universidad veracruzana instituto de ciencias bÁsicas
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INSTITUTO DE CIENCIAS BAacuteSICAS
ldquoEfecto biofuncional del jugo de capuliacuten (Prunus serotina) sobre la proliferacioacuten celular y
expresioacuten del gen COX-2 en HeLa y NIH-3T3 tratados con 5-fluorouracilordquo
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Alimentarias
Presenta
L N EUGENIA MARINA OLASCOAGA CASO
Directores de tesis
Dr Rafael Diacuteaz Sobac
Dra Mariacutea Elizbeth Aacutelvarez Saacutenchez
XALAPA VER NOVIEMBRE 2015
DEDICATORIAS
A mis padres Miguel Aacutengel y Amparo por apoyarme en todo momento ensentildearme a
confiar en mis capacidades y porque gracias a su esfuerzo y ensentildeanzas me motivaron
a no conformarme y buscar el desarrollo acadeacutemico y profesional Los amo
ldquoEl suentildeo del heacuteroe es ser grande en todas partes y pequentildeo al lado de su padrerdquo
Viacutector Hugo
AGRADECIMIENTOS
Al Dr Rafael Diacuteaz Sobac por creer en mi trabajo y por su apoyo por sus palabras
conocimientos y experiencia transmitidos y por tener las palabras exactas ante
cualquier situacioacuten simplemente por ser un ejemplo mi ejemplo a seguir
profesionalmente
A la Dra Alma Vaacutezquez Luna por el tiempo dedicado a esta investigacioacuten por
confiarme su espacio de trabajo y espacio familiar
Al Dr Enrique Juaacuterez Aguilar por ser una persona iacutentegra y sensible ante los
problemas de las demaacutes personas por ser siempre un apoyo ante cualquier situacioacuten
acadeacutemica y personal Por transmitirme el trabajo en equipo y el gusto por la ciencia
A la Dra Mariacutea Elizbeth Aacutelvarez Saacutenchez encargada del posgrado en ciencias
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico por permitirme trabajar
en su equipo de trabajo y por confiar en miacute
A la Dra Rosa Isela Guzmaacuten Geroacutenimo y al Dr Joseacute Enrique Meza Alvarado por el
tiempo dedicado a la evaluacioacuten de esta investigacioacuten y por sus pertinentes
comentarios y consejos
A la M Eva Luz Montoya por todo su apoyo brindado durante la capacitacioacuten en cultivo
celular por su paciencia y tiempo
Al Bioacutel Armando Loacutepez Ramiacuterez director del Instituto de investigaciones forestales de
la Universidad Veracruzana por su apoyo en la identificacioacuten del fruto
Al Dr Jonathan Puente al Dr Joseacute Luis Villalpando a la Dra Jacqueline Castantildeeda a
la MCG Laura Velaacutezquez al QFB Yebraacuten Viveros y al QFB Jorge Moreno grupo
de trabajo del posgrado en ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico por su amistad y apoyo brindado en todo momento
A la MCA Maricela Santiago Santiago por todo el apoyo a lo largo de la maestriacutea y por
su amistad
A mi hermana Reneeacute por su apoyo y ayuda durante mi estancia en el Distrito Federal
A mi hermano Miguel Aacutengel que a pesar de no demostrarlo muy seguido seacute que
cuento con su apoyo para lo que sea y eacutel con el miacuteo
A Jorge Perfecto por entender las dificultades que se presentaron a lo largo de la
maestriacutea por compartir las satisfacciones y frustraciones y por darme la estabilidad
emocional necesaria para terminar el posgrado
GLOSARIO
5-FU 5-Fluoruracilo
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ADNc Aacutecido desoxirribonucleico complementario
ADNg Aacutecido desoxirribonucleico genoacutemico
AKT Proteiacutena quinasa B
AP-1 Proteiacutena activadora 1
ARN Aacutecido ribonucleico
ATP Adenosina trifosfato
Bcl-2 Familia de oncogenes
Cdks Ciclinas quinasa-dependientes
CE Equivalentes de catequina
c-Fos Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
c-Jun Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
COX-2 Ciclooxigenasa 2
cPLA2 Fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica
Cyt C Citocromo C
DDF Diacuteas despueacutes de la floracioacuten
dNTPs Desoxinucleoacutetidos trifosfatados
DPPH 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EGCG Epigalocatequina-3-galato
EGFEGFR Factor de crecimiento epitelialReceptor del EGF
ET Equivalentes de trolox
ETC Cadena de transporte de electrones
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
GAC Equivalentes de aacutecido gaacutelico
HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
IC50 Concentracioacuten inhibitoria media
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
LDH Lactato deshidrogenasa
LPS Lipopolisacaacuteridos
MAPKs Proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos
MEC Matriz extracelular
MnSOD Superoacutexido dismutasa mitocondrial
MMPs Metaloproteinasas
MPTP Poro de transicioacuten de permeabilidad mitocondrial
MTT Bromuro de 3-(45-Dimetiltiazol-2-il)-25-Difeniltetrazolio
NADH Nicotinamida adenina nucleoacutetido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido fosfato
NF-κB Factor nuclear kappa B
P13K Fosfatidilinositor-3-quinasa
PCNA Antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en proliferacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena polimerasa
PDGF Factor de crecimiento plaquetario
PGE2 Prostaglandina E2
PGG2 Prostaglandina G2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaglandina I2
PLA2 Fosfolipasa A2
pRb Proteiacutena de retinoblastoma (proteiacutena supresora de tumores)
RP-HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten fase reversa
SIRT3 Sirtuinas mitocondriales 3
SIRT4 Sirtuinas mitocondriales 4
SIRT5 Sirtuinas mitocondriales 5
SOD Superoacutexido dismutasa
TFG-β1 Factor de crecimiento transformante β1
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r FIBROBLASTOS
HELA
83
existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
1
Niv
ele
s r
ela
tivo
s d
e m
RN
A
Tratamientos
89
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0
02
04
06
08
1
12
14
Niv
ele
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ela
tivo
s d
e m
RN
A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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actions Mutation research 579 200-213
Stevenson D E and R D Hurst 2007 Review Polyphenolic phytochemicals -just
antioxidants or much more Cellular and Molecular Life Sciences 642900-2916
Swain E C Ping and J E Poulton 1992 Development of the potential for
cyanogenesis in maturing black cherry (Prunus serotina Ehrh) fruits Plant
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Trifan O C and T Hla 2003 Cyclooxygenase-2 modulates cellular growth and
promotes tumorigenesis J Cell Mol Med 7(3) 207-222
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fruto de la guanaacutebana (Annona muricata) Tesis de maestriacutea no publicada
Universidad Veracruzana Xalapa Meacutexico pp84
105
10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
DEDICATORIAS
A mis padres Miguel Aacutengel y Amparo por apoyarme en todo momento ensentildearme a
confiar en mis capacidades y porque gracias a su esfuerzo y ensentildeanzas me motivaron
a no conformarme y buscar el desarrollo acadeacutemico y profesional Los amo
ldquoEl suentildeo del heacuteroe es ser grande en todas partes y pequentildeo al lado de su padrerdquo
Viacutector Hugo
AGRADECIMIENTOS
Al Dr Rafael Diacuteaz Sobac por creer en mi trabajo y por su apoyo por sus palabras
conocimientos y experiencia transmitidos y por tener las palabras exactas ante
cualquier situacioacuten simplemente por ser un ejemplo mi ejemplo a seguir
profesionalmente
A la Dra Alma Vaacutezquez Luna por el tiempo dedicado a esta investigacioacuten por
confiarme su espacio de trabajo y espacio familiar
Al Dr Enrique Juaacuterez Aguilar por ser una persona iacutentegra y sensible ante los
problemas de las demaacutes personas por ser siempre un apoyo ante cualquier situacioacuten
acadeacutemica y personal Por transmitirme el trabajo en equipo y el gusto por la ciencia
A la Dra Mariacutea Elizbeth Aacutelvarez Saacutenchez encargada del posgrado en ciencias
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico por permitirme trabajar
en su equipo de trabajo y por confiar en miacute
A la Dra Rosa Isela Guzmaacuten Geroacutenimo y al Dr Joseacute Enrique Meza Alvarado por el
tiempo dedicado a la evaluacioacuten de esta investigacioacuten y por sus pertinentes
comentarios y consejos
A la M Eva Luz Montoya por todo su apoyo brindado durante la capacitacioacuten en cultivo
celular por su paciencia y tiempo
Al Bioacutel Armando Loacutepez Ramiacuterez director del Instituto de investigaciones forestales de
la Universidad Veracruzana por su apoyo en la identificacioacuten del fruto
Al Dr Jonathan Puente al Dr Joseacute Luis Villalpando a la Dra Jacqueline Castantildeeda a
la MCG Laura Velaacutezquez al QFB Yebraacuten Viveros y al QFB Jorge Moreno grupo
de trabajo del posgrado en ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico por su amistad y apoyo brindado en todo momento
A la MCA Maricela Santiago Santiago por todo el apoyo a lo largo de la maestriacutea y por
su amistad
A mi hermana Reneeacute por su apoyo y ayuda durante mi estancia en el Distrito Federal
A mi hermano Miguel Aacutengel que a pesar de no demostrarlo muy seguido seacute que
cuento con su apoyo para lo que sea y eacutel con el miacuteo
A Jorge Perfecto por entender las dificultades que se presentaron a lo largo de la
maestriacutea por compartir las satisfacciones y frustraciones y por darme la estabilidad
emocional necesaria para terminar el posgrado
GLOSARIO
5-FU 5-Fluoruracilo
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ADNc Aacutecido desoxirribonucleico complementario
ADNg Aacutecido desoxirribonucleico genoacutemico
AKT Proteiacutena quinasa B
AP-1 Proteiacutena activadora 1
ARN Aacutecido ribonucleico
ATP Adenosina trifosfato
Bcl-2 Familia de oncogenes
Cdks Ciclinas quinasa-dependientes
CE Equivalentes de catequina
c-Fos Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
c-Jun Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
COX-2 Ciclooxigenasa 2
cPLA2 Fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica
Cyt C Citocromo C
DDF Diacuteas despueacutes de la floracioacuten
dNTPs Desoxinucleoacutetidos trifosfatados
DPPH 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EGCG Epigalocatequina-3-galato
EGFEGFR Factor de crecimiento epitelialReceptor del EGF
ET Equivalentes de trolox
ETC Cadena de transporte de electrones
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
GAC Equivalentes de aacutecido gaacutelico
HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
IC50 Concentracioacuten inhibitoria media
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
LDH Lactato deshidrogenasa
LPS Lipopolisacaacuteridos
MAPKs Proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos
MEC Matriz extracelular
MnSOD Superoacutexido dismutasa mitocondrial
MMPs Metaloproteinasas
MPTP Poro de transicioacuten de permeabilidad mitocondrial
MTT Bromuro de 3-(45-Dimetiltiazol-2-il)-25-Difeniltetrazolio
NADH Nicotinamida adenina nucleoacutetido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido fosfato
NF-κB Factor nuclear kappa B
P13K Fosfatidilinositor-3-quinasa
PCNA Antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en proliferacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena polimerasa
PDGF Factor de crecimiento plaquetario
PGE2 Prostaglandina E2
PGG2 Prostaglandina G2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaglandina I2
PLA2 Fosfolipasa A2
pRb Proteiacutena de retinoblastoma (proteiacutena supresora de tumores)
RP-HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten fase reversa
SIRT3 Sirtuinas mitocondriales 3
SIRT4 Sirtuinas mitocondriales 4
SIRT5 Sirtuinas mitocondriales 5
SOD Superoacutexido dismutasa
TFG-β1 Factor de crecimiento transformante β1
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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Tratamientos
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Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
AGRADECIMIENTOS
Al Dr Rafael Diacuteaz Sobac por creer en mi trabajo y por su apoyo por sus palabras
conocimientos y experiencia transmitidos y por tener las palabras exactas ante
cualquier situacioacuten simplemente por ser un ejemplo mi ejemplo a seguir
profesionalmente
A la Dra Alma Vaacutezquez Luna por el tiempo dedicado a esta investigacioacuten por
confiarme su espacio de trabajo y espacio familiar
Al Dr Enrique Juaacuterez Aguilar por ser una persona iacutentegra y sensible ante los
problemas de las demaacutes personas por ser siempre un apoyo ante cualquier situacioacuten
acadeacutemica y personal Por transmitirme el trabajo en equipo y el gusto por la ciencia
A la Dra Mariacutea Elizbeth Aacutelvarez Saacutenchez encargada del posgrado en ciencias
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico por permitirme trabajar
en su equipo de trabajo y por confiar en miacute
A la Dra Rosa Isela Guzmaacuten Geroacutenimo y al Dr Joseacute Enrique Meza Alvarado por el
tiempo dedicado a la evaluacioacuten de esta investigacioacuten y por sus pertinentes
comentarios y consejos
A la M Eva Luz Montoya por todo su apoyo brindado durante la capacitacioacuten en cultivo
celular por su paciencia y tiempo
Al Bioacutel Armando Loacutepez Ramiacuterez director del Instituto de investigaciones forestales de
la Universidad Veracruzana por su apoyo en la identificacioacuten del fruto
Al Dr Jonathan Puente al Dr Joseacute Luis Villalpando a la Dra Jacqueline Castantildeeda a
la MCG Laura Velaacutezquez al QFB Yebraacuten Viveros y al QFB Jorge Moreno grupo
de trabajo del posgrado en ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico por su amistad y apoyo brindado en todo momento
A la MCA Maricela Santiago Santiago por todo el apoyo a lo largo de la maestriacutea y por
su amistad
A mi hermana Reneeacute por su apoyo y ayuda durante mi estancia en el Distrito Federal
A mi hermano Miguel Aacutengel que a pesar de no demostrarlo muy seguido seacute que
cuento con su apoyo para lo que sea y eacutel con el miacuteo
A Jorge Perfecto por entender las dificultades que se presentaron a lo largo de la
maestriacutea por compartir las satisfacciones y frustraciones y por darme la estabilidad
emocional necesaria para terminar el posgrado
GLOSARIO
5-FU 5-Fluoruracilo
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ADNc Aacutecido desoxirribonucleico complementario
ADNg Aacutecido desoxirribonucleico genoacutemico
AKT Proteiacutena quinasa B
AP-1 Proteiacutena activadora 1
ARN Aacutecido ribonucleico
ATP Adenosina trifosfato
Bcl-2 Familia de oncogenes
Cdks Ciclinas quinasa-dependientes
CE Equivalentes de catequina
c-Fos Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
c-Jun Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
COX-2 Ciclooxigenasa 2
cPLA2 Fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica
Cyt C Citocromo C
DDF Diacuteas despueacutes de la floracioacuten
dNTPs Desoxinucleoacutetidos trifosfatados
DPPH 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EGCG Epigalocatequina-3-galato
EGFEGFR Factor de crecimiento epitelialReceptor del EGF
ET Equivalentes de trolox
ETC Cadena de transporte de electrones
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
GAC Equivalentes de aacutecido gaacutelico
HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
IC50 Concentracioacuten inhibitoria media
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
LDH Lactato deshidrogenasa
LPS Lipopolisacaacuteridos
MAPKs Proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos
MEC Matriz extracelular
MnSOD Superoacutexido dismutasa mitocondrial
MMPs Metaloproteinasas
MPTP Poro de transicioacuten de permeabilidad mitocondrial
MTT Bromuro de 3-(45-Dimetiltiazol-2-il)-25-Difeniltetrazolio
NADH Nicotinamida adenina nucleoacutetido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido fosfato
NF-κB Factor nuclear kappa B
P13K Fosfatidilinositor-3-quinasa
PCNA Antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en proliferacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena polimerasa
PDGF Factor de crecimiento plaquetario
PGE2 Prostaglandina E2
PGG2 Prostaglandina G2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaglandina I2
PLA2 Fosfolipasa A2
pRb Proteiacutena de retinoblastoma (proteiacutena supresora de tumores)
RP-HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten fase reversa
SIRT3 Sirtuinas mitocondriales 3
SIRT4 Sirtuinas mitocondriales 4
SIRT5 Sirtuinas mitocondriales 5
SOD Superoacutexido dismutasa
TFG-β1 Factor de crecimiento transformante β1
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
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24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
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25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
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Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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r FIBROBLASTOS
HELA
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existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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Tratamientos
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Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
Al Dr Jonathan Puente al Dr Joseacute Luis Villalpando a la Dra Jacqueline Castantildeeda a
la MCG Laura Velaacutezquez al QFB Yebraacuten Viveros y al QFB Jorge Moreno grupo
de trabajo del posgrado en ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico por su amistad y apoyo brindado en todo momento
A la MCA Maricela Santiago Santiago por todo el apoyo a lo largo de la maestriacutea y por
su amistad
A mi hermana Reneeacute por su apoyo y ayuda durante mi estancia en el Distrito Federal
A mi hermano Miguel Aacutengel que a pesar de no demostrarlo muy seguido seacute que
cuento con su apoyo para lo que sea y eacutel con el miacuteo
A Jorge Perfecto por entender las dificultades que se presentaron a lo largo de la
maestriacutea por compartir las satisfacciones y frustraciones y por darme la estabilidad
emocional necesaria para terminar el posgrado
GLOSARIO
5-FU 5-Fluoruracilo
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ADNc Aacutecido desoxirribonucleico complementario
ADNg Aacutecido desoxirribonucleico genoacutemico
AKT Proteiacutena quinasa B
AP-1 Proteiacutena activadora 1
ARN Aacutecido ribonucleico
ATP Adenosina trifosfato
Bcl-2 Familia de oncogenes
Cdks Ciclinas quinasa-dependientes
CE Equivalentes de catequina
c-Fos Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
c-Jun Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
COX-2 Ciclooxigenasa 2
cPLA2 Fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica
Cyt C Citocromo C
DDF Diacuteas despueacutes de la floracioacuten
dNTPs Desoxinucleoacutetidos trifosfatados
DPPH 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EGCG Epigalocatequina-3-galato
EGFEGFR Factor de crecimiento epitelialReceptor del EGF
ET Equivalentes de trolox
ETC Cadena de transporte de electrones
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
GAC Equivalentes de aacutecido gaacutelico
HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
IC50 Concentracioacuten inhibitoria media
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
LDH Lactato deshidrogenasa
LPS Lipopolisacaacuteridos
MAPKs Proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos
MEC Matriz extracelular
MnSOD Superoacutexido dismutasa mitocondrial
MMPs Metaloproteinasas
MPTP Poro de transicioacuten de permeabilidad mitocondrial
MTT Bromuro de 3-(45-Dimetiltiazol-2-il)-25-Difeniltetrazolio
NADH Nicotinamida adenina nucleoacutetido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido fosfato
NF-κB Factor nuclear kappa B
P13K Fosfatidilinositor-3-quinasa
PCNA Antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en proliferacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena polimerasa
PDGF Factor de crecimiento plaquetario
PGE2 Prostaglandina E2
PGG2 Prostaglandina G2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaglandina I2
PLA2 Fosfolipasa A2
pRb Proteiacutena de retinoblastoma (proteiacutena supresora de tumores)
RP-HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten fase reversa
SIRT3 Sirtuinas mitocondriales 3
SIRT4 Sirtuinas mitocondriales 4
SIRT5 Sirtuinas mitocondriales 5
SOD Superoacutexido dismutasa
TFG-β1 Factor de crecimiento transformante β1
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
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CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
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ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
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25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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r FIBROBLASTOS
HELA
83
existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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V
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ilid
ad
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lula
r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
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A
Tratamientos
89
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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tivo
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A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
GLOSARIO
5-FU 5-Fluoruracilo
ADN Aacutecido desoxirribonucleico
ADNc Aacutecido desoxirribonucleico complementario
ADNg Aacutecido desoxirribonucleico genoacutemico
AKT Proteiacutena quinasa B
AP-1 Proteiacutena activadora 1
ARN Aacutecido ribonucleico
ATP Adenosina trifosfato
Bcl-2 Familia de oncogenes
Cdks Ciclinas quinasa-dependientes
CE Equivalentes de catequina
c-Fos Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
c-Jun Proto-oncogen perteneciente al complejo AP-1
COX-2 Ciclooxigenasa 2
cPLA2 Fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica
Cyt C Citocromo C
DDF Diacuteas despueacutes de la floracioacuten
dNTPs Desoxinucleoacutetidos trifosfatados
DPPH 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EGCG Epigalocatequina-3-galato
EGFEGFR Factor de crecimiento epitelialReceptor del EGF
ET Equivalentes de trolox
ETC Cadena de transporte de electrones
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
GAC Equivalentes de aacutecido gaacutelico
HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
IC50 Concentracioacuten inhibitoria media
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
LDH Lactato deshidrogenasa
LPS Lipopolisacaacuteridos
MAPKs Proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos
MEC Matriz extracelular
MnSOD Superoacutexido dismutasa mitocondrial
MMPs Metaloproteinasas
MPTP Poro de transicioacuten de permeabilidad mitocondrial
MTT Bromuro de 3-(45-Dimetiltiazol-2-il)-25-Difeniltetrazolio
NADH Nicotinamida adenina nucleoacutetido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido fosfato
NF-κB Factor nuclear kappa B
P13K Fosfatidilinositor-3-quinasa
PCNA Antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en proliferacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena polimerasa
PDGF Factor de crecimiento plaquetario
