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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
“Estudio estadístico de los datos obtenidos en el análisis microbiológico
de leche cruda entre unidades IBC y UFC para obtener el cálculo del
factor de conversión”.
Autor: Paúl Benjamín Bohórquez Chávez
Tesis para optar por el título profesional de:
QUÍMICO DE ALIMENTOS
Tutora: Dra. Guadalupe Jibaja MBA
Quito, Noviembre 2015
ii
Bohórquez Chávez, Paúl Benjamín (2015), “Estudio estadístico de
los datos obtenidos en el análisis microbiológico de leche cruda
entre unidades IBC y UFC para obtener el factor de conversión”.
Trabajo de investigación para optar por el grado de Químico de
Alimentos. Carrera de Química de Alimentos. Quito: UCE 139p.
iii
DEDICATORIA
Quiero dedicar mi tesis a mi madre Gladys Chávez que con su constancia y preocupación ha
hecho posible que pueda culminar mi carrera, a mi padre Arturo Bohórquez que se convirtió en
mi ángel y que desde el cielo guía mi camino, ustedes han sido mi apoyo para no decaer y
alcanzar mis metas, este esfuerzo es un reconocimiento de todo lo que han dado por mí.
Paúl Bohórquez
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AGRADECIMIENTO
Quiero agradecer a la Universidad Central del Ecuador por brindarme la oportunidad de estudiar
y ser un profesional responsable, a mi directora de tesis Dra. Guadalupe Jibaja MBA, quien con su
esfuerzo, dedicación y guía ha logrado que yo pueda culminar mi trabajo de titulación y pueda ser
un aporte más para este país como un profesional, también quisiera agradecer a cada uno de mis
profesores que con el pasar de los años me enseñaron todos los conocimientos, que ahora tengo
los cuales podré demostrar y poner en práctica en mi vida profesional y personal.
Muchas gracias a todos, a mis amigos y a mi familia, para todos que Dios les bendiga.
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vi
vii
viii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN:
La presente investigación se realizó en los laboratorios de Control de Calidad de Leche y el
Laboratorio de Sanidad Animal de “AGROCALIDAD”, el cual se encuentra ubicado en Tumbaco
Av. Interoceánica km 14 ½ sector la granja del Magap provincia de Pichincha.
ix
CONTENIDOS
DEDICATORIA ............................................................................................................................... iii
AGRADECIMIENTO ....................................................................................................................... iv
CONTENIDOS ................................................................................................................................. ix
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................................ xii
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... xiii
LISTA DE ANEXOS ...................................................................................................................... xiv
RESUMEN DOCUMENTAL ........................................................................................................... xv
ABSTRACT .................................................................................................................................... xvi
CAPÍTULO I ....................................................................................................................................... 1
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 1
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ........................................................................... 2
1.3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 2
1.3.1. Objetivo general.............................................................................................................. 2
1.3.2. Objetivos específicos ...................................................................................................... 2
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN .......................................................................... 2
CAPITULO II ..................................................................................................................................... 4
2. MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 4
2.1. Antecedentes. .................................................................................................................. 4
2.2. Fundamento Teórico ....................................................................................................... 5
2.3. Control de Lácteos .......................................................................................................... 7
2.4. Situación mundial de la leche. ........................................................................................ 7
2.5. Situación de la leche a nivel nacional ........................................................................... 10
2.6. Normativa de calidad .................................................................................................... 12
2.7. Fundamento teórico ...................................................................................................... 12
2.7.1. Leche cruda ................................................................................................................... 12
2.7.2. Componentes de la leche cruda .................................................................................... 13
2.7.2.1. Agua.............................................................................................................................. 13
2.7.2.2. Grasa ............................................................................................................................. 13
2.7.2.3. Proteína ......................................................................................................................... 13
2.7.2.4. Carbohidratos ................................................................................................................ 13
2.7.2.5. Minerales y sales........................................................................................................... 14
2.7.2.6. Otros constituyentes de la leche ................................................................................... 14
x
2.7.3. Contaminación bacteriana ............................................................................................ 14
2.7.4. Contaminación de la leche por microorganismos y enfermedades ............................... 14
2.7.4.1. Shigelosis (Disentería bacilar) ...................................................................................... 14
2.7.4.2. Brucelosis ..................................................................................................................... 14
2.7.4.3. Tuberculosis .................................................................................................................. 15
2.7.5. Microorganismos aerobios mesófilos. ......................................................................... 15
2.7.6. Citometria de flujo ........................................................................................................ 16
2.7.7. BactoScan FC. .............................................................................................................. 17
2.7.8. Funcion de los reactivos del BactoSan FC ................................................................... 18
2.7.9. Sistema de Flujo ........................................................................................................... 18
2.7.10. Módulo del contador ..................................................................................................... 19
2.7.11. Análisis de altura pulso (PHA) ..................................................................................... 20
2.7.12. Procedimiento de análisis del equipo BactoScan FC .................................................... 20
2.7.13. Unidades IBC. ............................................................................................................. 22
2.7.14. Unidades UFC. ............................................................................................................ 22
2.7.15. El conteo bacteriano ..................................................................................................... 22
2.7.16. Método de recuento en placas petri. ............................................................................. 22
2.7.17. Toma de muestras ......................................................................................................... 23
2.7.18. Fundamento Legal ........................................................................................................ 23
CAPITULO III .................................................................................................................................. 24
3. METODOLOGÍA ......................................................................................................... 24
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN ....................................................................................... 24
3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA ....................................................................................... 24
3.2.1. Población ...................................................................................................................... 24
3.2.2. Muestra ......................................................................................................................... 24
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................................ 25
3.3.1. Variables ....................................................................................................................... 25
3.3.2. Tipo de Diseño .............................................................................................................. 25
3.3.3. Procedimiento ............................................................................................................... 25
3.3.4. Método de recuento en placa petri. .............................................................................. 26
3.3.4.1. Acceso al área de siembra. ........................................................................................... 26
3.3.4.2. Normas del Laboratorio ................................................................................................ 26
3.3.4.3. Equipos y materiales ..................................................................................................... 27
3.3.4.4. Preparación de reactivos y muestras. ............................................................................ 27
3.3.4.5. Procedimiento para el recuento en placa petri .............................................................. 28
3.3.4.6. Realización del Ensayo de Recuento en placa. ............................................................. 28
xi
3.3.5. Método de citometria de flujo con equipo BactoScan FC. ........................................... 29
3.3.5.1. Procedimiento de recuento de las bacterias en el quipo BactoScanFC. ...................... 30
3.3.5.2. Equipos y materiales ..................................................................................................... 30
3.3.5.3. Preparación de soluciones ............................................................................................. 31
3.3.5.4. Realización del ensayo en citometria de flujo .............................................................. 33
3.3.6. Comparación del método de recuento en placa y los resultados del equipo
BactoScan FC .................................................................................................................................... 34
3.3.7. Diagrama de Experimentación ..................................................................................... 38
CAPITULO IV .................................................................................................................................. 39
4. Análisis e Interpretación de resultados ......................................................................... 39
4.1. Resultados de los análisis realizados con las técnicas de citometria de flujo y
recuento en placa. .............................................................................................................................. 39
4.2. Recuperabilidad ............................................................................................................ 40
4.2.1. Recuperabilidad (%) método con el equipo BactoScan FT .......................................... 40
4.2.2. Recuperabilidad % del método de recuento en placa .................................................. 40
4.3. PRECISIÓN .................................................................................................................. 41
4.3.1. Repetibilidad de los datos obtenidos con el método de recuento en placa ................... 41
4.3.2. Repetibilidad de los datos obtenidos con el método de citometria de flujo .................. 44
4.3.3. Reproducibilidad método de recuento en placa ............................................................ 47
4.3.4. Reproducibilidad método de citometria de flujo .......................................................... 50
4.4. Calculo de la ecuación de correlación .......................................................................... 53
CAPÍTULO V ................................................................................................................................... 56
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................... 56
5.1. Conclusiones ................................................................................................................. 56
5.2. Recomendaciones ......................................................................................................... 57
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 58
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 3.1 Variables de la Investigación .......................................................................................... 25
Tabla 3.2. Repetibilidad y reproducibilidad: Diseño de Factores Totalmente Anidados ................. 35
Tabla 4.1 Datos obtenidos de los muestreos ................................................................................... 39
Tabla 4.2 Datos experimentales para repetibilidad .......................................................................... 41
Tabla 4.3 Cuadrados medios entre grupos ...................................................................................... 42
Tabla 4.4 Cuadrados medios dentro de grupos ................................................................................ 43
Tabla 4.5 Análisis de varianza repetibilidad .................................................................................... 44
Tabla 4.6 Datos experimentales para repetibilidad ......................................................................... 44
Tabla 4.7 Cuadrados medios entre grupos ....................................................................................... 45
Tabla 4.8 Cuadrados medios dentro de grupos repetibilidad .......................................................... 45
Tabla 4.9 Análisis de varianza repetibilidad .................................................................................... 46
Tabla 4.10 Datos experimentales reproducibilidad .......................................................................... 47
Tabla 4.11 Cuadrados medios entre grupos reproducibilidad recuento en placa ............................. 48
Tabla 4.12 Cuadrados medios dentro de grupos reproducibilidad recuento en placa ..................... 48
Tabla 4.13 Análisis de varianza reproducibilidad recuento en placa ............................................... 49
Tabla 4.14 Datos experimentales reproducibilidad ......................................................................... 50
Tabla 4.15 Cuadrados medios entre grupos reproducibilidad citometria de flujo ......................... 51
Tabla 4.16 Cuadrados medios dentro de grupos reproducibilidad recuento en placa ..................... 51
Tabla 4.17 Análisis de varianza reproducibilidad método de citometria de flujo ........................... 52
Tabla 4.18 de resultados de IBC y UFC en LOG10 ........................................................................ 53
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Conversión de los países de la Unión Europea ................................................................. 4
Figura 2.2 Producción mundial de leche de vaca, entera y fresca ....................................................... 8
Figura 2.3 Índice de la FAO para los precios internacionales de los productos lácteos, 2002-
2004. .................................................................................................................................................... 9
Figura 2.4 Mayor Producción – Ecuador-2011. Principales productos que se comercializan
en el país para producción en dólar internacional y toneladas métricas. Fuente: (FAOSTAT,
2013b) ............................................................................................................................................... 10
Figura 2.5 Participación Cantonal. Porcentaje que cubre cada cantón en el Ecuador en
cuanto a las Unidades Productoras Agropecuarias. Fuente: (III Censo Nacional
Agropecuario, 2000). ........................................................................................................................ 11
Figura 2.6 Producción de leche. Litros de leche producidos por cada cantón de la región
Sierra. ................................................................................................................................................ 11
Figura 2.7 Diagrama de flujo del sistema y recorrido de la muestra en el Equipo BactoScan
FC (FOSS 2011) ................................................................................................................................ 21
Figura 3.1Toma de muestra ............................................................................................................... 28
Figura 3.2Preparación de diluciones ................................................................................................. 29
Figura 3.3 Dilución de la muestra ..................................................................................................... 29
Figura 3.4 Toma de muestra en el equipo BactoScan FC ................................................................ 33
Figura 3.5Equipo BactoSca FT ......................................................................................................... 34
Figura 4.1 Grafica para obtener el factor de correlación ................................................................... 55
xiv
LISTA DE ANEXOS
Anexos A Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 9:2012. Leche cruda. Requisitos .................... 62
Anexos B Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 3. “Leche y productos lácteos.
Terminología.” .................................................................................................................................. 68
Anexos C Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529. “Determinación de Aerobios M”. .......... 74
Anexos D Instructivo INT/CL/010 ................................................................................................... 81
Anexos E Acuerdo Ministerial 394 del 4 de septiembre del 2013. ................................................ 97
Anexos F Acuerdo Interministerial 2013-001, de 15 de marzo del 2013 ....................................... 107
xv
RESUMEN DOCUMENTAL
Esta investigación se realizó porque en la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del
Agro “Agrocalidad” dispone del equipo BactoScan FC en el que se realiza análisis
microbiológicos de leche cruda, estos análisis son expresados en Células Indivuales de Bacterias.
