universidad austral de chile - usfx

Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Ingeniería en Alimentos

Validación de una metodología analítica por HPLC y Espectrofotometría para la identificación y cuantificación de antibióticos en propóleos. (Primera parte).

Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero en Alimentos

Milthon Esprel Gallegos

Valdivia – Chile

2012

PROFESOR PATROCINANTE:

Bernardo Carrillo L.

Ingeniero Agrónomo, Master en Ciencia e Ingeniería de los Alimentos

Instituto de Ciencias y Tecnología de los Alimentos

PROFESORES INFORMANTES:

Juan Carlos Paredes

Profesor de Biología y Química

Instituto de Ciencias Químicas de la Facultad de Ciencias

Ociel Muñoz

Bioquímico, Dr.

Instituto de Ciencias y Tecnología de los Alimentos

i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN

1

SUMMARY

2

1

INTRODUCCIÓN

3

2

MATERIAL Y METÓDOS

10

2.1

Equipos

10

2.2

Software

10

2.3

Material de laboratorio de vidrio

10

2.3.1

Reactivos

10

2.3.1.1

Estándares

10

2.3.1.2

Químicos

10

2.4

Preparación de los estándares

13

2.5

Validación del método analítico

13

2.5.1

Determinación de la precisión del sistema instrumental

13

2.5.1.1

Repetividad del sistema instrumental

13

2.5.1.2

Reproducibilidad del sistema instrumental

13

2.5.2

Determinación de la precisión del método

13

2.5.2.1

Exactitud

14

2.5.2.2

Sensibilidad

14

ii

2.5.2.2.1 Límite de detección 14

2.5.2.2.2

Límite de cuantificación

14

2.6

2.7

Características para la elaboración de las curvas de linealidad para

cada antibiótico

Determinación de los distintos antibióticos

14

14

2.7.1

Oxitetraciclina

14

2.7.2

Tetraciclina

15

2.7.3

Sulfamidas

15

2.7.4

Estreptomicina

16

2.7.5

Cloranfenicol

16

3

PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

17

3.1

Sulfamameter

17

3.1.1

Linealidad

17

3.1.2

Precisión del instrumento

17

3.1.3

Precisión del método

18

3.2

Sulfametoxipiridina

18

3.2.1

Linealidad

18

3.2.2


19

3.2.3


19

3.3

Cloranfenicol

20

3.3.1

Linealidad

20

3.3.2


21

3.3.3


21

iii

3.4 Sulfadoxina 22

3.4.1

Linealidad

22

3.4.2


23

3.4.3


23

3.5

Sulfaguanidina

23

3.5.1

Linealidad

23

3.5.2


24

3.5.3


24

3.6

Sulfapiridina

25

3.6.1

Linealidad

25

3.6.2


26

3.6.3


26

3.7

Sulfameracina

27

3.7.1

Linealidad

27

3.7.2


28

3.7.3


28

3.8

Sulfacitamida

29

3.8.1

Linealidad

29

3.8.2


29

3.8.3


30

3.9

Sulfatiazol

31

3.9.1

Linealidad

31

3.9.2


31

3.9.3


32

iv

3.10 Sulfacloropiridina 32

3.10.1

Linealidad

32

3.10.2


33

3.10.3


33

3.11

Estreptomicina

34

3.11.1

Linealidad

34

3.11.2


35

3.11.3


35

3.12

Tetraciclina

36

3.12.1

Linealidad

36

3.12.2


36

3.12.3


37

3.13

Oxitetraciclina

38

3.13.1

Linealidad

38

3.13.2


38

3.13.3


39

3.14

Sulfaciacina

39

3.14.1

Linealidad

39

3.14.2


40

3.14.3


40

4

CONCLUSIONES

42

6

BIBLIOGRAFÍA

43

ANEXOS

v

INDICE DE CUADROS

Cuadro

1

Antibióticos con sus tiempos de retención de estándares, longitud de

Página

12

onda, solvente de preparación estándar, fase móvil, según distintos

autores.

2

Valores obtenidos de la ecuación de linealidad Sulfameter

17

3

Valores obtenidos para precisión del equipo

18

4

Valores obtenidos para precisión del método

18

5

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad sulfametoxipiridina

19

6


19

7


20

8

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad cloranfenicol

20

9


21

10


22

11

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad sulfadoxina

22

12


23

13


23

14

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad sulfaguanidina

24

15


24

16


25

17

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfapiridina

25

18


26

vi

19 Valores obtenidos para precisión del método 27

20

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfameracina

27

21


28

22


28

23

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfacitamida

29

24


30

25


30

26

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfatiazol

31

27


31

28


32

29

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfacloropiridina

33

30


33

31


34

32

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Estreptomicina

34

33


35

34


35

35

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Tetraciclina

36

36


37

37


37

38

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Oxitetraciclina

38

39


38

40


39

41

Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfadiacina

39

42


40

vii

43 Valores obtenidos para precisión del método 40

viii

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Curva de Calibración Concentración de Sulfameter (µg/mL) v/s Área 17