PGE2 Prostaglandina E2
PGG2 Prostaglandina G2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaglandina I2
PLA2 Fosfolipasa A2
pRb Proteiacutena de retinoblastoma (proteiacutena supresora de tumores)
RP-HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten fase reversa
SIRT3 Sirtuinas mitocondriales 3
SIRT4 Sirtuinas mitocondriales 4
SIRT5 Sirtuinas mitocondriales 5
SOD Superoacutexido dismutasa
TFG-β1 Factor de crecimiento transformante β1
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
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CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
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ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
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25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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r FIBROBLASTOS
HELA
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existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
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A
Tratamientos
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Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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tivo
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A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
IL-8 Interleucina 8
LDH Lactato deshidrogenasa
LPS Lipopolisacaacuteridos
MAPKs Proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos
MEC Matriz extracelular
MnSOD Superoacutexido dismutasa mitocondrial
MMPs Metaloproteinasas
MPTP Poro de transicioacuten de permeabilidad mitocondrial
MTT Bromuro de 3-(45-Dimetiltiazol-2-il)-25-Difeniltetrazolio
NADH Nicotinamida adenina nucleoacutetido
NADPH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido fosfato
NF-κB Factor nuclear kappa B
P13K Fosfatidilinositor-3-quinasa
PCNA Antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en proliferacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena polimerasa
PDGF Factor de crecimiento plaquetario
PGE2 Prostaglandina E2
PGG2 Prostaglandina G2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaglandina I2
PLA2 Fosfolipasa A2
pRb Proteiacutena de retinoblastoma (proteiacutena supresora de tumores)
RP-HPLC Cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten fase reversa
SIRT3 Sirtuinas mitocondriales 3
SIRT4 Sirtuinas mitocondriales 4
SIRT5 Sirtuinas mitocondriales 5
SOD Superoacutexido dismutasa
TFG-β1 Factor de crecimiento transformante β1
TNF-α Factor de necrosis tumoral α
TNF-R1 Receptor del factor de necrosis tumoral
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
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CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
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ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
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25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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r FIBROBLASTOS
HELA
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existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
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A
Tratamientos
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Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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tivo
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A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
IacuteNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1 INTRODUCCIOacuteN 3
2 MARCO TEOacuteRICO 5
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute) 5
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico 8
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten 11
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles 16
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles 18
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles 19
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical 21
28 Proceso de carcinogeacutenesis 24
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis 27
210 Tratamiento oncoloacutegico 30
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo 32
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico 33
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico 35
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta 36
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2 41
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 43
4 OBJETIVOS 44
41 Objetivo general 44
42 Objetivos especiacuteficos 44
5 HIPOacuteTESIS 45
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
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CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
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ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
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25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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r FIBROBLASTOS
HELA
83
existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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V
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ilid
ad
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lula
r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
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A
Tratamientos
89
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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tivo
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A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS 46
61 Materia prima 46
611 Fruto 46
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 46
62 Reactivos 48
63 Meacutetodos y teacutecnicas 49
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad 49
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten 50
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo 51
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 53
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 56
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 58
64 Anaacutelisis estadiacutestico 62
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 63
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad 63
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten 64
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante 68
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min 68
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h 69
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP 69
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular 70
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2 84
8 CONCLUSIONES 90
9 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 92
10 ANEXOS 105
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
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existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
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Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten 5
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la
madurez 6
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo 7
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten 8
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten
(HPLC) 14
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten
(HPLC) 15
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles 16
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides 16
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides 17
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica 26
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular 27
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad 47
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular 48
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten 66
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina 67
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de Cianidina 67
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol 68
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten 68
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa 71
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos 72
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
mediante el meacutetodo azul alamar 73
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h 74
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h 75
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r FIBROBLASTOS
HELA
83
existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
1
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A
Tratamientos
89
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
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A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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105
10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h 76
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h 76
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas
NIH-3T3 77
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 78
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h 79
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las
24 y 48 h 80
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y
fibroblastos 82
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos
tratados con 5-FU 83
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y
fibroblastos 86
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la
expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos 87
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa 88
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas
fibroblaacutesticas 89
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva 10
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz 11
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva 12
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva 13
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten 14
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los
compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten 15
Tabla 8 Tipos de carcinoma 22
Tabla 9 Tipos de sarcomas 22
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos 23
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos 24
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos 31
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis 38
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad 63
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco 65
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco 66
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco 70
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR 85
1
RESUMEN
El caacutencer cervical es una de las principales causas de morbi-mortalidad en el mundo
ocupando el segundo lugar en mujeres mexicanas Se cuenta con terapias meacutedicas
como quimio y radioterapia para su tratamiento Sin embargo debido a la nula
especificidad celular de eacutestas se producen efectos secundarios por el dantildeo causado a
tejidos sanos comprometiendo el estado general de los pacientes oncoloacutegicos Con
base en la evidencia cientiacutefica que avala el efecto selectivo de compuestos polifenoacutelicos
en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales y el efecto en la expresioacuten del gen
ciclooxigenasa-2 el objetivo de la investigacioacuten fue evaluar el efecto del jugo de capuliacuten
(Prunus serotina) fruto rico en polifenoles en la proliferacioacuten de ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical (HeLa) y fibroblastos normales (NIH-3T3) tratados con el
quimioterapeacuteutico 5- Fluorouracilo ndashuno de los principales causantes de efectos
secundarios- y conocer su impacto en la expresioacuten del gen COX-2 El efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de las liacuteneas celulares fue analizado mediante el meacutetodo
MTT y su efecto en la expresioacuten del gen COX-2 se determinoacute mediante RT-PCR punto
final Los resultados mostraron que el tratamiento con jugo de capuliacuten ya sea en
combinacioacuten con el 5-fluorouracilo o previo a la aplicacioacuten del antineoplaacutesico aumenta
el efecto citotoacutexico de eacuteste teniendo un efecto significativamente mayor en ceacutelulas de
adenocarcinoma cervical que en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales En ceacutelulas HeLa la
aplicacioacuten simultaacutenea y el pre-tratamiento con jugo de capuliacuten y el agente
antineoplaacutesico producen una disminucioacuten en la expresioacuten del gen COX-2 comparado
con los niveles basales mientras que en fibroblastos protege a las ceacutelulas del aumento
en la expresioacuten de este gen provocado por el 5-fluorouracilo Por lo que se considera
que el jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes con adenocarcinoma cervical sometidos a tratamiento
quimioterapeacuteutico La evidencia in vitro del efecto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten
del gen COX-2 sugiere la capacidad de eacuteste de disminuir los efectos de la
sobreexpresioacuten de eacuteste en la carcinogeacutenesis como el aumento en la proliferacioacuten
celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral no obstante maacutes estudios son
requeridos PALABRAS CLAVE COX-2 5-FU polifenoles antiproliferativo
2
ABSTRACT
Cervical cancer is a major cause of morbidity and mortality in the world ranking
second in Mexican women It has medical therapies such as chemotherapy and
radiotherapy for treatment However due to the null cell specificity of these side effects
are caused by damage to healthy tissue compromising the overall state of cancer
patients Based on the scientific evidence supporting the selective effect of polyphenolic
compounds on tumor cell proliferation and the effect on the expression of
cyclooxygenase-2 gene the aim of research was to evaluate the effect black cherry
juice (Prunus serotina) fruit rich in polyphenols in cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
and normal (NIH-3T3) fibroblasts proliferation treated with the chemotherapeutic 5-
fluorouracil and to determine its impact on the expression of COX-2 gene The effect of
the black cherry juice in the proliferation of cell lines was analyzed by the MTT method
and its effect on the expression of COX-2 gene was determined by RT-PCR endpoint
The results showed that treatment with black cherry juice either in combination with 5-
fluorouracil or prior to application of the antineoplastic enhances the cytotoxic effect
thereof having a significantly greater effect in cervical adenocarcinoma cells than in
normal fibroblast cells In HeLa cells the simultaneous application and pretreatment with
black cherry juice and the antineoplastic agent cause a decrease in the expression of
COX-2 gene compared to baseline whereas in fibroblasts protects cells of increased
expression of this gene caused by 5-fluorouracil So it considers that black cherry juice
is a potential adjuvant to medical treatment as part of the diet therapy of patients with
cervical adenocarcinoma undergoing chemotherapeutic treatment Evidence of in vitro
effect of black cherry juice in the expression of COX-2 gene suggesting the ability to
decrease the effects of this overexpression in carcinogenesis such as increased cell
proliferation immunosuppression and tumor vascularization however further studies
are required
KEY WORDS COX-2 5-FU polyphenols antiproliferative
3
1 INTRODUCCIOacuteN
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en Meacutexico como
capuliacuten pertenece a la subfamilia de las rosaacuteceas y es originario del continente
americano En la Repuacuteblica Mexicana este fruto se distribuye naturalmente en regiones
montantildeosas como el estado de Meacutexico Veracruz Hidalgo Michoacaacuten y Jalisco (Loewe
y Pineda 1998) A pesar de la adaptabilidad climaacutetica de este cultivo el consumo de
capuliacuten se limita a zonas rurales y de acuerdo con lo reportado por Paacuteez et al (2013)
en municipios del centro del paiacutes se observa un bajo rendimiento en la produccioacuten y una
baja importancia econoacutemica consecuencia del manejo inadecuado y el
desaprovechamiento de este cultivo
Los metabolitos secundarios identificados en el capuliacuten en mayor cantidad son
los polifenoles cianidina-3-O-rutinoacutesido quercetina hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico y
kaempferol Estos polifenoles han mostrado tener actividad antiproliferativa selectiva
sobre ceacutelulas cancerosas sin afectar significativamente la proliferacioacuten de ceacutelulas
sanas posiblemente por la inhibicioacuten de las proteiacutenas mitocondriales sirtuinas
encargadas de la respuesta antioxidante que impide la apoptosis de las ceacutelulas
tumorales (Ramos 2008 Branco et al 2015) El flavonoide quercetina impide la
diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas a traveacutes de la inhibicioacuten transcripcional del gen
ciclooxigenasa 2 (COX-2 Crespo et al 2007 OrsquoLeary et al 2004)
El gen COX-2 participa en la siacutentesis de prostaglandinas (PGs) liacutepidos activos
involucrados de manera indirecta en la proliferacioacuten de ceacutelulas tumorales mediante la
activacioacuten del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR) y el
desencadenamiento de la ruta de la proteiacutena quinasa activada por mitoacutegenos (MAPK)
Interviene en la inhibicioacuten de la actividad del sistema inmunoloacutegico capaz de detener el
crecimiento de estas ceacutelula y estaacute involucrado en la propagacioacuten del caacutencer gracias a
que las PGs regulan la expresioacuten del factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEFG) y endotelina 1 a partir de estas proteiacutenas se inicia la angiogeacutenesis y con ello se
favorece el crecimiento tumoral (Williams et al 1999 Trifaacuten y Hla 2003)
4
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en algunos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical (Liao et al 2005 Xia et al 2010) el cual es el segundo tipo de
caacutencer que afecta a la poblacioacuten femenina en Meacutexico (GLOBOCAN 2012) Diversos
quimioterapeacuteuticos producen un aumento de este gen en ceacutelulas normales entre ellos
el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo provocando la disminucioacuten del efecto del
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas cancerosas (Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005) La
sobreexpresioacuten de este gen estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del caacutencer
consecuencia de los efectos de eacuteste en la iniciacioacuten promocioacuten y propagacioacuten del
caacutencer y se relaciona con una prognosis desfavorable de los pacientes (Li et al 2007)
Con base en los antecedentes mencionados se estudioacute el efecto del jugo de
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) comparado
con el efecto en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas normales (NIH-3T3) para
establecer si el jugo presenta selectividad celular y determinar la actividad del jugo al
interaccionar con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo uno de los principales
antineoplaacutesicos que produce dantildeos a tejidos sanos (Koumlstler et al 2001) Y debido a la
implicacioacuten del gen COX-2 en la proliferacioacuten celular crecimiento y diseminacioacuten
tumoral se estudioacute la biofuncionalidad del jugo de capuliacuten en la expresioacuten de este gen
5
2 MARCO TEOacuteRICO
21 Caracteriacutesticas del capuliacuten (Prunus serotina subsp capuliacute)
El fruto Prunus serotina subsp capuliacute es conocido comuacutenmente en la Repuacuteblica
Mexicana como capuliacuten cerezo americano o shencua de acuerdo con la regioacuten en la
que se encuentra Su taxonomiacutea lo ubica en el phillum plantae subphyllum
spermatophyta clase magnoliophytina subclase magnoliopsida orden rosidas familia
rosales y subfamilia rosaacuteceas (Loewe y Pineda 1998)
El aacuterbol del capuliacuten puede ser perennifolio o caducifolio puede medir de 5 a 15 m
de altura con un diaacutemetro de hasta 12 m tiene una copa ovoide y ancha y un tronco
largo y recto con una corteza de color cafeacute o grisaacutecea por el cual se extienden ramas
alternas con presencia de un gran nuacutemero de lenticelas esparcidas Sus hojas son
ovadas o lanceoladas que miden de 5 a 16 cm de largo por 2 a 5 cm de ancho Las
flores crecen agrupadas en racimos axilares colgantes son pequentildeas y blancas de 10
a 15 cm de largo El fruto es una drupa globosa de color negro rojizo con un diaacutemetro
de 12 a 20 mm con sabor agridulce y ligeramente astringente conteniendo una sola
semilla (Figura 1 McVaugh 1951)
Figura 1 A) Hoja B) fruto C) Corteza y D) Flor del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
A)
B) C)
D)
6
De acuerdo con la investigacioacuten realizada en 1992 por Swain et al sobre los
estados de desarrollo y maduracioacuten del capuliacuten el fruto muestra tres distintas fases de
crecimiento eacutestas inician despueacutes de la floracioacuten la cual se presenta en el mes de
mayo (Marquis 1990) durante la fase I (0-28 diacuteas despueacutes de la floracioacuten DDF) los
frutos exhiben un dramaacutetico incremento en su tamantildeo tanto en peso fresco como seco
(Figura 2) durante la mitad de esta fase comienza la diferenciacioacuten del endocarpio
hasta el diacutea 28 DDF donde es bastante lentildeoso (Figura 3A)
Figura 2 Crecimiento y maduracioacuten del capuliacuten desde la floracioacuten hasta la madurez Media de peso fresco () y peso seco () Fuente Swain et al 1992
Posteriormente la fase II (29-65 DDF) es un periodo de crecimiento retardado
durante el cual el embrioacuten se desarrolla a expensas del nuacutecleo y del endospermo
(Figura 3B y C) los cotiledones comienzan a ser visibles aproximadamente 42 DDF y
hasta el final de la fase II (65 DDF) eacutestos ocupan la mayoriacutea del volumen de la semilla
mientras el tejido del endospermo residual es restringido en dos delgadas tiras de
ceacutelulas asociadas con la testa que lo rodea los frutos comienzan a presentar una
coloracioacuten roja por la produccioacuten de antocianinas
DIacuteAS DESPUEacuteS DE LA FLORACIOacuteN
Pe
so
(m
gf
ruto
)
7
La uacuteltima fase de maduracioacuten del fruto la fase III (66-81 DDF) se caracteriza por
un incremento marcado del peso fresco y del peso seco cuando el mesocarpio madura
y el fruto finalmente adquiere un matiz oscuro dado por la siacutentesis de compuestos
fenoacutelicos que dan esa coloracioacuten (Figura 3D) La duracioacuten de la fase I hasta la III variacutea
de acuerdo con las condiciones climaacuteticas pudiendo ser diferente de estacioacuten a
estacioacuten
Figura 3 Anatomiacutea del capuliacuten durante tres fases caracteriacutesticas del desarrollo A) Fase I B) Fase II C y D) Fase III m mesocarpio n nuacutecleo e endospermo y c
cotiledones Fuente Swain et al 1992
Diversas estructuras del aacuterbol de capuliacuten se han empleado como aditivos
productos alimenticios y para fines terapeacuteuticos la goma obtenida del peduacutenculo
