"'C

oE::::1..

Figura 23: Teores de BITC (-D-Polpa; ~Cascae Semente) em

mamão papaia, submetidos aos tratamentos com etileno e 1-MCP,

comparados aos frutos controle, durante o amadurecimento na 3a amostragem

(duplicata de extração ± desvio padrão).

---- --------- - ----- ====:::s:o~ ---, '""" - r'

80

300

controle

200

100

300';-

Jetilenoc"E,;-. 200

O>EQ)l/lo 100uO>

oEc 300

!1-MCP200

100

OI' ....... ,' ti' ,! II t t !, 'I

3456789

Dias pós-colheita

Figura 24: Atividade da mirosinase relativa a 4a amostragem em sementes de

mamões submetidos aos tratamentos com 100 ppm de etileno(~), 100 ppb de 1-

MCP (-0-) comparados aos frutos controle( ) (triplicata de extração ± desvio

padrão).

81

Uma primeira análise mostra que, comparando a segunda com a terceira

amostragens, os frutos diferem bastante no que se refere aos os teores de BG e de

BITC tanto na polpa, quanto na casca e na semente, em qualquer fase de

amadurecimento que se considere (Figuras 19, 20, 21, 22 e 23). Por ocasião da

colheita, por exemplo, o teor de BG na polpa foi cerca de 12 vezes menor na terceira

amostragem que na segunda e o de BITC foi 31 vezes menor. Como os frutos de

ambas amostragens são da mesma cultivar e do mesmo produtor, pode-se creditar esta

variação à época do ano, mudanças no cultivo ou condições climáticas. Sendo o BG um

metabólito secundário da planta, ligado à sua defesa, é natural que varie segundo o

meio ambiente e as condições de clima. Este tipo de variação mostra que, mesmo que

se chegue a um consenso quanto aos teores mínimos necessários de BG ou BITC

presentes no fruto para protegê-lo das moscas-das-frutas, para efeito de exportação, é

muito difícil garantir que o mesmo contenha estes metabólitos quando colhidos, sem

análise prévia.

Apesar de terem perfis diferenciados, na média os teores de BG (Figura 22) e de

BITC (Figura 23), foram muito próximos na polpa e na casca entre os frutos controle e

tratados (1-MCP e etileno), mas foram maiores nas sementes dos frutos tratados com

1-MCP. O antagonista do etileno parece atuar positivamente na via de síntese destes

metabólitos, ou negativamente na sua degradação, já que o resultado final é de um

perfil com maiores quantidades de benzilglicosinolato, durante todo o período de

amadurecimento do fruto (Figura 22). Porém quando a atividade da mirosinase foi

testada nas sementes dos frutos tratados e controle, novamente, não foi encontrada

correlação entre atividade da enzima e teores de BG e BITC, em nenhum dos

- - - - --- - - - - - - - - - - -

82

tratamentos. Apesar de terem perfis semelhantes, a maior atividade da mirosinase foi

de cerca de 175 nmol nas sementes dos frutos controle e tratados com etileno e menor

que 150 nmol na dos frutos tratados com 1-MCP. Este experimento demonstrou que o

etileno exógeno não parece exercer nenhum tipo de controle sobre a atividade da

enzima, já que a atividade da mirosinase tanto dos frutos tratados com etileno, quanto

com seu antagonista (1-MCP), foram similares à do controle. Não existem na literatura

relatos sobre a influência do 1-MCP no perfil de benzilglicosinolatos, sendo o aumento

dos teores observado na semente, inédito.

Em folhas de Arabdopisis submetidas à aplicação exógena do seu precursor de

etileno, o ACC (1-aminociclopropano 1- carboxilato), foi observado um aumento no teor

do glicosinolato alifático, 8-metilsulfiniloctil (8-mso) (MIKKEL8EN et aI., 2003). Este

aumento pode ser correlacionado aos teores encontrados na polpa e na casca, sendo

que a semente manteve praticamente os mesmos níveis. Assim como observado por

MIKKEL8EN et aI. (2003), o sistema de defesa da planta parece ser regulado por uma

múltipla via de transdução de sinal, onde o etileno parece ser uma das moléculas

sinalizadoras. Neste trabalho, foi observado que o 1-MCP parece interferir em um dos

mecanismos de defesa do mamão, no caso o sistema glicosinolato-mirosinase.

