universidad nacional autonoma de mexico estudio del mecanismo de regulación transcripcional por la...
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UNIVERSIDAD NACIONAL UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICOAUTONOMA DE MEXICO
Estudio del mecanismo de regulación transcripcional por la proteína RhlR de Pseudomonas aeruginosa.
Presentado por:Gerardo Enrique Medina Basulto
Tutor:Dra. Gloria Soberón Chávez
Instituto de BiotecnologíaInstituto de Biotecnología
Doctorado en Ciencias BioquímicasDoctorado en Ciencias Bioquímicas
INTRODUCCIONINTRODUCCION
Bacteria Gram negativaBacteria Gram negativa
Patógeno oportunista Patógeno oportunista Fibrosis quísticaFibrosis quísticaQuemadurasQuemadurasInmunodeficienciaInmunodeficiencia
Producción de factores de virulenciaProducción de factores de virulenciaRamnolípidosRamnolípidosProteasasProteasasToxinasToxinasPigmentosPigmentos
Ubicua en la naturalezaUbicua en la naturaleza
Genoma de Genoma de 6.3 6.3 Mpb Mpb
Gran versatilidad metabólicaGran versatilidad metabólica
67% de G+C en su genoma67% de G+C en su genoma
Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa
Organismo Feno ti po Autoi nduc torsintetasa
Regul adortransc ripcio nal
Autoi nducto r
Agrobacteriumtume faciens
Con jugación TraI TraR OOHL
Chromobacteriumviolaceum
Antibióticos, exoenzimas,violaceina
CviI CviR HHL
Erwinia carotov ora Antibioticos, exoenzimas CarI CarR OHHL
Erwinia stewartii Exopolisacárido EsaI EsaR OHHL
Escherichia coli División celular ? SdiA ?
Vibrio(Photobacterium)fischeri
Bioluminiscencia LuxI LuxR OHHL, HHL
Pseudomonasaeruginosa
Proteasa alcalina,elastasa, exotoxina A,exoenzima S,neuraminidasa,hemolisina.Quitinasa, elastasa,piocianina,ramnolípidos,RpoS
LasI
RhlI
LasR
RhlR
OdDH L
BHL
Serratia lique faciens Motilidad, fosfolipasa SwrL ? BHL
Algunos sistemas detectores de quórum en bacterias Algunos sistemas detectores de quórum en bacterias gram-negativasgram-negativas
Regulación de la transcripción
Multime-rización
Unión aAHL
LuxR
LuxR
AHL
transcripción
Promotor blanco
ARNpolimerasa
ADN
Caja lux
5´ 3´
N-terminal C-terminal
gen
Dominios de la proteína LuxR y modelo de activación de laDominios de la proteína LuxR y modelo de activación de lattranscripción por dicha proteínaranscripción por dicha proteína
HTH activación
luxI C D A B E G luxR
Caja lux
LuxR
LuxR
LuxI OHHL
+
Regulación de la bioluminiscencia en Regulación de la bioluminiscencia en Vibrio fischeriVibrio fischeri
Modelo de la biosíntesis de HHL catalizado por LuxI enModelo de la biosíntesis de HHL catalizado por LuxI enV. fischeriV. fischeri
TDP-L-ramnosa
TDP
(CH2)6
CH3
HO CH CH2 CO S ACP
Biosíntesis de ramnolípidos mostrando las reaccionesBiosíntesis de ramnolípidos mostrando las reaccionescatalizadas por RhlAB y RhlC en catalizadas por RhlAB y RhlC en P. aeruginosaP. aeruginosa..
OPO
O
PO
OH
CH3
OOH
CH3
OHOH
O
O
O O
P
OH
O
Timidina
dTDP-L-ramnosa hidroxidecanoil-ACP
+
Lipopolisacáridos
RhlABRhlABTDP
L-ramnosil--hidroxidecanoil-- hidroxidecanoato
(CH2)6
CH3
(CH2)6
CH3
O
O CH CH2 C OOH O CH CH2 COOHO
CH3
OHOH
L-ramnosil-L-ramnosil--hidroxidecanoil-- hidroxidecanoato
RhlCRhlC
(CH2)6
CH3
(CH2)6
CH3
O
O CH CH2 C O CH CH2 COOHOOH O
CH3
OOH
OH O
CH3
OHOH
BHL
RhlRautoinductorsintetasaRhlR
+ ? +
rhlA rhlB rhlR rhlI+
rhlC
-RhlR
autoinductorsintetasaRhlRRhlR
+ ? +
rhlA rhlB rhlR rhlI+
rhlC
Ramnolípidos
-
Modelo regulatorio de la producción de ramnolípidosModelo regulatorio de la producción de ramnolípidosen en P. aeruginosaP. aeruginosa
LasR
OdDHL+
OBJETIVOSOBJETIVOS
Objetivo generalObjetivo general
-Estudiar la regulación transcripcional de los genes rhlA y rhlR de Pseudomonas aeruginosa así como la interacción de la proteína RhlR con la región promotora de rhlA.
