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UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja
ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMÉDICA
TÍTULO DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO
Determinación de la capacidad antioxidante en alimentos tradicionales.
TRABAJO DE TITULACIÓN
AUTOR: Zaquinaula Iñahuazo, Fabián Efraín
DIRECTOR: Figueroa Hurtado, Jorge Geovanny, Mg. Sc.
LOJA – ECUADOR
2016
Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NY-SA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es
Septiembre, 2016
II
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Mg. Sc.
Jorge Geovanny Figueroa Hurtado
DIRECTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
De mi consideración:
El presente trabajo de titulación: “Determinación de la capacidad antioxidante en
alimentos tradicionales” realizado por Fabián Efraín Zaquinaula Iñahuazo ha sido
orientado y revisado durante su ejecución, y cumple con los requisitos establecidos en
las normas generales para la graduación en la Universidad Técnica Particular de Loja
por cuanto se aprueba la presentación del mismo.
Loja, octubre del 2016.
f)…………………………
Mg. Sc. Jorge Geovanny Figueroa Hurtado
C.I: ……………………………………………
III
DECLARACIÓN DE AUTORIA Y CESIÓN DE DERECHOS
“Yo Fabián Efraín Zaquinaula Iñahuazo declaro ser autor del presente trabajo de
titulación: ´Determinación de la capacidad antioxidante en alimentos tradicionales´ de la
Titulación de Bioquímica Y Farmacia, siendo Mg. Sc. Jorge Geovanny Figueroa Hurtado
director del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular
de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además
certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente
trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art.88 del Estatuto Orgánico
de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente
dice: “Forman parte del patrimonio Universidad la propiedad intelectual de
investigaciones, trabajos científicos o técnicos y tesis de grado que se realicen a través,
o con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”.
Loja, Octubre del 2016
F: ………………………………………..
Zaquinaula Iñahuazo Fabián Efraín
C.I: 1900465764
IV
DEDICATORIA
A Dios, por ser el creador de todo, por guiarme, bendecirme y acompañarme día a día
en el transcurso de mi vida.
A mis padres por su apoyo, comprensión, sacrificio, amor y constante aliento en todo
momento, sobre todo por creer en mí; todo lo que soy se lo debo a ustedes. En
especial a mi madre Elsie, la distancia nunca significó que estuviese alejada de mí.
A mis hermanos que con igual cariño han sabido inspirarme a más cada día,
especialmente Elvis, todo lo que hago lo haré para tu beneficio.
V
AGRADECIMIENTO
A Dios, siempre en primer lugar, por todas las bendiciones que me brinda, por el don
de fe que me ha concedido y por permitirme hacer realidad uno más de mis sueños.
Al Mg. Sc. Geovanny Figueroa Hurtado, quien como director de tesis ha sabido
compartir sus conocimientos y experiencia, para poder guiarme correctamente en la
realización de este proyecto, gracias también por su paciencia y ayuda.
A los Ingenieros: María Del Cisne Guamán y Felipe Reyes, por su colaboración como
miembros del jurado de tesis, que han sabido guiar esta investigación con sus
observaciones y sugerencias, por su tiempo y dedicación.
A mis profesores, los cuales han sido mis maestros en todos estos años y han sabido
despejar mis inquietudes con sus conocimientos, durante mi crecimiento académico,
en especial a la Bq. Andrea Vintimilla, gracias por tanta paciencia.
A mi familia, por ser el motor en toda mi vida, por creer en mí y por su cariño infalible.
.
VI
TABLA DE CONTENIDOS
CARÁTULA .……………………………………………………………………………………. I
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ........................... II
DECLARACIÓN DE AUTORIA Y CESIÓN DE DERECHOS ....................................... III
DEDICATORIA ............................................................................................................ IV
AGRADECIMIENTO ..................................................................................................... V
NOMENCLATURA ...................................................................................................... IX
RESUMEN .................................................................................................................... 1
ABSTRACT .................................................................................................................. 2
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 3
1. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 5
1.1. Firigüelo (Vigna unguiculata) .................................................................................... 6
1.2. Zarandaja (Dolichos lablab) ...................................................................................... 7
1.3. Amaranto (Amaranthus spp.) .................................................................................... 8
1.4. Radicales libres, estrés oxidativo y antioxidantes ................................................. 9
1.5. Extracción de antioxidantes .................................................................................... 12
1.6. Determinación de la capacidad antioxidante ....................................................... 13
1.6.1. DPPH (radical 2,2difenil-1-picrilhidrazil). ...................................................... 13
1.6.2. ABTS. ................................................................................................................. 14
1.6.3. FRAP. ................................................................................................................. 14
1.7. Contenido de Fenoles Totales ................................................................................ 15
2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 16
2.1. Muestras .................................................................................................................... 17
VII
2.2. Reactivos ................................................................................................................... 17
2.3. Método Experimental ............................................................................................... 17
2.3.1. Preparación de las muestras. ......................................................................... 17
2.3.2. Determinación de húmedad. ........................................................................... 18
2.3.3. Extracción de antioxidantes. ........................................................................... 18
2.3.4. Cuantificación de la capacidad antioxidante. ............................................... 19
2.3.5. Determinación de fenoles totales. .................................................................. 22
2.4. Análisis estadístico ................................................................................................... 23
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 25
3.1. Análisis DPPH ........................................................................................................... 27
3.2. Análisis ABTS ........................................................................................................... 29
3.3. Análisis del Poder Antioxidante Reductor del Hierro (FRAP) ............................ 31
3.4. Análisis de Fenoles Totales .................................................................................... 32
CONCLUSIONES ....................................................................................................... 35
RECOMENDACIONES ............................................................................................... 36
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 43
ANEXOS .................................................................................................................... 50
Anexo A. Determinación de humedad .............................................................................. 44
Anexo B. Cuantificación de la capacidad antioxidante (DPPH) .................................... 46
Anexo C. Cuantificación de la capacidad antioxidante (ABTS) .................................... 50
Anexo D. Cuantificación de la capacidad antioxidante (FRAP) .................................... 54
Anexo E. Determinación de fenoles totales por el método Folin-Ciocalteu ................ 58
Anexo F. Análisis estadístico .............................................................................................. 62
VIII
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS Y FIGURAS
Fotografía 1. Firigüelo …………………………………………………………………….7
Fotografía 2. Zarandaja …………………………………………………………….…….8
Fotografía 3. Amaranto …………………………………………………………………...9
Figura 1. Preparación de extractos ……………………………………………………..19
Figura 2. Diagrama del método DPPH …………………………………………………20
Figura 3. Diagrama del método ABTS ………………………………………………….21
Figura 4. Diagrama del método FRAP ………………………………………………….22
Figura 5. Diagrama del método Fenoles Totales ………………………………………23
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Análisis DPPH en amaranto, firigüelo y zarandaja ……………………….28
Gráfica 2. Análisis ABTS en amaranto, firigüelo y zarandaja ………………………. 30
Gráfica 3. Análisis FRAP en amaranto, firigüelo y zarandaja …….………………….32
Gráfica 4. Análisis de Fenoles Totales en amaranto, firigüelo y zarandaja …….…..34
IX
NOMENCLATURA
ABTS: 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico)
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
FRAP: Capacidad de reducción férrica del ion
TPTZ: 2, 4, 6 - tripiridil-s-triazina
TROLOX: Ácido 6- hidroxi-2, 5, 7, 8- tetrametilcromo- 2- ácido carboxílico
MeOH= Metanol
HCl: Ácido clorhídrico
H20= Agua
Na2CO3: Carbonato de sodio
K2S2O8: Persulfato de potasio
FeCl3.6H2O: Cloruro férrico hexahidratado
Fe2+= Hierro (estado de oxidación ferroso)
Fe3+= Hierro (estado de oxidación férrico)
μmol ET/g: Micromoles equivalentes de trolox/gramo de muestra
mg EAG/100 g: Miligramos equivalentes de ácido gálico/100 gramos de muestra
FT: Fenoles totales
Abs: Absorbancia
BF: Base fresca
BS: Base seca
Co: Concentración luego de aplicación de pendiente e intersección
Cf= Concentración final en µmol ET/g; o en mg EAG/100 g
ET= Estándar
ST= Sólidos totales
g: Gramo
mg: Miligramo
L: Litro
ml: Mililitro
μL: Microlitro
N: Normal
M: Molar
X
mM: Milimolar
µM: Micromolar
rpm: Revoluciones por minuto
nm: Nanómetro
1
RESUMEN
En la presente investigación se trabajó con tres tipos de especies vegetales, las cuales
incluyeron 2 legumbres distintas: firigüelo (Vigna unguiculata) y zarandaja (Dolichos
lablab); y un pseudocereal: amaranto (Amaranthus spp). Se analizó muestras de distinto
lugar de procedencia. Se realizaron extracciones secuenciales con metanol/agua (50:50
v/v) y acetona/agua (70:30 v/v) y ambas extracciones se combinaron, y a partir de ésta
se cuantificó la capacidad antioxidante. Las muestras de firigüelo provenientes del
cantón Macará de la ciudad de Loja presentaron el mayor potencial antioxidante en los
métodos: ABTS (27,5 μmol ET/g BS), DPPH (27,8 μmol ET/g BS), FRAP (18,3 μmol
ET/g BS) y contenido de fenoles totales (288 mg EAG/100 g BS). Todas las muestras
estudiadas demostraron ser fuentes importantes de antioxidantes, sin embargo,
dependiendo del lugar de procedencia de la muestra se obtuvo mayor o menor
resultado, lo cual fue analizado estadísticamente.
Palabras clave: capacidad antioxidante, fenoles totales, ABTS, DPPH, FRAP.
2
ABSTRACT
In the present investigation we worked with three types of plant species, which included
2 different legumes: cowpea (Vigna unguiculata) and hyacinth bean (Dolichos lablab);
and a pseudocereal: amaranth (Amaranthus spp). There were two samples of each
species with different place of origin. Sequential extractions were performed with
methanol/water (50:50 v/v) and acetone/water (70:30 v/v) and both extractions were
combined, and from this the antioxidant capacity was quantified. The samples of cowpea
from the Macará canton of the city of Loja presented the highest antioxidant potential in
the methods: ABTS (27,5 μmol TE/g DW), DPPH (27,8 μmol ET/g DW), FRAP (18,3
μmol TE/g DW) and total phenol content (288 mg GAE/100 g DW). All the samples
studied proved to be important sources of antioxidants, however, depending on the place
of origin of the sample, a higher or lower result was obtained, which was analyzed
statistically.
Key words: antioxidant capacity, total phenols, ABTS, DPPH, FRAP.
3
INTRODUCCIÓN
La producción de granos andinos es un recurso vital en el aspecto alimenticio de la
población mundial, sin embargo, muchos de sus beneficios no son conocidos por gran
parte de la población (Sven Jacobsen & Sherwood, 2002). El consumo de legumbres se
correlaciona con beneficios positivos para la salud tales como propiedades
hipocolesterolemiantes, anticancerígenas e hipoglucemiantes (Cardador, Loarca, &
Piña, 2002).
Ecuador a pesar de ser un país geográficamente pequeño, cada km2 de éste alberga
una gran cantidad de plantas, es por tal motivo que Ecuador está entre los 17 países
más biodiversos del mundo, con más de 16000 especies de plantas (Coba & Tivi, 2010).
Además, se determinó que en Ecuador existen 5172 plantas útiles, de las cuales 3118
especies han sido usadas durante siglos por numerosas comunidades con fines
medicinales, y la mayoría de estas plantas medicinales son hierbas, arbustos y árboles
(De La Torre, Balslev, Navarrete, & Macía, 2008). Los cultivos andinos, tanto granos,
tubérculos, raíces, frutales, aromáticas y medicinales, tienen un gran potencial de
transformación en productos procesados, sin embargo, es muy importante que en esta
transformación, no se pierdan los numerosos beneficios que conlleva el consumirlos (S
Jacobsen, Mujica, & Ortiz, 2003).