---- -- - -- - -

83

4.7 Determinação e quantificação relativa do BITC na cavidade

interna do mamão durante o amadurecimento

o fato do BITC ser um composto volátil, com possível atuação inibitória sobre a

mosca-da-fruta na superfície do mamão, tomou importante quantificar o BITC volátil na

cavidade central do fruto, considerando-se que ele pode migrar do interior para a

superfície do fruto. Os dados aqui apresentados (Figura 25), foram calculados com

base na resposta do aparelho, sendo, portanto valores relativos e não quantitativos,

comparativos entre os tratamentos.

Os perfis de BITC na cavidade interna foram muito semelhantes nos frutos

controle e nos tratados com 1-MCP, mas diferentes nos frutos tratados com etileno.

Uma das hipóteses é que o etileno inibiu a síntese de BITC volátil contido no interior do

mamão, que foi reativado somente 5 dias após o tratamento, quando atingiu os

mesmos níveis do fruto controle logo após o tratamento. Outra hipótese é que o etileno

tenha aumentado a permeabilidade da polpa e casca do mamão, permitindo que o BITC

tenha se volatilizado mais facilmente que o controle e tratado com 1-MCP.

Apesar do 1-MCP não parecer afetar o teor de BITC volátil, após a diminuição do

nível de isotiocianato nos frutos controle, os frutos tratados com 1-MCP mantiveram

estes teores, constantes, nos dias 5, 6 e 7 pós-colheita e cerca de 2 vezes mais alto

comparados aos teores dos frutos controle, entretanto, no fim do amadurecimento, o

BITC volátil do tratado com 1-MCP foi similar ao controle.

84

11

r

1-MCP

controle

o I ,I I 1,1 1 1,1 I 1,1 -;-1,1, I,I , 1,1 I 1,1 I I, I

20

15

10

5

O

Cll 15~-«Q)

10"OIn

~.Q 5Cll>

O

15

10

5

3 4 5 6 7 8 9 10

Dias pós-colheita

Figura 25: Teores de benzilisotiocianato na cavidade interna do mamão papaia

durante o amadurecimento (-I!!Il-Controle; 100 ppm Etileno e -D- 100 ppb

1-MCP) (triplicata de injeção ± desvio padrão).

85

4.8 Extração de RNA total

Na extração de RNA total foram necessárias otimizações do tempo de

centrifugação, que aumentou para 20 minutos em cada etapa, e a proporção

massa:volume de solução extratora empregada foi diferente para polpa, casca e

semente. Os RNA extraídos a partir dos tecidos de mamão, na segunda amostragem,

estão representados na Figura 26, na qual é possível observar a integridade dos RNA

da polpa, casca e semente pela presença das bandas de subunidades 288 e 188 de

RNA ribossomal.

20001200

800400

285185

Figura 26: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo, de

RNA total de mamão papaia. Padrão Low mass DNA ladder (P), polpa com 30 e 60 dpa

(Pl e P2), casca com 90 e 150 dpa (Cl e C2), sementes com 150 e 156 dpa (SI e

S2).

4.9 Amplificação por peR

Os testes de amplificação com os primers definidos a partir de seqüências

conservadas da mirosinase foram efetuados utilizando a primeira fita de cDNA como

molde, a qual foi sintetizada a partir de 20 /-lg do RNA total. Todas as possíveis

combinações de pares de primers foram testadas com o cDNA de polpa, casca e

86

semente. Apesar da aparente integridade dos RNA obtidos a partir da casca e da polpa,

não foi possível obter amplificações com o cDNA destes tecidos com os primers

testados. Entretanto, três fragmentos de diferentes tamanhos, compatíveis com os

números de pares de bases (pb) esperados, foram amplificados a partir do cDNA da

semente (Figura 27).