semilla y hojas fue utilizada para fabricar dulces y pastas alimenticias Los chichimecas
usaban la harina del fruto para preparar tamales (mezquitamales) bebidas nutritivas
(mezquitatole) y bebidas alcohoacutelicas fermentadas (McVaugh 1951) Como parte de la
medicina tradicional mexicana la resina la infusioacuten de las hojas y el fruto han sido
8
empleados en el tratamiento de afecciones de los ojos bronquitis asma tos e
inflamaciones intestinales (Olszewska 2005 Jimeacutenez et al 2011 Luna et al 2013)
22 Produccioacuten y consumo de capuliacuten en Meacutexico
El capuliacuten es originario del continente americano y su cultivo se extiende
actualmente desde Canadaacute hasta Guatemala Ecuador Peruacute y el sur de Bolivia En la
Repuacuteblica Mexicana crece de forma natural en regiones montantildeosas a una altitud de
2500 m o maacutes principalmente en el estado de Meacutexico Distrito Federal Guanajuato
Jalisco Chiapas Chihuahua Coahuila Hidalgo Michoacaacuten Oaxaca Guerrero San
Luis Potosiacute Tamaulipas y Veracruz (Figura 4) (Loewe y Pineda 1998 Downey y
Iezzoni 2000 Intriago 2013)
Figura 4 Distribucioacuten natural del capuliacuten Fuente Loewe y Pineda 1998
De acuerdo con Santacruz y Santacruz (2007) los principales estados
productores de capuliacuten son el estado de Meacutexico Puebla el Distrito Federal y en cuarto
lugar se encuentra el estado de Veracruz si bien son los estados en donde se
9
concentra la mayor produccioacuten de este fruto se ha identificado que el manejo de eacuteste
no es el adecuado a pesar de que se cuenta con las condiciones y clima convenientes
para su faacutecil crecimiento y manejo
Paacuteez et al (2013) evaluaron el manejo dado a las plantaciones de capuliacuten en
algunos municipios de Puebla observando un rendimiento bajo es decir la relacioacuten de
las toneladas obtenidas de capuliacuten con las hectaacutereas sembradas dentro de sus
conclusiones mencionan que el mejoramiento del manejo de las plantaciones como
podas programadas y fertilizaciones orgaacutenicas elevariacutean considerablemente el
rendimiento de este producto el cual es bajo en comparacioacuten con otros frutos de mayor
importancia econoacutemica nacional
Este fruto no es cultivado a gran escala con fines alimenticios sino que su
produccioacuten se limita a parcelas cercanas en bordes de carreteras para su cosecha y
comercializacioacuten a nivel local (Intriago 2013) La cantidad de capuliacuten cosechado por los
locatarios resulta difiacutecil de cuantificar seguacuten Farfaacuten (2007) debido a que es consumido
en los hogares en donde se cultiva Sin embargo de acuerdo con reportes de estos
investigadores se calculoacute que el consumo de capuliacuten en Mazahua Michoacaacuten es en
promedio 18 plusmn 04 Kg en cada hogar por semana (404 ton por temporada) y cerca del
14 de los hogares venden el fruto esto es 11 plusmn 23 Kg por hogar a la semana (343
ton por temporada) dando un total de 747 ton cosechadas en cada temporada
El anuario estadiacutestico de la produccioacuten agriacutecola (SIAP 2000 2005 2010 y 2014)
reporta los datos de produccioacuten de una gran variedad de frutos y vegetales en Meacutexico
en la Tabla 1 se muestran los datos de cosecha y produccioacuten de capuliacuten a nivel
nacional en contraste con la ciruela (Prunus domestica) -fruto del mismo geacutenero- y la
uva (Vitis viniacutefera) fruto ampliamente consumido en Meacutexico De manera general se
observa un desbalance en la produccioacuten nacional de los tres frutos ya que se muestran
cifras que indican fluctuaciones en su siembra y cosecha principalmente se tiene
descontrol en la produccioacuten del capuliacuten partiendo de que las cantidades de capuliacuten
sembradas son muy variantes
10
Tabla 1 Produccioacuten nacional de capuliacuten ciruela y uva
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)1
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 978 978 37896 160284
Ciruela 1570453 1538178 7988806 16963861
Uva 4018745 3915403 37179566 188906867
Antildeo 2005
Capuliacuten 492 492 16870 50608
Ciruela 1562638 1495375 7605242 21655733
Uva 3121470 3001380 33189761 303065427
Antildeo 2010
Capuliacuten 12720 12620 44234 183271
Ciruela 1529465 1494065 7020244 22582709
Uva 2768386 2710389 30714664 422038511
Antildeo 2014
Capuliacuten 893 877 25382 91834
Ciruela 1516092 1480062 7117247 32343463
Uva 2946633 2723655 33573948 453183026
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
En la Tabla 2 se presentan los datos del capuliacuten producido en el estado de
Veracruz comparado con dos frutos del mismo geacutenero ciruela y durazno (Prunus
peacutersica) Se observa una disminucioacuten en la produccioacuten de Prunus serotina y eacutesta es
considerablemente menor que lo reportado para ciruela y durazno a pesar de que la
siembra y cosecha de ciruela ha disminuido el valor de su produccioacuten ha aumentado
draacutesticamente en el caso del durazno la siembra y cosecha han aumentado en los
uacuteltimos antildeos lo que no ha ocurrido con el cultivo de capuliacuten
11
Tabla 2 Produccioacuten de capuliacuten ciruela y uva en el estado de Veracruz
Fruto Superficie
sembrada (Ha) Superficie
cosechada (Ha) Produccioacuten
(Ton)
Valor de produccioacuten
(Miles de pesos)
Antildeo 2000
Capuliacuten 18 18 93 186
Ciruela 9235 9235 844915 1295936
Durazno 96 96 1095 27375
Antildeo 2005
Capuliacuten 13 13 5710 21696
Ciruela 8285 8285 552428 622276
Durazno 12725 12725 74103 231179
Antildeo 2010
Capuliacuten 15 15 596 596
Ciruela 9455 9455 694683 1611991
Durazno 2645 2645 172111 951551
Antildeo 2014
Capuliacuten 10 10 3185 11915
Ciruela 848 848 461710 2173165
Durazno 227 227 178077 1182141
Hectaacuterea 1 Tonelada Fuente Servicio de informacioacuten agroalimentaria y pesquera (SIAP) SAGARPA
23 Composicioacuten nutrimental y metabolitos secundarios del capuliacuten
En deacutecadas pasadas seguacuten los reportes de McVaugh (1951) soacutelo se conociacutea que
el sabor dulce del fruto de capuliacuten proveniacutea del contenido de sacarosa (13 a 36 ) y de
los hidratos de carbono totales los cuales corresponden del 45 al 55 del peso total
del fruto En algunos estados centrales del paiacutes como Tlaxcala y el Distrito Federal de
acuerdo con Raya-Peacuterez et al 2012 el fruto y la semilla eran considerados buenas
12
fuentes de minerales a pesar de no contar con reportes del contenido exacto de
minerales
Fue hasta el antildeo 2013 que Luna et al reportaron el contenido de compuestos
nutrimentales y metabolitos secundarios de capuliacuten recolectado en San Miguel
Teanguizolco Puebla En la Tabla 3 se muestra el contenido de humedad proteiacutena
grasa fibra hidratos de carbono y cenizas y en la Tabla 4 se muestra el contenido de
minerales Las concentraciones de sodio potasio calcio magnesio y foacutesforo del
capuliacuten son mayores que las contenidas en ciruela y uva
Tabla 3 Composicioacuten proximal del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Humedad
Proteiacutena
Grasa
Fibra
Cenizas
Carbohidratos+
8118 plusmn 087a
210 plusmn 001a
005 plusmn 001a
358 plusmn 003a
086 plusmn 011a
1223 plusmn 079a
8729 plusmn 112b
049 plusmn 004b
004 plusmn 001a
357 plusmn 003a
037 plusmn 003b
828 plusmn 102b
8183 plusmn 072a
046 plusmn 001b
003 plusmn 001a
321 plusmn 045a
049 plusmn 007b
1396 plusmn 033a
Contenido crudo g100g media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=3) a
y b
valores en la misma fila
seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) +Contenido de
carbohidratos fue determinado por el meacutetodo de diferencia Fuente Luna et al 2013
Dentro del anaacutelisis de metabolitos secundarios realizado por Luna et al 2013
reportan la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en la parte comestible
iacutentegra del capuliacuten (epicarpio y mesocarpio homogeneizados) soacutelo en la piel y soacutelo en
la pulpa comparaacutendolos con los contenidos en la porcioacuten comestible de ciruela y uva
(Tabla 5) En la piel o epicarpio del capuliacuten se concentra el mayor contenido de
polifenoles totales y flavonoides no obstante el contenido de toda la porcioacuten comestible
del capuliacuten (piel y pulpa) es mayor que las concentraciones en ciruela y uva
13
Tabla 4 Composicioacuten mineral del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Componente Capuliacuten Ciruela Uva
Sodio
Potasio
Calcio
Magnesio
Foacutesforo
2240 plusmn 160a
18430 plusmn 350a
1290 plusmn 190a
2120 plusmn 020a
2810 plusmn 040a
152 plusmn 240a
8130 plusmn 200b
420 plusmn 015b
1040 plusmn 120a
1350 plusmn 050b
1250 plusmn 049a
9660 plusmn 374b
441 plusmn 021b
530 plusmn 020c
139 plusmn 040b
mg100 g de fruto fresco media plusmn desviacioacuten estaacutendar (n=5) a
y b
valores en la misma fila seguida de la misma letra no son significativamente diferentes (p˃005) Fuente Luna et al 2013
Tabla 5 Polifenoles totales y flavonoides del fruto de capuliacuten ciruela y uva
Fruto
Parte del fruto
Polifenoles totales
(mg de GAE100 g de
peso fresco)
Flavonoides
(mg de CE100 g de peso
fresco)
Capuliacuten
Pulpa
Piel
Ciruela
Uva
3622 plusmn 116
325130 plusmn 120
5649 plusmn 109
2180 plusmn 105
1609 plusmn 121
2018 plusmn 121
1463 plusmn 80
2595 plusmn 145
1802 plusmn 83
1212 plusmn 49
Los datos son presentados como la media plusmn la desviacioacuten estaacutendar de nueve replicaciones GAE equivalentes de aacutecido gaacutelico CE equivalentes de catequina Fuente Luna et al 2013
Este mismo grupo de investigacioacuten reportoacute 12 compuestos polifenoacutelicos
presentes en el epicarpio del capuliacuten y 9 en el mesocarpio analizado mediante
cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detectados mediante espectroacutemetro de masas
(HPLC-ESI-MS) y comparaacutedolo con un detector UV-vis los compuestos polifenoacutelicos
maacutes abundantes en el epicarpio fueron la cianidin-3-O-rutinoacutesido quercetin pentoacutesido
hiperoacutesido aacutecido clorogeacutenico procianidina B y kaempferol hexoacutesido (Figura 5 y Tabla 6)
y aacutecido clorogeacutenico procianidina B cianidina-3-O-rutinoacutesido hiperoacutesido y quercetina
malonilglucoacutesido en el mesocarpio (Figura 6 y Tabla 7)
14
Figura 5 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el epicarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 6 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del epicarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
143
148
166
192
203
223
232
235
243
255
259
277
272
292
284 518
300 328
280
296 324
255 354
282
256 356
266 348
256 356
264 348
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
387 (179 161 135)
609 (353 301)
577 (425 289)
463 (301)
447 (285)
433 (301)
417 (285)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Cafeoil hexosa-
deoxihexoacutesido
Rutin
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Kaempferol hexoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Kaempferol pentoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 3 Fuente Luna et al 2013
15
Figura 6 Cromatograma de compuestos fenoacutelicos en el mesocarpio del capuliacuten (HPLC) Fuente Luna et al 2013
Tabla 7 Tiempos de retencioacuten UV-vis y datos espectrales de masa de los compuestos fenoacutelicos del extracto crudo del mesocarpio de capuliacuten
Pico TR
(min)
λmax (nm) Patroacuten de
fragmentacioacuten [M-H]-
Compuesto
1
2
3
4
5
8
9
11
13
151
155
173
198
208
239
246
257
262
272
292
284 518
300 328
280
282
256 356
256 356
256 356
315 (169 125)
329 (167 152 123 108)
593 (465 447 285)
353 (191)
577 (425 289)
577 (425 289)
463 (301)
433 (301)
549 (505 301)
Aacutecido gaacutelico hexoacutesido
Aacutecido vaniacutelico hexoacutesido
Cianidin-3-O-rutinoacutesido
Aacutecido clorogeacutenico
Procianidina B (diacutemero)
Procianidina B (diacutemero)
Hiperoacutesido
Quercetin pentoacutesido
Quercetin
malonilglucoacutesido
Nuacutemero de los picos corresponde a la figura 4 Fuente Luna et al 2013
16
24 Caracteriacutesticas de los polifenoles
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles estaacuten conformados estructuralmente por
un anillo aromaacutetico unido a uno o maacutes grupos hidroxilo denominado grupo fenol se
clasifican en cuatro principales grupos flavonoides aacutecidos fenoacutelicos estilbenos y
lignanos (Figura 7) siendo los maacutes abundantes los flavonoides moleacuteculas de bajo peso
molecular formadas por la combinacioacuten de derivados del aminoaacutecido fenilalanina y
aacutecido aceacutetico con una estructura baacutesica que posee un esqueleto difenilpropano
(C6C3C6) formado por tres anillos identificados como A B y C (Figura 8 Zamudio
2011)
Figura 7 Clasificacioacuten de los polifenoles Fuente Modificado de Granado 2010
Figura 8 Estructura baacutesica de los flavonoides Fuente Zamudio 2011
Los flavonoides se clasifican de acuerdo con algunos autores en flavonoles
flavanonas isoflavonas flavonas flavanoles y antocianinas (Figura 9 Aacutelvarez 2010
Haminiuk et al 2012) Existe una clasificacioacuten maacutes amplia que incluye a las chalconas
Flavonoides Aacutecidos fenoacutelicos Estilbenos Lignanos
17
flavonas isoflavonas flavonoles flavandioles antocianinas taninos condensados o
proantocianidinas y un grupo denominado auronas el cual no se ha encontrado en
concentraciones importantes en la naturaleza (Winkel 2001)
Figura 9 Estructura general de las distintas familias de flavonoides Fuente Aacutelvarez 2010
Los polifenoles se encuentran en las raiacuteces tallos hojas y frutos son
sintetizados durante el desarrollo normal de las plantas y constituyen uno de los
metabolitos secundarios maacutes numeroso y ubicuo en eacutestas (Etienne-Selloum 2013) Son
producidos como mecanismo de defensa contra diferentes situaciones de estreacutes como
proteccioacuten contra estreacutes oxidativo radiacioacuten ultravioleta atraccioacuten de insectos y aves
polinizadoras proteccioacuten frente a predadores y proveer resistencia contra patoacutegenos
La concentracioacuten de estos compuestos en los frutos estaacute relacionada con el grado de
madurez de eacutestos la variedad el clima composicioacuten del suelo y su localizacioacuten
geograacutefica (Aacutelvarez 2010 Zamudio 2011 Haminiuk et al 2012)
18
Los compuestos fenoacutelicos provenientes de fuentes alimentarias se encuentran
unidos a una o maacutes moleacuteculas de hidratos de carbono conocidos como polifenoles
glicosilados y cuando no se encuentran unidos a alguna moleacutecula de carbohidrato se
denominan agliconas El grado de glicosilacioacuten afecta directamente a la actividad
antioxidante biodisponibilidad y absorcioacuten de estos compuestos (Haminiuk et al 2012)
25 Relacioacuten entre la biodisponibilidad y la biofuncionalidad de los polifenoles
El consumo promedio de polifenoles como parte de la dieta es de 1 gdiacutea las
fuentes principales de estos compuestos son las frutas enteras bebidas como cafeacute teacute
vino y jugos de frutas y en menor medida vegetales cereales y leguminosas (Scalbert
et al 2002) La mayoriacutea de polifenoles provenientes de estos alimentos se encuentran
en forma glicosilada y aproximadamente una quinta parte se encuentra en forma de
aglicona estos compuestos fenoacutelicos ingresan al organismo en forma nativa ya sea
glicosilados polimerizados o esterificados (Haminiuk et al 2012)
El grado de glicosilacioacuten afecta directamente la velocidad de absorcioacuten intestinal
de los polifenoles (Haminiuk et al 2012) Del 5-10 de los polifenoles glicosilados
consumidos se absorben en el intestino delgado en donde los enlaces glicosiacutedicos de
los polifenoles son degradados por la enzima citosoacutelica β glucosidasa y las agliconas
resultantes son absorbidas mediante difusioacuten pasiva El 90-95 de polifenoles
consumidos son degradados por la microflora del colon a aacutecidos hidroxicinaacutemicos
hidrocinaacutemicos fenilaceacuteticos y aacutecido benzoico y posteriormente son absorbidos
(Stevenson y Hurst 2007)
Una vez absorbidos por la ceacutelulas intestinales ya sea en el intestino delgado o
en el colon sufren una conjugacioacuten a traveacutes de transferasas especiacuteficas ya sea dentro
de los mismos enterocitos en donde se lleva a cabo la glucoronidacioacuten a partir de UDP-
glucoronosil tranferasa o en los hepatocitos en donde sufren una metilacioacuten por la
enzima catecol-2-metiltransferasa o sulfatacioacuten por accioacuten de sulfotransferasas
(Manach et al 2004 Granado 2010)
19
Posterior a la conjugacioacuten ingresan al plasma sanguiacuteneo en donde se unen a la
proteiacutena albuacutemina y son transportados a diferentes oacuterganos como el hiacutegado estoacutemago
intestino colon rintildeones pulmones paacutencreas cerebro y corazoacuten Las concentraciones
plasmaacuteticas de polifenoles conjugados y no conjugados oscilan entre 1 y 5 microM que a
pesar de ser concentraciones menores a las que se encuentran los antioxidantes
endoacutegenos han mostrado actividad bioloacutegica incluso a concentraciones nanomolares
(Stevenson y Hurst 2007)
La conjugacioacuten especialmente la metilacioacuten disminuye la actividad antioxidante
directa de los polifenoles dentro del organismo por lo que se piensa que su
funcionalidad se da mediante la modulacioacuten de cascadas de sentildealizacioacuten intracelulares
por la interaccioacuten con proteiacutenas blanco maacutes que por su actividad antioxidante la cual
podriacutea conservarse soacutelo en el tracto digestivo donde pueden interaccionar directamente
con los radicales libres provenientes de la dieta y especies reactivas de oxiacutegeno (EROs)
formadas por factores externos (Dangles y Dufour 2008)
26 Propiedades biofuncionales de los polifenoles
Los polifenoles poseen propiedades funcionales debido a su estructura quiacutemica
Dangles y Dufour (2008) describen tres principales la primer propiedad se da por el
nuacutecleo del anillo aromaacutetico rico en π electrones y sus grupos hidroxilo laacutebiles lo que les
confiere caracteriacutesticas reductoras -donacioacuten de electrones y iones hidroacutegeno- y la
capacidad de captacioacuten de radicales libres La segunda propiedad es mediada por los
grupos hidroxilo y grupos cetoacutenicos presentes en los flavonoides que les permiten
unirse a iones cobre (Cu+) y hierro (Fe+) e inactivarlos los cuales podriacutean participar en
reacciones enzimaacuteticas
La tercer propiedad se le atribuye a los grupos hidroxilo y anillos aromaacuteticos por
medio de estos grupos funcionales los polifenoles son capaces de interaccionar con
proteiacutenas ya sean enzimas o receptores Los anillos aromaacuteticos son capaces de formar
interacciones de dispersioacuten (Van der Waals) con residuos de aminoaacutecidos no polares y
20
los grupos hidroxilo interactuacutean con residuos de aminoaacutecidos polares Al entrar en
contacto los polifenoles con las proteiacutenas se modifica o inhibe la actividad de eacutestas
Por otro lado Fraga et al (2010) describen mecanismos especiacuteficos y no
especiacuteficos de los polifenoles los mecanismos no especiacuteficos son resultado de la
actividad antioxidante de los polifenoles para lo se requiere un consumo elevado de
eacutestos para promover su efecto beneacutefico ante el dantildeo oxidativo lo que estaacute limitado por
su biodisponibilidad y absorcioacuten Dentro de los mecanismos especiacuteficos estaacute la
capacidad de los polifenoles de interaccionar con liacutepidos y proteiacutenas de la membrana
celular debido a la presencia de dominios hidrofoacutebicos e hidrofiacutelicos en la mayoriacutea de
los polifenoles que les permite localizar diferentes niveles en la membrana celular
Los polifenoles establecen contacto ndashsin ingresar a la membrana celular- con la
superficie de la bicapa lipiacutedica de la membrana en la regioacuten polar de los fosfoliacutepidos
gracias a la formacioacuten de enlaces mediante puentes de hidroacutegeno Por otro lado para la
insercioacuten de los polifenoles en la membrana celular se establecen conexiones entre las
cadenas hidrofoacutebicas de los fosfoliacutepidos de membrana y las regiones hidrofoacutebicas de
los polifenoles El ingreso de los polifenoles en la bicapa puede provocar
modificaciones en la estructura de la membrana plasmaacutetica y afectar la funcioacuten celular
por alteraciones en la actividad de enzimas interacciones ligando-receptor y la
modulacioacuten de sentildeales de transduccioacuten
Las principales enzimas afectadas por polifenoles se derivan estructuralmente de
purinas (como el adenosintrifosfato o ATP) quinasas ATPasas transcriptasa reversa
ARN polimerasa ADN polimerasa ribonucleasa y enzimas que utilizan NADPH como
cofactor (lactato deshidrogenasa oacutexido niacutetrico sintasa glutatioacuten reductasa) los
polifenoles inhiben enzimas ATP dependientes a traveacutes de la competicioacuten por el sitio de
unioacuten de la enzima ATP dependiente esto ocurre cuando los flavonoides presenta dos
grupos hidroxilo en las posiciones 5 y 7 del anillo A
21
En contraste con los mecanismos no especiacuteficos mencionados para lograr
efectos biofuncionales a traveacutes de los mecanismos especiacuteficos son necesarias
concentraciones bajas de polifenoles lo que puede explicar el efecto in vivo de estos
compuestos en investigaciones cientiacuteficas Dentro de la actividad bioloacutegica reportada de
los polifenoles se encuentra el efecto antiinflamatorio antialergeacutenico antitromboacutetico
vasodilatador antiproliferativo y anticarcinogeacutenico siendo eacutestos dos uacuteltimos de intereacutes
para la presente investigacioacuten por su papel en el inicio y desarrollo del caacutencer
(Soobrattee et al 2005 Aacutelvarez 2010)
27 Enfermedades oncoloacutegicas caacutencer cervical
El caacutencer es el grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento
incontrolado y la propagacioacuten de ceacutelulas anormales de acuerdo con la sociedad
americana del caacutencer (American Cancer Society 2012) La Organizacioacuten Mundial de la
Salud lo define como un proceso de crecimiento y diseminacioacuten incontrolados de
ceacutelulas pudiendo aparecer praacutecticamente en cualquier lugar del cuerpo el tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metaacutestasis en puntos distantes del
organismo (OMS 2013)
La mayoriacutea de los tipos de caacutenceres se desarrollan a partir de tejidos epiteliales
los cuales son llamados carcinomas los tumores que se derivan de las capas epiteliales
de proteccioacuten se denominan carcinomas de ceacutelulas escamosas algunos tejidos
epiteliales contienen ceacutelulas que secretan sustancias dentro de conductos o cavidades
adyacentes esta clase de ceacutelulas epiteliales generan adenocarcinomas (Tabla 8) Los
tumores restantes se derivan de tejidos no epiteliales la primer clase de tumores no
epiteliales se forma a partir de tejidos conectivos llamados sarcomas derivadas de
ceacutelulas mesenquimales incluidos fibroblastos adipositos osteoblastos miocitos
ceacutelulas endoteliales y condrocitos (Tabla 9 Weinberg 2014)
22
Tabla 8 Tipos de carcinoma
Tipos de
adenocarcinomas
Tipos de carcinoma de
ceacutelulas escamosas
Otros tipos de carcinoma
Pulmoacuten
Colon
Mama
Paacutencreas