(mVxmin)

2 Curva de Calibración Concentración de Sulfametoxipiridina (µg/mL) v/s Área 19

(mVxmin)

3 Curva de Calibración Concentración de Cloranfenicol (µg/mL) v/s Área 21

(mVxmin)

4 Curva de Calibración Concentración de Sulfadoxina (µg/mL) v/s Área 22

(mVxmin)

5 Curva de Calibración Concentración de Sulfaguanidina (µg/mL) v/s Área 24

(mVxmin)

6 Curva de Calibración Concentración de Sulfapiridina (µg/mL) v/s Área 26

(mVxmin)

7 Curva de Calibración Concentración de Sulfameracina (µg/mL) v/s Área 28

(mVxmin)

8 Curva de Calibración Concentración de Sulfacitamida (µg/mL) v/s Área 29

(mVxmin)

9 Curva de Calibración Concentración de Sulfatiazol (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 31

10 Curva de Calibración Concentración de Sulfacloropiridina (µg/mL) v/s Área 33

(mVxmin)

11 Curva de Calibración Concentración de Estreptomicina (µg/mL) v/s Área 35

(mVxmin)

ix

12 Curva de Calibración Concentración de Tetraciclina (µg/mL) v/s Área 36

(mVxmin)

13 Curva de Calibración Concentración de Oxitetraciclina (µg/mL) v/s Área 38

(mVxmin)

14 Curva de Calibración Concentración de Sulfadiacina (µg/mL) v/s Área 40

(mVxmin)

x

INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Criterios de aceptación para el parámetro de precisión en función de la 47

concentración del analito de la AOAC

2 Criterio de aceptación del parámetro de exactitud, relacionando el 47

porcentaje de recuperación en función de la concentración del analito

1

RESUMEN

Este estudio se realizó en paralelo con la investigación, que está probando la acción inhibitoria de soluciones de propóleos sobre cepas bacterianas que producen mastitis en vacas y el control sobre esta enfermedad. Se ha demostrado que este producto natural tiene propiedades que benefician el control de microorganismos in vitro. Sin embargo, esta acción favorable podría ser producto de la presencia de antibióticos residuales que pudieron haber quedado durante la producción apícola. Es por ello que se realiza una validación de métodos en determinación de antibióticos en propóleos, ya que no se encontró en la bibliografía revisada una metodología que permitiera determinar estos compuestos en el propóleos. En la primera parte del estudio se busca bibliografía sobre la determinación de estos antibióticos, la determinación de la linealidad con estándares, determinación de la precisión del equipo, determinación de la precisión del método, determinación de sensibilidad y la determinación de al menos dos antibióticos quedando en una segunda etapa el trabajo con la matriz de propóleos.

Se utilizaron 14 tipos de antibióticos utilizados en la producción apícola y para su determinación se utilizaron 2 equipos de alta sofisticación, un HPLC y un espectrofotómetro VARIOSKAN FLASH.

Los resultados obtenidos en los equipos para cada antibiótico son aceptables tanto para linealidad, precisión de equipos, precisión de métodos y sensibilidad, probado a través de la prueba estadística t-student, bajo las condiciones que propone QUATTROCHI et al (1992), además, de ser respaldado por el manual de verificación de rangos para métodos analíticos de la Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C) en el cual se establece parámetros de aceptación, donde los resultados obtenidos en este estudio se encuentran dentro de los rangos de aceptación.

2

SUMMARY

This study was realized together with the investigation, which is testing the inhibitory action of solutions from propolis about bacterial strains that produce mastitis by cows and the control of this disease. It was shown that this natural product has qualities that benefit the control of microorganisms in vitro. However, this favorable action could be product of the present residual antibiotics that could be left during the apiculture. Therefore a validation of techniques is accomplished in determination of antibiotics in propolis, at first you search a bibliography about the determination of these antibiotics, the determination of rectilinearity with standards, the determination of the precision of the team, the determination of the precision of techniques, the determination of sensitivity, leaving the second phase of work with the matrix of propolis. There were used 14 types of antibiotics that are utilized in apiculture and for its determination were used 2 teams of high sophistication, un HPLC And a spectrophotometer VARIOSKAN FLASH. The received results of every antibiotic are acceptable as well for rectilinearity, precision of the team, precision of techniques and sensitivity tested through the statistical test t- student under conditions that are suggested by QUATTROCHI et al (1992). In addition, the results are supported by the manual checking ranges for analytical methods by the analytic techniques of the Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C) in which parameters of acceptance are defined. And the received results in this study are considered inside of acceptance rank.

