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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Estudio del perfil de aminoácidos del huevo de gallina (gallus domesticus) y pre-diseño
de una planta de producción de huevo líquido
Trabajo de Titulación, modalidad Proyecto de Investigación para la obtención del
título de Ingeniera Química
AUTORA: Castillo Jácome Jenifer Daniela
TUTOR: Ing. Jorge René Viterí Moya PhD
Quito, 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Jenifer Daniela Castillo Jácome en calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación “Estudio del perfil de aminoácidos del huevo de gallina
(gallus domesticus) y pre-diseño de una planta de producción de huevo líquido”, modalidad
Proyecto de Investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE
LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E
INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita,
intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en
la normativa citada.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la ley orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de
toda responsabilidad.
Firma:
Jenifer Daniel Castillo Jácome
C.C. 0401552856
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Ing. Jorge René Viteri Moya en calidad de tutor del trabajo de titulación, modalidad
Proyecto de investigación, cuyo título es “Estudio del perfil de aminoácidos del huevo de
gallina (gallus domesticus) y pre-diseño de una planta de producción de huevo líquido”,
elaborado por la estudiante Jenifer Daniela Castillo Jácome de la Carrera de Ingeniería
Química, Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, considero
que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el
campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador
que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar
con el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de noviembre de 2019.
Ing. Jorge René Viterí Moya PhD
C.C. 1705618088
iv
DEDICATORIA
A Dios por bendecir mi camino
A mis padres Clara y Bolívar,
por ser mi apoyo y fortaleza en
aquellos momentos de dificultad
y de debilidad, por ser mi
ejemplo a seguir, a través de sus
concejos y sacrificios para
ayudarme a ser mejor persona y
llegar a ser una profesional. A
mis hermanas Yadira y Paola,
por su cariño incondicional y por
ser lo más bonito que la vida me
pudo regalar. A mis familiares y
amigos por su apoyo, amistad y
por las buenas historias
compartidas.
v
AGRADECIMIENTOS
A Dios por bendecirme, guiarme en cada uno de mis pasos y darme la fuerza para superar
cada obstáculo que se me presento durante este caminar.
A mis padres, por ser mi pilar fundamental en cada una de mis decisiones, por ser mi apoyo
y fortaleza en todo momento y nunca dejarme sola cuando más los necesite, por sus consejos
de sabiduría para levantarme en los momentos de debilidad, por su esfuerzo y sacrifico he
llegado a cumplir una meta más en mi vida.
A mis Hermanas Yadira y Paola, por ser mis amigas, confidentes y mis cómplices en cada
una de mis locuras, por su cariño incondicional y sobre todo su apoyo en mis momentos
difíciles, nunca me dejaron sola, gracias hermanas.
A mis cuñados, Klever por sus consejos de amigo, por brindarme su cariño incondicional a
Israel por ser en mi vida como un hermano y siempre estar conmigo en las buenas y malas.
A mis sobrinas Danna y Paula por ser lo más lindo que puedo tener en mi vida, por su amor
sincero, por sacarme una sonrisa día a día
A mi tutor y profesor, Ing. Jorge Viteri que, con su conocimiento, amistad y sus consejos
supo guiarme para culminar mi carrera y mi trabajo de investigación.
A el Ing. Alejandro Delgado y a la Dra. Elvia Victoria Cabrera por su ayuda y análisis de
mejorar este trabajo de titulación.
A mi novio Luis por su apoyo, consejos, compañía, cariño y sobre todo amor incondicional
en todo momento.
A mis amigos de universidad, en especial a Mary, Yesenia, Naty por ser un apoyo y por su
compañía dentro y fuera de las aulas, por sus locuras brindadas que compartimos durante
nuestra carrera universitaria.
vi
CONTENIDO
pág.
LISTA DE TABLAS ............................................................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... xi
LISTA DE ANEXOS .......................................................................................................... xiii
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1
1. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 3
1.1. Generalidades del Huevo de Gallina ............................................................................... 3
1.2. Estructura del Huevo ....................................................................................................... 3
1.3. Composición Química del Huevo ................................................................................... 4
1.5. Proteínas .......................................................................................................................... 6
1.5.1. Estructura de proteínas ................................................................................................. 7
1.5.1.3. Estructura terciaria ..................................................................................................... 9
1.5.1.4. Estructura Cuaternaria ............................................................................................. 10
1.5.2. Tipos de Proteínas presentes en el huevo ................................................................... 11
1.6. Desnaturalización .......................................................................................................... 12
1.6.1. Agentes desnaturalizantes .......................................................................................... 12
1.7. Aminoácidos .................................................................................................................. 13
1.8. Enzima ........................................................................................................................... 14
vii
1.9. Hidrólisis Ácida ............................................................................................................. 15
1.10. Hidrólisis Enzimática .................................................................................................. 16
1.10.1. Proceso de hidrólisis enzimática en las proteínas. .................................................... 17
1.11. Uso y Aplicación del Huevo de gallina ....................................................................... 17
1.11. Antecedentes de plantas productoras de huevo líquido. .............................................. 18
2. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 20
2.2. Proceso Experimental .................................................................................................... 20
2.2.2. Diagrama de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis Enzimática. ...
........................................................................................................................ 22
2.3.1. Método de colorimetría .............................................................................................. 24
2.3.2. Método de Hidrólisis Ácida ........................................................................................ 27
2.3.3. Hidrólisis Enzimática ................................................................................................. 28
2.4. Determinación de presencia de las Proteínas en el huevo de gallina. ........................... 30
2.4.1. Análisis Espectroscopia Infrarrojo por transformada de Fourier: (FTIR) .................. 30
2.4.2. Determinación de proteínas mediante Electroforesis ................................................. 31
2.5. Determinación y cuantificación del perfil de aminoácidos ........................................... 33
2.5.1. Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). ...................................................... 33
2.6. Pre-diseño de una planta para la producción de huevo líquido a partir de proteína
hidrolizada de la yema y clara. ............................................................................................. 33
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS ...................................................................................... 35
3.1. CÁLCULOS .................................................................................................................. 35
viii
3.1.1. Cálculos para determinar la concentración de proteínas mediante el método de
colorimetría. ........................................................................................................................ 35
3.1.2. Cálculo de la Concentración de Proteína a partir de las ecuaciones de la Curva de
Concentración de Proteínas para yema y clara en función de la Absorbancia. .................... 36
3.1.3. Cálculo del Balance de Masa de la Planta de Producción de Huevo Líquido. ........... 38
3.1.4. Cálculo de la Espectrometría Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR). .............
........................................................................................................................ 39
3.2. RESULTADOS ............................................................................................................. 40
3.2.1. Resultado promedio de las propiedades físicas del Huevo de Gallina. ...................... 40
3.2.2. Resultados de Absorbancia de la yema, clara, estándar y blanco obtenido posterior al
ensayo del kit de cuantificación de proteínas. ...................................................................... 41
3.2.3. Resultados de la concentración de proteína en la yema y clara del huevo de gallina ....
............................................................................................................................ 42
3.2.4. Resultados del Perfil de Aminoácidos ........................................................................ 42
3.2.5. Resultado de Balance Masa General y de los Reactores 1-2. ..................................... 44
3.2.6. Espectroscopia Infrarroja por transformada de Fourier del proceso de hidrólisis ácida
y enzimática del Huevo de Gallina ....................................................................................... 45
3.3. Análisis Cualitativo mediante Método Electroforesis ................................................... 48
4.3. Descripción detallada del proceso. ................................................................................ 53
CITAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................................ 68
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................. 70
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades Físico-Químicas del Huevo de Gallina, Fracciones Másicas de su
composición y Valor Nutricional en 100g. (Sayar, s. f.) ........................................................ 4
Tabla 2. Valor nutritivo del huevo (en valor absoluto y densidad), comparado con otras
fuentes proteicas dietéticas ..................................................................................................... 6
Tabla 3. Clasificación de Aminoácidos por la estructura y composición química
(Bioquímica, s. f.) ................................................................................................................. 14
Tabla 4. Clasificación Internacional de Enzimas (Torres & César, 2014) ........................... 15
Tabla 5. Propiedades Tecno-Funcionales de los huevos para la Industria Alimentaria
(Instituto de Estudios del Huevo, 2006) ............................................................................... 17
Tabla 6. Plantas productoras de huevo líquido (ARCSA, 2019) .......................................... 18
Tabla 7. Datos obtenidos de Absorbancia, concentración de proteína de la clara y yema ... 37
Tabla 8. Resultado promedio de las propiedades físicas del huevo de gallina. .................... 40
Tabla 9. Resultados de Absorbancia de la yema, clara, estándar y blanco obtenido posterior
al ensayo del kit de cuantificación de proteínas. .................................................................. 41
Tabla 10. Resultados de concentración de proteína de la yema y clara. .............................. 42
Tabla 11. Resultados de Perfil de Aminóacidos ................................................................... 42
Tabla 12. Balance de Masa General ..................................................................................... 44
Tabla 13. Balance de Masa del Reactor 1 (yema) y Reactor 2 (clara) ................................. 45
Tabla 14. Interpretación de los picos para los espectros de la Figura 19. ............................ 47
Tabla 15. Análisis de los picos en el espectro de la yema de huevo de gallina.................... 48
Tabla 16.Resultado ANOVA para Concentración por Tiempo ............................................ 50
x
Tabla 17. Listado de Equipos ............................................................................................... 55
Tabla 18. Costos de equipos de la planta de producción de huevo líquido .......................... 56
Tabla 19. Costos de la instalación de la planta de producción de huevo líquido ................. 56
Tabla 20. Costo de materia prima (Ovomas, 2019) .............................................................. 57
Tabla 21. Costos variables de producción ............................................................................ 57
Tabla 22. Costos fijos de producción ................................................................................... 58
Tabla 23. Costo de Mantenimiento ...................................................................................... 58
Tabla 24. Venta del producto al año ..................................................................................... 58
Tabla 25. Costos totales de la implementación y producción .............................................. 59
Tabla 26. Datos para el flujo de caja .................................................................................... 59
Tabla 27. Depreciación de Equipos ...................................................................................... 59
Tabla 28. Préstamo para la implementación de la planta de producción de huevo líquido.. 60
Tabla 29. Flujo de Caja, TIR, VAN ..................................................................................... 61
Tabla 30. Datos del Túnel de plástico caja de limpieza lavadora (Alibaba, 2019) .............. 82
Tabla 31.Datos comercial de huevo blanco y separador de yema de huevo /máquina de
separación de huevo/interruptor (Alibaba, 2019) ................................................................. 83
Tabla 32. Datos reactor químico (Alibaba, 2019) ................................................................ 84
Tabla 33. Centrifuga (Alibaba, 2019) ................................................................................... 85
Tabla 34. Homogeneizador (Alibaba, 2019) ........................................................................ 86
Tabla 35. Placa intercambiadora de calor de placas (Alibaba, 2019) ................................... 87
Tabla 36. Máquina de pasteurización (Alibaba, 2019) ......................................................... 88
Tabla 37. Tanque de almacenamiento (Alibaba, 2019) ........................................................ 89
Tabla 38. Sistema CIP para alimentos .................................................................................. 90
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aporte nutricional por huevo .................................................................................. 6
Figura 2. Estructura Primaria de las proteínas ........................................................................ 7
Figura 3. Hélice α y hoja β de la estructura secundaria de las proteínas ................................ 9
Figura 4. Estructura terciaria de las proteínas («Estructura proteica», s. f.) ....................... 10
Figura 5. Estructura cuaternaria de las proteínas (Zarkadas et al., 1992)............................. 10
Figura 6. Desnaturalización de una proteína. ....................................................................... 13
Figura 7. Estructura general de los aminoácidos (Bruño, 2016). ......................................... 13
Figura 10. Diagrama de Flujo de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis
Ácida (Autor) ........................................................................................................................ 21
Figura 11. Diagrama de Flujo de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis
Enzimática (Autor) ............................................................................................................... 22
Figura 12. Esquema Experimental de Ensayos para Obtener el Perfil de Aminoácidos ...... 24
Figura 13. Diagrama de proceso del método de Colorimetría .............................................. 26
Figura 14. Cámara de electroforesis horizontal .................................................................... 31
Figura 15. Cámara de electroforesis carga de muestra en cada pozo de gel ........................ 32
Figura 16. Tinción con azul de Bromo Fenol en la electroforesis de gel de Agarosa. ......... 32
Figura 17. Diagrama Absorbancia vs Concentración de Proteína de la yema de huevo. ..... 37
Figura 18. Diagrama Absorbancia vs Concentración de Proteína de la clara de huevo. ...... 38
Figura 19 .Diagrama comparativo entre la Hidrólisis Ácida y Enzimática de los
Aminoácidos obtenidos en la yema de huevo. ..................................................................... 43
xii
Figura 20. Diagrama comparativo entre la Hidrólisis Ácida y Enzimática de los
Aminoácidos obtenidos en la clara de huevo. ...................................................................... 44
Figura 21. Espectro FTIR de hidrólisis ácida y enzimática de clara de huevo..................... 46
Figura 22. Espectro FTIR de hidrólisis ácida y enzimática de yema de huevo. ................... 47
Figura 23. Resultados de bandas de aminoácidos mediante proceso de electroforesis (Autor)
.............................................................................................................................................. 49
Figura 24. Determinación de parámetros físicos del huevo ................................................. 74
Figura 25. Muestras separadas.............................................................................................. 74
Figura 26. Análisis de colorimetría con reactivo (Erba) ...................................................... 75
Figura 27. Identificación de proteínas mediante colorimetría .............................................. 75
Figura 28. Adición de HCl 4% a cada muestra. ................................................................... 76
Figura 29.Muestras Hidrolizadas a 110°C ............................................................................ 76
Figura 30. Neutralización con Ca(OH)2 y secado a 37°C .................................................... 77
Figura 31. Muestras obtenidas mediante el proceso de hidrólisis ácida y enzimática. ........ 77
Figura 32. Separación de muestras y desnaturalización de proteínas................................... 78
Figura 33. Calentamiento a baño maría y centrifugado ........................................................ 78
Figura 34. Obtención de muestras mediante el proceso de hidrólisis enzimática ................ 79
Figura 35. Equipo de Electroforesis (Facultad de Ciencias Química, UCE) ....................... 79
xiii
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A. Cuantificación de Proteína Total ...................................................................... 73
ANEXO B. Reporte Fotográfico para la determinación del perfil de aminoácidos ............. 74
ANEXO C. Mediciones de Absorbancias de las muestras por Espectrofotometría UV-Vis 80
ANEXO D. Tablas de Espectroscopia Infrarroja de Ácidos Carboxílicos y Aminas .......... 81
ANEXO E. Especificaciones técnicas de los equipos de la planta de producción de huevo
líquido ................................................................................................................................... 82
ANEXO F. Protocolo para el análisis de proteínas mediante Electroforesis según INS. .... 91
xiv
TITULO: Estudio del perfil de aminoácidos del huevo de gallina (gallus domesticus) y
pre-diseño de una planta de producción de huevo líquido
Autora: Jenifer Daniela Castillo Jácome
Tutor: Ing. Jorge René Viterí Moya PhD
RESUMEN
Se analizó el perfil de aminoácidos del huevo de gallina (gallus domesticus), para proponer
un pre-diseño de una planta de producción de huevo líquido con el fin de obtener un producto
con mejor valor nutritivo y preservación.