En el Ecuador la norma en la cual podemos tener una referencia del límite máximo de bacterias
permitidas para estar presentes en leche cruda es la INEN 9: 2012 en la que el resultado se expresa
como Unidades Formadoras de Colonias.
Por esta razón se tiene la necesidad de encontrar una ecuación de correlación entre unidades IBC a
UFC para disponer de criterios con límites que se puedan referenciar si una leche está cumpliendo
con los requisitos de la Norma.
Para obtener la ecuación de correlación se utilizó los métodos de citometria de flujo con el equipo
BactoScan FT y el método tradicional de recuento en placa petri.
Las muestras que se tomaron fueron evaluadas para las dos técnicas respectivamente, obteniendo
resultados en células individuales de bacterias, unidades formadoras de colonias. Luego se realizó
el análisis estadístico para obtener la ecuación con el cual se puede comparar las unidades.
Con los resultados se pudo concluir con la ecuación de correlación, el cual es sumamente
importante para Agrocalidad ya que dispondrá de las herramientas para comparar los resultados
que emite el Equipo BactoScan FC con la normativa nacional.
PALABRAS CLAVES: ECUACIÓN DE CORRELACIÓN, CITOMETRIA DE FLUJO,
RECUENTO EN PLACA, UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS, CÉLULAS
INDIVIDUALES DE BACTERIAS,CALIDAD DE LECHE.
xvi
ABSTRACT
This research was carried out due to in Ecuadorean Agency of Agricultural Quality Assurance
"Agrocalidad" has the BactoScan FC team in which is performed microbiological analysis of raw
milk, these analyzes are expressed in Single Cells of bacteria. In Ecuador, the standard in which we
can have a reference to the maximum limit of bacteria allowed in raw milk is the INEN 9:2012 in
which the outcome is expressed as Colony Forming Units.
For this reason it is necessary to find a interrelationship equation between IBC to UFC units to
have standards with limits that can be referenced if a milk is complying with the requirements of
the Regulation.
The samples taken were evaluated for both techniques respectively, obtaining results in single cells
of bacteria, colony forming units. Statistical analysis was then performed to obtain the equation
with which it can compare the units.
The results was concluded with the interrelationship equation, which is extremely important
for Agrocalidad; since, it will have the tools to compare the results issued by the BactoScan
FC Team and the national regulations.
KEY WORDS: INTERRELATIONSHIP EQUATION, FLOW CYTOMETRY, PLATE
COUNTING, COLONY FORMING UNITS, SINGLE CELLS OF BACTERIA,MILK QUALITY.
1
CAPÍTULO I
1. INTRODUCCIÓN
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro (AGROCALIDAD), institución
en la cual se realizó la investigación, dispone del Laboratorio de Control de Calidad de Leche, el
cual cuenta con equipos de última tecnología para realizar análisis físico químico de composición
de leche cruda, determinación de células somáticas o contaje total de bacterias. Cuyo objetivo es
controlar la calidad de la leche cruda que se produce en el Ecuador
Para el contaje total de bacterias presentes en la leche, los análisis microbiológicos se realizan en el
equipo BactoScan FC, el cual se ha convertido en la norma industrial para el recuento de bacterias
en más de 40 países como por ejemplo:(Bélgica, Dinamarca, Francia, Alemania, Irlanda, Italia,
Polonia, Eslovaquia, etc.) y ha obtenido numerosas aprobaciones. La combinación única de
tecnología y bioquímica combinada con un procesamiento óptimo de datos, hace del BactoScan FC
sea una herramienta muy útil para el análisis en laboratorios.
Con el nuevo concepto de tecnología de láser, el BactoScan FC tiene la capacidad de analizar 150
muestras por hora y obtener resultados de cada una de las muestras en menos de 10 minutos.
Comparando con métodos de referencia a nivel nacional, el tiempo y el costo para desarrollar esta
técnica son muy elevados.
Utilizando la técnica de citometria de flujo para analizar muestras de leche cruda, los resultados
que emite el Equipo BactoScan FC, son reportados en unidades IBC (Células Individuales
Bacterianas) pero la normativa NTE INEN 9:2012 exige que los resultados sean presentados en
unidades UFC (Unidades Formadoras de Colonias), según su tabla de requisitos microbiológicos,
es por ello que el presente estudio, se encaminó a realizar una investigación para determinar la
ecuación de correlación para comparar las unidades IBC con UFC.
Debido a que en el país los organismos de control aún no están familiarizados con las unidades
IBC, es necesario una ecuación de correlación de unidades IBC a UFC. La Agencia Ecuatoriana de
Aseguramiento de la Calidad “Agrocalidad”, y el laboratorio encargado del Control de Calidad de
Leche, tendrá la facilidad de comparar las células individuales de bacterias, con unidades
formadoras de colonias las cuales se expresan en la NTE INEN 9.
2
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
En base al planteamiento anterior, el problema de esta investigación se formula con la siguiente
interrogante:
¿Qué ventaja tiene el realizar un estudio estadístico del análisis microbiológico de leche para
obtener la ecuación de correlación para comparar unidad IBC con unidad UFC? y ¿Cómo influye la
ecuación de conversión entre unidad IBC con UFC en el reporte que se emitirá en el laboratorio de
análisis calidad de leche para cumplir con las especificaciones de unidades requeridas por el
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN?
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo general
Obtener la ecuación de correlación para comparar unidades IBC (Células Individuales de
Bacterias) con unidades UFC (Unidades Formadoras de Colonias) realizando análisis
microbiológicos.
1.3.2. Objetivos específicos
Realizar análisis microbiológicos para comparar unidades IBC y UFC.
Obtener resultados para determinar la ecuación de correlación entre unidades IBC (Células
Individuales de Bacterias) y UFC ( Unidades Formadoras de Colonias)
Evaluar la metodología de citometria de flujo para verificar si los resultados dispone de
repetibilidad y reproducibilidad.
Evaluar la metodología de recuento en placa para verificar si los resultados disponen de
repetibilidad y reproducibilidad.
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN
Esta investigación se justifica porque:
En el laboratorio de Control de Calidad de Leche que pertenece a Agrocalidad, se realizan análisis
microbiológicos de leche cruda utilizando el equipo BactoScan FC, el cual emite los resultados en
3
unidades IBC pero no se puede comparar estos resultados con los requisitos de la NTE INEN
9:2012 ya que en la norma se expresa en UFC por este motivo, se efectuará el estudio para
obtener una ecuación de correlación entre unidades IBC y UFC.
Esta investigación es importante porque sus resultados servirán para:
a) Por medio de una ecuación de correlación entre unidades IBC Y UFC que servirá para
reportar resultados que emite el equipo BactoScan FC en UFC, hasta que se incluya IBC en
la Normativa Nacional.
b) Controlar la calidad de la leche cruda a nivel del Ecuador en: haciendas, centros de acopio,
industrias lácteas y ganaderas un método alternativo que ayude a obtener resultados con
mayor rapidez que métodos tradicionales.
4
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes.
La conversión entre las unidades es a veces una necesidad para propósitos legales o comerciales, a
continuación se detalla las investigaciones que se realizaron a nivel mundial sobre este tema,
también se puede ver en la figura 2-1 las distintas conversiones que tienen a nivel mundial.
No tiene conversión: UK, Noruega, Canadá expresan sus resultados en IBC.
Una tabla de conversión fija: Alemania, U.S., Nueva Zelanda, Irlanda, Colombia.
Muchas conversiones hacia una sola: Italia.
Una Tabla por instrumento: Holanda (tabla cambiante, posiblemente porque sólo es un
laboratorio en el país).
Tendencias: las ecuaciones de conversión cubren áreas geográficas mayores, ejemplo.
Conversiones Nacionales. También en la UE la conversión está en desarrollo.
Conversiones en los países de la UE
Figura 2.1 Conversión de los países de la Unión Europea
5
2.2. Fundamento Teórico
La calidad de leche es de fundamental importancia a lo largo de los últimos años, puesto que tiene
una relación directa con la salud de los seres humanos y el estado económico de las regiones, es así
que en 1991, National NAHMS llevó a cabo el Proyecto de Evaluación Nacional de Lechería en
Novillos, cuya línea base presentó estimaciones de prevalencia de Cryptosporidium, Escherichia
Coli cepa O157: H7 y Salmonella (USDA, 2007).
Debido a las políticas de producción y consumo de ciertos sectores, en el Ecuador se ve la
necesidad de mejorar a corto y mediano plazo la sanidad agropecuaria y el control de los alimentos,
así la globalización de la economía y la creación de la Organización Mundial de Comercio, a través
de la aplicación de medidas sanitarias y fitosanitarias, exige al continente americano y al Caribe
cumplir con normas internacionales para impedir la difusión de enfermedades animales, plagas
vegetales y contaminación de los alimentos; obligando a la adopción de prácticas sanitarias
adecuadas, apoyadas en servicios de sanidad agropecuaria y de control de alimentos modernos y
eficientes (FAO/OMS, 2005).
En el Ecuador la información sobre la calidad de la leche resulta escasa, en el 2008 se realizó una
de las primeras intervenciones mediante estudios realizados en los laboratorios de la Universidad
Politécnica Salesiana, que dio paso al inicio de un proyecto pecuario en el cantón Cayambe,
provincia de Pichincha; permitiendo implementar un servicio para el control de la calidad de la
leche, desarrollar proyectos de apoyo técnico a los ganaderos, elaborar bases de datos pecuarios de
las fincas y desarrollar políticas de capacitación en áreas gerenciales relacionadas con la
ganadería.(Contero,2012)
Con la necesidad de continuar con estudios o proyectos pecuarios y controlar el pago por calidad de
leche cruda, se publica el 4 de septiembre del 2013 el acuerdo ministerial 394 en donde como
antecedentes menciona que en el Art. 13 de la Constitución de la República del Ecuador establece
que las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro y permanente a alimentos sanos,
suficientes y nutritivos, preferentemente producidos a nivel local y en correspondencia con sus
diversas identidades y tradiciones culturales. (Ministerio de Agricultura Ganaderia, 2013)
Según lo mencionado y con el acuerdo Interministerial 2013-001 el 15 de marzo del 2013,
publicado en el Registro Oficial No. 941 del 25 de abril del 2013, los ministros de agricultura,
ganadería, acuacultura y pesca, de Salud Pública, e Industrias y Productividad, expiden el
Reglamento de Control y Regulación de Cadena de Producción de Leche y sus derivados, con el
objetivo de: "Asegurar la calidad e inocuidad en los procesos de producción, manipulación,
6
elaboración y comercialización de la leche y sus derivados para garantizar el acceso a los mercados
y la salud de los consumidores, delimitando las competencias de las instituciones para regular y
controlar la cadena de producción de la leche y sus derivados; enmarcadas en el fomento,
promoción y desarrollo de la producción higiénica y eficiente, con el fin de proteger la salud, la
seguridad alimentaria de la ciudadanía y prevenir las prácticas inadecuadas que puedan inducir a
error, confusión o engaño a los consumidores". (Ministerio de Agricultura Ganaderia, 2013)
En el artículo 10 del acuerdo 394 resuelve que: La Subsecretaría de Ganadería y la Agencia
Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro —AGROCALIDAD-, serán quienes
verifiquen la transparencia, veracidad, correcto funcionamiento y calibración de equipos utilizados
para el análisis de leche cruda; y, validaran los resultados de los análisis de calidad de leche cruda
emitidos por los laboratorios de las industrias, centros de acopio o laboratorios privados. Estos
resultados de los laboratorios son determinantes para el cálculo del precio final pagado en finca,
mediante la aplicación de la Tabla Oficial presentada en este instrumento (Ver Anexo E). En caso
de incumplimiento se aplicará el procedimiento establecido en el Acuerdo Interministerial 2013-
001, de 15 de marzo del 2013, publicado en el Registro Oficial No. 941, del 25 de abril del 2013.