3

1 INTRODUCCIÓN

Este estudio nace como una necesidad planteada en otra investigación paralela, que se encuentra probando la acción inhibitoria de soluciones de propóleos sobre cepas bacterianas que producen mastitis en vacas y el control sobre esta enfermedad. Existen estudios en que se ha demostrado que este producto natural tiene propiedades beneficiosas que ayudan al control de microorganismos in vitro. Sin embargo, esta acción beneficiosa podría ser producto de la presencia de antibióticos que han quedado como residuo, producto de su utilización en el tratamiento contra algunas enfermedades que padecen las abejas. Se sabe que en la producción apícola algunos productores suministran antibióticos a las abejas para el control de enfermedades, debido a que el sistema inmune de éstas es deficiente. Por consiguiente existe el riesgo que estos pudieran estar ayudando o enmascarando la acción propia y natural del propóleos en el control de microrganismos. Y por lo que, no sólo las propiedades intrínsecas del propóleos estarían actuando sobré éstos, sino también restos de antibióticos que podrían traspasar las abejas al propóleos. El propóleos es una mezcla resinosa de sustancias recolectadas por la abeja Apis mellifera y sus propias secreciones (GONZALES et al., 2010). De acuerdo a lo señalado por TOLOSA y CAÑIZARES (2002). la sustancia es compleja, constituida por una gran variedad de compuestos químicos que difieren según su origen botánico, las condiciones geográficas y de las condiciones climáticas de donde se encuentren. En esta se encuentran resinas y bálsamos aromáticos (55%), 30% de ceras, 10% de aceites esenciales y 5% granos de polen. Estas pueden ser de color ocre, rojo, pardo, marrón. Y en textura igual puede haber diferencias, algunos más firmes, otros gomosos y más elásticos Según PEÑA (2008). etimológicamente el término proviene del griego compuesto por “pro” que significa “delante o defensa” y polis que quiere decir “ciudad” por lo cual se podría traducir en “defensa de la ciudad (o colmena). Se le ha utilizado desde tiempos muy remotos y por distintas civilizaciones. Gracias a la compleja composición que posee, tiene innumerables propiedades que han sido estudiadas en todo el mundo. La primera introducción se hizo en América del Norte en el año de 1622, en la isla de Cuba en 1763, en Australia en 1822, en Nueva Zelanda en 1842, en Brasil en 1839 y en 1897 en Chile. De este modo, hace poco más de cien años que las abejas melíferas - miembros del género Apis - viven en los cinco continentes, debiendo adaptarse a los diferentes climas y a través de innumerables generaciones formó lo que se llamó razas naturales o geográficas.( LÓPEZ DEL VILLAR y UBILLÚS, 2002) Las abejas mezclan la cera y las resinas con una enzima llamada 13-glicosidasa presente en su saliva, provocando una hidrólisis de los flavonoides glicosados en flavonoides agliconas. Luego son transportadas al interior de la colmena, para ser utilizados con diferentes fines, para tapizar el interior de la colmena, interior de las celdillas y cámaras de crías, lo cual evita la contaminación del medio (LOZINA et al.,2009). Las abejas poseen un sistema inmune débil por lo tanto el cuidado de la colmena es fundamental, refuerzan las paredes, tabiques y todo aquello que pudiera estar inestable dentro de la estructura, sellar sus grieta evitando las corrientes de aire que pudieran penetrar, reducir al mínimo las piqueras de entrada a la colmena, tapizar las piqueras para evitar la introducción de entes

4

contaminantes a través de sus patas.(LÓPEZ DEL VILLAR, y UBILLÚS, 2002). Además, estos autores señalan que se debe evitar las vibraciones cuando las colmenas son ubicada en sitios donde quedan expuestas a corrientes de aire, amortiguar los sonidos intensos a los cuales las abejas son muy sensibles, mantener la temperatura de la colmena (alrededor de unos 30°C), mantener el nivel de humedad relativa de la colmena, impidiendo la entrada de agua, evitando la evaporación excesiva, para el desarrollo de la larvas, las que necesitan condiciones especiales de humedad, momificar y aislar entes que hayan penetrado en la colmena que no puedan ser expulsados de está debido a sus dimensiones. Por colmena se pueden encontrar entre 50.000 y 60.000 habitantes aproximadamente por lo cual se destaca la eficacia sanitaria de su hábitat, en la cual almacenan su alimento. Si bien la miel no fermenta ni posee mayores degradaciones debido a su alta concentración de azúcares, la asepsia del lugar permite el normal desarrollo de la comunidad de insectos Agrega PEÑA (2008) que la composición del propóleos difiere de las resinas vegetales, pudiendo considerarse por lo tanto un producto de origen mixto, vegetal y animal. Cabe señalar que en Chile, es considerado como un alimento o suplemento alimentario.

