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UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS:
“EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL
EXTRACTO DE HOJAS DE Prosopis pallida forma
armata (ALGARROBO) SOBRE Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida
albicans ATCC 10231, AREQUIPA - 2018”.
PRESENTADO POR:
BACH. JOSÉ ANTONIO ARCE TINTAYA
BACH. JUAN JOSÉ CUTIPA HUAMANTUMA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO - FARMACÉUTICO
ASESORA:
Mg. GISELE MARÍA DELGADO MONTOYA
CO-ASESORA:
Mg. DIANA LUCÍA DÍAZ MONTOYA
AREQUIPA – PERÚ
2019
UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL
EXTRACTO DE HOJAS DE Prosopis pallida forma
armata (ALGARROBO) SOBRE Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida
albicans ATCC 10231, AREQUIPA - 2018”.
PRESENTADO POR:
BACH. JOSÉ ANTONIO ARCE TINTAYA BACH. JUAN JOSÉ CUTIPA HUAMANTUMA
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO - FARMACÉUTICO
APROBADO POR:
PRESIDENTE DEL JURADO : Dra. Romina L. RONDON CHAMBI
PRIMER MIEMBRO DEL JURADO : Mg. Celia CHOQUENAIRA QUISPE
SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO : Mg. Ruth E. GARATE MANRIQUE
I
DEDICATORIA
“La realización de esta tesis está dedicada a Dios y a mis padres. A
Dios porque estuvo conmigo a cada paso que iba dando, cuidándome
y brindándome fortaleza para continuar, a mis padres, quienes a lo
largo de mi vida han velado por mi bienestar y educación, siendo mi
apoyo en todo momento. Su perseverancia y lucha insaciable han
hecho de ellos el gran ejemplo a seguir y destacar, no solo para mí,
sino para mi hermano y familia en general”.
José Antonio Arce Tintaya
II
“A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado
salud para conseguir mi propósito, por fortalecer mi corazón e iluminar
mi mente y por haberme puesto en mi sendero a esas personas que
fueron sustento y compañía a lo largo de todo el tiempo de estudio”.
“A mis padres, por la buena crianza, el amor, la dedicación y el
apoyo incondicional para cumplir mi objetivo y la meta de ser
profesional”.
“A mis familiares, amigos y profesores por la ayuda en la realización del
presente trabajo”.
Juan José Cutipa Huamantuma
III
AGRADECIMIENTO
“A Dios Todopoderoso, por darnos la vida, ser nuestro amigo
incondicional, al estar siempre con nosotros, aun en los momentos
difíciles, y recordarnos siempre, que somos seres humanos con virtudes
y defectos”.
“Por brindarnos esa mano de amigo que conforta, da alivio y esperanza,
a quien debemos la vida, la inteligencia y la sabiduría, porque sin el
nada seriamos”.
“A la razón de mi vida, mis padres y a todas aquellas personas que
confiaron en mí y me apoyaron de una u otra forma, permitiendo lograr
este primer gran paso para obtener mi Título Profesional”.
“Con mucho cariño y afecto para ustedes mi familia, profesores y
amigos”
José Antonio Arce Tintaya
IV
“Agradezco ante todo a Dios por haberme guiado a lo largo de mi
carrera, por ser mi fortaleza en las situaciones difíciles y las bendiciones
brindadas en el trajinar amplio de mi vida”.
“A mis padres Margarita y Luis, por el apoyo incondicional, por los
valores que me han enseñado para hacerme una mejor persona a
través de sus consejos, porque gracias a ellos veo alcanzado mi
propósito”.
“A nuestra asesora Magister Bióloga Diana Díaz Montoya por su apoyo,
comprensión y paciencia que nos ha tenido”.
“A nuestros docentes, personas de gran sabiduría quienes se han
esforzado y nos han brindado sabios conocimientos para lograr mi
propósito. Mg. QF. Elvis Gonzales Condori por su tiempo, consejos y
enseñanzas para la realización de este trabajo de investigación”.
Juan José Cutipa Huamantuma
V
RESUMEN
Desde la antigüedad se sabe que existen especies vegetales con actividad
terapéutica, usado ampliamente en la medicina tradicional actual por los
múltiples beneficios que se les atribuyen. La presente investigación tuvo por
finalidad estudiar el efecto antimicrobiano del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo); para lo cual, se obtuvieron extractos
usando como solvente al etanol por el método de extracción Soxhlet, logrando
un rendimiento del 20.71 %, en dichos extractos, identificándose la presencia
de taninos condensados y flavonoides.
El extracto de algarrobo presenta efecto antibacteriano frente a Escherichia coli
ATCC 25922 con una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración
Mínima Bactericida (CMB) de 6.25 mg/mL; del mismo modo, efecto
antibacteriano frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 con una CMI y
CMB de 0.39 mg/mL; asimismo, presenta efecto antimicótico frente a Cándida
albicans ATCC 10231 con una CMI y Concentración Mínima Antimicótica
(CMA) de 0.39 mg/mL.
En cuanto al estudio de sensibilidad, Escherichia coli ATCC 25922 presentó
susceptibilidad al extracto etanólico de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) a concentraciones de 10.00, 20.00, 40.00, 60.00, 80.00 y alta
sensibilidad a concentraciones de 80.00 y %100.00 %, cuyo diámetro de
inhibición llego a más de 30 mm, siendo indicativo de que esta cepa es
altamente sensible a este extracto. Así también, Staphylococcus aureus ATCC
25923 presentó sensibilidad al extracto de algarrobo a concentraciones de
5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00 y 80.00 % y alta sensibilidad a
concentraciones de 100.00 %, inclusive a un diámetro superior al halo que
forma la ampicilina. Finalmente, Cándida albicans ATCC 10231 presentó
sensibilidad al extracto etanólico de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
a una concentración de 100%, donde la sensibilidad del Clotrimazol es superior
a las concentraciones estudiadas.
Palabras Clave. Efecto antibacteriano, efecto antimicótico, Prosopis pallida
VI
ABSTRACT
Since ancient times it is known that there are plant species with therapeutic
activity, widely used in current traditional medicine for the multiple benefits
attributed to them. The purpose of the present investigation was to study the
antimicrobial effect of leaf extract of Prosopis pallida forma armata (algarrobo);
for which, extracts were obtained using ethanol as solvent by the Soxhlet
Extraction method, obtaining a yield of 20.71%, in said extracts, identifying the
presence of condensed tannins and flavonoids.
The extract of algarrobo tree presents antibacterial effect against Escherichia
coli ATCC 25922 with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum
Bactericidal Concentration (CMB) of 6.25 mg/mL; similarly, antibacterial effect
against Staphylococcus aureus ATCC 25923 with a MIC and CMB of 0.39 mg /
mL; It also has an antimicotic effect against Cándida albicans ATCC 10231 with
a MIC and Minimum antimicotic Concentration (AMC) of 0.39 mg/ L.
Regarding the sensitivity study, Escherichia coli ATCC 25922 presented
susceptibility to the ethanolic extract of Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) at concentrations of 10.00, 20.00, 40.00, 60.00, 80.00 and high
sensitivity at concentrations of 80.00 and% 100.00%, whose diameter of
inhibition reached more than 30 mm, being indicative that this strain is highly
sensitive to this extract. Also, Staphylococcus aureus ATCC 25923 presented
sensitivity to carob extract at concentrations of 5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00
and 80.00% and high sensitivity at concentrations of 100.00%, even to a
diameter greater than the halo that forms ampicillin. Finally, Cándida albicans
ATCC 10231 showed sensitivity to the ethanolic extract of Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) at a concentration of 100%, where the sensitivity of
Clotrimazole is higher than the concentrations studied.
Keywords: Antibacterial effect, antimicotic effect, Prosopis pallida.
VII
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA I
AGRADECIMIENTO III
RESUMEN V
ABSTRACT VI
ÍNDICE DE CONTENIDOS VII
ÍNDICE DE TABLAS XI
ÍNDICE DE FIGURAS XIII
ÍNDICE DE ANEXOS XV
ÍNDICE DE ABREVIATURAS XVI
INTRODUCCIÓN XVII
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1.- Descripción de la realidad problemática 1
1.2.- Formulación del problema 2
1.2.1.- Problema principal 2
1.2.2.- Problemas especificos 2
1.3.- Objetivos 2
1.3.1.- Objetivo general 2
1.3.2.- Objetivos específicos 2
1.4.- Justificación 3
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.- Antecedentes de investigación 5
2.1.1.- A nivel internacional 5
2.1.2.- A nivel nacional 5
2.1.3.- A nivel local 7
2.2.- Base Teórica 7
2.2.1.- Prosopis pallida (Algarrobo) 7
VIII
2.2.2.- Polifenoles 11
2.2.3.- Flavonoides 11
2.2.4.- Taninos 12
2.2.5.- Propiedades antimicrobianas de metabolitos secundarios 13
2.2.6.- Extractos vegetales 14
2.2.7.- Equipo Soxlet 16
2.2.8.- Escherichia coli 16
2.2.9.- Staphylococcus aureus 17
2.2.10.- Cándida albicans 17
2.2.11.- Método de macrodilución en tubos 18
2.2.12.- Método de difusion 19
2.2.13.- Antibiograma 19
2.3.- Hipótesis 20
2.3.1.- Hipótesis principal 20
2.3.2.- Hipótesis secundarias 20
2.4.- Variables 21
2.4.1.- Identificación de variables 21
2.4.2.- Definición conceptual de variables 21
2.4.3.- Definición operacional de variables 21
2.4.4.- Operacionalización de variables 22
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1.- Tipo y nivel de investigación 23
3.1.1.- Nivel de la investigación 23
3.1.2.- Tipo de investigación 23
3.1.3.- Diseño de la investigación 23
3.2.- Descripción del ámbito de la investigación 23
3.2.1.- Ubicación espacial 23
3.2.2.- Ubicación temporal 23
3.3.- Población, muestra y muestreo 23
3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 23
3.4.1.- Material biológico 24
IX
3.4.2.- Materiales 24
3.4.3.- Recolección, identificación y almacenamiento de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 25
3.4.4.- Obtención extracto seco de hojas Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) 26
3.4.5.- Identificación de Taninos 27
3.4.6.- Identificación de Flavonoides 27
3.4.7.- Escala de Mc Farland 28
3.4.8.- Evaluación de la Actividad Antimicrobiana 28
3.4.9.- Estrategia de recoleccion de datos 31
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1.- Recolección e identificación 32
4.2.- Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) 32
4.3.- Identificación de taninos 33
4.4.- Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda 34
4.5.- Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Escherichia coli ATCC 25922 35
4.5.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Escherichia coli ATCC 25922 35
4.5.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Escherichia coli ATCC 25922 38
4.5.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo), comparada con Ciprofloxacino frente a
Escherichia coli ATCC 25922. 38
4.6.- Evaluación de la actividad antimicrobiana de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 42
4.6.1.- Concentración Minima Inhibitoria (CIM) de extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente
a Staphylococcus aureus ATCC 25923 42
X
4.6.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 45
4.6.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) comparada con Ampicilina frente a
Staphylococcus aureus ATCC 25923. 46
4.7.- Evaluación de la actividad antimicótica de extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente
a Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 50
4.7.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente
a Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 50
4.7.2.- Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Cepas de Cándida albicans ATCC
10231 53
4.7.3.- Determinación de la sensibilidad antimicótica de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) comparada con Clotrimazol 1% frente a Cándida
albicans ATCC 10231 54
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN 59
CONCLUSIONES 63
RECOMENDACIONES 65
BIBLIOGRAFÍA 66
ANEXOS 72
XI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación Taxonómica 10
Tabla 2. Mecanismo de acción de compuestos antimicrobianos 14
Tabla 3. Indicadores y subindicadores de las Variables en estudio 22
Tabla 4. Determinación de CMI por microdilución en caldo 30
Tabla 5. Identificación, tipificación de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) recolectadas 32
Tabla 6. Porcentajes de rendimiento correspondientes a las
extracciones del extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo). 33
Tabla 7. Resultados de la determinación de concentración
inhibitoria mínima (CIM) de extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Escherichia coli ATCC 25922 37
Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración
Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Escherichia coli ATCC 25922 38
Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a
concentraciones del extracto de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo). 39
Tabla 10. Análisis de varianza de la determinación de prueba de
sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a
concentraciones del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). 40
Tabla 11. Test de Tukey de comparacion de la sensibilidad de
Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo). 41
Tabla 12. Resultados de la determinación de la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Staphylococcus aureus ATCC 25923. 45
Tabla 13. Resultados de la determinación de la Concentración
Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de hojas
XII
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Staphylococcus aureus ATCC 25923 46
Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones
de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) 47
Tabla 15. Análisis de varianza de la determinación de prueba de
sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a
concentraciones del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 48
Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones
de Prosopis pallida (Algarrobo) 49
Tabla 17. Resultados de la determinación de la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Cándida albicans ATCC 10231 53
Tabla 18. Resultados de la determinación de la Concentración
Mínima Antimicótica (CMA) de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente
a Cándida albicans ATCC 10231. 54
Tabla 19. Resultados de determinación de la sensibilidad de
Cándida albicans ATCC 10231 a concentraciones de
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo). 55
Tabla 20. Análisis de varianza de la determinación de prueba de
sensibilidad de Cándida albicans ATCC 10231 a
concentraciones del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). 56
Tabla 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de
Cándida albicans ATCC 10231 a concentraciones
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
(Algarrobo). 57
XIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 9
Figura 2 Estructura general de flavonoides 12
Figura 3 Clasificación de taninos 13
Figura 4 Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 26
Figura 5 Proceso de obtención del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) 27
Figura 6 Reacción química en la prueba de Shinoda 28
Figura 7 Peso de extracto seco obtenido luego de la evaporación del
solvente (etanol) a Baño María 33
Figura 8 Identificación de taninos condensados en Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) 34
Figura 9 Identificación de flavonoides. Presencia de flavononas en
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). 34
Figura 10 Tubos de ensayo de determinación de CMI de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Escherichia coli ATCC 25922 35
Figura 11 Siembra en placa (CMB) de extracto etanólico de hojas de
P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC
25922 38
Figura 12 Sensibilidad bacteriana de extracto etanólico de hojas de P.
Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC
25922 39
Figura 13 Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de
Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) 42
Figura 14 Tubos de ensayo de determinación de la CMI del extracto
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente
a Staphylococcus aureus ATCC 25923 44
Figura 15 Siembra en placa CMB de extracto etanólico de hojas
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a S. aureus
ATCC 25923 46
Figura 16 Sensibilidad bacteriana de Staphylococcus aureus ATCC
25923 frente al extracto de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) 47
XIV
Figura 17 Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de S.
aureus ATCC 25923 a concentraciones de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) 50
Figura 18 Método de microdilución en tubos para la determinación de
CMI de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 52
Figura 19 Siembra en placa (CBM) de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Cándida albicans ATCC 10231 54
Figura 20 Sensibilidad fúngica de Cándida albicans ATCC 10231
frente al extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) 55
Figura 21 Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Cándida
albicans ATCC 10231 a concentraciones de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo). 58
XV
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Clasificación taxonómica de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) 73
Anexo 2. Recolección hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) en distrito de Quequeña – Arequipa 74
Anexo 3. Trituración de Hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo), con posterior colocación en papel filtro 74
Anexo 4. A. Cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923, B. Cepa
de Escherichia coli ATCC 25922, C. Cepa de Cándida
albicans ATCC 10231 75
Anexo 5. Obtención de Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) 75
Anexo 6. Sembrado de cepas en placas petry, con depósito de disco
de papel filtro de 5 mm de diámetro, impregnado con
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo). 76
XVI
TABLA DE ABREVIATURAS
OMS : Organización Mundial de la Salud
CDC : Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades
IIH : Infecciones Intrahospitalarias
CMI : Concentración Mínima Inhibitoria
CMB : Concentración Mínima Bactericida
CMA : Concentración Mínima Antimicótica
DMSO : Dimetilsulfóxido
ITU : Infección del tracto urinario
INS : Instituto Nacional de Salud
ITU-IH : Infecciones de tracto urinario Intrahospitalarias
XVII
INTRODUCCIÓN
Nuestro país es considerado dentro de los 12 países de gran diversidad
biológica de la tierra, conocidos como países mega diversos, tanto por el
número de especies y de recursos genéticos, como la variedad de
ecosistemas. La utilización de las plantas medicinales es de gran importancia
en la medicina tradicional (1), puesto que diversos pueblos oriundos del Perú
las utilizan con fines terapéuticos como antioxidantes, antimicrobianos,
antiinflamatorios y antidepresivos (2).
El conocimiento científico de algunas especies es desconocido y es necesario
que aprendamos a investigar los recursos naturales, pero con los
requerimientos técnicos que la ciencia hoy pide. Este conocimiento dejará
saber los principios activos de las plantas medicinales y estudiar su actividad
en el organismo para después aislarlos, obtenerlos y avalar sus usos que la
medicina popular le asigna a distintas especies vegetales. En nuestro medio,
algunas plantas medicinales en el sector de la salud son usadas en distintas
formulaciones en el área de farmacia (3).
En la actualidad el estudio de especies vegetales, tiene como finalidad
incrementar las investigaciones relacionados a los metabolitos secundarios con
posible actividad medicinal, teniendo en cuenta que a nivel mundial se dan
infecciones intrahospitalarias y extrahospitalarias, producidas en general por
Cándida albicans, Staphylococcus aureus y Escherichia coli (4).
Prosopis pallida forma armata, conocida popularmente como algarrobo ha
demostrado tener actividad terapéutica frente a algunos microorganismos
(5,6,7), donde las hojas, semillas secas y resinas frescas, son empleados para
aliviar procesos de tos, dolor de estómago, bronquitis, resfríos y sanacion
heridas, dichos efectos podrían ser atribuidos al contenido de compuestos
fenólicos, teniendo en consideracion que estudios a dicha planta demuestran
presencia de taninos, flavonoides y polifenoles, además de tener un alto
contenido de taninos (8,9).
XVIII
Por otro lado, las especies Prosopis son conocidas por sus múltiples
propiedades antibacteriales, antimicóticas, antiparasitarias, y nutricionales
debido a sus características químicas y bromatológicas. La pulpa de su fruto
tiene alto contenido de fibra rica en sustancias antioxidantes y con alta
capacidad de absorción de agua (10).
La resistencia a los antibióticos se produce cuando los microorganismos, sufren
cambios que hacen que los medicamentos usados para sanar las infecciones
dejen de ser eficaces. El fenómeno es muy alarmante porque las infecciones
por microorganismos resistentes pueden causar la muerte del paciente,
pudiéndose tener una infección generalizada de personas, creando grandes
costos tanto para los pacientes como para la sociedad, donde hoy en día, los
estados y la población consumidora están interesados en la investigación de
plantas medicinales, empezándose a considerar los aspectos de la medicina
natural para integrarlos en la atención de servicios de salud, que tiene como
objetivo promover su uso racional, seguro y eficaz. La aparición de cepas
resistentes a los antibióticos comerciales en los últimos tiempos, está creando
la necesidad de buscar otras alternativas para combatir las infecciones
causadas por los microorganismos (9,11).
La utilización de las plantas para fines curativos se remonta al principio de la
historia de la humanidad. En la actualidad cientos de plantas son usadas en
la medicina, donde la ciencia moderna quiere precisar, comparar y
clasificar las diversas propiedades existentes, para así agrupar las plantas
de efectos similares, conocer los principios activos responsables de la actividad
terapéutica, determinar sus estructuras químicas, procurar su síntesis,
proponer modificaciones estructurales y finalmente, dar a conocer a la
humanidad los resultados de los investigaciones (5).
Las plantas son laboratorios naturales donde se biosintetiza una gran cantidad
de sustancias químicas, considerándose como una gran fuente de compuestos
químicos más importante que existe; dentro de ellos un considerable
número de investigaciones han sido perfilados hacia la evaluación de
XIX
actividades antimicrobianas en extractos y aceites esenciales de plantas
medicinales y aromáticas (5).
Por lo expuesto, el presente estudio busca evaluar el efecto antimicrobiano del
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida
albicans ATCC 10231.
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1.- Descripción de la realidad problemática
Recientemente, el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades
(CDC) de Atlanta indico que en Estados Unidos de América más de 70000
pacientes mueren anualmente por Infecciones Intrahospitalarias (IIH). Estas IIH
tienen origen por un prolongado tiempo de hospitalización, originando una
carga económica de unos 4000 millones de dólares al año. Un porcentaje de
estas muertes y otra aún mayor de los gastos, podrían evitarse con programas
de control de infecciones y con el cumplimiento de normas preventivas (12,13).
Existen factores asociados a las infecciones intrahospitalarias (IIH) en general,
los intrínsecos que incluye las condiciones fisiopatológicas clínicas del paciente
que incrementan riesgo de padecer una IIH, como pueden ser: insuficiencia
renal, neoplasia, diabetes mellitus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica,
inmunosupresión, ulcera de decúbito, entre otros (11,14). En el grupo los
factores extrínsecos poseemos los procedimientos invasivos, diagnósticos o
terapéuticos, a los que el paciente es sometido a lo largo de su estancia
hospitalaria, siendo los catéteres vesicales un aspecto asociado de mucha
consideracion (11,14), demostrándose en algunos estudios que estos se
asocian en un 80% a las Infecciones de tracto urinario Intrahospitalarias (ITU-
IH) (15,16).
Estudios realizados en el Perú encontraron que el riesgo de desarrollar ITU-IH
se incrementa 36 veces en pacientes mayores de 60 años en comparación con
pacientes de edades menores (17).
En la última década los gérmenes responsables de las ITU-IH así como la
susceptibilidad antibiótica de los mismos han sufrido cambios importantes (18).
La susceptibilidad antibiótica de los urocultivos es usualmente reportada 48
horas después de la toma de la muestra, lo que implica un inicio empírico de
tratamiento antibiótico (19). Los pacientes suelen presentar infecciones
polimicrobianas. Hongos, como Cándida sp y Bacterias como Staphylococcus
aureus y Escherichia coli (20).
2
1.2.- Formulación del problema
1.2.1.- Problema principal
¿Cuál es el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231?
1.2.2.- Problemas secundarios
¿Existe presencia de flavonoides y taninos en el extracto de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)?
¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923?
¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) sobre Escherichia coli ATCC 25922?
¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 10231?
¿Cuál es Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231?
1.3.- Objetivos
1.3.1.- Objetivo general
Determinar el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231
1.3.2.- Objetivos específicos
Identificar flavonoides y taninos el extracto de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo)
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración
Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923.
3
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración
Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) sobre Escherichia coli ATCC 25922.
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración
Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 10231.
Evaluar la Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231.
1.4.- Justificación
Las infecciones Intrahospitalarias (IIH) constituyen un gran problema de salud
pública, no solo por su alta frecuencia, sino por sus consecuencias que se
indican en términos de morbimortalidad, incremento de costos y estancia
hospitalaria prolongada; variables utilizadas como indicadores de calidad de
atención en los servicios en salud (21). Más del 10% de los pacientes
hospitalizados desarrollan IIH, previniéndose en forma mínima estas IIH con los
programas de supervisión y control epidemiológico (22).
Los esfuerzos desarrollados a lo largo del tiempo para prevenir IIH son
numerosos, pero en 1965 el Centro para el Control y la Prevención de
Enfermedades (CDC) (23), en Atlanta Georgia, EE.UU. recomendó la vigilancia
de IIH con el fin de dictar medidas nacionales de control hospitalario,
desarrollando para 1969 el Estudio Nacional de Infecciones Nosocomiales
(NNIS) (24), siendo ahora el Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones
Nosocomiales, comprobándose en investigaciones posteriores que las bases
de un programa de control de IIH adecuado son: educación y vigilancia
epidemiológica permanente (25,26).
Por investigaciones, se sabe que, se han aislado aproximadamente 12000
compuestos procedentes de los organismos vegetales y se estima que
constituyen tan solo el 10 % de los metabolitos secundarios que podrían existir.
Un porcentaje de dichos metabolitos podrían aportar efectos benéficos para
combatir diversas infecciones por su poder antimicrobiano (19, 27).
4
En el presente estudio, se busca evaluar el efecto antimicrobiano del extracto
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC
10231.
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.- Antecedentes de investigación
2.1.1.- A nivel internacional
“Alzate et al. (10), en su investigación Propiedades farmacológicas del
Algarrobo (Hymenaea courbaril L.) de interés para la industria de alimentos en
el año 2008, nos indica que el Hymenaea courbaril L., conocido comúnmente
como algarrobo, guapinol (en español), locust, jatobá o courbaril entre muchos
otros, es un imponente árbol forestal que produce vainas grandes y muy duras
conteniendo una pulpa de un olor penetrante pero comestible. Es conocido por
sus múltiples propiedades antibacteriales, antimicóticas, antiparasitarias, y
nutricionales debido a sus características químicas y bromatológicas. La pulpa
de su fruto tiene alto contenido de fibra rica en sustancias antioxidantes y con
alta capacidad de absorción de agua. La gran cantidad de sustancias químicas
que hay en las diferentes partes de esta planta la constituyen en una fuente
interesante de futuras investigaciones con respecto a la obtención de
conservantes naturales, compuestos con capacidad de retención de agua e
ingredientes con capacidades antioxidantes, que puedan ser usados en
alimentos sin que representen un riesgo potencial para la salud (10)”.
2.1.2.- A nivel nacional
“Vásquez (6), en su tesis titulada efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico
de Prosopis pallida (algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 90028, en el
2017 en la Universidad Cesar Vallejo reporta que, se evaluó el efecto
antifúngico in vitro del extracto etanólico de Prosopis pallida (Algarrobo) sobre
Cándida albicans ATCC 90028. Se realizó diversas concentraciones de 2.5, 5,
7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25 mg/mL; se utilizó un control positivo
Nistatina y un control negativo Solución salina fisiológica estéril. El efecto
antifúngico del extracto se evaluó por medio del método de difusión en disco,
que consiste en sembrar por dispersión en superficie con hisopo estéril el
inóculo fúngico de Cándida albicans sobre la superficie de placas de petri con
agar Sabouraud. Inmediatamente después se colocaron discos de sensibilidad
embebidos con cada una de las concentraciones del extracto a evaluar incluido
6
los controles. Cada placa fue incubada a 37°C durante 24 horas en condiciones
de aerobiosis. Los ensayos se realizaron por decuplicado y cuatro repeticiones.