P (Pb.2000 __ :,yo:,"'~,

1200 __

SOO -400 __

200 --

Figura 27: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo das

amplificações com os primers 81 e R6 (1), com os primers 81 e R2 (2), e com os

primers 85 e R6 (3). Padrão Low mass DNA Ladder ( P).

o fragmento com tamanho esperado de 1030 pb foi amplificado com o par de

primers 81/R6. O fragmento amplificado a partir do par de primers 81/R2 apresentou o

tamanho aproximado de 1000 pb, e a terceira amplificação obtida com os primers

85/R6, gerou um fragmento de aproximadamente 400 pb.

87

4.10 Clonagem e seqüenciamento

Os fragmentos purificados e ligados no vetor pCR® 4-TOPO foram clonados em

E.coli, como já descrito. As colônias contendo os plasmídeos positivos foram testadas

com os primers da sequência do vetor em combinação com os primers da sequência da

mirosinase. Este teste foi realizado para verificar a posição dos insertos no vetor e se

apresentavam os tamanhos de bases esperados.

O sequenciamento destes plasmídeos purificados mostrou que o clone obtido

com o par de primers S1/R2, denominado como miro1, apresentou 963 pb, o clone

obtido com a combinação S1/R6, nomeado como miro2, resultou em 975 pb e o clone

obtido com o par de primers S5/R6, chamado de miro3, apresentou um fragmento de

411 pb. Foram feitas várias repetições de sequenciamento que serviram para eliminar

ao máximo as ambigüidades da seqüência, com o objetivo de melhorar o grau de

confiabilidade da análise. A partir destas repetições, uma seqüência de consenso foi

elaborada com a ajuda do aplicativo "Pretty" para cada um dos clones. Das seqüências

de consenso, foram feitas análises de tradução da proteína, usando o aplicativo

"Translate".

As seqüências de aminoácidos deduzidas para a semente de mamão foram,

então, analisadas pelo "BLAST" (Basic Local Alignment search Toa/) , disponível no site

http://www.ncbi.nim.nih.gov, para verificar se eram parecidas com algumas das ~

tioglicosidases depositada no Genebank.

88

Estas análises resultaram em alta similaridade com outras mirosinases conforme

indicado pelos baixos "e value" fornecidos pelo aplicativo BLAST a cada um dos

alinhamentos. O "e value" mostra que quanto mais próximo de zero, maior a

similaridade com as seqüências de comparação. Assim, com este resultado pode-se

concluir que a probabilidade deste alinhamento ter sido ao acaso foi quase zero.

As análises obtidas pelo BLAST mostraram altos graus de similaridade com as

mirosinases de Sinapis alba (mostarda branca) (P293736; S19149; P29092 e P29738),

Arabidopsis thaliana (BT002458; AAK62412; AAF14024; NP187537; S57621; P37702;

S56653 e NP175191)J J Brassica juncea (mostarda marrom ou oriental) (AAG54074)J

Raphanus sativus (rabanete) (BAB17227) e Brassica napus (canola) (CAA79989;

S39550 e Q00326)J que são plantas, junto de outras já citadas no início deste trabalho,

que têm como característica a produção de glicosinolatos.

Houve 67% de similaridade da sequência parcial deduzida para o mamão com

Arabidopsis thaliana (BT002458) com "e value" de 9X10-95. Nesta planta foram

encontradas basicamente duas mirosinases funcionais que codificam para os genes

denominados como TGG1 e TGG2, sendo que foram observados altos níveis de

expressão gênica do promotor de TGG1 nas células guarda e no f10ema do pedúnculo

floral, região de alta produção de glicosinolatos (HUSEBYE et aI., 2002). Análises

filogenéticas mostraram que esses dois genes de Arabidopsis thaliana foram agrupados

nas duas famílias gênicas, MA e MB (XUE et aI., 1995), sendo que a família MB, que

codificam para mirosinases de 65 KDa é a que provavelmente teria atividade contra os

insetos (CHEN & ANDRÉASSON, 2000) e a de maior similaridade com a do mamão.

!i

·i

1~------------

89

A seqüência parcial de aminoácidos deduzida para o mamão mostrou 62 % de

similaridade com as mirosinases de mostarda branca, com "e value" 10-83, e na qual a

família MB também está presente. Os genes da família MA e MB de mostarda branca,

são potencialmente expressos durante o desenvolvimento da semente e do embrião

(XUE et aI., 1995). Estas enzimas já foram bem caracterizadas na mostarda branca e

as proteínas analisadas por cristalografia de raios X, que identificaram algumas regiões

conservadas, importantes no mecanismo de ação das mirosinases, o que serviu de

comparação com a seqüência parcial de aminoácidos da mirosinase, isolada do mamão

(BURMEISTER et aI., 1997; RASK et aI., 2000).