En Chile el uso de antibiótico según el reglamento sanitario de los alimentos solo se encuentra normado para la industria láctea, mientras que en la comunidad europea no se permite que se encuentre antibióticos en los alimentos. Por sus propiedades es conocido el espectro de cualidades biológicas que posee el propóleos. Existen diversos estudios que describen estas cualidades como antibacterianas (bactericidas, bacteriostáticas), antimicóticos, anticolesterolémica, antiparasitarias, antiinflamatorias, antitóxicas, antialérgicas, analgésicas, anestésicas, antituberculosas, antivirales, citostáticas , desodorantes, epitelizantes, estimulantes de la inmunogénesis, fitoinhibidoras, hipotensoras, termoestabilizadoras (antipiréticas), además, ha sido destacado en la literatura el poder antioxidante del propóleos.( PEÑA, 2008; FIERRO, 2000; PEDRAZA, 2001). POPOVA et al. (2005) indican que las propiedades de la actividad antimicrobiana, se le atribuyen fundamentalmente a los flavonoides. LÓPEZ DEL VILLAR y UBILLÚS (2002) reafirman lo anteriormente dicho y se evaluó extractos de propóleos sobre bacterias gran positivas y gran negativas, se encontró una mayor efectividad sobre las gram prositivas, como en cocos: Sarcina lútea, Staphylococcus aureus; y bacilos: Bacillus subtilis, Bacillus larvae(causante de la loque americana), Corynebacterium equi. FIERRO (2000), también agrega que numerosas bacterias gram negativas son sensibles, en las que se encuentra las cepas piociánico y proteus. Por otra parte este mismo autor señala que existe mucha evidencia que atribuye a Helicobacter pylori la génesis de la gastritis, úlcera gastroduodenal e incluso el cáncer gástrico. En estudios realizados en Argentina se demostró que el propóleos posee la capacidad para destruir esta bacteria, siendo el principal responsable los flavonoides: pinocembrina en primer lugar y luego la galangina y la crisina. Esto tiene una enorme trascendencia terapéutica para encarar la erradicación de este germen en pacientes con patología gástrica. También se ha establecido que posee capacidad antiviral. FIERRO (2000), indica que diversos estudios confirmaron la acción virulicida frente al herpes tipo 1 y 2, pero también

5

ante poliovirus. Como un estudio en Francia realizado en la facultad de medicina de Rennes en donde se estableció que reduce la síntesis del ADN viral y que los responsables son flavonoides, que actúan en sinergismo con un éster del ácido cafeico y el ácido ferúlico. Otros investigadores han corroborado estos hallazgos, como HEINZ y SCHNITZLER (2010), quienes relizaron un estudio en herpes virus de tipo 2 llegando a conclusiones muy parecidas; en los pacientes con herpes simple bucal o genital se acorta el período de estado de la enfermedad, reducen las sobre infecciones, disminuye significativamente la molesta sintomatología local e incluso en muchos pacientes permite no tener una repetición de la enfermedad poco después de la convalecencia; también indica como responsables a los flavonoides y esteres de ácidos fenólicos. Desde hace un largo tiempo se están haciendo estudios respecto al poder cicatrizante y antiinflamatorio del propóleos. LESSER (1986) indica que existen estudios que datan de la guerra de los Bóers (1899-1902) done se utilizaba propóleos con vaselina a lo que se le llamó “popóleo vasógeno” comprobando que el preparado ejercía una acción cicatrizante y regeneradora en los tejidos. Se observaron 58 casos quirúrgicos en los que se utilizó este preparado obteniéndose excelentes resultados. FIERRO (2000), coincidiendo con ello también afirma que es cicatrizante y antiinflamatoria, esta última comparable a antiinflamatorios como el diclofenaco. Se señala al ácido cafeico un componente del propóleos, como el principal responsable de inhibir la dihidrofolato reductasa, reduciendo la producción de interleuquinas y prostaglandinas. Por otra parte, diversos autores han descrito su capacidad inmunomoduladora; varios trabajos demuestran que el propóleos estimula la inmunidad inespecífica y la específica, tanto inmunidad celular (linfocitos T) como la humoral (linfocitos B). En ratones infectados con el virus influenza tipo A y tratados con propóleos, se constató un aumento de los linfocitos T, un mayor nivel de fagocitosis y una menor mortalidad, en comparación con animales testigo no tratados. Los autores determinaron que se estimula la liberación del factor inhibidor de la migración de los leucocitos. (FIERRO,2000). Diversos estudios también han hecho tratamientos en base al propóleos, estos han demostrado resultados positivos en el empleo en pacientes con inmunodeficiencia. BANKOVA (2011), hace referencia a diferentes experimentos en lo que destaca el propóleos verde brasileño que ejerce una acción inmunomoduladora en ratones a los cuales se les suministró extracto de propóleos durante tres días, mejorando la inmunidad, la respuesta de activación en las etapas iniciales lo que ayuda al reconocimiento de microrganismos y a la activación de linfocitos, también aumentó la generación del peróxido de hidrógeno, lo que favorece en eliminar microrganismos. Este mismo autor también hace referencia a estudios en humanos en los que se les administró por dos semanas capsulas de propóleos, verificándose un aumento significativo de la capacidad de secreción de leucocitos, además de mostrar inhibición sobre la proliferación de esplentocitos; este efecto inmunosupresor linfoproliferativa puede ser atribuido a los flavonoides. Otra de las cualidades descritas del propóleos es su propiedad antiasmática. FIERRO (2000) describe como un recurso terapéutico capaz de mejorar a muchos pacientes con asma, sin efectos secundarios. Su empleo permite reducir o retirar otro tipo de medicación. Se utiliza solo o asociado a la medicación convencional (broncodilatadores). El efecto positivo en esta patología es atribuida a su acción sobre el sistema inmune, pero también por su capacidad de inhibir la liberación de histamina y a la antiinflamatoria.