Los resultados indicaron que se presentó mayor inhibición a la concentración
de 22.5 mg/ml y 25 mg/ml obteniéndose halos promedio de inhibición de 12.9 y
11.5 mm respectivamente, y el menor promedio de halos de inhibición se
encontró en las concentraciones de 2.5 mg/ml y 5 mg/ml respectivamente, por
lo que se dedujo que a mayor concentración del extracto existe un mayor
efecto antifúngico. El control positivo presento un halo de inhibición promedio
de 13 mm de diámetro (6)”.
“Cárdenas (9), en su tesis titulada Actividad antimicrobiana y antioxidante del
extracto etanólico de Prosopis pallida “algarrobo” en el 2017 en la Universidad
Mayor de San Marcos evaluó las actividades antimicrobianas y antioxidante del
extracto etanólico de Prosopis pallida. Para la evaluación de dichas actividades
se obtuvo el extracto etanólico de las hojas, vaina (pulpa) y semillas. El
contenido de polifenoles totales fue determinado por el método de Folin-
Ciocalteu. La actividad antimicrobiana se evaluó mediante el método de
difusión en agar frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli
ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 y la concentración mínima inhibitoria (CMI) por el método
demicrodilución colorimétrico en microplaca. La actividad antioxidante se
determinó utilizando los métodos del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo
(DPPH) y el método del radical ácido 2,2”-azinobis (3-etilbenzotiazolin) -
6sulfónico (ABTS●+). Las hojas de P. pallida presentó mayor contenido de
compuestos fenólicos expresado como 8,39 mg/Eq de ácido gálico en un
gramo de extracto seco. El extracto etanólico de las hojas de P. pallida
presentó actividad antimicrobiana frente a S. aureus ATCC 25923 con un CMI
= 1000 µg/mL y frente a S. epidermidis ATCC 12228 con un CMI= 62,5 µg/mL.
Los extractos de las hojas, vaina (pulpa) y semillas en el análisis de DPPH
presentaron una concentración efectiva media (EC50) de 456,75 µg/mL; 392,15
µg/mL y 309,10 µg/mL; para el ensayo de ABTS●+ mostraron un EC50 de 4,7
mg/mL; 10,39 mg/mL y 9,90 mg/mL respectivamente (9)”.
“Zandoval y Zúñiga (5), en su tesis efecto antibacteriano in vitro de los
alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis pallida (Humb. & Bonpl. ex
7
Willd.) Kunth “algarrobo” frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli
publicada el 2016 en la Universidad Nacional de Trujillo evaluó el efecto
antibacteriano in vitro de los alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida
frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli . Para lo cual, las hojas
fueron recolectadas del Bosque y Complejo Arqueológico el Cañoncillo del
distrito de San José provincia de Pacasmayo región La Libertad; ubicado a una
altitud de 104 m.s.n.m., a 07º 15' Latitud Sur y 79º 29' Longitud Oeste. Para la
extracción de alcaloides se utilizó el método de fraccionamiento acido básico
del extracto etanólico. A partir de 5 kg de hojas secas y pulverizadas se
obtuvieron 0.8 g de alcaloides totales, obteniéndose un rendimiento de 0.016%.
El efecto antibacteriano fue desarrollado mediante el método de pozos
modificados de agar; donde se empleó cepas de S. aureus ATCC 13071 y E.
coli ATCC 25992. Donde se trabajó con concentraciones de alcaloides totales
de 2.5 mg/mL, 5 mg/mL y 10 mg/mL disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) y
cloranfenicol como control. Los halos de inhibición en promedio frente a S.
aureus fueron de 13.63 mm de diámetro a la concentración de 2.5 mg/ml, 16
mm de diámetro a 5 mg/ml y 18.38 mm de diámetro a una concentración de 10
mg/ml; para E. coli los halos de inhibición fueron de 12 mm de diámetro a una
concentración de 2.5 mg/ml, 14.13 mm de diámetro a 5 mg/ml y 15.38 mm de
diámetro para la concentración de 10 mg/ml (5)”.
2.1.3.- A nivel local
No se han reportado estudios en relación a Prosopis pallida a nivel local
2.2.- Base Teórica
2.2.1.- Prosopis pallida (Algarrobo)
2.2.1.1.- Generalidades
El algarrobo, “es una especie vegetal oriundo de Perú, Colombia y Ecuador,
crece en las partes más secas de estos países, a lo largo de la costa del
Pacífico, es un árbol longevo, que pertenece a la familia de las leguminosas.
Cuenta con una gran capacidad para sobrevivir en el desierto, debido a su
habilidad para captar nitrógeno y agua por medio de sus largas raíces. Es un
árbol de gran talla, llegando a alcanzar alturas de 8 a 20 m y hasta 80 cm de
8
diámetro en el tronco (en lugares apropiados), sin embargo, en terrenos
infértiles y con escasez de agua, se hace arbustivo. Presenta fuste irregular,
tortuoso y nudoso”. La corteza externa pardo-gris-negruzca; fisurada con
ritidoma leñoso; frecuentemente con espinas. La corteza interna es de color
blanco y rojo, es amarga, con olor a barniz y textura fibrosa. El género Prosopis
son originarias de los territorios áridos y semiáridos de las Américas, con
algunas excepciones en África, el sudeste de Asia y Europa, distribuidas en las
zonas áridas y semiáridas de América del Norte y América del Sur; (Argentina,
Bolivia, Chile, Paraguay y Perú) (28).
En el Perú se conocen solamente tres especies: “Prosopis chilensis, Prosopis
limensis y Prosopis pallida; esta última especie, conocida como “algarrobo” o
“huarango”; y que es usada en la parte norte del país, como alimento para
animales; así como para la elaboración de “algarrobina”; mientras que en
algunas regiones del sur, como Ica y Arequipa, se utiliza únicamente como
combustible (carbón vegetal) y rara vez sus frutos como forraje (28). Desde el
punto de vista botánico, las especies de este género, corresponden a árboles o
arbustos, normalmente xerófilos y espinosos. Sus hojas son generalmente
bipinnadas y con flores pequeñas, pentámeras, actinomorfas y hermafroditas.
El fruto es una legumbre carnosa e indehiscente” (29).
Prosopis pallida es una especie muy rústica, “debido a que puede prosperar sin
ningún inconveniente en toda clase suelos, llegando a tener muy buen
crecimiento y producir notables cantidades de frutos. Crece en suelos
arenosos, arcillosos, calcáreos, pedregosos y hasta en aquellos que son
superficiales y salinos. El enorme desarrollo que adquiere el sistema radicular
le permite la absorción del agua. Se han encontrado pivotes hasta en 50 m de
profundidad. El algarrobo, es una planta que prospera bien en las zonas áridas
y semiáridas, en las cuales en condiciones naturales no se desarrollaría otro
tipo de vegetación arbórea, por tener esta última mucho mayor requerimiento
de calidad de los suelos. Tiene una notable tolerancia a períodos prolongados
de sequías y también a la salinidad, pudiendo irrigarse con agua cuyo
contenido de sal sea equivalente, hasta a la mitad del contenido de sal del
agua de mar” (28).
9
En algunos “distritos del sureste de la Provincia de Arequipa, se distribuyen
poblaciones dispersas de algarrobos en biotopos distintos, localizados en
Quequeña, Mollebaya y Yarabamba (28). En el año 2001 se realizó la
evaluación de las características biométricas, ecológicas y el estado de
conservación de algunos relictos (poblaciones dispersas) de “huarangos”,
localizados en cinco quebradas en Yarabamba (30). Asimismo en el año 2005
se determinó el tipo de relación que existe entre los “huarangos” y las
características del suelo que ocupan en la Quebrada Cachihuasi, localizada en
Yarabamba: mediante la evaluación poblacional de los “huarangos” y también
de las características edafológicas del suelo. Cuatro años después, se realizó
otro trabajo de investigación, referido a la evaluación de la diversidad florística,
estructura poblacional y estatus de conservación de la flora fanerogámica
silvestre, tomando como puntos de referencia, cuatro biotopos distintos
(pertenecientes al matorral desértico)”, en Mollebaya, Quequeña y Yarabamba
(31), planta de algarrobo que se puede apreciar en la Figura 1.
Figura 1. Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) (Sector Belaunde -
Quequeña 2018) (Latitud 16°32'16.96"S – Longitud 71°28'38.04"O) – Octubre
2018.
Fuente: Elaboración propia.
10
2.2.1.2.- Clasificación Taxonómica
En cuanto a la clasificación taxonómica el algarrobo se clasifica como Prosopis
pallida forma armata, según Vásquez y Escurra (32).
Tabla 1. Clasificación Taxonómica.
División Magnoliophyta
Clase Magnolipsidae
Orden Fabales
Familia Fabaceae
Subfamilia Mimosoideae
Género Prosopis
Especie Prosopis pallida
Fuente. Adaptado de Vásquez y Escurra (32).
2.2.1.3.- Descripción botánica de las hojas
“Las hojas son bipinnadas y alternas, además, es habitual ver en los nudos de
las plantas adultas de 1 a 10 hojas que nacen en ramitas muy cortas y juntas,
logran medir de 2 a 8 cm de longitud, falcadas dorsalmente, se destaca por
presentar folíolos lineales, obtusos, mucronados, regularmente pubescentes,
de 7 a 10 mm de longitud por 1 a 3 mm de ancho, con además de poseer
glándulas cupuliformes en la unión de cada par de foliolos (33)”.
2.2.1.4.- Composición Química de las hojas
“Las hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) muestran altos niveles
de proteína cruda (17,8%) y fibra cruda (23,3%). Entre sus minerales presenta
fósforo, potasio, calcio y magnesio, por otro lado, se evidencia presencia de
taninos, flavonoides y polifenoles, donde el contenido de taninos generalmente
alto de 0,8% a 1,9-2,0 % (8,9)”.
2.2.1.5.- Propiedades terapéuticas y usos
“El algarrobo tiene una gran variedad de utilización, dado que es un alimento
vegetal con concentraciones altas de almidón y proteína siendo un alimento
esencial en la alimentación de los pueblos indígenas. Con la pulpa se elabora
harina la cual es incorporada en galletas, sopas y leche de los niños (34)”.
11
“La harina de algarrobo está indicada para tratar problemas de diarreas y
vómitos tanto en niños como en lactantes, se usada para ayudar a mejorar la
digestión. El fruto de la algarroba es un alimento de primera calidad para el
ganado. El tronco produce una resina llamada copal, la cual tiene propiedades
curativas de usos medicinales y también es empleada para la elaboración de
barnices e inciensos. La corteza y las hojas de esta planta contienen
propiedades medicinales (34)”.
2.2.2.- Polifenoles
“En la naturaleza existe una amplia variedad de compuestos que presentan una
estructura molecular caracterizada por la presencia de uno o varios anillos
fenólicos. “Estos compuestos podemos denominarlos polifenoles que se
originan principalmente en las plantas en grandes cantidades como producto
de su metabolismo secundario”. Algunos son indispensables para las funciones
fisiológicas vegetales, otros participan en funciones de defensa ante
situaciones de estrés y diversos estímulos (hídrico, luminoso, etc.) (9)”.
“Existen varias clases y subclases de polifenoles que se definen en función al
número de anillos fenólicos que poseen y de los elementos estructurales que
presentan estos anillos. Los principales grupos de polifenoles son: ácidos
fenólicos (derivados del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico),
estilbenos, lignanos, alcoholes fenólicos y flavonoides” (35).
2.2.3.- Flavonoides
Los “flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que
poseen actividad antioxidante por lo cual, protegen al organismo del daño
producido por especies reactivas de oxigeno (ROS) conocidos como radicales
libres, así como también de los rayos ultravioletas, la polución ambiental,
sustancias químicas presentes en los alimentos” (9).
La estructura de los “principales flavonoides se diferencia entre ellos
principalmente en el grupo –OH y en el grado de saturación que presenta el
anillo C. En la Figura 2 se muestran A) La estructura general de flavonoides, B)
Isoflavonas, C) Flavanos, D) Flavonoles, E) Flavanoles y F) Antocianidinas ”.
12
Los “flavonoides son sustancias sólidas cristalizadas de color blanco o
amarillento. Sus heterósidos son solubles en agua caliente, alcohol y en
disolventes orgánicos polares, siendo insolubles en los apolares. Sin embargo,
cuando están en estado libre, son poco solubles en agua, pero son solubles en
disolventes orgánicos más o menos oxigenados dependiendo de su polaridad,
su carácter fenólico y su intensa absorción en la región ultravioleta y visible del
espectro es debido a la presencia de sistemas aromáticos conjugados” (9).
Figura 2. A) La estructura general de flavonoides, B) Isoflavonas, C) Flavanos,
D) Flavonoles, E) Flavonoles y F) Antocianidinas.
Fuente: Adaptado de Limón S (36).
2.2.4.- Taninos
Los “taninos son compuestos secundarios producidos por las plantas que
pueden formar complejos con proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos,
esteroides y saponinas desempeñando en las plantas una acción ” defensiva (9).