(Ministerio de Agricultura Ganaderia, 2013)
Agrocalidad por medio del Laboratorio de Control de Calidad de Leche verificará las
metodologías, procedimientos, instalaciones, equipos, calibraciones, análisis que se utilicen para
emitir resultados emitidos para el pago por calidad de los laboratorios de las industrias, centros de
acopio o laboratorios privados, por esta razón el Laboratorio de Control de Calidad de Leche se
convertirá en un laboratorio de referencia nacional, mismo que busca ser el organismo por medio
del cual se determine la calidad de la leche para consumo interno y con perspectivas de
exportación.
Los laboratorios a ser controlados, y según se indica en la resolución DAJ-20144C1-0201.0401
tienen la libertad de realizar sus metodologías según su disponibilidad de equipos, por lo cual
podrán realizar los análisis microbiológicos, con técnicas tradicionales o métodos indirectos como
el de citometría de flujo, con lo cual pueden reportar sus resultados en unidades formadoras de
colonias, o contaje total de bacterias respectivamente.
7
2.3. Control de Lácteos
En los últimos años el Ecuador se establece varias normativas de control en alimentos que se
elaboran o comercializan en el país, el control es realizado por los Ministerios de Agricultura,
Industrias, Comercio, y de Salud Pública, éste último dispone del Reglamento de Buenas Prácticas
de Manufactura, cuyo cumplimiento consta como requisito obligatorio para el permiso de
funcionamiento; adicionalmente las industrias deben cumplir con lo establecido en las normas
técnicas INEN (FAO/OMS, 2005).
En el caso del Reglamento de Alimentos del Código de la Salud, que está desactualizado frente a
los requerimientos de la OMC y el Codex Alimentarius y aunque no se ha armonizado con las
normas internacionales, está en vigencia y es utilizado para reforzar la labor de los organismos de
control en la vigilancia del cumplimiento de las reglamentaciones, que a su vez facilitan el
comercio internacional de alimentos (FAO/OMS, 2005).
2.4. Situación mundial de la leche.
En la producción y exportación de la leche predominan los países industrializados. Así, poco
más de 80% de la producción mundial se concentra en los países desarrollados. El ascenso de
la Unión Europea (UE) tiene como contraparte el desplazamiento de los tradicionales
abastecedores del mercado mundial: Australia y Nueva Zelanda (FIRA, 2001).
En la mayoría de los países desarrollados, a excepción de Nueva Zelanda y Australia, se establece
como prioridad la estabilización del mercado lechero interno y la satisfacción de las necesidades
de la población. Por tanto, la producción de excedentes exportables no es un fin de las políticas
nacionales, sino un medio para apoyar el ingreso de sus productores.
La tendencia de producción del material básico de la industria mundial lechera es quizás la única de
los artículos de consumo de primera necesidad que cambia poco de año en año (1 a 2 %). Existe un
sin número de razones para esto. Primeramente casi toda la producción lechera (65%) se concentra
en países desarrollados; así, la venta en muchos países está limitada por restricciones de producción
(EU, Japón, Canadá, Noruega, Suiza). De todas formas la tendencia en EU (el mayor productor de
leche) para la producción láctea ha tenido un leve aumento de 1% al año. Los países arriba
mencionados producen como grupo el 40% de la producción total, por lo que no sorprende que
ellos actúen como un factor de restricción importante del crecimiento de la producción láctea a
nivel mundial. Aunque esto parece ser una situación que cambia poco globalmente, se debe
reconocer que hay otras fuerzas en juego.
8
En años recientes, crecimientos substanciales en rendimientos lácteos en Asia, Latinoamérica y
Oceanía ha sido compensado por un empinado declinamiento de los rendimientos de Europa
oriental y la nueva Rusia. Mirando al futuro, se espera que sucedan algunas tendencias importantes
en el mediano plazo (próximos 10 años): crecimiento fuerte en zonas del mundo donde el consumo
está registrando un rápido crecimiento como en Asia y Latinoamérica.
La oferta, demanda y comercio mundial de alimentos está influenciado por un conjunto de factores
referidos al contexto macroeconómico esperado, a la evolución y localización de la población
mundial, a las políticas de apoyo a la producción y comercialización en los distintos países y a las
negociaciones internacionales (FAO, 2012).
A pesar de que en buena parte del mundo el sector lácteo está influenciado por medidas de
protección o por subsidios y barreras que limitan el comercio, los desequilibrios entre la oferta y
demanda en muchos países, así como el proceso de globalización y la creciente interdependencia
económica han contribuido a promover el crecimiento del comercio (SEM, 2012).
Según la FAO-SMIA (2012) la producción total mundial de leche para el año 2011 se estimó en
730,1 millones de toneladas, representada por los 9 principales productores (Figura 2.2), siendo el
primer lugar para Estados Unidos con 89.015,200 toneladas métricas/año y el menor productor
Reino Unido con 14.246,000 toneladas métricas/año (FAOSTAT, 2013); y con proyecciones de un
aumento en la producción mundial de 2,7% llegando a 750,1 millones de toneladas para el año
2012 (FAO-SMIA, 2012)
Fuente: (FAOSTAT, 2013 Figura 2.2 Producción mundial de leche de vaca, entera y fresca
9
Las previsiones del comercio mundial de productos lácteos demuestran que continuó
expandiéndose en el 2012, la demanda se mantuvo firme, y se prevé que las importaciones
alcancen los 52,7 millones de toneladas, equivalente de leche, donde el continente Asiático
continuó siendo el mercado principal, seguido de África del Norte, Oriente Medio, América Latina
y el Caribe (FAO-SMIA, 2012).
El consumo humano promedio per-cápita a nivel mundial es de 103,3 kg/año para el 2010, 104,5
kg/año estimado para el 2011 y 106,1 kg/año proyectado para el 2012; en cuanto a nivel de países
desarrollados el estimado para el 2012 fue 237,8 kg/año, y a nivel de países en desarrollo 71,1
kg/año (FAO-SMIA, 2012), muy por debajo de los 188 kg recomendado por FAO (Indonesia 5 kg,
Perú 55 kg, México 97 kg, Brasil 128 kg) (SEM, 2012).
En cuanto a los precios de los productos lácteos empezaron a bajar a mediados del 2011, al mejorar
los suministros al mercado internacional, esta reducción se debió a un aumento de las
disponibilidades de exportación pero también a una desvalorización del euro en relación con el
dólar estadounidense; a pesar de las bajas recientes, los precios internacionales de los productos
lácteos se mantienen más altos que las medias históricas (Figura 2.3) (FAO-SMIA, 2012).
Fuente: (FAO, 2012)
Figura 2.3 Índice de la FAO para los precios internacionales de los productos lácteos, 2002-2004.
10
2.5. Situación de la leche a nivel nacional
La producción lechera a nivel nacional es generadora de una alta cantidad de empleos, ya que
alrededor de 600.000 ecuatorianos dependen de la producción diaria de leche. En la actualidad los
ganaderos o productores de leche garantizan el autoabastecimiento del Ecuador y contribuyen
fundamentalmente a la seguridad y soberanía alimentaria del país, además de esto la producción
aumenta con el pasar de los años, por lo que se está generando oportunidades para exportar.
El Ecuador es uno de los países con el mayor incremento en la producción de leche de ganado
vacuno. A nivel nacional la mayor cantidad de producción de leche se genera en la región sierra,
seguida de costa y oriente, estas dos últimas dedicándose principalmente al manejo de ganado de
carne.
Figura 2.4 Mayor Producción – Ecuador-2011. Principales productos que se comercializan en el país
para producción en dólar internacional y toneladas métricas. Fuente: (FAOSTAT, 2013b)
El III Censo Nacional Agropecuario, (2000) determinó que en el país existen un total de
12.355.831 hectáreas ocupadas por 842.882 Unidades de Producción Agropecuarias (UPA’s) es
decir fincas, haciendas y demás predios; deduciéndose según el informe que más del 48% de la
superficie nacional está al servicio de los productores agropecuarios. La producción diaria de leche
a nivel nacional se sitúa en 3.525,037 litros de leche diarios (Figura 2.4).
11
En cuanto a las cabezas de ganado (Figura 2.5), según el III Censo Nacional la mayor participación
cantonal en el país tiene Santo Domingo con el 30,6%, seguido de Quito con 26% y en tercer lugar
se encuentra el cantón Mejía con el 12,5%.
Fuente: (III Censo Nacional Agropecuario, 2000)
Figura 2.5 Participación Cantonal. Porcentaje que cubre cada cantón en el Ecuador en cuanto a las
Unidades Productoras Agropecuarias. Fuente: (III Censo Nacional Agropecuario, 2000).
La producción de leche en el país está determinada de acuerdo al tamaño de la UPA, existiendo
según el III Censo Nacional Agropecuario (INEC-MAG-SICA, 2002), mayor producción en
aquellas que tienen una extensión de 20 a menos de 50 hectáreas con 644.654 L, de 50 a menos de
100 ha con 531.871 L, seguida de aquellas 200 ha y más con 439.098 L.
Dentro de la región Sierra, según el III Censo Nacional Agropecuario la mayor producción de leche
se encuentra en el cantón Mejía con 220.666 L, y el resto de cantones con menor producción
(Figura 2.6).
Fuente: (III Censo Nacional Agropecuario, 2000).
Figura 2.6 Producción de leche. Litros de leche producidos por cada cantón de la región Sierra.
12
2.6. Normativa de calidad
El Organismo técnico nacional, eje principal del Sistema Ecuatoriano de la Calidad en el
país, competente en Normalización, Reglamentación Técnica y Metrología, que contribuye
a garantizar el cumplimiento de los derechos ciudadanos relacionados con la seguridad; la
protección de la vida y la salud humana, animal y vegetal; la preservación del medio
ambiente; la protección del consumidor y la promoción de la cultura de la calidad y el
mejoramiento de la productividad y competitividad en la sociedad ecuatoriana. (INEN)
En la Norma INEN9:2012 Leche Cruda Requistos, señala el límite máximo de recuento de
microorganismos aeróbios mesófilos tiene que tener una leche cruda (tabla 2.7).
Tabla 2.7 Tabla de requisitos microbiológicos de leche cruda.
2.7. Fundamento teórico
En esta sección se realiza una recopilación de varias definiciones teóricas para esta área del
conocimiento las cuales puedan sustentar esta investigación:
2.7.1. Leche cruda
Leche.
Es el resultado de la secreción mamaria de animales bovinos lecheros sanos, obtenida mediante
ordeños diarios, higiénicos, completos e ininterrumpidos, sin ningún tipo de adición o extracción,
la cual será destinada a un tratamiento tecnológico previo a su consumo. (INEN, 2012)
Leche cruda.
Es la leche que luego del ordeño diario no ha sido sometida a ningún tipo de calentamiento.
(INEN, 2012)
13
Desde el punto de vista agroindustrial:
Producto íntegro de la secreción mamaria normal sin adición ni sustracción alguna de sus
componentes y obtenida mediante uno o más ordeños y que no ha sido sometido a procesamiento o
tratamiento alguno. La designación de "leche" sin especificación de la especie productora,
corresponde exclusivamente a la leche de vaca.
A las leches obtenidas de otras especies les corresponde la denominación de leche pero seguida de
la especificación del animal productor”. (Carlos R, 2007)
2.7.2. Componentes de la leche cruda
2.7.2.1.Agua
El agua es el componente más abundante de la leche, representa aproximadamente el 87,5 % del
total de la leche. (Bylund & López, 1998)
2.7.2.2.Grasa
La grasa de la leche está compuesta por triglicéridos (componentes dominantes), diglicéridos y
monoglicéridos, ácidos grasos, esteroles, carotenoides vitaminas A, D, E y K y otros elementos en
trazas.