Tal es el caso del firigüelo, amaranto y zarandaja, en los cuales se ha comprobado que
contienen sustancias que ayudan a la supervivencia de la planta, además de ejercer un
efecto antioxidante, por tal motivo su consumo es de gran beneficio, ya que pueden ser
útiles en la prevención de muchas patologías, entre éstas, diversos tipos de cáncer
(Escudero, Albarracín, Lucero López, & Giménez, 2011; Ojeda, 1991; Vargas & Villamil,
2012).
La tecnología médica ha avanzado significativamente en proporcionar información sobre
las enfermedades, su fisiopatología, tratamiento, y más importante aún, su prevención;
es así por ejemplo, la participación de los procesos oxidativos y producción de radicales
libres en el desarrollo de patologías, y como los antioxidantes nos brindan una
protección contra las mismas (Venereo-Gutiérrez, 2002),
Se han realizado estudios que proporcionan valiosa información acerca de las
propiedades antioxidantes de muchas variedades de granos y cereales, sin embargo,
en nuestro país y aún más en nuestra ciudad esos estudios son escasos (Kraujalis,
4
Venskutonis, Pukalskas, & Kazernavičiute, 2013; Marathe, Rajalakshmi, Jamdar, &
Sharma, 2011). El objetivo del presente trabajo fue cuantificar la capacidad antioxidante
y los fenoles totales de extractos obtenidos a partir de muestras de legumbres y cereales
como el firigüelo, zarandaja y amaranto; y de esta manera proporcionar valiosa
información que pueda incentivar su consumo local. Para lo cual se dividió esta
investigación por capítulos, los cuales contienen temas y subtemas. El primer capítulo
o marco teórico tuvo un enfoque justamente teórico, donde se analizaron estudios y
antecedentes en general referentes al problema de investigación. El siguiente capítulo
titulado Materiales y métodos, se centra en la parte práctica de la investigación,
explicando los materiales y reactivos que se usarán, al igual que la metodología a seguir,
la cual fue ya determinada por otros autores en investigaciones previas. En el último
capítulo, nos enfocamos en los resultados obtenidos, su interpretación y comparación
con estudios previos, para lo cual también nos servimos de la ayuda de gráficas.
Es importante destacar la facilidad de conseguir las muestras vegetales analizadas, ya
que al ser productos que se cosechan en la provincia de Loja, se pueden conseguir con
facilidad en los principales mercados comerciales a precios bajos, sin embargo, un
inconveniente fue que, al no haber investigaciones científicas sobre el potencial
antioxidante en estas muestras en nuestro país, se tuvo que tomar como referencia para
la comparación de resultados, investigaciones realizadas en otros países. Al final de
esta investigación pudimos determinar la capacidad antioxidante y fenoles totales de las
muestras mencionadas, corroborando que son una fuente importante de antioxidantes,
y proporcionando información valiosa que pueda incentivar su consumo e impulsar otras
investigaciones similares.
1. MARCO TEÓRICO
6
1.1. Firigüelo (Vigna unguiculata)
También conocida como frejol caupí o frijol de Castilla (Fotografía 1); es una leguminosa de
la familia de las Fabáceas, originaria de África e India, y ampliamente cultivada en áreas
tropicales y subtropicales (Araméndiz-Tatis & Combatt-caballero, 2016). Es cultivada para el
consumo humano y animal, siendo un alimento básico que proporciona distintos beneficios,
como fuente de proteínas, vitaminas, entre otros, y siendo básica en muchos países,
especialmente para poblaciones de bajos recursos económicos, debido a la facilidad y bajo
costo de producción (Nassourou, Njintang, Noubissié, Nguimbou, & Bell, 2016; De la Pava S
& Sepúlveda-cano, 2015).
Estudios realizados en esta planta han comprobado la existencia de compuestos con
propiedades antioxidantes, algunos de los cuales son esenciales para la misma planta
(Cardona-Ayala & Jarma-Orozco, 2013), y que ejercen una función protectora contra algunas
especies altamente reactivas, igualmente se encontraron algunos compuestos fenólicos
como: ácido caféico, ácido gálico, pirogagol, ácido 4-hidroxibenzoico, y también se encontró
la presencia de flavonoides (Ayedemi & Olorunsanya, 2012; Urarte, Asensio, Tellechea, Pires,
& Moran, 2014). En un estudio comparativo sobre la capacidad antioxidante de diferentes
variedades de legumbres, realizado por Marathe et al. (2011) se comprobó que entre ciertos
tipos de firigüelo, el contenido de fenoles totales varía desde 148 ± 2,8 mg EAG/ 100 g
muestra, hasta 637,8 ± 5,4 mg EAG/ 100 g muestra, mostrando que las variedades de firigüelo
estudiadas presentan desde un contenido moderado de compuestos fenólicos, hasta un alto
contenido fenólico, sin embargo, este contenido total de compuestos fenólicos depende de
múltiples factores (Arranz-Martínez, 2010)
La hidrólisis enzimática en el firigüelo, generan fracciones peptídicas con propiedades
farmacológicas, estas sustancias son capaces de regular eventos fisiopatológicos asociados
al síndrome metabólico, como por ejemplo, reguladores de la enzima convertidora de
angiotensina para reducir la presión arterial, como secretagogos de insulina o como
hipolipemiantes (Melorose, Perroy, & Careas, 2015), es por esto, que el consumo de firigüelo
está asociado con una disminución en el riesgo de desarrollo de enfermedades crónicas no
transmisibles, por ejemplo diabetes, además de ayudar en situaciones de presión arterial
alterada e hiperlipidemias (Figuerola, María, & Avendaño, 2008)
7
Fotografía 1. Firigüelo
Fuente: El autor
1.2. Zarandaja (Dolichos lablab)
La zarandaja, también llamada Chaucha japonesa (Fotografía 2), es una leguminosa cultivada
en zonas tropicales y subtropicales, y sus vainas maduras son ricas en proteínas, vitaminas,
carbohidratos, fibra y otros nutrientes, y es una fuente alimenticia barata si comparamos con
fuentes de origen animal en los países en desarrollo (Castillo, 2012; Das & Fakir, 2014).
La zarandaja es uno de los granos más consumidos en américa latina y por su contenido de
glucósidos cianogénicos hace que deba haber una adecuada cocción antes de su consumo
(Castillo, 2012). Constituye uno de los cultivos considerados de mayor importancia para el
agricultor de la provincia de Loja, debido a sus características morfológicas, hábito de
crecimiento, variedad genética y rendimiento; aunque actualmente solo se dispone de
estudios básicos de esta leguminosa tanto como alimento y su importancia industrial (Ojeda,
1991).
Se ha comprobado que los granos de esta leguminosa contienen enzimas y otros compuestos
capaces de transformar especies reactivas de oxígeno en compuestos mucho menos dañinos,
entre las enzimas que forman el componente enzimático antioxidante se encuentran:
peroxidasa, catalasa, superóxido dismutasa, glutatión reductasa y polifenol oxidasa, mientras
que los componentes antioxidantes no enzimáticos incluyen ascorbato, el glutatión, fenoles,
entre otros (D’Souza & Devaraj, 2011; Yancey, Clark, Hand, Bowlus, & Somero, 1982).
La zarandaja es una buena fuente de antioxidantes, según el estudio realizado por Marathe
et al. (2011) el contenido de fenoles totales entre ciertos tipos de zarandaja van desde 32,5 ±
0,2 mg EAG/100 g muestra hasta 101,7 ± 3,8 mg EAG/100 g de muestra.
8
El potencial compuesto químico Kievitona, el cual es un isoflavonoide, que combate contra el
cáncer de mama, también fue encontrado en la zarandaja, además de otros compuestos
beneficiosos (Oboh, 2006; Soong & Barlow, 2004). Además, estudios diversos reportan que
la inclusión de esta leguminosa en la dieta genera en los consumidores beneficios óptimos de
salud, junto con la asimilación de nutrientes sin consecuencias negativas, por ejemplo,
beneficios debido al potencial efecto hipocolesterolémico de la misma (Maheshu, Priyadarsini,
& Sasikumar, 2013).
Fotografía 2. Zarandaja Fuente: El autor
1.3. Amaranto (Amaranthus spp.)
El amaranto es un pseudocereal y un grano antiguo (Fotografía 3), perteneciente a la familia
Amaranthaceae (Chauhan, Saxena, & Singh, 2015; Coombes, 2012). Esta familia tiene una
amplia distribución en las regiones tropicales y subtropicales e incluyen cerca de 170 géneros
y 2300 especies, pero en nuestro país se han registrado 20 géneros y 84 especies, de las
cuales 21 son endémicas (Montufar & Tye, 2000).
El cultivo del amaranto en América se remonta a más de siete mil años, siendo básico en la
alimentación de algunos pueblos indígenas y actualmente es parte de la agricultura
tradicional, además algunos escritos procedentes de China, India y Egipto atestiguan el uso
del amaranto tanto nutricional como medicinal (Box, 2005). Además se conoce que tiene un
potencial económico, debido a que la familia Amaranthaceae tiene varios usos, especialmente
en la alimentación y medicina, y las especies centroamericanas se usaban en diversos rituales
religiosos en diversas culturas (Freire-Fierro, 2004).
En la actualidad, se han realizado algunos estudios sobre la actividad antioxidante de
amaranto y se muestra que este pseudocereal exhibe una actividad antioxidante
9
principalmente por su contenido de polifenoles, antocianinas, flavonoides, y tocoferoles
(Escudero et al., 2011). Además se ha revelado que es una fuente importante de hierro, calcio,
magnesio y zinc, así como también de riboflavina, vitamina C, niacina, y tiamina (Becker et
al., 1981). Un estudio llevado a cabo por Li et al. (2015) para determinar el contenido de
fenoles totales en semillas de amaranto, encontró un contenido total fenólico desde 129 hasta
155 mg EAG/ 100g BS.
El alto valor nutritivo del amaranto es beneficioso en el tratamiento de anemias y desnutrición
por lo que se recomienda que sea parte de la dieta, especialmente en mujeres embarazadas
y niños; así también en el caso osteoporosis, y además el grano de amaranto ha sido probado
y reconocido como un alimento libre de gluten por lo que se considera apto para incorporarse
en la dieta de los pacientes con enfermedad celíaca (Becker et al., 1981; Chauhan et al., 2015;
Yawadio Nsimba, Kikuzaki, & Konishi, 2008).
Fotografía 3. Amaranto Fuente: El autor
1.4. Radicales libres, estrés oxidativo y antioxidantes
Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón desapareado o
libre, y debido a esto son muy reactivos y tienden a captar un electrón de moléculas estables
con el fin de alcanzar su propia estabilidad electroquímica (Youngson, 2003). Una vez que el
radical libre ha conseguido sustraer el electrón que necesita, la molécula que se lo cedió
pierde su estabilidad y se convierte a su vez en un radical libre por quedar con un electrón
desapareado, iniciándose de esa manera una verdadera reacción en cadena que provoca
daños significantes en nuestras células (Uwalsky, 2006).
Según Olivares et al. (2010), los radicales libres, producidos normalmente durante el
metabolismo aerobio se utilizan en diversos procesos fisiológicos como un mecanismo de
defensa contra agentes infecciosos. Cuando existen condiciones metabólicas normales
también debe existir un balance entre los procesos oxidantes, donde hay producción de
10
radicales libres, y los sistemas de defensa antioxidante y reparación del daño oxidante, sin
embargo cuando no se mantiene un balance entre estos, ya sea por la pérdida o disminución
del sistema protector, por un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno o
por ambos factores simultáneamente, se dice que existe un estado de estrés oxidante, que
ocasiona graves disfunciones metabólicas y posterior daño celular (Laguna, Piña, Martínez,
Pardo, & Riveros, 2013). Estos radicales libres tienen una función fisiológica en el organismo,
participan en la fagocitosis, favorecen la síntesis de colágeno, favorecen la síntesis de
prostaglandinas, activan enzimas de la membrana celular, disminuyen la síntesis de
catecolaminas por las glándulas suprarrenales, modifican la biomembrana y favorecen la
quimiotaxis, sin embargo, como ya se mencionó, estas moléculas son altamente reactivas,
capaces de dañar a las diversas biomoléculas de nuestras células y provocar problemas
importantes en las mismas (Venereo-Gutiérrez, 2002).
