UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA

CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA EN BIOLOGíA

PROYECTO FINAL

'' INTERPRETACION DE DATOS ELISA Y ESTABLECIMIENTO DEL RANGO POSITIVO

NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS CITRICOS (VTC),MUESTRAS

SIMPLES

DR. DANIEL TELIZ ORTIZ ASESOR EXTERNO

M.en.C MARTIN VALENCIA ACEVES

MATRICULA : 85239323

INTERPRETACION DE DATOS ELISA Y

ESTABLECIMIENTO DEL RANGO POSITIVO

NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS

TRISTEZA DE LOS CITRICOS (VTC),

MUESTRAS SIMPLES

CONTENIDO:

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES:

o Importancia económica el Virus Tristeza de los Cítricos (VTC) 0 Distribución de la enfermedad 0 Descripción del Virus tristeza de los Cítricos 0 Transmisión 0 Síntomas 0 Metodología de detección 0 Principio de ELISA 0 Antecedentes del VTC

OBJETIVOS:

MATERIAL Y METODO: 0 Trabajo de campo 0 Trabajo de laboratorio:

RESULTADOS:

DISCUSION:

VENTAJAS:

DESVENTAJAS:

CONCLUSION:

RECOMENDACIONES:

APENDICES:

BIBLIOGRAFIA

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES: I Con base a las estadísticas elaboradas por FA0 (1991), la producción mundial de los cítricos se considera que es de 60 millones de toneladas anuales; de esta cifra los países Sudamericanos aportan el 29.1%; el 23.3% es aportado por Asia; un 23% por Norte y Centro América; un 11% por Europa; un 8% por Africa y el restante 5.6% por Oceania y por la ex-Unión Soviética (Fig 1). Del total de la producción, el porcentaje que corresponde por producto cítrico es de 66.2% para naranja,l5.6% mandarinas, 8.8% toronjas, 8.5% limones y el restante 0.9% con otras especies (Fig 2). (FAO, 1991).

Por otra parte, en orden de importancia como país productor, se encuentran: Brasil (23.7%), Estados Unidos (15.2%), España (.5%), China (6.45%), Italia (.3%) y México, que ocupa el sexto lugar (4.9%). En total estos países aportan más del 60% de la producción mundial (Fig 3 ) (FAO, 1991).

México cuenta en la actualidad, con una superficie total de más de 313 O00 mil ha. dedicadas al cultivo de los cítricos, los cuales proporcionan una producción anual promedio estimada en 3.5 millones de toneladas; siendo el principal productor de limón mexicano a nivel mundial y sexto en producción de naranjo. Con lo anterior, se benefician 38 500 productores mexicanos.

A nivel nacional, la superficie destinada a cítricos ocupa el 23% del total que se destina a frutales, dicha superficie se distribuye en los siguientes Estados de la República Mexicana, de acuerdo al tipo de cítrico:

1. Naranja, mandarina y toronja. Veracruz, Nuevo León, San Luis Potosí y Tamaulipas que aportan el 75 % de la producción nacional.

2. Limón. Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca, que aportan el 14.9%; Yucatán, Sonora, Sinaloa y Tabasco que aportan el 9.5%.(INEGI. 1993).

La industria citricola de México, además de proporcionar fruta para consumo local y para exportación, representa un importante apoyo para la economía del país proporcionando fuente de divisas y de empleo para una gran parte de la población.

Prácticamente, todas las plantaciones comerciales de cítricos en México están injertados sobre patrón de naranjo agrio (Citrus aurantium L.). No obstante las ventajas agronómicas que representa el empleo de este portainjerto, es extremadamente susceptible al virus tristeza de los cítricos (VTC), el cual ha eliminado millones de árboles crecidos sobre este patrón de naranjo, ocasionando cambios radicales en muchas áreas citrícolas del mundo como Brasil, Uruguay, Argentina, California y Florida, E.U.A, España e Israel.

Esta enfermedad de "tristeza", ocasionada por un virus es la mas destructiva que se conoce (Roistacher, C.N. 1976), ya que puede disminuir gradualmente la calidad y rendimiento de los frutos cítricos o matar los árboles en un corto período. Originalmente, era considerada una enfermedad que se presentaba solamente en ciertas combinaciones susceptibles de patrón- injerto, como naranjo agrio con naranja, toronja o mandarina y, especies muy susceptibles como limón mexicano y Citrus macrophilla Wester; sin embargo, el virus es tan cambiante que continuamente forma nuevas líneas o variantes que se transmiten más rápidamente, o son más virulentos y que atacan a las combinaciones de patrón-injerto antes considerados resistentes.

Produccón anual estimada en 60 millones de tonelada

Fig. l. Producción mundial de citricos por región.

Limones Otras spp. 1 %

T oronja 1 9 %

’ i ‘I

/’

fig 2. Porciento de producción por producto cítrico a nivel mundial

En total aportan el 60% de la producción mundial

E s paiia 12% E S tados U nidos

24%

México 8%

B r a i l 38%

fig.3 Principales países productores de cítricos

Transmisión

El virus tristeza de los cítricos es transmitido, además de por injertos naturales y artificiales, por una serie de organismos vectores. Tales agentes diseminadores incluyen principalmente al grupo de los áfidos o pulgones que hospedan los cítricos, entre los que se pueden citar como vectores potenciales Toxoptera citvicidus kirk, T. auruntii Boyer De Fonscolombe, Aphis gossypii Glover, A. spiraecola Patch, A. cruccivora koch y Dactynotus jacae L.(klotz, L.J., E.C. Calavan, and L.G. Weathers. 1972.)

El más importante y eficiente de ellos es el áfido café Toxoptera citricidus; probablemente es nativo de China y actualmente se encuentra distribuido en una gran cantidad de regiones citricolas del mundo. Aunque es considerado como una especie tropical, el áfido existe en los lugares fríos del Japón, en el sur del desierto del Sahara, en la India, Ceylan, en las regiones áridas de Africa del Sur, Australia, y Nueva Zelanda; así como, en todos los países del Oriente, es en si una plaga de consideración del cultivo de cítricos. No se transmite por semilla (McClean, 1957). La transmisión de planta a planta por equipo de campo es aparentemente rara, aunque experimentalmente el virus puede transmitirse mecánicamente al causar heridas en el tallo. (Becerra, Leor. Enrique Noe. 1996).