As famílias gênicas das mirosinases MA, MB, MC e MBPs (mirosinases ligadas a

proteínas), foram inicialmente descobertas em plantas de B. napus (canola), a partir da

qual descobriu-se que há diversas isoformas, neste trabalho, a sequência parcial

deduzida para o mamão apresentou 51 % de similaridade com as mirosinases de canola

(FALK et aI., 1995; CHEN & ANDRÉASSON, 2000).

Em outras plantas que sintetizam de glicosinolatos, tais como rabanete e

mostarda oriental, foram encontrados cerca de 52% e 45% de similaridade com a

mirosinase de mamão, respectivamente.

Após as análises fornecidas pelo BLAST, as sequências parciais da mirosinase

de mamão foram alinhadas com as seqüências de aminoácidos de outras mirosinases

inicialmente utilizadas no planejamento dos primers, as quais estavam disponíveis no

GenBank, através do aplicativo Pileup. Os dados mostrados no alinhamento (Figura

28), sugerem que os três clones, ainda que parciais, parecem representar a mesma

seqüência, portanto, é possível que sejam produtos de um mesmo gene.

,J

90

Para verificar, no alinhamento, quais as sequências eram similares e/ou

indênticas e/ou conservadas, foi utilizado o programa Boxshade, disponível no síte:

http://bioweb.pasteur.frlseganal/interfaces/boxshade.html, mostrando que as áreas coloridas em preto,

significam que pelo menos 50% dos aminoácidos são idênticos, as áreas em cinza,

representam as seqüências similares e conservadas (identidade menor que 50%) e o

verde representa as seqüências conservadas com 100% de identidade.

~~,~,°1

IJI

92

A mirosinase de mamão parece estar mais próxima das mirosinases deduzidas

para mostarda branca: MB49 (819149), MB92 (P29092) e MB38 (P29738) e

Arabidopsis thaliana 91 (BT002458), devido à sua posição dentro do alinhamento

(Figura 28), esta proximidade parece estar de acordo com a alta similaridade

encontrada para a seqüência de mirosinase do mamão com as seqüências de

Arabidopsis thaliana (67%) e mostarda (62%).

Na análise da estrutura tridimensional da mirosinase, Burmeister et aI. (1997)

identificaram resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação da glicose com a aglicona

e envolvidos no mecanismo catalítico. Esses resíduos estão representados no

alinhamento com um asterisco magenta (*) e foram encontrados também na mirosinase

de mamão. A suposta mirosinase obtida a partir da semente de mamão, apresentou

grande parte dos aminoácidos e algumas regiões de domínios funcionais bem

conservados quando comparada a mirosinases de outras plantas. Nas seqüências

obtidas por Burmeister et aI. (1997) e em seguida por Rask et aI. (2000) um resíduo a

mais de aminoácido está envolvido nesta ligação, no caso a glutamina, a qual foi

encontrada antes do aminoácido histidina-217, na distância de setenta e três

aminoácidos anteriores.

Os resíduos que constituem o nucleófilo catalítico das mirosinases são altamente

conservados, e estão presentes na seqüência parcial da mirosinase obtida com o

mamão. O nucleófilo catalítico é a região do primeiro ataque da enzima ao substrato,

ele é constituído por um resíduo de aminoácido glutâmico, e pode ser visualizado na

Figura 28 através da região colorida em verde e delineada em magenta. Ainda nesta

figura, pode ser observado o nucleófilo catalítico das o -glicosidases, na região da linha

93

pontilhada em vermelho, a presença destes resíduos mostram o alto grau de

parentesco destas enzimas com as mirosinases, assim como observado por

BURMEISTER et aI. (1997) e RASK et aI. (2000)

Com relação ao mecanismo de regulação da atividade enzimática das

mirosinases, os resíduos do alinhamento que foram delineados em azul, são muito

importantes, pois, estão diretamente envolvidos na re-ligação da enzima com a aglicona

durante a catálise (BURMEISTER et aI. (1997); RASK et aI. 2000).