Las principales especies reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes son:
Radical hidroxilo (HO)+
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Anión superóxido (O2 )
Oxígeno singlete (1O2)
Oxígeno nítrico (NO)
Peróxido (ROO)
Semiquinona (Q)
Ozono
Nuestro cuerpo sufre diariamente el ataque de los radicales libres con los consiguientes
problemas de salud, entre otras enfermedades, promueven la arteriosclerosis, el cáncer y
envejecimiento prematuro de la piel (Ortemberg, 2004). Además diversos estudios relacionan
a los radicales libres con el envejecimiento y se propone que la pérdida de funciones celulares
que acarrea el envejecimiento es el resultado de la acumulación del daño oxidante ocasionado
por los radicales libres sobre los distintos componentes celulares (Laguna et al., 2013).
Por otro lado, los antioxidantes son compuestos químicos que interactúan con los radicales
libres uniéndose a los mismos, para neutralizarlos y favorecer a su eliminación (Ortemberg,
2004). Son un conjunto de compuestos químicos o productos biológicos que contrarrestan los
efectos nocivos de los radicales libres (López et al., 2012), y de esta manera detienen o
inhiben significativamente el estrés oxidativo (Laguna et al., 2013).
Para que una sustancia sea considerada antioxidante, tendría que ser capaz, en cantidades
bajas, de competir con otros sustratos oxidables y por tanto, retrasar o inhibir la oxidación de
11
dichos sustratos, además, deben tener alta efectividad y versatilidad para poder combinarse
con una importante variedad de especies de radicales libres (González & Cavia, 2011).
Debido a que el cuerpo no puede formar antioxidantes de forma espontánea, sino que se los
debe consumir en la dieta, estos compuestos presentan un alto interés nutricional, por su
contribución al mantenimiento de la salud debido a las propiedades benéficas de su actividad
antioxidante (Torres et al., 2008). Entre los nutrientes que parecen poseer propiedades
antioxidantes se incluyen las vitaminas E, C y A, el β-caroteno, el selenio, entre otros
(Thompson, Manore, & Vaughan, 2008).
Los antioxidantes, tanto sintéticos como naturales, se añaden a aceites y grasas, así como a
alimentos, para prevenir la formación de colores y flavores no deseables y de otros
compuestos que se originan en la oxidación de los lípidos (Maestro & Borja, 1993). Los
antioxidantes sintéticos más usados son el terbutil-hidroxi-tolueno, el terbutil-hidroxi-anisol y
la terbutil-hidroxi-quinona (Derache, 1990).
Los antioxidantes sintéticos mencionados han presentado muchos inconvenientes, lo que ha
provocado que se compruebe su seguridad en los alimentos, y de igual manera ha provocado
que las investigaciones se enfoquen en encontrar productos naturales con actividad
antioxidante (Maestro & Borja, 1993). Entre los antioxidantes naturales podemos encontrar el
ácido ascórbico (Vitamina C) y todos sus derivados, el palmitato de ascorbilo, y los tocoferoles
(Kuklinski, 2003)
También cabe recalcar la importancia de los compuesto polifenólicos, los cuales son los
compuestos bioactivos antioxidantes más abundantes en la dieta, y son producto del
metabolismo secundario de las plantas, a las cuales también protegen del ataque de
patógenos y herbívoros; y estructuralmente poseen anillos aromáticos y dobles enlaces
conjugados a partir de los cuales ejercen su acción antioxidante (Arranz-Martínez, 2010;
Gimeno-Creus, 2004)
Durante los últimos años el interés en los compuestos fenólicos ha ido en aumento, debido a
su efecto benéfico contra algunas enfermedades, como por ejemplo, ciertos cánceres y
desordenes cardíacos, esto gracias a su poderosa actividad antioxidante (Gracia-Nava, 2000).
Entre estos compuestos se destacan: alcoholes y ácidos fenólicos, ácidos cinámicos, sus
derivados y glucósidos, cumarinas, flavonoides y sus glucósidos, catequinas, taninos, entre
otros (Maestro & Borja, 1993). Muchos científicos han comprobado el potencial antioxidante
de los polifenoles en frutas y verduras y su relación en la disminución del riesgo de
enfermedades degenerativas (Kaur & Kapoor, 2001), además de la existencia de la relación
entre el consumo de alimentos de origen vegetal y los beneficios para la salud, por ejemplo,
12
la reducción en las tasas de enfermedades isquémicas del corazón, diabetes, ciertos tipos de
cáncer, y la disminución del riesgo de obesidad, dislipemia e hipertensión (Sabaté, 2005).
Los sistemas enzimáticos y endógenos de defensa del organismo pueden ser insuficientes
para neutralizar la acción oxidativa que provocan los radicales libres asociados al estrés
oxidativo, y por tal motivo es sumamente importante el consumo de alimentos que sean
considerados fuente de antioxidantes, y de esta manera evitamos o disminuimos los daños
importantes en proteínas, lípidos y ADN provocados por los radicales libres (López & Medina,
2009).
Los alimentos de origen vegetal son una fuente importante de vitaminas antioxidantes como
α-tocoferol, β-caroteno y vitamina C, aparte de otras sustancias fitoquímicas con potente
efecto antioxidante como los compuestos fenólicos, por ejemplo, los flavonoides, los cuales
son otras sustancias con propiedades antioxidantes contenidas en los productos vegetales, y
según estudios epidemiológicos, una dieta de alimentos ricos en flavonoides protege contra
enfermedades humanas asociadas con el estrés oxidativo (Nassourou et al., 2016). Las
hierbas aromáticas y especias típicas de recetas mediterráneas como el perejil, laurel, tomillo,
pimentón y orégano, también contienen abundantes compuestos fitoquímicos con potentes
efectos antioxidantes (Rodés, Piqué, & Trilla, 2007).
1.5. Extracción de antioxidantes
Los compuestos polifenólicos presentes en alimentos se extraen generalmente con
disolventes acuoso-orgánicos. Esta extracción va a depender de múltiples factores, por
ejemplo, la naturaleza química, el grado de polimerización de los compuestos, del método de
extracción, polaridad de los solventes, del tamaño de partícula de la muestra y de las
sustancias que pueden interferir (Arranz-Martínez, 2010). Algo igualmente importante es el
tiempo de contacto que deben tener las muestras con los disolventes, por ejemplo, según
Krygier, Sosulski y Hogge (1982) el tiempo óptimo para la extracción de polifenoles libres y
esterificados es de 50-60 minutos, con una mezcla de metanol/acetona/agua.
Existe una gran cantidad de disolventes utilizados para la extracción de antioxidantes en
alimentos de origen vegetal, entre los más usados podemos destacar al metanol, etanol,
acetona, y mezclas de los mismos con agua en diferentes proporciones. Uno de los más
usados es la extracción de antioxidantes mediante dos tratamientos sucesivos con mezclas
de distintos disolventes (metanol/agua 50:50 v/v pH 2 y acetona/agua 70:30 v/v) debido a su
eficacia en alimentos de origen vegetal (Pérez-Jiménez & Saura-Calixto, 2007). Según un
estudio llevado a cabo por Pérez-Jiménez y Saura-Calixto (2005), en una extracción de
antioxidantes en salvado de trigo, los valores de la capacidad antioxidante que se obtuvieron
13
mediante la mezcla de disolventes antes mencionados fueron mayores a las que se obtuvieron
solo con uno de estos dos disolventes o con acetona, metanol y etanol combinados con agua.
Es habitual la utilización de disolventes acidificados (metanol/HCl) para una mejor extracción
y estabilidad de antocianidinas y proantocianidinas (Krygier et al., 1982).
1.6. Determinación de la capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante ha sido generalmente reconocida como una herramienta para
evaluar el potencial antioxidante de un compuesto puro o de un extracto en los alimentos, así
como también ser un índice útil para predecir la estabilidad oxidativa, pero también puede ser
considerada como un índice de potenciales benéficos para la salud (Isaza, Restrepo, López,
Ochoa, & Gil, 2010; Pellegrini et al., 2003)
La capacidad antioxidante total de una muestra está determinada por interacciones sinérgicas
entre diferentes compuestos, así como el modo de acción de cada uno de ellos, es por eso
que es necesario combinar más de un método para que la evaluación de la capacidad
antioxidante de una muestra sea más eficaz, y por tanto, se han desarrollado una gran
cantidad de métodos para evaluar la capacidad antioxidante de alimentos, basados en
distintos aspectos, como la reducción de metales (FRAP), la capacidad de captación de
radicales peroxilo (ORAC, TRAP), de radicales hidroxilo (ensayo de la desoxirribosa), de
radicales generados a partir de ciertas moléculas orgánicas (ABTS, DPPH); por lo que muchos
autores sugieren que al momento de evaluar la capacidad antioxidante de una muestra,
siempre se deben combinar al menos dos métodos, y que además estén basados en distintos
fundamentos (Frankel & Meyer, 2000; Pérez-Jiménez & Saura-Calixto, 2007)
Las técnicas que se han utilizado con mayor frecuencia para estimar las capacidades
antioxidantes en los productos y alimentos de origen vegetal para estudios clínicos incluyen
DPPH, ABTS y FRAP (Thaipong et al., 2006)
1.6.1. DPPH (radical 2,2difenil-1-picrilhidrazil).
El método fue descrito por Brand-Williams, Cuvelier y Berset (1995). Este método se basa en
la capacidad captadora de radicales libres de un extracto, reduciendo el catión DPPH (1,1-
Diphenyl-2-picrylhydrazyl) frente a los antioxidantes presentes en el compuesto estudiado, lo
que provoca una decoloración del mismo, que puede ser medido a 515 nm (Pérez-Jiménez &
Saura-Calixto, 2007; Thaipong et al., 2006).
El radical DPPH es una especie de radical orgánico estable. El ensayo de DPPH se utiliza en
todo el mundo en la cuantificación de la capacidad de captación de radicales. La capacidad
de los reactivos biológicos para captar el radical DPPH, se puede expresar como su magnitud
14
de la capacidad antioxidante (Deng, Cheng, & Yang, 2011) . La solución de alcohol DPPH es
de color morado oscuro, el cual desaparece en presencia de antioxidantes, lo que produce un
descenso de la absorbancia a 515 nm. DPPH es hidrófoba por lo que sus reacciones deben
ejecutarse en disolventes orgánicos, por ejemplo metanol (Schaich, Tian, & Xie, 2015).
1.6.2. ABTS.
El radical ABTS se genera a partir de su precursor el ácido 2,2-azinobis (3-etilbenzoatiazolín-
6-sulfónico) (ABTS). Es un método descrito por Arnao, Cano y Acosta (1999) el cual mide la
capacidad captadora de radicales libres a través de la decoloración del radical ABTS. Éste
método es capaz de determinar propiedades antioxidantes tanto hidrofílicas y lipofílicas.