Los taninos son el segundo grupo de fenoles más abundante en la naturaleza y
cumplen diversas e importantes actividades biológicas en la planta que los
produce: actúan como defensa contra enfermedades causadas por hongos,
bacterias y virus además de proteger los tejidos contra el ataque de insectos y
13
herbívoros (37), por otro lado, “tradicionalmente se ha clasificado a los taninos
en dos grandes grupos: los taninos condensados y los taninos hidrolizables. En
la actualidad, la clasificación más aceptada, divide a los taninos en cuatro
grupos: galotaninos, elagitaninos”, taninos condensados y taninos complejos
(38), conforme se puede apreciar en la Figura 3.
Figura 3. Clasificación de taninos Fuente. Adaptado de Khanbabaee y Van Ree (39).
2.2.5.- Propiedades antimicrobianas de metabolitos secundarios
Algunos extractos obtenidos de plantas por diversos métodos de extracción
presentan alto contenido de flavonoides que está relacionado con la actividad
antibacteriana (40).
Por lo expuesto en la Tabla 2 se presentan los principales compuestos
encontrados en plantas indicando la clase, subclase y el mecanismo de acción
que presentan (41).
14
Tabla 2. Mecanismo de acción de compuestos antimicrobianos
Clase Subclase Ejemplo Mecanismo
Compuestos fenólicos
Fenoles simples
Catecol Privación del substrato
Epicatequina Destrucción de la membrana
Ácidos fenólicos
Ácido cinámico
Quinonas Hipericina Enlazar adhesinas formando complejos con la pared, inactivas enzimas
Flavonoides Crisina Enlazar adhesinas
Flavonas Abyssinona Forma complejos con la pared celular, inactivación de enzimas e inhibe la transcriptasa inversa del VIH
Flavonoles Totarol
Taninos Elagitanino Une a proteínas, enlaza adhesinas, inhibición de enzimas, privación del sustrato, formar complejos con la pared celular, destrucción de la membrana y forma complejos con iones metálicos
Cumarinas Warfarina Interacción con el ADN eucariota (actividad antiviral)
Terpenos, aceites esenciales
Capsaicina Destrucción de la membrana
Alcaloides Berberina Intercalarse en la pared celular y/o ADN
Piperina
Lectinas y polipéptidos
Manosa especifica-Aglutina Bloquea la fusión viral o adsorción
Fabatin Forma puentes disulfuros
Poliacetilenos 8S-Heptadeca2(Z),9(Z)-dieno4,6-diino-1,8-diol
Fuente. Adaptado de Murpdhy (42).
2.2.6.- Extractos vegetales
La “extracción es un método por la cual se obtienen los principios activos del
material vegetal, de una manera más concentrada; los componentes solubles
contenidos debidamente preparados, se disuelven en uno o más solventes o
líquidos extractores formando así un extracto crudo o total, el cual va a tener la
15
mayor cantidad de principio activos, pigmentos vegetales y metabolitos
secundarios” (43), clasificándose en:
Infusión: “Consiste en someter la materia vegetal en contacto con el
solvente a una temperatura igual a la de ebullición del agua por cinco
minutos” (43).
Decocción o Cocimiento: “Consiste en llevar la materia vegetal más
menstruo a la temperatura de ebullición del agua, manteniendo esta
temperatura durante un período de 15 a 30 minutos” (43).
Maceración: “Consiste en poner en contacto prolongado durante cierto
tiempo la materia vegetal con el menstruo, en el cual el menstruo actúa
simultáneamente sobre todas las proporciones de la droga, circulando a
través en todas las direcciones y sentidos y disolviendo sus principios
activos hasta producirse una concentración en equilibrio con la del
contenido celular. Este tipo de extracto se protege de la luz, para evitar
posibles reacciones y debe agitarse continuamente, el tiempo de
maceración va entre cuatro y diez días, cuanto mayor sea la relación entre
el líquido extractivo y la droga, más favorable será el rendimiento” (43).
Digestión: “Es un tipo de maceración que se da a una temperatura suave
de 50 o 60° C”. Al aumentar medianamente la temperatura se consigue un
mayor rendimiento de la extracción, haciendo que el solvente pueda
ingresar más rápidamente al interior de las células y así extraer los
principios activos” (43).
Lixiviación o Percolación: “Es el método oficial de extracción, descrito en
la Farmacopea Americana, consiste en que el menstruo atraviese la masa
de materia vegetal pulverizada en un solo sentido, alcanzando
concentraciones crecientes de tal modo que el equilibrio entre el solvente
dentro y fuera del marco nunca se alcanza, por lo que la droga bañada
siempre por nuevas proporciones de menstruo acaba por ceder todos sus
componentes solubles de manera progresiva. Este tipo de extracción se
realiza en recipientes cilíndricos o cónicos (percoladores), que poseen
dispositivos de carga y descarga, lográndose una extracción total de los
principios activos” (43).
16
Soxhlet: “Este método de extracción es una técnica basada en la
separación sólido-líquido, en continuo, empleando un disolvente, con
posterior evaporación de éste y pesada final del residuo. Se usa para la
determinación del contenido graso en muestras de diferente naturaleza ” (43).
2.2.7.- Equipo Soxhlet
“El equipo Soxhlet tiene como función recircular los vapores condensados con
ayuda de un sifón a la fuente de disolvente que se encuentra en evaporación
continua, arrastrando consigo los principios activos de la materia prima
contenido en los cartuchos desechables” (44).
La “capacidad aproximada en un equipo de laboratorio es de 500 mL de
volumen primario con una recirculación de 100 mL cada cinco minutos
aproximadamente en estado estable. La velocidad de reflujo depende
directamente de la eficiencia y el tamaño del condensador” (44).
2.2.8.- Escherichia coli
2.2.8.1.- Generalidades
Escherichia coli “se describió por primera vez en 1885 por el pediatra alemán
Theodore Escherich. Fue nombrada inicialmente como “Bacterium coli
commune”, pero en 1919 fue renombrada con el nombre actual en honor a su
descubridor” (45).
Los “representantes de esta especie son bacilos gramnegativos, oxidasa
negativos, con un tamaño promedio de 1,1-1,5 μm de ancho y 2,0-6,0 μm de
largo. De acuerdo a sus requerimientos de oxígeno son anaerobios facultativos
y pueden ser móviles por la presencia de flagelos peritricos o no móviles” (46).
E. coli “forma parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal (TGI) del
ser humano, otros mamíferos y las aves y constituye una de las especies
bacterianas más abundantes en esta localización” (45,47).
En agar Mac Conkey forma colonias planas, secas, rosadas con un área
circundante de color rosa más oscuro compuesto por sales precipitadas
(46,47).
17
2.2.8.2.- Patogenicidad
Escherichia coli “es el miembro más frecuente e importante del género
Escherichia. Forma parte de la flora intestinal normal en animales y humanos.
Cada gramo de heces humanas contiene hasta 108 microorganismos
Escherichia coli. Este microorganismo se asocia a múltiples enfermedades,
incluida la gastroenteritis e infecciones extraintestinales, como las infecciones
urinarias (ITU), meningitis y sepsis. Multitud de cepas son capaces de producir
enfermedad y algunos serotipos se asocian a una mayor virulencia ” (Ejemplo:
Escherichia coli O157 es la causa más frecuente de colitis hemorrágica) (47).
2.2.9.- Staphylococcus aureus
2.2.9.1.- Morfología
Es un microorganismo Gram (+) “de forma esférica, de aproximadamente 1μm
de diámetro. Tiende a agruparse en forma de racimos. Su pared celular es la
típica de grampositivos, con peptidoglicano asociado a ácidos teicoicos
mediante el aminoácido L-lisina. A diferencia de los estreptococos produce
catalasa, enzima que desdobla el agua oxigenada. En agar pueden formar
colonias de color amarillo dorado y pueden ser betahemolíticas. Su
característica más importante es la fermentación de varios azúcares, entre los
que destaca el manitol, para producir ácido láctico, lo que le diferencia de los
demás estafilococos. Resiste altas concentraciones de sal, por ” lo que el medio
Chapman (agar manitol salado) es útil para su aislamiento e identificación (47).
2.2.9.2.- Patogenicidad
S. aureus coloniza de forma habitual casi al 30% de las personas,
encontrándose principalmente en la nariz y la zona nasofaríngea, piel y
genitales externos y rara vez en el colon y la vagina. En el medio hospitalario,
tanto en enfermos como en personal sanitario, aumenta de manera importante
el porcentaje de colonización, al igual que en diabéticos, pacientes sometidos a
diálisis crónica y drogodependientes (47).
2.2.10.- Cándida albicans
2.2.10.1.- Morfología
18
Cándida albicans “es un hongo dimórfico, es decir, se desarrolla de forma
distinta en función de la temperatura de crecimiento, como levadura,
normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de aspecto filamentoso, a
25ºC en la naturaleza. Pertenece al filo Ascomycota” y se reproduce de forma
asexual por gemación (48).
En forma de levadura presenta un “aspecto de células redondas u ovaladas, de
3-8 x 2-7 micras de tamaño, agrupadas en pequeños grupos, mientras que, en
forma de hongo filamentoso, las células se alargan y se diversifican tomando la
apariencia de filamentos, pseudo-hifas o pseudo-micelio” (48).
2.2.10.2.- Patogenicidad
Candidiasis o moniliasis: “infección superficial que aparece principalmente en
individuos con las defensas bajas, afectando a la piel (intertrigo), a las mucosas
(oral, genitourinaria o digestiva) y a las uñas (paroniquia o perionixis). Los
síntomas son leves como: enrojecimiento, picazón y malestar. En personas con
cáncer, trasplantados o con SIDA la infección puede hacerse sistémica
(candidemia), y puede llegar a ser mortal” (48).
2.2.11.- Método de macrodilución en tubos:
Es utilizado para determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) y la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) (49).
La CMI “es definida como la concentración más baja de sustancia que puede
inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de incubar por 24
horas y la CMB se define como la concentración más baja que puede prevenir
el crecimiento de un organismo después de subcultivar en un medio libre del
compuesto evaluado”
(49).
Es un método “estandarizado de dilución en caldo, que se utiliza para medir
cuantitativamente la actividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo
bacteriano. Estos métodos se basan en la preparación de una serie de tubos o
placas con caldo o agar, los cuales se les agrega el antibiótico en distintas
concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o placas con una
suspensión estandarizada del microorganismo en estudio”. Las pruebas se
19
examinan después de incubar a 35 ± 2ºC y se determina la (CMI) del
antimicrobiano frente al microorganismo (50).
2.2.12.- Método de difusión:
Este método de difusión en disco o en pozo fue estandarizado por Bauer Kirby
y colaboradores y es actualmente recomendado por el Subcomité de Ensayos
de Susceptibilidad de NCCLS, de Estados Unidos (51). “Se basa en la relación
entre la concentración de la sustancia necesaria para inhibir una cepa
bacteriana y el halo de inhibición de crecimiento en la superficie de una placa
de agar con un medio de cultivo adecuado y sembrado homogéneamente con
la bacteria a ensayar y sobre la cual se ha depositado un disco de papel filtro
de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado” en pozo impregnado con una cantidad
conocida de la sustancia (49).
La lectura se interpreta como sensible (S), intermedia (I), resistente (R) según
las categorías establecidas por el NCCLS. La concentración de bacterias usada
para el estudio de susceptibilidad en el laboratorio ha sido estandarizada en 1.5
x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL, lo cual equivale a un patrón de
0.5 en la escala de Mac Farland. Es recomendable tomar el inóculo de cultivos
en la fase exponencial de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias de un
cultivo puro (51). Los medios de cultivo más utilizados en dichas técnicas son el
agar Müller Hinton y agar tripticasa soya, ya que sus componentes facilitan el
crecimiento de diferentes cepas bacterianas y mayor difusión de las muestras
(49).
2.2.13.- Antibiograma:
El “antibiograma es la prueba microbiológica de susceptibilidad in vitro que se
lleva a cabo para conocer el comportamiento de un microorganismo frente a
determinados antibióticos, cuyos resultados se expresan en términos de
"sensibilidad" y "resistencia". La selección de antimicrobianos en el estudio de
susceptibilidad in vitro tiene como objetivo disponer de un adecuado apoyo en
la elección de las terapias antimicrobianas, al igual que promover su uso
racional”
(52).
La interpretación del antibiograma presenta las siguientes características:
20
Establecer la probabilidad de éxito o fracaso terapéutico que de un
antibacteriano frente a los microorganismos causantes de infección
estudiados en el antibiograma.
Utilizar criterios en función del conocimiento microbiológico, para definir una
correlación entre el antibiograma y el éxito terapéutico.
Realizar un análisis fenotípico de los resultados de sensibilidad según los
mecanismos de resistencia y expresión bacteriana.
Realizar la detección de la resistencia y la predicción del fracaso terapéutico
(52).
2.3.- Hipótesis
2.3.1.- Hipótesis principal
Dado que existen antecedentes del uso de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) en la medicina tradicional, es probable que el extracto de hojas de
dicha especie presente efecto antimicrobiano sobre cepas de Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC
10231.
2.3.2.- Hipótesis secundarias
Es posible que el extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) presente flavonoides y taninos.
Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923
Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) la
Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) sobre Escherichia coli ATCC 25922.
Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
Concentración Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 10231.
Es probable que Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli
ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231 presenten sensibilidad al
extracto de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
21
2.4.- Variables
2.4.1.- Identificación de variables
Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo).
Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans
ATCC 10231.
2.4.2.- Definición conceptual de variables
Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo).
Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans
ATCC 10231.
2.4.3.- Definición operacional de variables
Variable independiente: Hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo).
Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
obtenido por el método de extracción por Soxhlet, verificando la presencia
de Taninos y Flavonoides.
Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans
ATCC 10231.
Actividad antimicrobiana evaluada por la determinación de la Concentración
Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima Bactericida, Concentración
Mínima Fungicida y por el método del antibiograma midiendo los halos de
inhibición.
22
2.4.4.- Operacionalización de variables
Tabla 3. Indicadores y subindicadores de las variables de estudio de la presente investigación.
VARIABLES INDICADOR SUB INDICADOR
Variable Independiente
Hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo)
Extracto etanólico de
hojas de Prosopis
pallida forma armata
(Algarrobo)
Taninos
Favonoides
% (Porcentaje)
Variable Dependiente
Actividad antimicrobiana sobre
Staphylococcus aureus ATCC
25923, Escherichia coli ATCC
25922 y Cándida albicans ATCC
10231
Concentración Minina
Inhibitoria
µL/mL
Concentración Mínima
Bactericida
µL/mL
Sensibilidad bacteriana Halo de inhibición
(mm) medidos con
un vernier
Fuente: Elaboración propia.
23
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1.- Tipo y nivel de investigación
3.1.1.- Nivel de la investigación
Experimental
3.1.2.- Tipo de investigación
Según manipulación de variables: Experimental
Según número de mediciones: Transversal
Según la temporalidad: Prospectivo
Enfoque: Cuantitativo
Por el propósito o finalidad: Aplicada
Paradigma: Positivista
3.1.3.- Diseño de la investigación
Experimental
3.2.- Descripción del ámbito de la investigación
3.2.1.- Ubicación espacial
El presente trabajo se realizó en los laboratorios de la Universidad Privada
Autónoma del Sur, ubicada en la Región, Provincia y Departamento de
Arequipa.
3.2.2.- Ubicación temporal
La presente investigación fue desarrollada en el periodo de Octubre,
Noviembre, Diciembre del 2018 y Enero, Febrero, Marzo, Abril del 2019.
3.3.- Población, muestra y muestreo
Muestreo: No probabilístico
3.4.- Técnicas e instrumentos para la recolección de datos
24
3.4.1.- Material biológico
Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC
25922 y Cándida albicans ATCC 10231.
Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
3.4.2.- Materiales
3.4.2.1.- Material de vidrio
Baguetas
Buretas
Fiola de 25 y 50 mL
Matraces de vidrio 100, 500 y 1000 mL.
Placas Petri de vidrio de 60mm x 15mm y 100mm x 15mm
Pera de decantación de 250 mL
Pipetas de 1ml, 2ml, 5ml y 10 mL
Probeta graduada de: 50 y 100 mL
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado: 50, 100, 250ml
Asa de Digralsky
Frascos de vidrio ambar de: 150, 250mL
3.4.2.2.- Meterial de Plástico
Placas petry descartable de 100 x 15 mm
Placas petry descartable de 60 x 15 mm
Pipetas cuentagotas
Puntas de pipeta: 70, 50 mm
3.4.2.3.- Equipos y Aparatos
Autoclave
Balanza analítica
Cocina eléctrica
Equipo de Soxhlet
Estufa
Refrigeradora
25
Asa de Kohle
Espátulas
Gasas estériles y Algodón.
Gradilla de metal para tubos de ensayo
Micropipeta graduada
Papel filtro rápido
Papel Kraft
Pinzas
Soporte universal
3.4.2.4.- Reactivos
Agua destilada
Cloruro férrico
Etanol
Suero fisiológico
Tween 80
Ácido clorhídrico
Láminas de Magnesio
Cloruro de Bario
Ácido Sulfúrico
3.4.2.5.- Medios de Cultivo
Agar Manitol salado
Agar Sabouraud
Agar Müller Hinton
Caldo Peptonado
3.4.3.- Recolección, identificación y almacenamiento de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo)
Las hojas de Prosopis pallida forma armata (algarrobo) fueron recolectadas del
Sector Belaunde del Distrito de Quequeña, Provincia de Arequipa,
Departamento de Arequipa (Latitud 16°32'16.96"S – Longitud 71°28'38.04"O)
26
durante el mes de Octubre 2018, siendo trasladadas al Herbarium Areqvipence
de la Universidad Nacional de San Agustín para su posterior identificación.
Las hojas recolectadas fueron lavadas con abundante agua destilada para
luego hacerlas secar temperatura ambiente; en sombra durante 72 horas. Las
hojas secas se muestran en la Figura 4.
Figura 4. Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
Fuente. Elaboración propia – Laboratorio Universidad Privada Autónoma
del Sur (Octubre - 2018).
3.4.4.- Obtención del extracto seco de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo).
Para la obtención del extracto etanólico se procedió a pulverizar las hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) hasta la obtención de partículas
finas, para luego pesar 20 g que se colocaron empaquetados en papel filtro
rápido en la cámara de extracción del equipo Soxhlet acondicionado con
aproximadamente 150 mL de etanol de 96°. El proceso de extracción se
desarrolló hasta el agotamiento de la muestra que fue equivalente a 21 vueltas
del solvente (9), conforme se visualiza en la figura 5.
27
Posteriormente el extracto obtenido fue sometido a Baño María a 70 °C
aproximadamente, con la finalidad de evaporar el solvente hasta sequedad,
luego se llevó a una estufa a la misma temperatura durante 1 hora para luego
enfriar en un desecador para luego calcular el porcentaje de rendimiento del
extracto seco (9).
Figura 5. Proceso de obtención del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo),
usando el método de extracción por Soxhlet –
Universidad Privada Autónoma del Sur, Noviembre
2018.
Fuente: Elaboración propia.
3.4.5.- Identificación de Taninos
Los “taninos fueron identificados adicionando al extracto etanólico 1 mL de
cloruro férrico al 5 %, dicha reacción se interpreta por los colores que resultan
luego de la adición de la sal de hierro, es así que para taninos hidrolizables o
gálicos da una coloración azul negruzco y para taninos condesados aparece
coloraciones entre verde a marrón” (44).
3.4.6.- Identificación de Flavonoides
La “identificación de flavonoides fue realizada mediante la prueba de Shinoda
cuyo fundamento radica en la oxidación del magnesio en medio ácido (Ácido
Clorhídrico), donde el hidrógeno liberado se produce por reducción el ion flavilio
y los colores varían de rojo pálido hasta rojo escarlata” (52).
28
Figura 6. Reacción química en la prueba de Shinoda. Fuente: Adaptado de Acosta y Castro (53).
El “procedimiento consistió en adicionar en un tubo una cantidad adecuada de
extracto para luego agregar etanol en presencia de magnesio metálico y dos
gotas ácido clorhídrico concentrado dando una coloración de naranja al rojo
para flavonas, una coloración rojo carmesí, purpura y azul para flavononas, un
color amarillo pálido o incoloro para flavonas y flavonoles, finalmente una
coloración de amarillo rojizo indica presencia de isoflavonas ” (44).
3.4.7.- Escala de Mc Farland
La escala de Mac Farland se preparó mezclando exactamente BaCl2 al 1.175%
y H2SO4 al 1% basándose en el Manual del Instituto Nacional de Salud (INS),
posteriormente se midió la absorbancia a 625 nm (52).
3.4.8.- Evaluación de la Actividad Antimicrobiana
3.4.8.1.- Reactivación de las cepas
Las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 fueron adquiridas de
KwikStik y almacenadas para su conservación en un intervalo de
temperaturas entre 2° a 8°C. Para la reactivación se puso en contacto el
hisopo que contenía la cepa con caldo, luego se sembró usando el hisopo
una placa Petri con agar Manitol Salado, finalmente se incubó la placa
sembrada por 24 horas a 37 °C (47).
Las cepas de Escherichia coli ATCC 25922 fueron adquiridas de KwikStik y
almacenadas para su conservación en un intervalo de temperaturas entre 2°
a 8°C. Para la reactivación se puso en contacto el hisopo que contenía la
cepa con caldo, luego se sembró usando el hisopo una placa Petri con agar
29
Müller Hinton, finalmente se incubó la placa sembrada por 24 horas a 37 °C
(47).
Las cepas de Cándida albicans ATCC 10231 fueron adquiridas de KwikStik
y almacenadas para su conservación en un intervalo de temperaturas entre
2° a 8°C. Para la reactivación se puso en contacto el hisopo que contenía la
cepa con caldo, luego se sembró usando el hisopo en una placa Petri con
agar Sabouraud, finalmente se incubó la placa sembrada por 48 horas a 37
°C (47).
3.4.8.2.- Preparación de la solución madre
Se preparó 1g de extracto seco de hojas de Prosopis pallida forma armata con
1mL de etanol, Se tomó una cantidad de extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 500 μL que se emulsifica con 50
μL de tween 80 y se le adicionó 450 μL de agua estéril hasta completar 1000
μL, de este modo se obtuvo una emulsión homogénea cuya concentración fue
de 500 μL/Ml (44).
3.4.8.3.- Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI).
Para la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima se preparó un
inóculo con una concentración de 108 UFC/mL tomando una cantidad adecuada
de colonias para luego sumergir el asa de kolle en 5 mL del caldo peptonado,
hasta obtener una turbidez del medio similar a la del tubo N° 0.5 de la escala
de Mac Farland, la cual equivale, a una concentración de 108 UFC/mL (52).
Luego se procedió a realizar una dilución de 1:100 del inóculo ya preparado
para obtener una solución de 106 UFC /mL (54), esta última dilución fue
utilizada como el inóculo de estudio.
Finalmente, se estudiaron diluciones de 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781,
0.39, 0.195 mg/mL a partir de una solución madre del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de una concentración de
500 mg/mL. Para ello en la Tabla 4 se observa el procedimiento resumido
siendo los primeros 7 tubos las diluciones expuestas, el tubo 9 el control
30
positivo que contiene el inóculo de microorganismos y el tubo 10 el control
negativo donde sólo se presenta el extracto en estudio en ausencia de inóculo
microbiano.
Tabla 4. Determinación de CMI por microdilución en caldo.
DESCRIPCIÓN TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+)
T10 (-)
solución madre del extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) (500 mg/mL)
100 500 500 500 500 500 500 500 _ 500
Caldo Peptonado (μL) 900 500 500 500 500 500 500 500 500 _
Concentración Inicial de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) (500 mg/mL)
50 25 12.50 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39
_
Inóculo (μL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 _
Volumen final (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.5
Concentración final extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo) (500 mg/mL) (μL/mL)
25 12.50 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 _ 500
Fuente: Elaboración propia.
3.4.9.- Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)
De los tubos de ensayo estudiados en la tabla precedente se sembró en placas
petry un volumen de 500 µL en agar manitol salado, Müller Hinton y Sabouraud
para S. aureus, E. coli y C. albicans respectivamente, incubando de 24 a 48
horas para luego evaluar el crecimiento bacteriano, ello a fin de determinar la
cantidad del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en
condiciones estandarizadas (54).
3.4.9.1.- Determinación de la sensibilidad antimicrobiana
El método usado fue por la impregnación de discos con las muestras a
estudiar, el resultado es una zona de inhibición del desarrollo con borde
delineado; los cuales se expresan según el INS como; sensible (S), intermedio
(I), y resistente (R). Siendo entre 30 y 35 mm altamente sensible, de 20 a 30
mm sensibles, de 15 a 20 intermedio y menores a 15 mm resistentes (52).
31
Se elaboraron discos de papel filtro de 5 mm de diámetro, los cuales fueron
esterilizados en la autoclave por 15 minutos a 121°C, posteriormente fueron
almacenados en un frasco previamente esterilizado, posteriormente los discos
fueron impregnados con las diferentes concentraciones del extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) (53).
Es así que, se evaluaron concentraciones del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 100.00, 80.00, 60.00, 40.00,
20.00, 10.00, 5.00, 2.50, 1.25, 0.63, 0.31 % en discos elaborados con papel
filtro, por otro lado, los diámetros se midieron usando un vernier.
3.4.9.2.- Estrategia de recolección de datos
Para el presente trabajo de investigación se utilizaron paquetes de datos como
Microsoft Excel y Minitab 16 para la comparación de grupos haciendo un
análisis de varianza ANOVA y una prueba comparativa de TUKEY.
32
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1.- Recolección e identificación
Las hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) recolectadas en el
Sector Belaúnde del Distrito de Quequeña, Provincia – Departamento de
Arequipa fueron identificadas en el Herbarium Areqvipense (HUSA) de la
Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa (Anexo 1), como Prosopis
pallida forma armata.
Tabla 5. Identificación y tipificación de hojas de Algarrobo recolectadas.
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsidae
Subclase Rosidae
Orden Fabales
Familia Fabaceae
Género Prosopis
Especie Prosopis pallida forma armata.
Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de
Arequipa.