La membrana está compuesta de fosfolípidos, lipoproteínas, cerebrosidos, proteínas, ácidos
nucleicos, enzimas, elementos traza (metales) y agua ligada. (Bylund & López, 1998)
2.7.2.3. Proteína
Las proteínas son moléculas, las cuales están formadas por cadenas pequeñas de aminoácidos, la
leche de vaca es una fuente de proteínas de alta calidad, constituidas por caseína, albúmina y la
globulina (Díaz, 2005)
2.7.2.4.Carbohidratos
El principal componente es la lactosa y es considerado por algunos autores como el único; sin
embargo, también se ha identificado a pequeñas cantidades de glucosa, galactosa, sacarosa,
cerebrósidos y aminoazúcares, los cuales a pesar de están en concentraciones muy bajas, llegan a
14
ejercer una influencia importante en la estabilidad de la leche, sobre todo cuando se somete a
tratamientos térmicos intensos.
2.7.2.5.Minerales y sales
La leche contiene un cierto número de minerales. Su concentración total es inferior al 1%. Las sales
minerales se encuentran disueltas en el suero de la leche o formando compuestos con la caseína.
Las sales más importantes son las de calcio, sodio, potasio y magnesio. Se encuentran como
fosfatos, cloruros, citratos, y caseínatos. Las sales de potasio y calcio son las más abundantes en la
leche normal. (Bylund & López, 1998)
2.7.2.6.Otros constituyentes de la leche
La leche contiene siempre células somáticas (glóbulos blancos o leucocitos). Su contenido es bajo
cuando se trata de leche procedente de ubres sanas, pero aumenta si se trata de una ubre enferma,
normalmente en proporción a la severidad de la enfermedad. El contenido máximo de células
somáticas/ cm3 es 7.0 x 10
5 de acuerdo a NTE INEN 9:2012
2.7.3. Contaminación bacteriana
Existen tres vías por las cuales se puede dar una contaminación bacteriana, (i) de la superficie
externa de la ubre y pezón, (ii) por el equipo de ordeño, y (iii) por organismos que causan mastitis
dentro de la ubre (Pantoja et al., 2009). Por lo que el nivel y tipo de microorganismos existentes en
la leche permiten monitorear la calidad higiénica en la que ha sido producida (Olechnowicz &
Jaskowskj, 2012).
2.7.4. Contaminación de la leche por microorganismos y enfermedades
Los principales microorganismos que pueden contaminar a la leche cruda se detallan a
continuación.
2.7.4.1.Shigelosis (Disentería bacilar)
Infección alimentaria típica provocada por las shigelas, gérmenes que pueden ser transmitidos por
la leche. Las shigelas que contaminan la leche proceden de las manos de los operadores o bien de
las heces, siendo transportadas por el agua y las moscas. (Magariños, 2000)
2.7.4.2.Brucelosis
15
El hombre puede contraer esta enfermedad a través del consumo de leche cruda. Además de esta
vía puede contraerla directamente por el contacto con tejidos y secreciones de animales infectados
o por la inhalación de productos secos infectados, mecanismo que en algunas zonas parece tener
más importancia que la infección mediante la leche. (Magariños, 2000)
La Brucella abortus predomina en todos los países, con excepción de los escandinavos, donde ha
sido posible su erradicación. Se ha calculado que la proporción de vacas no vacunadas que
eliminan por la leche un número apreciable de bacilos, oscila entre un 15 y un 35%. Por otra parte,
la cantidad de leche infectada por Brucella que llega a las industrias lecheras suele ser mayor que
la contaminada con bacilos tuberculosos. La causa de ésto se explica por el hecho de que la
brucelosis produce lesiones en las ubres con mayor frecuencia que la tuberculosis. (Magariños,
2000)
En general, es posible afirmar que la leche cruda, crema y mantequilla, preparadas a partir de
leches no fermentadas ni tratadas térmicamente, así como quesos frescos no fermentados,
constituyen productos muy peligrosos desde el punto de vista de la transmisión de brucelosis
(Magariños, 2000)
2.7.4.3.Tuberculosis
El consumo de leche cruda representa el vehículo principal por el que los bacilos tuberculosos pasan
del animal al hombre. Las vacas lecheras infectadas son con mucho el reservorio más importante de
bacilos tuberculosos. La incidencia de tuberculosis bovina en el hombre depende sobre todo de su
presencia en el ganado vacuno y de la cantidad de leche cruda o insuficientemente tratada que
consume la población. (Magariños, 2000)
Los bacilos tuberculosos de la leche proceden unas veces del medio exterior contaminado (estiércol,
polvo, etc.) y otras, las más, de las ubres afectadas; se ha observado, sin embargo, que los bacilos
pueden pasar de la sangre a la leche a través de la ubre sin lesiones clínicas perceptibles. En
términos generales puede decirse que el 4% aproximadamente de las vacas tuberculina-positivas
eliminan bacilos tuberculosos en la leche, pero que sólo el 25% de los animales que excretan bacilos
presenta lesiones evidentes de la ubre.
El bacilo tuberculoso de la variedad humana puede contaminar directamente la leche a partir de los
ordeñadores y otros operarios, y llegar al consumidor del mismo modo que tantos otros gérmenes
patógenos transmitidos por la leche, a menos que se destruya a tiempo con un
tratamiento térmico adecuado. (Magariños, 2000)
2.7.5. Microorganismos aerobios mesófilos.
16
Los aerobios mesófilos son microorganismos que se desarrollan a temperatura ambiente y se
encuentran en el aire, agua y suelo.
El número de microorganismos aerobios mesófilos cuantificados en los alimentos es uno de los
indicadores microbiológicos de calidad más utilizados. Es aplicable a todos los alimentos con
excepción de los productos fermentados madurados
El Instituto Nacional de Normalización en la norma INEN9:2012 en la quinta revisión indica que el
límite máximo de microorganismos aeróbicos mesófilos permitidos para leche cruda es de es 1,5 x
106
UFC/ cm3, en una ubre de una vaca sana la leche tiene un muy bajo contenido de
microorganismos si el contenido es alto nos indica que la vaca puede estar enferma o no hay un
correcto proceso de ordeño y un buen enfriamiento de la leche después del ordeño.
2.7.6. Citometria de flujo
La citometria de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparametrico cuyo fundamento
se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en
una por delante de un haz de láser focalizado. La citometría de flujo es una tecnología (proceso)
que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula. Estas
medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a
4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido (1).
(NEUROBIOQUIMICA, s.f.)
En la industria láctea se ha utilizado éste método para la determinación del contenido de células
somáticas, contaje total de bacterias medido mediante equipos Foss: Fossomatic FC y BactoScan
FC, y otros marcas de equipos confiables, en el cual el conteo de partículas se fundamenta en el
contaje de núcleos de células teñidos, principalmente leucocitos con alto contenido de ADN y
células epiteliales con bajo contenido de ADN (Jánosi & Baltay, 2004).
Estudios previos han demostrado que existe correlación significativa entre la citología manual y la
citometría de flujo, además se ha validado como un método de diagnóstico para la identificación de
mastitis bovina que puede detectar verdaderos negativos, es decir, que no tienen mastitis y han
reportado que la sensibilidad y especificidad es similar o mayor a la citología, 100 y 83%,
respectivamente (Jánosi & Baltay, 2004).
Además la citometría de flujo puede ser utilizada para identificar antígenos de superficie, que
pueden arrojar luz en la identificación celular y la función asociada; distinguir tipos de células
17
viables de otra materia también presente en la muestra, combinando el perfil obtenido por la luz
dispersada con información de células específicas identificadas por anticuerpos monoclonales
fluorescentes, esto es utilizado principalmente para contar e identificar células en la leche las cuales
contienen glóbulos de grasa; cuantificar neutrófilos en la leche de vacas sanas y vacas inoculadas
con endotoxinas; y evaluar linfocitos en leche de glándulas no infectadas y glándulas con
infecciones espontáneas por Staphylococcus (Rivas et al., 2001).
2.7.7. BactoScan FC.
El BactoScan™ FC se ha diseñado para la determinación rápida y fiable completamente
automatizada de la calidad higiénica de la leche cruda. El analizador cuenta el número total de
Células Bacterianas Individuales (CBI) en una muestra láctea.
El analizador normalmente se usa en los laboratorios centrales de control de la leche para analizar
el contenido de bacterias en las muestras de leche cruda con el fin de fijar el pago por la leche. Los
resultados también pueden usarse para una examinación del estado higiénico a nivel de las
explotaciones. Las centrales lecheras pueden usar el recuento de bacterias para vigilar la leche
cruda entrante para impedir la contaminación interna de las muestras.
El BactoScan FC tiñe las bacterias con un colorante fluorescente y reduce y dispersa los
componentes lácteos, de modo que es posible contar las bacterias. Un detector detecta la luz
emitida por las bacterias, cuando un hilo fino de muestra atraviesa una célula de flujo pasando bajo
el detector. Los pulsos de luz se convertirán en pulsos electrónicos y se contarán y se visualizan en
un PC.
Para evitar la interferencia de otras partículas, tales como glóbulos grasos, micelas de proteína y
células somáticas, la muestra será sujetada a un tratamiento químico para destruir estas partículas.
Además, el analizador rompe la agrupación de bacterias. El analizador ejecutará automáticamente
este tratamiento. (FOSS, 2011)
Basado en las probadas tecnologías de FOSS, el BactoScan™ mide la calidad higiénica de la leche,
analizando las bacterias presentes en la leche cruda. BactoScan da los resultados en pocos minutos
y permite así a las granjas y laboratorios interprofesionales actuar rápido para poder preservar y
mejorar la calidad de la leche (FOSS, 2011).
El BactoScan ™ FC puede analizar hasta 200 muestras de leche por hora con las actualizaciones
disponibles para satisfacer las necesidades de todos los laboratorios de análisis de la leche. Esta
18
capacidad de alto rendimiento permite una producción elevada de muestras diarias y libera al
personal de pruebas para otros fines. (FOSS, 2011).
Características:
Parámetros: Recuento de células de bacterias
Resultados: En diez minutos
Para utilizar en: Laboratorios interprofesionales
Tecnología: Citometría de flujo
Volumen de pruebas: Hasta 200 muestras a la hora
Muestras: Se pueden analizar muestras de leche cruda de vaca, oveja, cabra, búfala y camella
directamente, sin necesidad de un calentamiento o disolución previa
2.7.8. Funcion de los reactivos del BactoSan FC
Reactivo incubación
Buffer: estabiliza el pH a 9,3
Detergente: disuelve la grasa láctea y abre la membrana de bacterias para permitir la penetración
del medio colorante.
Enzima: descompone las células somáticas y proteínas y rompe las agrupaciones de bacterias.
Medio colorante: Bromuro de etidio tiñe el ADN y ANR.
Líquido portador
Hace pasar las bacterias por el láser y el detector.
Líquido limpiador
Limpia el sistema de flujo entre las muestras.
Líquido de final del día
Limpia el sistema de flujo al final de un día de trabajo.
2.7.9. Sistema de Flujo
La pipeta aspirará unos 5 mL de leche. La primera parte de la leche sirve para llenar/limpiar el
sistema.
19
Al mismo tiempo, la jeringa se llenará con reactivo de incubación.
Antes de llegar al dispositivo de incubación, la leche así como el reactivo de incubación pasarán
por un filtro de 100 µm. 0,4 mL de la leche pasará al dispositivo de incubación.
La jeringa administra 1,1 mL de reactivo de incubación en el dispositivo de incubación, en su
camino el reactivo pasará un filtro de 0,22 µm.
El dispositivo de incubación avanzará a una posición para poder llenar el próximo vaso.