Estoacutemago
Esoacutefago
Proacutestata
Endometrio
Ovario
Piel
Cavidad nasal
Laringe
Pulmoacuten
Esoacutefago
Cervical
Carcinoma de ceacutelulas
pequentildeas de pulmoacuten
Carcinoma de ceacutelulas
grandes de pulmoacuten
Hepatocarcinoma
Carcinoma renal
Fuente Weinberg 2014
Tabla 9 Tipos de sarcomas
Tipo de tumor Linaje celular
Osteosarcoma
Liposarcoma
Leiomiosarcoma
Rabdomiosarcoma
Fibrosarcoma
Angiosarcoma
Condrosarcoma
Osteoblastos
Adipocitos
Ceacutelulas de muacutesculo liso
Ceacutelulas de muacutesculo esqueleacutetico
Fibroblastos
Ceacutelulas endoteliales
Condrocitos
Fuente Weinberg 2014
El segundo grupo de caacutenceres no epiteliales se deriva de ceacutelulas que constituyen
los tejidos hematopoyeacuteticos incluidas las ceacutelulas del sistema inmune como los
eritrocitos y linfocitos (Tabla 10) Por uacuteltimo el tercer grupo incluye a los tumores
generados en ceacutelulas del sistema nervioso central y perifeacuterico denominados
generalmente como tumores neuroectodermales que incluye gliomas glioblastomas
meduloblastomas neuroblastomas entre otros
23
Tabla 10 Tipos de tumores hematopoyeacuteticos
Leucemia aguda linfociacutetica
Leucemia aguda mielociacutetica
Leucemia croacutenica mielociacutetica
Mieloma muacuteltiple
Linfoma no-Hodgkin
Linfoma de Hodgkin
Fuente Weinberg 2014
En el 2012 seguacuten la estimacioacuten de GLOBOCAN se presentaron 141 millones de
nuevos casos de caacutencer en ese antildeo se reportaron 82 millones de muertes debido a
este padecimiento y la prevalencia fue de 326 millones alrededor del mundo
Aproximadamente el 57 de los nuevos casos en ese antildeo 65 de las muertes y 48
de los casos prevalentes se presentan en los paiacuteses menos desarrollados la
incidencia de caacutencer es aproximadamente 25 maacutes elevado en hombres que en
mujeres siendo 205 y 165 por cada 100000 habitantes respectivamente
Dentro de los tipos de caacutenceres mencionados anteriormente el caacutencer cervical
es el segundo tipo de caacutencer maacutes comuacuten entre mujeres en todo el mundo y el seacuteptimo
de manera general En el antildeo 2012 se estima que hubo 528000 nuevos casos de
caacutencer cervical la gran mayoriacutea de estos casos cerca del 85 se presentaron en
regiones poco desarrolladas en estadiacutesticas sobre mortalidad a nivel mundial se
presentaron 266000 muertes por este tipo de caacutencer (GLOBOCAN 2012)
El Instituto Nacional de Estadiacutestica Geograacutefica e Informaacutetica (INEGI) en el 2014
publicoacute una recopilacioacuten estadiacutestica sobre morbilidad y mortalidad del caacutencer a nivel
nacional y por entidad federativa El caacutencer cervical lo agrupoacute dentro del caacutencer en
oacuterganos genitales femeninos de acuerdo con los datos presentados en las Tablas 11 y
12 la mayor incidencia de caacutencer en oacuterganos genitales femeninos se presenta entre
mujeres de 40 y 59 antildeos de edad y tanto a nivel nacional como en el estado de
Veracruz se encuentra en segundo lugar de incidencia y mortalidad
24
Tabla 11 Incidencia de caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2011
Grupo de edad (antildeos)
Tipo de caacutencer 20-29 30-39 40-49 50-59 60-64
Nacional Mama 19 107 28 292 116
Oacuterganos genitales 41 166 252 236 116
Veracruz Mama 16 103 252 30 109
Oacuterganos genitales 32 149 248 274 87
Datos mostrados en porcentaje Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
Tabla 12 Mortalidad consecuencia del caacutencer en mujeres mayores a 20 antildeos Datos de Meacutexico y Veracruz 2012
Total de casos
Tipo de caacutencer
Nacional Mama 1538
Oacuterganos genitales 1343
Veracruz Mama 1469
Oacuterganos genitales 168
Datos mostrados en nuacutemero de casos por cada 100 mil habitantes femeninos
Fuente modificado de INEGI 2014a y 2014b
28 Proceso de carcinogeacutenesis
En el desarrollo del caacutencer se distinguen tres fases seguacuten lo mencionado por
Ramos (2008) la primer fase es la iniciacioacuten que es un periodo corto en la que se
presenta la exposicioacuten de las ceacutelulas principalmente el ADN con agentes
carcinogeacutenicos la segunda es la promocioacuten se da por la replicacioacuten de ceacutelulas
dantildeadas llamadas ceacutelulas pre-neoplaacutesicas y la tercer fase es la progresioacuten se
presenta por la proliferacioacuten celular desmedida hasta llegar a la formacioacuten de un tumor
finalmente las ceacutelulas tumorales son capaces de invadir otros sitios u oacuterganos conocido
25
como metaacutestasis En estas fases estaacuten involucradas diferentes proteiacutenas que
determinan la evolucioacuten del padecimiento
Algunas proteiacutenas pueden estar sobreexpresadas en los padecimientos
oncoloacutegicos como es el caso de receptores de factores de crecimiento genes Bcl-2 con
actividad antiapoptoacutetica (Bcl-2 y Bcl-XL) la proteiacutenas quinasa B (AKT) fosfatidilinositol-
3-quinasa (PI3K) proteiacuten-quinasa activada por mitoacutegenos (MAPKs) y el factor nuclear
kappa B (NF-κB) y por otro lado se puede dar la disminucioacuten de la expresioacuten de otras
proteiacutenas como caspasas y miembros de la familia de genes Bcl-2 (Bax Bak y Bad)
con actividad proapoptoacutetica Las tres fases del desarrollo del caacutencer se generan a partir
de alteraciones en el ciclo celular
El ciclo celular en condiciones normales estaacute regulado por diversas proteiacutenas las
cuales dirigen a la ceacutelula en procesos complejos hasta llegar finalmente a la mitosis o
produccioacuten de dos ceacutelulas hijas es decir el ciclo celular es el proceso mediante el cual
se da el crecimiento reproduccioacuten de las ceacutelulas desarrollo de organelos reparacioacuten
de las fracciones de ADN dantildeadas y regulacioacuten de hiperplasia La coordinacioacuten de
estos eventos unidireccionales entre las diferentes fases del ciclo celular son criacuteticos
para la sobrevivencia e integridad de la misma la peacuterdida de estabilidad a lo largo del
ciclo permite alteraciones genoacutemicas pudiendo propiciar el desarrollo de caacutencer (Cho et
al 1998 Schafer 1998)
De acuerdo con Schafer (1998) las ciclinas kinasas-dependientes (cdks) son la
parte central del proceso a traveacutes de estas proteiacutenas se regulan las diferentes fases del
ciclo las cuales estaacuten reguladas por otras proteiacutenas de los genes supresores de
tumores dentro de las que se incluye a p53 p21 p16 cdc25 entre otros Las distintas
fases que regulan las cdks son la fase G1 S G2 y M del ciclo celular (Figura 10) en la
fase G1 la ceacutelula se prepara para la siacutentesis de ADN en la fase S se sintetiza el ADN
en la fase G2 la ceacutelula se prepara para la divisioacuten celular y finalmente la fase M estaacute
compuesta por la profase metafase anafase y telofase en la cual se completa la
formacioacuten de dos ceacutelulas hijas finalmente la fase G0 es el estado de reposo celular
26
Figura 10 Las cuatro fases sucesivas de una ceacutelula eucariota tiacutepica Fuente Lomanto
et al 2003
Las cdks son activadas en las diferentes fases del ciclo celular y estaacuten reguladas
principalmente por fosforilacioacuten lo que les permite unirse con proteiacutenas denominadas
ciclinas para su activacioacuten se sugiere que tal unioacuten provee de sustratos enzimaacuteticos
especiacuteficos para su accioacuten final Las cdks pueden activarse soacutelo en un tiempo
especiacutefico del ciclo antes de que la ceacutelula ingrese en la siguiente fase la ciclina de la
fase anterior debe degradarse y la ciclina de la fase siguiente debe sintetizarse (Figura
11) La proteiacutena p21 es de gran importancia en la regulacioacuten de la fase G1 esta familia
de proteiacutenas puede inhibir a la mayoriacutea de las cdks a traveacutes de su unioacuten con las
ciclinas
El supresor de tumores p21 inhibe la actividad de la enzima ADN polimerasa δ
a partir de la cual se lleva a cabo la replicacioacuten y reparacioacuten del ADN cuando existe
alguacuten dantildeo al ADN se desencadena el detenimiento de las fases G1 y G2 del ciclo y se
produce la reparacioacuten del ADN Las oncoproteiacutenas presentes en las ceacutelulas sanas
promueven sentildeales desde la superficie hasta el nuacutecleo resultando en la iniciacioacuten del
ciclo celular en ceacutelulas transformadas estas rutas de sentildealizacioacuten estaacuten
constantemente activadas (oncogenes) mientras que los mecanismos inhibitorios se
27
encuentran inactivados permanentemente (genes supresores de tumores) lo que
permite el desarrollo de la neoplasia o caacutencer
Figura 11 Ciclinas involucradas en las fases del ciclo celular Fuente Israles e Israels 2000
29 Funcioacuten de la enzima ciclooxigenasa 2 en la carcinogeacutenesis
La enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2) es tambieacuten conocida como prostaglandina
endoperoacutexido H sintasa es una enzima inducible y su transcripcioacuten se da en presencia
de estiacutemulos intra y extracelulares a partir de la expresioacuten del gen denominado de la
misma manera Actuacutea como un factor pro-inflamatorio bloquea la respuesta apoptoacutetica
en ceacutelulas tumorales y posee un papel directo en la carcinogeacutenesis por su influencia en
el crecimiento tumoral angiogeacutenesis diseminacioacuten de ceacutelulas cancerosas y metaacutestasis
(Williams et al 1999 Trifan and Hla 2003 Simmons et al 2004 Greenhough et al
2009 Fei et al 2013)
Punto de restriccioacuten
Ciclina AB
Ciclina A Ciclina E
28
El gen COX-2 se expresa en diversos tipos celulares como ceacutelulas endoteliales
musculares monocitos y fibroblastos como respuesta a factores de crecimiento
promotores tumorales hormonas y citocinas (Trifan y Hla 2003) La induccioacuten
transcripcional de la enzima COX-2 se da mediante la unioacuten de la citocina pro-
inflamatoria -el factor de necrosis tumoral alfa TNF-α- a su receptor TNF-R1 en la
membrana plasmaacutetica tras ser estimulado por estreacutes y dantildeo celular a partir de este
factor se da la activacioacuten del NF-κB y por medio de eacuteste se promueve la transcripcioacuten
de la COX-2 y fosfolipasa A2 citoplasmaacutetica (cPLA2 Williams et al 1999)
Las enzimas COX-2 y cPLA2 son las responsables de la siacutentesis de
prostaglandinas (liacutepidos activos) el proceso inicia con la accioacuten de cPLA2 que permite la
liberacioacuten de aacutecido araquidoacutenico de la membrana plasmaacutetica en forma de araquidonato
la COX-2 (funcioacuten ciclooxigenasa) introduce dos moleacuteculas de oxiacutegeno en eacuteste y se
forma la prostaglandina G2 (PGG2) el siguiente paso ocurre en otro sitio de la moleacutecula
de COX-2 (actividad peroxidasa) en donde PGG2 es reducido a prostaglandina H2
(PGH2) y a traveacutes de prostaglandinas sintasas se da la siacutentesis de las prostaglandinas
funcionales I2 y E2 (PGI2 y E2 Williams et al 1999 Smith et al 2011 Nakanishi y
Rosenberg 2013)
El gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en diversos tipos de caacutenceres entre
ellos el caacutencer cervical De acuerdo con Liao et al (2005) y Xia et al (2010) en el
adenocarcinoma cervical se presenta una sobreexpresioacuten de COX-2 de un 98 a un
100 de los casos Esta sobreexpresioacuten estaacute asociada con la evolucioacuten raacutepida del
caacutencer y se relaciona con prognosis desfavorable (Li et al 2007) en ceacutelulas tumorales
se puede presentar por induccioacuten de ciertos oncogenes como Ras y scr (Howe et al
2001) factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1
Greenhough et al 2009) y el factor de crecimiento epitelial (EGF Fosslien 2000) y
receptores celulares como el receptor del EGF (HER-2 o EGFR Ristimӓki et al 2002)
La enzima COX-2 tiene efectos en la proliferacioacuten celular de una manera
indirecta mediante la estimulacioacuten de la mitogeacutenesis en presencia del EGF debido a
29
que las prostaglandinas sintetizadas a partir de COX-2 especiacuteficamente PGE2
producen la fosforilacioacuten del EGFR y desencadena la ruta de sentildealizacioacuten extracelular
mitogeacutenica regulada por MAPK 1 que actuacutea en la fase G1 del ciclo celular permitiendo
a las ceacutelulas la entrada a la fase S (Howe et al 2001 Pai et al 2002 Donnini et al
2007 Greenhough et al 2009 Jiang y Dingledine 2013)
Asiacute mismo COX-2 posee actividad inmunosupresora por lo que disminuye el
efecto citotoacutexico de las ceacutelulas inmunoloacutegicas encargadas de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas debido a que las PGs producen la disminucioacuten de la proliferacioacuten de
ceacutelulas inmunitarias como ceacutelulas T B y natural killer La expansioacuten maacutexima del tumor
es beneficiada por las caracteriacutesticas del microambiente tumoral que involucra ceacutelulas
epiteliales y componentes estromales -tejido conectivo endotelio y linfocitos- en donde
existe una sobreexpresioacuten de COX-2 Las PGs inducen la produccioacuten de interleucina 10
que posee efectos inmunosupresores permitiendo la proliferacioacuten celular y propagacioacuten
del tumor (Williams et al 1999 Howe et al 2001)
La principal actividad de COX-2 en la progresioacuten del caacutencer es mediante la
promocioacuten de la angiogeacutenesis esto es por accioacuten de las PGs ya que regulan la
expresioacuten de factores de crecimiento como el factor de crecimiento de endotelio
vascular (VEGF) el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) y endotelina-1 mediante
estos factores se promueve la formacioacuten de nuevas redes sanguiacuteneas lo que favorece
el crecimiento de los tumores y su posible propagacioacuten a otros sitios tambieacuten llamada
metaacutestasis (Howe et al 2001 Sales et al 2001 Trifan y Hla 2003 Greenhough et al
2009)
Otro efecto observado consecuencia de la sobreexpresioacuten de COX-2 se
relaciona con la disminucioacuten de la eficacia de los tratamientos oncoloacutegicos la
radioterapia aplicada a ceacutelulas de adenocarcinoma cervical (HeLa) provoca un aumento
de la expresioacuten de COX-2 y debido a esto se presenta la resistencia de estas ceacutelulas al
tratamiento radioterapeacuteutico (Xia et al 2010) Existen quimioterapeacuteuticos como el
irinotecan doxorubicina y paclitaxel que no causan aumentos en la expresioacuten de COX-
30
2 y otros como el 5-fluorouracilo (5-FU) que causan una sobreexpresioacuten de eacutesta lo que
provoca la disminucioacuten del efecto de este quimioterapeacuteutico en las ceacutelulas cancerosas
(Trifan y Hla 2003 Mercer et al 2005)
210 Tratamiento oncoloacutegico
Para el tratamiento del caacutencer se han desarrollado diversas terapias como la
radioterapia quimioterapia cirugiacutea inmunoterapia entre otras y se seleccionan
dependiendo del tipo de caacutencer y etapa en la que se encuentre siendo las maacutes
utilizadas la radioterapia y quimioterapia (Siegel et al 2012) Este uacuteltimo tratamiento
de acuerdo con lo descrito por Escobar (2011) es la administracioacuten por viacutea intravenosa
de faacutermacos con efectos citostaacuteticos para impedir la proliferacioacuten de ceacutelulas
cancerosas en la Tabla 13 se muestra la clasificacioacuten de eacutestos seguacuten su mecanismo
de accioacuten
De manera general los agentes alquilantes contienen grupos alquiacutelicos muy
reactivos que forman uniones por medio de enlaces covalentes con los puntos
nucleoacutefilos (ricos en electrones) de compuestos orgaacutenicos en donde se sustituyen
aacutetomos de hidroacutegenos por grupos alquilo principalmente esto ocurre en aacutecidos
nucleicos proteiacutenas y fosfoliacutepidos terminando en muerte celular Por otro lado los
antimetabolitos son anaacutelogos funcionales de los metabolitos normales actuacutean
ocupando un lugar enzimaacutetico y poseen generalmente una mayor afinidad por los
sustratos enzimaacuteticos que el metabolito normal
Los faacutermacos que se fijan a la tubulina tienen como mecanismo de accioacuten la
detencioacuten de la mitosis en la metafase donde las fibras que parten de los centriolos
dispuestos en los extremos de las ceacutelulas y que intervienen en la separacioacuten de la
cromaacutetida estaacuten compuestas de microtuacutebulos formados por la proteiacutena tubulina estos
faacutermacos se unen a esta proteiacutena impidiendo su depolimerizacioacuten provocando la
desaparicioacuten de los microtuacutebulos y deteniendo la mitosis en esta fase
31
Tabla 13 Clasificacioacuten de los antineoplaacutesicos
Grupo terapeacuteutico Subgrupo terapeacuteutico Faacutermaco
Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas Ciclofosfamida
Ifosfamida
Melfalaacuten
Clorambucilo
Alquilantes atiacutepicos Dacarbazina
Antimetabolitos Antifoacutelicos Metotrexato
Antipirimidiacutenicos 5-Fluorouracilo
Citarabina (Ara-C)
Capecitabina
Gemcitabina
Antibioacuteticos Antraciclinas Doxorrubicina
Epirrubicina
Otros antibioacuteticos Mitomicina C
Bleomicina
Faacutermacos que se fijan
a la tubulina
Alcaloides de la vinca Vincristina
Vinblastina
Vinorelbina
Inhibidores de
topoisomerasas II
Etopoacutesido
Taxanos Paclitaxel
Docetaxel
Compuestos varios Derivados del platino Cisplatino
Carboplatino
Oxaliplatino
Bifosfonatos Aacutecido zoledroacutenico
Ibandronato
Otros Imatinib
Fuente modificada de Escobar 2011
32
211 Mecanismo de accioacuten del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
El 5-fluorouracilo es un quimioterapeacuteutico utilizado para el tratamiento del caacutencer
de mama cabeza cuello piel colorectal y caacutencer cervical en combinacioacuten con otros
antineoplaacutesicos (Diasio et al 1989 Longley et al 2003) Es un antimetabolito derivado
de pirimidina anaacutelogo de uracilo con un aacutetomo de fluacuteor en la posicioacuten del carbono 5 en
lugar de un aacutetomo de hiacutedrogeno por lo que es llamado fluorpirimidina (Wendling et al
2003) Este antineoplaacutesico al ingresar al organismo es metabolizado en el hiacutegado por
accioacuten de la enzima dihidropirimidin dehidrogenasa y se da la formacioacuten de
dihidrofluorouracilo (DHFU Longley et al 2003)
Basado en la descripcioacuten de Marlet-Martino et al (2002) se conoce que el 5-FU
ingresa en dos rutas metaboacutelicas la anaboacutelica en la cual se generan los metabolitos
activos 5-fluoro-2rsquo-deoxiuridin-5rsquomonofosfato (5-FdUMP) 5-fluorouridin-5rsquo-trifosfato (5-
FUTP) y 5-FUDP a traveacutes de la conjugacioacuten de 5-FUTP con carbohidratos dando lugar
a la formacioacuten de 5-FU nucleoacutetidos y la ruta cataboacutelica en donde se inactiva y se
permite su eliminacioacuten del organismo inicia con la enzima dihidropirimidin
deshidrogenasa (DPD) para la reduccioacuten del 5-FU y finalmente formar α-fluoro-β-
alanina (FBAL) el mayor catabolito de 5-FU
El 5-FU sigue tres mecanismos de accioacuten para llevar a cabo el dantildeo celular el
primer mecanismo se basa en que los fluoronucleoacutetidos formados (5-FUTP) imitan la
funcioacuten de uridina trifosfato (UTP) para ser reconocidos por la enzima ARN polimerasa y
ser incorporados a la estructura del ARN presentando actividad citotoacutexica por las
modificaciones a la estructura del ARN y su funcioacuten El segundo mecanismo es
producto de la formacioacuten de 5-FdUMP el cual inhibe la accioacuten de la enzima timidilato
sintasa (TS) involucrada en la siacutentesis de ADN dando como resultado el dantildeo letal a la
ceacutelula El tercer mecanismo es la formacioacuten de nucleoacutetidos 5-FUDP que permiten una
alteracioacuten de la funcioacuten de la membrana celular por la incorporacioacuten de eacutestas
33
212 Efectos concomitantes al tratamiento oncoloacutegico
Dos factores principales afectan el estado nutricio de los pacientes oncoloacutegicos
las alteraciones fisioloacutegicas inducidas por el tumor y el tipo de tratamiento meacutedico
aplicado el primero estaacute relacionado con alteraciones anatoacutemicas por la localizacioacuten del
tumor que conlleva a alteraciones en la ingesta de alimentos al aumento del
requerimiento caloacuterico por el incremento del gasto energeacutetico basal consecuencia del
estado cataboacutelico inherente al caacutencer y al siacutendrome caqueacutectico que desarrollan los
pacientes con caacutencer Este estado se caracteriza por el desarrollo de anorexia y un
elevado desgaste tisular que afecta particularmente al muacutesculo esqueleacutetico y al tejido
adiposo (Argileacutes et al 2006 Mestre et al 2010)
El segundo factor es promovido por efectos directos de los tratamientos de quimio
y radioterapia a tejidos sanos debido a que no tienen selectividad celular y afectan a
todos las ceacutelulas sanas de alta tasa proliferativa como ceacutelulas germinales fibroblastos
ceacutelulas del epitelio intestinal y ceacutelulas de la meacutedula oacutesea Al presentarse un dantildeo a los
tejidos sanos se desencadenan eventos moleculares que inician procesos inflamatorios
reflejaacutendose en la aparicioacuten de siacutentomas que comprometen el consumo alimentario de
los pacientes provocan una pobre absorcioacuten de nutrimentos y finalmente alteraciones
del metabolismo que dependen del tipo y dosis de los faacutermacos administrados (Argileacutes
et al 2006 Mestre et al 2010 Width y Reinhard 2010 y Escobar 2011)
Los principales efectos inherentes al tratamiento radioterapeacuteutico pueden ser de
naturaleza aguda o croacutenica dependiente de la zona y aacuterea del cuerpo sometida a
radiacioacuten de manera general se presenta anorexia y fatiga en radiacioacuten de cabeza y
cuello se presenta ageusia hipogeusia disgeusia mucositis (estomatitis y esofagitis)
disfagia odinofagia xerostomiacutea e inflamacioacuten de enciacuteas la radiacioacuten a esoacutefago y toacuterax
produce esofagitis mucositis disfagia y estenosis esofaacutegica y en radiacioacuten de abdomen
y pelvis naacuteusea voacutemito esteatorrea colitis enteritis aguda fiacutestulas malabsorcioacuten
entre otros (Width y Reinhard 2010)
34
Los efectos concomitantes a la quimioterapia maacutes reportados en la praacutectica
cliacutenica son la anorexia voacutemito mucositis diarrea estrentildeimiento peacuterdida de peso
hipogeusia disgeusia y xerostomiacutea (Width y Reinhard 2010) La mucositis oral
representa una de las mayores complicaciones encontrada en pacientes bajo
tratamiento quimio y radioterapeacuteutico En esta afectacioacuten se presenta una toxicidad
directa a la mucosa provocado por los agentes citotoacutexicos y la radiacioacuten ionizante y una
afectacioacuten indirecta provocada por la subsecuente inflamacioacuten y su empeoramiento por
neutropenia (Koumlstler et al 2001)
La presencia de bacterias patoacutegenas bacterias de la microbiota bucal hongos y
virus estaacute asociada con una mayor morbilidad causada por dolor odinodisfagia y
disgeusia en pacientes con mucositis oral (Koumlstler et al 2001) La mucositis se puede
presentar en la porcioacuten baja del sistema digestivo llamada mucositis intestinal que se
caracteriza por la peacuterdida de la integridad de la mucosa que resulta en apoptosis
generalizada y el dantildeo resultante incluye una disminucioacuten de la actividad de hidrolasas
presentes en el cepillo enzimaacutetico dantildeo al ADN y ARN de enterocitos disminucioacuten de