4.2.- Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo)
Los “extractos obtenidos por el método de extracción por Soxhlet usando 20
gramos de hojas pulverizadas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo),
fueron concentrados a Baño María a 70 °C”, hasta peso constante luego los
extractos secos fueron pesados (Figura 7) para calcular el rendimiento (%R)
(44), conforme a fórmula que se indica:
33
Figura 7. Peso de extracto seco obtenido luego de la evaporación
del solvente (etanol) a Baño María.
Fuente: Elaboración propia.
A continuación, en la Tabla 6 se muestran los resultados obtenidos luego de
calcular el rendimiento de las 3 extracciones realizadas, donde se muestra un
rendimiento promedio de 20.71 ± 0.40 % y una desviación estándar relativa de
1.93 %
Tabla 6. Porcentajes de rendimiento (%R) correspondientes a las extracciones del
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
N Muestra (g) Peso de vaso (g) Peso de vaso con extracto
seco (g) %R
1 20 48.67 52.73 20.27
2 20 46.83 51.00 20.83
3 20 48.93 53.14 21.04
Promedio (%) 20.71
Desviación estándar 0.40
Desviación Estándar Relativa DSR (%) 1.92
Fuente. Elaboración propia
4.3.- Identificación de taninos
En la Figura 8 se observa que el tubo de ensayo N° 1 correspondiente al
Cloruro Férrico al 5 % sin extracto, el tubo de ensayo 2 corresponde al extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) obtenido, y el
tubo 3 es el tubo que contiene el extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata con el Cloruro Férrico al 5 % dando una coloración marrón
correspondientes a taninos condensados.
34
Figura 8. Identificación de taninos condensados en Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). Fuente: Elaboración propia.
4.4.- Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda.
En la Figura 9 se observa el tubo de ensayo 3 que corresponde al extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), el tubo 2 es el
blanco el cual presenta solo etanol con Mg y HCl y el tubo 1 es el tubo que
contiene el extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) con etanol, Mg y HCl dando una coloración rojo carmesí
característico de flavononas.
Figura 9. Identificación de flavonoides. Presencia de flavononas en Prosopis pallida forma armata (Algarrobo). Fuente: Elaboración propia.
35
4.5.- Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Escherichia
coli ATCC 25922.
Para la evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Escherichia coli ATCC
25922, se evaluó primero la Concentración Mínima Inhibitoria, posteriormente
la Concentración Bactericida Mínima y finalmente la Sensibilidad usando discos
de inhibición y los resultados se exponen a continuación.
4.5.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922.
La concentración inhibitoria mínima CIM se determinó por el método de
microdilución en caldo peptonado, evaluando concentraciones finales de 0.19,
0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.50 y 25 µL/mL de extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida (Algarrobo), realizándose el ensayo por triplicado y los
resultados se pueden reflejar en la Figura 10:
Figura 10. Tubos de ensayo de determinación de CMI de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli. Fuente. Elaboración propia.
De donde:
Tubo 1: Se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto de 500 mg/mL) con
900 µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se
adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una
36
concentración final de 25 mg/mL (2.5 %) de extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC
/mL lográndose una concentración final de 12.5 mg/mL (1.25 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tubo 3: A los 500 µL retirados del tubo 2 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 4, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 6.25 mg/mL (0.63 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tubo 4: A los 500 µL retirados del tubo 3 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 5, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 3.125 mg/mL (0.31 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tubo 5: A los 500 µL retirados del tubo 4 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 6, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 1.562 mg/mL (0.16 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tubo 6: A los 500 µL retirados del tubo 5 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 7, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.781 mg/mL (0.08 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tubo 7: A los 500 µL retirados del tubo 6 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 8, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.39 mg/mL (0.04 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
37
Tubo 8: A los 500 µL retirados del tubo 7 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta
solución se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.195 mg/mL (0.02 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
El tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de caldo
peptonado con 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL.
Por otro lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se
agregaron 500 µL de solución madre (500 mg/mL) de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Finalmente, todos los tubos fueron incubados por 24 horas a 37 °C.
En la Tabla 7 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de
incubación, donde se presenta a partir del Tubo 4 se nota crecimiento de
Escherichia coli ATCC 25922 manifestado por la presencia de turbidez, la cual
se interpreta que la Concentración Mínima Inhibitoria del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) es de 6.25 mg/mL dicha
concentración es capaz de inhibir el crecimiento de Escherichia coli ATCC
25922 es de 6.25 mg/mL por el método de micro dilución en caldo.
Tabla 7. Resultados de la determinación de concentración inhibitoria mínima (CIM) de
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Escherichia coli ATCC 25922.
DESCRIPCIÓN
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
(+)
T10
(-)
Concentración Final (mg/mL) de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)
25.0 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.00 500
Concentración Porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)
2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50
E. coli ATCC 25922 ENSAYO 1 - - - + + + + + + -
E. coli ATCC 25922 ENSAYO 2 - - - + + + + + + -
E. coli ATCC 25922 ENSAYO 3 - - - + + + + + + -
Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia.
38
4.5.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de
hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922.
La Concentración Mínima Bactericida fue realizada por el método de siembra
en placa con agar Müller Hinton de los tubos del 2, 3, 4, 5 y el tubo 9 como
control positivo con el fin evaluar el crecimiento bacteriano.
Figura 11. Siembra en placa (CMB) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922.
Fuente: Elaboración propia.
En la Tabla 8 y Figura 11 se observa que en las placas del tubo 4 y 5 si existe
crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922 al observarse el crecimiento de
colonias las cuales fueron contrastadas con el control positivo, por lo cual, la
concentración mínima del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) para inhibir el crecimiento del 99.9 % de Escherichia coli
ATCC 25922 es de 6.25 mg/mL lo cual coincide con el resultado de la CMI.
Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Bactericida
(CMB) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
frente a Escherichia coli ATCC 25922.
DESCRIPCIÓN PLACAS
T2 T3 T4 T5 T9
Concentración Final (μL/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
12.50 6.25 3.12 1.56 0
Concentración Porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
1.25 0.63 0.31 0.16 0
Escherichia coli ENSAYO 1 - - + + +
Escherichia coli ENSAYO 2 - - + + +
Escherichia coli ENSAYO 3 - - + + +
Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia
4.5.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), comparada con
Ciprofloxacino frente a Escherichia coli ATCC 25922.
39
La sensibilidad bacteriana evaluada a concentraciones de 0.31, 0.63, 1.25,
2.50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) por el método de dilución en discos en placas
con agar Müller Hinton presentó halos de inhibición definidos.
Figura 12. Sensibilidad bacteriana de extracto etanólico de hojas de
P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli ATCC 25922
Fuente. Elaboración propia
En la Tabla 9 se observan los resultados promedio de los halos de inhibición de
las concentraciones estudiadas de extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) frente a E. coli.
Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Concentración extracto etanólico de hojas
de P. Pallida forma armata (Algarrobo) Halos de inhibición (mm) Evaluación
(%) E1 E2 E3 Promedio
100.00% 39.1 36.0 34.0 36.3 AS
80.00% 33.2 32.2 32.0 32.4 AS
60.00% 29.1 28.5 28.0 28.5 S
40.00% 28.0 27.4 26.0 27.1 S
20.00% 25.0 25.0 22.1 24.0 S
10.00% 22.0 21.5 21.1 21.5 S
5.00% 19.0 18.5 18.4 18.6 I
2.50% 18.0 17.1 16.6 17.2 I
1.25% 16.4 14.5 15.0 15.3 I
0.63% 14.2 14.0 13.8 14.0 R
0.31% 13.5 12.2 12.0 12.5 R
Ciprofloxacino 50.2 48.0 47.6 48.6 AS
Etanol 0 0 0 0.00 NE
Donde: NE = No hay efecto, AS = Altamente sensible, S = Sensible, I = Intermedio, y R =
Resistente.
Fuente: Elaboración propia
40
En la Tabla 9 se observa que de las concentraciones del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiadas frente al
Escherichia coli ATCC 25922, donde es Resistente a concentraciones de 0.31
y 0.63 %, Intermedio a concentraciones de 1.25, 2.50 y 5.00 %, Sensible a
concentraciones de 10.00, 20.00, 40.00 y 60.00 % y Altamente sensible a
concentraciones de 80.00 y 100.00 % de la misma forma Altamente sensible al
ciprofloxacino.
Para la comparación estadística se procedió a realizar un análisis de varianza
ANOVA, obteniendo como resultado que el valor crítico para Fc es menor al
valor de F (Fc: 2.15 < F: 375.46), por lo cual, se concluye que al menos un
grupo es diferente al 95 % de confianza (Tabla 10).
Tabla 10. Análisis de varianza de la determinación de prueba de sensibilidad de
Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
GL Promedio
de los cuadrados
F Probabilidad Valor crítico
para Fc
Entre grupos 5413.54 12 451.13 375.46 6.09x10-26 2.15
Dentro de los
grupos 31.24 26 1.20
Total 5444.78 38
Donde:
Fc:2.15<F:375.46; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)
GL = Grado de libertad
Fc = Factor de Corrección
F = Estimación de la varianza
Fuente: Elaboración propia adaptado de ANOVA
Posteriormente, se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla 11,
con la finalidad de distinguir qué grupos son iguales y diferentes, en dicha tabla
se observa que ninguna concentración del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiada se asemeja al efecto
mostrado por el ciprofloxacino por lo cual el efecto antibacteriano frente a E.
coli mostrado por el extracto es menor al ciprofloxacino.
41
Tabla 11. Test de Tukey de comparación de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC
25922 a concentraciones del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo).
FACTOR N PROMEDIO DE TAMAÑO DE
HALOS EVALUADOS GRUPO
Ciprofloxacino 3 48.60 A
100.00% 3 36.37
B
80.00% 3 32.47
C
60.00% 3 28.53
D
40.00 % 3 27.13
D E
20.00% 3 24.03
E F
10.00% 3 21.53
F G
40.00% 3 18.63
G H
2.50% 3 17.23
H I
0.63% 3 15.30
I J
1.25% 3 14.00
J
0.31% 3 12.57
J
Etanol 3 0.000 K
Donde:
- % = Concentración de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo)
- Cada letra indicada en la columna grupo, señala un grupo evaluado, a letras iguales no
hay diferencia significativa entre los grupos.
N = Número de pruebas realizadas de una misma concentración.
Fuente: Elaboración propia adaptado de Minitab 17.
En la Figura 13 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondientes a
los datos obtenidos, luego de realizar los ensayos de sensibilidad bacteriana de
Escherichia coli ATCC 25922, donde los halos de inhibición varían en tamaño
de acuerdo con cada concentración del extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida (Algarrobo).
42
Figura 13. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de E. coli ATCC 25922 a
concentraciones del extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)
Fuente: Elaboración propia.
4.6.- Evaluación de la actividad antimicrobiana de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Para la evaluación de la actividad antibacteriana de extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus
ATCC 25923 primero se evaluó la Concentración Inhibitoria Mínima,
posteriormente la Concentración Bactericida Mínima y finalmente la
Sensibilidad usando discos de inhibición y los resultados se exponen a
continuación.
4.6.1.- Concentración inhibitoria mínima (CIM) de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Staphylococcus aureus ATCC 25923
La concentración inhibitoria mínima CIM se determinó por el método de
microdilución en caldo peptonado, evaluando concentraciones finales de 0.19,
43
0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.50 y 25 mg/mL de extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), donde en el:
Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 500 mg/mL) con 900 µL de
caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se adicionaron
500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una concentración
final de 25 mg/mL (2.5 %) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
(Algarrobo).
Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC
/mL lográndose una concentración final de 12.50 mg/mL (1.25 %) de
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 3: A los 500 µL retirados del tubo 2 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 4, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 6.25 mg/mL (0.63 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 4: A los 500 µL retirados del tubo 3 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 5, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 3.12 mg/mL (0.31 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 5: A los 500 µL retirados del tubo 4 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 6, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 1.56 mg/mL (0.16 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 6: A los 500 µL retirados del tubo 5 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 7, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.78 mg/mL (0.08 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
44
Tubo 7: A los 500 µL retirados del tubo 6 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 8, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.39 mg/mL (0.04 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 8: A los 500 µL retirados del tubo 7 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta
solución se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC/mL
lográndose una concentración final 0.19 mg/mL (0.02 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de
caldo peptonado con 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro
lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500
µL de solución madre (500 mg/mL) de extracto. Se dejó incubar por 24
horas a 37 °C.
Finalmente, todos los tubos fueron incubados por 24 horas a 37 °C.
El ensayo fue realizado por triplicado y los resultados se pueden reflejar en
la Figura 14.
Figura 14. Tubos de ensayo de determinación de la CMI del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Staphylococcus
aureus ATCC 25923.
Fuente: Elaboración propia.
45
En la Tabla 12 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de
incubación, encontrándose que no existe turbidez en los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, y
7 en cambio en el tubo 8 si existe crecimiento los cual se interpreta que la
Concentración Mínima Inhibitoria del extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) es de 6.25 mg/mL dicha concentración es
capaz de inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC 25923 es de
0.39 mg /mL por el método de microdilución en caldo.