Durante la incubación, la muestra y el reactivo de incubación se mezclan bien dos veces para que el
reactivo de incubación pueda separar todas las partículas, destruir las células somáticas, las
proteínas y grasa y para teñir bien las bacterias.
Después de 8,5 minutos de incubación, 0,8 mL de la muestra será aspirada en el vaso y pasará a
través de un filtro de 100 µm. El primer líquido es descartado y la muestra remanente es
administrada a la jeringa a la entrada de la célula de flujo, pronta para su inyección.
La jeringa de medición inyecta la muestra en la célula de flujo, y el líquido portador transportará la
muestra a través de la célula de flujo.
A medida que se estabilice el flujo de muestra, las bacterias pasan por debajo del microscopio
como las perlas en un collar. Cuando la luz azul procedente de la fuente láser excita las bacterias
teñidas, estas emitirán pulsos de luz (luz roja) que serán detectados y contados.
Todo el sistema de flujo será enjuagado entre cada muestra láctea, y todos los filtros se lavan por
corriente reversa.
Cuando la muestra sale del dispositivo de incubación, el vaso se limpia detenidamente antes de
recibir la próxima muestra.
La varilla será limpiada entre cada muestra, y debido a este procedimiento de limpieza es necesario
usar la varilla BactoScan FC.
2.7.10. Módulo del contador
El fin del módulo contador es de examinar la mezcla de leche y reactivos y de generar un pulso
electrónico por cada bacteria en un volumen dado de muestra. Usando un fenómeno conocido
20
como el enfoque hidrodinámico, la mezcla incubada y los reactivos penetran en una célula de flujo
como un hilo fino transportado por un “ carrier” o líquido portador (citometría de flujo).
Presentadas así las bacterias prácticamente aparecen como las perlas en un collar, haciendo posible
detectar su presencia individual y contarlas.
En su camino atravesando la célula de flujo, la bacteria marcada pasa un haz focalizado de láser
azul, y emite una luz roja debido al colorante fluorescente atado a ellas. La luz fluorescente será
detectada por un detector sumamente sensitivo, que da un impulso electrónico cada vez que una
bacteria pasa por el haz de láser.
2.7.11. Análisis de altura pulso (PHA)
Los pulsos que son contados por el detector y convertidos en señales electrónicas son de tamaño
diferente. Originan de la bacteria así como el ruido. Por tanto, han ser separado en pulsos de ruido
(pulsos demasiado poco intensos para ser bacteria) y pulsos causados por bacterias.
El diagrama de PHA muestra la distribución de pulsos según su intensidad. El diagrama de PHA
reflejando las muestras de control bacteriano y de control con partículas se presenta junto con
varias cifras clave o los llamados “parámetros segundarios”, tales como anchura de señal, señal
media y ruido. Así se facilita información sobre la condición de la muestra y el analizador, y por
turno la validez/calidad de los resultados producidos. De ahí que el diagrama de PHA sea una
herramienta importante en localización de problemas en el BactoScan a través de PHA .
La señal media, la anchura de señal y el ruido sólo se presentan para las muestras de control
bacteriano y de control con partículas - cuando el analizador está operando en tipo de tarea normal
(normalmente muestras lácteas), estos parámetros no darán información con sentido.
2.7.12. Procedimiento de análisis del equipo BactoScan FC
Puesta a punto del equipo (Encendido y Limpieza)
La muestra se coloca en la pipeta y es absorbida
Se absorbe el reactivo colorante utilizando la jeringa de tintura.
Este colorante se mezcla en proporción 1:1 con la muestra
La mezcla se deposita en la rueda de incubación, en la cual se mantiene por 8 minutos para
fomentar la reproducción bacteriana
21
La jeringa de medición empuja la mezcla, junto con solución portadora a través de la celda
de flujo.
Paralelo a la celda de flujo se encuentra el microscopio, conectado a un fotomultiplicador.
El mismo detecta los pulsos tintados de bacterias.
El software suma estos pulsos de acuerdo a su duración (tamaño de la célula) y los gráfica.
Para evitar tomar en cuenta impurezas, el programa descarta la zona baja de la gráfica de
conteo, así considera únicamente las partículas lo suficientemente grandes para ser
consideradas como bacterias.
El programa trabaja en la gráfica y presenta el resultado en miles de bacterias por mililitro.
El instrumento posee filtros bacterianos para los reactivos, de esta manera se evita
distorsionar las lecturas con contaminación exterior.
Figura 0.1 Diagrama de flujo del sistema y recorrido de la muestra en el Equipo BactoScan FC
(FOSS 2011)
Fuente: (FOSS, 2011)
22
2.7.13. Unidades IBC.
Células Individuales Bacterianas, son unidades internacionales las cuales serán reportadas en el
Equipo BactoScan FC, estas unidades tienen una relación directamente proporcional a las Unidades
Formadores de Colonias, por lo cual, se pueden comprar entre sí. Al contar bacteria por bacteria se
puede expresar los resultados en contaje total de bacterias (CBT).
2.7.14. Unidades UFC.
UFC es el número mínimo de células separables sobre la superficie, o dentro, de un medio de agar
semi-sólido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de millones de
células descendientes. Las UFC pueden ser pares (diplococos), cadena (estreptococos) o racimos
(estafilococos), así como células individuales Unidad formadora de colonias. (Wikipedia)
2.7.15. El conteo bacteriano
Señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por
diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida.
Recuento de microorganismos viables totales: Contaje en placa, determinación del número
más probable, métodos basados en la reducción de colorantes por viables, contaje de
microscópico directo.
Métodos físicos: Impedancia, Microcalorimetria, Citometría de Flujo.
Métodos Químicos: Nucleasa termoestable, lisado de limulus, sondas de ácidos nucleicos,
PCR, medida de ATP, radiometría, substratos fluoro y cromogénicos.
2.7.16. Método de recuento en placas petri.
“Es el procedimiento que se utiliza para determinar el número de microorganismos por gramo o
mililitro del alimento en estudio, partiendo de una serie de diluciones decimales, mediante el
empleo de técnicas en placas de agar”. (Tortora G. J., 2007)
Es el método más usado para contar bacterias. Es un caldo de cultivo con microorganismos en una
dilución determinada y posteriormente estas muestras son distribuidas en la caja de petri
contenedora de agar. Es de suponerse que cada célula se dividirá en sus múltiples alrededores para
producir colonias separadas en el agar. Cada célula es llamada unidad formadora de colonias
23
(UFC). Después de la incubación, el número de colonias se reflejará en el número de células UFC
originalmente presentes. Es importante considerar un número limitado de colonias pues de no ser
así, éstas pueden sobre poblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango sugerido de acuerdo a
FDA 25-250 colonias). El conteo se facilita utilizando un contador de colonias. Este método es
deseable porque arroja el total de células viables (sólo células vivas); en contraste con el conteo
microscópico y el conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para
producir las colonias, ya que se necesitan como mínimo veinticuatro horas o más. Por otra parte, no
es cien por ciento fiable porque generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en grupos.
2.7.17. Toma de muestras
Independientemente del tipo de análisis al que se sujetan las muestras lácteas, estas deberán ser
tomadas primeramente en una manera uniforme y representativa. El método que se utilizó en la
presente investigación se tomó del INT/CL10 anexo D
2.7.18. Fundamento Legal
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 9:2012. Leche cruda. Requisitos. Ver anexo A
(INE, 2012)
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 3. Leche y productos lácteos. Terminología.
Ver anexo B (INEN, 2012)
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529. Determinación de Aerobios Mesófilos.
Ver anexo C (INE, 2012)
Acuerdo Ministerial 394 del 4 de septiembre del 2013. Ver anexo E (Ministerio de
Agricultura Ganaderia, 2013)
Acuerdo Interministerial 2013-001, de 15 de marzo del 2013. Ver anexo F (Ministerio de
Agricultura Ganaderia, 2013
24
CAPITULO III
3. METODOLOGÍA
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
Es una investigación de tipo experimental, se realizaron ensayos variando las condiciones de
trabajo por ser dos metodologías y técnicas diferentes pero si con una misma matriz con iguales
condiciones de muestreo, permite usar los conocimientos en la práctica y aplicarlos en la mayoría
de los casos con el fin de dar provecho a la sociedad.
La investigación realizada es cuantitativa permite examinar los datos de manera científica con
ayuda de herramientas estadísticas para poder comparar resultados con las dos metodologías.
Los métodos para comparar las unidades IBC con UFC se realizaron en el laboratorio de Control
de Calidad de Leches y el Laboratorio de Sanidad Animal de “AGROCALIDAD”, la materia prima
se obtuvo de la hacienda ganadera “EL BELÉN” ubicada en la provincia de Pichincha, parroquia
de Lloa.
3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA
3.2.1. Población
Lote homogéneo que se obtuvo del muestreo realizado a la vaca lechera que se encuentran en la
hacienda “El Belén”, ubicada en la parroquia Lloa de la provincia de Pichincha.
3.2.2. Muestra
Leche de una vaca seleccionada aleatoriamente (Nombre de la vaca que se tomó las muestras:
Mochila) de raza holstein, la leche fue tomada del ordeño de la mañana, la cual permitirá obtener
muestras (120) con una distribución homogénea para disponer de repetitibilidad y reproducibilidad
en los métodos.
La toma de muestra de leche cruda de acuerdo al Instructivo INT/CL/010 “Instructivo para toma de
muestras de leche cruda” (Anexo D).
25
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL
Se detalla a continuación el diseño experimental utilizado en los métodos, lo realizado en el
laboratorio además se incluye el procedimiento seguido.
3.3.1. Variables
Tabla 3.1 Variables de la Investigación
Método de Análisis Variable Dependiente Variable Independiente
I
(Citometria de Flujo)
Leche Cruda de Vaca
Células Individuales de
Bacterias
II
(Método Tradicional)
Leche Cruda de Vaca
Unidades Formadoras de
Colonias
3.3.2. Tipo de Diseño
La investigación se separó en dos etapas en las cuales se realizaron las técnicas que se muestran
en el diseño para cada uno de los diferentes métodos, el diseño utilizado el cálculo de la ecuación
de correlación, para comparar que los resultados obtenidos son confiables se realizó análisis de
repetibilidad, reproducibilidad, recuperabilidad para cada uno de los métodos.
3.3.3. Procedimiento
1. Preparo reactivos y materiales en el laboratorio de Control de Calidad de Leche Cruda de
AGROCALIDAD previo al muestreo.
2. Se trasladó a la hacienda ubicada en la parroquia de Lloa.
3. Se usó vestimenta adecuada para realizar el muestreo.
4. Recolecto muestras en recipientes de polietileno estériles.
5. Mantener las muestras obtenidas a una temperatura aproximada de 2 a 8 °C.
6. Transporto las muestras al laboratorio de CONTROL DE CALIDAD DE LECHE CRUDA
7. Realizo análisis microbiológicos por los dos métodos descritos.
8. Elaboro un tratamiento estadístico de los datos obtenidos y establecer el factor de conversión.
26
3.3.4. Método de recuento en placa petri.
Utilizando la cuantificación de microorganismos aerobios mesófilos, por el método de
recuento en placa en muestras de leche cruda de vaca, se logra:
Verificar que el instructivo INT/CL/010 es óptimo para aplicarlo en campo y con ello
tener un buen muestreo.
Determinar si las temperaturas aplicadas en el proceso fueron adecuadas.
Obtener resultados e unidades UFC con una misma matriz para luego ser comparadas con
unidades IBC.
3.3.4.1.Acceso al área de siembra.
Exclusivamente tendrá acceso el personal del Laboratorio de Microbiología que, al ingresar al
área, utilizará: mandiles abrochado, protectores de cabello y guantes. El personal que ingresa en
esta área debe:
Lavarse las manos al iniciar y finalizar el trabajo del laboratorio y cada vez que se sospeche
de contacto con material contaminado.