Objetivos específicosObjetivos específicos
-Determinar cuales son los factores involucrados en la expresión del gen rhlA y las condiciones necesarias para su expresión.
-Establecer el o los sitios de unión de la proteína RhlR a la región promotora del gen rhlA y las condiciones en que se presenta dicha interacción.
-Determinar cuales son los factores involucrados en la expresión del gen rhlR, sus inicios transcripcionales y las condiciones necesarias para su expresión.
RESULTADOSRESULTADOS
Silenciamiento en fase exponencial del promotor Silenciamiento en fase exponencial del promotor rhlAB.rhlAB.
Las lineas 1, 2 y 3 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas de crecimiento respectivamente. Las lineas 4, 5 y 6 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas en cultivos con 10M de C4-HSL y 0.1mM de IPTG.
Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimientoInmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimientoen la cepa PAO1/pECP61.5 en medio PPGAS.en la cepa PAO1/pECP61.5 en medio PPGAS.
1 2 3 4 5 6 MR
40
30
20
Expresión de Expresión de rhlA::lacZrhlA::lacZ en la cepa PAO1/pECP61.5 a lo largo en la cepa PAO1/pECP61.5 a lo largo de la curva de crecimiento en medio PPGAS.de la curva de crecimiento en medio PPGAS.
Tiempo (horas)
D.
O.
600n
m
Un
idad
es m
ille
r
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
2 4 6 8
0,01
0,1
1
10
PPGAS D. O. 600nmAIPTG D. O. 600nmPPGASAIPTG
Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimiento en Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimiento en la cepa DH5la cepa DH5/pECP61.5./pECP61.5.
Las lineas 1, 2 y 3 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas de crecimiento respectivamente. Las lineas 4, 5 y 6 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas en cultivos con 10M de C4-HSL y 0.1mM de IPTG.
1 2 3 4 5 6
MR40
3020
Expresión de Expresión de rhlA::lacZrhlA::lacZ en la cepa DH5 en la cepa DH5/pECP61.5 a lo largo /pECP61.5 a lo largo de la curva de crecimiento.de la curva de crecimiento.
Tiempo (horas)
D.
O.
600n
m
Un
idad
es m
ille
r
0
50
100
150
200
250
300
2 4 6 8
0,1
1
10
LB D. O. 600nmAIPTG D. O. 600nmLBAIPTG
0,1
1
10
Tiempo (horas)
Un
idad
es
mille
r
O.
D.
600n
m
0
100
200
300
400
500
600
700
2 4 6 8
MC4100 600nmMC4100 AIPTG 600nmJV1065 600nmJV1065 AIPTG 600nmMC4100MC4100 AIPTGJV1065JV1065 AIPTG
A
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
2 4 6 8
Tiempo (horas)
Un
idad
es m
ille
r
D.
O.
600n
m
0,01
0,1
1
10PAO1 600nmPAO1 AIPTG 600nmPAS1 600nmPAS1 AIPTG 600nmPAO1PAO1 AIPTGPAS1PAS1 AIPTG
B
Efecto de una mutación en el gen Efecto de una mutación en el gen rpoSrpoS en la expresión de en la expresión de rhlArhlA en enE. coliE. coli (A) y en (A) y en P. aeruginosaP. aeruginosa (B). (B).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
2 4 6 8
0,1
1
10
Tiempo (horas)
Un
idad
es
mille
r
D.
O.
600n
mpGM LB 600nmpGM AIPTG 600nmpMT LB 600nmpMT AIPTG 600nmpGM LBpGM AIPTGpMT LBpMT AIPTG
Cinética de la expresión deCinética de la expresión de rhlA rhlA en presencia de RhlR o en presencia de RhlR oLasR en LasR en E. coliE. coli..
Mecanismo de regulación transcripcional delMecanismo de regulación transcripcional delpromotor promotor rhlABrhlAB por RhlR. por RhlR.