La investigación inició con la preparación de muestras de yema y clara, separadas
previamente mediante hidrólisis ácida con HCl 4%, hidrólisis enzimática con proteasa y con
el método colorimétrico, controlando en cada análisis las variables: homogenización,
temperatura, tiempo y pH. En los productos obtenidos se realizó la cuantificación del perfil
de aminoácidos empleando cromatografía de alta resolución, espectrometría UV-VIS,
electroforesis capilar y espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier.
Adicionalmente se realizó el pre-diseño de una planta para la producción de huevo líquido
basado en los resultados obtenido del perfil de aminoácidos.
Los resultados del perfil de aminoácidos obtenidos con los métodos de propuestos son
comparables con los reportados en la literatura, lo que permite confirmar el valor nutritivo
de las muestras de huevo de gallina empleados y proponer el pre-diseño de la planta para la
producción de huevo líquido y poder aportar con los cambios indicados en el PI&D una
solución a los procesos de pasteurización.
PALABRAS CLAVES: PERFIL DE AMINOÁCIDOS/HUEVOS/GALLINAS/GALLUS
DOMESTICUS/ESTUDIO DE FACTIBILIDAD/PASTEURIZACIÓN/
xv
TITLE: Study of the amino acid profile of the chicken egg (gallus domesticus) and pre-
design of a liquid egg production plant
Author: Jenifer Daniela Castillo Jácome
Tutor: Ing. Jorge René Viterí Moya PhD
ABSTRACT
The amino acid profile of the chicken egg after acidic, enzymatic hydrolysis and colorimetric
method was analyzed to propose a pre-design of a liquid egg production plant in order to
obtain a product with better nutritional value and preservation.
The investigation began with the preparation of yolk and albumen samples by acid hydrolysis
with 4% HCl, by enzymatic hydrolysis with protease and with the colorimetric method
controlling in each analysis the variables like homogenization, temperature, time and pH.
With the obtained products, the quantification of the amino acid profile was performed using
high resolution chromatography, UV-VIS spectrometry, capillary electrophoresis and
Fourier transform infrared spectroscopy. On the other hand, a pre-design of a plant for the
production of liquid egg was developed based on the results obtained from the amino acid
profile.
The results of the amino acid profile obtained with the proposed methods are comparable
with those reported in the literature, which allows to confirm the nutritional value of the
chicken egg samples used and proposing the pre-design of the plant for the production of
liquid egg and be able to provide a solution to the pasteurization processes with the changes
indicated in the PI&D.
KEY WORDS: AMINO ACID PROFILE/EGGS/CHICKENS/GALLUS
DOMESTICUS/FEASIBILITY STUDY/PASTEURIZATION/
1
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial, la mayor producción de huevos de gallina es en Asia (58.6%), América
(20.4%) y Europa (16%), siendo la producción mundial en el año 2013 de 68 millones de
toneladas de huevos, aproximadamente (Raigón, 2016).
Según (FAO, 2019), Estados Unidos es el tercer productor mundial de huevos de mesa y la
producción de huevos de mesa se ha mantenido dinámica durante la última década en
comparación con Europa o China mientras que según el Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos (USDA) manifiesta que el consumo de huevos en los Estados Unidos en el
2019 es de 279.2 huevos (USDA,2019). En las últimas dos décadas, la producción y el
consumo de los huevos de mesa han aumentado en todo el mundo. La FAO predice que la
producción en el 2030 será de 89 millones de toneladas de huevos de gallina (Magdelaine,
Braine,Gonnier y Spiess, 2010).
Según la Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador (CONAVE,2018); Ecuador subió
su consumo per cápita de huevos. Actualmente registra un uso de entre 160 y 165 unidades
anuales, mientras que antes no superaba los 130, pero esta cifra sigue siendo baja con relación
al promedio de otros países. (El Telégrafo,2018).
Los huevos son considerados como una fuente importante de macro y micronutrientes dentro
de la dieta, compuestos de proteínas, lípidos, vitaminas y minerales. Están constituidos por
una cáscara, la clara (que contiene ovoalbúmina, ovotransferrina, ovomucoide, lisozima y
ovomucina) y la yema (que contiene: lipovitelinas, fosvitina, livetinas y lipoproteínas de baja
densidad). Debido a su valor nutricional y características biológicas, las proteínas de clara de
huevo y yema se fraccionan ampliamente utilizando diferentes técnicas (p. Ej.,
Cromatografía líquida, ultrafiltración, electroforesis y precipitación química), en las cuales
la cromatografía líquida es la técnica más comúnmente utilizada para obtener individuos
2
proteínas con alta recuperación de proteínas y pureza para desarrollar nuevos productos
alimenticios. (Chang,Lahti,Tanaka,Nickerson, 2018).
La industria de procesamiento de huevos representa un segmento importante del mercado de
alimentos, suministrando sus derivados en formas secas, congeladas y líquidas para ser
utilizados como ingredientes en diversas formulaciones de alimentos. Debido al bajo costo,
disponibilidad, valor nutricional y múltiples propiedades tecnológicas de sus proteínas
derivadas, estos productos presentan una gran importancia en diferentes sectores industriales.
Hay varios usos de cada componente: la yema de huevo se usa generalmente como fuente
calórica en salsas, pastas, mayonesa y otros (Stadelman y Cotterill 1995), mientras que la
clara de huevo tiene aplicación en unión y coagulación, las proteínas derivadas de esta son
útiles en tecnologías alimentarias, por ejemplo, espuma, emulsificación, adhesión en sectores
como la panadería, la carne y los productos de cereales (Mine 1995; Campbell y Mougeot
1999).
El huevo y sus derivados pueden estar contaminados por diferentes agentes patógenos,
durante cualquier etapa de la cadena de producción. Infección por Salmonella Enteritis es el
patógeno transmitido más común asociado con el consumo de huevos de gallina (Gantois et
al., 2009). causando intoxicación e infección alimentaria. La lucha contra estas
enfermedades es un objetivo prioritario de la política comunitaria en salud pública y su
incidencia debe reducirse progresivamente. La medida que se plantea para inhibir estos
agentes patógenos es un proceso de pasteurización entre el proceso de calentamiento y
enfriamiento del huevo líquido “clara y yema”.
Debido al alto consumo y beneficios que presenta el huevo de gallina tanto a nivel mundial
como en Ecuador, se propone el pre-diseño de una planta de producción de huevo líquido
con el fin de obtener un producto con mejor valor nutritivo y preservación con base previo al
estudio del perfil de aminoácidos que presenta el huevo de gallina. Obteniendo así un
producto con mayor valor nutritivo e inocuo de agentes patógenos y ayude a satisfacer las
necesidades alimenticias de personas con falta de nutrientes.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Generalidades del Huevo de Gallina
El huevo de gallina conocido también como (Gallus gallus), proviene del latín ovum que
significa “cuerpo redondeado, de tamaño y dureza variables”, destinado a la alimentación
humana. El huevo es uno de los alimentos más nutritivos y económicos de la naturaleza.
Se considera uno de los alimentos más completos por la equilibrada proporción de
proteínas, grasas, hidratos de carbono, minerales y vitaminas. (Sandoval, Soriano, &
Instituto de Estudios del Huevo, 2009).
1.2. Estructura del Huevo
El huevo está conformado por tres partes principales como son: Cáscara, clara y yema. A
continuación, se detalla cada una de ellas.
Cáscara: La cascara es la cubierta exterior del huevo y tiene gran importancia, ya que
mantiene su integridad y actúa como barrera bacteriológica. Está constituida, en su
mayor parte, por una matriz cálcica, en el que el calcio es el elemento más abundante
y de mayor importancia. También se encuentran en su composición otros minerales
en menores concentraciones como son: sodio, magnesio, cinc, manganeso, hierro,
cobre, aluminio y boro.
Clara: La clara o albumen está compuesta básicamente por agua (88%) y proteínas
(cerca del 12%). La proteína más importante que presenta la clara es la ovoalbúmina,
cuya propiedad son de especial interés desde el punto nutritivo.
4
Yema: La yema es la parte central del huevo está rodeada de la membrana vitelina que
da la forma a la yema y permite que se mantenga separada de la clara o albumen. En
la yema se encuentran las principales vitaminas, lípidos y minerales del huevo y por
ello es la parte nutricionalmente más valiosa. Su contenido en agua es de
aproximadamente el 50%. (Sandoval et al., 2009).
1.3. Composición Química del Huevo
La clara de huevo y albúmina, consta de tres componentes heterogéneos. La capa líquida
interna (17% de clara de huevo), la clara de huevo está en contacto con la yema de huevo
y está rodeada por una espesa clara de huevo (57% de clara de huevo). La capa gruesa
conecta el resto de la clara del huevo con la cáscara del huevo. Hay una capa globular no
fibrosa entre la membrana interna de la concha y albúmina. Esta capa se conoce como
perialbumen, eso evita la penetración de bacterias dentro de la clara de huevo. Las
membranas de la cubierta interna y externa están compuestas de glicoproteína que
proporciona rigidez mecánica a los componentes internos del huevo. (Abeyrathne, Lee y
Ahn, 2013).
Tabla 1. Propiedades Físico-Químicas del Huevo de Gallina, Fracciones Másicas de
su composición y Valor Nutricional en 100g. (Sayar, s. f.)
Propiedades Físico-Químicas
Densidad del huevo (g/ml) 1,03
Fracciones másicas
Cáscara 14,34%
Clara 57,56%
Yema 28,10%
M HCl (g/mol) 36,46
M Ca(OH)2 (g/mol) 74,09
M CaCl2 (g/mol) 110,98
M H2O (g/mol) 18
5
Continuación de tabla 1.
Valor Nutricional (100g)
Agua 73,8
Valor calórico (kcal) 159
Proteínas 12,9
Glúsidos 0,6
Lípidos 11,7
Colesterol 0,55
Hierro 0,0027
Calcio 0,058
Magnesio 0,013
Fósforo 0,221
Potasio 0,144
Sodio 0,121
Vitamina A 0,000202
Vitamina B2 0,00035
Vitamina B6 0,00012
Total 259,1104
1.4. Valor Nutritivo del Huevo
El huevo es uno de los alimentos más importantes, se considera una de las fuentes más
económicas para obtener proteína de la mejor calidad. Además, también es reconocido
por su aporte elevado de micronutrientes (elementos minerales y vitaminas). La figura 1
resume, de una forma mucho más concreta la composición nutricional del huevo. De esta
forma, si hablamos en términos de densidad nutricional (g, µg o mg de nutriente/1000 kcal
alimento). El huevo es realmente un alimento muy aconsejable en comparación con otros
alimentos proteicos a los que puede sustituir en la dieta. La tabla 2 recoge los contenidos
6
en valor absoluto, así como expresados en densidad nutricional, de los nutrientes más
relevantes en el huevo. (Sastre Gallego, 2002)
Figura 1. Aporte nutricional por huevo
Tabla 2. Valor nutritivo del huevo (en valor absoluto y densidad), comparado con
otras fuentes proteicas dietéticas
1.5. Proteínas
Las proteínas son macronutrientes esenciales que adquirimos a través de los alimentos y
que cumplen funciones importantes para el buen funcionamiento del organismo. Son
consideradas sustancias orgánicas que contienen el 16 % nitrógeno. Las proteínas se
7
encuentran en las células animales y vegetales. Son consideradas macromoléculas
formadas por cadenas de unidades estructurales como son los aminoácidos. Estas
proteínas son componentes esenciales de todas las células vivas, su objetivo en el
organismo es de dos tipos: una de tipo estructural del propio organismo y otra de tipo
funcional. (Pertierra, 2006).
1.5.1. Estructura de proteínas
Las proteínas son moléculas muy complejas; presentan una estructura lógica y funcional
específica para cada una de ellas; tienen como característica común los aminoácidos en
sus unidades estructurales. Los aminoácidos se encuentran unidos entre sí mediante
uniones covalentes conocidos como enlaces peptídicos y, según el tamaño de las cadenas,
pueden ser desde una simple unión de dos aminoácidos llamados di péptido, hasta grandes
moléculas de proteína, pasando por las de tamaño mediano o polipéptidos. Los niveles de
organización son: estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria (Guerrero, Ríos,
& Ancona, s. f.).
1.5.1.1.Estructura Primaria
La estructura primaria de un aminoácido está determinada por la secuencia de
aminoácidos. Es decir, las proteínas se diferencian por su número y composición de
aminoácidos y por el orden de ellos en sus cadenas polipeptídicas (Figura 2). (Guerrero
et al., s. f.).
Figura 2. Estructura Primaria de las proteínas
8
1.5.1.2. Estructura Secundaria
La estructura secundaria consiste esencialmente en la relación espacial de un aminoácido
con respecto al que le sigue a lo largo de la cadena poli peptídica. Existen varios tipos de
estructura secundaria en las proteínas: en uno de ellos se puede adoptar (plegamiento) la
forma de α hélice y en otro la conformación de la hoja plegada. Las combinaciones de
estas estructuras secundarias dan origen a arreglos geométricos específicos que se
presentan en las proteínas («Estructura protéica», s. f.).
Hélice alfa: Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno
intracatenarios formados entre el grupo –NH de un enlace peptídico y el grupo –C=O
del cuarto aminoácido que le sigue. Cuando la cadena polipeptídica se enrolla en
espiral sobre si misma debido a los giros producidos en torno al carbono alfa de cada
aminoácido se adopta una conformación denominada hélice α. Esta estructura es
periódica y en ella cada enlace peptídico puede establecer dos puentes de hidrógeno,
un puente de hidrógeno se forma entre el grupo –NH- del enlace peptídico del
aminoácido en posición n y el grupo –CO- del enlace peptídico del aminoácido situado
en posición n-4. El otro puente de hidrógeno se forma entre el grupo –CO- del enlace
peptídico del AA en posición del AA en posición n y el grupo –NH- del enlace
peptídico del AA situado en posición n+4. Cada vuelta de la hélice tiene un paso de
rosca de 0.54 nm. (Guillén, 2008).