Síntomas:

Los síntomas de los árboles con tristeza son similares a los de un árbol cuyo sistema radical ha sido dañado por hongos del suelo, empantanamiento, exceso de fertilizante u otro daño similar. El primer síntoma apreciable es una coloración ceniza de las hojas las cuales se tuercen hacia arriba como denotando falta de agua. En los primeros estadios los árboles cargan más que los sanos y entran en cosecha 1 o 2 años antes. En esta fase, las raicillas de la periferia mueren y demuestran un abatimiento del contenido de almidón diagnosticable con la prueba del yodo. Conforme avanza la muerte de raíces la copa del árbol se deteriora, las hojas se marchitan y caen. Esto ocurre más frecuentemente en los períodos de sequía. Los síntomas descritos corresponden a la combinación susceptible de patrón agrio injertado con naranja, toronja o mandarina infectados con el virus de la tristeza; sin embargo, estos pueden cambiar con diferente combinación patrón-injerto o especies de cítricos y con otra línea de virus pertenecientes al mismo complejo de la tristeza. El mejor indicador para diagnosticar la enfermedad es el limón mexicano (Citrus uurantifolia Christm.) (Swing). Las plántulas y los árboles de distintas variedades pueden mostrar también picadura de tallo y las plántulas de árboles de distintas variedades pueden mostrar los síntomas de amarillamiento (Agrios, 1991) .

Métodos de detección:

Las pruebas serolópcas se basan en la propiedad que tienen los virus de ser altamente antigénicos debido a su naturaleza química, ya que al ser introducidos a un organismo son considerados como cuerpos extraños (antigenos) y son capaces de inducir la información de anticuerpos contra ellos ( Hernández, M .1993).

Además, del empleo de plantas indicadoras para la detección del virus existen varios métodos por los cuales el virus tristeza de los cítricos puede ser detectado en tejido infectado. Tales métodos incluyen:

0 Inmunodifusión con dodecil sulfato de sodio (Bar-Joseph, M., Garnsey, S.M., Gonsalves, D.,

- 0 lnmunoadsorción ligada a enzima (ELISA) (Bar-Joseph, M., Garnsey , S.M Gonsalves, D., and

0 Inmunoadherencia a membranas de nitrocelulosa (Rocha-Peña, M.A., Lee, R.F. and Niblett,

Microscopía de luz y electrónica (Garnsey, S.M., Christie, R.G., Derrick, K.S., and Bar-Joseph,

Inmunoflurescencia insuti (Brlansky, R. H., Garsey, S.M., Lee, R.F., and Pursifull, D.E. 1984)..

and Purcifull, D.E. 1980),

Purcifull, D.e. 1980) .

C.L. 1991.),

M. 1980),

Cada uno de estos métodos tienen diferentes ventajas, desventajas y niveles de sensibilidad en la detección por lo que tienen diferentes usos y aplicaciones; sin embargo, debido a su gran versatilidad y alta sensibilidad, el método ELISA ha llegado a ser de uso imprescindible en cualquier laboratorio o institución donde se trabaje con el virus tristeza de los cítricos VTC.(Rocha-Peña, M.A and Lee, R.F. 1991).

La prueba ELISA (Inmunoadsorción con enzimas conjugadas) , se basa en la unión que se establece entre antigen0 y anticuerpos solubles que son adsorbidos a una fase sólida insoluble.

Principios de la Técnica (ELISA):

a) La adsorción de un antisuero especifico a la pared de un pozo de plástico. b) Agregar un extracto de planta infectada de virus; las particulas vírales se adherirán a las del

c) Agregar otra vez el antisuero usado inicialmente, pero ahora conjugado con una enzima. El

d) Agregar un sustrato sobre el que la enzima actúe y produzca una coloración, cuya intensidad

antisuero.

conjugado se adherirá al virus.

será proporcional a la concentración del virus.

En cada paso se lava el pozo, por lo que si el virus no está relacionado con el antisuero no habrá adherencia ni color al final .(Téliz, Ortiz, D. et al. 1986) .

La técnica ELISA descrita por primera vez en la literatura médica en 1971 (Enguall and Perlaminn, 1971), se caracteriza por ser:

1. Altamente sensible 2. Rápida 3. Requiere pequeñas cantidades de antisuero(Ghabrie1 y Shepherd, 1980) .

Años más tarde fue introducida a la virología vegetal (Voller y colaboradores 1976) y adaptada en 1977 por Clark y Adams para la detección de virus en plantas. Actualmente la técnica ELISA es de gran utilidad en el diagnóstico de enfermedades vírales.

Antecedentes del VTC en México:

A nivel nacional, se utiliza casi en un 100% el patrón naranjo agrio, con una gran cantidad de variedades injertadas sobre el. La combinación de naranjo agrio o "cucho" con naranjo Valencia es considerado como la combinación más susceptible al VTC. En tal situación, se corre el riesgo

de que desaparezcan 160 202 has plantadas con cítricos en Veracruz y en los estados productores de limón mexicano del Pacífico, donde el 70% de los árboles están establecidos a pie franco.

El primer informe de la detección del VTC en México se reportó en 1983 en el estado de Tamaulipas sobre tres variedades en un vivero; el segundo se da en 1986-87 en un Campo Agrícola Experimental y en un lote demostrativo en el estado de Veracruz sobre 21 variedades; el tercer reporte se presenta en 1992 nuevamente en Veracruz en los mismos sitios sobre 26 plantas y dos viveros; el cuarto se da en 1993 en los Distritos de Desarrollo Rural de Martinez de la Torre, Tlapacoyan, Alamo y Tuxpan, Ver. en 14 viveros .

En cada uno de estos casos, las plantas enfermas se eliminaron completamente. Con respecto, a la ultima detección se erradicaron todos los sitios positivos en 1994 (Rocha P. M.A. et al, 1992; Jasso y Rocha, 1993; Becerra, 1995; Colli y Cardenas, 1995)..

Las especies de áfidos reportados en plantaciones comerciales de Nuevo León, Tamaulipas, San Luis Potosí y Veracruz son: Toxoptera auranfii, Aphis gosypii, A. citricola y Myzus persicae.

OBJETIVOS:

Estandarizar un método estadístico para determinar el rango "positivo-negativo" (plantas sanas- enfermas), en virus tristeza de los cítricos (VTC), en muestras simples.

Estandarizar criterios en la determinación del rango positivo-negativo válidos en cualquier laboratorio en donde se realice el diagnóstico del virus tristeza de los cítricos (VTC), mediante la técnica ELISA en muestras simples.

c MATERIAL Y METODOS:

El Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario, realizó un proyecto para determinar la ausencia o presencia del virus tristeza de los cítricos; así como, el rango positivo- negativo (plantas sanas-enfermas), a la presencia del virus tristeza de los cítricos, en los estados de Campeche, Tabasco, Yucatan y Quintana Roo. Su estudio es tanto en campo como en laboratorio.