- + - + - +
I II III
G A T C - + - + - +
0
100
200
300
400
500
600
Un
idad
es m
ille
r I II III
Mapeo del sitio de inicio transcripcional de Mapeo del sitio de inicio transcripcional de rhlArhlA y nivel y nivel de expresión en diferentes cepas de de expresión en diferentes cepas de E. coliE. coli..
I. DH5/pECP61.5II. ET8000/pECP61.5III. GMN01/pECP61.5
- Ausencia de BHL+ Presencia de BHL
1 2 3 4 5 6 7 8
CF
1 2 3 4 5
CF
prhlA frio
C4-HSL C12-HSL
Retardamiento en gel de un fragmento conteniendoRetardamiento en gel de un fragmento conteniendoel promotor de el promotor de rhlA.rhlA.
1 2 3 4 5 6
CF
RhlRA
B
C
Carriles 1A, 1B, 1C.- Fragmento sin RhlRCarril 2C.- Fragmento + RhlR -AI
GGCGGCCGCCCGTCCTGTGAAATCTGGCAGTTACCG
-35
las
box
*
*
*
*
-20
-30
-40
-50
-60
-70
*
*
Protección Protección in vivoin vivo de la región promotora de de la región promotora derhlArhlA por RhlR por RhlR
1. DH5/pMPCG-pUCP20 +AI2. DH5/pMPCG-pGMYC +AI3. DH5/pMPCG-pUCP20 +IPTG4. DH5/pMPCG-pGMYC +IPTG
G A T C 1 2 3 4
*-80
-90
Expresión de Expresión de rhlArhlA en la cepa DH5 en la cepa DH5/pECP61.5 en/pECP61.5 en presencia de diferentes concentraciones de IPTG. presencia de diferentes concentraciones de IPTG.
0
50
100
150
200
250
LB AI 10M AIPTG 0.1 AIPTG 0.5
Un
idad
es m
iller
30
MR AI 10M AIPTG 0.1 AIPTG 0.5
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
1 32
Un
idad
es m
ille
r
1.- PAO1/pECP61.5 PPGAS2.- PAO1/pECP61.5 + C4HSL3.- PAO1/pECP61.5 + C4HSL + 1mM IPTG
MR
1 2 3
30
Expresión de Expresión de rhlArhlA y concentración de RhlR y concentración de RhlRen en Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa..
Expresión de una fusión Expresión de una fusión rhlA::lacZrhlA::lacZ en la cepa en la cepa DH5DH5de de E. coliE. coli..
Plásmido NA AI IPTG AI + IPTG
pMPCG 2.3 0.7 (1.4) 4.1 0.3 (2.6) 1.9 0.4 (1.2) 1.9 0.4 (1.2)pMPCG/pGMYC 1.5 0.2 (0.9) 157 14 (100) 1.2 0.2 (0.7) 130 12 (83)pMPCG/pMT1 0.6 0.2 (0.3) 12.3 1.3 (7.8) 0.6 0.3 (0.3) 12.1 0.4 (7.6)
Actividad -galactosidasa (%)*
RNPRhlR-10-35las box
-10-35las box
-10-35las box
BHL
RNPRhlR
RNPRhlR
A
BI
BII
Modelos propuestos de la interacción de RhlR con elModelos propuestos de la interacción de RhlR con el promotor de promotor de rhlArhlA y con la ARN polimerasa ya sea en y con la ARN polimerasa ya sea en
presencia o ausencia de autoinductorpresencia o ausencia de autoinductor
Regulación transcripcional del gen Regulación transcripcional del gen rhlRrhlR..
0
5
10
15
20
25
30
35
Absorbancia a 600nm
PAO1/1002 LB
PAO1/1002 PPG
PAOR1/1002 LB
PAOR1/1002 PPG
0.5 1 1.5
Un
idad
es m
ille
r (1
x103 )
Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una cepa de en una cepa de P.P.aeruginosa aeruginosa mutante en el gen mutante en el gen lasR.lasR.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0.5 1 1.5
Un
idad
es m
ille
r (1
x103 )
Absorbancia a 600nm
PG201 LBPG201 PPGAS65E12 LB65E12 PPGAS
Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una cepa de en una cepa de P.P.aeruginosa aeruginosa mutante en el gen mutante en el gen rhlRrhlR
0
5
10
15
20
25
30
0.5 1 1.5
Absorbancia a 600nm
Un
idad
es m
i lle r
(1 x
1 03 )
PAK LB
PAK PPGAS
PAKN1 LB
PAKN1 PPGAS
Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una cepa de en una cepa de P.P. aeruginosaaeruginosa mutante en el gen mutante en el gen rpoNrpoN..