Colocarse protección, tomar las medidas de seguridad de vestimenta.
Ponerse cuando sea necesario, lentes de seguridad para proteger la cara de salpicaduras, sustancias
corrosivas, lus Uv y otras radiaciones. Ponerse cuando sea necesario, lentes de seguridad para
proteger la cara de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones.
3.3.4.2.Normas del Laboratorio
El laboratorio permanecerá ordenado y limpio. No debe mantenerse en las mesas el material
que no sea pertinente al trabajo.
Asegurarse que el material contaminado sea descontaminado antes de desecharse.
Las superficies de trabajo deben limpiarse y descontaminarse con desinfectantes adecuados
al final del trabajo y en caso de haberse derramado material contaminado.
Está prohibido, comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicarse cosméticos y colocarse
lentes de contacto en el área de trabajo
27
3.3.4.3.Equipos y materiales
Equipos:
Contador de colonias
Cabina de flujo laminar
Balanza de capacidad no superior a 2500 g y de 0,1 de sensibilidad
Incubadora regulable (25 °C - 60 °C)
Autoclave
Refrigeradora
Materiales:
Frascos Estériles
Tubos de ensayo 150 mm x 16 mm con tapa
Pipeta de 1 mL
Cajas Petri
Erlenmeyer boca acha de 500 mL
Jeringuillas 10 mL
Jeringuillas de 100 mL
Gradillas
Medios de cultivo:
Agua Peptona al 0,1 % diluyente INEN 1529-1 (Anexo C)
Agar nutritivo
3.3.4.4.Preparación de reactivos y muestras.
Agua de peptona:
Disolver la peptona en 1 litro de agua destilada y ajustar el pH de manera que, después de ser
esterilizado, sea 7,0 ± 0,1. Distribuir en frascos o en tubos, de modo que después de esterilizado, el
volumen sea de 9 mL ± 2% del deseado, luego de esterilizado a 121°C por 20 minutos,
asépticamente reajustarlo con una pipeta
Medio de cultivo: Agar nutritivo
Disolver 23 gramos de agar nutritivo en 1 litro agua destilada, esterilizar a 121 °C por 20 minutos,
luego de la esterilización, distribuir 20 ml en cajas petri previamente esterilizadas.
28
Muestra:
Antes de preparar la muestra para el ánalisis, se realizó una homogenizacion de la leche cruda
con el objeto de obtener representatividad de la misma.
3.3.4.5.Procedimiento para el recuento en placa petri
Se realizó el procedimiento según especifica la Norma INEN 1529-5: 2006 de “Control
Microbiológico de los Alimentos. Determinación de la cantidad de Microorganismos Aerobios
Mesófilos”. (Anexo C)
3.3.4.6.Realización del Ensayo de Recuento en placa.
Figura 3.1Toma de muestra
29
Figura 3.2Preparación de diluciones
Figura 3.3 Dilución de la muestra
3.3.5. Método de citometria de flujo con equipo BactoScan FC.
Está destinado a la determinación del contenido de Microorganismos totales, expresados como
contaje de bacterias totales CBT, presentes en la leche de vaca cruda que serán recolectadas en
frascos estériles, utilizando como guía el instructivo de muestreo del Laboratorio de Control de
Calidad de leche de “Agrocalidad”. (Anexo D2)
30
Se establece además que el presente método de ensayo se aplicará a muestras de leche sin haberse
sometido a un tratamiento tecnológico, no se aplica para leches que fueran procesados en derivados
lácteos o leches pasteurizadas y se utilizaron muestras sin conservantes.
Este procedimiento específico de ensayo está basado en la medición de la calidad higiénica de la
leche realizando recuentos de bacterias individuales en leche cruda empleando para ello el equipo
BactoScam FC, que utiliza la técnica de citometría de flujo que permite analizar de forma rápida y
precisa las bacterias presentes en la leche.0. La citometría de flujo es una técnica que permite
realizar un recuento de células y partículas.
3.3.5.1.Procedimiento de recuento de las bacterias en el quipo BactoScanFC.
Incubando la leche con un líquido específico y empleando un tratamiento mecánico que
hace que se descompongan todos los componentes de la leche, excepto las bacterias. Los
grupos de bacterias, a su vez, se dividen en bacterias individuales.
Durante el periodo de incubación, las bacterias se tiñen con una solución específica para el
ADN y ARN.
En el punto de medición, la muestra se expone a un haz de luz láser, haciendo que las
bacterias teñidas emitan una luz roja, un pulso de luz por cada una de las bacterias que pasa
por el haz.
Entonces se utiliza una jeringa muy precisa para pasar toda la muestra a través de una celda
de flujo presentando las bacterias una por una.
La electrónica cuenta los pulsos y los muestra en un diagrama de análisis de altura de
pulsos en el monitor del ordenador
3.3.5.2. Equipos y materiales
Equipos:
Planchas de calentamiento con sistema de agitación Magnetos.
Agitador magnético pequeño.
Purificador de agua.
BactoScan FC
31
Materiales:
Probeta de 2000 mL
Probeta de 1000 mL
Probeta de 250 mL
Embudos de vidrio
Vasos de precipitación de 250 mL
Pipeta volumétrica de 25 mL
Pipeta volumétrica de 10 mL
Reactivos:
Rinse Concentrate.
Detergente.
Buffer Power.
Enzima Mini o Enzima 50
Stainig Mediun.
Amoniaco al 25%
Acido Bórico
Glicerol
Lactato de Ringer
Sorbato de Potasio
3.3.5.3. Preparación de soluciones
Stock de líquido portador:
Se agregó 8 litros de agua purificada en una botella de 10 litros y con cuidado añadió un
paquete de polvo Buffer.
Se Agito la mezcla hasta que el polvo se disolvió. Se puede acelerar el proceso calentando
a 40°C durante la agitación.
Una vez disuelto el polvo, se añadió 500 mL de Detergente (una botella) y despacio se
llenó hasta la marca de 10 litros ± 2% con agua purificada para evitar la formación de
espuma.
Puede almacenarse hasta seis semanas a temperatura ambiente, no refrigerar.
Stock de reactivo colorante:
32
Se agregó 8 litros de agua purificada en una botella de 10 litros y con cuidado se añado r
un paquete de polvo Buffer.
Se agito la mezcla hasta que el polvo se haya disuelto.
Una vez disuelto el polvo, se agregó una botella de medio colorante, 500 mL de detergente
(una botella) y despacio, selleno con agua purificada hasta la marca de 10 litros ± 2%
Almacenar en lugar oscuro hasta 6 semanas a temperatura de ambiente, no refrigerar.
Colorante de stock para Enzima Mini:
Se agregó 8 litros de agua purificada en una botella para 10 litros y con cuidado añadió un
paquete de Polvo Buffer.
Se agito la mezcla hasta que se haya disuelto el polvo.
En el polvo disuelto , añadir una botella de medio colorante poco a poco, hasta llenar la
marca de 10 litros ± 2% con agua purificada para evitar espuma.
Guardar en lugar oscuro durante hasta 4 meses a temperatura ambiente, no refrigerar.
Rehidratación para muestra de control bacteriano:
Requiere: Pastillas Ringer, 1/4 concentración, p.e. Oxoid Unipath.
Se agregó Agregar una pastilla Ringer en una botella de 1 litro, se añadió 300 mL de agua
purificada y de solución de stock de preservación.
Se agito la mezcla hasta que la pastilla se haya disuelto.
Almacenar a temperatura de ambiente (<25°C) durante hasta 1 semana.
Líquido portador:
Se agregó 8 litros ± 10% de agua purificada y 2 litros ± 10% de líquido portador pronto
para usar en un recipiente para 10 litros.
Tapar y mezclar con una varilla magnética, durante el uso, la temperatura de los líquidos
deberá ser superior a 15°C.
Solución blanca:
Se mezcló 1 litro ± 10% de agua purificada y 50 mL ± 10% de Solución blanca pronta para
usar en una botella limpia para 1 litro y agitar bien. Usar en el día de su preparación.
Solución de final:
Se agregó 10 litros ± 10% de agua purificada y echar en 50 mL ± 10% del 25% de
Amonio. Agitar bien.
33
Puede almacenarse a temperatura ambiental (< 25°C) durante un período máximo de una
semana.
Pasada una semana, desechar los restos y hacer nueva solución, durante el uso, la
temperatura de los líquidos deberá ser superior a 15°C.
Solución de Lavado:
Primero, se agregó 100 mL de Concentrado de Lavado en un recipiente para 50 litros,
luego se añadió 50 litros de agua purificada para asegurar que el Concentrado de Lavado
se mezcle por completo con el agua.
Agitar detenidamente la solución.
Deberá almacenarse a temperatura de ambiente (15 - 25°C) durante un período máximo de
una semana.
3.3.5.4.Realización del ensayo en citometria de flujo
Figura 3.4 Toma de muestra en el equipo BactoScan FC
34
Figura 3.5Equipo BactoSca FT
3.3.6. Comparación del método de recuento en placa y los resultados del equipo
BactoScan FC
a) Precisión (Repetibilidad/ Reproducibilidad)
La precisión de reproducibilidad que mide la siguiente SR es la del método en el laboratorio (es por
tanto una medida de precisión intermedia según el esquema de la norma ISO 5725, que define la
SR como desviación estándar de reproducibilidad del método, incluyendo la variabilidad que
proviene de los distintos laboratorios de un ensayo interlaboratorios adecuado. (INEN V. D.)
El estudio de la precisión se puede realizar calculando, a través del análisis simple de varianza
(ANOVA de factores totalmente anidados y homogéneos), las desviaciones estándar de
repetibilidad (sr) y de reproducibilidad (SR) para cada uno de los niveles de ensayo.
Para la ejecución de esta prueba se trabajó con un diseño de factores completamente anidados en el
que el factor B (analistas y repeticiones) está anidado en el factor A (días). Realizando un ANOVA
de un factor y mediante la F de Fisher determinar si existe o no diferencia significativa entre la
desviación.
35
Tabla 3.2. Repetibilidad y reproducibilidad: Diseño de Factores Totalmente Anidados
Elaborado por: Paúl Bohórquez
Hipótesis:
𝑯𝒐: 𝑺𝒃𝟐 = 𝑺𝒘𝟐
𝑯𝒊: 𝑺𝒃𝟐 > 𝑺𝒘𝟐
Donde
𝑺𝒃𝟐: Varianza entre grupos “Días”
𝑺𝒘𝟐: Varianza dentro del grupo “Repeticiones”
f) Se utilizaron las siguientes fórmulas para los cálculos de repetibilidad:
Cuadrados medios entre grupos (SDB)
r ∑(Xt − Xg)2
t
i=1
Cuadrados medios dentro de grupos (SDW)
r ∑ ∑(Xi − Xt)2
r
j=1
t
i=1
g) Se utilizaron las siguientes ecuaciones para el cálculo de repetibilidad:
𝑆𝑟 = √𝐷𝐶𝑀𝑤
𝑆𝐷𝐶𝑊 = r ∑ ∑(Xi − Xt)2 = 454.83
r
j=1
t
i=1
Días
1 2 3 4
Analista 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Observaciones o
repeticiones
36
h) Se utilizaron las siguientes fórmulas para los cálculos de reproducibilidad:
Cuadrados medios entre grupos (SDB)
r ∑(Xt − Xg)2
t
i=1
Cuadrados medios dentro de grupos (SDW)
r ∑ ∑(Xi − Xt)2
r
j=1
t
i=1
i) Se utilizaron las siguientes ecuaciones para el cálculo de repetibilidad:
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =𝑆𝑅
�̅�∗ 100
j) Coeficiente de correlación de Pearson
En estadística, el coeficiente de correlación de Pearson es una medida de la relación lineal entre
dos variables aleatorias cuantitativas. A diferencia de la covarianza, la correlación de Pearson
es independiente de la escala de medida de las variables.