6

Según este mismo autor las propiedades antioxidantes del propóleos también son notables. En los últimos años ha tomado relevancia el consumo de antioxidantes, en especial los de origen natural, para la prevención de enfermedades de gran trascendencia como la aterosclerosis, reuma e incluso el cáncer, sólo son superadas por el té. El estudio realizado por PEÑA (2008), indica que algunos compuestos antioxidantes identificados en propóleos fueron el ácido ferúlico, la quercetina y el ácido caféico. Por otra parte, se ha señalado que propóleos de algunas fuentes serían bioactivos por la presencia de compuestos prenilados como la apigenina, compuesto presente en mieles y propóleos, esta presentaría un efecto supresor de tumores. MOHAMMADZADEH et. al (2007) comprobaron que este efecto se da por los compuestos fenólicos que posee en su composición el propóleos. Sin embargo PEÑA (2008)., señala que pese a sus ventajas, faltan estudios sobre los efectos alergénicos que pudiera producir el propóleos en ciertas personas, debido fundamentalmente a las ceras presentes en estos productos; no obstante ya se han reportado casos de dermatitis asociados a ciertas variedades de propóleos, este autor tiene antecedentes de productos cosméticos, como la cera alba (cera de abeja), es un producto que produce dermatitis; este es extraído del propóleos, además la cera alba es empleada como aditivo alimentarios por lo cual hay que tener un especial cuidado en la utilización de estos en las industria. ALIBONI (2011) dice en su estudio que ácidos caféico, ácido salicílico y cinámico son responsables de estas reacciones y ha montado una técnica de separación y purificación del propóleos. PEÑA (2008), postula que diferentes propóleos pueden presentar diferentes propiedades químicas y farmacológicas, por lo tanto, la estandarización de los propóleos es una necesidad. A nivel mundial los principales países productores de propóleos son en América los Estados Unidos, Brasil y Argentina, en Europa Francia, España, Italia, Alemania, Bulgaria y la Comunidad de Estados Independientes (CEI). Los principales mercados para el propóleos se encuentran en Europa Alemania, Italia y en menor medida Suiza y Francia. También parece haber buenas perspectivas, por lo menos a mediano plazo, en Japón y los Estados Unidos para los exportadores de países en desarrollo. Los cuatro primeros países citados tienen una producción nacional insuficiente para sus necesidades y la demanda se cubre cada vez más con importaciones. Francia, por ejemplo, importa propóleos de España.

HERNÁNDEZ et al. (2005) y PEÑA (2008), indican que en Chile, el mercado del propóleos es cautivo y su manejo es artesanal. Por tanto, requiere de una amplia difusión de sus diferentes propiedades para interesar a los productores y empresarios a incursionar en un rubro no tradicional dentro de la actividad apícola. Se considera necesario poner especial énfasis en el manejo y explotación de la colmena, optimizando la producción, para lograr insertar el propóleos chileno en el mercado nacional e internacional

Además de resaltar la calidad del propóleos y de la miel, producto similar, o también producido por las abejas, es importante señalar que pueden aparecer antibióticos producto del tratamiento de éstas contra enfermedades como Loque europea, que ataca