Inicios transcripcionales de Inicios transcripcionales de rhlRrhlR en en P. AeruginosaP. Aeruginosaen medio PPGAS crecida a 1.5 de Abs. 600nm.en medio PPGAS crecida a 1.5 de Abs. 600nm.
A
C T A G 1 2 3 4
P1
P2
P3
1. PAO12. PAOR1 (lasR-)3. PAK4. PAKN1 (rpoN-)
B
C T A G 1 2 3 4 5
P3
P2
P1
1. PG2012. 65E12 (rhlR-)3. PAKN14. PAK5. PAS1 (rpoS-)
Inicio transcripcional mas distal de Inicio transcripcional mas distal de rhlRrhlR en en P. P. AeruginosaAeruginosa crecida en PPGAS a 1.5 Abs. 600nm crecida en PPGAS a 1.5 Abs. 600nm
A
C T A G 1 2
P4
1. PAO12. PAOR1 (lasR-)
B
C T A G 1 2
P4
1. PAO12. PAO9001 (vfr-)
-24
GGCGTTTCAT
rhlB
GTGCCGAGGT GCTGCTGCCC TGCGCCCACG ACCAGTTCGA CAATGCCGAA -348
CGGCTGGTCC GGCTCGGCTG CGGGATGCGC CTGGGCGTGC CATTGCGCGA -298
-35
GCAGGAGTTG CGCGGGCTGG TGGCGCTTGC TCGAGGACCC GGCCATGGCG -248
-10 VFR
GCGGCCTGTC GGAATTGTCA CAACCGCACA GTATCGCTTG -198
CGGTAAAGCG GCCCAGGTGG TCGAACGTTG TCATAGGGAG GGGGATGCGC -148
GATGGCTGAA GGCTGCGTCC TGAACGGTGC TGGCATAACA GATAGGGTTG -98
CCATGATTTT GCCGTATCGG CAAGGCTGCG CGCTTGACAG CGTCATACCC -48
-10 -10
CGGGCCAATT CTGCTGTGAT GCATTTTATC GATCAGGGCT TACTGCAATG +3
AGGAATGACG GAGGCTTTTT GCTGTGGTGG GACGGTTTGC GTAGCGAGAT G +54
P 1P2
P 3
rhlR
las box 1
-35 -35
-12
P4
pRD58-1
las box 3
las box 2
Oligo 2
Oligo 1
Secuencia nucleotídica de la región corriente arribaSecuencia nucleotídica de la región corriente arriba de de rhlRrhlRmostrando los elementos mostrando los elementos reguladores reguladores importantesimportantes..
rhlAB
rhlI
lasB
rhlR1
rhlR2
rhlR3
T C C T G T G A A A T C T G G C A G T T C C C T A C C A G A T C T G G C A G G T
A C C T G C C A G T T C T G G C A G G T
G G C T G C G C G C T - T G A C A G C G
C G G T G C T G G C A - T A A C A G A T
C C C T G C G C C C A CG A C C A G T T
Alineamiento de las probables cajas Alineamiento de las probables cajas laslas encontradas en la encontradas en la región reguladora de región reguladora de rhlRrhlR con otras cajas con otras cajas laslas reportadas. reportadas.
A A N T G T G A N N N N N N T C A C A N T T
A A A T G T G A T C T A G A T C A C A T T T
A A T T G T C A - C A A C C G C A C A G T A
E. coli CRP lasRrhlR
Alineamiento de la probable caja VFR encontrada en la región Alineamiento de la probable caja VFR encontrada en la región reguladora de reguladora de rhlRrhlR con la caja VFR presente en con la caja VFR presente en lasRlasR y con la y con la
secuencia consenso para la unión de CRP de secuencia consenso para la unión de CRP de E. coliE. coli..
0
2
4
6
8
10
12
14
AI+IPTG
Un
idad
es m
ille
r
Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una fusión que carece en una fusión que carecede una de las probables cajas de una de las probables cajas laslas en en E. coliE. coli
DH5/pRD58-1DH5/pRD58-2
Influencia del medio de cultivo en la expresión de Influencia del medio de cultivo en la expresión de rhlRrhlR y y en la producción de ramnolípidos.en la producción de ramnolípidos.