la proliferacioacuten celular enteacuterica y aumento de apoptosis de las ceacutelulas de las criptas
intestinales (Huang et al 2001)
Gran parte de los efectos secundarios del tratamiento oncoloacutegico son
consecuencia de una respuesta inflamatoria por el dantildeo provocado a las ceacutelulas sanas
en donde los fibroblastos juegan un papel importante debido a su ubicuidad y a sus
funciones eacutestos participan en la sentildealizacioacuten para activar proteiacutenas pro-inflamatorias
en respuesta a dantildeos en los tejidos son consideradas ceacutelulas no inmunoloacutegicas que
generan quimiocinas y sus receptores y participan en la activacioacuten de citocinas
convirtieacutendolos en participantes directos en las respuestas inflamatorias (Karlson
2007)
Un factor importante involucrado en la siacutentesis de las proteiacutenas pro-inflamatorias
es la proteiacutena CD40 y su ligando (CD40L) la sentildealizacioacuten a partir de esta proteiacutena es
esencial en la regulacioacuten de la inflamacioacuten a traveacutes de su acoplamiento con el factor
35
nuclear κappa B (NF-ĸB) el cual promueve la siacutentesis de las citocinas pro-inflamatorias
IL-1 IL-6 IL-8 y la enzima COX-2 La proteiacutena CD40 se expresa en los fibroblastos por
lo que les permite regular el comportamiento de otras ceacutelulas que expresen al ligando
de CD40 Ademaacutes de estos factores los miembros de la familia del factor de
transcripcioacuten AP-1 c-Fos y c-Jun han sido asociados con el dantildeo tisular que es iniciado
por la radiacioacuten y quimioterapia (Karlson 2007)
Los faacutermacos que afectan la siacutentesis de ADN principalmente en la fase S del
ciclo celular especiacuteficamente 5-fluorouracilo metotrexato y citarabina muestran la
mayor evidencia de toxicidad en la mucosa especiacuteficamente estomatotoxicidad (Koumlstler
et al 2001 Sonis 2004) y de acuerdo con lo reportado por Sonis (2004) los
quimioterapeacuteuticos etopoacutesido citarabina y melfalaacuten son capaces de generar un dantildeo en
el tejido mucosal especiacuteficamente en los fibroblastos Otros antineoplaacutesicos asociados
al desarrollo de la mucositis son la ciclofosfamida doxorrubicina daunorrubicina
docetaxel y paclitaxel (Ruiacutez-Esquide et al 2011)
213 Importancia de la dietoterapia en el paciente oncoloacutegico
La presencia de tumores en el organismo altera el metabolismo de proteiacutenas
hidratos de carbono liacutepidos y micronutrientes en los pacientes lo que conlleva a que la
alimentacioacuten sea un obstaacuteculo habitual en la praacutectica oncoloacutegica aunado a que la
enfermedad oncoloacutegica per se y los tratamientos meacutedicos que se administran pueden
llegar a producir un estado de malnutricioacuten caloacuterico-proteacuteico como resultado de todos
los efectos concomitantes mencionados en el apartado anterior (Libro consenso de
nutricioacuten 2008) Lo anterior compromete el estado nutricio del paciente (Calixto-Lima et
al 2012) y se relaciona con la baja eficacia del tratamiento meacutedico (San Mauro et al
2013)
Por esa razoacuten la terapia nutricional o dietoterapia es la viacutea proveedora de
nutrimentos para mantener el peso corporal conservar la integridad de los tejidos y
mantener el sistema inmunoloacutegico funcional de los pacientes oncoloacutegicos y no soacutelo se
36
debe considerar importante en el aspecto preventivo de esta enfermedad (San Mauro et
al 2013) Es importante valorar como parte de la intervencioacuten nutricional las limitantes
anatoacutemicas y fisioloacutegicas de los pacientes para asiacute proporcionar una terapia integral
para mantener y mejorar el estado nutricional del paciente oncoloacutegico y reducir
significativamente los efectos inherentes al tratamiento meacutedico y a la enfermedad (Libro
consenso de nutricioacuten 2008 Calixto-Lima et al 2012)
En la revisioacuten bibliograacutefica realizada por Calixto-Lima et al (2012) consideran
que es necesario realizar modificaciones en la dieta para evitar o atenuar los siacutentomas y
efectos frecuentes dentro de estas recomendaciones mencionan el ofrecer los
alimentos en fracciones pequentildeas distribuidas a lo largo del diacutea preferir comidas con
elevado contenido proteico y caloacuterico a temperatura ambiente evitando temperaturas
bajas o elevadas evitar alimentos irritantes como sazonadores y picantes Asiacute mismo
ofrecer alimentos con consistencias maacutes suaves como pureacutes cremas y jugos para
favorecer la masticacioacuten y deglucioacuten y hacer eacutenfasis en la importancia de un alto
consumo de liacutequidos para disminuir los riesgos de deshidratacioacuten
Ademaacutes de los beneficios que conlleva el tratamiento dietoterapeacuteutico por la
influencia de los macro y micronutrientes en el mejoramiento del estado nutricio del
paciente en los uacuteltimos antildeos el impacto de la dieta y compuestos derivados de los
alimentos han ganado la atencioacuten de los investigadores debido a la identificacioacuten de
compuestos bioactivos que se encuentran naturalmente en los productos dieteacuteticos y el
estudio de su actividad como quimiopreventivos Idealmente se espera de los
compuestos bioactivos que impidan el crecimiento de ceacutelulas cancerosas o pre
neoplaacutesicas mientras que minimicen la toxicidad en el tejido normal (Neergheen et al
2012)
214 Efecto antiproliferativo de los polifenoles provenientes de la dieta
El consumo de alimentos y bebidas ricos en polifenoles se asocia con una menor
incidencia de padecer diferentes tipos de caacutenceres este posible efecto se relaciona con
37
su contenido de polifenoles como quercetina kaempferol aacutecido elaacutegico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico se sugiere que las diferentes combinaciones de estos
compuestos encontrados en los frutos aumentan los efectos anticarcinogeacutenicos debido
a una actividad sineacutergica (Li et al 2013) Los aacutecidos fenoacutelicos tienen efecto
antiproliferativo de acuerdo con Kampa et al (2003) esto es evidente incluso a bajas
concentraciones similares a aqueacutellas que han sido encontradas en anaacutelisis a muestras
de fluidos bioloacutegicos despueacutes del consumo de polifenoles a traveacutes de la dieta
Los polifenoles intervienen en diversas fases del desarrollo del caacutencer como la
iniciacioacuten promocioacuten y progresioacuten Sin embargo el efecto de estos compuestos
depende del tipo celular dosis y tipo de los polifenoles (Tabla 14 Ramos 2008) En el
caso de la quercetina genisteiacutena apigenina diosmetina y diferentes antocianidinas han
demostrado tener un papel importante en la inhibicioacuten del factor de transcripcioacuten NF-
ĸB el cual es activado por radicales libres estiacutemulos inflamatorios radiaciones UV X y
γ ademaacutes de tener un papel importante en la iniciacioacuten y progresioacuten de las
enfermedades oncoloacutegicas (Aacutelvarez 2010)
Existen polifenoles que propician el detenimiento del ciclo celular de las ceacutelulas
cancerosas como la epigalocatequina-3-galato (EGCG) proveniente del teacute verde eacuteste
promueve el detenimiento del ciclo celular en la fase G1 mediante la represioacuten de la
ciclina D E las cinasas CDK1 CDK2 CDK4 y el antiacutegeno nuclear de ceacutelulas en
proliferacioacuten (PCNA) en ceacutelulas de caacutencer de mama y caacutencer cervical este polifenol
tambieacuten es capaz de inhibir la degradacioacuten de la proteiacutena del retinoblastoma (pRb) p21
p27 y p53 (viacutea proteasoma-ubiquitina) en caacutencer de mama vejiga y ceacutelulas de caacutencer
prostaacutetico (Ramos et al 2008)
El polifenol EGCG provoca la disminucioacuten de las ciclinas D1 y las cinasas CDK4
y CDK6 lo que promueve el detenimiento del ciclo celular en las fases G0 y G1 en una
liacutenea de caacutencer epidermal la proliferacioacuten celular es inhibida por la induccioacuten del
oncogen Ras con lo que se bloquea la transicioacuten del ciclo celular a la fase G1 Las
antocianinas interrumpen el ciclo celular mediante el incremento de la expresioacuten de p21
38
asiacute como el aacutecido elaacutegico y quercetina que promueven el incremento de supresor
tumoral p53 (Ramos et al 2008)
Tabla 14 Evidencia del efecto de los polifenoles en la carcinogeacutenesis
POLIFENOL TIPO CELULAR EFECTO O MECANISMO DE
ACCIOacuteN
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama y caacutencer
cervical
Represioacuten de ciclina D E y las
ciclinas quinasas dependientes
CDK1 CDK2 y CDK4
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer de
mama vejiga y
caacutencer prostaacutetico
Inhibicioacuten de la degradacioacuten de la
proteiacutena de retinoblastoma (pRb)
p21 p27 y p53
Epigalocatequina-3-
galato
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Disminucioacuten de las ciclinas D1 y
CDK4 y CDK6 promueve el
detenimiento de las fases G0 y G1
Antocianinas aacutecido
elaacutegico y quercetina
Ceacutelulas de caacutencer
epidermal
Incremento en la expresioacuten de p21 y
p53
Epigalocatequina-3-
galato (extracto
polifenoacutelico completo de
teacute verde)
Ceacutelulas de
osteosarcomas
Detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1
Extracto de Araucaria
angustifolia (catequina
epicatequina rutina
quercetina apigenina)
Liacutenea celular de
caacutencer de laringe
HEp-2
Inhibicioacuten de la proteiacutena SIRT3 en
ceacutelulas tumorales provocando la
apoptosis de ceacutelulas tumorales
Polifenoles metilados
(aacutecido feruacutelico orcinol
aacutecido vaniacutelico trimetin
tricina y selgina)
Ceacutelulas de
adenocarcinoma
alveolar (A-549) y
pancreaacutetico
(INS38312)
Presentan un efecto citotoacutexico
selectivo en ceacutelulas tumorales en
contraste con la liacutenea celular de
fibroblastos normales NIH-3T3
39
Las ceacutelulas tumorales han mostrado tener una mayor sensibilidad a los cambios
producidos por los polifenoles que las ceacutelulas normales el extracto de polifenoles
contenidos en el teacute verde inhibe el crecimiento celular y dependiendo de la dosis
administrada producen alteraciones morfoloacutegicas detencioacuten del ciclo celular en las
fases G0 y G1 e induce apoptosis en ceacutelulas humanas de osteosarcoma pero no en
osteoblastos normales de ratoacuten (Ramos et al 2008)
En un estudio realizado por Branco et al (2015) en donde utilizaron un extracto
rico en polifenoles de pino Brasil (Araucaria angustifolia) obtuvieron una alta
citotoxicidad en ceacutelulas de caacutencer de laringe HEp-2 con un miacutenimo efecto en ceacutelulas
normales HEK-293 este extracto contiene los polifenoles catequina epicatequina
rutina quercetina apigenina 4rsquo-metoxitectorigenina y 3-glucoacutesido-dihidroquercetina
Este grupo de investigacioacuten describe un mecanismo de accioacuten de los polifenoles para
poder elucidar el efecto selectivo de eacutestos en la citotoxicidad de ceacutelulas tumorales que
estaacute relacionado directamente con la actividad mitocondrial
La mitocondria ademaacutes de la generacioacuten de ATP y control de la homeostasis
redox modula el flujo de calcio a traveacutes de la ceacutelula e interviene en la ruta intriacutenseca de
la apoptosis La funcioacuten mitocondrial depende del mantenimiento y dinaacutemica de este
organelo cualquier disrupcioacuten en este balance puede causar una disfuncioacuten
mitocondrial que puede deberse a un desbalance de la homeostasis del calcio
deficiencia de generacioacuten de ATP y una aumentada generacioacuten de EROs a traveacutes de la
cadena de transporte de electrones (ETC) la cual induce a la formacioacuten del poro de
transicioacuten de permeabilidad mitocondrial (MPTP) favoreciendo el dantildeo a este organelo
El complejo I de la ETC tambieacuten llamado NADH ubiquinona oxidoreductasa se
encuentra dentro de los mayores sitios de formacioacuten del radical anioacuten superoacutexido (O2-)
uno de las ERO maacutes comunes eacuteste puede ser dismutado por la accioacuten de la enzima
antioxidante superoxido dismutasa (SOD) para producir peroacutexido de hidroacutegeno para lo
que la mitocondria posee una enzima SOD especiacutefica la MnSOD que se encuentra en
40
la matriz mitocondrial Altos niveles de EROs favorece el inicio del proceso apoptoacutetico
intriacutenseco el cual es regulado por la mitocondria
El proceso apoptoacutetico intriacutenseco es iniciado por la liberacioacuten del citocromo C (Cyt
C) dentro del citosol lo cual ocurre frecuentemente como resultado de la
permeabilizacioacuten de la membrana mitocondrial inducido por la formacioacuten del MPTP y
permite la iniciacioacuten del proceso de apoptosis y la muerte celular En este contexto el
grupo de investigacioacuten citado encontroacute que los polifenoles inhiben la actividad del
complejo I de la ETC con la subsecuente deplecioacuten en la siacutentesis de ATP permitiendo
la muerte celular viacutea apoptosis en contraste los polifenoles no producen la reduccioacuten
de los niveles de ATP en las ceacutelulas normales debido a que se produce un dantildeo miacutenimo
en la actividad del complejo I y la viabilidad celular es mantenida
La diferencia en citotoxicidad en ceacutelulas tumorales respecto a ceacutelulas normales
es posiblemente debido a diferencias en la modulacioacuten de unas proteiacutenas llamadas
sirtuinas que estaacuten implicadas en numerosos procesos bioloacutegicos y son moleacuteculas
mensajeras que regulan el estado metaboacutelico celular en respuesta a condiciones de
estreacutes de las sirtuinas mitocondriales conocidas (SIRT3 SIRT4 y SIRT5) la SIRT3
especiacuteficamente es responsable del mantenimiento de la mitocondria para producir
energiacutea mediante el metabolismo oxidativo
La proteiacutena SIRT3 activa la ETC que como se ha descrito anteriormente
participa en el mantenimiento de los niveles de ATP esta proteiacutena tambieacuten participa en
la expresioacuten del Cyt C otro importante componente de la ETC asiacute como de la
activacioacuten de la enzima antioxidante MnSOD Los polifenoles disminuyen o inhiben la
proteiacutena SIRT3 en las ceacutelulas tumorales resultando en una disminucioacuten de la respuesta
antioxidante lo que permite el aumento de EROs asiacute se inhibe a la ETC y a traveacutes de
las ERO se inicia la apoptosis de ceacutelulas tumorales en las ceacutelulas normales la actividad
antioxidante es mantenida previniendo el dantildeo oxidativo
41
Dentro de los antecedentes sobre el efecto selectivo de los polifenoles Moheb et
al (2013) evaluaron el efecto de 13 compuestos fenoacutelicos metilados en la proliferacioacuten
de dos liacuteneas celulares de caacutencer adenocarcinoma alveolar (A-549) y pancreaacutetico
(INS38312) y una liacutenea celular de fibroblastos normales de ratoacuten (NIH-3T3) La
proliferacioacuten fue evaluada mediante el meacutetodo lactato deshidrogenasa (LDH) expresada
en porcentaje de mortalidad en donde diferentes concentraciones de los compuestos
metilados purificados fueron evaluadas (25 5 75 15 30 and 45 microM) en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h
En este estudio concluyeron que los compuestos polifenoacutelicos metilados
presentan una actividad citotoacutexica selectiva ya que el porcentaje de mortalidad de las
ceacutelulas tumorales tratadas con los 13 compuestos estuvo en el intervalo de 59 a 94 y
la mortalidad de los fibroblastos abarcoacute del 11 al 23 Los polifenoles que presentaron
una mayor selectividad fueron el aacutecido feruacutelico (71 de mortalidad en liacuteneas tumorales
y 17 en fibroblastos) y trimetil-tricetin (94 de mortalidad en liacuteneas tumorales y 15
en fibroblastos)
215 Efecto inhibitorio de los polifenoles en la expresioacuten de COX-2
Flavonoides como kaempferol miricetina escutelarina y apigenina inhiben
diferentes isoformas de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2) la cual provoca la liberacioacuten del
aacutecido araquidoacutenico de los fosfoliacutepidos de la membrana celular especiacuteficamente la
quercetina inhibe de forma selectiva la isozima sPLA2 ndash IIA que se sobreexpresa
durante procesos inflamatorios Los polifenoles son capaces de inhibir la expresioacuten de
COX-2 a nivel transcripcional es decir la siacutentesis del ARN mensajero (ARNm) que
mantiene la secuencia de ADN del gen como la luteolina genisteiacutena kaempferol
procianidinas crisina resveratrol galangina y la apigenina y a nivel enzimaacutetico como la
quercetina y EGCG (Ramos 2008)
Desde 1999 se ha estudiado el efecto de los flavonoides en la expresioacuten del gen
COX-2 en una investigacioacuten realizada por Liang et al estimularon la expresioacuten de este
42
gen mediante lipopolisacaacuteridos (LPS) en macroacutefagos de ratoacuten y evaluaron el efecto de
los flavonoides apigenina ECCG genisteiacutena kaempferol miricetina y quercetina a
concentraciones de 1 5 15 y 25 microM encontrando que el efecto es dependiente de la
dosis en donde concentraciones de apigenina de 5 15 y 15 microM 15 y 25 microM de
genisteiacutena y 15 y 25 microM de kaempferol disminuyeron significativamente la expresioacuten de
COX-2
En el antildeo 2004 OrsquoLeary et al probaron el efecto de un estaacutendar de quercetina
conjugados de quercetina quercetin 3-glucoroacutenido quercetin 3rsquo-sulfato y
3rsquometilquercetina 3-glucoroacutenido -eacutestos han sido encontrados en el plasma sanguiacuteneo- y
vitamina E (α-tocoferol α-tocoferol acetato y γ-tocoferol) El estudio fue realizado en
ceacutelulas de caacutencer de colon (Caco2) para ello estimularon la expresioacuten de COX-2 a
traveacutes de la citocina interleucina-1β El estaacutendar de quercetina y 3rsquometilquercetin-3-
glucuronido no tuvieron un efecto inhibitorio de la expresioacuten de COX-2 de manera
significativa mientras que quercetin 3rsquo-sulfato y quercetin 3-glucoroacutenido inhibieron de
manera significativa la expresioacuten de COX-2
43
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Como resultado del aumento en la incidencia de procesos patoloacutegicos croacutenicos
especiacuteficamente las enfermedades oncoloacutegicas se han desarrollado terapias meacutedicas
como la quimioterapia y radioterapia Sin embargo debido a la inespecificidad celular
de estos tratamientos no soacutelo afectan a ceacutelulas tumorales sino a ceacutelulas sanas de alta
tasa proliferativa generando efectos secundarios al tratamiento oncoloacutegico
Especiacuteficamente el antineoplaacutesico 5-fluorouracilo (5-FU) ha mostrado una alta
incidencia de siacutentomas concomitantes a su uso como mucositis voacutemito naacuteusea y
anorexia
Aunado a lo anterior el 5-FU provoca un aumento en la expresioacuten del gen COX-2
en las ceacutelulas normales este gen participa de manera indirecta en el crecimiento
tumoral mediante la inhibicioacuten del sistema inmunoloacutegico capaz de dantildear a las ceacutelulas
cancerosas y en la diseminacioacuten tumoral mediante la expresioacuten de proteiacutenas que
participan en la angiogeacutenesis En los tipos de caacutenceres en los que se presenta la
sobreexpresioacuten del gen COX-2 como en el caacutencer cervical debido a los efectos de eacuteste
en la progresioacuten del caacutencer se relaciona con una prognosis desfavorable para los
pacientes
Por la creciente necesidad de desarrollar terapias oncoloacutegicas maacutes selectivas
se propuso el estudio in vitro del jugo de capuliacuten El capuliacuten contiene compuestos
fenoacutelicos que en forma purificada han mostrado inhibir factores promotores del
crecimiento tumoral entre ellos el gen ciclooxigenasa-2 afectando en menor medida la
proliferacioacuten de las ceacutelulas normales Con lo anterior se pretende obtener informacioacuten
que permita proponer a este fruto como parte de la dietoterapia de pacientes
oncoloacutegicos para mejorar la calidad de vida de eacutestos
44
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten celular y expresioacuten
del gen ciclooxigenasa-2 en ceacutelulas de caacutencer cervical y fibroblastos tratados con el
quimioterapeacuteutico 5-flurouracilo
42 Objetivos especiacuteficos
Cuantificar el contenido de polifenoles totales y flavonoides del jugo de capuliacuten para
conocer la concentracioacuten aplicada a las liacuteneas celulares
Determinar la actividad antioxidante del jugo de capuliacuten para conocer su posible efecto
ante radicales libres
Estudiar el efecto sineacutergico del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas de caacutencer
cervical HeLa y fibroblastos NIH-3T3 para establecer si existe selectividad en el
crecimiento de ceacutelulas tumorales tratadas con el quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo
Evaluar el impacto del jugo de capuliacuten en la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en las
liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
45
5 HIPOacuteTESIS
El tratamiento con jugo de capuliacuten disminuye la expresioacuten del gen ciclooxigenasa-2 en
las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3 tratadas con 5-Fluorouracilo inhibiendo
selectivamente la proliferacioacuten de ceacutelulas cancerosas en cultivos in vitro
46
6 MATERIALES Y MEacuteTODOS
61 Materia prima
611 Fruto
El fruto fue obtenido del municipio de las Vigas Veracruz recolectado entre los
meses de junio y agosto del 2014 o a partir de los 66 diacuteas despueacutes de la floracioacuten del
aacuterbol esto de acuerdo con la bibliografiacutea consultada en la que se reporta una mayor
concentracioacuten de compuestos fenoacutelicos en este tiempo Los frutos fueron seleccionados
por muestreo aleatorio simple de un total de 10 aacuterboles se seleccionoacute de acuerdo con
su apariencia para lo que observoacute que no presentara crecimiento de hongos y que la
caacutescara no presentara lesiones El fruto fue Identificado como Prunus serotina subsp
capuli por el Bioacutel Miguel Armando Loacutepez Ramiacuterez director e investigador del Instituto
de investigaciones forestales (INIFOR) de la Universidad Veracruzana
612 Liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
Se utilizoacute la liacutenea celular HeLa (Figura 12) proporcionada por el laboratorio de
cultivo celular del posgrado de ciencias genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la
Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de tejido humano extraiacutedo de adenocarcinoma
cervical y son ceacutelulas epiteliales adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto
en glucosa complementado con 10 de suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico
penicilina-estroptomicina incubadas a 37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 3 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 90 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute tres veces por semana y se siguioacute el cuidado de los cultivos de
acuerdo con lo indicado por la ATCC (HeLa ATCCreg CCL2trade)
La liacutenea celular fibroblaacutestica NIH-3T3 utilizada en esta investigacioacuten (Figura 13)
fue proporcionada por el laboratorio de cultivo celular del posgrado de ciencias
47
genoacutemicas de la Universidad Autoacutenoma de la Ciudad de Meacutexico La liacutenea se deriva de
embrioacuten de ratoacuten de la especie Mus musculus las cuales tienen caracteriacutesticas