Hoja Beta: Se define hoja beta cuando la cadena principal de un polipéptido se estira
al máximo que permiten sus enlaces covalentes adopte una configuración espacial
denominada estructura β, que suele representarse como una flecha. En esta estructura
las cadenas laterales de los aminoácidos se sitúan de forma alternante a la derecha y a
la izquierda del esqueleto de la cadena polipeptídica. Las estructuras β de distintas
cadenas polipeptídicas o bien las estructuras β de distintas zonas de una misma cadena
9
polipeptídica pueden interaccionar entre sí mediante puentes de hidrógeno, dando
lugar a estructuras laminares llamadas por su forma hojas plegadas u hojas β.
Cuando las estructuras β tienen el mismo sentido, la hoja β resultante es paralela, y
si las estructuras β tienen sentidos opuestos, la hoja plegada resultante es anti
paralela. (Guillén, 2008).
Figura 3. Hélice α y hoja β de la estructura secundaria de las proteínas
(Villa et al.,2010)
1.5.1.3. Estructura terciaria
La estructura terciaria es conocido como dominio, éstos son clasificados en tres categorías
principales: una formada exclusivamente de α-hélices, otra de láminas β, otra de láminas
β paralelas rodeadas de α hélices y finalmente las que no corresponden a pequeñas
proteínas. Según (Guerrero et al., s. f.) los dominios proteicos son una región compacta
de la proteína que generalmente está formada por segmento continuo de amino ácidos y
que puede plegarse de manera estable por sí misma en solución.
10
Figura 4. Estructura terciaria de las proteínas («Estructura proteica», s. f.)
1.5.1.4. Estructura Cuaternaria
Se conoce a la estructura cuaternaria al arreglo espacial de una proteína que contiene
varias cadenas polipeptídicas y es la manera en que cada cadena polipeptídica en la
proteína se arregla en el espacio con relación a las otras cadenas. Cada de una de esas
cadenas es conocida como una subunidad o protómero y el complejo cuaternario es
entonces una proteína oligomérica o multimérica. (Zarkadas et al., 1992)
Figura 5. Estructura cuaternaria de las proteínas (Zarkadas et al., 1992).
11
1.5.2. Tipos de Proteínas presentes en el huevo
Las proteínas presentes en la clara del huevo son:
“Ovoalbúmina: Es la principal proteína de la clara del huevo. Esta proteína se
desnaturaliza fácilmente por el calor. Además, es la proteína de mayor valor biológico
ya que tiene muchos de los nueve aminoácidos esenciales. Es llamada
fosfoglucoproteína integrada por tres fracciones, A1, A2 y A3, en una proporción de
85:12:3, respectivamente, que se diferencian por su contenido en fósforo. Es rica en
cisteína y metionina y presenta grupos sulfhidrilos y se puede decir que la presencia
de estos grupos sulfhidrilos hacen una gran contribución aparte del sabor, textura y
aroma característicos del huevo.
Conalbúmina: Suma alrededor del 14% del total de proteínas en la clara de huevo
también se coagula por el calor. Es una proteína no fosforilada formada por dos
cadenas polipeptídicas. No presenta grupos sulfhidrilo, pero es rica en enlaces
disulfuro. Tiene gran poder quelante de metales, en especial el hierro, y en este caso
se vuelven más termorresistentes. La capacidad secuestrante del hierro le confiere
propiedades antioxidantes y antimicrobianas.
Ovomucoide: Una tercera proteína, el ovomucoide representa el 12% del total. El
ovomucoide no se coagula con el calor. Es una glucoproteína rica en glucosamina
(14%) y aminoácidos azufrados (12%). Presenta manosa, galactosa y ácido
neuramínico. Es rica en enlaces disulfuro.
Lisozima: Además la clara de huevo contiene aproximadamente un 7 % de globulinas,
incluyendo la lisozima, una proteína interesante ya que disuelve las paredes celulares
de ciertas bacterias, en especial los mucopolisacáridos de los microbios Gram
positivos.” (Paulson, Deatherage, & Almy, 1953).
La yema de huevo contiene:
12
Lipovitelinas: Es una proteína alta en azufre, lipoproteína de alta densidad (HDL)
rica en cisteína. Presenta un 20% de lípidos (dos tercios de fosfolípidos y uno de
colesterol, lípidos neutros y triglicéridos)
Lipovitelenina: Es una lipoproteína de baja densidad pobre en cisteína. Presenta un
88% de lípidos (un tercio de fosfolípidos y dos de lípidos neutros y colesterol).
Existen restos glucídicos, hexosas y ácido neuramínico. (Paulson, Deatherage, &
Almy, 1953).
1.6. Desnaturalización
Se denomina desnaturalización la alteración de una proteína que modifique su
conformación nativa; este cambio provoca la consiguiente alteración o desaparición de
sus funciones. En una proteína se produce la desnaturalización al perder su estructura
secundaria, terciaria y cuaternaria, conservándose la primera (covalente).
En el estado de desnaturalizado los niveles de estructuración superior de la
conformación nativa se encuentran al azar, es decir la proteína altamente ordenada
queda reducida a un polímero estadístico formado por una cadena de aminoácidos
(figura 5). La existencia de enlaces disulfuro en una proteína aumenta su resistencia a
la desnaturalización. (Guerrero et al., s. f.)
1.6.1. Agentes desnaturalizantes
Todos aquellos agentes capaces de romper o alterar los enlaces que mantienen las
estructuras de orden superior de una proteína pueden desnaturalizarla. Un agente
desnaturalizante muy común es el calor, también se consideran otros agentes físicos
(radiaciones, tensoactividad, altas presiones) o químicos (ácidos, álcalis, urea,
detergentes) capaces de alterar las interacciones débiles pueden llegar a desnaturalizar
las proteínas. (Guerrero et al., s. f.)
13
Figura 6. Desnaturalización de una proteína.
1.7. Aminoácidos
Como su nombre lo implica, los aminoácidos son moléculas orgánicas que contienen un
grupo amino (NH2) en uno de los extremos de la molécula y un grupo ácido carboxílico
(COOH) en el otro extremo. Ambos grupos están unidos al mismo átomo de carbono,
designado carbono a. Al carbono a de cada aminoácido también está unido un átomo de
hidrógeno y un grupo R o lateral (Gutiérrez, 2017).
La estructura general que representa a todos los aminoácidos se puede representar de la
siguiente manera:
Figura 7. Estructura general de los aminoácidos (Bruño, 2016).
14
Así mismo los aminoácidos pueden ser clasificados de la siguiente manera:
Tabla 3. Clasificación de Aminoácidos por la estructura y composición química
(Bioquímica, s. f.)
1.8. Enzima
“Las enzimas son grandes proteínas que aceleran la velocidad de la reacción química hasta
alcanzar el equilibrio, actúan como catalizadores en reacciones químicas específicas de
los seres vivos o sistemas biológicos. Muchas de las enzimas no trabajan solas, se
organizan en secuencias, también llamadas rutas metabólicas, y muchas de ellas tienen la
capacidad de regular su actividad enzimática. En su estructura, se enlazan y se pliegan una
o más cadenas poli peptídicas, que contribuyen un pequeño conjunto de aminoácidos para
crear el sitio activo considerado la parte donde se incrusta el sustrato y donde se da la
reacción”.(Torres & César, 2014).
1.8.1. Clasificación de las enzimas
En general las enzimas han sido nombradas añadiendo el sufijo “asa” correspondiente a
cada sustrato la palabra que describe su actividad. (Torres & César, 2014).
15
En la actualidad el número de enzimas descubiertas han ido incrementando por lo cual de
acuerdo de la Unión Internacional de Bioquímica han adoptado un sistema de clasificación
de enzimas. En la tabla 4. Se aprecia las seis clases principales, según el tipo de reacción
catalizada. (Torres & César, 2014).
Tabla 4. Clasificación Internacional de Enzimas (Torres & César, 2014)
Número Clase Tipo de reacción catalizada
1 Oxidoreductasas Transferencia de electrones ( iones hidruro o
átomo de H)
2 Transferasas Reacciones de transferencia de grupos
3 Hidrolasas Reacción de hidrólisis (transferencia de
grupos funcionales al agua)
4 Liasas Adición de grupos a dobles enlaces.
Formación de dobles enlaces por eliminación
de grupos.
5 Isomerasas Transferencia de grupos dentro de la
molécula dando formas isoméricas.
6 Ligasas Formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N;
mediante reacciones de condensación
acopladas a la rotura de ATP.
1.9. Hidrólisis Ácida
La hidrólisis ácida es la ruptura de las proteínas primarias, terminando esta fragmentación
en la obtención de aminoácidos. La hidrólisis ácida es un proceso químico que actúa con
un ácido puede ser ácido sulfúrico o ácido clorhídrico, el cual sirve para catalizar la
escisión de los enlaces químicos.
La hidrólisis ácida pude ser diluida o concentrada, en la primera los medios de presión y
temperatura son altas y el tiempo en el que se da la reacción es entre 1 a 4 horas lo que
facilita el proceso continuo. Este proceso se debe considerar entre temperaturas de (50 –
16
215 °C). Las hidrólisis ácidas concentradas, habitualmente es usada para liberar la
hemicelulosa. (Montiel & Romero, 2015).
Sin embargo, existen trabajos de investigación donde la albúmina con hidrólisis ácida, se
opera con temperaturas de 110 y 145 °C , tiempos que fueron desde 8 hasta 32 horas,
hacen relación entre el contenido aparente de un aminoácido en la proteína, que afecta a
los valores obtenidos directamente del análisis realizado luego de la hidrólisis ácida y el
valor real considerando las modificaciones y degradaciones de los 19 aminoácidos que
pueden darse simultáneamente al proceso de ruptura de los enlaces que los unen durante
el proceso hidrolítico. (Navarro, García, & Sanchez, 2012).
1.10. Hidrólisis Enzimática
En los hidrolizados de proteína se potencian diversas características funcionales, tales
como alta solubilidad, viscosidad baja, dispersión, mayor capacidad de agitación que
proporcionan diferentes ventajas para el uso de productos alimenticios, en relación a las
proteínas originales. (Torres & César, 2014)
El grado de hidrólisis es considerado como una propiedad fundamental de un hidrolizado
ya que define el porcentaje de enlaces peptídicos rotos en dependencia a la proteína real.
El grado de hidrólisis obtenido finalmente en cada proceso es de acuerdo a las condiciones
utilizadas para dicha hidrólisis, como son: relación enzima-sustrato, el tiempo de
incubación, concentración de sustrato, temperatura y pH.
Un factor importante que debe ser considerado es la naturaleza de la enzima, determinada
por el tipo de actividad y por su actividad específica que presenta, por lo cual la enzima
utilizada en cada proceso también influye en el tipo de enlaces producidos. (Ricardo
Benitez, 2008).
17
1.10.1. Proceso de hidrólisis enzimática en las proteínas.
La hidrólisis enzimática de proteínas se lleva a cabo en un reactor, con control de
agitación, pH, temperatura y tiempo del proceso. El sustrato se disuelve en agua hasta que
el pH y la temperatura se estabilizan; a continuación, se agrega la proteasa dando inicio al
hidrólisis. A medida que la etapa anterior se desarrolle se produce una disminución del
pH debido a la rotura de los enlaces peptídicos. En los diferentes casos de hidrólisis
enzimática el pH debe ser mantenido en el óptimo de la enzima mediante la adición de
base diluida. Finalmente, en la hidrólisis proteica la enzima puede ser inactivada con calor
mediante una disminución del pH o con una combinación de ambos, de igual manera
puede ser retirada del medio por filtración y la proteína precipita. (Torres & César, 2014).
1.11. Uso y Aplicación del Huevo de gallina
La elevada calidad y biodisponibilidad de la proteína del huevo la convierte en una gran
fuente de nutrientes en las primeras etapas de la vida (a través de la alimentación de la
madre, favorece el desarrollo del feto durante la etapa embrionaria y del bebé lactante, y
después en el crecimiento infantil). (Sandoval et al., 2009).
Tabla 5. Propiedades Tecno-Funcionales de los huevos para la Industria
Alimentaria (Instituto de Estudios del Huevo, 2006)
YE
MA
Propiedades Componentes Aplicaciones
Aromatizantes Muchos flanes,pastas,salsas
Colorantes Xantofilas Magdalenas, pastas, panes
Capacidad
emulsionante
Leotina,
lipoproteínas,
LDL
Mayonesas,cremas,dulces,
croquetas
Poder coagulante y
aglutinante
LDL, otras
propiedades
Flanes, cremas, dulces
Antioxidantes Fosvitina alimentos
18
1.11. Antecedentes de plantas productoras de huevo líquido.
Tabla 6. Plantas productoras de huevo líquido (ARCSA, 2019)
AL
BU
ME
N
Propiedades Componentes Aplicaciones
Capacidad espumante,
estabilización espuma
Lisozima,
Ovoalbúmina
pasteles, pastas, panes
especiales
Poder anticristalizante Ovomucina,
Ovomucoide
merengues, pasteles,
confitería
Aglutinante Ovoalbúmina,
Conalbúmina
galletas, patés.
Conservantes Lisozima,
Conalbúmina
quesos y otros alimentos,
Propiedades reológicas Proteínas
diversas
confitería
Nombre de la Planta Descripción
Empresas Nacionales en Ecuador
Ovosan Joaquín Rodríguez y Eduardo Tapia, emprenden en el 2003 la
producción de pasteurización de huevos en Ecuador –Quito, la
empresa se encuentra ubicada en la zona de Amaguaña.
Industria Avícola En el 2014, José Luis Espinal Restrepo, pone en operación a la
primera planta productora de huevo líquido y pasteurizado de
Ecuador, ubicada en el parque industrial de la ciudad de
Ambato ( centro, provincia de Tungurahua)
19
Continuación de tabla 6.
Empresas Productoras en Centroamérica
Empresa Innovo Ricardo Rojas gerente general de Innovo, en el 2015 dio el
inicio de la primera planta de producción de huevo líquido en
Centroamérica ubicada en Costa Rica.
Prohuevo S.A En el 2017, el grupo nicaragüense da inicio a la primera
empresa pasteurizadora de huevos que operara en
Centroamérica y el Caribe.
Ovosan Joaquín Rodríguez y Eduardo Tapia, emprenden en el 2003 la
producción de pasteurización de huevos en Ecuador –Quito, la
empresa se encuentra ubicada en la zona de Amaguaña.