Foi observado que a mirosinase é uma proteína dimérica que se encontra ligada

a um íon metálico Zn2+, sendo que este cátion é responsável pela estabilização dos

dímeros da mirosinase. Os resíduos de aminoácidos responsáveis por essa ligação

foram observados em mostarda no trabalho de cristalização da proteína (BURMEISTER

et aI., 1997; também citado por RASK et aI. 2000), entretanto, pelo fato de ser um

sequenciamento parcial, não foi possível visualizar estes resíduos no mamão. Na

seqüência obtida para mirosinase do mamão foi verificada uma diferença nos resíduos

de aminoácidos nas possíveis regiões de glicosilação (destacadas na Figura 28 por um

delineamento em amarelo, entre os aminoácidos 420 e 440), ou seja, houve a

substituição de um resíduo de asparagina (N), presente na mirosinase de mostarda

branca cristalografada, por um resíduo de arginina (R), e também a substituição de

asparagina pelo resíduo prolina (P).

BIBLIOTECAFaculdade de CI~"~;:s Farmacêuticas

Universidôde de Sá" Pau\o

94

4.11 Expressão heteróloga do cDNA da mirosinase de semente de

mamão em E.colí

A proteína total foi extraída a partir da polpa, casca e semente de mamão (Figura

29). O interesse na obtenção deste perfil foi verificar se as mirosinases na faixa de peso

molecular descrita na literatura estavam próximas das obtidas com o gel corado para

proteína. Como já observado, dependendo da família gênica codificadora, do nível de

glicosilação ou complexação com outras proteínas, os pesos moleculares das

subunidades de mirosinases podem variar de 70 a 59 Kda (FALK et aI., 1992; LENMAN

et aI. 1993). Na Figura 29 pode ser observado que nos três tecidos do mamão foram

encontradas proteínas em uma ampla faixa de peso molecular, o que dá uma boa

probabilidade de se encontrar uma mirosinase. Para confirmar a presença da enzima e

a expressão da proteína durante o desenvolvimento e amadurecimento nos diversos

tecidos do mamão, são necessárias as obtenções de anticorpos poli ou monoclonais.

4

2

1 2 3 4

Figura 29: Eletroforese de proteínas de mamão em sistema dissociante SDS

PAGE, gel a 9%. Padrão de peso molecular (1); polpa com 120dpa (2); casca

com 150 dpa (3); semente com 150dpa (4).

95

Quanto à indução da proteína, pode-se observar na Figura 30, que a cepa

BL21 (DE3)pLysS de Ecolí expressou a proteína recombinante codificada pelo

fragmento de cDNA de 975 pares de bases. O peso molecular predito para esta

proteína recombinante foi de aproximadamente 37 KDa. O tempo ótimo de indução foi

de 4 horas, que resultou em maior concentração da proteína recombinante expressa e

induzida pelo IPTG.

i'·

97

66

45

30

20··..."t::

KDa

4h 2h 2h 2h 6h 6h 6h 4h 4h

Intervalos de indução

Figura 30: Eletroforese de extratos protéicos de E calí em gel de poliacrilamida

9% da expressão piloto de mirosinase. Padrão de peso molecular (P); indução da

colônia 1 (IC1); bactérias não-induzidas com IPTG (NI); indução da colônia 2 (IC2).

A expressão em sistema heterólogo conduzido em leveduras (Pichia pastoris), a

partir do cDNA do gene MB de canola, forneceu uma isoforma de mirosinase de 64 KDa

(HARTEL & BRANT, 2002). Já no mamão, a expressão heteróloga realizada em

bactérias (E CO/I), forneceu uma proteína recombinante com o tamanho da subunidade

de 37 Kda. Essa diferença no tamanho da subunidade com relação à literatura pode ser

96

atribuído ao fato de que foi utilizada apenas uma parte da seqüência protéica e não a

seqüência inteira, elou pelas diferenças dos tipos de sistemas aplicados. Apesar da

proteína recombinante estar incompleta, ela mostrou alta similaridade com as mesmas

proteínas da canola expressas na levedura.