adherentes Se sembroacute en medio de cultivo DMEM alto en glucosa suplementado con
10 suero fetal de bovino y 1 de antibioacutetico penicilina-estroptomicina incubadas a
37degC y CO2 al 5 humidificado
Las ceacutelulas se mantuvieron en cultivos durante el tiempo de desarrollo de los
experimentos los subcultivos fueron sembrados a una proporcioacuten de 5 x 103 ceacutelcm2
transfiriendo a nuevos subcultivos al llegar al 70 de confluencia El cambio de medio
de cultivo se realizoacute dos veces por semana y se siguioacute el cuidado del cultivo de acuerdo
con lo indicado por la ATCC (Fibroblastos NIH-3T3 ATCCreg 1658 trade)
Figura 12 Ceacutelulas HeLa a baja y alta densidad Fuente HeLa (ATCCreg CCL2trade)
Baja densidad Alta densidad
48
Figura 13 Fibroblastos NIH-3T3 a baja y alta densidad celular Fuente Fibroblastos NIH-3T3 (ATCCreg 1658 trade)
62 Reactivos
Para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de polifenoles se utilizaron los reactivos
Folin-Ciocalteu 2N (F9252 Sigma-Aldrich) aacutecido foacutermico (JT Baker) acetonitrilo (JT
Baker) metanol grado HPLC (JT Baker) Para los ensayos de proliferacioacuten celular se
emplearon el medio de cultivo DMEM alto en glucosa (GIBCO No 12800-058) suero
fetal bovino (FBS GIBCO) tripsina 1250 (GIBCO) dimetil sulfoacutexido DMSO (Sigma)
aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) alamarBlue reg (AbD Serotec) MTT tetrazolium
(Microgen)
Para los ensayos de biologiacutea molecular se empleoacute cloroformo 2-propanol y
etanol grado biologiacutea molecular (Sigma- Aldrich) agua libre de nucleasas (Bio-rad)
TRIzolreg (Life technologies) master mix para PCR (Bio-rad) bromuro de etidio grado
biotecnoloacutegico (Solarbio) y agarosa de grado analiacutetico (Promega cat V3125)
Baja densidad Alta densidad
49
63 Meacutetodos y teacutecnicas
631 Determinacioacuten de soacutelidos solubles totales pH y humedad
Para la reconstitucioacuten del jugo de capuliacuten conocer el pH del fruto y el caacutelculo del
contenido de los compuestos de intereacutes en base seca se determinaron los soacutelidos
solubles totales el pH y el porcentaje de humedad del fruto Para la determinacioacuten de
soacutelidos solubles totales se utilizoacute un refractoacutemetro ATAGO Modelo NART-1T y los
soacutelidos solubles totales fueron expresados como grados brix (degBrix) Para la
determinacioacuten del pH del jugo y fruto se utilizoacute un potencioacutemetro modelo HANNA
Instruments HI 4521 La determinacioacuten del porcentaje de humedad se realizoacute seguacuten lo
propuesto por el meacutetodo de la AOAC y el porcentaje de humedad se calculoacute mediante
las Ecuaciones 1 y 2 (Martines y Lira 2010)
119867119887119904 =1198981198672119874
119898119878lowast 100
(1)
donde
Hbs = porcentaje de humedad en base seca
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa seca del fruto
119867119887ℎ =1198981198672119874
119898ℎlowast 100
(2)
donde
Hbh = porcentaje de humedad en base huacutemeda
mH2O = masa de agua contenida en el fruto
ms = masa total del fruto
50
632 Obtencioacuten de extractos de fruto y jugo de capuliacuten
Extracto de fruto y jugo de capuliacuten para la cuantificacioacuten e identificacioacuten de
polifenoles
La obtencioacuten del extracto para la cuantificacioacuten de polifenoles totales y
flavonoides del fruto fresco se realizoacute mediante el meacutetodo empleado por Zamudio en el
2011 en el cual se pesaron 10 g de fruto de capuliacuten (pulpa y piel) utilizando el sistema
de extraccioacuten metanol-agua (100 mL) al 80 (vv) acidificado a pH 25 con HCI
sometiendo a agitacioacuten magneacutetica durante 2 h protegido de la luz Posteriormente se
decantoacute y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 minutos y se separoacute el sobrenadante
por filtracioacuten con papel Whatman No 5 Para el anaacutelisis de jugo fresco de capuliacuten se
realizoacute una dilucioacuten en metanol al 80 bajo las mismas condiciones que lo realizado
para el fruto
Para la identificacioacuten de compuestos por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC) se pesoacute 1 g de fruto (pulpa y piel) homogeneizado y de jugo liofilizado y se
preparoacute una solucioacuten de metanol al 80 y aacutecido foacutermico al 2 de acuerdo con lo
reportado por Luna et al (2013) Las soluciones aforadas a 10 mL fueron agitadas a
temperatura ambiente durante 30 min en un bantildeo ultrasoacutenico posteriormente fueron
centrifugadas a 12000 g por 15 min a 5 degC filtradas y almacenadas protegidas de la luz
a -20 degC
Extraccioacuten de jugo de capuliacuten para pruebas bioloacutegicas
El fruto obtenido se desinfectoacute en una solucioacuten de hipoclorito de sodio al 01
se dejoacute secar a temperatura ambiente y se retiroacute la semilla para la elaboracioacuten del jugo
el cual se obtuvo mediante maceracioacuten del fruto sin semilla y posteriormente se filtroacute
para eliminar los soacutelidos se clarificoacute el jugo obtenido mediante centrifugacioacuten a 6000
rpm durante 20 minutos a 25 degC y se filtroacute utilizando papel whatman No4
51
Una vez obtenido el jugo de capuliacuten se almacenoacute en ultracongelacioacuten (-80 degC)
durante 24 oacute 48 h en placas con un grosor maacuteximo de 05 cm para ser liofilizado en un
liofilizador marca Labconco El jugo ultracongelado se mantuvo en el equipo
aproximadamente 30 h hasta que la presioacuten registrada en el equipo no mostroacute
variaciones El jugo liofilizado se empacoacute al vaciacuteo en lotes de 4 g y se colocoacute en
congelacioacuten (-20 degC) hasta su uso
Para la realizacioacuten de las pruebas bioloacutegicas el jugo liofilizado se reconstituyoacute
con la cantidad de agua que permitioacute conservar los degBrix contenidos en el jugo fresco
de acuerdo con el CODEX alimentarius se diluyoacute en una proporcioacuten 14 (pv) con agua
destilada se colocoacute en agitacioacuten magneacutetica por 15 min se llevoacute a un pH de 73 - 75
(Xu et al 2003) se centrifugoacute a 4500 rpm por 10 min a 4 degC y finalmente se esterilizoacute
mediante filtracioacuten a traveacutes de una unidad de filtrado de 022 microm (Boivin et al 2007)
633 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de capuliacuten descritos para la
cuantificacioacuten de polifenoles (apartado 1321) se analizaron mediante un barrido
espectrofotomeacutetrico ultravioleta-visible (UV-vis) con arreglo de diodos Agilent Mod 8453
a longitudes de onda de 200 a 700 nm para determinar a queacute longitudes se obtienen los
picos de maacutexima absorcioacuten para lo que los extractos se colocaron en la celda del
espectrofotoacutemetro y se hizo incidir la luz UV-vis y se obtuvieron las lecturas de la
absorbancia de cada muestra
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
La cuantificacioacuten de polifenoles totales se realizoacute mediante el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico de Folin-Ciocalteu utilizando aacutecido gaacutelico como estaacutendar tal
reactivo tiene una coloracioacuten amarilla que en presencia de un grupo fenol se torna azul
la intensidad del color azul se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 765 nm para lo que se
52
disolvieron 100 mg de estaacutendar de aacutecido gaacutelico en 50 mL de mezcla metanol-agua
5050 (vv) para la realizacioacuten de la curva patroacuten
Aliacutecuotas de 10 20 30 40 y 50 microL de esta solucioacuten fueron tomadas y se
colocaron en tubos de ensayo protegidos de la luz posteriormente se adicionaron 15
mL de agua destilada y 100 microL de reactivo de Folin-Ciocalteu y se mezcloacute en un voacutertex
Fisher modelo genie 2 durante 5 minutos se agregaron 300 microL de Na2CO3 al 10 (pv)
hasta completar un volumen de 3 mL con agua destilada finalmente se incuboacute durante
2h a 20 degC y se midioacute la absorbancia para obtener la curva patroacuten a 765 nm
Las absorbancias de las muestras del extracto metanoacutelico (20 microL) del fruto
fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten se determinaron y se calculoacute la
concentracioacuten de polifenoles totales mediante la interpolacioacuten de los valores de la curva
patroacuten el experimento se realizoacute por triplicado y el total de polifenoles se reportoacute como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico100 g de pulpa fresca (mgEAG100 g) 100 mL de jugo
fresco y 100 g de jugo liofilizado (Zamudio 2011)
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se calculoacute mediante el meacutetodo colorimeacutetrico de
Zhishen modificado por Zamudio (2011) el cual se basa en la cuantificacioacuten de
catequina para la preparacioacuten de la curva patroacuten Se disolvieron 100 mg de catequina
en 100 mL de metanol se tomaron aliacutecuotas de 50 100 150 200 y 250 microL de esta
solucioacuten a las que se les adicionaron 1250 microL de agua destilada y 75microL de NaNO2 al 5
se agitaron durante 5 minutos posteriormente se agregaron 150 microL de NaOH 1M
completando un volumen total de 3 mL con agua destilada
Para cuantificar los flavonoides de los extractos metanoacutelicos se tomaron 250 microL
de cada muestra y se determinaron las concentraciones de flavonoides interpolando los
valores de la curva patroacuten obteniendo la absorbancia a una longitud de onda de 510
nm La concentracioacuten de flavonoides totales se expresoacute como mg equivalentes de
53
catequina por cada 100 g de pulpa fresca (mgEC100 g) 100 mL de jugo fresco y 100
g de jugo liofilizado
Identificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten
(HPLC)
El anaacutelisis de los compuestos polifenoacutelicos del capuliacuten fueron realizados en un
equipo de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) utilizando para la separacioacuten
de los compuestos una columna C18 fase reversa con un sistema de elucioacuten de aacutecido
aceacutetico al 2 (solvente A) y acetonitrilo (solvente B) El gradiente de elucioacuten fue de 2 a
100 (B) de 0 a 25 min con una velocidad de flujo de 05 mLmin a 25 degC Se
emplearon los estaacutendares kaempferol quercetina y cianidina marca Sigma utilizando
soluciones a concentraciones conocidas de eacutestos
634 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (60 min)
La actividad antioxidante del fruto y jugo de capuliacuten se determinoacute mediante el
meacutetodo 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical de acuerdo con las
modificaciones propuestas por Floegel et al (2011) A partir de este meacutetodo se puede
determinar la capacidad de captacioacuten de radicales libres de los compuestos
antioxidantes contenidos en el alimento a los 60 min Se preparoacute una solucioacuten estaacutendar
en donde se disolvieron 12 mg de DPPH en 50 mL de metanol a partir de eacutesta se
preparoacute una solucioacuten de trabajo en donde se tomaron 38 mL de la solucioacuten estaacutendar y
se disolvieron en 183 mL de metanol Se midioacute la absorbancia a una longitud de onda
517 nm para corroborar que la absorbancia de la solucioacuten fuera de 1 plusmn 002
De los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo se tomaron 075 mL (10 mgmL) y
se hicieron reaccionar con 125 mL de la solucioacuten de trabajo de DPPH por 60 min
protegidos de la luz una vez transcurrido el tiempo se realizoacute una lectura de la
absorbancia en un espectrofotoacutemetro UV-Vis a una longitud de onda de 517 nm se
54
utilizoacute como blanco metanol el blanco de la muestra se preparoacute con 075 mL de los
extractos metanoacutelicos y 125 mL de metanol El patroacuten de referencia se preparoacute con
075 mL de agua destilada y 125 mL de la solucioacuten de trabajo DPPH en tres
experimentos independientes Con las absorbancias obtenidas se determinoacute el
porcentaje de captacioacuten de radicales libres mediante la Ecuacioacuten 3
119862119886119901119905119886119888119894oacute119899 119889119890 119903119886119889119894119888119886119897119890119904 = 1 minus1198602 minus 1198603
1198601lowast 100
(3)
donde
A1= absorbancia del patroacuten de referencia
A2= absorbancia de la muestra
A3= absorbancia del blanco de muestra
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH (24 h)
El ensayo de actividad antioxidante mediante DPPH que se basa en la
neutralizacioacuten de radicales libres por transferencia de H+ provenientes de sustancias
antioxidantes en este caso los polifenoles se realizoacute utilizando el reactivo 11-diphenyl-
2-picrylhydrazyl (DPPH) en su forma radical basado en el meacutetodo reportado por
Thaipoing et al 2006 el cual es tomado de Brand-Williams et al 1995 con algunas
modificaciones Con esta metodologiacutea se reporta la actividad antioxidante a las 24 h de
interaccioacuten con el reactivo en su forma radical expresado en microM equivalentes de trolox
A partir de una solucioacuten ldquostockrdquo fue realizado el ensayo preparada con 24 mg de
DPPH en 100 mL de metanol y almacenada a -20 degC hasta su utilizacioacuten A partir de
eacutesta se preparoacute la solucioacuten de trabajo conteniendo 10 mL de la solucioacuten stock y 45 mL
de metanol hasta obtener una absorbancia de 11 plusmn 002 a una longitud de onda de
515 nm usando un espectrofotoacutemetro Los extractos metanoacutelicos del fruto y jugo de
55
capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten de trabajo de
DPPH durante 24 h protegidos de la luz
Transcurrido este tiempo se realizoacute la lectura de la absorbancia a una longitud de
onda de 515 nm para calcular la actividad antioxidante mediante este meacutetodo se
realizoacute una curva patroacuten de trolox anaacutelogo de la vitamina E con un rango de
concentracioacuten de 300 a 900 microM los resultados fueron expresados en microM equivalentes
de trolox (ET) por 100 g de fruto fresco 100 mL de jugo de capuliacuten o 100 g de jugo
liofilizado
Ensayo de actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
La actividad antioxidante se evaluoacute mediante otra metodologiacutea FRAP propuesta
originalmente por Benzie y Strain y modificada por Thaipoing et al (2006) cuyo
principio se basa en la reduccioacuten de un complejo de tripiridiltriazin feacuterrico por la
donacioacuten de electrones de los compuestos antioxidantes agregados a una forma
coloreada La solucioacuten FRAP se preparoacute a partir de 25 mL de 10 mmolL de TPTZ en
40 mmolL de HCl maacutes 25 mL de 20 mmolL de FeCl3 hexahidratado y 25 mL 03 molL
de buffer acetato a un pH de 36
Los extractos metanoacutelicos del fruto las soluciones diluidas del jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten (150 microL) se hicieron reaccionar con 2850 mL de la solucioacuten FRAP
durante 30 min protegidos de la luz a 37 degC la lectura de la absorbancia del producto
coloreado fue realizada a una longitud de onda de 593 nm se realizoacute una curva
estaacutendar utilizando el anaacutelogo de vitamina E trolox a concentraciones de 100 a 800
microM los resultados fueron expresados como microM ET por 100 g de fruto fresco 100 mL de
jugo fresco y 100 g de jugo liofilizado
56
635 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo azul alamar
El ensayo con el reactivo azul alamar que se realizoacute inicialmente tuvo como
objetivo conocer cuaacutel es la densidad celular oacuteptima y el tiempo de incubacioacuten necesario
con el reactivo para cada liacutenea celular para la realizacioacuten de los experimentos
subsecuentes Las variables consideradas fueron el tiempo de incubacioacuten (0 h 30 min
2 3 4 20 y 48 h) y las densidad celular (1 5 10 15 y 20 x 103 ceacutelulas por pozo) para
cada liacutenea celular Se manejoacute un blanco (soacutelo medio de cultivo) y un control negativo
(medio de cultivo maacutes el reactivo azul alamar)
El experimento se realizoacute en placas de 96 pozos se sembraron las diferentes
densidades celulares y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas en un tiempo de
incubacioacuten de 24 h Al finalizar el tiempo de adaptacioacuten se adicionaron 10 microL del
reactivo azul alamar por pozo (volumen final 110 microL por pozo) y se protegioacute la placa de
la luz directa Una vez agregado el reactivo a la totalidad de pozos se midioacute la
absorbancia a las longitudes de onda de 570 y 630 nm a las 0 h 30 min 2 3 4 20 y 48
h
El porcentaje de reduccioacuten del reactivo se calculoacute tomando lo datos de las
absorbancias de los pozos de los diferentes tratamientos a 570 y 630 nm para ello se
obtuvo el factor de correccioacuten calculado a partir del valor de la absorbancia del medio
de cultivo celular maacutes 10 del reactivo azul alamar (AO570) y la absorbancia del medio
de cultivo solo (AO630) Se consideroacute como blanco el medio de cultivo y se utilizoacute la
siguiente ecuacioacuten para todos los datos obtenidos
119860119877570 = 119860570 minus (119860630 lowast 119877119900)
(4)
57
donde
AR = el porcentaje de reduccioacuten del reactivo
A570 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 570 nm
A630 = absorbancia obtenida de las muestras de prueba a 630 nm
Ro = factor de correccioacuten (AO570 AO630)
El segundo ensayo con el reactivo azul alamar tuvo como objetivo determinar la
concentracioacuten inhibitoria media (IC50) del jugo de capuliacuten en cada liacutenea celular Las
variables consideradas fueron la concentracioacuten del jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90
100 300 500 700 y 900 microLmL) y el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
utilizoacute la densidad celular y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo seleccionados con
los resultados del experimento anterior (14700 ceacutelcm2 para la liacutenea celular HeLa y
29400 ceacutelcm2 para la liacutenea celular NIH-3T3 y el tiempo de incubacioacuten con el reactivo
de 4 h)
Despueacutes de calcular el porcentaje de reduccioacuten de todos los tratamientos (control
y muestras de prueba) los resultados se expresaron como porcentaje de reduccioacuten
respecto al control (cultivos que no tuvieron tratamiento) Para ello se dividioacute el
porcentaje de reduccioacuten de la muestra de prueba entre el porcentaje de reduccioacuten de
las muestras control multiplicado por cien y se graficoacute el porcentaje de reduccioacuten contra
los diferentes tratamientos realizados La determinacioacuten de la IC50 fue calculada
mediante la ecuacioacuten de la recta considerando el valor 50 como el 50 de reduccioacuten
del reactivo azul alamar
Ensayo de proliferacioacuten celular mediante el meacutetodo MTT
El ensayo MTT se realizoacute como comparacioacuten del ensayo con el reactivo azul
alamar para determinar el efecto de los tratamientos en la proliferacioacuten de ambas
liacuteneas celulares Para esta prueba se utilizaron placas de 96 pozos y se sembraron a
densidades celulares especiacuteficas los fibroblastos se sembraron a una densidad de
29400 ceacutelcm2 y la liacutenea celular HeLa a 14700 ceacutelcm2 debido a su reducido tiempo de
58
duplicacioacuten Ambas densidades celulares se encuentran dentro del intervalo
considerado por Gasque et al (2013) para obtener lecturas ideales con el meacutetodo MTT
que va de 3125 x 103 a 3125 x 104
El ensayo de MTT se realizoacute con la metodologiacutea propuesta por Gasque et al
(2013) Una vez sembradas las ceacutelulas en las placas se permitioacute la adherencia de eacutestas
durante 24 h al transcurrir ese tiempo se retiroacute el medio de cultivo y se agregaron las
diferentes concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y
900 microLmL) y una vez terminado el tiempo de incubacioacuten con el jugo (24 y 48 h) se
adicionaron 110 microLpozo del reactivo MTT (el reactivo MTT se disolvioacute en medio DMEM
alto en glucosa sin complementar el cual es el mismo medio de cultivo utilizado para
las liacuteneas celulares a una concentracioacuten de 05 mgmL) la placa se protegioacute de la luz
directa y se incuboacute a 37 degC durante 4 h
Una vez transcurridas las 4 h se removioacute el MTT cuidadosamente y se
agregaron 150 microL de isopropanol se resuspendioacute cada pozo para disolver los cristales
de formazaacuten se transfirioacute la suspensioacuten de cada pozo a una placa de lectura y se midioacute
la absorbancia espectrofotomeacutetricamente a una longitud de onda de 570 nm utilizando
como longitud de onda de referencia 630 nm Los resultados se expresaron como
porcentaje de viabilidad celular dividiendo el valor de la absorbancia de la muestra de
prueba entre el valor de la absorbancia del control por cien y se graficoacute el porcentaje
de viabilidad
636 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Extraccioacuten de ADN genoacutemico
La extraccioacuten del ADN genoacutemico (ADNg) se realizoacute para utilizarlo como control
de las reacciones de PCR realizadas con ARN La cantidad de ceacutelulas utilizadas fue
entre 1 y 2 x 106 las cuales se lavaron con PBS 1X a pH 70 se resuspendieron en 2
mL de PBS y se transfirieron a 4 tubos eppendorf de 15 mL A cada tubo se le
adicionaron 300 microL de amortiguador de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8 SDS 02 NaCl
59
100 mM EDTA 10 mM) y 300 microL de fenol y se agitoacute por inversioacuten 30 s se
centrifugaron a 13000 rpm 5 min 4 degC
La fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se adicionaron 300 microL de fenol y
300 microL de cloroformo se mezcloacute suavemente y se centrifugoacute nuevamente a 13000 rpm
durante 5 min a 4 degC la fase acuosa se transfirioacute a un tubo nuevo y se cuantificoacute el
volumen para precipitar el ADNg con etanol y acetato de sodio 3M pH 80 (2 frac12 vol
etanol - 110 de acetato de sodio) se incuboacute a 20 degC durante 2 h se centrifugoacute a
13000 rpm por 15 min a 4 degC y se retiroacute el sobrenadante
El sobrenadante fue lavado con etanol grado biologiacutea molecular al 70 a 4 degC y
se centrifugoacute a 13000 rpm durante 15 min a 4 degC se dejoacute secar la pastilla en un
concentrador de muestras con bomba de vaciacuteo (Eppendorf) a 65 degC para finalmente
resuspenderla en agua destilada esteacuteril (10 ndash 50 microL) y cuantificar la concentracioacuten de
ADN en el equipo Nanodropreg (Thermo) se realizoacute una prueba de integridad mediante
electroforesis en gel de agarosa de la misma manera que se realizoacute para la prueba de
integridad del ARN
La prueba de integridad del ADN se realizoacute mediante electroforesis en gel de
agarosa para proceder con las pruebas la preparacioacuten del gel de agarosa se inicioacute
diluyendo 1 g de agarosa grado reactivo en TBE 05X llevando a un volumen final de
100 mL para obtener un gel al 1 maacutes 1 microL de bromuro de etidio (10 mgmL) como
solucioacuten tentildeidora la mezcla se calentoacute en un horno de microondas hasta disolverse y
se vacioacute en un molde para geles limpio y seco hasta su polimerizacioacuten
Una vez formado el gel se colocoacute en la cubeta de electroforesis y se antildeadioacute
solucioacuten tamponadora TBE 05X cubriendo el gel de agarosa se cargoacute la muestra en un
pozo la cual conteniacutea 1 microL del ADN de cada liacutenea celular maacutes la cantidad de buffer de
carga 6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X se cerroacute la caacutemara de