Tabla 12. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
DESCRIPCIÓN
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
(+)
T10
(-)
Concentración Final (μL/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
25.0 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.00 500
Concentración porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)
2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50
S aureus ATCC 25923 ENSAYO 1 - - - - - - - + + -
S. aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - - - - - + + -
S. aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - - - - - + + -
Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia.
4.6.2.- Concentración Mínima Bactericida (CMB) de extracto etanólico de
hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a S. aureus ATCC
25923
La determinación de Concentración Mínima Bactericida fue realizada por el
método de siembra en placa con agar Manitol Salado, la concentración de los
tubos de ensayo del 5, 6, 7, 8 y el tubo 9 como control positivo, ello con la
finalidad de evaluar el crecimiento bacteriano
46
Figura 15. Siembra en placa CMB de extracto etanólico de hojas Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo) frente a S. aureus ATCC 25923.
Fuente: Elaboración propia.
En la Tabla 13 y Figura 15 se evidencian que en las placas 5, 6 y 7
correspondientes a los tubos de ensayo 5, 6 y 7 de la prueba de CMI no existe
crecimiento bacteriano, sin embargo en la placa 8 correspondiente al tubo de
ensayo 8 si presenta crecimiento de S. aureus ATCC 25923, por lo que la
Concentración Mínima Bactericida es de 0.39 mg/mL equivalente al 0.04% de
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tabla 13. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Bactericida
(CMB) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
DESCRIPCIÓN PLACAS
T5 T6 T7 T8 T9 (+)
Concentración final (mg/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
1.56 0.78 0.39 0.19 0
Concentración porcentual (%) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
0.16 0.08 0.04 0.02 0
Staphylococcus aureus ATCC 2592 3ENSAYO 1 - - - + +
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - + +
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - + +
Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia.
4.6.3.- Determinación de la sensibilidad bacteriana de extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) comparada con
Ampicilina frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
La sensibilidad bacteriana evaluada a concentraciones de 0.31, 0.63, 1.25,
2.50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) por el método de dilución en discos en placas
con agar Manitol Salado, presentó halos de inhibición definidos como se
observa a continuación.
47
Figura 16. Sensibilidad bacteriana de S. aureus ATCC 25923 frente al
extracto etanólico de hojas de P.pallida forma armata (Algarrobo).
Fuente: Elaboración propia.
En la Tabla 14 se observan los resultados de los halos de inhibición de las
concentraciones estudiadas de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus
ATCC 25923 a concentraciones de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo)
Concentración extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo)
Halos de inhibición (mm) Evaluación
(%) E1 E2 E3 Promedio
100% 33.4 31.5 30.0 31.6 AS
80% 29.9 28.3 28.3 28.8 S
60% 27.9 25.2 25.0 26.0 S
40% 24.6 24.4 24.0 24.3 S
20% 23.6 23.0 23.0 23.2 S
10% 21.9 21.8 21.0 21.5 S
5% 20.8 20.5 19.5 20.2 S
2.50% 19.2 18.7 18.3 18.7 I
1.25% 17.8 17.3 17.0 17.3 I
0.63% 16.6 15.3 15.0 15.6 I
0.31% 12.5 12.0 11.6 12.0 R
Ampicilina 24.4 24.6 25.0 24.6 S
Etanol 0 0 0 0 NE
Donde: NE = No hay efecto, AS = Altamente sensible, S = Sensible, I = Intermedio, y
R = Resistente.
Fuente: Elaboración propia
48
En la Tabla 14 se observa que de las concentraciones del extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiadas, Staphylococcus
aureus ATCC 25923 es Resistente a concentraciones de 0.31 %, Intermedio a
concentraciones de 0.63, 1.25 y 2.50 %, Sensible a concentraciones de 5.00,
10.00, 20.00, 40.00, 60.00 y 80.00 % y Altamente sensible a concentraciones
de 100.00 % por otro lado, sensible a Ampicilina.
Para la comparación estadística se procedió a realizar un análisis de varianza
ANOVA, obteniendo como resultado que el valor crítico para Fc es menor al
valor de F (Fc:2.15 < F: 269.59), por lo cual, se concluye que al menos un
grupo es diferente al 95 % de confianza (Tabla 15).
Tabla 15. Análisis de varianza de la determinación de prueba de sensibilidad de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones del extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
GL Promedio
de los cuadrados
F Probabilidad Valor crítico
para Fc
Entre grupos 2378.21 12 198.18 296.59 1.27 x10-24 2.15
Dentro de los
grupos 17.37 26 0.69
Total 2395.58 38
Donde:
Fc: 2.15 < F:296.59; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)
GL = Grado de libertad
Fc = Factor de Corrección
F = Estimación de la varianza
Fuente: Elaboración propia adaptado de ANOVA
Posteriormente, se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla 16 con
la finalidad de distinguir qué grupos son iguales y diferentes, en dicha tabla se
observa no existe diferencia significativa entre concentraciones de 20, 40 y 60
% de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
y Ampicilina en cuanto a la sensibilidad de S. aureus.
49
Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 a concentraciones de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
FACTOR N PROMEDIO DE TAMAÑO DE
HALOS EVALUADOS GRUPO
100.00 % 3 31.6
A
80.00 % 3 28.8 B
60.00 % 3 26.0 C
Ampicilina 3 24.6 C D
40.00 % 3 24.3 C D
20.00 % 3 23.2 D E
10.00 % 3 21.5 E F
5.00 % 3 20.2 F G
2.50 % 3 18.7 G H
1.25 % 3 17.3 H I
0.63 % 3 15.6 I
0.31 % 3 12.0 J
Etanol 3 0 K
Donde:
- % = Concentración de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo)
- Cada letra indicada en la columna grupo, señala un grupo evaluado, a letras iguales no
hay diferencia significativa entre los grupos.
N = Número de pruebas realizadas de una misma concentración.
Fuente: Elaboración propia adaptado de Minitab 17.
En la Figura 17 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondientes a
los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad bacteriana de
Staphylococcus aureus ATCC 25923, donde a concentraciones de 80 y 100 %
de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), los
halos de inhibición son superiores al obtenido con Ampicilina.
50
Figura 17. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de S. aureus ATCC
25923 a concentraciones de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo).
Fuente: Elaboración propia.
4.7.- Evaluación de la actividad antimicótica de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Cepas de
Cándida albicans ATCC 10231
Para la evaluación de la actividad antimicótica de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) frente a Cándida albicans ATCC 10231, primero se evaluó la
Concentración Mínima Inhibitoria, posteriormente la Concentración Mínima
Antimicótica y finalmente la Sensibilidad usando discos de inhibición y los
resultados se exponen a continuación.
4.7.1.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a cepas de
Cándida albicans ATCC 10231.
La concentración Inhibitoria Mínima se determinó por el método de
microdilución en caldo peptonado, evaluando concentraciones finales de 0.195,
0.390, 0.781, 1.562, 3.125, 6.25, 12.5 y 25 µL/mL de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
51
Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) de 500 mg/mL) con 900 µL de
caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se adicionaron
500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una concentración
final de 25 mg/mL (2.5 %) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
(Algarrobo).
Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC
/mL lográndose una concentración final de 12.50 mg/mL (1.25 %) de
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 3: A los 500 µL retirados del tubo 2 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 4, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 6.25 mg/mL (0.63 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 4: A los 500 µL retirados del tubo 3 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 5, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 3.12 mg/mL (0.31 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 5: A los 500 µL retirados del tubo 4 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 6, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 1.56 mg/mL (0.16 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 6: A los 500 µL retirados del tubo 5 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
al tubo 7, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.78 mg/mL (0.08 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 7: A los 500 µL retirados del tubo 6 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución
52
al tubo 8, se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.39 mg/mL (0.04 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Tubo 8: A los 500 µL retirados del tubo 7 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta
solución se adicionaron 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0.19 mg/mL (0.02 %) de extracto
etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de
caldo peptonado con 500 µL de inóculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro
lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500
µL de solución madre (500 mg/mL) de extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida (Algarrobo).
Finalmente, todos los tubos fueron incubados por 48 horas a 37 °C.
El ensayo fue realizado por triplicado y los resultados se pueden reflejar en
la Figura 18.
Figura 18. Método de microdilución en tubos para la determinación de CMI de
P. Pallida forma armata (Algarrobo) frente a cepas de C. albicans ATCC
10231.
Fuente: Elaboración propia.
53
En la Tabla 17 se observan los resultados obtenidos luego de las 48 horas de
incubación, visualizándose que no existe turbidez en los tubos 1, 2, 3, 4,5, 6, y
7 en cambio en el tubo 8 si existe crecimiento los cual se interpreta que la
Concentración Mínima Inhibitoria del extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) es de 6.25 mg/mL dicha concentración es
capaz de inhibir el crecimiento de Cepas de Cándida albicans ATCC 10231 es
de 0.39 mg/mL por el método de micro dilución en caldo.
Tabla 17. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
frente a Cándida albicans ATCC 10231.
DESCRIPCIÓN
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
(+)
T10
(-)
Concentración final (μL/ml) de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)
25.0 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.00 500
Concentración porcentual (%)de extracto etanólico de hojas de P. Pallida forma armata (Algarrobo)
2.50 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.00 50
C. albicans ATCC 10231 ensayo 1 - - - - - - - + + -
C. albicans ATCC 10231 ensayo 2 - - - - - - - + + -
C. albicans ATCC 10231 ensayo 3 - - - - - - - + + -
Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia.
4.7.2.- Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Cepas de
Cándida albicans ATCC 10231.
La determinación de Concentración Mínima Antimicótica fue realizada por el
método de siembra en placa con agar Sabouraud, realizado con las
concentraciones de los tubos de ensayos del 5, 6,7,8 y el tubo 9 como control
positivo con el fin evaluar el crecimiento micótico, como se observa en la Figura
19.
54
Figura 19. Siembra en placa (CBM) de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a
Cándida albicans ATCC 10231
Fuente: Elaboración propia
En la Tabla 18 se presentan los resultados, los cuales mostraron crecimiento
de Cándida albicans ATCC 10231 positivo en el Tubo 8, observándose
crecimiento del microorganismo por lo que la Concentración Mínima
Antimicótica es de 0.39 mg/mL equivalente al 0.04% de extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Tabla 18. Resultados de la determinación de la Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) frente a Cándida albicans ATCC 10231.
DESCRIPCIÓN PLACAS
T5 T6 T7 T8 T9 (+)
Concentración final (mg/ml) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
1.56 0.78 0.39 0.19 0
Concentración porcentual (%) de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
0.16 0.08 0.04 0.02 0
Cándida albicans ATCC 10231 ENSAYO 1 - - - + +
Cándida albicans ATCC 10231 ENSAYO 2 - - - + +
Cándida albicans ATCC 10231 ENSAYO 3 - - - + +
Donde: + = crecimiento bacteriano positivo; - = crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia.
4.7.3.- Determinación de la sensibilidad antimicótica de extracto etanólico
de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) comparada con
Clotrimazol 1% frente a Cándida albicans ATCC 10231.
La sensibilidad bacteriana evaluada a concentraciones de 0.31, 0.63, 1.25,
2.50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de extracto etanólico de hojas de Prosopis
pallida forma armata (Algarrobo) por el método de dilución en discos en placas
con agar Sabouraud, presentó halos de inhibición definidos como se observa a
continuación.
55
Figura 20. Sensibilidad fúngica de Cándida albicans ATCC 10231 frente al extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) Fuente: Elaboración propia
En la Tabla 19 se observan los resultados de los halos de inhibición de las
concentraciones estudiadas de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
forma armata (Algarrobo) frente a Cándida albicans.
Tabla 19. Resultados de determinación de la sensibilidad de Cándida albicans ATCC
10231 a concentraciones de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo).
Concentración extracto etanólico de hojas de P. pallida forma armata
(Algarrobo) Halos de inhibición (mm) Evaluación
(%) E1 E2 E3 Promedio
100.00 % 24.0 22.6 20.9 22.5 S
80.00 % 20.2 17.8 17.4 18.4 I
60.00 % 16.0 16.0 16.0 16.0 I
40.00 % 15.7 15.6 14.9 15.4 I
20.00 % 14.7 14.6 14.6 14.6 R
10.00 % 14.3 13.6 13.5 13.8 R
5.00 % 13.2 13.0 11.9 12.7 R
2.50% 11.8 11.7 11.4 11.6 R
1.25% 11.0 9.7 8.9 9.8 R
0.63% 8.8 8.6 7.5 8.3 R
0.31% 7.0 6.7 6.5 6.7 NE
Clotrimazol 44.0 36.0 41.0 40.3 AS
Etanol 0 0 0 0 NE
Donde: NE = No hay efecto, AS = Altamente sensible, S = Sensible, I = Intermedio,
R = Resistente.
Fuente: Elaboración propia
56
En la Tabla 19 se observa que de las concentraciones del extracto etanólico de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) estudiadas, donde Cándida albicans
ATCC 10231 es Resistente a concentraciones de 0.31, 0.63, 1.25, 2.50 5.00,
10.00, 20.00 %, Intermedio a concentraciones, 40.00, 60.00 y 80.00 % y
Sensible a concentraciones de 100.00 %; por otro lado, es Altamente sensible
al Clotrimazol.