Industria Avícola En el 2014, José Luis Espinal Restrepo, pone en operación a la
primera planta productora de huevo líquido y pasteurizado de
Ecuador, ubicada en el parque industrial de la ciudad de
Ambato ( centro, provincia de Tungurahua)
20
2. METODOLOGÍA
2.1. Ubicación del área de investigación
El proceso de obtención de Aminoácidos a partir del Huevo de gallina mediante hidrólisis
ácida y la cuantificación de proteínas por el método de colorimetría se desarrollaron en el
laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad
Central del Ecuador, mientras que los ensayos de FTIR se desarrolló en el área de
investigación de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador
y la Electroforesis obtenidos de los procesos de hidrolisis ácida y enzimática se llevó
acabo en la Facultad de Ciencias Química de la Universidad Central del Ecuador. La
obtención de aminoácidos, se validó en el laboratorio Récor Dental S.A. el método
escogido para el perfil de aminoácido fue HPLC (Cromatografía líquida de alta eficacia).
2.2. Proceso Experimental
Previo a la obtención de Aminoácidos libres del Huevo de Gallina, fue necesario conocer
una concentración inicial de proteínas, esto se realizó por medio de colorimetría. Posterior
a la cuantificación de proteínas se realizaron procesos de hidrólisis enzimática y ácida.
Una vez que se obtuvo una suspensión con aminoácidos libres se procedió a realizar un
método cualitativo para definir la presencia de aminoácidos, por medio de electroforesis
y FTIR. Finalmente, se realizó el estudio del perfil de los aminoácidos presentes en la
solución, por medio de la cuantificación de Cromatografía líquida (HPLC) utilizando un
kit de L-aminoácidos de la marca SIGMA Chemicals Corp.
Para elaborar el presente trabajo se realizó una revisión bibliográfica de artículos
científicos, libros y trabajos relacionados al tema con el fin de plantear el Diseño
Experimental.
21
2.2.1. Diagrama de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis Ácida.
a)
Figura 8. Diagrama de Flujo de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis Ácida (Autor)
22
2.2.2. Diagrama de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis Enzimática.
b)
Figura 9. Diagrama de Flujo de Obtención del Perfil de Aminoácidos mediante Hidrólisis Enzimática (Autor)
23
Se consideró para el estudio las siguientes variables operacionales para el proceso de
hidrólisis tanto ácida como enzimática. Entre ellas se tiene:
Variables dependientes: Perfil de Aminoácidos
Variables independientes: Tiempo
Temperatura
pH
A cada muestra se realiza los procesos antes mencionados, se trabaja con veinte huevos
de diferentes pesos durante quince días, se controló la temperatura, el tiempo y pH
manteniendo constante como se muestra en la siguiente figura:
Donde:
MH: Muestra de Huevo de Gallina
C: Clara de Huevo de Gallina
Y: Yema de huevo de gallina
CO: Método de Colorimetría
HA: Hidrolisis Acida
HE: Hidrolisis Enzimática
CP: Concentración de Proteínas
SE: Secado
IR: Método de Infrarrojo
EF: Método de Electroforesis
PA: Perfil de Aminoácidos
24
Figura 10. Esquema Experimental de Ensayos para Obtener el Perfil de
Aminoácidos
2.3. Métodos
2.3.1. Método de colorimetría
Como proceso previo a la hidrólisis ácida se utilizó el método de cuantificación de
proteínas por colorimetría; este método permitió medir la concentración de proteínas
presentes en el huevo de gallina tanto en la yema y clara; se aplicó el protocolo de
colorimetría basado con un kit de proteínas, descrito en el Anexo A. Se elaboró una curva
de calibración con estándar del Kit proteína (Erba Lacherma S.R.O) de concentración
4ug/ml. Posteriormente se utilizó la técnica instrumental analítica de espectrofotometría
que nos permitió obtener la lectura de absorbancia; para obtener la curva de calibración
se trabajó a una longitud de onda de 560 nm.
25
a) Materiales y Reactivos
Vaso de precipitación V: 100 ml Ap ± 10 ml
Micropipeta R: (10– 100) µL Ap ± 5 µL
Micropipeta R: (100 – 1000) µL Ap ± 10 µL
Balones de Aforo R: (0 – 100) ml Ap ± 0,1 ml
Gotero
Pipeta R: (0 – 10) ml Ap ± 0,1 ml
Pera
Balanza digital analítica R: (0.0001 – 220) g Ap ± 0.0001 g
Cronometro
Probeta R: 10 ml Ap ± 0.1 ml
Yema
Clara
Kit proteína (Erba Lacherma S.R.O)
b) Equipos
Espectrofotómetro
Nombre: UV-VIS Marca: Agilent Tecnologies Modelo: Cary 60
c) Procedimiento
Separar la yema y clara del huevo. Se vertió en dos vasos de precipitación tanto la yema
como la clara.
Tomar 20 µL de yema y 20 µL de clara, se colocó en dos tubos viales de 2 mL.
Agregar en un tercer tubo 20 µL de estándar de proteínas (Erba Lacherma S.R.O).
Agregar en un cuarto tubo 20 µL de agua destilada.
Agregar a cada tubo 1000 µL del reactivo R1, colocar en un lugar oscuro por 10 min.
26
Luego de transcurridos los 10 minutos se procedió a medir la absorbancia haciendo uso
del equipo Espectrofotómetro UV- VIS.
Posterior a la lectura, se volvió a colocar los tubos en el lugar oscuro por 30 minutos y
posterior a esto se volvió a medir la absorbancia.
Determinar la concentración de proteínas en yema y clara con los datos de absorbancia
a diferentes tiempos tanto de las muestras, del blanco y del estándar, por medio de la
formula otorgada por el inserto del kit de cuantificación de proteínas.
Este proceso se realizó 5 días con dos huevos diferentes.
Uso de Equipo UV- Visible Espectrofotómetro
Encender el equipo, espectrofotómetro y computadora
Seleccionar el método “Simple Reads” que servirá para determinar la absorbancia,
este programa viene predeterminado en el software.
Definir la longitud de onda, se trabajó a 560 nm.
Realizar las lecturas de cada muestra para determinar la cantidad de proteínas
presentes en la clara y la yema.
d) Diagrama de Flujo
En el siguiente esquema se presenta el diagrama de flujo del procedimiento a realizar en
cada experimentación basada en el método de colorimetría.
Figura 11. Diagrama de proceso del método de Colorimetría
27
2.3.2. Método de Hidrólisis Ácida
Técnica previa a la cuantificación del perfil de aminoácidos, en la cual se procedió a
hidrolizar con HCl al 4 % a una temperatura de 110 °C, terminada la hidrólisis ácida se
neutralizó con Ca(OH)2 al 20 %. A continuación, se centrifugó a 3500 rpm; se sometió a
un proceso de secado durante 24 h a una temperatura de 50 °C y el producto obtenido fue
analizado mediante el espectrómetro FTIR S.N. 97575 y electroforesis.
a) Materiales y Reactivos
Vaso de precipitación V: 100 ml Ap ± 10 ml
Balones de Aforo R: (0 – 100) ml Ap ± 0,1 ml
Gotero
Pipeta R: (0 – 10) ml Ap ± 0,1 ml
Pera
Balanza digital analítica R: (0.0001 – 220) g Ap. ± 0.0001 g
Cronometro
Probeta R: 10 ml Ap. ± 0.1 ml
Gradilla
Mortero de ágata
Prensa de mano
Juego de Piezas metálicas
Yema
Clara
b) Reactivos
Ácido Clorhídrico HCl 4 %
Hidróxido de Calcio Ca (OH)2 20 %
Bromuro de Potasio KBr (s)
c) Equipos
28
Estufa
Marca: MMM Group Modelo: Ecocell 111
Centrifuga
Modelo: Model 80- 2S
Espectrómetro FTIR S.N. 97575
Marca: PerkinElmer Modelo: Spectrum Two
d) Procedimiento
Separar la yema y clara del huevo. Se vertió en dos vasos de precipitación tanto la yema
como la clara.
Se agregó en cada vaso de precipitación HCl al 4 % en una proporción de 1:2.
Someter a digestión por un tiempo de 8 horas a una temperatura de 110 °C.
Neutralizar con Ca (OH)2 al 20 % con agitación permanente por 10 min.
Centrifugar por 15 min a 3500 rpm
Finalmente secar el precipitado por un tiempo de 24 horas a una temperatura de 50 °C,
en un horno de convección natural.
Analizar el sólido obtenido utilizando el equipo de FTIR y electroforesis.
2.3.3. Hidrólisis Enzimática
En este proceso la reacción de hidrólisis consiste en la ruptura del enlace que existe entre
los aminoácidos que componen una cadena peptídica, en el cual se consume una molécula
de agua por cada enlace roto. La enzima utilizada “proteasa” nos ayuda a catalizar esta
ruptura del enlace peptídico.
Para llegar a obtener el perfil de aminoácidos la actuación sobre la proteína da lugar a las
siguientes especies intermedias de la siguiente manera:
𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 → 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑜𝑠𝑎𝑠 → 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛𝑎𝑠 → 𝑝é𝑝𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠 → 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠
En este método se hidroliza la clara y yema de huevo en el cual se mezclaron con agua
destilada y fueron sometidos a un proceso de calentamiento durante un determinado
tiempo, llevándose a cabo una desnaturalización en presencia de la proteasa de Bacillus
29
subtilis a un pH 7,5, a continuación, se llevó a un proceso de centrifugación por 15
minutos.
a) Materiales y Reactivos
Vaso de precipitación V: 100 ml Ap ± 10 ml
Pipeta R: (0 – 10) ml Ap ± 0,1 ml
Pera
Cronometro
Probeta R: 10 ml Ap. ± 0.1 ml
Gradilla
Mortero de ágata
Prensa de mano
Juego de Piezas metálicas
Baño María Memmert
Yema
Clara
b) Reactivos
Proteasa Subtilisina 3,5 KLPU-SX/g
Bromuro de Potasio KBr (s)
c) Equipos
Estufa
Marca: MMM Group Modelo: Ecocell 111
Centrifuga
Modelo: Model 80- 2S
Espectrómetro FTIR S.N. 97575
Marca: PerkinElmer Modelo: Spectrum Two
d) Procedimiento
Separar la yema y clara de huevo. Colocar en dos vasos de precipitación.
30
Disolver la clara y yema de huevo en agua destilada (1:20 p/v)
La proteína en la solución fue térmicamente desnaturalizada a 90°C en un baño maría
durante 20 min.
Se agregó la proteasa Subtilisina 3,5 KLPU-SX/g una proporción de 1:25 enzima-
sustrato para llevar a cabo la reacción de hidrólisis, el cual fueron calentados a 37 °C
y el pH controlado a 7.5
Finalmente fue sometida a un proceso de centrifugación a una velocidad de 3500 rpm
a un tiempo de 15 min.
Separar el precipitado obtenido para secar a una temperatura de 37 ° por 48 horas.
Una vez obtenido el sólido se procedió a su análisis utilizando el FTIR y electroforesis.
2.4. Determinación de presencia de las Proteínas en el huevo de gallina.
2.4.1. Análisis Espectroscopia Infrarrojo por transformada de Fourier: (FTIR)
a) Materiales y equipos
Espectrofotómetro FTIR Marca PerkinElmer modelo: Spectrum Two
Balanza analítica Rango: 0-220 g Apreciación: ±0,0001 g
Mortero de ágata
Prensa de mano
Juego de piezas metálicas
b) Reactivos
Bromuro de potasio KBr(s)
c) Procedimiento
Conectar el dispositivo de almacenamiento que contiene el programa en el equipo.
Abrir software “Spectrum” del equipo y realizar un barrido (background)
Pesar la muestra y el Bromuro de Potasio seco con una relación de 1:100 muestra/KBr.
Colocar la muestra y el Bromuro de potasio en el mortero y mezclar hasta obtener un
polvo fino.
31
Colocar alrededor de 100mg del polvo fino en el juego de piezas metálicas para formar
la pastilla.
Prensar la muestra con una prensa de mano hasta que se forme una pastilla entre el
anillo metálico.
Colocar la pastilla con el anillo de prensado en el porta muestras del equipo Spectrum
Two FTIR.
Presionar Scan para obtener el espectro
Corregir el espectro mediante las herramientas disponibles en el software (Baseline
Correction, Smooth, Normalization)
2.4.2. Determinación de proteínas mediante Electroforesis
Para determinar en el producto final de la hidrólisis la presencia de aminoácidos, se realizó
la técnica de electroforesis utilizado el sistema de electroforesis comprendido por la fuente
de poder marca Major Science y la cámara de electroforesis de marca Biostep ® que se
encuentra en la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
Para dicho análisis se llevó acabo el procedimiento establecido en el “Manual de
procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN” (García, 2003) el cual se
encuentra en el Anexo F.
Para dicho análisis se utilizó gel de agarosa al 3% y se disolvió en 50ml de TBE (Tris
Borato EDTA), el cual se procedió a calentar por 45 segundos. Una vez obtenido el gel,
se agregó a la cámara de gel para que solidifique.
Figura 12. Cámara de electroforesis horizontal
32
Se tomó 5 mg de producto final de hidrólisis de la yema y clara de huevo de gallina y se
disolvió con agua destilada 0,5 ml, a continuación 50 µl de la muestra diluida se trató con
50 µl de azul de bromofenol y 50 µl SDS, se sometieron a calentamiento mediante baño
maría a una temperatura de 90°C durante 3 minutos e inmediatamente las muestras se
sumergieron en un baño de hielo.
Se cargaron a la cámara de electroforesis 10 µl de proteínas tanto de la yema y clara del
huevo de gallina en cada pocillo del gel, se utilizó un voltaje de 80V/ 90 minutos hasta
terminar la corrida.
Figura 13. Cámara de electroforesis carga de muestra en cada pozo de gel
Finalmente, una vez terminada la electroforesis, el gel debe ser teñido, para ello se retira
el gel de su molde cuidadosamente y se sumerge en una disolución de 1:10 DMB, o azul
de coomasie; 0,25 g en 90 mL de metanol (96%): H2O (v/v 1:1) y 10 mL de ácido acético
glacial y con suave movimiento rotatorio, durante 10 min Tinción del gel y visualización.
Figura 14. Tinción con azul de Bromo Fenol en la electroforesis de gel de Agarosa.
33
2.5. Determinación y cuantificación del perfil de aminoácidos
2.5.1. Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).
Para la cuantificación de aminoácidos presentes en las muestras de la clara y yema de
huevo de gallina, se utilizó el método HPLC (cromatografía líquida de alta eficiencia). El
equipo de HPLC necesita una columna especial para analizar aminoácidos y posterior a
dicho ensayo de cromatografía es necesario realizar una derivatización, para finalmente
obtener el perfil de aminoácidos presentes en las muestras. Los aminoácidos que se
determinaron fueron: lisina, histidina, arginina, treonina, ácido glutámico, prolina, glicina,
valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, triptófano, ácido aspártico,
alanina, serina.