En este método, el color azul/verde radical ABTS+, generado por la oxidación de ABTS con
persulfato potásico, se reduce en presencia de antioxidantes, y el grado de decoloración se
determina en un punto de tiempo fijo, por tanto, entre mayor es la capacidad antioxidante del
polifenol, mayor es la decoloración generado sobre el ABTS (Re et al., 1999)
1.6.3. FRAP.
El método FRAP fue desarrollado por Benzie y Strain (1996), el cual mide la capacidad que
tiene un compuesto para reducir el Hierro férrico (Fe3+) del complejo de la tripiridiltriazina
férrica al complejo ferroso (Fe2+) por un antioxidante en medio ácido. Esta reacción produce
un cambio de color que se puede determinar midiendo la absorbancia a 593 nm en 30 minutos
(Thaipong et al., 2006), según el método original el cambio de color se da en 4 minutos,
aunque este tiempo fue posteriormente ampliado hasta 30 minutos, debido a que a los 4
minutos el compuesto aún no ha reaccionado totalmente. Es uno de los métodos más
populares debido a su simplicidad y consistencia, además de no requerir equipos sofisticados.
Este método no se recomienda para compuestos lipofílicos debido a la incapacidad de los
carotenoides para reducir Fe3+ a Fe2+ (Pulido, Bravo, & Saura-Calixto, 2000; Benzie & Strain,
1996).
Cuanto mayor sea la cantidad de antioxidantes presentes en el compuesto estudiado, mayor
es la reducción y mayor es la concentración de TPTZ-Fe2+, con lo cual también será más alta
la absorbancia obtenida (Sulbarán et al., 2011). Básicamente los ensayos FRAP y ABTS+ son
los mismos, debido a que ambos tienen como ventaja la transferencia de electrones usando
una sal férrica con un potencial redox similar al usado en el ensayo ABTS+ (Preed & Watson,
2008).
15
1.7. Contenido de Fenoles Totales
El contenido de fenoles totales se determinó por el método Folin-Ciocalteu, que fue adaptado
por Swain y Hillis (1959). Este método consiste en la reacción entre el reactivo de Folin
Ciocalteu de color amarillo y los grupos fenólicos presentes en la muestra, lo cual produce un
complejo de color azul con máxima absorción a 725 nm (Isaza et al., 2010). Los compuestos
fenólicos, entre los cuales se encuentran los flavonoides, presentan una amplia ubicuidad en
la naturaleza. Son responsables del buen funcionamiento de las plantas y, en su relación con
el hombre, son utilizados para tratar desordenes cardiovasculares y prevenir algunos
cánceres (Gracia-Nava, 2000). Es un método que se fundamenta en su carácter reductor y
posterior neutralización con Na2CO3, mientras que los resultados son expresados en
equivalentes de ácido gálico (Thaipong et al., 2006).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
17
2.1. Muestras
Se trabajó con tres tipos de especies vegetales: amaranto, zarandaja y firigüelo. A su
vez, dos muestras de cada especie vegetal, provenientes de lugares distintos una de la
otra: dos muestras de amaranto, una proveniente de la parroquia Perucho en Pichincha
y la otra del cantón Celica perteneciente a Loja; dos muestras de zarandaja, una
proveniente de la parroquia Malacatos en el cantón Loja y la otra del cantón Zapotillo; y
dos muestras de firigüelo, provenientes de los cantones Macará y Celica en la provincia
de Loja. Las muestras mencionadas fueron obtenidas tanto en el mercado mayorista y
en el mercado central, ubicados en la ciudad de Loja.
2.2. Reactivos
Los reactivos utilizados para la extracción de antioxidantes, determinación de la
capacidad antioxidante y fenoles totales, se detallan a continación, así como la marca y
concentración de cada uno de ellos:
Extracción de antioxidantes: Metanol (99,9% PAI-ACS), acetona (99,8%) ,
ácido clorhídrico (37% PQ).
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (Sigma), (ácido 6- hidroxi-2,5,7,8-
tetrametilcromo- 2- ácido carboxílico) (97%) (Trolox) (Aldrich Chemistry).
ABTS: 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolín-6–sulfónico) (>98%) (Sigma), persulfato
de potasio (99% USP) (Sigma- Aldrich), (ácido 6–hidroxi–2,5,7,8-
tetrametilcromo- 2- ácido carboxílico) (97%) (Trolox) (Aldrich Chemistry).
FRAP: 2, 4, 6 - tripiridil-s-triazina (<98%) (TPTZ) (Sigma), acetato de sodio
trihidratado (USP) (Merck), ácido clorhídrico (37% PQ) (Sigma-Aldrich), cloruro
férrico hexahidratado (USP) (Merck).
Determinación de Fenoles totales: Folin-Ciocalteu 2N (Sigma-Aldrich),
carbonato de sodio (ISO) (Merck), ácido gálico (97.5-102.5%) (Sigma), metanol
(99,9% PAI-ACS).
2.3. Método Experimental
2.3.1. Preparación de las muestras.
Los análisis se realizaron sobre muestras de polvo seco del material vegetal. Por lo que
se procedió a triturar las muestras. Al tratarse de una materia prima con una textura
dura, no hubo problema en la trituración y el tamizaje. Las muestras se trituraron a 1400
rpm usando un molino vibratorio de discos marca RETSCH y posteriormente se tamizó
en un tamizador automático marca J. ENGELSMANN hasta un tamaño de partícula de
menor a 250 µm. Las muestras que no se usaron inmediatamente fueron empacadas al
vacío (Saura-calixto & Pérez Jiménez, 2007).
18
2.3.2. Determinación de húmedad.
Para la determinación de la humedad se utilizó el método descrito por la norma NTE
INEN 712 (2013). Una vez que las muestras fueron trituradas y tamizadas, se procedió
a determinar la humedad de cada muestras; cabe recalcar que este proceso se llevo a
cabo por duplicado. Se usó una estufa de marca Memmert, a temperaturas de 130°C.
Previamente se secó durante 24 horas las cápsulas a usar. Se registró el peso de las
cápsulas secas. Se colocó la cantidad de 2 g de muestra en cada cápsula, y se procedió
al anotar el peso que registraba la balanza analítica. Luego las cápsulas con la muestra
aún sin pérdida de humedad se llevaron a la estufa a una temperatura de 130°C, pasada
1 hora se sacaron las cápsulas y se dejó enfriar por 45 minutos en un desecador, para
que de esa manera las muestras no ganen humedad del ambiente. Pasado ese tiempo
se volvió a pesar y a registrar los pesos resultantes. Se realizó este procedimiento
continuamente hasta que la diferencia entre los dos últimos pesos registrados no
sobrepasen los 0,01g. Los cálculos para determinar la humedad se detallan en el anexo
A.
2.3.3. Extracción de antioxidantes.
Para extraer los antioxidantes de las muestras, se empleó el método descrito por Saura-
Calixto y Pérez Jiménez (2007). Cabe recalcar que todo el proceso se realizó por
triplicado. Se pesó 0,5 g de muestra seca, y se colocó dentro de tubos de centrífuga. La
muestra se puso en contacto con 20 mL de metanol/agua (50:50 v/v, pH 2, acidificado
con HCl 2N), y se mezcló en el agitador horizontal marca GFL durante 1 hora a 180 rpm.
Luego se procedió a centrifugar en una centrífuga marca DINAC a 2800 rpm durante 30
minutos. Una vez centrifugado se separó el sobrenadante del residuo, obteniéndose la
fracción A. El residuo se puso en contacto con 20 mL de acetona/agua (70:30 v/v), y se
agitó nuevamente durante 1 hora a 180 rpm, para luego centrifugarlo por otros 30
minutos a 2800 rpm. Tras la centrifugación se separó nuevamente el sobrenadante del
residuo, obteniéndose la fracción B. Ambos sobrenadantes (fracciones A y B) se
mezclaron y se obtuvo el extracto en el cual se llevará a cabo la determinación de la
capacidad antioxidante y de fenoles totales, efectuándose directamente tomando
alícuotas del mismo (Jiménez-Escrig, Jiménez-Jiménez, Pulido, & Saura-Calixto, 2001).
El proceso descrito se detalla en la Figura 1.
19
Figura 1. Preparación de extractos para la determinación de la capacidad antioxidante. Fuente: Saura-calixto y Pérez Jiménez, (2007) Elaborado por: El autor
2.3.4. Cuantificación de la capacidad antioxidante.
Los métodos usados en este estudio se han utilizado con frecuencia para estimar la
capacidad antioxidante en alimentos e incluyen: ABTS, DPPH y FRAP (Thaipong et al.,
2006).
2.3.4.1. DPPH.
Para la determinación de la capacidad antioxidante mediante el método DPPH, se usó
el método empleado por Brand-Williams et al. (1995), con modificaciones descritas por
Thaipong et al. (2006). En la figura 2 se describe la preparación de los reactivos, así
0,5 g de muestra
preparada: seca y tamaño
de partícula >250 µm
20 mL de MeOH:Agua
(50:50 v/v) pH 2 con HCl
2N
Agitar durante 1 hora a
180 rpm
Centrifugar a 2800 rpm
durante 30 minutos
Se separa sobrenadante
del residuo.
Se almacena el
sobrenadante (Fracción A)
El residuo se trata con 20 mL
de Acetona: Agua (70:30 v/v)
Agitar durante 1 hora a 180
rpm
Centrifugar a 2800 rpm
durante 30 minutos
Se separa sobrenadante
(Fracción B) del residuo. Combinar ambos
sobrenadantes
Determinación de
antioxidantes
20
como el procedimiento del mismo. La curva estándar fue lineal entre 25 y 800 mM de
Trolox. Los resultados se expresaron como micromoles equivalente de trolox por gramo
de muestra en base seca (µmol ET/g de muestra BS). Los cálculos y datos se detallan
en el Anexo B.
Preparación de reactivos
Muestras Estándares de Trolox
Figura 2. Diagrama del método DPPH. Fuente: Brand-Williams et al. (1995); Thaipong et al. (2006) Elaborado por: El autor
2.3.4.2. ABTS.
El método usado fue el descrito por Arnao et al. (1999) con algunas modificaciones
descritas por Thaipong et al. (2006). En la figura 3 se describe la preparación de los
reactivos para este método, asi como el procedimiento del mismo. Se usó un blanco con
metanol para calibrar el espectrofotómetro a cero. La curva estándar fue lineal entre 25
Solución stock:
24 mg DPPH aforar en 100 mL de MeOH
Solución de trabajo (ST DPPH):
10 mL de Solución stock + 45 mL de MeOH
Ajustar absorbancia a 1,1 ± 0,02 a 515 nm
Solución Madre (1032 µM)
Pesar 12,5 mg de Trolox y aforar en 50 mL de MeOH.
Se toma alícuotas determinadas, y se
aforan a 10 mL con MeOH, para llegar a
una concentración conocida:
Alícuota (mL) Concentración (µM)
0,25 26 1 103 2 207 4 413 6 620 7 723 9 930 9,5 981
Dejar reaccionar por 24
horas en oscuridad
Leer absorbancia a 515
nm
Se realiza el mismo procedimiento realizado
en las muestras.
150 µL de muestra +
2,85 mL de ST DPPH
21
y 600 mM de Trolox. Los resultados se expresaron como µmol ET/g de muestra BS. Los
cálculos y datos se detallan en el Anexo C.
Preparación de reactivos
Muestras Estándares de Trolox
Figura 3. Diagrama del método ABTS. Fuente: Arnao et al. (1999); Thaipong et al. (2006) Elaborado por: El autor
2.3.4.3. Poder antioxidante de reducción férrica (FRAP).
La determinación de la capacidad antioxidante mediante FRAP fue realizada mediante
el método descrito por Benzie y Strain (1996), con algunas modificaciones descritas por
Thaipong et al. (2006). En la Figura 4 se describe la preparación de los reactivos y
también el procedimiento del mismo. La curva estándar fue lineal entre 25 y 800 mM de
Solución Stock
ABTS 7,4 mM: 40,6 mg ABTS en 10 mL de Agua destilada
Persulfato de Potasio 2,6 mM: 7,02 mg de Persulfato de potasio en 10 mL de agua destilada.
Mezclar en cantidades iguales y dejar
reaccionar por 12 horas, a temperatura
ambiente y en oscuridad.