O passo seguinte foi a tentativa de se obter os anticorpos policlonais entretanto,

talvez devido à falta do restante da seqüência, este trabalho não apresentou resultados

satisfatórios (dados não mostrados).

4.12 Expressão ~~nica da Illirosinase de mamão papaia

A transferência dos RNAs totais para membrana de nylon mostrou que os RNAs

ribossomais estavam íntegros (Figura 31). Apesar das quantidades de 'RNA não

estarem homogêne~ f:m todas as fases do desenvolvimento, especialmente no estádio" I

de q,madurecimentQ qa semente e em algumas fases do desenvolvimento qa ç,ascs,

não houve probl~ma$ çom a análise, pois, o aumento da transcrição ocorreu apenas no

ponto de colheit~.

li ,~

97

fi~

·18S

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B

1~·;t'1

y ,:~:"f;/" .~~.. .' I ~ ~f

"h~· , 'i<; jj

Figura 31: Análise de northem blot em diferentes tecidos do mamão papaia A.

Eletroforese de RNA total em gel de agarose (1,2%). POLPA com 30 dpa (1), 60 dpa

(2), 90 dpa (3), 120 dpa (4), 150 dpa (5); CASCA com 30 dpa (6), 60 dpa (7), 90 dpa

(8), 120 dpa (9), 150 dpa (10) e SEMENTE com 60 dpa (11), 90 dpa (12), 120 dpa (13),

150 dpa (14),153 dpa (15),155 dpa (16),156 dpa (17),157 dpa (18); i. Autoradiografia

de RNA hibridizado com a sonda específica para mirosinase do mamão. B. Eletroforese

de RNA total em gel de agarose (1,2%). CASCA com 30 dpa (1), 60 dpa (2), 90 dpa (3),

120 dpa(4), 150 dpa (5) e SEMENTE com 30 dpa(6), 60 dpa(7), 90 dpa(8), 120 dpa (9),

150 dpa(10), 153 dpa(11), 155 dpa (12),156 dpa (13),157 dpa(14); ii. Autoradiografia:

de RNA hibridizado com a sonda específica para mirosinase. 11,',".

l~

As membranas hibridizadas com a sonda marcada, mostraram boa

especificidade com os RNAs transcritos da semente. Esta seqüência parcial que foi

marcada radioativamente foi a que apresentou maior número de bases e que fomeceu

melhores resultados quanto à similaridade junto à família gênica MS, as quais codificam

para mirosinases de 65 KDa na planta de mostarda branca (Sinapis alba) (XUE et all'\'..

1992), canola (Brassica napus) (LENMAN et aI., 1993), Arabidopsis thaliana (XUE et al.\1

1995a) e rabanete (HARA et aI., 2000). Segundo Lenman et aI. (1993) e FALK et aI.

--e::::: ~

98

(1995) os transcritos MS mostraram expressão dominante em sementes, plântulas e ~.

folhas jovens de B. napus, enquanto que no desenvolvimento da semente só foram

expressos genes da família MA. Essa observação parece não se aplicar para as

sementes de mamão durante o desenvolvimento, uma vez que a sonda utilizada

apresentou semelhança apenas com os genes da família MB.

De acordo com a Figura 31 (itens A e B), os transcritos da mirosinase aparecem

na semente e a partir dos 90 dpa. Um grande aumento na transcrição gênica é

encontrado no ponto de colheita (150 dpa) que em seguida, após a colheita, permanece

constante. O perfil do nível de transcritos da mirosinase da semente acompanha o perfil

de atividade (Figura 21), ou seja, enquanto aumenta a atividade no ponto de colheita,

aumenta o nível de transcrito (Figura 31). Já na fase pós-colheita o perfil de atividade

da semente é mantido alto (Figura 21), porém não é acompanhado pelo nível de

transcritos.

Não se sabe qual seria a razão definitiva para o aumento da atividade e do nível

de transcritos da enzima. Uma das hipóteses seria que a planta poderia entender o

sinal de desligamento da planta - mãe como uma injúria e ativar o seu mecanismo de

defesa para produzir, no caso do mamão, o BITC e com isso melhorar o sistema de

proteção do fruto através do aumento da atividade de enzimas antioxidates, assim

como as glutationa S-transferases, já que foi observado que o BITC aumenta a

atividade destas enzimas, tanto nos mamíferos, como nas plantas, sendo enzimas

chaves na detoxificação dos muitos agentes prejudiciais nos vários tipos de células

(MARSS, 1996; DERRIDER et aI., 2002).