Para la comparación estadística se procedió a realizar un análisis de varianza
ANOVA, obteniendo como resultado que el valor crítico para Fc es menor al
valor de F (Fc:2.15 < F: 250.23), por lo cual, se concluye que al menos un
grupo es diferente al 95 % de confianza (Tabla 20).
Tabla 20. Análisis de varianza de la determinación de prueba de sensibilidad de
Cándida albicans ATCC 10231 a concentraciones del extracto etanólico de hojas de
Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
GL Promedio
de los cuadrados
F Probabilidad Valor crítico
para Fc
Entre grupos 3276.99 12 273.08 250.23 7.77 x10-21 2.15
Dentro de los
grupos 47.26 26 1.818
Total 3324.26 38
Donde:
Fc: 2.15 < F:250.23; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)
GL = Grado de libertad
Fc = Factor de Corrección
F = Estimación de la varianza
Fuente: Elaboración propia adaptado de ANOVA
Posteriormente, se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla 21 con
la finalidad de distinguir que grupos son iguales y diferentes, notamos que
ninguna concentración estudiada se iguala al efecto del clotrimazol.
57
Tabla 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Cándida albicans
ATCC 10231 a concentraciones extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida
(Algarrobo).
FACTOR N PROMEDIO DE TAMAÑO DE
HALOS EVALUADOS GRUPO
Clotrimazol 3 40.3 A
100.00 % 3 22.5 B
80.00 % 3 18.4 C
60.00 % 3 16.0 D
40.00 % 3 15.4 D
20.00 % 3 14.6 D E
10.00 % 3 13.8 D E F
5.00 % 3 12.7 E F
2.50% 3 11.6 F G
1.25% 3 9.8 G H
0.63% 3 8.3 H I
0.31% 3 6.7 I
Etanol 3 0 J
Donde: - % = Concentración de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo)
- Cada letra indicada en la columna grupo, señala un grupo evaluado, a letras iguales no
hay diferencia significativa entre los grupos.
N = Número de pruebas realizadas de una misma concentración.
Fuente: Elaboración propia adaptado de Minitab 17.
En la Figura 21 se observa el gráfico de cajas y bigotes, donde se evidencia la
sensibilidad de Cándida albicans ATCC 10231 frente a las concentraciones del
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo),
sensibilidad que aumenta a medida que se incrementa la concentración.
58
Figura 21. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Cándida albicans ATCC
10231 a concentraciones de extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma
armata (Algarrobo).
Fuente: Elaboración propia.
59
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
La presente investigación tuvo por objetivo estudiar el efecto antimicrobiano del
extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y
Cándida albicans ATCC 10231, planta identificada por el biólogo Leoncio
Mariño Herrera de la Universidad Nacional de San Agustín.
Los estudios con extractos de productos naturales van teniendo más
importancia a través de los años debido a los beneficios y propiedades que
presentan para mejorar el estado de salud de la población, como se demostró
en los trabajos de Zandoval E, Zuñiga E. (5); Vásquez L. (6); Cárdenas C, Ruiz
J, Castro A, Ramos N, Rojas J, Ramos D. (7); Cardenas C. (9) y Alvarado S.
(34), encontrándose que las hojas y frutos de Prosopis pallida posee efectos
antibacteriano y antifungicida.
Cárdenas et al. (7), en su estudio fitoquímico de extracto de las hojas
reportaron presencia de fenoles, taninos y flavonoides, asimismo Vásquez L.
(7) indicó también la presencia de alcaloides, esteroides, aminoácidos no
proteicos, fenoles, flavonoides, quinonas, cumarinas, taninos y terpenoides,
estudios que se comparan con la presente investigación, donde también se
evidenció la presencia de Taninos y Flavonoides, significando que la actividad
antimicrobiana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida
(Algarrobo) puede atribuirse a la presencia de polifenoles, flavonoides y taninos
que se pudieron observar en los análisis fitoquímicos preliminares. Donde los
flavonoides son pigmentos vegetales que poseen un esqueleto carbonado, este
presenta efecto antimicrobiano ya que puede formar complejos con las
proteínas solubles, extracelulares y el complejo con la pared microbiana, los
taninos tienen una acción de defensa y evitan un medio apropiado para los
microorganismos para que no se desarrollen y la especie vegetal pueda
reproducirse adecuadamente, Los taninos son compuestos fenólicos y su
acción es antimicrobiana la cual se debe a su capacidad para desnaturalizar
60
proteínas, inactivar adhesinas microbianas, enzimas y formar complejos con la
pared celular (9).
De acuerdo a los resultados obtenidos por Cárdenas et al. (7), estos midieron
la actividad antibacteriana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis
pallida mediante el método de difusión en agar, evidenciando un halo de
inhibición de 18,1 ± 1,2 mm frente a la cepa de Staphylococcus aureus ATCC
25923. En la presente investigación, usando el método de extracción por
Soxhlet, se obtuvo como CMI y CMB de 0.39 mg/mL del extracto seco frente a
cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 con halos de inhibición de
12.03mm hasta 31.63mm, en comparación, el presente estudio mostró mayor
efecto que lo obtenidos por Cárdenas et al. La diferencia entre estos resultados
puede deberse a ciertos factores, por ejemplo, a la posible diversidad entre las
especies de las plantas, a la ubicación geográfica, a los disolventes utilizados y
a la presencia de los compuestos activos en cada una de las especies.
Vásquez L. (6), evaluó el efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico de
Prosopis pallida (algarrobo) sobre Cándida albicans ATCC 90028 dando como
resultado una mayor inhibición a la concentración de 22.5 mg/mL y 25 mg/mL
obteniéndose halos promedio de inhibición de 12.9mm y 11.5mm
respectivamente. En la presente investigación se obtuvo una Concentración
Mínima Antimicótica (CMA) frente a Cándida albicans ATCC 10231 de 0.39
mg/mL logrando halos de inhibición de 8.30 a 22.50 mm, lo cual indica que los
resultados obtenidos son superiores a los obtenidos por Vásquez los cual
podría deberse a la procedencia y condiciones ambientales en las que creció la
especie vegetal.
Por otro lado, Zandoval E. y Zúñiga E. (5), determinaron el efecto
antibacteriano de las hojas de Prosopis pallida (Algarrobo) mediante el método
modificado de pozos en agar; empleando cepas de Staphylococcus aureus
ATCC 13071 y Escherichia coli ATCC 25992, con concentraciones de
alcaloides totales de 2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml disueltos en
dimetilsulfóxido (DMSO) y cloranfenicol como control. Los halos de inhibición
en promedio para E. coli fueron de 12 mm de diámetro a una concentración de
61
2.5 mg/ml, 14.13 mm de diámetro a 5 mg/ml y 15.38 mm de diámetro para la
concentración de 10 mg/ml. En la presente investigación se obtuvo una
Concentración Mínima Bactericida (CMB) y una Concentracion Minima
Inhibitoria (CMI) frente a Escherichia coli ATCC 25922 de 6.25 mg/mL con
halos de inhibición de 12.57mm a 36.37mm, halos superiores a los encontrados
por Zandoval E. Zuñiga E., diferencia que podría estar marcada por el método
de extracción de principios activos, donde Zandoval E. Zuñiga E, realizaron la
extracción de alcaloides totales mediante la maceración en etanol de hojas de
Prosopis pallida (Algarrobo) y el presente trabajo de investigación se realizó
mediante la extracción etanólica de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo)
mediante equipo Soxhlet.
Cárdenas C. (9), nos indica en su investigación que el método de difusión en
agar es ampliamente utilizado para evaluar la actividad de extractos
antimicrobianos, este método es cualitativo y está diseñado específicamente
para bacterias de crecimiento rápido, lo que tener un amplio panorama para
determinar el comportamiento de los extractos frente a los diferentes
microorganismos estudiados. El método de microdilución en placa permitió
determinar los valores de CMI, este método tiene los estándares más
reconocidos proporcionados por el CLSI (Clinical Laboratoty Standars Institute)
y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST),
estas directrices proporcionan un procedimiento uniforme para la prueba para
llevar a cabo en la mayoría de los laboratorios de microbiología clínica. Por lo
tanto, la reproducibilidad, la economía de los reactivos y el espacio que se
produce debido a la miniaturización de la prueba son las principales ventajas
de este método de microdilución. No obstante, es conocido que el tamaño del
inóculo, el tipo de medio de crecimiento, el tiempo de incubación y el método
de preparación del inóculo puede influir en los valores de CMI, situación que
respalda nuestros estudios realizados, como determinación de Concentración
Mínima Inhibitoria realizada sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans ATCC 10231.
Asimismo, Lerida A (55), nos señala que el medio ambiente donde crecen las
plantas, el clima ejerce gran influencia en lo que respecta a los principios
62
activos. La luz, temperatura y precipitaciones principalmente tienen un efecto
marcado sobre su presencia en las plantas; también la velocidad del viento,
aspecto poco estudiado experimentalmente, es determinante en muchos casos,
se conoce que por su acción se aumenta la evaporación de aceite esenciales,
el clima ejerce gran influencia en lo que respecta a los principios activos. La luz
es probablemente el factor de mayor significación, estimula el crecimiento de
los tejidos jóvenes, etapa en la cual se sustenta la teoría ocurre la acumulación
de los principios activos. La temperatura también juega un papel importante en
la producción de metabolitos secundarios, influye grandemente en el desarrollo
acelerado y en la estabilidad entre el desarrollo de fotosíntesis y respiratorio,
por consiguiente en la producción de los principios activos, factores
agroclimáticos que podrían marcar las diferencias que existe entre los halos de
inhibición registrados, entre los de la presente investigación y los estudios
realizados por Zandoval E., Zuñiga E. (5); Vásquez L. (6); Cárdenas C., Ruiz J.,
Castro A., Ramos N., Rojas J., Ramos D. (7); Cardenas C. (9) y Alvarado S.
(34).
63
CONCLUSIONES
1. Se identificaron taninos condensados con cloruro férrico al 5 % y
flavonoides mediante la prueba de Shinoda en el extracto etanólico de hojas
de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo).
2. El extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
presenta efecto antibacteriano frente a Escherichia coli ATCC 25922 con
una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) de 6.25 mg/mL.
3. El extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
presenta efecto antibacteriano frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923
con una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Bactericida (CMB) de 0.39 mg/mL.
4. El extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
presenta efecto antimicótico frente a Cándida albicans ATCC 10231 con
una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima
Antimicótica (CMA) de 0.39 mg/mL.
5. Escherichia coli ATCC 25922 presenta sensibilidad extracto etanólico de
hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) siendo resistente a
concentraciones de 0.31 y 0.63 %, Intermedio a concentraciones de 1.25,
2.50 y 5.00 %, Sensible a concentraciones de 10.00, 20.00, 40.00 y 60.00 %
y Altamente sensible a concentraciones de 80.00 y 100.00 %, por otro lado,
la sensibilidad de ciprofloxacino es superior a las concentraciones
estudiadas. Staphylococcus aureus ATCC 25923 presenta sensibilidad al
extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo)
siendo Resistente a concentraciones de 0.31 %, Intermedio a
concentraciones de 0.63, 1.25 y 2.50 %, Sensible a concentraciones de
5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 60.00 y 80.00 % y Altamente sensible a
concentraciones de 100.00 %. por otro lado, los extractos 80 y 100 %
presentan efecto superior a la ampicilina. Cándida albicans ATCC 10231
presenta sensibilidad al extracto de Prosopis pallida forma armata
(Algarrobo) siendo Resistente a concentraciones de 0.31 de 0.63, 1.25, 2.50
64
5.00, 10.00, 20.00 %, Intermedio a concentraciones, 40.00, 60.00 y 80.00 %
y Sensible a concentraciones de 100.00 % por otro lado, la sensibilidad de
clotrimazol es superior a las concentraciones estudiadas.
65
RECOMENDACIONES
1. Fomentar el estudio y la investigación de las plantas medicinales de nuestra
región, elaborando un registro de las acciones terapéuticas que sirvan de
guía para el estudiante.
2. Realizar estudios de aislamiento de cada metabolito presente en el extracto
etanólico de hojas Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), ello con la
finalidad de señalar que metabolito es responsable específico de la acción
antimicrobiana y antimicótica.
3. Realizar diversos tipos de método de extracción de principios activos con
hojas de Prosopis pallida (Algarrobo), a fin de evaluar el solvente y método
adecuado que permita evaluar la mayor presencia de principios activos
contenidos en las hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).
4. Continuar con la línea de investigación para poder crear un nuevo
antibiótico y/o compuesto plantilla para el diseño de nuevos medicamentos
y antimicóticos.
5. Realizar estudios de toxicidad que pueda presentar el extracto etanólico de
Prosopis pallida (Algarrobo), ello con el propósito de realizar ensayos
clínicos que permitan usar en pacientes.
66
BIBLIOGRAFÍA
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Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima: 2006.
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Anexo 2. Recolección hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo) en el Sector Belaunde del distrito de Quequeña – Arequipa.
Anexo 3. Trituración de Hojas de Prosopis pallida forma armata (Algarrobo), con posterior colocación en papel filtro.
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Anexo 4. A. Cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923, B. Cepa de Escherichia coli ATCC 25922, C. Cepa de Cándida albicans ATCC 10231
Anexo 5. Obtención de Extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida (Algarrobo).