2.6. Pre-diseño de una planta para la producción de huevo líquido a partir de
proteína hidrolizada de la yema y clara.
El pre diseño de esta planta se lleva acabo debido al alto potencial que se obtuvo en el
perfil de aminoácidos, específicamente para la industria alimenticia.
Esta planta piloto tiene por objetivo diversificar la forma de consumir el huevo de gallina
en el país, para introducirse a un segmento de mercado sin explotar aprovechando el alto
consumo de huevo tanto industrialmente y como alimento primario dentro del núcleo
familiar.
Se realizó una estimación del dimensionamiento de los equipos utilizados en el proceso
de producción de huevo líquido obteniendo las especificaciones técnicas de catálogos de
empresas especializadas en la industria alimenticia. Se realizó el balance de masa en los
reactores y con ello se preparó el diagrama PI&D.
34
2.7. Estimación de los Costos del pre-diseño de la planta de producción de huevo
líquido.
La estimación de los costos del pre-diseño de la planta de producción de huevo líquido
con una mejora en el proceso debido a la implementación del método de hidrólisis ácida,
se basó en los equipos principales necesarios para el proceso. Se realizó cotizaciones en
diferentes empresas de acuerdo a las especificaciones técnicas requeridas.
Las principales características de los equipos utilizados en la producción de huevo líquido
se detallan en el Anexo E
35
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
3.1. CÁLCULOS
3.1.1. Cálculos para determinar la concentración de proteínas mediante el método
de colorimetría.
a) Cálculo del peso promedio de huevo de gallina
𝑾�̂� =𝒘𝟏 + 𝒘𝟐 + ⋯ + 𝒘𝒏
𝒏
(2)
𝑾�̂� =60,38 + 66.69 + 70,49 + 61,6 + 56,16 + 63,32 + 56,1 + 63,31
8
𝑾�̂� = 62,27
Donde:
𝑾�̂�= Peso promedio (g)
𝒏 = Número de Muestras
b) Cálculo de tamaño de huevo de gallina
𝑾�̂� =𝒘𝟏 + 𝒘𝟐 + ⋯ + 𝒘𝒏
𝒏
(3)
𝑾�̂� =7 + 7,5 + 8,5 + 8 + 7,5 + 8 + 7,5 + 8
8
𝑾�̂� = 7,75
Donde:
𝑾�̂�= Tamaño promedio (cm)
36
𝒏 = Número de Muestras
3.1.2. Cálculo de la Concentración de Proteína a partir de las ecuaciones de la
Curva de Concentración de Proteínas para yema y clara en función de la
Absorbancia.
𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚𝐜𝐢ó𝐧 𝐏𝐫𝐨𝐭𝐞𝐢𝐧𝐚 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥 (𝐠
𝐝𝐋) =
𝐀𝟏
𝐀𝟐∗ 𝐂𝐬𝐭
(4)
Concentración Proteina total (g
dL) =
0,0209
0,038∗ 4
Proteina total (g
dL) = 2,2
Donde:
𝐴1 = Absorbancia de la muestra
𝐴2 = Absorbancia del estándar
𝐶𝑠𝑡 =Concentración del estándar
Ecuaciones a partir de los Diagramas de Absorbancia vs Concentración de Proteínas de
las (Figuras 17 y Figura 18) para determinar la Concentración de Proteína.
Para la Concentración de Proteína en la Yema de Huevo.
𝑨 = 𝟎. 𝟎𝟏𝑪 − 𝟎. 𝟎𝟎𝟏𝟐
(5)
Para la Concentración de Proteína en la Yema de Huevo.
𝑨 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟗𝟐𝑪 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟏𝟏
(6)
37
Tabla 7. Datos obtenidos de Absorbancia, concentración de proteína de la clara y
yema
Clara Yema
Concentración
(g/dL)
Absorbancia
Promedio
Concentración
(g/dL)
Absorbancia
Promedio
3,16 0,030 2,014 0,019
3,26 0,031 2,014 0,019
3,38 0,032 2,021 0,019
3,42 0,033 2,077 0,020
3,44 0,033 2,189 0,021
3,69 0,035 2,232 0,021
3,74 0,036 2,242 0,021
4,04 0,038 2,600 0,025
Figura 15. Diagrama Absorbancia vs Concentración de Proteína de la yema de
huevo.
y = 0,01x - 0,0012
R² = 0,9882
0,018
0,019
0,02
0,021
0,022
0,023
0,024
0,025
2 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6
Ab
sorb
anci
a
Concentración de proteína (g/dL)
Concentración vs Absorbancia (YEMA)
Yema
38
Figura 16. Diagrama Absorbancia vs Concentración de Proteína de la clara de
huevo.
3.1.3. Cálculo del Balance de Masa de la Planta de Producción de Huevo Líquido.
Balance de masa
Se realizó el balance de masa del proceso y con ello se construyó los diagramas de tuberías
e instrumentación para el diagrama (P&ID). Anexo E.
Balance General
𝐹 = ∑ 𝑃𝑖
(7)
Donde:
F: Flujo de alimentación (Huevo entero).
∑ 𝑃𝑖: Sumatoria de proteínas desnaturalizadas.
y = 0,0092x + 0,0011
R² = 0,9875
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
3,1 3,3 3,5 3,7 3,9 4,1
Ab
sorb
anci
a
Concentración de proteína (g/dL)
Concentración vs Absorbancia (CLARA)
Clara
39
Balance Reactor 1
𝐹1 = ∑ 𝑃𝑖
4
1
(8)
Donde:
𝐹1: Flujo de alimentación (Clara).
∑ 𝑃𝑖41 : Sumatoria de proteínas desnaturalizadas.
Balance Reactor 2
𝐹2 = ∑ 𝑃𝑖
7
5
(9)
Donde:
𝐹2: Flujo de alimentación (yema).
∑ 𝑃𝑖75 : Sumatoria de proteínas desnaturalizadas.
3.1.4. Cálculo de la Espectrometría Infrarroja por Transformada de Fourier
(FTIR).
�̂� =1
𝜆=
1
0.002 𝑐𝑚= 500𝑐𝑚−1
(10)
La longitud por la frecuencia está dada por:
𝐶 = 𝜆𝑉
(11)
40
Donde:
C: velocidad de la Luz
𝜆: longitud de onda
𝑉: frecuencia
La frecuencia es igual a:
𝑉 =𝐶
𝜆= (
1
𝜆) 𝐶 = �̂� 𝐶
(12)
3.2. RESULTADOS
3.2.1. Resultado promedio de las propiedades físicas del Huevo de Gallina.
Tabla 8. Resultado promedio de las propiedades físicas del huevo de gallina.
Muestra Tamaño (cm) Peso (g) 𝑾�̂� (𝒈) 𝑾�̂� (cm)
1 7 60,38
62,26
7,75
2 7,5 66,69
3 8,5 70,49
4 8 61,61
5 7,5 56,16
6 8 63,31
7 7,5 56,16
8 8 63,31
41
3.2.2. Resultados de Absorbancia de la yema, clara, estándar y blanco obtenido
posterior al ensayo del kit de cuantificación de proteínas.
Tabla 9. Resultados de Absorbancia de la yema, clara, estándar y blanco obtenido
posterior al ensayo del kit de cuantificación de proteínas.
Absorbancia
Muestra Tamaño Peso, g Mediciones Clara Yema Estándar Blanco Promedio
Clara
Promedio
Yema
1 7 60,38
1 0,033 0,019 0,0185 0,0174
0,033 0,019 2 0,033 0,019 0,0186 0,0174
3 0,033 0,019 0,0187 0,0174
2 7,5 66,69
1 0,033 0,021 0,0185 0,0171
0,033 0,021 2 0,033 0,021 0,0186 0,0173
3 0,033 0,021 0,0187 0,0174
3 8,5 70,49
1 0,031 0,019 0,0185 0,0174
0,031 0,019 2 0,031 0,019 0,0186 0,0175
3 0,031 0,019 0,0187 0,0175
4 8 61,61
1 0,03 0,019 0,0185 0,0174
0,03 0,019 2 0,03 0,019 0,0186 0,0175
3 0,03 0,019 0,0187 0,0175
5 7,5 56,16
1 0,032 0,02 0,0185 0,0174
0,032 0,02 2 0,032 0,02 0,0186 0,0175
3 0,032 0,02 0,0187 0,0175
6 8 63,31
1 0,038 0,021 0,0185 0,0174
0,038 0,021 2 0,038 0,021 0,0186 0,0175
3 0,038 0,021 0,0187 0,0175
7 7,5 56,16
1 0,035 0,025 0,0185 0,0175
0,035 0,025 2 0,035 0,025 0,0186 0,0175
3 0,035 0,025 0,0187 0,0175
8 8 63,31
1 0,036 0,021 0,0185 0,0174
0,036 0,021 2 0,036 0,021 0,0186 0,0175
3 0,036 0,021 0,0187 0,0175
42
3.2.3. Resultados de la concentración de proteína en la yema y clara del huevo de
gallina
Tabla 10. Resultados de concentración de proteína de la yema y clara.
Muestra Tamaño Peso, (g)
Concentración
de proteína en
clara (g/dL)
Concentración
de proteína en
yema (g/dL)
1 7,0 60,38 3,42 2,014
2 7,5 66,69 3,44 2,232
3 8,5 70,49 3,26 2,014
4 8,0 61,61 3,16 2,021
5 7,5 56,16 3,38 2,077
6 8,0 63,31 4,04 2,189
7 7,5 56,16 3,69 2,600
8 8,0 63,31 3,74 2,242
3.2.4. Resultados del Perfil de Aminoácidos
Los resultados obtenidos del análisis de Cromatografía Líquida son los siguientes:
Tabla 11. Resultados de Perfil de Aminóacidos
Concentración de
aminoácidos mediante
Hidrólisis enzimática
(mg/mL)
Concentración aminoácidos
de mediante Hidrólisis ácida
(mg/mL)
AMINOÁCIDOS YEMA CLARA YEMA CLARA
Ácido Aspártico (Asp) 4,54* 8,25* 3,00* 4,95*
Ácido Glutámico (Glu) 6,39 11,63 4,00 6,98
Alanina (Ala) 1,55 2,81 0,93 2,00
Arginina (Arg) 3,36 6,11 2,02 3,67
Fenilalanina (Phe) 1,07 1,95 0,64 1,17
Glicina (Gly) 3,04 5,53 2,00 3,00
43
Continuación tabla 11.
Histidina (His) 2,55 4,64 1,53 2,78
Isoleucina (Ile) 1,75 3,18 1,05 1,91
Leucina (Leu) 2,26 4,11 1,00 2,50
Lisina (Lys) 1,09 1,98 0,65 1,88
Metionina (Met) 1,84 3,35 1,00 2,01
Prolina (Pro) 5,72 10,40 3,00 6,24
Serina (Ser) 1,88 3,43 1,00 2,00
Tirosina (Tyr) 0,99 1,80 0,59 1,08
Treonina (Thr) 2,20 4,00 1,32 2,40
Triptófano (Trp) 0,40 0,73 0,24 0,44
Valina (Val) 3,79 6,89 2,00 4,13
* Ensayo validado en Récor Dental S.A.
Figura 17 .Diagrama comparativo entre la Hidrólisis Ácida y Enzimática de los
Aminoácidos obtenidos en la yema de huevo.
4,54
6,39
1,55
3,36
1,07
3,042,55
1,752,26
1,091,84
5,72
1,880,99
2,20
0,40
0
1
2
3
4
5
6
7
Aminoácidos obtenidos de la yema mediante Hidrólisis
Ácida y Enzimática
44
Figura 18. Diagrama comparativo entre la Hidrólisis Ácida y Enzimática de los
Aminoácidos obtenidos en la clara de huevo.
3.2.5. Resultado de Balance Masa General y de los Reactores 1-2.
Tabla 12. Balance de Masa General
BALANCE GLOBAL
Reactivos Entrada Salida
Cascara 1230,85 1230,85
Clara 4940,57 -
Yema 2411,92 -
HCl (4%) 48,24 -
Ca (OH)2 (20%) 49,01 -
Lípidos - 793,52
Huevo Líquido - 1715,62
Total 8680,58 8680,58
02468
101214
Aminoácidos obtenidos de la clara mediante Hidrólisis
Ácida y Enzimática
45
Tabla 13. Balance de Masa del Reactor 1 (yema) y Reactor 2 (clara)
HUEVO ENTERO
Balance Reactor 1 (yema) Balance Reactor 2 (clara)
Reactivos Entrada Salida Entrada Salida
Agua 694,632 694,63 2608,6 2608,6
Proteínas 237,33 - 299,39 -
grasa 476,11 476,11 5,92 5,92
CHO 28,94 28,94 23,71 23,71
Otros 10,13 10,13 26,67 26,67
Aminoácidos - 237,33 - 299,39
HCl (4%) 28,94 - 59,28 -
Ca(OH)2 (20%) 29,40 - 60,23 -
CaCl2 - 44,04 - 90,22
H2O - 14,28 - 29,26
Total 1505,5 1505,5 3083,86 3083,86
3.2.6. Espectroscopia Infrarroja por transformada de Fourier del proceso de
hidrólisis ácida y enzimática del Huevo de Gallina
Las pruebas FT-IR se realizaron para la hidrólisis ácida e hidrólisis enzimática tanto para
la clara y yema que presenta el huevo de gallina, en la Figura 19. se muestran los espectros
correspondientes a la clara.
Los espectros FTIR para determinar los grupos funcionales presentes en las muestras, se
analizaron en el rango de número de onda de 4000 cm-1 a 500 cm-1.
46
Figura 19. Espectro FTIR de hidrólisis ácida y enzimática de clara de huevo.
En la figura 19. se muestran los picos de la transmitancia para diferentes longitudes de
onda, el cual se puede evidenciar los diferentes grupos funcionales característicos
presentes en la clara del huevo de gallina tanto para el proceso de hidrólisis ácida como
enzimática. Los diferentes valores de los picos que representan los diferentes grupos
funcionales contenidos en las muestras analizadas se interpreta en la tabla 14.
El análisis realizado en las figuras 19 y 20 se basó de acuerdo al Anexo J. de acuerdo a las
tablas de Espectroscopia Infrarroja, según (Callejas, 2012).
47
Tabla 14. Interpretación de los picos para los espectros de la Figura 19.