Campo:

a) Muestreo. Para determinar el número de muestras el Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, se basó en el modelo “W ”, que consistía en dividir el área (una hectárea) de estudio en forma de ”W, de está forma se tomaron las muestras de cítricos (naranja, limón) al azar. Cada submuestra consistia de 3 brotes tiernos tomadas en diferentes partes de la planta en una hectárea, obteniendo así una submuestra ”simple”.

b) Colecta de muestras. Los brotes tiernos se cortaron del árbol, con tijkras de podar, mismas que eran esterilizadas con hipoclorito de sodio al 1 %, cada que se hacía un corte, para minimizar la posibilidad de la dispersión de la enfermedad. Los 3 brotes tiernos se colocaron en papel secante ó de estrasa, que se humedecia ligeramente.

c) Etiquetado: Después de la colecta de las muestras, se llevó a cabo el llenado de las etiquetas para su identificación, una por muestra, conteniendo información de estado, propietario, vivero o plantaciones comerciales , árbol.

d) Envío de muestras al laboratorio: Las muestras se colocaron en una bolsa de plástico, anexando la dormación codificada en las etiquetas y el nombre del área o lugar al que se remiten las muestras para su análisis. Se transportaron en hieleras al laboratorio por los medios más rápidos disponibles.

Laboratorio.

El procesamiento de las muestras se realizó en el Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario, área de virologia en el laboratorio de serología de la Dirección General de Sanidad Vegetal.

Registro de muestras: Al llegar las muestras se reptraban anotando los datos correspondientes: Lugar de procedencia, propietario, vivero ó plantación comercial, número de muestra, etc.

Procesamiento. Considerando que las técnicas comunes de diagnostico de virus requiere de entre 30 y 60 días para obtener un resultado parcial, se decidió trabajar con la Técnica Serologica ELISA, que se caracteriza por ser altamente sensible, rápida y sobre todo por requerir sólo pequeñas cantidades de antisuero.

Método serologico ELISA :

En el procesamiento de las muestras se retiraba la corteza de los tres brotes tiernos y se cortaban en pedazos de aproximadamente 1-2 mm. Posteriormente, se sometian a la técnica ELISA como se indica a continuación:

1.- Agregar 200 u1 de antisuero atrapador (cabra anti VTC) relación (1:lOOO) en solución amortiguadora (SOLAM) de cobertura a cada pozo de la placa de microtitulación de polietileno. Incubar a 37 "C por 4 a 6 horas o toda la noche (por lo menos 16 horas ) a 6 "C. (Los anticuerpos se adherirán a las paredes del pozo).

Si se mantiene a 6°C , una vez cubierta y sellada la placa con polietileno adherible, se puede usar en un intervalo de 8 días.

2.- Lavado de placa:

Después de cada incubación las celdas de las placas se deben lavar con PBST usando una pizeta. Esperar 3 minutos , vaciar y sacudir fuertemente en una toalla de papel sobre una superficie plana. Repetir el lavado tres veces. Vaciar y sacudir.

(Se eliminará el exceso, pero los anticuerpos quedarán adheridos a las paredes del pozo) .

3.- Preparación y adición de la muestra.

Macerar la planta por probar en una dilución de 1 : l O o 1:20 (peso/vol) , en solam de extracción. Durante el procedimiento, el Solam y las muestras vegetales deben mantenerse frías.

Agregar 200 u1 de savia de cada planta prueba a pozos duplicados.

Incubar la placa durante toda la noche (por lo menos 16 horas) a 6 "C o 37 "C por 4- 6 horas.( Las particulas vírales se adherirán a los anticuerpos, si es que son afines).

4.- Lavar la placa tres veces como en el paso dos.

5.- Adición de anticuerpos secundarios monoclonal (detector) ratón anti- VTC en solam reactivo A en una relación (1:lOOO) . Agregar 200 u1 de esta solución en cada pozo. Incubar por 2 horas a temperatura de 37 "C , de preferencia en cámara húmeda .

6.- Lavar la placa tres veces como en el paso dos.

7.- Adición del conjugado (Antisuero-enzima).

Preparar la solución del conjugado (anti ratón IgG+ fosfatasa alcalina) diluyendo en solam reactivo A en una relación (1:lOOO). Colocar 200 u1 por pozo. Incubar una hora a temperatura de 37 "C.

(El conjugado se adherirá al compuesto virus-anticuerpo pegado a las paredes del pozo y se formará un sandwich anticuerpo-virus-conjugado anticuerpo enzima ).

8.- Lavar la placa tres veces como en el paso dos .

9.- Adición del sustrato.

La solución del sustrato se prepara disolviendo el p-nitrofenil fosfato (PNP) en polvo o tableta en solución dietanolamina(DTA), para una concentración final de 1 mg/ml.. En todos los casos los sustratos deben , ser utilizados inmediatamente después de su preparación. Incubar por 30 a 60 minutos a temperatura de 37°C en un medio obscuro.

10.- Parar la reacción agregando 50 u1 de NaOH 3 M en cada pozo.

11.- Evaluar resultados.

La evaluación de las muestras colectadas para el diagnóstico del virus, se realizo de acuerdo a:

Observación visual (coloración ) . Medición de absorbancia a 405 nm (lectura fotométrica).

Diagrama del Método ELISA

Agregar 200 u1 en cada pozo de antisuero atrapador (cabra anti-VTC) relación ( 1:lOOO ) en Solam de cubrimiento As policlonal.

Incubar :Toda la noche (por lo menos 16 hrs) a temperatura de 6°C ó 4-6 horas a 37°C

Lavar

Extraer la savia de las muestras y diluir en Solam de extracción relación (1:20) peso/vol., a pH= 7.4 . Agregar 200 u1 del extracto vegetal a cada pozo.

1

I v

1

Incubar: Toda la noche (por lo menos 16 hrs) a temperatura de 6°C. ó 4-6 horas a 37°C.

Lavar

Adición de anticuerpo secundario (monoclonal), detector ratón anti-VTC en Solam reactivo A (1:lOOO). Agregar 200 u1 a cada pozo.

Incubar: 2 hrs a temperatura de 37°C.

Lavar.

Adición de enzima conjugada IgG. Diluir el conjugado del antisuero y la fosfatasa alcalina en Solam reactivo A . Agregar 200 u1 en cada pozo.

Incubar: lhora a temperatura de 37°C

Lavar.

Enzima sustrato añadido. Agregar sustrato p-nitrofenil fosfato en solucion dietanolamina, para una concentracion final de 1 mg /d.

30-60 minutos a temperatura de 37°C medio obscuro.

Parar la reaccion con 50 u1 de NaOH 3.0 M.

1 1 Lectura visual Lectura en espectrofotometro

a 405 m.