7

a las crías de las abejas en su tubo digestivo. En este tratamiento se utiliza tetraciclina y los residuos dañan la producción de miel y propóleos. Ello sería muy perjudicial para la producción de productos naturales como éste: de allí la importancia de determinar la presencia de estos residuos (antibióticos) en el propóleos; tema del cual, en la literatura revisada hasta la fecha, no se han encontrado antecedentes de ello.(CHILE. PROGRAMA TERRITORIAL INTEGRADO CORPORACION DE FOMENTO DE LA PRODUCCIÓN, 2010) Por otra parte, en la literatura revisada no se encontró un sistema o método a través del cual se pueda determinar la presencia de antibióticos en el propóleos. De allí que se decidió probar y validar una metodología o protocolo que, a partir del propóleos natural, permitiera obtener muestras para ser analizadas a través de HPLC y espectrofotometría, con el fin de detectar la presencia de antibióticos que pudieran estar presentes en éste. El propóleos al presentar tantas cualidades permite ser un producto que se puede potenciar mucho más logrando insospechadas perspectivas para el desarrollo de nuevos productos. Con tal objeto, es que se procedió a probar y validar una técnica para determinar antibióticos en propóleos usando el equipo de High Performance Liquid Chromatography (HPLC) y el espectrofotómetro. El HPLC es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. La fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna, la cual está rellena con la fase fija. Luego de colocar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. A medida que fue aumentando la tecnología, también fue aumentando la eficacia de las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Otro equipo que se utilizó en la determinación de residuos de antibióticos es el Varioskan flash, que es un espectrofotómetro que combina la lectura fluorométrica, luminométrica y fotométrica. En fluorometría utiliza un monocromador cuádruple que asegura una máxima sensibilidad y superior calidad espectral. Utiliza un monocromador doble para las lecturas fotométricas que asegura una máxima linealidad. Para las lecturas luminométricas dispone de 2 ópticas de detección incluyendo la óptica Varioskan LumiSens diseñada especialmente para incrementar la sensibilidad de las lecturas luminométricas (catálogo instrumentación para micro placas). Respecto a la validación de un método analítico, MANOSALVA (2005), lo define como el proceso por el cual se establece, por medio de estudios de laboratorio, que un método es apropiado para el uso propuesto.

Para realizar la validación se toman parámetros estadísticos con los cuales se hace efectiva y coherente la validación, parámetros tales como: selectividad, linealidad, precisión,

8

exactitud y sensibilidad.

Selectividad, es la capacidad del método para producir una señal medible debida sólo a presencia del analito de forma exacta y específica, libre de interferencias de otros componentes que podrían causar interferencias en las mediciones, presentes en la matriz de la muestra. (QUATTROCHI et al., 1992).

Linealidad, de un método analítico se refiere a la proporcionalidad entre la concentración de analito presente en la matriz muestra con su respuesta captada por el equipo HPLC. (QUATTROCHI et al, 1992).

Precisión, está referida a la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea. La precisión de un método analítico debe estudiarse sobre el sistema, como también por el método que se utilizará.

Estos análisis de precisión deben hacerse sobre condiciones de repetitividad (mismo instrumento, mismo día, mismo analista) y en condiciones de reproducibilidad (diferente analista, diferente día, diferente instrumento).

Exactitud de un método, también conocido como error sistemático o tendencia, corresponde a la diferencia entre el valor obtenido (media) y el valor verdadero. Si esta diferencia entre el valor hallado y el verdadero es muy pequeña se debe concluir que la exactitud es buena, en este estudio la exactitud del equipo por ejemplo se midió mediante la aplicación del método analítico de mezclas preparadas con los estándares de antibióticos que se desea determinar, bajo una concentración conocida dentro del intervalo del método.

Sensibilidad: es la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo o que puede determinarse en una muestra, con razonable precisión y seguridad.

Para la evaluación de este parámetro se fijan los límites en los cuales el límite de detección o Cantidad mínima Detectable el cual hace referencia a la mínima cantidad de analito que puede detectarse en una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. También está el límite de cuantificación o cantidad mínima cuantificable: es la mínima cantidad de analito presente en una muestra que se puede cuantificar con un grado de confianza previamente establecido (exactitud y precisión).

El objetivo general de este trabajo fue llevar a cabo la validación de la primera parte de una metodología analítica en donde se determinara linealidad del estándar, precisión de los equipos, precisión de los métodos, sensibilidad de cada antibiótico y tratamiento de muestras. Para que luego este estudio sea utilizado para cuantificación diferentes antibióticos que se pudieran encontrarse en productos de origen natural (propóleos) proveniente de la industria apícola en Chile. Para ello se recopiló antecedentes bibliográficos que aportaron información, sobre el producto propóleos, la validación, la técnica de valoración y las características y funcionamientos de los equipos utilizados en el presente estudio.