37
De manera menos formal, podemos definir el coeficiente de correlación de Pearson como un
índice que puede utilizarse para medir el grado de relación de dos variables siempre y cuando
ambas sean cuantitativas.
En el caso de que se esté estudiando dos variables aleatorias x e y sobre una población; el
coeficiente de correlación de Pearson se simboliza con la letra , siendo la expresión que
nos permite calcularlo:
Dónde:
es la covarianza de
es la desviación típica de la variable
es la desviación típica de la variable
De manera análoga podemos calcular este coeficiente sobre un estadístico muestral, denotado como
a:
k) Interpretación
El valor del índice de correlación varía en el intervalo [-1,1]:
Si r = 1, existe una correlación positiva perfecta. El índice indica una dependencia total
entre las dos variables denominada relación directa: cuando una de ellas aumenta, la otra
también lo hace en proporción constante.
Si 0 < r < 1, existe una correlación positiva.
Si r = 0, no existe relación lineal. Pero esto no necesariamente implica que las variables son
independientes: pueden existir todavía relaciones no lineales entre las dos variables.
Si -1 < r < 0, existe una correlación negativa.
Si r = -1, existe una correlación negativa perfecta. El índice indica una dependencia total
entre las dos variables llamada relación inversa: cuando una de ellas aumenta, la otra
disminuye en proporción constante.
38
3.3.7. Diagrama de Experimentación
Para los ensayos se utilizó el siguiente el siguiente diagrama.
RESULTADOS
IBC/mL
EQUIPO
BACTOSCAN
MUESTRA
HOMOGENEA
MUESTRAS DE
LECHE
ANÁLISIS
CITOMETRIA DE
FLUJO
MÉTODO
TRADICIONAL
MUESTRAS DE
LECHE
ESTERILIZACIÒN DE
MATERIALES,
PREPARACION DE
DILUCIONES Y
SIEMBRA
INCUBACIÓN Y
CONTAJE
RESULTADOS
UFC/mL
39
CAPITULO IV
4. Análisis e Interpretación de resultados
4.1. Resultados de los análisis realizados con las técnicas de citometría de flujo y
recuento en placa.
Se tomó un solo lote (una sola vaca), el cual se dividió en 10 muestreos en varios días , se tomó de
cada uno de los muestreos 12 muestras de leche sin conservante para ser analizadas 6 muestras
con la metodología de citometría de flujo y las otras 6 con la metodología de recuento en placa, el
volumen aproximado por muestra es de 50 mL, dando los siguientes resultados.
A= Método de recuento en placa
B= Método de citometría de flujo
Tabla 4.1 Datos obtenidos de los muestreos
MUESTRAS A B
1 384 2030
2 383 2050
3 380 2020
4 381 2040
5 387 2036
6 388 2028
7 385 2041
8 383 2081
9 387 2020
10 383 2047
11 386 2036
12 382 2028
13 385 2019
14 383 2079
15 387 2010
16 382 2040
17 381 2035
18 389 2020
19 383 2040
20 389 2060
21 386 2020
22 384 2015
23 389 2019
24 382 2028
25 384 2069
26 380 2060
40
MUESTRAS A B
27 378 2066
28 375 2068
29 378 2069
30 379 2070
31 386 2078
32 387 2068
33 380 2047
34 381 2048
35 389 2036
36 388 2035
37 381 2045
38 387 2048
39 388 2079
40 381 2089
41 387 2021
42 388 2024
43 385 2021
44 380 2028
45 383 2029
46 385 2026
47 383 2036
48 389 2046
49 384 2086
50 387 2084
51 388 2085
52 387 2045
53 389 2065
54 383 2034
55 387 2039
56 382 2092
57 388 2031
58 384 2058
59 389 2047
60 382 2039
4.2. Recuperabilidad
4.2.1. Recuperabilidad (%) método con el equipo BactoScan FT
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜∗ 100%
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =2045,8800
2068∗ 100%
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 98,93%
4.2.2. Recuperabilidad % del método de recuento en placa
41
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜∗ 100%
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =384,34
388.3704∗ 100%
%𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 98,96%
Para demostrar que los métodos son capaces de determinar el analito se realizaron pruebas de
recuperabilidad a través de un Material de Referencia (Bacterial Control Sample de Lote 6004232).
Los porcentajes de recuperación fueron, 98,93% para el método utilizado con el equipo BactoScan
FC y 98,96% para el método de recuento en placa.
4.3. PRECISIÓN
4.3.1. Repetibilidad de los datos obtenidos con el método de recuento en placa
Tabla 4.2 Datos experimentales para repetibilidad
Mediciones (x) UFC/1000 mL
Días
REPETIBILIDAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 384 385 385 383 384 386 381 385 384 387
2 383 383 383 389 380 387 387 380 387 382
3 380 387 387 386 378 380 388 383 388 388
4 381 383 382 384 375 381 381 385 387 384
5 387 386 381 389 378 389 387 383 389 389
6 388 382 389 382 379 388 388 389 383 382
SUMA 2303 2306 2307 2313 2274 2311 2312 2305 2318 2312
PROMEDIO (Xt) 383,8 384,3 384,5 385,5 379,0 385,2 385,3 384,2 386,3 385,3
Media(Xg) 384,35
42
Cuadrados medios entre grupos (SDB)
r ∑(Xt − Xg)2
t
i=1
Tabla 4.3 Cuadrados medios entre grupos
(xt - xg) ^2
0,27
0,00
0,02
1,32
28,62
0,67
0,97
0,03
3,93
0,97
Sumatoria 31,90
producto (r x suma) 191,41
Cuadrados medios dentro de grupos (SDW)
r ∑ ∑(Xi − Xt)2
r
j=1
t
i=1
43
Tabla 4.4 Cuadrados medios dentro de grupos
Total SDB + SDW = 191,41 + 454,83 = 2497,61
TOTAL (SDB + SDW) 646,2467
Cálculos de repetibilidad
Se utilizaron las siguientes ecuaciones:
𝑆𝑟 = √𝐷𝐶𝑀𝑤
𝑆𝐷𝐶𝑊 = r ∑ ∑(Xi − Xt)2 = 454.83
r
j=1
t
i=1
𝐷𝐶𝑀𝑊 =SDCW
n − t=
454.83
54= 8.40
𝑆𝑟 = √8.40
𝑺𝒓 = 𝟐. 𝟖𝟗
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑟 =𝑆𝑟
�̅�∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =2.89
384.35∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑟 = 0.75%
Prueba F
V1 y V2 = Grados de libertad
t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10
(xi - xt)^2 (xi - xt)^2 (xi - xt)^2 (xi - xt)^2 (xi - xt)^2 (xi - xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2 (xi - xt)^2 (xi - xt)^2
0,0 0,4 0,3 6,3 25,0 0,7 18,8 0,7 5,4 2,8
0,7 1,8 2,3 12,3 1,0 3,4 2,8 17,4 0,4 11,1
14,7 7,1 6,3 0,3 1,0 26,7 7,1 1,4 2,8 7,1
8,0 1,8 6,3 2,3 16,0 17,4 18,8 0,7 0,4 1,8
10,0 2,8 12,3 12,3 1,0 14,7 2,8 1,4 7,1 13,4
17,4 5,4 20,3 12,3 0,0 8,0 7,1 23,4 11,1 11,1
SDW
454,83333
3
44
t= grupos muestrales = 10
n= número total de elementos=60
r= tamaño de la muestra= 6
Tabla 4.5 Análisis de varianza repetibilidad
Fuente GL Sum
Cuadrados
Cuadrado
Medio F Sr SL
2 SR CVR
Error (= t(r-1) ) 50 454,8333 9,0966667 2,69
Tratamiento (= t-1 ) 9 191,4133 24,535
8,5 -52,7 53,4 13,9
Total (= rt-1) 59 646,2467
𝐹𝑇𝑎𝑏 99% 2,7849557
4.3.2. Repetibilidad de los datos obtenidos con el método de citometria de flujo
Tabla 4.6 Datos experimentales para repetibilidad
Mediciones (x) IBC/1000 mL
Días
REPETIBILIDAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2030 2041 2019 2040 2069 2078 2045 2021 2086 2039
2 2050 2081 2079 2060 2060 2068 2048 2028 2084 2092
3 2020 2020 2010 2020 2066 2047 2079 2029 2085 2031
4 2040 2047 2040 2015 2068 2048 2089 2026 2045 2058
5 2036 2036 2035 2019 2069 2036 2021 2036 2065 2047
6 2028 2028 2020 2028 2070 2035 2024 2046 2034 2039
SUMA 12204 12253 12203 12182 12402 12312 12306 12186 12399 12306
PROMEDIO (Xt) 2034,0 2042,2 2033,8 2030,3 2067,0 2052,0 2051,0 2031,0 2066,5 2051,0
Media(Xg)
2045,883333
45
Tabla 4.7 Cuadrados medios entre grupos
(xt - xg) ^2
141,21
13,81
145,20
241,80
445,91
37,41
26,18
221,51
425,05
26,18
Sumatoria 1273,05
producto (r x suma) 7638,32
Cuadrados medios dentro de grupos (SDW)
r ∑ ∑(Xi − Xt)2
r
j=1
t
i=1
Tabla 4.8 Cuadrados medios dentro de grupos repetibilidad
Total SDB + SDW = 7638,32+ 18174,5 = 25812,82
TOTAL (SDB + SDW) 25812,82
t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10
(xi - xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
16,0 1,4 220,0 93,4 4,0 676,0 36,0 100,0 380,3 144,0
256,0 1508,0 2040,0 880,1 49,0 256,0 9,0 9,0 306,3 1681,0
196,0 491,4 568,0 106,8 1,0 25,0 784,0 4,0 342,3 400,0
36,0 23,4 38,0 235,1 1,0 16,0 1444,0 25,0 462,3 49,0
4,0 38,0 1,4 128,4 4,0 256,0 900,0 25,0 2,3 16,0
36,0 200,7 191,4 5,4 9,0 289,0 729,0 225,0 1056,3 144,0
SDW 18174,5
46
Cálculos de repetibilidad
Se utilizaron las siguientes ecuaciones:
𝑆𝑟 = √𝐷𝐶𝑀𝑤
𝑆𝐷𝐶𝑊 = r ∑ ∑(Xi − Xt)2 = 454.83
r
j=1
t
i=1
𝐷𝐶𝑀𝑊 =SDCW
n − t=
7638,32
54= 141,45
𝑆𝑟 = √141,45
𝑺𝒓 = 𝟏𝟏, 𝟖𝟗
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑟 =𝑆𝑟
�̅�∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =11,89
2045,88∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑟 = 0.58%
Prueba F
V1 y V2 = Grados de libertad
t= grupos muestrales = 10
n= número total de elementos=60
r= tamaño de la muestra= 6
Tabla 4.9 Análisis de varianza repetibilidad
Fuente GL Sum
Cuadrados
Cuadrado
Medio F Sr SL
2 SR CVR
Error (= t(r-1) ) 50 18174,5000 363,49 2,3348709
Tratamiento (= t-1 ) 9 7638,3200 848,70222 8,5 -2107,2 2107,3 103,0
Total (= rt-1) 59 25812,8200
Ftabulado 2,7849557
47
4.3.3. Reproducibilidad método de recuento en placa
Tabla 4.10 Datos experimentales reproducibilidad
Cua
dra
dos
med
ios
entr
e
gru
pos
(SD
B)
r ∑(Xt − Xg)2
t
i=1
Mediciones (x) UFC/1000 mL
REPRODUC. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MUESTRA
Analista 1
Analista 2
1 384 385 385 383 384 385 383 384 382 381
2 383 383 383 389 380 385 380 383 386 382
3 380 387 387 386 378 383 389 385 382 385
4 381 383 382 384 375 382 384 383 385 385
5 387 386 381 389 378 388 389 381 387 380
6 388 382 389 382 379 380 387 380 383 385
SUMA 2303 2306 2307 2313 2274 2303 2312 2296 2305 2298
PROMEDIO
(Xt) 383,8 384,3 384,5 385,5 379,0 383,8 385,3 382,7 384,2 383,0