RESULTADOS DE LOS DIAGNOSTICOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CITRICOS POR MEDIO DE LA TECNICA DE ELISA EN MUESTRAS (SIMPLES) CORRESPONDIENTES AL ESTADO DE CAMPECHE.

b ~~ ~~~

2

0.0030 0.0233 0.0255 4 b

0.0024 0.022 0.0237 2 a 0.0212 3

3 a 5 I 0.0212 I b 0.0013 0.0221 0.0231 6

"

b 48 0.0203 0.01 94 0.0012 P IXTU M l a 49 0.0288

b 50 0.0279 0.0283 0.0006 - "

b 52 0.0273 0.0272 0.00007

b 54 0.0282 0.0272 0.001 3

"

3 a 53 0.0263

I I 4 a I 55 I 0.0288 I 1 I b 0.0019 0.0266 0.0252 56

5 a 0.0320 57 b 0.0014 0.0309 0.0299 58

I 6 a 0.0279 59 b 0.0014 0.0268 0.0258 60

7 a ..

61 0.0286 ~ ~~~ ~

b 0.0007 0.0281 0.0276 62

2 a 71 0.0256 b 72 0.0240 0.0248 0.001 1

I I 3 a I 73 I 0.0272 I 1 I b 0.0002 0.027 0.0268 74

4 a 0.0271 75 b 0.0010 0.0278 0.0286 76

5 a 0.0252 77 b 0.0065 0.0298 78 1 0.0344

1 6 a 0.0291 79

I I - .. I I I 1

b . .

80 -

0.0238 0.0037 0.0264 7 a 0.0246 81 b 0.0002 0.0244 0.0242 82

8 a 0.0253 83 b 0.0012 0.0244 0.0235 84

9 a 0.0260 85 b 0.0009 0.0266 0.0273 86

2 a 0.0242 89 b I 90 0.0050 0.0278 0.0314

3 a 0.0259 91 b O. 0007 0.0253 O. 0248 92

4 a 0.0253 93 b 0.0012 0.0244 0.0236 94

5 a 0.0259 95 h 0.0007 0.0253 0.0248 96

6 a 0.0269 97 b 1 98 1 0.0265 1 0.0267 0.0002

7 a 0.0245 99 b o. 002 1 0.0260 0.0276 100

RANCHO STA CRUZ. 0.0202 101 l a PINO SUAREZ

b 0.0009 0.0209 0.0216 102

I 2 a 0.0216 103 1 b 0.0232 I 0.0022 0.0248 104

3 a 105 ~~ ~

0.0232 .

b 0.0017 0.0219 0.0207 106 4 a 0.0215 107

3 a 0.0232 105 b 0.0017 0.0219 0.0207 106

4 a 0.0215 107

b 0.001 1 0.0108 0.0100 122 2 a 0.0120 123

b 0.0019 0.0106 0.0093 124 3 a 0.0392 125

b 0.021 1 O. 0242 0.0093 126 4 a 0.0180 127

b 0.0066 0.01 33 0.0086 128 ~ ~ ~~ ~ ~ ~

5 a 0.0135 129 b 0.0036 0.0109 0.0084 130

6 a 0.0116 131 b 0.0063 0.0161 0.0206 132

8 a 0.0143 135 b 0.0002 0.0141 0.0140 136

9 a 0.0129 137 b 0.0012 0.0120 0.0112 138

10 a 0.0350 139 b 0.01 76 0.0225 0.0100 140

CAYAL POZO 2 O. 0241 141 l a b 0.0016 0.0253 0.0265 142

t 2 a I 143 0.0252 b 144 0.0014 O. 0242 0.0232

I I 3 a I 145 I O. 0248 I 1 I b 0.0012 0.0239 0.0230 146

4 a 0.0245 147 b 0.0010 0.0237 0.0228 148

5 a 0.0242 149 I b 0.0214 I 0.00007 0.0241 150

6 a ~~ ~

151 0.0242 ~~

b 0.0009 0.0248 0.0255 152 7 a 0.0237 153

b 0.0002 0.0239 0.0241 154 8 a 0.0250 155

b 0.0012 0.0241 0.0232 156 9 a 0.0248 157

b 0.0018 0.0235 0.0222 158 10 a 0.0241 159

b 0.0004 0.0238 0.0235 160 EL CORTIJO 0.0438 161 l a

b 0.0010 0.0430 0.0423 162

b 0.0002 0.0435 O. 0434 164 3 a 0.0295 165

I I ~~

I ~" I I 1

b -. ". -

166 0.0057 0.0336 0.377 4 a 0.0459 167

b 0.0018 0.0472 0.0485 168 5 a O. 0428 169

b 0.0018 0.0441 0.0454 170 6 a O. 0432 171 b 0.0007 0.0437 0.0443 172

7 a O. 0428 173 b 0.0016 0.0439 0.0451 174

8 a 0.0435 175 b 0.0009 0.0428 0.0422 176

I t b 178 0.0459 0.0447 0.0016

I I I I b I 200 0.0420 0.0425 0.0007

RESULTADOS DE LOS DIAGNOSTICOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CITRICOS POR MEDIO DE LA TECNICA DE ELISA EN MUESTRAS(S1MPLES) CORRESPONDIENTES AL ESTADO DE TABASCO.

I b 144 0.0269 0.0018 0.0256 I 3 a

4 a

0.0231 145

0.0237 147 b

0.0012 0.0228 0.0220 148 b

0.0002 0.0232 0.0234 146

5 a 0.0223 149 I I b I 150 I 0.0225 I 0.0224 I 0.0001 I

6 a 0.0187 151 b 0.0026 0.0206 0.0225 152

7 a 0.0198 153 b 0.0009 0.0191 0.0184 154

I 8 a 155 0.0218 I

3 a 205 0.0229 b 206 0.0233 0.0231 0.0002

4 a 207 0.0235 b 208 0.0235 0.0235 0.0000

5 a 209 0.0236 b 210 0.0244 O. 024 0.0005

6 a 211 0.0245 b 21 2 0.0232 0.0238 0.0009

7 a 213 0.0234 b 214 0.0240 0.0237 0.0004

8 a 215 0.0238 b 216 0.0227 0.0232 0.0007

9 a 217 0.0236 b 218 0.0238 0.0237 0.0001

10 a 219 0.0238 b 220 0.0231 0.0234 0.0004

VIVERO MIGUEL OLARTEI MERCEDES GAMES

l a 221 0.0252

b 222 0.0246 0.0249 0.0004 2 a 223 0.0235

b 224 0.0238 0.0236 0.0002 3 a 225 0.0256

b 226 0.0236 0.0246 0.0014

8 a 275 0.0296

9 a 277 0.0287 b 276 0.0289 0.0292 0.0004

b 278 0.0291 0.0289 0.0002 CITRIC05 HUIMANGUILLO SOC. DE PRODUCTORES.