Solución de trabajo
1 mL de Solución Stock + 60 mL de metanol
Ajustar absorbancia a 1,1 ± 0,02 a 734 nm
Solución Madre (1032 µM)
Pesar 12,5 mg de Trolox y
aforar en 50 mL de MeOH.
Se toma alícuotas determinadas, y
se aforan a 10 mL con MeOH, para
llegar a una concentración
conocida:
Alícuota (mL) Concentración (µM)
0,25 26 1 103 2 207 3 310 4 413 5 516 6 620
150 µL de muestra +
2,85 mL de ST ABTS
Dejar reaccionar por 2
horas en oscuridad
Leer absorbancia a 734
nm
Se realiza el mismo
procedimiento realizado en
las muestras.
22
Trolox. Los resultados se expresan en µmol TE/g de muestra BS. Los cálculos y datos
se detallan en el Anexo D.
Preparación de reactivos
Muestras Estándares de Trolox
Figura 4. Diagrama del método FRAP. Fuente: Benzie y Strain (1996); Thaipong et al. (2006) Elaborado por: El autor
2.3.5. Determinación de fenoles totales.
La determinación de fenoles totales se realizó mediante el método Folin- Ciocalteu, que
fue descrito por Swain y Hillis (1959). La preparación de los reactivos y el procedimiento
del método se describe en la Figura 5. La absorbancia se midió a 725 nm, y los
Solución de trabajo FRAP
Buffer Acetato 300 mM: 310 mg de
Acetato de sodio trihidratado+ 1,6
mL de Ácido Acético; aforar en 100
mL de agua destilada; medir pH 3
Cloruro Férrico Hexahidratado
20 mM:54,1 mg de FeCl3.6H2O
aforados en 10 mL de agua
destilada
Solución Madre (1032 µM)
Pesar 12,5 mg de Trolox y aforar en 50 mL de MeOH.
Se toma alícuotas determinadas, y
se aforan a 10 mL con MeOH, para
llegar a una concentración
conocida:
Alícuota (mL) Concentración (µM)
0,25 26 1 103 2 207 3 310 4 413 5 516 6 620 7 723
Dejar reaccionar por 30
minutos en oscuridad
Leer absorbancia a 593
nm
Se realiza el mismo procedimiento realizado
en las muestras.
150 µL de muestra +
2,85 mL de solución
FRAP
TPTZ 10 mM:31,2 mg de
TPTZ, aforar a 10 mL en una
solución de HCl 40 mM
Mezclar 25 mL de Buffer acetato + 2,5
mL de TPTZ + 2,5 mL de FeCl3.6H2O
Calentar en baño maría hasta 37°C
antes de usar
23
resultados se expresan en equivalente de Ácido Gálico (EAG mg/100 g de muestra BS).
Para la curva de calibración se usó una solución madre de ácido gálico en
concentraciones de 0- 0,1 mg/mL. Los cálculos y datos se detallan en el Anexo E.
Preparación de reactivos
Muestras Estándares de Ácido Gálico
Figura 5. Diagrama del proceso de determinación de Fenoles Totales. Fuente: Swain y Hillis (1959) Elaborado por: El autor.
2.4. Análisis estadístico
Los resultados obtenidos de capacidad antioxidante y fenoles totales se expresaron
como media ± desviación típica y fueron analizados estadísticamente a través del
programa Minitab 16, mediante un análisis de varianza (ANOVA), seguido de un test de
Folin Ciocalteu 0,25 N: 1,25 mL de Folin-Ciocalteu aforar en 10 mL de Agua destilada
Carbonato de sodio 1N: 0,53 g de Na2CO3, aforar en 10 mL de agua destilada.
Solución Madre (1,98 mg/mL)
Pesar 50 mg de Ácido Gálico y
aforar en 25 mL de MeOH.
Se toma alícuotas determinadas, y
se aforan a 10 mL con MeOH, para
llegar a una concentración
conocida:
Alícuota (mL) Concentración (mg/mL)
0,05 0,01 0,1 0,02 0,2 0,04 0,3 0,06 0,4 0,08 0,5 0,1
150 µL de muestra + 2,4
mL de agua destilada +
150 µL de Folin-
Ciocalteu
Homogeneizar en un
vórtex durante 5
minutos
Dejar reaccionar
durante 3 minutos
Se realiza el mismo
procedimiento
realizado en las
muestras.
Añadir 300 µL de
Na2CO3 y mezclar
Incubar a temperatura
ambiente y en
oscuridad durante 2
horas
Leer absorbancia a 725
nm
24
rango múltiple (Tukey), con nivel de confianza del 95%, para determinar si existió
diferencia significativa de la cantidad de compuestos antioxidantes entre cada tipo de
muestra y entre las mismas muestras de distintos lugares de procedencia (Anexo F).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
27
A continuación se detallan los resultados de cada uno de los análisis para la determinación
de la capacidad antioxidante y fenoles totales, y se comparó los mismos con estudios previos
realizados en las mismas especies vegetales estudiadas. Es muy importante mencionar que
al no encontrarse estudios realizados bajo las mismas condiciones de extracción usadas en
la presente investigación, se procedió a comparar los resultados obtenidos con estudios
previos que más se asemejaban. Como se mencionó anteriormente, el proceso de extracción
de antioxidantes es sumamente importante y se ve afectada por múltiples factores, por
ejemplo, polaridad de los solventes seleccionados, tamaño de partícula de la muestra y
sustancias que pueden ejercer un efecto de interferencia (Arranz-Martínez, 2010).
3.1. Análisis DPPH
En la gráfica 1 se muestra la capacidad antioxidante medida por la captación de radicales
(DPPH) en muestras de firigüelo, zarandaja y amaranto. Los resultados mostraron una mayor
(p<0,05) capacidad antioxidante en las muestras de firigüelo, superando a las muestras de
zarandaja y amaranto. El firigüelo obtuvo 27,8 ± 1,05 y 26,1 ± 0,53 µmol Trolox/ g BS, la
primera y segunda muestra respectivamente, las cuales fueron estadísticamente iguales entre
sí (p>0,05). A pesar de que no se encontró estudios previos con condiciones iguales a las de
esta investigación en cuanto al proceso de extracción de antioxidantes, los resultados
obtenidos en este caso pueden compararse a los encontrados por Zia-Ul-Haq, Ahmad,
Amarowicz y De Feo (2013), en donde determinaron que los valores de la capacidad
antioxidante del firigüelo oscilan en un rango de 25,1 hasta 32,5 µmol Trolox/ g BS. Y aunque
las muestras analizadas en el presente estudio, y las analizadas en los estudios de referencia
pertenecen a sitios muy alejados geograficamente, los resultados son muy similares entre sí,
habiendo cierta diferencia que puede atribuirse a las condiciones de extracción mencionadas,
como la selección de solventes, tamaño de partícula de la muestra, entre otros (Arranz-
Martínez, 2010).
Por otro lado, las muestras de zarandaja mostraron resultados de 12,8 ± 1,46 y 12,6 ± 0,41
µmol Trolox/ g BS, la primera y segunda muestra respectivamente, las mismas que fueron
iguales estadísticamente (p>0,05). Si comparamos con un estudio llevado a cabo en China
por Wang et al. (2016), nuestros resultados van ser mayores, ya que en dicho estudio
determinaron que la capacidad antioxidante de la zarandaja fue de 4,8 ± 0.05 µmol Trolox/ g
BS; mientras que en otro estudio, realizado en el mismo país por Yao, Cheng, Wang, Wang y
Ren (2011), se obtuvieron resultados de 28.01 ± 1.17 µmol Trolox/ g BS. Nuevamente, esta
diferencia entre los resultados puede ser explicada por las condiciones de la extracción, por
ejemplo, en el último ensayo mencionado, hicieron, al igual que en el presente estudio una
doble extracción, con la diferencia de que se usaron una mezcla de metanol/agua y dos horas
28
de maceración en cada extracción, además de un menor tamaño de partícula. Todos estos
factores pueden ser la razón de que la eficacia de la extracción varíe y con esto, los resultados
del mismo (Arranz-Martínez, 2010).
Finalmente, las muestras de amaranto mostraron una capacidad antioxidante de 12 ± 0,89 y
14,5 ± 0,66 µmol Trolox/ g BS la primera y segunda muestra respectivamente, siendo superior
la muestra proveniente de Celica (p<0,05). Estos resultados muestran gran similitud con los
obtenidos por Kraujalis et al. (2013), en donde determinaron la capacidad antioxidante en dos
tipos de extractos de grano de amaranto. En el primer extracto se usó solamente acetona
como solvente, y mostró un resultado de 14.6 ± 0.65 µmol Trolox/ g BS; mientras que en el
segundo extracto, el cual fue realizado con una mezcla de metanol/agua (70:30), se obtuvo
9.5 ± 0.73 µmol Trolox/ g BS. El segundo extracto realizado en el estudio mencionado muestra
resultados menores a los obtenidos en el presente estudio, lo que se atribuye nuevamente a
la selección de solventes en el proceso de extracción, ya que según Pérez-Jiménez y Saura-
Calixto (2007), es recomendable que, en productos vegetales, se utilice al menos dos mezclas
de solventes de distinta polaridad para que exista una extracción de antioxidantes más
completa y eficaz.
Las medias entre columnas del mismo color que no comparten una misma letra minúscula son significativamente diferentes (p<0,05), en función del lugar de procedencia de la muestra. Las medias entre columnas que no comparten una misma letra mayúscula son significativamente diferentes (p<0,05) en función de todos los tipos de muestras.
Gráfica 1. Análisis DPPH en amaranto, firigüelo y zarandaja. Elaborado por: El autor
0
5
10
15
20
25
30
µM
ol
E T
rolo
x/
g B
S
Amaranto 1 Amaranto 2 Firiguelo 1 Firiguelo 2 Zarandaja 1 Zarandaja 2
Ba
Aa Aa
BCa BCa
C
Cb
29
3.2. Análisis ABTS
En la gráfica 2 se muestra la capacidad antioxidante de firigüelo, zarandaja y amaranto. Los
resultados entre las tres especies vegatales estudiadas nuevamente determinaron una mayor
(p<0,05) capacidad antioxidante en las muestras de firigüelo, obteniendose: 24,31 ± 1,71 y 25
± 1,12 µmol Trolox/ g BF, la primera y segunda muestra respectivamente, las mismas que
estadísticamente fueron similares (p>0,05). Estos resultados superan muy levemente a los
obtenidos por Deng et al. (2013), los cuales determinaron la capacidad antioxidante en
distintas legumbres, entre éstas el firigüelo y obtuvieron un resultado de 21,01 ± 1,11 µmol
Trolox/ g muestra BF. Por otro lado, un estudio llevado a cabo en legumbres de la India,
clasificó a las legumbres en función de sus valores de equivalentes de Trolox para la
capacidad antioxidante: bajo (<6,0 µmol ETrolox/g), moderado (6,0 a 12,0 µmol ETrolox/g) y
alto (>12,0 µmol ETrolox/g); y clasificó al firigüelo como una legumbre con moderado potencial
antioxidante (Marathe et al., 2011); según esta clasificación los resultados encontrados para
el firigüelo en esta investigación serían altos. La diferencia entre los resultados obtenidos y
los encontrados en ambos estudios previos se puede atribuir nuevamente a las condiciones
de extracción, que se ve determinada por diversos factores, por ejemplo, en este caso se
presume fue la selección de solventes la que produjo esta diferencia (Arranz-Martínez, 2010).