Los objetivos específicos es montar de la metodología con las condiciones cromatográficas

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óptimas para la validación del método y de los equipos. Por consiguiente se aplicó un análisis estadístico sobre los datos obtenidos, calculando y desarrollando los parámetros para validar: linealidad, selectividad, precisión y exactitud para antibióticos bacteriostáticos del grupo de tetraciclinas (oxitetraciclina y tetraciclina) del grupo cloranfenicol (cloranfenicol), del grupo sulfamidas( sulfameter, sulfadiacina, sulfametoxipiridina, sulfaguanidina, sulfanilamida, sulfatiazol, sulfacetamida, sulfapiridina, sulfameracina, sulfadoxina, sulfacloropiridacina). Mientras para antibióticos bactericidas se trabajará con Estreptomicina, del grupo de los aminoglucósidos

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2 MATERIAL Y MÉTODOS El trabajo se hizo en laboratorio de analítica del instituto de Farmacología y morfofisiología veterinaria, perteneciente a la facultad de veterinaria de la universidad austral de chile

A continuación se detalla los diversos materiales y equipos utilizados en el estudio. 2.1 Equipos

Varioskan flash marca thermo scientific espectrofotómetro.

HPLC marca Hitachi La Chrome (bomba L-2130, con detector de diodo L-2455 La Chrom, Colum oven L-2300, autosampler L-2200)

pHmetro modelo HANNA pH 21

Balanza analítica adventurer OHAUS.

Vortex wise mix VM-10.

2.2 Software. Los Programas estadísticos utilizados fueron:

Statgraphics Plus Versión 5.1

Microsoft Excel 2007.

2.3 Material de laboratorio de vidrio.

2.3.1 Reactivos. 2.3.1.1.-Estándares:

Hidrocloruro de tetraciclina cristalina (T3383-25G SIGMA-ALDRICH)

Oxitetraciclina dihidratada BIOXTRA(O4636-10G SIGMA-ALDRICH)

Estreptomicina Sulfato irradiado con rayos gamma(S2522-50MG SIGMA-ALDRICH)

Cloranfenicol,1000mg, NEAT (442513 SIGMA-ALDRICH)

Sulfameter vetranal, 250 MG (46834-250MG SIGMA-ALDRICH)

Sulfacloropiridacina (46802-250MG SIGMA-ALDRICH)

Sulfadiacina Vetrenal (35033-100MG SIGMA-ALDRICH)

Sulfaguanidina (S8751-25G SIGMA-ALDRICH)

Sulfatiazol sodio (S0127-100G SIGMA-ALDRICH)

Sulfacetamida VETRENAL (46770-250MG SIGMA-ALDRICH)

Sulfapiridina (S6252-25G SIGMA-ALDRICH)

Sulfamerazina(S8876-50G SIGMA- ALDRICH)

Sulfadoxina (S7821-10G SIGMA-ALDRICH)

Sulfanilamida(SIGMA-ALDRICH)

Sulfametoxipiridina (SIGMA-ALDRICH)

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2.3.1.2- Químicos:

Acetonitrilo calidad HPLC

Etil acetato

Hexano

Metanol

Ácido Trifluoroacético

Agua destilada calidad HPLC

Acetona

Ácido oxálico

Nitroprusiato de sodio (SNP)

Ferrocianuro de potasio

Hidróxido de sodio Para la determinación de cada antibiótico se prepararon soluciones estándares (patrones) de concentraciones conocidas, para de esta forma ayudar a establecer las condiciones ideales para que el equipo realice lecturas medibles y lograr recabar datos que luego fueron procesados estadísticamente. En la mayoría de los casos estos fueron tratados siguiendo un esquema básico de preparación de la muestra, fijación de condiciones cromatográficas, preparación de los estándares en sus respectivos solventes y curvas de calibración, validación del método.

Para la preparación de las muestras de propóleos, estas se debieron hacer de tal manera que se puedan extraer de forma más pura. Se trabajó con 5 muestras de propóleos provenientes de distintas regiones del país, el paso inicial en las muestra fue hacer un proceso de trituración y de filtración por mallas, luego se mantuvo a 4°C, la idea es obtener una señal pura y sin ruidos (poco clara la lectura) en el HPLC para trabajar con el equipo y poder realizar las mediciones. Sobre las condiciones cromatográficas, se tuvo en cuenta la bibliografía que existe sobre el estudio de estos antibióticos. Si bien no se logró encontrar estudios de antibióticos relacionados con propóleos, más bien es casi nula la información, la estrategia utilizada fue buscar en estudios con respecto a antibióticos en miel, ya que lo más probable es que sean estos los mismos que se pudieran encontrar en el propóleos. Cada antibiótico posee características especiales como el tiempo de retención dentro de la columna, longitud de onda para lo cual se programó el equipo para que el análisis sea el óptimo (ver CUADRO 1). También se fijó la velocidad de flujo, la temperatura, volumen de inyección y el tiempo por muestra, todo determinado de forma específica para cada antibiótico, debido al comportamiento que éstos tienen en la columna, apoyado con la bibliografía. Previo al inicio de análisis de cada antibiótico se realizó inyección de fase móvil durante unos 30 min por la columna, para cebarla y equilibrarla.