electroforesis y se conectoacute a una fuente de poder para aplicar una tensioacuten de 5 a 10
Vcm para permitir que el ADN viajara hacia el aacutenodo Finalmente se introdujo el gel en
60
un transiluminador UV (Bio-rad) y se fotografioacute en donde se esperoacute observar una sola
banda por cada muestra
Extraccioacuten de ARN mediante el meacutetodo TRIzol
Inicialmente se realizoacute la transferencia de ceacutelulas stock a cajas de cultivo de 75
cm2 y se permitioacute la adherencia de las ceacutelulas durante 24 h Posteriormente se aplicaron
los diferentes tratamientos control (soacutelo medio de cultivo) jugo de capuliacuten (1885
microLmL) por 24 h 5-fluorouracilo (435 microgmL) por 24 h combinacioacuten de jugo de capuliacuten
y 5-fluorouracilo (1885 microLmL y 435 microgmL) por 24 h y pretratamiento con jugo de
capuliacuten (1885 microLmL) durante 24 h y posterior aplicacioacuten de 5-fluorouracilo durante 24
h (435 microgmL) para ambas liacuteneas celulares Una vez transcurrido el tiempo de cada
experimento se retiroacute el medio de cultivo de cada caja y se realizaron lavados
consecutivos con PBS 1X a pH 70 para eliminar la mayor cantidad de residuos
A cada caja se le antildeadioacute 1 mL del reactivo TRIzolreg para provocar la lisis celular
posteriormente se realizoacute la homogeneizacioacuten para lo que se pipeteoacute cuidadosamente
el reactivo con la suspensioacuten celular y se transfirioacute a un tubo eppendorf de 15 mL se
procedioacute con la fase de separacioacuten se antildeadieron 200 microL de cloroformo y se mezcloacute
cuidadosamente por inversioacuten durante 15 s se incuboacute de 2 a 3 min a temperatura
ambiente y se centrifugoacute a 12000 g 15 min 4 degC se recuperoacute la fase acuosa en un
tubo nuevo inclinando el tubo ligeramente y pipeteando
Para el aislamiento del ARN eacuteste se precipitoacute utilizando 05 mL de isopropanol
por cada mL de TRIzol y se incuboacute a temperatura ambiente por 15 min posterior a eso
se centrifugoacute a 12000 g 10 min 4 degC se realizaron lavados para lo que se decantoacute
el sobrenadante dejando la pastilla formada y se antildeadioacute 1 mL de etanol al 75 se
centrifugoacute a 7500 rpm 5 min 4 degC se retiroacute la mayor cantidad de etanol y se dejoacute
secar a temperatura ambiente de 5 a 10 min Finalmente se resuspendioacute la pastilla en
agua DEPC de 10 a 50 microL y se cuantificoacute el ARN midiendo la absorbancia en el equipo
NanoDropreg a una longitud de onda de 260 y 280 nm (Chomczynski 1987)
61
La integridad del ARN se visualizoacute mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
utilizando la misma metodologiacutea que en la prueba de integridad del ADN se cargoacute la
muestra en un pozo la cual conteniacutea 2 microL del ARN maacutes la cantidad de buffer de carga
6X correspondiente para tener una proporcioacuten 1X La integridad del ARN se visualizoacute en
el gel mediante la presencia de dos bandas de cada muestra representando las
subunidades ribosomales 28S y 18S
PCR punto final
Una vez extraiacutedo el ARN se le dio un tratamiento con la enzima DNasa para
eliminar cualquier contaminacioacuten por ADN para esto se tomaron 5 microg de ARN y se
agregoacute 1 microL de buffer de carga 10X 5 microL de DNasa (1umicrog) y se aforoacute a 10 microL con
agua DEPC se dejoacute en incubacioacuten por 30 min a 37 degC y transcurrido el tiempo se
agregoacute 1 microL de solucioacuten de paro DNasa I se incuboacute a 65 degC por 10 min y se cuantificoacute
nuevamente utilizando el Nanodropreg
Para la realizacioacuten de la PCR fue necesario sintetizar el ADN complementario
(ADNc) a partir del ARN extraiacutedo para lo que se tomoacute 1 microg del ARN tratado con DNasa
y se mezcloacute con 1 microL de oligo dT y se aforoacute a 13 microL con agua esteacuteril friacutea se introdujo en
un termociclador GeneAmpreg PCR system 9700 (Applied biosystems) a 65 degC durante 5
min e inmediatamente se colocoacute en hielo para agregar 4 microL de buffer 5X 2 microL de
dNTPs y 1 microL de enzima retrotranscriptasa RevertAid se ingresoacute nuevamente en un
programa del termociclador con las siguientes condiciones 4 degC durante 5 min 42 degC
por 60 min 70 degC durante 10 min y finalmente a 4 degC
La PCR fue realizada utilizando el reactivo master mix (Bio-rad) para reacciones
con un volumen final de 12 microL en donde se agregoacute el master mix los primers
disentildeados para el experimento 1 microL de ADNc sintetizado anteriormente y agua esteacuteril
en tubos para PCR se programoacute el siguiente ciclaje para la amplificacioacuten de los
fragmentos 94 degC por 5 min para la desnaturalizacioacuten 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min
por 32 ciclos para la hibridacioacuten y finalmente 72 degC por 10 min para la extensioacuten
62
Una vez finalizada la PCR se agregaron 2 microL de buffer de carga 6X y se
cargaron 6 microL en un pozo de un gel de agarosa al 2 El gel de agarosa se corrioacute con
un marcador de 100 pares de bases (pb) agregando 1microL del marcador + 3 microL de agua
esteacuteril + 2 microL de buffer de carga 6X y se cargoacute en el primer pozo para conocer la talla
de los amplicones resultantes y comprobar que el amplicoacuten obtenido fue el esperado
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante densitometriacutea a partir de
los valores mostrados con el sistema de unidades LAUmm2 Para el anaacutelisis se
normalizoacute con los valores obtenidos del gen constitutivo o control de carga GAPDH
posteriormente se graficoacute tomando como referencia el valor del tratamiento control
(ceacutelulas sin tratar) y los valores obtenidos fueron expresados como valores relativos de
ARNm El anaacutelisis estadiacutestico se realizoacute con los datos del valor relativo de ARNm de
cada liacutenea celular
64 Anaacutelisis estadiacutestico
Los resultados obtenidos en la determinacioacuten de la IC50 fueron analizados
mediante un ANOVA de dos viacuteas en donde los tratamientos fueron las concentraciones
empleadas de jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo y el tiempo de incubacioacuten de las ceacutelulas
fue considerado como bloque con el anaacutelisis se determinoacute si se presentoacute alguna
interaccioacuten entre las concentraciones aplicadas y el tiempo
Para el anaacutelisis de los resultados de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU y
los resultados de los niveles de expresioacuten relativa de ARNm - COX-2 se utilizoacute un
ANOVA de una viacutea para determinar si existiacutean diferencias significativas entre los
tratamientos una vez determinadas las diferencias significativas se realizoacute un anaacutelisis
de medias mediante la prueba de Tukey con una P˂05
63
7 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
71 Soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad
El contenido de soacutelidos solubles totales pH y porcentaje de humedad se reportan
en la Tabla 15 Los degBrix contenidos en el jugo fresco y jugo liofilizado reconstituido
tienen un valor similar que el fruto fresco y de acuerdo con el codex alimentarius
(CODEX STAN 247-2005) cumplen con la caracteriacutestica de contener la misma cantidad
de degBrix que lo contenido en el fruto fresco para poder adquirir la denominacioacuten de jugo
y jugo reconstituido respectivamente El pH calculado para el fruto fresco jugo fresco y
jugo liofilizado reconstituido es similar al valor reportado por Jimeacutenez et al (2011) en
donde la pulpa homogeneizada presentoacute un pH de 396 plusmn025 a 25 degC
Tabla 15 Contenido de soacutelidos solubles totales pH y contenido de humedad del fruto y jugo de capuliacuten
Soacutelidos solubles
totales (degBrix)
pH
(a 25 degC)
Contenido de
humedad ()
Fruto fresco 169 plusmn 043 402 plusmn 006 7088 bh 2434 bs
Jugo fresco 170 plusmn 015 396 plusmn013 -
Jugo liofilizado 170 plusmn 060 411 plusmn013 -
El contenido de soacutelidos solubles totales expresados en degBrix y el pH a 25 degC son el resultado del promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
El porcentaje de humedad evaluado en el fruto completo fue de 7088 en base
huacutemeda y 2434 en base seca y de acuerdo con Martines y Lira (2010) esto significa
que la masa de agua presente en el fruto es 24 veces su masa seca El capuliacuten
utilizado en esta investigacioacuten tuvo aproximadamente 10 menor contenido de
humedad (base huacutemeda) que el utilizado por el grupo de investigacioacuten de Luna et al
2013 el cual fue recolectado en Puebla
64
72 Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles en el fruto y jugo de capuliacuten
Identificacioacuten de polifenoles por espectrofotometriacutea UV-visible
Los resultados del anaacutelisis por espectrofotometriacutea ultravioleta-visible del extracto
metanoacutelico-HCl de la pulpa de capuliacuten jugo fresco y jugo liofilizado mostraron bandas
de maacutexima absorcioacuten a longitudes de onda de 200 a 300 nm y de 500 a 550 nm el
sistema de extraccioacuten metanol-aacutecido foacutermico 2 mostroacute bandas similares de 250 a
350 nm y de 500 a 580 nm Estos resultados muestran parcialmente la presencia de
flavonoides debido a que se presentan dos bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas la
banda del anillo aromaacutetico A con un maacuteximo de absorcioacuten de 240 a 285 nm
denominada banda benzoil y la banda del anillo B con un maacuteximo de absorcioacuten de 300
a 550 nm denominada banda cinamoil (Martiacutenez-Cruz et al 2011 Zamudio 2011)
Los datos obtenidos se compararon con los reportes de Luna et al en el 2011
en donde muestran los picos de maacutexima absorcioacuten de polifenoles mayoritarios en el
fruto del capuliacuten los cuales se encuentran dentro de los rangos obtenidos en esta
investigacioacuten reportan que el aacutecido gaacutelico hexoacutesido tiene una maacutexima absorbancia a
272 nm la cianidina 3-O rutinoacutesido a 284 nm la procianidina B a 280 nm la quercetina
a 256 nm y el kaempferol a 264 nm
Cuantificacioacuten de polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con aacutecido gaacutelico la cual tuvo un coeficiente de correlacioacuten de 991 (Anexo
1) obteniendo los valores reportados en la Tabla 16 Comparado con lo reportado por
Luna et al (2011) en donde evaluacutean el contenido de polifenoles en la pulpa y piel del
capuliacuten cuantificaron 3622 plusmn 116 (mg EAG100 g fruto fresco base huacutemeda) el cual
tiene una concentracioacuten menor que lo reportado en esta investigacioacuten No se tienen
reportes de otros autores de la concentracioacuten de polifenoles totales en el jugo fresco de
capuliacuten
65
Tabla 16 Contenido de polifenoles totales en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de polifenoles totales
59658 plusmn 2793 244597 plusmn
11451 18275 plusmn 667
18275 plusmn 66 100384 plusmn 126
El contenido de polifenoles totales expresados en mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (EAG) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EAG100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2
EAG100 g de fruto fresco en base seca 3 EAG100 mL de jugo frescoL
4 EAG100 mL de jugo
liofilizado
El contenido de polifenoles del jugo de capuliacuten se comparoacute con otras bebidas
como el vino tinto cuyo contenido de polifenoles es de 2036 plusmn 59 el teacute verde de 1029 plusmn
36 y el jugo de los granos de la granada que contiene 2117 plusmn 95 todos expresados en
mg EAGL jugo (Gil et al 2000) El jugo de capuliacuten contiene 10 y 15 menos
polifenoles que el vino tinto y el jugo de granada respectivamente y 44 maacutes que los
polifenoles contenidos en el teacute verde Con lo anterior se podriacutea proponer al jugo de
capuliacuten como una buena fuente de estos compuestos bioactivos debido a la similitud
en el contenido de polifenoles con bebidas consideradas buenas fuentes de
antioxidantes
Cuantificacioacuten de flavonoides
El contenido de flavonoides se determinoacute a partir de una curva estaacutendar
realizada con catequina (coeficiente de correlacioacuten de 998 Anexo 2) obteniendo los
valores reportados en la Tabla 17 Comparado con los reportes de Luna et al (2011)
en donde cuantificaron 2018 plusmn 121 mg EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda el
contenido de flavonoides es superior en el fruto evaluado en esta investigacioacuten El
contenido de polifenoles totales y de flavonoides del capuliacuten evaluado en esta
investigacioacuten fue mayor que el analizado por Luna et al (2013) lo que puede deberse a
que los frutos proveniacutean de ciudades y plantaciones distintas En la Figura 14 se
muestra la concentracioacuten de polifenoles totales y flavonoides en el fruto y jugos
66
Tabla 17 Contenido de flavonoides en el fruto fresco jugo fresco y jugo liofilizado de capuliacuten
Fruto fresco (bh)1
Fruto fresco (bs)2
Jugo fresco3 Jugo liofilizado4
Contenido de flavonoides
32051 plusmn 2655 131409 plusmn
10885 1088 plusmn 39 1088 plusmn 39
69177 plusmn 607
El contenido de flavonoides expresado en mg equivalentes de catequina (EC) son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE
1 EC100 g de fruto fresco en base huacutemeda
2 EC100 g de fruto
fresco en base seca 3 EC100 mL de jugo fresco o L
4 EC100 mL de jugo liofilizado
Figura 14 Contenido de polifenoles y flavonoides en el fruto y jugo de capuliacuten Los datos son presentados como la media plusmn DE de tres experimentos independientes EAG equivalentes de aacutecido gaacutelico EC equivalentes de catequina bh base huacutemeda bs base seca
Identificacioacuten y cuantificacioacuten de polifenoles mediante cromatografiacutea liacutequida de
alta resolucioacuten (HPLC)
Los cromatogramas de los estaacutendares identificados en el fruto fresco de capuliacuten
se muestran en las Figuras 15 16 y 17 las sentildeales obtenidas de los estaacutendares se
observaron a los tiempos de retencioacuten 17073 para quercetina 13532 para cianidina y
a los 18576 min para kaempferol El Cromatograma representativo de la muestra del
fruto de capuliacuten se presenta en la Figura 18 La identificacioacuten de estos compuestos en
el fruto es importante para la presente investigacioacuten debido a que la actividad bioloacutegica
0
500
1000
1500
2000
2500
100 g Frutobh
100 g Frutobs
100 mL Jugo 100 g Jugoliofilizado
mg
E
AG
m
g E
C
Contenido depolifenoles (mgEAG)
Contenido deflavonoides (mgEC)
67
esperada de este fruto el efecto antiproliferativo selectivo e inhibicioacuten del gen COX-2
ha sido reportada principalmente en cianidina quercetina y kaempferol (OrsquoLeary et al
2004 Crespo et al 2008 Aacutelvarez 2010 Li et al 2013)
Figura 15 Cromatograma representativo del estaacutendar de quercetina
Figura 16 Cromatograma representativo del estaacutendar de cianidina
68
Figura 17 Cromatograma representativo del estaacutendar de kaempferol
Figura 18 Cromatograma de la muestra de fruto fresco de capuliacuten
73 Determinacioacuten de la actividad antioxidante
731 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a los 60 min
El porcentaje de captacioacuten fue medido a partir del extracto del fruto de capuliacuten a
una concentracioacuten de 10 mgmL el fruto fresco tuvo un porcentaje de inhibicioacuten del
7817 con una DE de 056 siendo superior que lo reportado por Jimeacutenez et al
Cia
nid
ina
Querc
etina
Kaem
pfe
rol
69
(2011) para el fruto de capuliacuten a la misma concentracioacuten en donde obtuvieron un
porcentaje de captacioacuten del 7274 El jugo fresco presentoacute un porcentaje de inhibicioacuten
de 805 plusmn 23 a una concentracioacuten de 20 microL de jugo por mL de solvente y el jugo
liofilizado de 8523 plusmn 015 a una concentracioacuten de 10 mgmL
732 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo DPPH a las 24 h
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
993 Anexo 3) de 28 plusmn 087 microM ET g F bh el jugo fresco tuvo una actividad de 193
plusmn 056 microM ET mL jugo y el jugo liofilizado 34141 plusmn 335 microM ET g comparado con los
reportes de Luna et al (2013) en donde obtuvieron una actividad de 2056 microM ETg F
bh la diferencia en la actividad antioxidante con el fruto evaluado en esta investigacioacuten
coincide con las diferencias observadas en el contenido de polifenoles totales y
flavonoides pudiendo haber relacioacuten entre el contenido de polifenoles y la actividad
antioxidante
Comparado con otros frutos seguacuten lo reportado por Ozgen et al (2006) la uva
morada tuvo una actividad antioxidante de 142 plusmn 04 micromol de Trolox g F bh y para
fresa 159 plusmn 01 micromol ETg F bh los cuales presentan actividad menor a lo obtenido
para los extractos de capuliacuten La actividad reportada para tres diferentes genotipos de
guayaba (Thaipoing et al 2006) fue de 32 plusmn 51 para el tipo Allahabad safeda para el
genotipo Fan retief reportan 277 plusmn 17 y para Ruby supreme obtuvieron 162 plusmn 10
todos expresados en microM ET g F bh el primer genotipo presentoacute una mayor actividad
antioxidante el segundo una actividad similar y el tercer genotipo menor actividad
antioxidante que obtenido en este estudio para el capuliacuten
733 Actividad antioxidante mediante el meacutetodo FRAP
El fruto fresco presentoacute una actividad antioxidante (coeficiente de correlacioacuten del
991 Anexo 4) equivalente a 298 plusmn 024 microM de Trolox g F bh el jugo fresco de
1856 plusmn 036 microM ET mL y el jugo liofilizado de 31736 plusmn 1955 microM ET g Luna et al
70
(2013) obtuvieron una actividad de 1455 microM ETg F bh para este mismo fruto Los
genotipos de guayaba presentados en el apartado anterior reportan para el tipo
Allahabad safeda una actividad equivalente a 333 plusmn 14 para el genotipo Fan retief
reportan 304 plusmn 12 y para Ruby supreme 155 plusmn 14 el primero genotipo presenta una
actividad mayor que el capuliacuten el segundo una similar y el tercero una actividad inferior
que el fruto de capuliacuten
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos para el fruto jugo fresco y jugo
liofilizado de capuliacuten mediante los tres ensayos realizados la actividad antioxidante es
similar seguacuten los resultados de los meacutetodos FRAP y DPPH De acuerdo con la finalidad
de cada meacutetodo realizado para la determinacioacuten de la actividad antioxidante el fruto es
capaz de reducir el ion feacuterrico mediante la donacioacuten de electrones (meacutetodo FRAP
Pulido et al 2000) y de captar radicales libres mediante la donacioacuten de electrones y
aacutetomos de hidroacutegeno (meacutetodo DPPH Niki 2010)
Tabla 18 Comparacioacuten de actividad antioxidante del fruto jugo fresco
y jugo liofilizado
Captacioacuten
DPPH1
DPPH
(microM ET)2
FRAP
(microM ET)2
Fruto fresco 7817 plusmn 056 28 plusmn 087 298 plusmn 024
Jugo fresco 805 plusmn 23 193 plusmn 056 1856 plusmn 036
Jugo liofilizado 8523 plusmn 015 34141 plusmn 335 31736 plusmn 1955
Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes plusmn DE 1Los valores son expresados
en porcentaje de captacioacuten de radicales libres 2Los valores son expresados en microM equivalentes de trolox
por gramo de fruto fresco mL de jugo fresco o g de jugo liofilizado (microM ET)
74 Determinacioacuten de la proliferacioacuten celular
Curva de reaccioacuten de azul alamar en las liacuteneas celulares HeLa y NIH-3T3
A partir del experimento para determinar el tiempo de incubacioacuten del reactivo y la
densidad celular se obtuvieron los resultados mostrados en las Figuras 19 y 20
evaluado a diferentes densidades celulares (1000 5000 10000 15000 y 20000
71
ceacutelulas por pozo o 2941 14705 29411 44117 y 58823 ceacutelcm2) la densidad celular
y el tiempo de incubacioacuten del reactivo se seleccionoacute con base en lo propuesto por
Lancaster y Fields (1996) en donde sugieren seleccionar el tiempo y densidad en las
que el reactivo muestre absorbancias con una tendencia lineal previa al maacuteximo punto
de reduccioacuten del reactivo
Se observoacute que a partir de las 4 h de incubacioacuten se muestra una disminucioacuten del
porcentaje de reduccioacuten del reactivo a algunas densidades celulares esto se debe a
que a mayor cantidad de ceacutelulas el reactivo alcanza en un menor tiempo su maacuteximo
punto de reduccioacuten y este tiende a descender El tiempo de incubacioacuten seleccionado
fue de 4 h ya que es un tiempo previo al maacuteximo punto de reduccioacuten de la mayoriacutea de
las densidades celulares utilizadas las densidades elegidas fueron 5000 ceacutelulas por
pozo para la liacutenea celular HeLa (14704 ceacutelcm2) y 10000 ceacutelulas por pozo para
fibroblastos (29411 ceacutelcm2)
Figura 19 Curva de reaccioacuten de azul alamar con HeLa
72
Figura 20 Curva de reaccioacuten de azul alamar con fibroblastos
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa mediante el meacutetodo azul
alamar
Los resultados obtenidos en el ensayo para determinar el efecto del jugo del
capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa son mostrados en la Figura 21 presentados
como porcentaje de reduccioacuten del reactivo azul alamar respecto al control tomado
como el 100 de reduccioacuten El valor del blanco fue restado de la absorbancia de los
diferentes tratamientos dada por el espectrofotoacutemetro y se realizoacute una curva de jugo de
capuliacuten y medio de cultivo a las mismas concentraciones que las utilizadas en el ensayo
para observar si existioacute alguna interferencia entre el reactivo azul alamar y el jugo de
capuliacuten
73
Figura 21 Efecto del jugo de capuliacuten en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa mediante el meacutetodo azul alamar (aA) Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La IC50 del jugo de capuliacuten se determinoacute utilizando el porcentaje de reduccioacuten de
las concentraciones 100 300 y 500 microLmL (Figura 22) a traveacutes de la ecuacioacuten de la
recta Son requeridos 220 microLmL para tener un porcentaje de reduccioacuten del reactivo
azul alamar del 50 con el jugo de capuliacuten Sin embargo se observoacute interferencia del
jugo de capuliacuten en las mediciones mediante espectrofotometriacutea por lo que se
seleccionoacute el ensayo con MTT para la determinacioacuten de la IC50 y la realizacioacuten de los
experimentos de combinacioacuten con el quimioterapeacuteutico ya que el reactivo no interactuacutea
con el jugo
Figura 22 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h mediante el meacutetodo azul alamar
0
20
40
60
80
100
120
R
educcioacute
n d
el re
activo a
A
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
y = -2286x + 86837 Rsup2 = 09957
0
10
20
30
40
50
60
70
100 microlmL 300 microlmL 500 microlmL R
ed
uccioacute
n d
el re
acti
vo
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
74
Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten mediante el meacutetodo MTT
Para determinar la concentracioacuten a la cual se obtiene el 50 de viabilidad
celular mediante MTT se realizoacute una curva exponiendo cada liacutenea celular a diferentes
concentraciones de jugo de capuliacuten (10 30 50 70 90 100 300 500 700 y 900
microLmL) se obtuvieron los siguientes porcentajes de viabilidad respecto al control