Glucosa 1.5% Glucosa 1.5% 150mM NH4Cl
Glicerol 0.75% Gluconato 1.5%
Expresión de Expresión de rhlRrhlR y producción de y producción de ramnolípidos en fase estacionaria tardía de la ramnolípidos en fase estacionaria tardía de la
cepa PAO1 en medio M9 modificado.cepa PAO1 en medio M9 modificado.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
Un
idad
es
mille
r
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0
g/m
l
Concentración de ramnolípidos
Actividad galactosidasa
Expresión de Expresión de rhlRrhlR y producción de ramnolípidos en y producción de ramnolípidos enfase estacionaria de la cepa PAO1 en medio PPGASfase estacionaria de la cepa PAO1 en medio PPGAS
modificado.modificado.U
nid
ad
es m
ille
r
0
5000
10000
15000
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35000
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250
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350
400
450
500
0
50
Tris HCl +PO4 MOPS - Buffer
Actividad galactosidasa
Concentración de ramnolípidos
g/m
l
Expresión de Expresión de rhlRrhlR y producción de ramnolípidos y producción de ramnolípidos de la cepa PAO1 en medio LB modificadode la cepa PAO1 en medio LB modificado
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
LB LB +MOPS LB LB +MOPS
1.5 A 600nm Fase estacionaria tardía
400
200
100
0
300
g/m
l
Actividad - galactosidasa
Concentración de ramnolipidos
Un
idad
es m
ille
r
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
I. El operón rhlAB se transcribe principalmente en fase estacionaria aún en presencia de RhlR y BHL desde la fase exponencial de crecimiento. Este silenciamiento de la expresión en fase exponencial puede estar relacionado con la respuesta astringente o con la presencia de algún represor. II. La expresión del promotor del gen rhlA es parcialmente dependiente del factor s en tanto no tiene un efecto directo en este proceso como había sido propuesto anteriormente. III. Existe una interacción directa y específica entre el regulador transcripcional RhlR y la región promotora de rhlA, la cual ocurre tanto con la proteína RhlR sola, como acomplejada con BHL. IV. La conformación tomada por RhlR varía dependiendo de si esta acoplado o no al autoinductor, como se manifiesta por las diferencias en la extensión que cubre del promotor de rhlA en estas dos condiciones. V. Cuando RhlR está acomplejado con BHL, funciona como un regulador positivo de rhlA, en tanto cuando no lo está funciona como un regulador negativo.
La región regulatoria de rhlR posee cuatro promotores, tres de los cuales muestran diferencias en su expresión dependiendo de la presencia de reguladores transcripcionales tales como LasR, Vfr, y RpoN que actuan como reguladores positivos, en tanto rhlR posee una autorregulación negativa por RhlR.
La región promotora de rhlR presenta tres probables cajas las y una probable caja Vfr.
La expresión de rhlR no solo depende de una alta densidad celular, sino de la composición del medio. Esta dependencia correlaciona con la existencia de una compleja estructura de su región promotora.
La regulación de la expresión de rhlR muestra que es un punto importante en la respuesta del sistema detector de quórum a factores ambientales así como para la producción de ramnolípidos, sin embargo la presencia de RhlR no es suficiente para producirlos.
VI.
VII.
VIII.
IX.
GacS
GacA
GacA-P
PO4
CitoplasmaVfr
lasR lasI
N-3-odDHL
LasRrhlRrhlI
RhlR
LasI
RhlI
N-BHL
lasB
lasA
apr
xcprhlAB
rpoS
HCNLectinas
s
?
(-)
QscR + AI(?)
Biopelículas
rhlC PA1131
qscR
(-)
2(phzABCDEFG)?
RsaL
PQS
ppGpp
( - )
Modelo de regulación de algunos factores de virulenciaModelo de regulación de algunos factores de virulenciaen en P. aeruginosaP. aeruginosa, mostrando los dos sistemas detectores, mostrando los dos sistemas detectores
de quórum y otros reguladores importantes.de quórum y otros reguladores importantes.
PERSPECTIVASPERSPECTIVAS
1. Determinar cual es el factor responsable del “silenciamiento” en fase exponencial de la expresión de rhlAB. 2. Determinar cuales son las bases importantes de la caja las de rhlAB para la especificidad y afinidad por la proteína RhlR. 3. Demostrar que la caja VFR putativa encontrada en la región promotora de rhlR es en efecto una secuencia de pegado de esta proteína.
4. Determinar cual o cuales de las tres cajas las encontradas en la región promotora de rhlR son funcionales, así como determinar si son sitios de pegado de LasR, de RhlR o de ambos. 5. Medir la concentración de autoinductores en los sobrenadantes de los medios utilizados, para determinar si la síntesis de autoinductores es el factor limitante para la producción de ramnolípidos en algunas condiciones de cultivo.