l a 0.0082 279

b 0.0389 0.0544 0.0269 280 2 a 0.0269 281

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~~ 1 ~ b ~~ r -282 I 0.0259 I 0.0264 I 0.0007 3 a 0.0238 283

b O. 0024 0.0255 0.0273 284 4 a 0.0236 285

b 0.0009 0.0243 0.0250 286 5 a 0.0249 287

b 0.0007 0.0244 0.0239 288 6 a 0.0278 289

b 0.0007 0.0278 0.0279 290 7 a 0.0086 291

b 0.0147 0.019 O. 0294 292 8 a O. 0280 293

b 0.0018 0.0293 0.0306 294 9 a 0.0258 295

b 0.0021 0.0273 0.0289 296 10 a 0.0252 297

b 0.00007 0.0252 0.0253 298

LA VICTORIA 0.0248 299 l a b 0.0027 0.0228 0.0209 300

2 a

0.0232 303 3 a

0.0223 301 b 0.0012 0.0231 O. 0240 302

b 0.0007 O. 0227 0.0222 304 I 4 a I 305 0.0230 I

b

0.0011 0.0227 0.0235 310 b

0.0009 0.0222 0.0229 308 b

0.0005 0.0226 0.0222 306 5 a 0.0215 307

6 a 0.0219 309

7 a 0.0222 311 b 0.00007 0.0221 0.0221 312

8 a 0.0214 313 b 0.00007 0.0213 0.0213 314

I I 9 a I 315 I 0.0217 I 1 b

0.0015 0.0214 0.0225 318 b

0.0002 0.0218 0.0220 316 10 a 0.0203 317

RESULTADOS DE LOS DIAGNOSTICOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CITRICOS POR MEDIO DE LA TECNICA ELISA DE MUESTRAS (SIMPLES), PROVENIENTES DEL ESTADO DE YUCATAN.

5a 0.0236 165 b 0.0002 0.0234 0.0233 166

6a 0.0239 167 b 0.0010 0.0246 0.0254 168

RESULTADOS DE LOS DIAGNOSTICOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CITRICOS POR MEDIO DE LA TECNICA DE ELISA EN MUESTRAS(S1MPLES) CORRESPONDIENTES AL ESTADO DE QUINTANA ROO.

ANGEL 0.0209 1 l a b

4 b

0.0017 0.0196 0.0184 2

0.0009 0.0201 0.0195 2 a 0.0208 3

I I I I

I u 10 a I 1Y u.uzz4

I I I 1, 18 0.0002 o. 0221 0.0220

I " I - "^ . b 0.0002 0.0222 0.0220 20

CORREDOR FRUTICOLA TIHOSUCO DE I l a 1 0.0167

CORREDOR CITRICOLA DE 41 I 0.0217 I

VANGUARDIA DEL CENTRO X-HAZIL Y

b 0.0002 0.0184 0.0186 98 10 a 0.0165 99

b 0.0002 0.0166 0.0168 100 HUERTO 0.0168 101 l a

FRUTICOLA DE DZIUCHE

b

0.0004 0.0179 0.0182 138 b

0.0011 0.0187 0.0179 136 b

0.0002 0.0164 0.0166 134 b

0.0004 0.0163 0.0166 132 7 a

135 8 a

0.0163 133

0.0176 137 9 a

0.0195

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CUADRO No. 1. RESULTADO DE MUESTREOS EN HUERTAS, VIVEROS, PLANTAS COMERCIALES DE CITRICOS DE CUATRO ESTADOS DE LA REPUBLICA MEXICANA. 1993

ESTADO RESULTADO MUESTRAS MUESTREADO VTC. PROCESADAS

Yucatan 88 Negativo 1 Quintana Roo

100 Campeche

Negativo 59 Tabasco

Negativo 99

Negativo

Total 446

CUADRO No. 2. RESULTADOS DE ANALISIS ESTADISTICO PARA LA DETERMINACION DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS CITRICOS (VTC) EN PLANTAS DE CITRICOS, MEDIANTE LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

ESTADO NUMERO DE MUESTRAS

Yucatan 88

Quintana ROO 99

Tabasco 159

Cam p eche 1 100

Total 446

ANALISIS ESTADISTICO POR ESTADO

ABSORBANCIA A 405 NM (X) X + 3s ESTANDAR(S). VALOR DE LA MEDIA DE LA

DESVIACION

0.0193 0.0485 0.009739

I I I 0.0196 1 0.002959 I 0.0285 ll

I 1 I1 O. 0225 0.0330 0.003515

0.0277 0.0556 0.009307

0.0224 I 0.007371 I 0.0445

CUADRO NO. 3. ANALISIS ESTADISTICO DE TESTIGOS NEGATIVOS EN VTC, CON LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

TESTIGOS NEGATIVOS

VALORES. ABSORBANCIA I ANALISIS ESTADISTICO I A 405 nrn DE LOS: x+35

ESTADOS X=MEDIA I S=DESV. ESTANDAR

Yucatán : 0.0300 Tabasco: 0.0225

CamDeche: 0.0438 Quintana Roo : 0.0242

0.0587 0.0090 0.0314 Tabasco : 0.0251 Yucatán : 0.0328 Campeche: 0.0483 Quintana Roo: 0.0218

O. 0676 0.0123 0.0306

CUADRO No. 4 . ANALISIS ESTADISTICO DE TESTIGOS POSITIVOS EN VTC, CON LA TECNICA SEROLOGIA ELISA

VALORES. ABSORBANCIA ANALISIS ESTADISTICO TESTIGOS

S=DESV. X=MEDIA ESTADOS POSITIVOS x+35 A 405 nm DE LOS:

ESTANDAR PLANTA CON VTC

Yucatán: 0.1045

Tabasco: 0.1015

Campeche: 0.1027 Quintana Roo: 0.0731

0.1403 0.01495 0.09545

1

Al analizar los resultados obtenidos de muestras simples de cítricos procesados por medio de la técnica ELISA, para determinar la presencia o ausencia del virus tristeza de los cítricos (VTC), podemos decir que la mayoría de las muestras procesadas presentan una frecuencia de absorbancia que oscila en un rango de 0.0180-0.0270, dichos datos se pueden observar en las gráficas de resultados.

Para que se establezca una estandarización del rango positivo-negativo en cítricos se plantean varios razonamientos:

1. Las lecturas del espectofotometro que automáticamente da el resultado, asumiendo que los valores de absorbancia están directamente relacionados a la concentración.