(Figuras 23 y 24) De acuerdo con el anaacutelisis estadiacutestico existen diferencias
significativas en el efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten en la liacutenea celular
HeLa (F959= 30706 P˂005) y fibroblaacutestica (F959= 128221 P˂005)
El efecto del jugo de capuliacuten a las 48 h es mayor que el observado a las 24 h
existiendo una dependencia del efecto de cada concentracioacuten de jugo de capuliacuten con el
tiempo de incubacioacuten tanto para HeLa (F959=18106 P˂005) como para fibroblastos
(F959=3298 P˂005) Se eligioacute las 24 h como tiempo de incubacioacuten debido a que las
ceacutelulas presentan una disminucioacuten moderada en la viabilidad celular a concentraciones
altas El experimento se llevoacute a cabo en un intervalo de 5 concentraciones (150 200
250 300 a 350 microLmL) ya que se observoacute que el 50 de viabilidad celular se
encontraba a concentraciones entre 100 y 300 microLmL para ambas liacuteneas celulares
Figura 23 Efecto del jugo de capuliacuten en HeLa 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten del jugo de capuliacuten
24 h
48 h
75
Figura 24 Efecto del jugo de capuliacuten en fibroblastos 24 y 48 h Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La concentracioacuten inhibitoria media se calculoacute con los resultados mostrados en las
Figuras 25 y 26 la concentracioacuten exacta se calculoacute mediante la ecuacioacuten de la recta
mostrando un coeficiente de correlacioacuten de 994 para ambas liacuteneas celulares La IC50
del jugo de capuliacuten para las ceacutelulas HeLa fue de 1885 microLmL y para fibroblastos se
requirioacute de una concentracioacuten mayor 198 microLmL estas concentraciones fueron
utilizadas para los experimentos subsecuentes
Con base en las concentraciones cuantificadas de polifenoles totales y
flavonoides del jugo liofilizado y la concentracioacuten inhibitoria media del jugo de capuliacuten
en ambas liacuteneas celulares se calcularon las concentraciones de polifenoles y
flavonoides aplicadas en los ensayos de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-
fluorouracilo En la liacutenea celular HeLa se aplicaron 473 microg de polifenoles por mL de
medio de cultivo y 325 microgmL de flavonoides -equivalente a 1885 microLmL de jugo de
capuliacuten- para la liacutenea celular fibroblaacutestica se aplicaron 496 microgmL de polifenoles y 3424
microgmL de flavonoides -equivalente a 198 microLmL-
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
48 h
76
Figura 25 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en HeLa a las 24 h
Figura 26 Determinacioacuten de la IC50 del jugo de capuliacuten en fibroblastos a las 24 h
y = -12355x + 69703 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150 microLmL200 microLmL250 microLmL300 microLmL350 microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
y = -13597x + 76687 Rsup2 = 09947
0
10
20
30
40
50
60
70
150microLmL
200microLmL
250microLmL
300microLmL
350microLmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de jugo de capuliacuten
24 h
Lineal (24 h)
77
Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo mediante el ensayo MTT
El efecto de cuatro concentraciones de 5-fluoruracilo fue evaluado en ambas
liacuteneas celulares (25 50 75 y 100 microgmL) a 24 y 48 h de incubacioacuten de acuerdo con los
resultados analizados estadiacutesticamente el efecto de las concentraciones utilizadas en
la liacutenea celular HeLa depende del tiempo de incubacioacuten (F323=7725 P˂005) en
contraste el efecto del quimioterapeacuteutico en la liacutenea fibroblaacutestica no depende del
tiempo de incubacioacuten del cultivo (F323=030 P=0826) El tiempo de incubacioacuten
seleccionado fue de 24 h debido a que a bajas concentraciones del quimioterapeacuteutico
se tiene un porcentaje de viabilidad bajo en HeLa
Los resultados obtenidos para la liacutenea celular HeLa y fibroblaacutestica se muestran
en las Figuras 27 y 28 respectivamente Para las ceacutelulas HeLa se tuvo un coeficiente
de correlacioacuten de 9824 (Figura 29) y la concentracioacuten inhibitoria media del
quimioterapeacuteutico de acuerdo con la ecuacioacuten de la recta fue de 435 microgmL Para
fibroblastos con un coeficiente de correlacioacuten de 9867 (Figura 30) fue de 8175
microgmL ambas determinadas a las 24 h
Figura 27 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas fibroblaacutesticas NIH-3T3 Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
78
Figura 28 Efecto del 5-Fluorouracilo en la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes
La cantidad de quimioterapeacuteutico necesaria para afectar a los fibroblastos fue
mayor que la necesaria para afectar la viabilidad de las ceacutelulas HeLa y el anaacutelisis
estadiacutestico muestra que en fibroblastos no influye significativamente el tiempo de
incubacioacuten con el quimioterapeacuteutico en las primeras 48 h esto puede ser debido al
tiempo de adaptacioacuten a las condiciones del cultivo y el tiempo de duplicacioacuten de cada
liacutenea celular considerando que el antineoplaacutesico utilizado afecta las fases del ciclo
celular por el dantildeo provocado al ADN El tiempo de duplicacioacuten reportado para cada
liacutenea celular es similar 19 h para HeLa (Percell biolytica) y 20 h para fibroblastos (NIH
reagent program 2014)
Sin embargo durante el desarrollo de la investigacioacuten se observoacute que la liacutenea
celular fibroblaacutestica presenta un periodo mayor de adaptacioacuten que la liacutenea celular HeLa
esto se observoacute mediante el porcentaje de confluencia del subcultivo de cada liacutenea
celular Una vez realizada la siembra de cada liacutenea se observoacute a las 24 48 y 72 h el
porcentaje de confluencia y en las primeras 24 h se observaba en fibroblastos una
confluencia similar a la inicial mientras que en las ceacutelulas HeLa el porcentaje de
confluencia era mayor que las ceacutelulas sembradas El requerimiento de una mayor
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-Fluorouracilo
24 h
48 h
79
concentracioacuten de 5-FU en el cultivo de fibroblastos se podriacutea atribuir a esta
caracteriacutestica de adaptacioacuten y la diferencia en el tiempo de duplicacioacuten celular
Figura 29 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en HeLa a las 24 y 48 h
y = -12498x + 7181 Rsup2 = 09825
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
24 h
y = -2719x + 12865 Rsup2 = 09898
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
celu
lar
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
80
Figura 30 Determinacioacuten de la IC50 del 5-fluorouracilo en fibroblastos a las 24 y 48 h
y = -11419x + 8737 Rsup2 = 09867
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
24 h
Lineal (24 h )
y = -12197x + 69145 Rsup2 = 09981
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 microgmL 50 microgmL 75 microgmL 100 microgmL
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Concentracioacuten de 5-FU
48 h
Lineal (48 h)
81
Efecto del jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la proliferacioacuten celular
Para conocer el efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU se aplicaron
cinco tratamientos diferentes un control positivo (ceacutelulas y medio de cultivo) un control
con agua bidestilada y esteacuteril a la misma concentracioacuten que el jugo de capuliacuten 1885
microLmL para la liacutenea celular HeLa y 198 microLmL para fibroblastos para verificar si la
disminucioacuten de la viabilidad celular en el tratamiento con el jugo de capuliacuten podriacutea ser
debido a una dilucioacuten de los nutrimentos del medio de cultivo un tratamiento con jugo
de capuliacuten un tratamiento con 5-FU y la combinacioacuten simultaacutenea de ambos Los
resultados muestran que no existen diferencias significativas entre las ceacutelulas sin
tratamiento y las ceacutelulas control con el medio de cultivo diluido en agua en fibroblastos
(P=032) y HeLa (P=095) (Figura 31)
En la combinacioacuten del antineoplaacutesico con el jugo de capuliacuten utilizando para
ambas liacuteneas celulares sus respectivas IC50 disminuye 25 la viabilidad celular de la
liacutenea fibroblaacutestica en comparacioacuten con el tratamiento por separado del jugo y el
quimioterapeacuteutico en ceacutelulas HeLa la combinacioacuten afecta la viabilidad celular 36
maacutes que el tratamiento por separado con estas soluciones de acuerdo con el anaacutelisis
estadiacutestico existen diferencias significativas en el efecto de la combinacioacuten de jugo y 5-
FU y los demaacutes tratamientos afectando mayormente a las ceacutelulas tumorales que a las
ceacutelulas normales (F15=2443P=0008)
Un segundo experimento se realizoacute para conocer el efecto del pretratamiento con
jugo de capuliacuten durante 24 h previo a la aplicacioacuten de 5-FU (24 h) para lo que se
realizaron tres ensayos independientes (Figura 32) Los tratamientos se aplicaron en las
liacuteneas celulares NIH-3T3 y HeLa utilizando tres variantes Fibroblastos tratados con
198 microLmL de jugo de capuliacuten y 8175 microgmL de 5-FU fibroblastos tratados con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU y ceacutelulas HeLa tratadas con 1885
microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
82
Figura 31 Efecto de la combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en HeLa y fibroblastos Las concentraciones de jugo de capuliacuten y 5-FU utilizadas fueron las IC50
calculadas para cada liacutenea celular Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas con el mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Con estos resultados se pudo conocer cuaacutel es el efecto sobre fibroblastos de las
concentraciones en las que las ceacutelulas HeLa son afectadas en un 50 Como
resultado se tuvo que la concentracioacuten de jugo de capuliacuten con la que se obtiene una
viabilidad celular en HeLa 505 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 708
La concentracioacuten de 5-fluorouracilo con la que se obtiene una viabilidad celular en
HeLa de 495 disminuye la viabilidad celular en fibroblastos a 7525 Lo que
muestra que las ceacutelulas normales son menos afectadas por el jugo de capuliacuten y el 5-FU
que las ceacutelulas tumorales
La aplicacioacuten del pretratamiento de 1885 microLmL de jugo de capuliacuten por 24 h y
posterior aplicacioacuten de 435 microgmL de 5-FU por 24 h provocoacute la disminucioacuten de la
viabilidad de fibroblastos a 427 mientras que en las ceacutelulas HeLa el pretratamiento
con jugo de capuliacuten disminuyoacute hasta el 133 su viabilidad Todos los tratamientos
aplicados en este experimento muestran diferencias estadiacutesticamente significativas
(F15= 67523 P˂005) Sin embargo al ser comparado con el experimento anterior no
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r FIBROBLASTOS
HELA
83
existen diferencias estadiacutesticamente significativas si el jugo es aplicado
simultaacuteneamente al 5-FU o si es aplicado como pretratamiento
Figura 32 Efecto del pretratamiento con jugo de capuliacuten en HeLa y fibroblastos tratados con 5-FU Fibroblastos [1] son fibroblastos tratados con las IC50 propias de esta liacutenea Fibroblastos [2] son fibroblastos tratados con las IC50 de HeLa HeLa son ceacutelulas HeLa tratadas con las IC50 propias de HeLa Los valores representan la media plusmn DE de tres experimentos independientes Un asterisco representa que existen diferencias significativas con los demaacutes tratamientos y indica que existen diferencias significativas del mismo tratamiento entre fibroblastos y HeLa
Los resultados obtenidos dan pie al anaacutelisis de cuaacutel seriacutea el efecto real de los
polifenoles que interactuacutean con agentes quimioterapeacuteuticos en la proliferacioacuten de
ceacutelulas tumorales debido a que existen dos principales propuestas de diversos
investigadores en donde se ha observado que tienen actividad directa en el ciclo
celular con lo que logran inhibir su proliferacioacuten sumado al efecto del antineoplaacutesico
(efecto sineacutergico) y por otro lado se ha observado que la aplicacioacuten de polifenoles como
la quercetina resveratrol apigenina y genisteiacutena (Colin et al 2009) son capaces de
sensibilizar a las ceacutelulas tumorales para potenciar el efecto antiproliferativo del
quimioterapeacuteutico (efecto sensibilizador)
0
20
40
60
80
100
120
V
iab
ilid
ad
ce
lula
r
Tratamientos
FIBROBLASTOS [1]
FIBROBLASTOS [2]
HELA
84
Con base en lo anterior y considerando que los resultados del pretratamiento y
tratamiento simultaacuteneo del jugo y el 5-FU no mostraron diferencias significativas podriacutea
sugerirse que el efecto de la combinacioacuten de los polifenoles y demaacutes compuestos
contenidos en el jugo de capuliacuten producen la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas tumorales
para que el 5-FU produzca un mayor efecto antiproliferativo en ceacutelulas HeLa teniendo
en cuenta que el jugo de capuliacuten fue retirado del cultivo celular previo a la aplicacioacuten del
5-FU en el pretratamiento
75 Determinacioacuten de la expresioacuten del gen COX-2
Estandarizacioacuten de condiciones para RT-PCR
Se disentildearon los primers para la identificacioacuten de los genes GAPDH y COX-2
tanto para ratoacuten (Mus musculus) como para humano (Homo sapiens) se obtuvo un
amplicoacuten o fragmento de 240 pares de bases (pb) para el gen COX-2 y 130 pb para el
gen GAPDH para la liacutenea celular fibroblaacutestica Para el gen COX-2 de la liacutenea celular
HeLa se obtuvo un amplicoacuten de 106 pb y 248 pb para el gen GAPDH Maacutes adelante se
presentan las secuencias de oligonucleoacutetidos que se utilizaron para la identificacioacuten de
los genes de intereacutes
Se realizaron pruebas con diferentes temperaturas de fusioacuten (Tm) para unificar la
teacutecnica a realizar en los experimentos de determinacioacuten de los niveles de expresioacuten
diferencial del gen COX-2 Para realizar esta prueba se utilizoacute el ADNg extraiacutedo
previamente debido a que los primers disentildeados mostraron diferentes temperaturas de
fusioacuten de acuerdo con las sugerencias del fabricante se realizaron diferentes ciclajes
teniendo como variable la Tm 55 57 59 y 60 degC para observar la temperatura ideal de
amplificacioacuten de los fragmentos de COX-2 y GAPDH esperados
El programa seleccionado en el termociclador para la amplificacioacuten de los
fragmentos del templado para ambos genes fue a un volumen final de reaccioacuten de 12
microL con el siguiente ciclaje 94 degC por 5 min 94 degC por 30 s 60 degC por 1 min para un
total de 32 ciclos y 72 degC durante 10 min basado en el programa reportado por Li et al
85
(2007) con la modificacioacuten de la temperatura de fusioacuten seleccionada (60 degC) para
ambos genes y visualizado en un gel de agarosa al 2 (Figura 33)
Tabla 19 Primers empleados para RT-PCR
COX-2 (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT ndash 3rsquo
GAPDH (Homo sapiens) Forward
5rsquo ndash GGG AAG AGT CAA CGG ATT TGG TCG T ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GGG AAT TGA TTT TGG AGG GAT CTC G ndash 3rsquo
COX-2 (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash ACT GGA TTC TAT GGT GAA A ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash GAA GTG GGT CAG GAT GTA G ndash 3rsquo
GAPDH (Mus musculus) Forward
5rsquo ndash CAA ATT CAA CGG CAC AGT CAA GGC ndash 3rsquo
Reverse
5rsquo ndash CTC CAC GAC ATA CTC AGC AC ndash 3rsquo
86
Figura 33 Amplificacioacuten de fragmentos de COX-2 y GAPDH de ADNg en HeLa y fibroblastos Pb pares de bases
Determinacioacuten del efecto del jugo de capuliacuten y 5-FU sobre la expresioacuten del gen
COX-2 en HeLa y fibroblastos mediante PCR punto final
En la Figura 34 se muestran las bandas de expresioacuten del gen COX-2 con los
diferentes tratamientos utilizados (Anaacutelisis densitomeacutetrico Figuras 35 y 36) control IC50
de jugo de capuliacuten IC50 de 5-FU combinacioacuten del jugo con el 5-FU y por uacuteltimo el
pretratamiento con jugo y posterior aplicacioacuten de 5-FU Las concentraciones utilizadas
fueron las mismas que en el experimento de combinacioacuten del jugo de capuliacuten y 5-FU en
la proliferacioacuten de ceacutelulas HeLa 1885 microLmL de jugo de capuliacuten y 435 microgmL de 5-FU
para ambas liacuteneas celulares El experimento fue realizado por duplicado De acuerdo
con las bandas de los controles de carga (GAPDH) se aseguroacute que las cantidades de
ADNc utilizadas en el ensayo hayan sido las mismas para todos los casos
87
Figura 34 Efecto del tratamiento con jugo de capuliacuten y 5-fluorouracilo en la expresioacuten del gen COX-2 de HeLa y fibroblastos
Se observa que el gen COX-2 se encuentra sobreexpresado en las ceacutelulas de
caacutencer cervical en condiciones basales lo que comprueba lo reportado en
investigaciones anteriores (Liao et al 2005 Li et al 2007 Xia et al 2010) En la liacutenea
celular fibroblaacutestica no se expresa COX-2 en condiciones basales (control) En el
tratamiento con jugo de capuliacuten no se observan cambios en la expresioacuten de COX-2
respecto al control en ambas liacuteneas celulares (F13= 424 P=0176 para fibroblastos
F13= 2 P=0293 para HeLa) El tratamiento con 5-fluorouracilo no modifica la expresioacuten
de este gen en HeLa (F13= 362 P=0198) y en fibroblastos produce una
sobreexpresioacuten de este gen (F13= 190479 P˂005)
Lo anterior coincide con los reportes de Mercer et al (2005) en donde
mencionan la influencia del 5-FU en la sobreexpresioacuten de COX-2 El uso exclusivo de
jugo de capuliacuten no provoca la disminucioacuten de la expresioacuten de COX-2 en HeLa la
disminucioacuten se presenta al combinarse con 5-FU o como pretratamiento de eacuteste
88
(F13=7044 P˂005) En el caso de los fibroblastos la combinacioacuten del jugo y del 5-FU
disminuye la sobreexpresioacuten generada por el quimioterapeacuteutico como tratamiento
individual (F13=2898 P˂005)
Este experimento se podriacutea relacionar con el efecto del jugo de capuliacuten y el 5-FU
en la proliferacioacuten celular el cual podriacutea ser resultado de la sensibilizacioacuten de las
ceacutelulas al efecto del 5-FU provocado por el jugo de capuliacuten mediante la inhibicioacuten de
COX-2 entre otros factores debido a que estaacute reportada que una sobreexpresioacuten de la
enzima COX-2 atenuacutea los efectos del 5-FU y por el contrario la inhibicioacuten de esta
enzima podriacutea favorecer la actividad del quimioterapeacuteutico (Trifaacuten y Hla 2003)
Es importante mencionar que el estudio se centroacute en el efecto del jugo de
capuliacuten a nivel transcripcional sin embargo es necesario realizar experimentos a nivel
de traduccioacuten para establecer si el efecto en la transcripcioacuten del gen estaacute
correlacionado en este caso con el aumento en la siacutentesis de la enzima COX-2 lo cual
puede estar influido por otros factores ademaacutes de la expresioacuten del gen COX-2
Figura 35 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas HeLa Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0010203040506070809
1
Niv
ele
s r
ela
tivo
s d
e m
RN
A
Tratamientos
89
Figura 36 Niveles relativos de ARNm en la expresioacuten de COX-2 en ceacutelulas fibroblaacutesticas Los valores representan los resultados plusmn DE de dos experimentos independientes Los asteriscos muestran las diferencias significativas con el resto de los tratamientos
0
02
04
06
08
1
12
14
Niv
ele
s r
ela
tivo
s d
e m
RN
A
Tratamientos
90
8 CONCLUSIONES
El jugo de capuliacuten se puede considerar una fuente importante de polifenoles
debido a que contiene cantidades similares que otras bebidas consideradas buenas
fuentes de eacutestos de los cuales ya se ha probado alguna actividad bioloacutegica in vitro Asiacute
mismo se propone como fuente de antioxidantes debido a que tiene la capacidad de
neutralizar radicales libres mediante la transferencia de iones hidroacutegeno y de reducir
radicales libres por la donacioacuten de electrones
El jugo de capuliacuten es un potencial coadyuvante al tratamiento meacutedico como parte
de la dietoterapia de pacientes oncoloacutegicos debido a que incrementa el efecto
citotoacutexico del quimioterapeacuteutico 5-fluorouracilo en ceacutelulas de adenocarcinoma cervical
posiblemente por la sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto de eacuteste presentando un
menor efecto en ceacutelulas fibroblaacutesticas normales a las mismas concentraciones Esta
sensibilizacioacuten de las ceacutelulas al efecto del quimioterapeacuteutico podriacutea estar relacionado
con la disminucioacuten del gen COX-2 debido a que en la bibliografiacutea se ha reportado que
la sobreexpresioacuten de COX-2 inhibe los efectos de este quimioterapeacuteutico
El efecto protector del jugo de capuliacuten en la sobreexpresioacuten provocada por el 5-
FU en fibroblastos NIH-3T3 podriacutea impactar de manera positiva en el estado nutricio y
general de los pacientes oncoloacutegicos al disminuir la sintomatologiacutea provocada por el
aumento de COX-2 secundario el tratamiento meacutedico La disminucioacuten de la expresioacuten
de este gen tanto en ceacutelulas tumorales como normales tambieacuten podriacutea reducir el
crecimiento y diseminacioacuten tumoral consecuencia de la actividad de COX-2 (aumento
de la proliferacioacuten celular inmunosupresioacuten y vascularizacioacuten tumoral)
Se recomienda un estudio para conocer si el efecto del jugo de capuliacuten es tanto a
nivel transcripcional como traduccional y determinar si el jugo de capuliacuten podriacutea tener
alguacuten efecto en la siacutentesis de la enzima COX-2 Asiacute mismo se requiere una
investigacioacuten in vivo para conocer si los compuestos polifenoacutelicos son absorbidos y
biodisponibles para producir los efectos observados in vitro
91
La investigacioacuten de los efectos en la salud del consumo de capuliacuten podriacutea
motivar el mejoramiento de la produccioacuten de este devaluado fruto asiacute como el disentildeo
de productos derivados del capuliacuten para facilitar su ingesta y formar parte de la dieta
habitual y dietoterapia
92
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10 ANEXOS
Anexo 1 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de polifenoles
Anexo 2 Curva estaacutendar para cuantificacioacuten de flavonoides
y = 32115x + 00001 Rsup2 = 09911
0
05
1
15
2
25
3
35
0 002 004 006 008 01 012
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de aacutecido gaacutelico mgmL
y = 64998x + 00434 Rsup2 = 09989
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
0 005 01 015 02 025 03
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de catequina mgmL
106
Anexo 3 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante DPPH
Anexo 4 Curva estaacutendar de trolox para la determinacioacuten de la actividad antioxidante mediante FRAPB
y = 00988x + 02225 Rsup2 = 09944
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rba
ncia
Concentracioacuten de Trolox
ABSORBANCIA
Lineal(ABSORBANCIA)
y = 00989x + 02257 Rsup2 = 0993
0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
Ab
so
rban
cia
Concentracioacuten de Trolox
Series1
Lineal (Series1)