En el presente estudio se realizaron dos extracciones sucesivas con mezcla de disolventes
de distinta polaridad, además de una doble maceración dinámica; mientras que en el primer
estudio mencionado, se realizó simplemente una extracción con una mezcla de
tetrahidrofurano/agua, además cabe destacar que el tetrahidrofurano tiene menor polaridad
que los solventes usados en el presente estudio (Deng et al., 2013); mientras que en el
segundo estudio la extracción se realizó con una mezcla de metanol/agua (Marathe et al.,
2011). Según bibliografia lo más recomendable, en productos vegetales, es que en el
momento de la extracción de antioxidantes se use al menos dos mezclas de solventes de
distinta polaridad y de esa forma la extracción será más eficaz (Pérez-Jiménez & Saura-
Calixto, 2007); a esto se atribuye que los resultados obtenidos en el presente estudio excedan
a los encontrados en los dos estudios anteriormente mencionados.
Por otro lado, los resultados obtenidos en las muestras de zarandaja fueron: 9,57 ± 0,13 y
8,82 ± 0,3 µmol Trolox/ g BF, la primera y segunda muestra respectivamente, siendo mayor
(p<0,05) la primera muestra proveniente de la parroquia Malacatos. Estos resultados
sobrepasan a los obtenidos en el estudio anteriormente mencionado, en legumbres de la
India, en el que se analizaron 2 variedades de zarandaja: blanca y crema, clasificando a este
alimento como bajo en capacidad antioxidante, con resultados de 3.4 ± 0.05 y 4.6 ± 0.24 µmol
Trolox/ g BF, respectivamente (Marathe et al., 2011). Según esta clasificación, los resultados
30
obtenidos en el presente estudio se considerarían moderados. La diferencia entre los valores
obtenidos, puede atribuirse nuevamente al tipo de solventes usados en el proceso de
extracción, ya que las mezclas de solventes usadas en el presente estudio han proporcionado
los mejores resultados en la extracción de antioxidantes en diversos productos vegetales
(Pérez-Jiménez & Saura-Calixto, 2007),
En los que respecta a las muestras de amaranto, se obtuvieron los siguientes resultados: 8,96
± 0,25 µmol Trolox/ g BS y 7,83 ± 0,29 µmol Trolox/ g BS, la primera y la segunda muestra
respectivamente, en este caso siendo superior (p<0,05) la primera muestra proveniente de
Pichincha. Estos resultados superan a los obtenidos en un estudio llevado a cabo en plantas
de la región andina peruana, en el que se encontró un resultado de 3,7 ± 0,1 µmol Trolox/ g
BS. Cabe recalcar que en el estudio anteriormente mencionado, se utilizó solamente una
mezcla de metanol/agua en la extracción de los compuestos antioxidantes, lo que explica que
el resultado sea menor que el revelado en el presente estudio, además de la fuente del origen
de las muestras usadas, al igual que en el resto de productos analizados (Chirinos, Pedreschi,
Rogez, Larondelle, & Campos, 2013).
Las medias entre columnas del mismo color que no comparten una misma letra minúscula son significativamente diferentes (p<0,05), en función del lugar de procedencia de la muestra. Las medias entre columnas que no comparten una misma letra mayúscula son significativamente diferentes (p<0,05) en función de todos los tipos de muestras.
Gráfica 2. Análisis ABTS en amaranto, firigüelo y zarandaja. Elaborado por: El autor
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
µM
ol
E T
rolo
x/
g B
S
Amaranto 1 Amaranto 2 Firiguelo 1 Firiguelo 2 Zarandaja 1 Zarandaja 2
Ba BCb
Aa Aa
Cb BCa
31
3.3. Análisis del Poder Antioxidante Reductor del Hierro (FRAP)
En la gráfica 3 se observa la capacidad antioxidante cuantificada mediante el método FRAP,
en muestras de firigüelo, zarandaja y amaranto. Los resultados una vez más muestran una
mayor (p<0,05) capacidad antioxidante encontrada en el firigüelo, los resultados obtenidos en
el mismo fueron: 16,20 ± 0,21 y 14,03 ± 0,1 µmol Trolox/ g BF, la primera y segunda muestra
respectivamente, siendo significativamente distintos (p<0,05), y siendo superior la muestra
proveniente de Macará. Estos resultados se pueden comparar con los obtenidos en un estudio
realizado en vegetales en Africa, en el que obtuvieron resultados de 5,80 µmol Trolox/ g BF
(Katerere, Graziani, Thembo, & Nyazema, 2012). El estudio mencionado muestra una
capacidad antioxidante menor al encontrado en el presente estudio, lo que puede ser
atribuido, nuevamente, a la selección de los solventes, y otros factores en el proceso de
extracción, por ejemplo, en el estudio mencionado se llevó a cabo una sola extracción con
una mezcla de metanol/agua, además de no existir maceración en el proceso; mientras que
en el presente estudio las condiciones para la extracción fueron más eficientes (Pérez-
Jiménez & Saura-Calixto, 2007).
Por otro lado, los resultados encontrados en zarandaja fueron de 6,35 ± 0,27 µmol Trolox/ g
BS y 6,47 ± 0,98 µmol Trolox/ g BS, la primera y segunda muestra respectivamente, siendo
estadísticamente similares entre sí (p>0,05). Estos resultados son muy similares a los
encontrados por Wang et al. (2016) en el cual se encontró 5.187 ± 0.11 µmol Trolox/ g BS en
un extraco etanólico de granos de zarandaja.
Mientras que las muestras de amaranto fueron iguales estadísticamente (p>0,05) mostrando
una capacidad antioxidante de 5,83 ± 0,15 y 6,0 ± 0,26 µmol Trolox/ g BS, la primera y segunda
muestra respectivamente; estos resultados pueden ser comparados con los obtenidos por
Birosová (2012), el cual determinó la capacidad antioxidante en extractos de varios
pseudocereales, entre ellos el amaranto, en donde obtuvo 3,31 ± 0,15 µmol Trolox/ g BS. Los
resultados de este estudio son menores a los de nuestra investigación, lo que puede deberse,
nuevamente, a la selección de solventes, ya que en el estudio mencionado, los solventes
usados en la extracción fueron etil-acetato y DMSO, además de no existir maceración
dinámica en el proceso, ni un adecuado tamaño de partícula; factores que influyen en la
extracción y posteriormente en los resultados obtenidos (Arranz-Martínez, 2010; Pérez-
Jiménez & Saura-Calixto, 2007).
32
Las medias entre columnas del mismo color que no comparten una misma letra minúscula son significativamente diferentes (p<0,05), en función del lugar de procedencia de la muestra. Las medias entre columnas que no comparten una misma letra mayúscula son significativamente diferentes (p<0,05) en función de todos los tipos de muestras
Gráfica 3. Análisis FRAP en amaranto, firigüelo y zarandaja. Elaborado por: El autor
3.4. Análisis de Fenoles Totales
En la gráfica 4 se observa el contenido total de compuestos fenólicos presentes en las
muestras de firigüelo, zarandaja y amaranto. La muestra que mostró mayor (p<0,05) cantidad
de compuestos fenólicos fue el firigüelo, con: 287,7 ± 5 y 256,6 ± 6,8 mg EAG/ 100g BS, la
primera y segunda, respectivamente, siendo la muestra de Macará la que exhibe mayor
(p<0,05) potencial antioxidante. Estos resultados son muy similares a los encontrados por Xu
y Chang (2012), en donde la cantidad de fenoles totales va en un rango de 214 ± 2 mg EAG/
100 g muestra. La extracción de compuestos fenólicos en el estudio mencionado fue hecho
con una mezcla de acetona y agua, lo que explica que en nuestro estudio los resultados son
mayores, esto debido a que, los compuestos fenólicos, como flavonoides, pueden ser
extraidos con solventes polares (Gracia-Nava, 2000), y en nuestro caso se usó la mezcla de
metanol/agua como primera extracción, seguido de una segunda extracción con
acetona/agua, para asegurar una extracción más eficaz (Pérez-Jiménez & Saura-Calixto,
2007), ya que la acetona es considerado un solvente intermedio entre los muy polares y los
no polares por lo que puede extraer conjuntamente sustancias polares y no polares (Nuñez,
2008).
0,00
2,50
5,00
7,50
10,00
12,50
15,00
17,50
20,00µ
Mo
l E
Tro
lox
/ g
M B
S
Amaranto 1 Amaranto 2 Firiguelo 1 Firiguelo 2 Zarandaja 1 Zarandaja 2
Ca Ca
Bb
Aa
Ca Ca
33
Por otro lado, la zarandaja, mostró una cantidad menor (p<0,05) de compuestos fenólicos
respecto al firigüelo, como en todos los demás casos, esta vez la zarandaja obtuvo una
cantidad de fenoles totales de 112 ± 9,7 y 131 ± 7,8 mg EAG/ 100g BF, respectivamente la
primera y segunda muestra, siendo ambos estadísticamente similares (p>0,05). En un estudio
anteriormente mencionado, en relación al contenido de fenoles totales, clasifica a ciertas
legumbres en función de la cantidad de equivalentes de ácido gálico que presenten: bajo
contenido fenólico (<100 mg EAG/100 g BF), moderado contenido fenólico (100-200 mg
EAG/100 g BF) y alto contenido fenólico (>200 mg EAG/100 g BF) (Marathe et al., 2011).
Según el mismo artículo, la zarandaja se categoriza como un alimento de bajo contenido
fenólico, con un rango de 32,5-69,3 mg EAG/100 g BF, por debajo del firigüelo, el cual muestra
un contenido fenólico moderado. Si comparamos estos resultados con los obtenidos en la
presente investigación, se observa diferencia entre estos, ya que si clasificamos nuestros
resultados de acuerdo al estudio anteriomente mencionado, la zarandaja mostraría un
contenido fenólico moderado y el firigüelo un contenido fenólico alto. Esta diferencia puede
atribuirse una vez más a las condiciones de extracción, ya que en el estudio mencionado se
usó solamente metanol/agua para la extracción, además que el tamaño de partícula fue de
casi 3 veces superior al usado en el presente estudio, y debido a estos factores la extracción
fue menos eficiente que la nuestra (Arranz-Martínez, 2010; Pérez-Jiménez & Saura-Calixto,
2007).
Finalmente, el amaranto, mostró un contenido fenólico total de 148,9 ± 9 y 171,3 ± 10,4 mg
EAG/ 100g BS, la primera y segunda muestra respectiamente, siendo la muestra de Celica
superior a la de Pichincha (p<0,05). Estos resultados son muy similares a los resultados
obtenidos por Li et al. (2015) en tres variedades de semillas de amaranto, en el cual muestran
un contenido fenólico en un rango de 129- 155 mg EAG/ 100g. Hay que recalcar nuevamente
la importancia de la elección de los solventes dentro del proceso de extracción, por ejemplo,
en el ensayo mencionado se realizó la extracción con metanol al 80%, esto podría explicar
que nuestros resultados son superiores a los del ensayo mencionado.
34
Las medias entre columnas del mismo color que no comparten una misma letra minúscula son significativamente diferentes (p<0,05), en función del lugar de procedencia de la muestra. Las medias entre columnas que no comparten una misma letra mayúscula son significativamente diferentes (p<0,05) en función de todos los tipos de muestras
Gráfica 4. Análisis de Fenoles Totales en amaranto, firigüelo y zarandaja. Elaborado por: El autor
0
50
100
150
200
250
300
350m
g E
AG
/ 1
00
g M
BS
AMARANTO 1 AMARANTO 2 FIRIGUELO 1 FIRIGUELO 2 ZARANDAJA 1 ZARANDAJA 2
CDb
Ca
Aa
Bb
Da Da
35
CONCLUSIONES
Todas las legumbres analizadas demostraron ser una fuente importante de
antioxidantes, especialmente el firigüelo, el cual mostró el mayor (p<0,05) potencial
antioxidante entre las especies estudiadas.
De las muestras de firigüelo, el que mostró mayor capacidad antioxidante fue el
proveniente de Macará, el cual superó (p<0,05) a los resultados obtenidos en la
muestra proveniente de Celica, en dos de los cuatro métodos (FRAP y Fenoles
totales), mientras que en los otros dos métodos (DPPH y ABTS) fueron
estadisticamente similares (p>0,05).