Hidrólisis Ácida Hidrólisis Enzimática Interpretación
Aprox.3419 Aprox.3390 Se observa que el pico pertenece
al estiramiento, tensión N-H+ ,
Aprox.2929 Aprox.2944 Se observa un estiramiento de
N-H+.
Aprox.1511 Aprox. 1688 Pico perteneciente al
Estiramiento de COO
Aprox.1085 Aprox.1070 Se observa un estiramiento de
COO.
En la Figura 22. se muestran los espectros correspondientes a la yema, tanto para el
proceso realizado de hidrólisis ácida como enzimática.
Figura 20. Espectro FTIR de hidrólisis ácida y enzimática de yema de huevo.
En la figura 20. Se muestran los picos de la transmitancia para diferentes longitudes de
onda, el cual se puede evidenciar los diferentes grupos funcionales característicos
presentes en la yema de huevo de gallina tanto para el proceso de hidrólisis ácida como
48
enzimática. Los diferentes valores de los picos que representan los diferentes grupos
funcionales contenidos en las muestras analizadas se interpreta en la tabla 15.
Tabla 15. Análisis de los picos en el espectro de la yema de huevo de gallina
Hidrólisis Ácida Hidrólisis Enzimática Interpretación
Aprox.3420 Aprox.3370 Se observa un estiramiento
asimétrico perteneciente a la
de aminas primarias N-H2.
Aprox. 2941 Aprox. 2945 Presencia de estiramiento de
OH con una señal ancha por
puentes de hidrogeno.
Aprox.1733 Aprox. 1743 Presencia de estiramiento del
carbonilo con una señal
intensa COO.
Aprox.1489 Aprox. 1546 Se observa una flexión de
tijera en el cual se evidencia
de aminas primarias NH2.
Aprox. 1113 Aprox. 1070 Se observa la presencia de
amina secundaria con una
intensidad ancha NH+.
De acuerdo a los espectros obtenidos en las figuras 19 y 20, se puede comprobar la
presencia de aminoácidos en cada muestra analizada.
3.3.Análisis Cualitativo mediante Método Electroforesis
La electroforesis en gel de agarosa, fue realizada con la finalidad de tener otra evidencia
de la presencia de aminoácidos en el resultado final de la hidrólisis, para posterior someter
a un ensayo cuantitativo. Es importante señalar que, ya que nuestra finalidad de la
electroforesis fue cualitativa, no se usaron marcadores de peso molecular. En la siguiente
imagen podemos encontrar
de Tabla
49
Figura 21. Resultados de bandas de aminoácidos mediante proceso de electroforesis
(Autor)
En la imagen podemos observar que existen bandas en el gel de agarosa, bandas que se
muestran difuminadas. La posible razón es que los aminoácidos libres o los fragmentos
de proteínas deben unirse a cantidades adecuadas de SDS para que las bandas sean más
claras, pero para nuestro fin cualitativo la presencia de estas bandas es evidencia suficiente
para seguir al análisis cuantitativo por HPLC.
3.4. Análisis Estadístico
Para nuestra investigación se utilizó el programa estadístico STATGRAPHICS,
definiendo el diseño experimental factorial con una sola variable 2k = 22 con una réplica.
Con estas variables definidas se comprobó la cantidad de concentración de proteínas que
presenta la clara y yema y el tiempo de acción de cambio de color que ayuda a determinar
la presencia de proteínas.
50
3.4.1. Resultados del análisis Estadístico de la Concentración Total de Proteínas
Tabla 16.Resultado ANOVA para Concentración por Tiempo
Fuente Suma de
Cuadrado
s
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-
P
Entre grupos 25.2004 1 25.2004 9692.46 0.0001
Intra grupos 0.0052 2 0.0026
Total (Corr.) 25.2056 3
De acuerdo al resultado ANOVA se descompone la varianza de Concentración en
contribuciones debido al factor tiempo. Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor
que 0.05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de
Concentración entre un nivel de Tiempo y otro, con un nivel del 95.0% de confianza.
51
4. SELECCIÓN Y COSTOS DE EQUIPOS DEL PRE-DISEÑO DE UNA
PLANTA DE PRODUCCIÓN DE HUEVO LÍQUIDO.
El pre-diseño de la planta de producción de huevo líquido se realiza bajo el criterio de
obtener un producto con mayor valor nutritivo sobre la base de los resultados obtenidos
en proceso experimental.
4.1. Selección de los equipos principales para la producción de huevo líquido
Para la selección y determinación de costos de los equipos que se utilizará para
implementar la planta de producción de huevo líquido, se realizaron diversos análisis de
costos en empresas con experiencia de ventas de equipo de limpieza, separación,
centrifugación, pasteurización facilitándonos la información y especificaciones técnicas
de cada equipo utilizado.
Las principales características de los equipos a utilizar en la implementación de la planta
de producción de huevo líquido se detallan en el Anexo E.
4.1.1. Selección del túnel de limpieza.
Para llevar a cabo la limpieza y desinfección de los huevos de gallina se seleccionó un
túnel de limpieza de alta presión con las características requeridas en la industria de
alimentos, esta máquina es de acero inoxidable de acero con una longitud de 4880nm, un
ancho 1610mm y con una altura de 1720 mm.
4.1.2. Selección de quebrador y separador de clara y yema.
Para la selección de este equipo se analizó las especificaciones detalladas en el catálogo,
presentando características requeridas en la industria alimenticia. Este equipo simula la
rotura artificial de los huevos entregados a la estación de huevos rotos, es la encargada de
empujar la cascara de huevo a través de una hoja especial para permitir que el huevo fluya,
el líquido de huevo se transporta al dispositivo de separación a través de la bandeja y el
tanque de desviación. Este equipo es de acero inoxidable 304 con una longitud de 1750
mm, un ancho 1150 y con una altura de 1050 mm.
52
4.1.3. Selección de Reactor
Se seleccionó un reactor tipo batch con agitador que cumple las especificaciones para
llevarse a cabo la hidrólisis ácida ya que este equipo permite que las proteínas se
desintegren en condiciones óptimas y convierte las proteínas con un mejor rendimiento.
Este equipo está hecho de acero inoxidable SUS304 o 316, presenta una chaqueta que se
utiliza para calentar unida a una capa de preservación de calor externa.
4.1.4. Selección de centrifuga
Se selección una centrifuga que tiene como función separar las grasas y recuperación de
proteínas presentes en la industria alimenticia. La centrifuga es de acero inoxidable, sus
dimensiones son 2000 mm de largo, 1200 mm de ancho y 1800 mm de alto. Esta centrifuga
tiene una velocidad de 4000 a 10000 rpm.
4.1.5. Selección de un tanque homogeneizador
Se seleccionó este equipo ya que es adecuado para mezclar y homogeneizar todo tipo de
líquidos viscosos, y presenta las características necesarias para la industria de alimentos.
El tanque es de inoxidable grado 304 0316, este equipo presenta una apertura rápida para
una fácil limpieza, su capacidad de carga es de 100000L/h.
4.1.6. Selección de intercambiador de placas
Este equipo está diseñado de BLS de acero inoxidable 304, específicamente utilizado para
transferir calor en los procesamientos de alimentos, presenta una capacidad de 50L a
10000L, con una longitud 600 mm, con un ancho de 700 mm y 800 de alto.
4.1.7. Selección de proceso de pasteurización
Esta máquina es de uso principal para la pasteurización líquida del huevo, está hecha de
acero inoxidable 1.304 con un grosor 2mm, presenta controladores de temperatura de
esterilización, velocidad que se ajusta según los requisitos del proceso para la producción
de pasteurización liquida de huevos. Presenta un control fiable y seguro de efecto
bactericida. Sus dimensiones son 1900 mm de largo, 800 de ancho y 1900mm de alto,
cumpliendo así las especificaciones necesarias en la industria alimenticia.
53
4.1.8. Tanque de almacenamiento
Este tanque de almacenamiento está diseñado con el estándar 3A, ampliamente es
utilizado para transferir medios viscosos en las industrias de procesamientos de alimentos,
presenta una chaqueta simple, tiene una capacidad de 50L- 10000 L.
4.1.9. Selección de proceso de CIP para alimentos.
Se seleccionó un proceso CIP específicamente para procesos de alimentos. El tamaño del
tanque es de 300L-1000L. Todos los tanques de nivel de líquido del sistema CIP toman la
alarma automática, se incrementará el ácido concentrado y el álcali manualmente cuando
se reduzca la concentración del líquido de limpieza.
4.2. Capacidad de la planta
La capacidad de esta unidad de producción de huevo líquido pasteurizado es de 300 L/h
por lo que se dice que en 1 litro de huevo líquido corresponde a 18 huevos enteros, siendo
una producción de 9000 litros por día.
4.3. Descripción detallada del proceso.
El pre-diseño con mejoras en el proceso de producción de huevo líquido a partir de la
implementación del proceso de hidrólisis ácida es esquematizado a través de las
operaciones unitarias establecidas en el diagrama PI&D. Ver en Anexos.
El proceso inicia con la clasificadora de huevos, se procede a la eliminación de todos los
huevos no aptos para el proceso (Pla Soler, 2002). El huevo se almacena a una temperatura
inferior a 4°C debido a que es la óptima temperatura para que no exista ningún tipo de
crecimiento de agentes patógenos. A continuación, pasan a un túnel de limpieza donde se
realiza el proceso de desinfección donde se utiliza una solución 0.5 % de hipoclorito de
sodio para reducir la carga bacteriana hasta niveles que no influyan negativamente en el
ovoproducto final.
54
Una vez obtenido el producto inocuo de bacterias pasa a un proceso de quebrado que
consiste en la separación de yema, clara y la cascara, la máquina tiene la capacidad de
quebrar 9000 huevos por hora. A este sistema se tiene acoplado un panel de flujo que tiene
la finalidad de ayudar a mejor la gestión del flujo de aire.
La yema y clara separadas se alimentan junto con una corriente de agua dos reactores. El
proceso es semi-batch y ocurre en un reactor enchaquetado con sistema de agitación. La
reacción ácida se realiza mediante la adición de ácido clorhídrico al 4% controlando que
la temperatura permanezca constante a 110°C, se adiciona una adiciona una solución de
Ca (OH)2 hasta alcanzar el pH 7. Del proceso de hidrólisis ácida se obtienen dos corrientes
para la yema hidrolizada, la primera es dirigida a un proceso de centrifugación donde
ocurre la separación de las grasas insaturadas mientras en la segunda se obtiene la proteína
con alto contenido de aminoácidos.
Luego de realizarse la hidrólisis ácida tanto para la yema como la clara son alimentadas a
un tanque de homogenización, en este proceso se trabajó a una presión de 150 bares con
una temperatura de 4°C. Una vez realizado el proceso de homogenización pasan al proceso
de pasteurización en el que se controla el tiempo y temperatura para lograr la destrucción
de las distintas cepas de Salmonella. En este proceso se utiliza un intercambiador de calor
de placas y un proceso de enfriamiento de ciclo cerrado provocando un choque término,
para la obtención de un producto de calidad, la temperatura debe estar entre 64-65°C
durante 2-4 minutos lo que garantiza la eliminación de los microorganismos patógenos,
así como el mantenimiento de las características físico-químicas y tecnológicas del
producto.
Finalmente ocurre el proceso de envasado/etiquetado/ almacenamiento. El producto se
deberá realizar en envases de 1 litro, 2 litros y 1 galón. Es crucial para evitar alguna
contaminación cruzada. Una vez el producto terminado se lo debe almacenar en un cuarto
frío de 4 °C.
Todo el proceso tiene una etapa de CIP de limpieza de todos los equipos, tuberías y con
drenaje adecuado sin puntos muertos para que no exista acumulación de agua residual que
pueda dar lugar a la proliferación de bacterias en el proceso.
55
4.4. Listado de Equipos
El listado de equipos que forman parte de todos los procesos que se encuentran en la
planta se detallan a continuación:
Tabla 17. Listado de Equipos
4.5. Estimación de costos para la implementación de la planta de producción de
huevo líquido.
En esta sección se describe el análisis de costos de equipos, accesorios, materia prima,
mano de obra para llevar acabo la implementación, de igual manera se detalla los costos
fijos, costos variables de producción.
Simbología Maquinaria y Equipos CANTIDAD
T-1 Túnel de limpieza 1
C-2, H-3
Quebrador/Separador de yema-
clara 1
R-4, R-5 Reactor Batch 1 y 2 2
H-6, H-7
Separador centrifugo y
decantador 1
E-8 Intercambiador de placas 1
X-9,G-10,E-11 Proceso de pasteurización 1
M-12 Homogeneizador 1
V-13 válvula de estrangulación 1
P-14,P-15,P-16 bomba 3
T-18,T-19,T-16 tanque de almacenamiento 2
T-19,T-20,T-
21,T-22,T-24,T-
25,T,26 Proceso CIP 1
56
Tabla 18. Costos de equipos de la planta de producción de huevo líquido
Simbología Maquinaria y Equipos CANTIDAD VALOR
UNI. TOTAL
T-1 Túnel de limpieza 1 6000 6000
C-2, H-3
Quebrador/Separador de
yema-clara 1 6500 6500
R-4, R-5 Reactor Batch 1 y 2 2 1500 3000
H-6, H-7
Separador centrifugo y
decantador 1 1500 1500
E-8 Intercambiador de placas 1 600 600
X-9,G-10,E-11 Proceso de pasteurización 1 7000 7000
M-12 Homogeneizador 1 800 800
V-13 válvula de estrangulación 1 20 20
P-14,P-15,P-16 bomba 3 300 900
T-18,T-19,T-16
tanque de
almacenamiento 2 2000 4000
T-19,T-20,T-
21,T-22,T-24,T-
25,T,26 Proceso CIP 1 9000 9000
Total 39320
Tabla 19. Costos de la instalación de la planta de producción de huevo líquido
Descripción
Unidad de
Medida Cantidad
Jornada de trabajo
diario horas 8
Mano de obra
Número de
personas 2
Tiempo de montaje días 10
horas 80 Costo
unitario(USD)
Total
(USD)
Costo unitario
USD/hora
persona 160 7 1120
Total 1120
57
4.5.1. Costo de la materia prima.
El valor de la cubeta de huevo al mayor es de $ 2,90, cada cubeta contiene 30 huevos.
(Ovomas, 2019).