Media(Xg)
383,61
48
Tabla 4.11 Cuadrados medios entre grupos reproducibilidad recuento en placa
(xt - xg)
2
0,05
0,51
0,78
3,55
21,31
0,05
2,95
0,90
0,30
0,38
Sumatoria 30,10
producto (r x suma) 180,59
Cuadrados medios dentro de grupos (SDW)
r ∑ ∑(Xi − Xt)2
r
j=1
t
i=1
Tabla 4.12 Cuadrados medios dentro de grupos reproducibilidad recuento en placa
t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t0
(xi - xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
0,0 0,4 0,3 6,3 25,0 1,4 5,4 1,8 4,7 4,0
0,7 1,8 2,3 12,3 1,0 1,4 28,4 0,1 3,4 1,0
14,7 7,1 6,3 0,3 1,0 0,7 13,4 5,4 4,7 4,0
8,0 1,8 6,3 2,3 16,0 3,4 1,8 0,1 0,7 4,0
10,0 2,8 12,3 12,3 1,0 17,4 13,4 2,8 8,0 9,0
17,4 5,4 20,3 12,3 0,0 14,7 2,8 7,1 1,4 4,0
SDW 377,5
Total SDB + SDW = 180,59 + 377,5= 558,09
49
𝑆𝑅 = √𝐷𝐶𝑀𝐵
𝑆𝐷𝐶𝐵 = r ∑ ∑(Xt − Xg)2 = 180,59
r
j=1
t
i=1
𝐷𝐶𝑀𝑊 =SDCW
t − 1=
180,59
4= 45,14
𝑆𝑅 = √45,14
𝑺𝒓 = 𝟔, 𝟕𝟏
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =𝑆𝑅
�̅�∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =6,71
383,61∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 = 1.75%
Prueba F
V1 y V2 = Grados de libertad
t= grupos muestrales = 10
n= número total de elementos=64
r= tamaño de la muestra= 6
Tabla 4.13 Análisis de varianza reproducibilidad recuento en placa
Fuente GL
Sum
Cuadrado
s
Cuadrado
Medio F Sr SL
2 SR CVR
Error (= t(r-1) ) 50 377,5000 7,55
2,6576404
2
Tratamiento (= t-1 ) 9 180,5867 20,065185 8,5 -39,4 40,3 10,5
Total (= rt-1) 59 558,0867
F
tabulado 2,7849557
50
4.3.4. Reproducibilidad método de citometria de flujo
Tabla 4.14 Datos experimentales reproducibilidad
Mediciones (x) IBC/1000 mL
REPRODUC. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MUESTRA
ANALISTA 1
ANALISTA 2
1 2030 2041 2019 2040 2069 2035 2033 2045 2034 2058
2 2050 2081 2079 2060 2060 2036 2034 2054 2067 2060
3 2020 2020 2010 2020 2066 2049 2038 2057 2065 2069
4 2040 2047 2040 2015 2068 2040 2041 2065 2060 2041
5 2036 2036 2035 2019 2069 2050 2051 2064 2030 2030
6 2028 2028 2020 2028 2070 2046 2060 2042 2010 2018
SUMA 12204 12253 12203 12182 12402 12256 12257 12327 12266 12276
PROMEDIO
(Xt) 2034,0 2042,2 2033,8 2030,3 2067,0 2042,7 2042,8 2054,5 2044,3 2046,0
Media(Xg) 2043,72
Cuadrados medios entre grupos (SDB)
r ∑(Xt − Xg)2
t
i=1
51
Tabla 4.15 Cuadrados medios entre grupos reproducibilidad citometria de flujo
(xt - xg)
2
95,39
2,56
98,67
180,45
539,79
1,21
0,87
115,20
0,32
4,99
Sumatoria 1034,15
producto (r x suma) 6204,88
Cuadrados medios dentro de grupos (SDW)
r ∑ ∑(Xi − Xt)2
r
j=1
t
i=1
Tabla 4.16 Cuadrados medios dentro de grupos reproducibilidad recuento en placa
t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10
(xi - xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
(xi -
xt)^2
16,0 1,4 220,0 93,4 4,0 58,8 96,7 90,3 106,8 144,0
256,0 1508,0 2040,0 880,1 49,0 44,4 78,0 0,3 513,8 196,0
196,0 491,4 568,0 106,8 1,0 40,1 23,4 6,3 427,1 529,0
36,0 23,4 38,0 235,1 1,0 7,1 3,4 110,3 245,4 25,0
4,0 38,0 1,4 128,4 4,0 53,8 66,7 90,3 205,4 256,0
36,0 200,7 191,4 5,4 9,0 11,1 294,7 156,3 1178,8 784,0
SDW 13226
Total SDB + SDW = 6204,88 + 13226= 19430,88
52
𝑆𝑅 = √𝐷𝐶𝑀𝐵
𝑆𝐷𝐶𝐵 = r ∑ ∑(Xt − Xg)2 = 6204,88
r
j=1
t
i=1
𝐷𝐶𝑀𝑊 =SDCW
t − 1=
6204,88
4= 1551,22
𝑆𝑅 = √1551,22
𝑺𝒓 = 𝟑𝟗, 𝟑𝟖
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =𝑆𝑅
�̅�∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 =39,38
2043,76∗ 100
𝐶𝑉 = 𝑅𝑆𝐷𝑅 = 1,92%
Prueba F
V1 y V2 = Grados de libertad
t= grupos muestrales = 10
n= número total de elementos=64
r= tamaño de la muestra= 6
Tabla 4.17 Análisis de varianza reproducibilidad método de citometria de flujo
Fuente GL Sum
Cuadrados
Cuadrado
Medio F Sr SL
2 SR CVR
Error (= t(r-1) ) 50 13226,0000 264,52 2,60634777
Tratamiento (= t-1 ) 9 6204,8800 689,43111 8,5 -1404,2 1404,2 68,7
Total (= rt-1) 59 19430,8800
F tabulado 2,7849557
53
4.4. Calculo de la ecuación de correlación
Para obtener el la ecuación de correlación se utilizó los resultados de IBC y UFC de los 10
muestreos realizados los cuales se linealizaron el log10, para ser graficados y obtener una ecuación
Tabla 4.18 de resultados de IBC y UFC en LOG10
MUESTRAS log ufc
A
log ibc
B
1 2,58433122 3,30749604
2 2,58319877 3,31175386
3 2,57978360 3,30535137
4 2,58092498 3,30963017
5 2,58771097 3,30877777
6 2,58883173 3,30706795
7 2,58546073 3,30984300
8 2,58319877 3,31827208
9 2,58771097 3,30535137
10 2,58319877 3,31111784
11 2,58658730 3,30877777
12 2,58206336 3,30706795
13 2,58546073 3,30513632
14 2,58319877 3,31785449
15 2,58771097 3,30319606
16 2,58206336 3,30963017
17 2,58092498 3,30856441
18 2,58994960 3,30535137
19 2,58319877 3,30963017
20 2,58994960 3,31386722
21 2,58658730 3,30535137
22 2,58433122 3,30427505
23 2,58994960 3,30513632
24 2,58206336 3,30706795
25 2,58433122 3,31576049
26 2,57978360 3,31386722
54
MUESTRAS log ufc
A
log ibc
B
27 2,57749180 3,31513032
28 2,57403127 3,31555053
29 2,57749180 3,31576049
30 2,57863921 3,31597035
31 2,58658730 3,31764554
32 2,58771097 3,31555053
33 2,57978360 3,31111784
34 2,58092498 3,31132995
35 2,58994960 3,30877777
36 2,58883173 3,30856441
37 2,58092498 3,31069331
38 2,58771097 3,31132995
39 2,58883173 3,31785449
40 2,58092498 3,31993844
41 2,58771097 3,30556631
42 2,58883173 3,30621051
43 2,58546073 3,30556631
44 2,57978360 3,30706795
45 2,58319877 3,30728205
46 2,58546073 3,30663944
47 2,58319877 3,30877777
48 2,58994960 3,31090563
49 2,58433122 3,31931430
50 2,58771097 3,31889771
51 2,58883173 3,31910606
52 2,58771097 3,31069331
53 2,58994960 3,31492006
54 2,58319877 3,30835095
55 2,58771097 3,30941723
56 2,58206336 3,32056168
57 2,58883173 3,30770992
58 2,58433122 3,31344537
59 2,58994960 3,31111784
60 2,58206336 3,30941723
55
Figura 4.1 Grafica para obtener el factor de correlación
Dónde:
log cfu= -0.169logibc + 3.144
Ecuación ufc = e^(-0169ln(ibc) + 3.144*ln10)
y = -0,169x + 3,1441 R² = 0,98
2,5722,5742,5762,578
2,582,5822,5842,5862,588
2,592,592
3,3 3,305 3,31 3,315 3,32 3,325
log1
0 u
fc
log10 ibc
Gráfica Ecuación de Correlación
56
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Para transformar las unidades IBC en UFC la cual está referenciada en la norma
INEN9:2012 se aplica la ecuación de correlación ufc=e^(-0169ln(ibc) + 3.144*ln10)
La ecuación de correlación es sumamente importante debido a que el método de citometría
de flujo es rápido, menos costo, lo que permite al productor conocer los datos con mayor
frecuencia y esto ayudara a mejorar la calidad de la leche en el sector lácteo.
Después del estudio realizado se puede evidenciar que las dos metodologías de citometria
de flujo y recuento en placa pueden ser comparadas entre sí.
Al sustituir el método de recuento en placa por citometría de flujo, se obtiene resultados en
10 minutos que permite la toma de decisión más rápido.
Para demostrar que los métodos determinan el analito se realizaron pruebas de
recuperabilidad a través de un Material de Referencia (Bacterial Control Sample de Lote
6004232). Los porcentajes de recuperación fueron, 98,93% para el método utilizado con el
equipo BactoScan FC y 98,96% para el método de recuento en placa.
Los coeficientes de variación de repetibilidad y reproducibilidad de cada una de los
métodos es inferior al 3 %; por lo tanto, no existe variación significativa entre los datos
hechos por varios analistas en diferentes días; lo que quiere decir que los resultados son
repetibles y reproducibles.
Al obtener una ecuación de correlación se reduce costos y tiempos por lo que un mayor
número de muestras pueden ser analizadas y garantizar la calidad higiénica
microbiológica.
Esta investigación contribuye al objetivo 3 del Plan Nacional del Buen Vivir. “Mejora la
calidad de vida de la población porque el productor conoce su producción y la mejora, de
esta manera ayuda a la economía del país”.
57
5.2. Recomendaciones
Realizar un estudio a nivel de las industrias lácteas que dispongan equipos de citometría de
flujo con el fin de unificar una sola ecuación de correlación para evitar inconvenientes al
momento de realizar el pago por calidad higiénica.
Sugerir al Instituto Nacional de Normalización Ecuatoriana que realice una actualización
para que referencia en la tabla de requisitos microbiológicos de la Norma INEN9:2012 las
dos unidades IBC y UFC.
Realizar un estudio con muestras que tenga conservante azidiol para verificar si hay un
cambio al comparar con el método tradicional de recuento en placa.
58
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ANEXOS
Anexos A Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 9:2012. Leche cruda. Requisitos
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Anexos B Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 3. “Leche y productos lácteos. Terminología.”
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Anexos C Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1529. “Determinación de Aerobios M”.
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Anexos D Instructivo INT/CL/010
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Anexos E Acuerdo Ministerial 394 del 4 de septiembre del 2013.
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Anexos F Acuerdo Interministerial 2013-001, de 15 de marzo del 2013
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