De las muestras de amaranto, se obtuvo mejores resultados en la muestra proveniente
del cantón Celica, la cual sobrepasó (p<0,05) a los resultados obtenidos de la muestra
proveniente de Pichincha en dos de los cuatro métodos usados (DPPH y Fenoles
totales), mientras que en el método FRAP fueron iguales estadísticamente (p>0,05).
En cuanto a las muestras de zarandaja, ambas muestras no presentaron diferencia
significativa en tres de los cuatro métodos (DPPH, FRAP y Fenoles totales).
36
RECOMENDACIONES
Para investigaciones posteriores se recomienda expresar la actividad antioxidante
medida por la captación del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) como los
gramos de muestra necesarios para inhibir en 50% de un gramo de DPPH (IC50) para
facilitar la comparacion estudios previos.
Realizar optimización en el método de extracción de antioxidantes para conocer las
variables más eficaces que se pueden utilizar.
Realizar estudios cromatográficos en extractos de las tres muestras estudiadas para
conocer los compuestos presentes en cada una de ellas.
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ANEXOS
44
Anexo A. Determinación de humedad
Muestra # W Cap Seca (g)
W Cap+M Húmeda (g)
W1 (g) W2 (g) W C+ Muestra seca (g)
W Muestra Húmeda (g)
W. Muestra seca (g)
Humedad (%)
Prom (%)
Sólidos Totales
(%)
Amaranto 1
1 122,9515 124,9626 124,9123 124,8401 124,804 2,0111 1,8525 7,89
7,53 92,47 2 85,5103 87,5322 87,4566 87,4022 87,3851 2,0219 1,8748 7,28
3 91,3086 93,3923 93,3423 93,2798 93,2373 2,0837 1,9287 7,44
Amaranto 2
1 115,3414 117,3514 117,3045 117,2334 117,2115 2,0100 1,8701 6,96
6,79 93,21 2 111,7686 113,7939 113,6996 113,6614 113,658 2,0253 1,8894 6,71
3 125,3889 127,4195 127,3562 127,3098 127,2834 2,0306 1,8945 6,70
Firigüelo 1
1 31,0103 33,0112 32,809 32,7847 32,7844 2,0009 1,7741 11,33
11,46 88,54 2 23,3746 25,3784 25,1613 25,1445 25,1428 2,0038 1,7682 11,76
3 63,6429 65,6428 65,4483 65,4201 65,4172 1,9999 1,7743 11,28
Firigüelo 2
1 127,0163 129,0358 128,9833 128,8711 128,8525 2,0195 1,8362 9,08
8,79 91,21 2 89,5691 91,6477 91,6012 91,5288 91,4652 2,0786 1,8961 8,78
3 110,9581 112,9613 112,9102 112,8267 112,791 2,0032 1,8329 8,50
Zarandaja 1
1 31,0113 33,0125 32,787 32,7828 32,7824 2,0012 1,7711 11,5
11,5 88,46 2 23,3846 25,3684 25,1713 15,1575 25,1418 1,9838 1,7572 11,42
3 63,6329 65,6291 65,4183 65,4075 65,3975 1,9962 1,7646 11,6
Zarandaja 2
1 51,7884 53,7853 53,5764 53,576 53,5758 1,9969 1,7874 10,49
10,47 89,53 2 51,7944 53,7757 53,5694 53,5691 53,5683 1,9813 1,7739 10,47
3 50,153 52,1304 51,9275 51,9245 51,924 1,9774 1,771 10,44
45
W= Peso
W Cap Seca= Peso de la cápsula seca
W Cap+M húmeda= Peso de la cápsula con la muestra húmeda
W Cap+ M seca= Peso de la cápsula con la muestra seca
W1= Peso de la cápsula con la muestra tras 1 hora de deshidratación
W2= Peso de la cápsula con la muestra tras 2 hora de deshidratación
W Cap+ M seca= Peso de la cápsula con la muestra tras 3 hora de deshidratación
W. Muestra seca= Peso de la muestra seca
- La fórmula que se aplicó a cada una de las muestras fue la siguiente:
% ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =(W muestra húmeda − W muestra seca)
W muestra húmeda 𝑥 100
- Ejemplo (Amaranto 1)
% ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =(W muestra húmeda−W muestra seca)
W muestra húmeda 𝑥 100 =
2,0111−1,8525
2,0111 𝑥 100 = 7,89%
Este porcentaje fue sumado a los obtenidos en las otras repeticiones, se sacó la media y la respuesta fue: 7,53%
- Al 100% de la masa total de la muestra le restamos el porcentaje de humedad y obtenemos el % de sólidos totales:
100% - 7,89% = 92,11%
46
Anexo B. Cuantificación de la capacidad antioxidante (DPPH)
Muestra # ABS Co
(µMol/ml) (y±b)/m
μmol Eq Trolox/40mL
extracto (0,5g)
μmol Eq Trolox/1 g muestra
μmol Eq Trolox /1 g muestra BS
Promedio Desviación Estándar
% Coeficiente de Variación
Amaranto 1
1 0,882 130,33 5,21 10,27 11,10
12,0 0,89 7,4 2 0,872 140,40 5,62 11,0 11,94
3 0,863 149,45 5,98 11,9 12,88
Amaranto 2
1 0,837 175,62 7,02 14,05 15,07
14,5 0,66 4,6 2 0,841 171,59 6,86 13,7 14,70
3 0,851 161,53 6,46 12,8 13,78
Firiguelo 1
1 0,718 295,38 11,82 23,6 26,67
27,8 1,05 3,8 2 0,701 312,49 12,50 24,9 28,11
3 0,695 318,53 12,74 25,4 28,72
Firiguelo 2
1 0,714 299,41 11,98 23,3 25,53
26,1 0,53 2,0 2 0,703 310,48 12,42 24,2 26,58
3 0,708 305,45 12,22 23,9 26,15
Zarandaja 1
1 0,879 133,35 5,33 10,6 12,02
12,8 1,46 11,5 2 0,879 133,35 5,33 10,4 11,80
3 0,849 163,54 6,54 12,8 14,43
Zarandaja 2
1 0,867 145,43 5,82 11,4 12,73
12,6 0,41 3,3 2 0,877 135,36 5,41 10,8 12,08
3 0,866 146,43 5,86 11,5 12,84
47
Curva de calibración y elaboración de estándares de Trolox (DPPH)
Para calcular la concentración de la solución madre de Trolox (CoSMT), se aplicó la siguiente fórmula:
CoSMT = 𝑊∗ 𝑝
𝑣
Donde: W= cantidad de trolox pesado (mg) p= pureza del trolox (%) v= volumen del aforo del trolox (mL)
- Reemplazando datos:
CoSMT = 25,1 ∗ 0,97
100 x 1000 = 243,47 mg/L
- Para conocer la concentración de la solución madre en µM, utilizamos el peso
molecular del trolox, cantidad de reactivo pesado y volumen de aforo:
X= 1,0028 x 10-3 M
- Convertimos M a µM (1M es igual a 1000000 µM), entonces:
1,0028 x 10-3 M = 1002 µM
- El reactivo no es 100% puro, por lo que hay que compensar el 3% de pureza
faltante:
X= 1032,9 µM
- La concentración obtenida permitió a su vez calcular la concentración de los
estándares, con la siguiente fórmula:
CoEt = 𝐶𝑜𝑆𝑀𝑇 𝑥 𝑉𝐸𝑇
𝑉𝑎
Donde:
CoSMT= Concentración de la solución madre de trolox VET= Volumen de la alicuota de la SMT Va= Volumen de aforo del estándar
48
W (g) Trolox
PM (g/mol) Pureza (%) Aforo (mL) Concentración (mg/L)
Concentración (µMol)
0,0251 250,29 97 100 243,47 1032,9
Pendiente Intersección R2
-0,0009936 1,01150388 0,9906
y = -0,0001x + 1,0115
R² = 0,9906
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2000 4000 6000 8000 10000
Ab
sorb
anci
a
Concentración µMol
Estándar
Alícuota (mL)
Aforo
Concentración
(µMol)
Absorbancia
ET1 0,25 9,75 25,82 0,989
ET2 1 9 103,29 0,895
ET3 2 8 206,58 0,771
ET4 4 6 413,17 0,635
ET5 6 4 619,75 0,435
ET6 7 3 723,06 0,351
ET7 9 1 929,63 0,061
ET8 9,5 0,5 981,28 0,049
49
Ejemplo del cálculo de la actividad antioxidante (DPPH) en las muestras.
Amaranto 1 (Repetición #1)
Pendiente Intersección
-0,0009936 1,01150388
Abs= Pendiente (Concentración) + Intersección
Concentración = 𝐴𝑏𝑠−𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Concentración= 0,882− 1,01150388
−0,0009936
Co= 130,33 µMol/mL
𝐶𝑜
𝑋1=
1000 𝑚𝐿
40 𝑚𝐿 = 5,213 µ𝑀𝑜𝑙
𝑋1
𝑋2=
0,5078 𝑔
1 𝑔 = 10,27 µ𝑀𝑜𝑙/𝑔 𝐵𝐹
𝑋2
𝐶𝑓=
92,47 % 𝑆𝑇
100 % 𝑆𝑇 = 11,10 µ𝑀𝑜𝑙/𝑔 𝐵𝑆
50
Anexo C. Cuantificación de la capacidad antioxidante (ABTS)
Muestra # ABS Co (µMol/ml)
(y±b)/m
μmol Eq Trolox/40mL
extracto (0,5g)
μmol Eq Trolox/1 g muestra
μmol Eq Trolox /1 g muestra BS
Promedio Desviación Estándar
% Coeficiente de Variación
Amaranto 1
1 0,834 104,84 4,19 8,26 8,93
8,96 0,25 2,8 2 0,829 108,43 4,34 8,53 9,22
3 0,839 101,25 4,05 8,07 8,72
Amaranto 2
1 0,849 94,07 3,76 7,52 8,07
7,83 0,29 3,7 2 0,858 87,60 3,50 6,99 7,50
3 0,851 92,63 3,71 7,37 7,90
Firiguelo 1
1 0,579 287,92 11,52 23,02 25,99
27,46 1,93 7,0 2 0,566 297,26 11,89 23,68 26,74
3 0,522 328,85 13,15 26,25 29,65
Firiguelo 2
1 0,523 328,13 13,13 25,52 27,97
27,42 1,23 4,5 2 0,520 330,28 13,21 25,79 28,27
3 0,557 303,72 12,15 23,72 26,00
Zarandaja 1
1 0,815 118,48 4,74 9,45 10,68
10,81 0,16 1,5 2 0,807 124,22 4,97 9,72 10,99
3 0,810 122,07 4,88 9,53 10,77
Zarandaja 2
1 0,827 109,86 4,39 8,61 9,62
9,85 0,36 3,6 2 0,829 108,43 4,34 8,66 9,68
3 0,817 117,04 4,68 9,19 10,27
51
Curva de calibración y elaboración de estándares de Trolox (ABTS)
Para calcular la concentración de la solución madre de Trolox (CoSMT), se aplicó la siguiente fórmula:
CoSMT = 𝑊∗ 𝑝
𝑣
Donde: W= cantidad de trolox pesado (mg) p= pureza del trolox (%) v= volumen del aforo del trolox (mL)
- Reemplazando datos:
CoSMT = 25,1 ∗ 0,97
100 x 1000 = 243,47 mg/L
- Para conocer la concentración de la solución madre en µM, utilizamos el peso
molecular del trolox, cantidad de reactivo pesado y volumen de aforo:
X= 1,0028 x 10-3 M
- Convertimos M a µM (1M es igual a 1000000 µM), entonces:
1,0028 x 10-3 M = 1002 µM
- El reactivo no es 100% puro, por lo que hay que compensar el 3% de pureza
faltante:
X= 1032,9 µM
- La concentración obtenida permitió a su vez calcular la concentración de los
estándares, con la siguiente fórmula:
CoEt = 𝐶𝑜𝑆𝑀𝑇 𝑥 𝑉𝐸𝑇
𝑉𝑎
Donde:
CoSMT= Concentración de la solución madre de trolox VET= Volumen de la alicuota de la SMT Va= Volumen de aforo del estándar
52
Estándar
Alícuota (mL)
Aforo (mL)
Concentración
(µMol)
Absorbancia
ET1 0,25 9,75 25,82 0,911
ET2 1 9 103,29 0,873
ET3 2 8 206,58 0,688
ET4 3 7 309,88 0,539
ET5 4 6 413,17 0,419
ET6 5 5 516,46 0,283
ET7 6 4 619,75 0,09
Pendiente Intersección R2
-0,00139278 0,980012105 0,9928
y = -0,0015x + 0,98
R² = 0,9928
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 100 200 300 400 500 600 700
Ab
sorb
anci
a
Concentración µMol
W (g) Trolox
PM (g/mol) Pureza (%) Aforo (mL) Concentración (mg/L)
Concentración (µMol)
0,0251 250,29 97 100 243,47 1032,9
53
Ejemplo del cálculo de la actividad antioxidante (ABTS) en las muestras.