Tabla 20. Costo de materia prima (Ovomas, 2019)
Cubeta Cantidad Precio
1 30 2.9
Además de los costos de los equipos, en el estudio económico se debe considerar también
los costos fijos, costos variables de producción, como se detallan a continuación:
Tabla 21. Costos variables de producción
Descripción Unidad
Medida Cantidad
Costo
unitario
USD/cubeta
Total
(USD/mes)
Total
(USD/año)
Materia prima
(huevos) cubeta 435
2.9 1261.5 15138
Descripción
Costo
Unitario
USD/kWh
Energía
Eléctrica KWh/mes 1620 0.04 76.9 921,6
Descripción
Unidad
medida
Agua Potable m3/mes 100 70 0.72 50.4
Descripción Unidad de
Medida Cantidad
Costo
unitario
Envases y
tapas litros 4000
$
0.95 3800 45600
Etiquetas Unidades 4000 0.2 800 9600
Total 9030.24
58
Tabla 22. Costos fijos de producción
Descripción
Unidad
Medida Cantidad
Costo
Unitario USD
Total
(USD/mes)
Total
(USD/año)
Arriendo Unidad 1 500 500 6000
Coordinador de
producción
número de
personas 1 800 800 9600
Operarios
número de
personas 3 394 1182 14184
Total 29784
Se realizará un mantenimiento de los equipos cada 3 meses, solo se requerirá un técnico
especializado en los equipos de la producción de huevo líquido.
Tabla 23. Costo de Mantenimiento
Descripción Unidad
Medida Cantidad
Costo
Unitario USD
Total
(USD/6)
Total
(USD/año)
Mantenimiento
número de
personas 1 394 1182 1182
Total 1182
4.5.2. Precio de venta del huevo liquido pasteurizado.
A continuación, se detallan los ingresos por ventas en un año de producción teniendo en
cuenta el precio en dólares por litro de producción.
Tabla 24. Venta del producto al año
Descripción Cantidad(
L/mes)
Precio
venta
(USD)
Total
(USD/mes) Total (USD/año)
Huevo líquido 9000 4.5 40500
486000
59
4.5.3. Costos Totales
Tabla 25. Costos totales de la implementación y producción
Descripción Costos
Costos de equipos 95320
Costo de Instalación 1120
Costos variables de
producción 903024
Costos fijos de
producción 29784
Costos de mantenimiento 1182
4.5.4. Cálculo del Valor actual neto (VAN) y la tasa de Retorno (TIR)
Tabla 26. Datos para el flujo de caja
Detalle/Año 1 2 3 4 5 6 Precio venta $/u $ 4.50 $ 4.73 $ 4.96 $ 5.21 $ 5.47 $ 5.74
Margen unitario
$/u $ 1.60 $ 1.68 $ 1.76 $ 1.85 $ 1.94 $ 2.04
Costo Variable
Unitario $ 2.90 $ 3.05 $ 3.20 $ 3.36 $ 3.52 $ 3.70
Unidades al año 30000 30200 30300 30400 30500 30600
Tabla 27. Depreciación de Equipos
No. ELEMENTOS DE
ACTIVO
Años de vida
útil Costo Depreciación
1 Túnel de limpieza 5 $ 12,000.00 $ 2,400.00
2
Quebrador/Separador
de yema-clara 5 $ 6,500.00 $ 1,300.00
3 Reactor Batch 1 y 2 5 $ 1,500.00 $ 300.00
4
Separador centrifugo y
decantador 5 $ 40,000.00 $ 8,000.00
5
Intercambiador de
placas 5 $ 600.00 $ 120.00
6
Proceso de
pasteurización 5 $ 12,000.00 $ 2,400.00
7 Homogeneizador 5 $ 800.00 $ 160.00
8
válvula de
estrangulación 5 $ 20.00 $ 4.00
9 bomba 5 $ 300.00 $ 60.00
10
tanque de
almacenamiento 5 $ 2,500.00 $ 500.00
60
Continuación de tabla 27.
11 Proceso CIP 5 $ 12,000.00 $ 2400
TOTAL $ 17,644.00
Tabla 28. Préstamo para la implementación de la planta de producción de huevo
líquido
Costo Años Interés
Préstamo 1 $ 45,000.00 10 5%
Con los datos obtenidos se procede a realizar el flujo de caja para 6 años y se realiza el
cálculo del TIR y el VAN.
61
Tabla 29. Flujo de Caja, TIR, VAN
No. DETALLE AÑOS 0 1 2 3 4 5 6
1 Ventas -$ 135,000.00$ 142,695.00$ 150,325.88$ 158,363.10$ 166,828.23$ 175,743.97$
2 Costos de producción -$ (87,000.00)$ (91,959.00)$ (96,876.68)$ (102,056.22)$ (107,511.53)$ #########
3 UTILIDAD BRUTA -$ 48,000.00$ 50,736.00$ 53,449.20$ 56,306.88$ 59,316.71$ 62,486.75$
4 Préstamo 1-Pago Interés -$ (3,610.92)$ (3,610.92)$ (3,610.92)$ (3,610.92)$ (3,610.92)$
5 Costos Fijos -$ (24,696.00)$ (25,930.80)$ (27,227.34)$ (28,588.71)$ (30,018.14)$ (31,519.05)$
6 Costos Mantenimiento -$ (1,182.00)$ (1,241.10)$ (1,303.16)$ (1,368.31)$ (1,436.73)$ (1,508.56)$
7 Costos Variables -$ (9,030.24)$ (9,481.75)$ (9,955.84)$ (10,453.63)$ (10,976.31)$ (11,525.13)$
8 Amortización -$ (83.00)$ (83.00)$ (83.00)$ (83.00)$ (83.00)$ (83.00)$
9 Depreciación -$ (17,644.00)$ (60.00)$ (60.00)$ (60.00)$ (60.00)$ (60.00)$
10 UTILIDAD OPERATIVA -$ (8,246.16)$ 10,328.43$ 11,208.95$ 12,142.31$ 13,131.60$ 17,791.00$
11Impuestos 25% -$ (1,649.23)$ 2,582.11$ 2,802.24$ 3,035.58$ 3,282.90$ 4,447.75$
12 INGRESO SIN NIVELAR -$ (9,895.39)$ 12,910.54$ 14,011.19$ 15,177.89$ 16,414.51$ 22,238.75$
13Amortización -$ 83.00$ 83.00$ 83.00$ 83.00$ 83.00$
14 Depreciación -$ 17,644.00$ 60.00$ 60.00$ 60.00$ 60.00$ 60.00$
15 Costo inicial de Inversión (30,000.00)$ -$ -$ -$ -$ -$
17FLUJO DE CAJA NETO (30,000.00)$ (22,168.39)$ (9,114.85)$ 5,039.34$ 20,360.23$ 36,917.73$ 59,216.49$
18 PAY BACK (años) 3.2
19 VAN $ 24,912.95
20 TIR 36.01%
62
5. DISCUSIÓN
Cuantificación de proteínas
Previo al análisis de la reacción de hidrólisis ácida se procedió a la cuantificación de
proteínas por colorimetría en el que se utilizó el kit Erba lachema SRO, el mismo que se
encuentra en el Anexo A. Este método se relaciona con en el método de Biuret descrito
por (Gutiérrez, 2005). Este método permitió la lectura de los valores de absorbancia, en el
que permitió obtener la concentración de proteína que presenta un huevo de gallina, en
este proceso se evidencio diferentes factores que afectaron a la medición de las
absorbancias, como fue la presencia de impurezas en el equipo de espectrofotometría UV-
Vis al momento de medir dichos datos, de acuerdo al Kit Erba lacherma SRO las muestras
debían ser sometidas a la oscuridad por un tiempo determinado en el que también fue un
factor que afecto a la medición, debido a los errores presentados se pudo obtener
cuantificar de la mejor manera la concentración total de las proteínas.
Luego de conocer la concentración total de proteínas de las muestras como se indica en la
tabla 6, se procedió con el método de hidrólisis ácida y enzimática, en el que permitió
identificar la presencia de aminoácidos libres. En las hidrólisis es determinante la
temperatura a la que se desarrolla está reacción puesto que las proteínas sufren
desnaturalización desde los 65 °C en adelante, en los ensayos se aceleró la liberación de
los aminoácidos por medio de la adición de soluciones ácidas y enzimáticas. En este
proceso para obtener un alto valor nutritivo como es la cantidad de aminoácidos libres es
necesario controlar temperatura, tiempo de reacción, pH y también la pureza de los
reactivos en los cuales se va a realizar la hidrólisis. Posterior a la hidrólisis es necesario
comprobar la presencia de aminoácidos para la cual se realizó el análisis en el
Espectrómetro IR (FTIR) y también por electroforesis.
63
Espectroscopia de Infrarrojo por transformada de Fourier
En el método FTIR se utiliza de la mano de la cuantificación de proteínas. En el espectro
infrarrojo presentado en la figura 19-20, se presentan bandas de Transmitancia
características de tipo amina primaria, secundaria y ácidos carboxílicos. Se observó que
el pico con menos transmitancia está en el rango 3600 a 3200 cm-1 que corresponde al
estiramiento de aminas primarias y 1680 a 1500 cm-1 corresponde al estiramiento de grupo
carbonilo relacionado al contenido de aminoácidos.
Según (Callejas, 2012) el rango comprendido entre 3300 a 2600 corresponde al
estiramiento de NH3, se observa en la figura 21, que la yema y clara que fueron sometidas
al tratamiento de hidrólisis ácida tiene menor transmitancia lo representa un mayor
contenido de absorbancia y por lo tanto mayor concentración de NH3 que la yema.
Además, se observa que los picos correspondientes a 1680 cm-1 que corresponden al grupo
carbonilo como lo menciona (Callejas, 2012) pueden tener relación con el grupo
carboxilato y se puede observar que en el caso de la hidrólisis el porcentaje de
transmitancia aumenta por lo tanto existe menor concentración de estos grupos
funcionales.
Electroforesis
En este tipo de análisis no se obtuvo los resultados esperados debido a que no se utilizó el
método adecuado, el cual era la determinación de sus pesos moleculares por electroforesis
por este motivo se recurrió a la cuantificación del perfil de aminoácidos mediante HPLC.
Al no ser posible la identificación cuantitativa de las proteínas presentes en las muestras,
se puede observar en la figura 23. la presencia de bandas correspondientes a los segmentos
de proteínas, esto quiere decir que si existió la ruptura de la triple hélice debido al proceso
de hidrólisis. Según See, Olley y Jackowski (1985), para obtener una correcta
determinación de pesos moleculares a través de electroforesis, se requiere que las
proteínas se enlacen a cantidades adecuadas de sodio dodecil sulfato (SDS) ya que la
cantidad SDS unido a las proteínas depende de la fuerza iónica presentes en la solución
64
SDS-proteína, por lo que cuanto mayor sea la concentración de sal en la muestra, más
lenta es la migración de las proteínas, dando así lugar a bandas difusas.
Cuantificación HPLC
Mediante análisis por HPLC se pudo finalmente cuantificar el perfil de aminoácidos
presentes en el huevo de gallina como se muestra en la tabla 10.
Debido al perfil de aminoácidos obtenidos se realiza la propuesta de una planta de
producción de huevo líquido, para así obtener un producto de mayor valor nutritivo y
gracias al proceso de pasteurización obtener un producto libre de agentes patógenos y de
calidad según lo manifiesta la norma NTE INEN 2983.
Pre-diseño de la planta de producción de huevo líquido.
La propuesta de pre-diseño de una planta de producción de huevo líquido a partir del
estudio del perfil de aminoácidos, es un proceso alternativo con mejoras en el producto
final obteniendo un producto inocuo de agentes patógenos y con un alto valor nutritivo. La
dificultad que se puede presentar en este proceso de pasteurización para los ovoproductos
radica en que el intervalo de tiempo/temperatura en que se puede actuar es muy corto. Se
dice que si se disminuye la intensidad del tratamiento existe el riesgo de que sobrevivan
Salmonellas; si aumenta, el producto tiende a coagular es por ese motivo que, como norma
general, en el proceso de pasteurización, el diferencial entre el agua de calentamiento y el
producto debe ser menos de 0.5°C para así evitar coagulaciones.
Otro aspecto importante que se debe considerar en este proceso es la desnaturalización de
proteínas que existe en mayor o menor cantidad. Esto conlleva un incremento en la
viscosidad de la solución que incrementara mucho al enfriarse, este fenómeno se debe tener
en cuenta en el intercambiador de placas para no producir su obstrucción. Según
(Monferrer y Villalta, 1994) para evitar todos los factores que pueden afectar al producto
final se recomienda controlar la presión y detectar anomalías mediante la activación de
alarmas.
65
6. CONCLUSIONES
Se obtuvieron aminoácidos libres identificados en la clara y yema de huevo de gallina
mediante el proceso de hidrólisis ácida y enzimática, controlando factores como
temperatura 110°C para hidrólisis ácida y 37°C para la hidrólisis enzimática, factores
necesarios para romper los enlaces peptídicos, basado en el método de determinación de
aminoácidos (Manley et al.,1981).
Se cuantificó la cantidad de aminoácidos por medio de la técnica HPLC (Cromatografía
Líquida de alto rendimiento) tanto para yema y clara de huevo que fueron tratados por
hidrólisis ácida y enzimática, como se evidencia en la tabla 10, existiendo en los dos
procesos aplicados un mayor porcentaje de ácido glutámico.
Se comparó la eficacia de obtención de aminoácidos libres por medio de dos métodos de
hidrólisis, de acuerdo a los resultados obtenidos de cuantificación por HPLC se puede
concluir que la hidrólisis enzimática permite obtener mayor cantidad de aminoácidos en
comparación al hidrólisis ácida. Por ejemplo, en el aminoácido de la Lisina, se obtuvo
una concentración de 1,09 mg/ml mediante la hidrólisis enzimática en yema mientras que
en la hidrólisis ácida se obtuvo 0,654 mg/ml.
El método FTIR es eficiente ya que el análisis muestra la presencia de una banda
característica de aminas en el rango 3300 a 2600 cm-1, debido a que existe un estiramiento
N-H+ en el que los iones absorben a la izquierda de este rango como se observa en las
figuras 19-20.
66
La implementación del método de hidrólisis ácida en una planta de producción de huevo
líquido, permite la generación de un producto terminado del alto contenido alimenticio,
al permitir una fácil asimilación de aminoácidos en el organismo
En la planta de producción de huevo líquido se debe también eliminar las grasas en una
etapa posterior a la hidrólisis ácida de la yema, como se puede ver en la tabla 12 un alto
contenido de grasa representando 793,4 g.
El pre- diseño propuesto de la planta de producción de huevo líquido es rentable como
lo demuestra los resultados obtenidos del TIR de 36,01 % y el VAN de $ 24912,95 estos
resultados se refieren a la factibilidad de la planta y a la recuperación de la inversión del
inicio de $36917,73 al quinto año.