2. Análisis cuantitativo donde se determina la curva de dosificación o a través del empleo de controles positivos de referencia, cuya concentración este bien establecida. Y de esta forma los valores obtenidos pueden ser comparados, hallándose las concentraciones relativas de las muestras problema.

3. La densidad óptica no rebase a 0.05 nanómetros

4. Se plantean diferentes métodos estadísticos para determinar el rango positivo- negativo como son:

2x de los testigos negativos x + 2s de los testigos negativos 3x de los testigos negativos x+3s de los testigos negativos

Para el objetivo de este trabajo, se determinó el rango positivo-negativo utilizando el método estadístico de Chebychevs, que considera la media más tres veces la desviación estándar (X+3S); es decir, se toma como límite negativo superior la media de los valores negativos más tres veces la desviación estándar. Se estableció la significación estadística entre las lecturas de las muestras y de los controles positivos y negativos.

El Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, de la Dirección General de Sanidad Vegetal, realizó el muestro para determinar la presencia o ausencia del virus tristeza de los cítricos mediante la técnica ELISA en los estados de Tabasco, Campeche, Yucatán y Quintana Roo. Se procesaron muestras simples formadas de tres brotes tiernos por árbol, obteniendo una mayor precisión en el diagnóstico.

En el estado de Tabasco se procesaron un total de 159 muestras simples, Quintana Roo 99 muestras simples, Campeche 100 muestras simples y Yucatán 88 muestras simples, con sus respectivas repeticiones.

Al aplicar la fórmula estadística x+3s en las lecturas reportadas por los cuatro estados, se obtuvo el valor estándar total que es de 0.0445. Los valores de absorbancia que excedieron el valor estándar total se consideraron positivos, y valores de absorbancia que estuvieron por debajo del valor estándar total se considerarán negativos.

Con base a lo anterior se determinó que las lecturas de absorbancia de las muestras simples evaluadas, dieron valores por debajo del valor estándar total, por lo que el diagnóstico de las muestras simples procesadas por medio de la técnica ELISA son negativas. Determinando la no presencia del virus tristeza de los cítricos (VTC).

Por otra parte, al confrontar los valores de absorbancia obtenidos, con las muestras control positivos, ninguna excedió al control positivo de referencia.

El diagnóstico rápido y preciso de una enfermedad es una condición necesaria para los programas de erradicación y control, sobre todo cuando se impone el aumento de la productividad en la esfera agropecuaria.

La serología tiene gran aplicación en el estudio de los virus de vegetales, sirve para identificarlos, detectarlos en el estado latente, medirlos cuantitativamente, determinar la relación entre distintos virus, etc. Por lo que la técnica ELISA como un método serológico utilizado en diversos campos, particularmente en virología, tanto animal como vegetal, ha tenido una amplia aceptación, habiéndose utilizado para la detección de diferentes antigenos vírales.

En fitopatología, esta ha sido la aplicación más generalizada, utilizándose no sólo para el diagnóstico de infecciones naturales en diversos cultivos fundamentalmente perennes y de propagación vegetativa, sino también para la detección de virus en semillas, áfidos y vectores virulíferos en general. Su mayor utilidad ha sido en la detección de anticuerpos inducidos por antigenos vírales.

ELISA ha ido remplazando técnicas menos sensibles o de difícil ejecución como la inmunodifusión, inmunofluorescencia, inhibición de la hemaglutinación o hamagluitinación pasiva y seroneutralización (Piroird y Lombard, 1980; Sánchez Vizcaíno et al., 1982), demostrándose que en algunos casos de virus vegetales ha llegado a ser más sensible que los ensayos de infectividad en plantas indicadoras (Clark et al; 1976; Bossenec y Maury , 1978; Gugerli, 1978).

México se considera como una de las pocas áreas del mundo donde aparentemente aún no existen problemas con tristeza. Sin embargo, la predominancia de naranjo agrio como Único portainjerto en casi el 100% de las plantaciones, junto con las áreas extensas plantadas con limón Mexicano en la costa del pacífico, lo hacen totalmente vulnerable al VTC.

La citricultura Mexicana se encuentra seriamente amenazada por el virus tristeza de los cítricos (VTC); ya que varios reportes indican que tarde o temprano tristeza inevitablemente va a llegar a ser un problema en México; ya que se han encontrado muestras positivas del VTC dentro del territorio nacional en 1983 y 1986-87, indicando

que puedan existir focos adicionales de infección, principalmente en huertas que hayan sido propagadas con material traído del extranjero

VENTAJAS:

Entre las principales ventajas de la técnica ELISA pueden citarse:

1. Alta sensibilidad que permite la detección de concentraciones muy bajas de antigen0 o

2. Rapidez y precisión en la ejecución del método 3. Posibilidad de utilización de extractos crudos y de detección de antigenos

4. Especificidad en la detección que permite la diferenciación y estudio de serotipos y

5. Factibilidad de automatización, estandarización y empleo para pruebas de diagnóstico

6. Fácil conservación de los reactivos por períodos largos 7. Bajo costo por determinación y requerimiento de equipamiento simple.

anticuerpos.

fragmentados y de diferentes tamaños.

relaciones antigénicos.

masivo.

DESVENTAJAS:

La desventaja de utilizar la técnica ELISA, es que si no se realiza correctamente el procedimiento; podríamos no tener resultados favorables como serían:

1. Placas con color indiscriminado: Debido a un recubrimiento defectuoso; conjugado muy concentrado; lavado insuficiente luego de aplicar el conjugado; controles negativos erróneos.

2. Obtener poca diferencia entre positivos y negativos: A causa de reacciones cruzadas por falta de especificidad de los antisueros utilizados; conjugado muy concentrado o muy diluido; sustrato mal preparado o poco tiempo de incubación; lavado defectuoso; reactivos envejecidos.

3. Placa sin coloración : Conjugados muy diluidos; sustrato poco concentrado; lavados excesivos; incubación insuficiente; ausencia de controles positivos reales.

n CONCLUSIONES:

Para determinar el rango positivo-negativo de los datos obtenidos al procesar las muestras de cítricos mediante la técnica ELISA utilizamos la fórmula estadística de Chebychevs; la media más tres veces la desviación estándar (x+3s).

Un rango debe ser adaptado en base a una referencia aceptable, de acuerdo a los resultados más correctos

Las muestras se analizaron serológicamente utilizando la técnica inmunoenzimática ELISA, que utiliza anticuerpos mono y policlonales, se requiere la purificación del virus y la preparación de anticuerpos específicos, y su conjugación con enzimas, aunque requiere algo de equipo no es tan costoso como otros métodos. La evaluación de las muestras colectadas para el diagnóstico del virus, se efectuó en un espectofotómetro a 405 nm, y sus lecturas se analizaron estádisticamente utilizando x+3s obteniendo así el valor estándar total de 0.0445.