6 '. :i .... \ O í f. C f-.f-oculda

nede ,..;.:; .. : .;~ F?ní\aGeU\\ca~

Uf\\'/e!5idírl(~ (:í: :~~o r,,'.lil)

99

Quanto à ausência destes transcritos na casca, na polpa e no início do ;~!:l

"desenvolvimento da semente, é difícil saber o que ocorreu realmente nestes tecidos.

Uma das hipóteses seria a de que outras famílias gênicas de ~-tioglicosidases poderiam

estar presentes na polpa, na casca e no início do desenvolvimento da semente, ou

talvez que a quantidade de RNA mensageiro presente nestes tecidos, seria insuficiente

para resultar em sinal visível.

5. CONCLUSÕES

» Não foi encontrada correlação entre a atividade da mirosinase e os níveis de BG

e BITC, cujos maiores teores foram encontrados na fase inicial e durante o

desenvolvimento do fruto, na semente e na sarcotesta.

» O sistema glicosinolato-mirosinase parece ser afetado pelo 1-MCP mas não pelo

etileno.

» O perfil de transcritos da mirosinase isolada do mamão mostrou que a

transcrição desta enzima ocorre apenas na semente, e inicia-se aos 90 dpa,

apresentando um significativo aumento da transcrição no ponto de colheita

(150 dpa), concomitante ao aumento de atividade.

100

6. BIBIOGRAFIA CITADA

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Resumo

o sistema glicosinolato-mirosinase faz parte do mecanismo de defesa das

plantas, quando o tecido é danificado, os glicosinolatos são degradados pela

mirosinase e os compostos tóxicos são liberados. No mamão, o principal

composto liberado pela enzima é o benzilisotiocianato (BITC), a partir da

degradação de benzilglicosinolato (BG). Altos teores de BG e BITC, presentes no

início da formação do fruto, diminuem durante o seu desenvolvimento. A semente,

é o tecido que mais acumula estes compostos, seguido da casca e da polpa e

estes teores parecem ser afetados pelo 1-MCP, mas não pelo etileno. Além disso,

foi observado neste trabalho, que mesmo a mais baixa atividade da mirosinase

parece ter sido suficiente para liberar o BITC, que nestas quantidades, poderia

exercer ação contra as moscas-das-frutas e outros microorganismos.

A seqüência parcial da mirosinase do mamão mostrou alto grau de

similaridade com Arabidopisis (67%), mostarda branca (62%) e canola (51 %),

plantas modelo no estudo de glicosinolatos, sendo encontradas muitas regiões e

resíduos altamente conservados. O perfil de transcritos da mirosinase mostrou

que ela está presente somente na semente, e a partir dos 90 dpa, apresentando

um significativo aumento no ponto de colheita, concomitante ao aumento de

atividade.

Abstract

The glucosinolate-myrosinase system is part of the defense mechanism in

plants, when tissue is damaged, the glucosinolates are degraded by myresinases

and toxic compounds are released. In papaya fruit, the major compounds released

are the benzylisothiocyanates, frem the degradation of benzylglucosinolate (BG).

High leveis of BG and BITC are present in the beginning of the fruit formation and

they decreased during the development. The seed is the tissue that accumulates

higher contents of these compounds, followed by skin and pulp and these leveis

seems to be disturb by 1-MCP, but not by ethylene. Moreover, it was observed in

this work, that exactly the lowest activity of myresinase seems to have been

enought to liberate the BITC, that in these amounts, could to act against fruit f1ies

and other microorganisms.

The partiaI sequence of myresinase of the papaya fruit showed high degree

of similarity with with Arabidopisis (67%), white mustard (62%) and rape (51 %),

plants model in the study of glicosinolatos, being found a lot of regions and

residues highly conserved. The transcript prefile of myresinase showed that it is

present only in the seed, and frem the 90 dpa, having a significant increase in the

point of harvest, concomitant to the activity increase.

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