67
7. RECOMENDACIONES
La obtención de aminoácidos a partir del huevo de gallina debería ser considerado por la
industria como un potencial producto intermedio puesto que los aminoácidos están
presentes en formulaciones farmacéuticas, productos alimenticios, productos cosméticos,
industria biológica, etc. Por lo tanto, el trabajo realizado es un punto de partida para el
desarrollo de productos a base de aminoácidos obtenidos en la industria alimenticia.
Se recomienda utilizar en el método de electroforesis marcadores de pesos molecular para
así poder determinar el peso molecular de las bandas de aminoácidos presentes en nuestra
muestra, estas bandas se presentan en el rango de 30 y 100 kDa.
Es recomendable utilizar otra forma de secado del producto final hidrolizado porque
existieron como puede ser utilizar un liofilizador para evitar perder cantidades
significativas de aminoácidos.
Sería importante emprender este tipo de producción en Ecuador, ya que existe factibilidad
para la producción de huevos líquidos pasteurizados en el mercado.
Debido a la presencia de Salmonella en el huevo de gallina existe un riesgo para la salud
humana, por ello es obligatorio según la norma NTE INEN 2983. En esta norma se detalla
el proceso de pasteurización, con el objeto de obtener un producto inocuo de bacterias.
68
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72
ANEXOS
73
ANEXO A. Cuantificación de Proteína Total
74
ANEXO B. Reporte Fotográfico para la determinación del perfil de aminoácidos
Figura 22. Determinación de parámetros físicos del huevo
Figura 23. Muestras separadas
75
Figura 24. Análisis de colorimetría con reactivo (Erba)
Figura 25. Identificación de proteínas mediante colorimetría
76
Figura 26. Adición de HCl 4% a cada muestra.
Figura 27.Muestras Hidrolizadas a 110°C
77
Figura 28. Neutralización con Ca(OH)2 y secado a 37°C
Figura 29. Muestras obtenidas mediante el proceso de hidrólisis ácida y enzimática.
78
Figura 30. Separación de muestras y desnaturalización de proteínas
Figura 31. Calentamiento a baño maría y centrifugado
79
Figura 32. Obtención de muestras mediante el proceso de hidrólisis enzimática
Figura 33. Equipo de Electroforesis (Facultad de Ciencias Química, UCE)
80
ANEXO C. Mediciones de Absorbancias de las muestras por Espectrofotometría UV-Vis
Muestra Tiempo, min Mediciones Yema Clara Estandar Blanco Promedio total yema (g/dl) Promedio de Clara (g/dl)
1 0.0209 0.0163 0.0256 0.0194
2 0.0209 0.0163 0.0256 0.0194
3 0.0209 0.0163 0.0256 0.0194
1 0.0325 0.0191 0.0185 0.0174
2 0.0325 0.0191 0.0186 0.0175
3 0.0325 0.0192 0.0187 0.0175
1 0.0201 0.017 0.0256 0.0194
2 0.0201 0.017 0.0256 0.0194
3 0.0201 0.017 0.0256 0.0194
1 0.0327 0.0212 0.0185 0.0171
2 0.0327 0.0212 0.0186 0.0173
3 0.0327 0.0212 0.0187 0.0174
1 0.0229 0.0165 0.0256 0.0194
2 0.0229 0.0165 0.0256 0.0194
3 0.0229 0.0165 0.0256 0.0194
1 0.031 0.0191 0.0185 0.0174
2 0.031 0.0191 0.0186 0.0175
3 0.031 0.0192 0.0187 0.0175
1 0.0228 0.0185 0.0256 0.0194
2 0.0228 0.0185 0.0256 0.0194
3 0.0228 0.0185 0.0256 0.0194
1 0.03 0.0192 0.0185 0.0174
2 0.03 0.0192 0.0186 0.0175
3 0.03 0.0192 0.0187 0.0175
1 0.0202 0.0165 0.0256 0.0194
2 0.0202 0.0165 0.0256 0.0194
3 0.0202 0.0165 0.0256 0.0194
1 0.0321 0.0204 0.0185 0.0174
2 0.0321 0.0204 0.0186 0.0175
3 0.0321 0.0204 0.0187 0.0175
1 0.0233 0.0169 0.0256 0.0194
2 0.0233 0.0169 0.0256 0.0194
3 0.0233 0.0169 0.0256 0.0194
1 0.0384 0.0208 0.0185 0.0174
2 0.0384 0.0208 0.0186 0.0175
3 0.0384 0.0208 0.0187 0.0175
1 0.0208 0.0181 0.0256 0.0194
2 0.0208 0.0181 0.0256 0.0194
3 0.0208 0.0181 0.0256 0.0194
1 0.0351 0.0247 0.0185 0.0175
2 0.0351 0.0247 0.0186 0.0175
3 0.0351 0.0247 0.0187 0.0175
1 0.0165 0.0159 0.0256 0.0194
2 0.0165 0.0159 0.0256 0.0194
3 0.0165 0.0159 0.0256 0.0194
1 0.0355 0.0213 0.0185 0.0174
2 0.0355 0.0213 0.0186 0.0175
3 0.0355 0.0213 0.0187 0.0175
0.0209375
0.0334125
0.017022727
0.020733333
10
3
10
30
10
30
2
30
1
4
10
30
5
10
30
6
10
30
8
10
30
7
10
30
81
ANEXO D. Tablas de Espectroscopia Infrarroja de Ácidos Carboxílicos y Aminas
82
ANEXO E. Especificaciones técnicas de los equipos de la planta de producción de huevo
líquido
Tabla 30. Datos del Túnel de plástico caja de limpieza lavadora (Alibaba, 2019)
Tipo de máquina Limpiadora de alta presión
Material De plástico
Capacidad 500 a 1000 pcs/h
Potencia 72 KW
Dimension (L*W*H) 4880(L)*1610(W)*1720(H)
Combustible Eléctrico
Rango de temperatura Max 90°C
El ancho máximo de
la caja puede
limpiarse
500mm
La altura máxima de
la caja puede
limpiarse
350mm
83
Tabla 31.Datos comercial de huevo blanco y separador de yema de huevo /máquina de
separación de huevo/interruptor (Alibaba, 2019)
Tipo de: Huevo maquina de
procesamiento
Materia prima Huevos
Material Acero inoxidable 304
Energía(W) 500
Dimension (L*W*H) 1750(L)*1500(W)*1050(H)
Tensión de: 220v
Peso 180kg, 130kg
Capacidad 6000pcs/h
Función Separador de clara de
huevos y yema
84
Tabla 32. Datos reactor químico (Alibaba, 2019)
Tipo de: Reactor de tanque, hervidor
de reaccion
Marca L&B
Material SS304…SS316
Energía(W) 0,75-75KW
Dimensión (L*W*H) 1100(L)*1100(W)*1500(H)
Voltaje 220 V-240 V, 380V-415 V,
110V
Peso 150kg, 1500kg
Capacidad 50-100000L
Método de calefacción Vapor de gas eléctrico
85
Tabla 33. Centrifuga (Alibaba, 2019)
Tipo de: Centrifujo
Marca Huading awards
Velocidad 4000 – 10000 rpm
Energia(W) 4-90KW
Dimension (L*W*H) 2000(L)*1200(W)*1800(H)
Voltaje 110 V-415 V
Peso del tazon 50kg, 1500kg
Peso 1000-5000 kg
Volumen 8-300L
Solidos de espacio 2-50L
Presión de entrada 0-0,1 Mpa
Líquido de presión de
salida
0,2-0,6 Mpa
86
Tabla 34. Homogeneizador (Alibaba, 2019)
Tipo de: homogeneizador
Marca BLS
Velocidad 0-2800 rpm
Energia(W) 7,5
Material Acero inoxidable
304/316
Voltaje 110- 480 V
Capacidad de carga 10000 l/h
Peso 500 kg
Max carga de
volumen
500
87
Tabla 35. Placa intercambiadora de calor de placas (Alibaba, 2019)
Caudal del líquido 200m3/h-2300m3/h
Marca BLS
Dimension L*W*H 600*700*800
Especificación 0,5-200m2
Material Acero inoxidable
304/316
Voltaje 110- 480 V
Maxima presión 10 bar
Peso 200 kg
Tipo Intercambiador de calor
de acero inoxidable
88
Tabla 36. Máquina de pasteurización (Alibaba, 2019)
Función Agua de refrigeración
pasteurizacion de leche
Marca MS
Dimensión L*W*H 1900*800*1900
Capacidad 100L/lote 1000L/lote
Material 304 de acero inoxidable
Voltaje 220/380V
Energía 9Kw
Peso 320 kg
89
Tabla 37. Tanque de almacenamiento (Alibaba, 2019)
Marca ZH
Dimensión L*W*H 1000*1000*2000
Capacidad 100L/lote 5000L/lote
Material 304 o 316
Voltaje 220/380V
Energía 9Kw
Peso 50-5000 kg
Max, la presión de
tanque
3 bar para tanque de
almacenamiento de
agua de acero
inoxidable
90
Tabla 38. Sistema CIP para alimentos
Tamaño del tanque 300L-1000L
CIP tipo del tanque Tanque de reciclaje de agua de tanque de
tankacid de alcali
Limpieza recicla Circuitdouble circuitstres circuito cuatro
circuitos
Automática completa
Control automático de fliujo
Control automático de temperatura
Compensar automaticamente el nivel de líquido
CIP
Compensar automaticamente el concentrado del
liquido
Transferencia automática de líquido de limpieza
De alarma de auto
Semi- Automática de
control
Control automático de temperatura
Control eléctrico con funcionamiento manual de
otros materiales
Operación manual Funcionamiento manual del proceso de limpieza
91
ANEXO F. Protocolo para el análisis de proteínas mediante Electroforesis según INS.
Electroforesis en gel de agarosa para determinación de proteínas.
1. Preparación del gel de agarosa
1.1. Pesar 1,5g de cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentración deseada
3% en función del volumen de gel aproximadamente de 10x10cm ajustando a 50mL con
buffer TBE.
1.2. Calentar la mezcla en un horno de microondas 1min30s hasta que se observe que toda
la agarosa se ha fundido.
1.3. Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50 °C.
1.4. Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a hacer el
gel sellando los bordes colocándolo en el dispositivo previsto para ello, y colocando el
peine en la posición deseada.
1.5. Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado y dejar que
solidifique durante al menos 30min.
1.6. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar el molde
con el gel en la cámara de electroforesis.
1.7. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las muestras.
Nota:
1. Lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada estéril.
2. Preparación del Buffer (TBE 5x) a (TBE 0,5x)
2.1. Preparar Tris base, 54 g; ácido bórico, 27.5 g; 0,5 M EDTA pH 8, 20 ml. Y ajustar a
1 litro con agua destilada.
2.2. Posteriormente, tomar del buffer de electroforesis anterior 100mL y ajustar de nuevo
a 1 litro con agua destilada hasta tener un (TBE 0,5x) añadiendo luego en la cámara
de electroforesis que cubra el gel unos 3-5mm.
Nota:
92
1. El EDTA debe estar preparado previamente: Se añade al agua destilada o desionizada
(un volumen 20% inferior al volumen final deseado) la cantidad adecuada de EDTA
para obtener una concentración final de 0,5 M. Se ajusta el pH con NaOH hasta que
el EDTA se disuelva y llegue la solución a un pH de 8. Se ajusta el volumen, se
esteriliza y se conserva a temperatura ambiente.
2. El TBE se diluye con agua destilada antes de cada electroforesis para lograr la
concentración de uso de 0,5x.
3. Preparación de las muestras y estándares
3.1. Mezclar las muestras de orina o estándar con el buffer de carga (6x): 0,025% azul de
bromofenol, 25 mg; 40% sacarosa, 4 g; o 3% glicerol, 3mL y ajustar a 10 mL con
agua destilada, en proporción 1:2 (50µL de la muestra y 100 µL de buffer).
3.2. Someter las muestras a temperatura de 65°C durante 3min y enfriar en a temperatura
ambiente 20-25°C hasta el proceso de electroforesis.
3.3. El volumen total estará determinado por el tamaño de los pocillos, habitualmente
10µL.
Nota:
1. Antes de cargar la muestra de orina con el buffer, previamente se debe agitarse bien.
2. Almacene los buffers bajo refrigeración para evitar el crecimiento de hongos entre 2
y 8°C.
3. Carga de las muestras y estándares para corrida del gel.
3.1. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon.
3.2. Al momento de sumergir las muestras en la cámara de electroforesis, asegurarse que
los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.
3.3. Conectar los cables a la fuente alimentación, uno positivo y otro negativo
(frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que serán
conectados a una fuente poder y aplicando un voltaje de 80V con un valor de corriente
aproximado a 1mA durante 1h30min.
Nota:
1. Debe tenerse en cuenta que los GAG´S migran hacia el cátodo, por lo que debe
disponerse correctamente la orientación del gel y de los cables.
93
2. Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea
azul por el colorante del buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.
3. Correr el gel hasta que el colorante azul de bromofenol esté a una distancia del borde
de aproximadamente un 25% de la longitud total del gel. En ese momento debe
detenerse la electroforesis.
4. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con
desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema
que contiene el gel de agarosa.
5. Enjuague con agua destilada todos los componentes de electroforesis al terminar la
corrida.
6. Reutilice el buffer de electroforesis hasta 6 veces.
4. Tinción del gel y visualización
a. Terminada la electroforesis, la membrana es teñida, para ello se saca el gel de su molde
cuidadosamente y se sumerge en una disolución de 1:10 DMB, o azul de coomasie;
0,25 g en 90 mL de metanol (96%): H2O (v/v 1:1) y 10 mL de ácido acético glacial
y con suave movimiento rotatorio, durante 10 min.
Nota:
1. Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el colorante puede
quedar retenido fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobre tinción
que impediría la visualización de los GAG´S.
2. Filtrar la solución de azul de coomasie a través de un papel Whatman N° 1 para
eliminar los residuos extraños. Antes de usar dejar en reposo por una semana en un
frasco oscuro.
3. Culminado el tiempo de incubación, depositar el colorante en su frasco original.
4. Finalizada la tinción, descartar el decolorante usado y lavar el gel, con agua destilada
2 o 3 veces, luego con una solución de decoloración lenta: 10mL de ácido acético 10%
+ 5mL de metanol + 85mL agua destilada o con una solución de decoloración rápida:
10mL de ácido acético 10% + 50mL de metanol + 40mL agua destilada, durante
40min.
94
Nota:
1. Dejar destiñendo con movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la
solución por una nueva cuantas veces sea necesario.
2. Seguir destiñendo hasta que las bandas de los GAG´S puedan ser apreciadas
claramente.
3. El ácido acético puede ser usado en concentraciones de 5% o 10%.
4. Los GAG´S se visualizarán como bandas y se compararán con los estándares.
95