Las muestras de los cítricos fueron tomadas de varios viveros, plantaciones comerciales, huertas, definidos en nuestro trabajo como localidades; registrándose un total de 46 localidades por los cuatro estados muestreados que son: Yucatán, Quintana Roo, Tabasco y Campeche. Cada localidad tiene un nombre específico para poder facilitar su : ubicación geográfica, procedencia(huerta, vivero, plantación comercial), propietario.

Se procesaron un total de 446 muestras simples y sus repeticiones. Obteniéndose un diagnóstico negativo, es decir que el virus tristeza de los cítricos no estuvo presente en las muestras de los cítricos.

El análisis de muestras simples en cítricos(tres brotes tiernos por árbol), nos permitió obtener una confiabilidad del 100% en el diagnóstico de los resultados.

La estandarización del método ELISA tienen gran importancia ya que permiten garantizar la repetibilidad de las experiencias y la confiabilidad de los resultados, así como su sensibilidad. El establecimiento de estos parámetros resulta de interés para la valoración de la utilidad del método ELISA y la interpretación correcta de los resultados que se obtengan.

RECOMENDACIONES:

Para reportar adecuadamente los datos de la técnica ELISA se recomienda:

1. Para el Testigo Positivo (T+) se establezca la media más tres veces la desviación estandar (X+3S).

2. Establecer claramente el rango de positivo y negativo

3. Probar suficientes plantas para familiarizarse con el rango de valores negativos (sano) involucradas.

4. Incluir suficientes controles conocidos negativos en cada ensayo de rutina para asegurar la representación del rango plenamente establecido de valores negativos.

5. La inclusión de un control o blanco PBS facilitará conocer los errores de manipulación que se hayan cometido al realizar la prueba.

6. Incluir simplemente un control positivo(p1anta con VTC)

7. Considerar un mínimo de dos repeticiones.

O BIBLIOGRAFIA

1. Bar-Joseph, M. and S. M. Garnsey. 1980: Enzyme -linked inmuno sorbent assay (ELISA): Principles and applications for diagnosis of plant viruses. Departament of Agriculture, Orlando, Florida. 50 p.

2. Becerra, L.E.N. 1993: Virus de la tristeza de los cítricos. Publicación No. 5. INIFAP/SARH. Campo Experimental Cotaxtla . México. 20 p.

3. Cartas China, Juan. 1987: Estadística Medica. Limusa. México.377 pags.

4. Clark, M. F. and A. N. Adams. 1977: Characteristics of microplate mehod of enzyme- linked inmunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 : 475- 483.

5. Ghabriel, S. A. And R. J. 1980: Asensitive radioinmunosorbent assay for detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 38: 311-317.

6. Guillett, Jerri M, Morrissey Sussan M, and Ramsdell Donald C. 1986: Interpreting ELISA data and establishing the positive - negative thr eshold. The American Phytopathologica Society. Plant Disease/Vol. 70 No. 8 .722- 726 pags.

7. Hernández, M.B.1994: Manual de Técnicas de diagnóstico de virus fitopatogenos. CNRDF. DGSV. México.

8. Peralta, E. Lilia y Frías , M. Teresa.1987: Manual sobre la técnica inmunoenzimatica ELISA. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, La Habana . 7 1 pags.

9. Rocha Peña, M y Peña del Río, M.A.1992: El virus de la tristeza y sus insectos vectores: Amenaza potencial para la cítricultura de México.Publicación especial No. 1. INIFAP/SARH. Campo Experimental General Terán. México. 20 pags.

10.- Téliz, Ortiz. D. y Mora Agulera, G. 1986: Inmunosorbencia con enzimas conjugadas. Rev. Mex. Fitopatología 4: 133-141.

Soluciones amortiguadoras (SOLAM) utilizadas en la técnica ELISA.

1.- Solam de Lavado (PBST)

En 1000 ml de agua destilada disolver:

Formula Química Cantidad Cloruro de sodio

1.15 g si es anhidro) 2.9 g Na2HP04.12H20 Fosfato dibásico de sodio hidratado(disminuir a 8.0 g NaC 1

o . 2 g KC1 Cloruro de potasio 0.2 g KH2P04 Fosfato monobásico de potasio

Tween-20 0.5 ml

Ajustar el PH a 7.4

2.- Solam de Cubrimiento:

En 1000 ml de agua destilada disolver

Formula Química Cantidad Carbonato de sodio

Ajustar el PH a 9.6 0.2 g NaN3 Azida de sodio 2.93 g NaHC03 Bicarbonato de sodio 1.59 g Na2C03

3.- Solam de Extracción de Muestra:

Disolver en 1000 ml de PBS-T 1X

Formula Química Cantidad Sulfito de sodio 1.3 R Polyvinylpyrrolidone (PVP)

0.2 e NaN3 Azida de sodio 20.0 g PM= 24-40,000

Albumina de Huevo

Ajustar el PH a 7.4. Almacenar a 4 oC. 20.0 g Tween-20 2.0 g

4.- Solam Reactivo A:

En 1000 ml de PBS-T 1X agregar:

Formula Química Cantidad Albumina de suero Bovino (BSA)

Almacenar a 4 OC 0.2 g NaN3 Azida de sodio

20.0 g Polyvinylpirrolidone (PVP) PM= 24-40,000 2.0 g

5.- Solam sustrato; p-nitrofenil fosfato (PNP)

Formula Química

800.0 ml Agua destilada 97.0 g Diethanolamina (DTA

Cantidad

Azida de sodio NaN3 0.2 g Ajustar el PH a 9.8 empleando ácido hidroclorhídrico concentrado. Ajustar el volumen final a 1000 ml con agua destilada.

PARAMETROS Y ESTADISTICOS.

A las características de una población se les llama parámetro, que son fijos y por lo regular se desconocem. Los parametros pueden ser:

a) Media b) Varianza c) Desviación estándar

Estadísticos: A las características de una muestra de población se les llama estadístico. Son fijos y siempre se conocen. Notación letras latinas y son:

a) Media aritmética(x): Es el promedio de los datos y se calcula sumándolos y dividiendo entre el tamaño de la muestra. Si se requiere una expresión más formal de la estimación y su variación, podemos obtener una estimación por intervalo al azar llamado intervalo de confianza para mayor claridad; el parámetro a estimar por intervalo de confianza es la media muestral. Sabemos que la distribución muestral de la media es apróximadamente normal por el Teorema de límite central que dice:

0 El 68% de los casos están comprendidos entre X-S y X + S (es decir, el valor de la

0 media. 0 El 95.45% de los casos están comprendidos entre X -2s y X +2S(es decir, el doble del

ambos lados de la media) El 99.73% de los casos están comprendidos entre X-3s y X+3S( es decir el triple del

ambos lados de la media).

desviación estándar a ambos lados de la

valor de la desviación estándar a

valor de la desviación estándar a

b) Varianza: La varianza de un conjunto de datos se define como el cuadrado positivo de la desviación estándar.

c) Desviación estándar: Se define como la raíz cuadrada positiva de la varianza.