Amaranto 1 (Repetición #1)
Pendiente Intersección
-0,00139278 0,980012105
Abs= Pendiente (Concentración) + Intersección
Concentración = 𝐴𝑏𝑠−𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Concentración= 0,834− 0,980012105
−0,00139278
Co= 104,84 µMol/mL
𝐶𝑜
𝑋1=
1000 𝑚𝐿
40 𝑚𝐿 = 4,19 µ𝑀𝑜𝑙
𝑋1
𝑋2=
0,5078 𝑔
1 𝑔 = 8,26 µ𝑀𝑜𝑙/𝑔 𝐵𝐹
𝑋2
𝐶𝑓=
92,47 % 𝑆𝑇
100 % 𝑆𝑇= 8,93 µ𝑀𝑜𝑙/𝑔 𝐵𝑆
54
Anexo D. Cuantificación de la capacidad antioxidante (FRAP)
Muestra # ABS Co
(µMol/ml) (y±b)/m
μmol Eq Trolox/40mL
extracto (0,5g)
μmol Eq Trolox/1 g muestra
μmol Eq Trolox /1 g muestra BS
Promedio Desviación Estándar
% Coeficiente
de Variación
Amaranto 1
1 0,207 67,46 2,70 5,31 5,75
5,83 0,15 2,5 2 0,214 70,53 2,82 5,55 6,00
3 0,205 66,58 2,66 5,30 5,74
Amaranto 2
1 0,205 66,58 2,66 5,33 5,71
6,00 0,26 4,4 2 0,219 72,72 2,91 5,81 6,23
3 0,215 70,97 2,84 5,64 6,05
Firiguelo 1
1 0,522 205,58 8,22 16,43 18,56
18,29 0,24 1,3 2 0,515 202,51 8,10 16,13 18,22
3 0,511 200,76 8,03 16,03 18,10
Firiguelo 2
1 0,462 179,27 7,17 13,94 15,28
15,38 0,11 0,7 2 0,466 181,03 7,24 14,13 15,50
3 0,462 179,27 7,17 14,00 15,35
Zarandaja 1
1 0,218 72,28 2,89 5,77 6,52
6,35 0,27 4,2 2 0,209 68,34 2,73 5,35 6,04
3 0,221 73,60 2,94 5,75 6,49
Zarandaja 2
1 0,212 69,65 2,79 5,46 6,10
6,47 0,98 15,2 2 0,247 85,00 3,40 6,79 7,59
3 0,202 65,27 2,61 5,13 5,72
55
Curva de calibración y elaboración de estándares de Trolox (FRAP)
Para calcular la concentración de la solución madre de Trolox (CoSMT), se aplicó la siguiente fórmula:
CoSMT = 𝑊∗ 𝑝
𝑣
Donde: W= cantidad de trolox pesado (mg) p= pureza del trolox (%) v= volumen del aforo del trolox (mL)
- Reemplazando datos:
CoSMT = 25,1 ∗ 0,97
100 x 1000 = 243,47 mg/L
- Para conocer la concentración de la solución madre en µM, utilizamos el peso
molecular del trolox, cantidad de reactivo pesado y volumen de aforo:
X= 1,0028 x 10-3 M
- Convertimos M a µM (1M es igual a 1000000 µM), entonces:
1,0028 x 10-3 M = 1002 µM
- El reactivo no es 100% puro, por lo que hay que compensar el 3% de pureza
faltante:
X= 1032,9 µM
- La concentración obtenida permitió a su vez calcular la concentración de los
estándares, con la siguiente fórmula:
CoEt = 𝐶𝑜𝑆𝑀𝑇 𝑥 𝑉𝐸𝑇
𝑉𝑎
Donde:
CoSMT= Concentración de la solución madre de trolox VET= Volumen de la alicuota de la SMT Va= Volumen de aforo del estándar
56
Estándar
Alícuota (mL)
Aforo (mL)
Concentración
(µMol)
Absorbancia
ET1 0,25 9,75 25,82 0,139
ET2 1 9 103,29 0,241
ET3 2 8 206,58 0,512
ET4 3 7 309,88 0,755
ET5 4 6 413,17 1,044
ET6 5 5 516,46 1,223
ET7 6 4 619,75 1,522
ET8 7 3 723,05 1,644
Pendiente Intersección R2
0,00228060 0,053150029 0,9946
y = 0,0023x + 0,0532
R² = 0,9946
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00
Ab
sorb
anci
a
Concentración µMol
W (g) Trolox
PM (g/mol) Pureza (%) Aforo (mL) Concentración (mg/L)
Concentración (µMol)
0,0251 250,29 97 100 243,47 1032,9
57
Ejemplo del cálculo de la actividad antioxidante (FRAP) en las muestras.
Amaranto 1 (Repetición #1)
Pendiente Intersección
0,00228060 0,053150029
Abs= Pendiente (Concentración) + Intersección
Concentración = 𝐴𝑏𝑠−𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Concentración= 0,207− 0,053150029
0,00228060
Co= 67,46 µMol/mL
𝐶𝑜
𝑋1=
1000 𝑚𝐿
40 𝑚𝐿 = 2,7 µ𝑀𝑜𝑙
𝑋1
𝑋2=
0,5078 𝑔
1 𝑔 = 5,31 µ𝑀𝑜𝑙/𝑔 𝐵𝐹
𝑋2
𝐶𝑓=
92,47 % 𝑆𝑇
100 % 𝑆𝑇= 5,75 µ𝑀𝑜𝑙/𝑔 𝐵𝑆
58
Anexo E. Determinación de fenoles totales por el método Folin-Ciocalteu
Muestra # Abs Co
(mg/ml)
mg EAG/ 40 mL extrato (0,5 g
muestra)
mg EAG/100 g muestra BF
mg EAG/100 g muestra BS
PROMEDIO (mg EAG/100 g
muestra BS)
Desviación Estandar
% Coeficiente Variación
AMARANTO 1
1 0,078 0,018 0,74 145 157
148,9 9,03 6,1 2 0,069 0,016 0,65 129 139
3 0,074 0,017 0,70 139 151
AMARANTO 2
1 0,081 0,019 0,76 153 164
171,3 10,41 6,1 2 0,091 0,021 0,86 171 183
3 0,083 0,020 0,78 156 167
FIRIGUELO 1
1 0,134 0,031 1,25 250 282
287,7 5,00 1,7 2 0,139 0,032 1,30 258 291
3 0,138 0,032 1,29 257 290
FIRIGUELO 2
1 0,129 0,030 1,20 234 257
256,6 6,84 2,7 2 0,132 0,031 1,23 240 263
3 0,125 0,029 1,17 228 250
ZARANDAJA 1
1 0,053 0,013 0,51 101 114
126,3 11,06 8,8 2 0,061 0,015 0,58 114 128
3 0,065 0,015 0,62 120 136
ZARANDAJA 2
1 0,075 0,018 0,71 139 155
146,1 8,74 6,0 2 0,065 0,015 0,62 123 138
3 0,07 0,017 0,66 130 145
59
Curva de calibración y elaboración de estándares de ácido gálico (Fenoles
totales)
Para calcular la concentración de la solución madre de ácido gálico (CoSAG), se aplicó la siguiente fórmula:
CoSAG = 𝑊∗ 𝑝
𝑣
Donde: W= cantidad del ácido gálico pesado (mg) p= pureza del reactivo (%) v= volumen del aforo (mL)
- Reemplazando datos:
CoSAG = 50 ∗ 0,975
25 = 1,95 mg/mL
- A partir del resultado obtenido se procede a calcular los volúmenes para los
estándares, para llegar a la concentración deseada, con la siguiente fórmula:
CSM VSM = CSt VSt
Donde: CSM= Concentración de la solución madre (mg/mL) VSM= Volumen a tomar de la solución madre CST= Concentración del estándar (mg/mL) VST= Volumen a preparar del estándar
- Por ejemplo, si tomamos una alícuota de 0,1 mL de la solución madre y aforamos a un volumen de 10 mL con metanol tenemos la siguiente concentración:
𝐶𝑆𝑡 = 𝐶𝑆𝑀∗ 𝑉𝑆𝑀
𝑉𝑆𝑡 =
1,95
𝑚𝑔𝑚𝐿 ∗ 0,1 𝑚𝐿
10 mL = 0,0195 mg/mL
60
W (g) Ácido gálico Pureza Aforo (mL) Concentración (mg/mL)
0,05 0,975 25 1,95
Estándar
Alícuota (mL)
Aforo (mL)
Concentración
(mg EAG/mL)
Absorbancia
ET1 0,000 10 0,0000 0,016
ET2 0,050 9,95 0,0098 0,044
ET3 0,100 9,9 0,0195 0,065
ET4 0,200 9,8 0,0390 0,161
ET5 0,300 9,7 0,0585 0,239
ET6 0,400 9,6 0,0780 0,349
ET7 0,500 9,5 0,0975 0,429
Pendiente Intersección R2
4,36597532 -0,00237372 0,993
y = 4,366x - 0,0024
R² = 0,993
0,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,3
0,3
0,4
0,4
0,5
0,5
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
Ab
sorb
anci
a
Concentración (mg EAG/mL)
61
Ejemplo del cálculo del contenido de fenoles totales en las muestras.
Amaranto 1 (Repetición #1)
Pendiente Intersección
4,36597532 -0,00237372
Abs= Pendiente (Concentración) + Intersección
Concentración = 𝐴𝑏𝑠−𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Concentración= 0,078−(−0,00237372)
4,36597532
Co= 0,018 mg EAG/mL
𝐶𝑜
𝑋1=
1000 𝑚𝐿
40 𝑚𝐿 = 0,74 mg EAG
𝑋1
𝑋2=
0,5078 𝑔
100 𝑔 = 145 mg EAG/100𝑔 𝐵𝐹
𝑋2
𝐶𝑓=
92,47 % 𝑆𝑇
100 % 𝑆𝑇= 157 mg EAG/100𝑔 𝐵𝑆
62
Anexo F. Análisis estadístico
- DPPH entre las mismas muestras de distintos lugares de procedencia.
63
- ABTS entre las mismas muestras de distintos lugares de procedencia.
64
65
- FRAP entre las mismas muestras de distintos lugares de procedencia.
66
- Fenoles Totales entre las mismas muestras de distintos sitios de procedencia.
67
68
- DPPH en todas las muestras.
69
- ABTS en todas las muestras.
70
- FRAP en todas las muestras.
71
- Fenoles Totales en todas las muestras.