Una población estará caracterizada por la información de la muestra extraída de ella misma. Por lo cual nos permitirá :

1. Estimar valores de los parámetros de las poblaciones con los datos de las muestras que

2. Probar hipótesis sobre los valores de los parámetros de las poblaciones usando en las de ellas hemos extraído.

pruebas los datos de muestras sacadas de ellas.

Una vez obtenidos los datos de la muestra, se construyen las tablas, gráficas(también llamadas histogramas). Una vez teniendo tablas e histogramas, se está en posición de tomar alguna decisión.

Histograma: Se usa únicamente para representar información que consiste de números sobre una escala continua; así pues, en el histograma se representa la frecuencia mediante áreas proporcionales y en el gráfico de barras es la altura de las barras la que es proporcional a la frecuencia.

Aspectos y consideraciones prácticas que influyen de forma determinante en la aplicación y el éxito de la técnica inmunoenzimática ELISA.

a) INMUNOADSORBENTES.

Los inmunoadsorbentes son sustancias empleadas para insolubilizar antígenos o anticuerpos bajo determinadas condiciones, siendo un requerimiento indispensable que pueda adsorberse a ella una cantidad adecuada del reactante de forma reproducible.

Entre los inmunoadsorbentes utilizados se encuentran la celulosa, agarosa, sefarosa, poliacrilamida y dextrán, que resultan útiles, pero requieren de centrifugaciones en la fase de lavado.

b) FASE SOLIDA.

El empleo de tubos , microplacas de poliestireno, polipropileno, polivinilo y otros plásticos, denominados fase sólida, proporcionan una adecuada adsorción pasiva o el anticuerpo en presencia de una solución alcalina.

El empleo de papel activado (Brighton et al., 1974), membranas de nitrocelulosa (Bode et al. , 1984) como inmunoadsorbentes de fase sólida, presentan ventajas en relación con la fase de lavado y la capacidad y selectividad de adsorción que no deben ser despreciadas. Las placas de microtitulación de poliestireno han sido la fase sólida más utilizada para la realización de ELISA.

Las placas pueden ser recuperadas, lavados sucesivos con soluciones de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio y etanol han permitido la reutilización de las placas. Las placas así tratados pueden reutilizarse durante cuatro ocasiones .

c) ANTISUEROS.

La calidad del antisuero es la variable de mayor importancia. Los antisueros empleados son producidos generalmente en conejos jóvenes, aunque otros animales pueden ser empleados con estos fines. El método de purificación de los antigenos y el esquema de inmunización a utilizar, dependen de las características del antigen0 en cuestión y de la utilización que se le dará a los antisueros, lo que determinará su espectro de especificidad.

d) ANTIGENOS.

Al ser introducidos a un organismo son considerados como cuerpos extraños; entre ellos encontramos a los virus; bacterias; hongos; micoplasmas; ácidos nucleicos y pequeñas proteínas o los anticuerpos inducidos por estos.

En los métodos de doble anticuerpo, las suspensiones antigénicas, sean extractos crudos o purificados, constituyen la muestra problema. En el caso de los vegetales, la parte foliar es la más empleada para este tipo de prueba, pero pueden utilizarse también tallos, tubérculos, frutos, etcétera. (Clarke et al, 1980, De Bokx y Maat, 1979).

Las muestras conteniendo antigen0 pueden ser evaluadas individualmente o formando grupos, previo análisis de la capacidad del método para detectar una muestra enferma en el grupo.

e) CONJUGADOS.

La calidad del conjugado es uno de los factores más importantes para la ejecución del método ELISA. Para ello es indispensable garantizar que se retengan en é1 las propiedades inmunológicas y enzimaticas de sus componentes.

La enzima a utilizar para estos fines debe cumplir una serie de requerimientos tales como: ser altamente reactiva, económica y estable tanto en almacenamiento como formando parte del conjugado; poseer una elevada actividad específica y poder ser obtenida en alto grado de pureza. Las enzimas más comúnmente usadas hasta el presente han sido la fosfatasa alcalina y la peroxidasa.

f ) SUSTRATOS.

Para seleccionar el sustrato es necesario tener en cuenta que este permita la detección de la enzima presente en el conjugado de forma sensible, específica y reproducible, así como que los productos de la hidrolisis sean solubles con un alto coeficiente de extinción. Finalmente debe atenderse su fácil preparación y baja nocividad.

Para la fosfatasa alcalina se utiliza comúnmente el p-nitrofenil fosfato con el que se obtiene un producto coloreado amarillo, fácilmente identificable y legible a 405 nm con poca coloración de fondo. El tiempo de reacción una vez adicionado el sustrato debe ser determinado experimentalmente.

g) LAVADOS.

Los lavados se realizan al finalizar cada período de incubación y tienen como objeto eliminar los reactantes fijados deficientemente o no fijados, pudiendo en ocasiones provocar la pérdida o desprendimiento de antigenos (Lehtonen y Viljanen 1980). Generalmente se realizan tres lavados breves con solución PBS o simplemente salina fisiológica, conteniendo tween 20 como agente tensoavtivo.

APENDICE No. 4: I REPRESENTACION FOTOGRAFICA DEL EQUIPO PARA LA TECNICA

SEROLOGICA ELISA.

ALMACENAMIENTO DE MATERIALES VEGETALES. MATERIAL VEGETAL SUJETO A ANALISIS FITOPATOLOGICO.

HOMOGENIZADOR PARA LA MACERACION DE MATERIAL VEGETAL QUE SE EVALUARA POR LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

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LECTOR DE ELISA., PARA DETERMINAR EL GRADO DE INCIDENCIA DE UN POSIBLE VIRUS EN EL MATERIAL VEGETAL EVALUADO.

MATERIAL COMPLEMENTARIO PARA LA PREPARACION DE REACTIVOS Y SUSTANCIAS REQUERIDAS PARA LA ELABORACION DE LA TECNICA

SEROLOGICA ELISA.

MATERIALES (BUFFER, REACTIVOS) SEROLOGICOS PARA LLEVAR A CABO LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

MATERIALES REQUERIDOS PARA LA APLICACION DE REACTIVOS EN LA TECNICA SEROLOGICA ELISA (PIPETAS , PIPETA MULTICANAL,

PLACA ELISA, CRISTALERIA Y SUSTANCIAS)