Las preparaciones de las fases móviles dependieron de del tipo de antibiótico, lo que se especifican en las características de cada antibiótico.

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CUADRO 1. Antibióticos con sus tiempos de retención de estándares, longitud de onda, solvente de preparación estándar, fase móvil, según distintos autores Antibiótico Longitud

de onda (nm)

Tiempo de retención ( min)

Solvente de preparación estándar

Fase móvil Fuente

Tetraciclina 275-350 4.91 Metanol Acido oxálico/aceto nitrilo/metanol

ZHOU et al., 2008

Oxitetraciclina 275-350 4.42 Metanol Acido oxálico/aceto nitrilo/metanol

ZHOU et al 2008; DIEGUEZ et al.2002

Estreptomicina 495 --- Agua destilada

---- LI, Q-L., GAO L-X. 2008

Cloranfenicol 280 6.8 Acetonitrilo Acetonitrilo Agua

RODZIEWICZ, ZAWADZKA. 2007; SHEN,H., JIANG. H.

2004 Sulfameter 254 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

Sulfadiacina 254 8.7 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

Pozo et al (2004)

Sulfametoxipiridina 254 14.55 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

Sulfaguanidina 254 7.54 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

Sulfanilamida 254 3.8 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

Sulfatiazol 254 11.7

Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

Pozo et al (2004)

Sulfacetamida 254 6.14 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

Sulfapiridina 254 9.08 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

Sulfameracina 254 10.6 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

Pozo et al (2004)

Sulfadoxina 254 22.53 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

**

sulfacloropiridacina 254 20.5 Acetonitrilo Acetonitrilo/ TFA

Pozo et al (2004)

FUENTE: elaboración propia a partir de la bibliografía revisada

** Estandarización de la técnica en laboratorio basado en el estudio de Pozo et al (2004).

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2.4 Preparación de los estándares

Las soluciones estándares de los distintos antibióticos se prepararon disolviendo 0,1g de éste en 100 mL de solución (dependiendo de cada antibiótico el solvente) la cual quedó en una concentración de 1mg/mL, luego se hacen 5 diluciones que también dependerán según la lectura y el comportamiento que tuvo en el equipo, por ejemplo entre 100µg/mL y 10µg/mL o entre 10µg/mL y 1µg/mL). Que fueron utilizadas en la determinación de linealidad para el proceso de validación según las condiciones que sugiere QUATTROCCI et al., (1992) 2.5 Validación del método analítico Para la determinación de linealidad se utilizó una calibración que se preparó en los rango de concentraciones ya mencionados entre 10 µg/mL y 1 µg/mL, la cuantificación de la curva fue realizada por el análisis de regresión entre el área analizada por el equipo contra la concentración estándar preparada a la cual se le hizo 15 repeticiones a cada muestra, cuyos resultados fueron sometidos a la prueba estadística de intervalo de confianza con un α de 0.05. El análisis se realizó en condiciones de repetitividad, único analista, mismo instrumento y reactivos, mismo día, y cortos intervalos de tiempo entre ellas. Luego con la ayuda del software estadístico se realizó el tratamiento de los datos 2.5.1 Determinación de la precisión del sistema instrumental. 2.5.1.1 Repetividad del sistema instrumental. Para esta parte del experimento se utilizaron soluciones stock a concentraciones conocidas, se midieron la dispersión de 10 inyecciones por cada concentración (se utilizaron 3) bajo condiciones de repetitividad. Los estimadores de la precisión del sistema instrumental señalados por QUATTROCHI et al. (1992) para la determinación fueron la desviación estándar (S.D.), el coeficiente de variación (C.V.). Además de ser verificados bajo el manual de verificación de rangos para métodos analíticos de la Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C) (ARLINGTON, 1990) 2.5.1.2 Reproducibilidad del sistema instrumental. Se determinó el coeficiente de variación para lo cual se consideró suficiente efectuar el experimento sólo tomando en cuenta la variable tiempo de retención. Se analizó una sola concentración de estándar con 10 repeticiones durante 4 días consecutivos, determinando posteriormente el promedio, S.D., y el C.V. metodología indicada por QUATTROCCHI et al (1992) Asimismo fueron verificados bajo el manual de verificación de rangos para métodos analíticos A.O.A.C (ARLINGTON, 1990) 2.5.2 Determinación de la precisión del método. Se hace necesaria la determinación de repetividad, reproducibilidad, exactitud y límite de cuantificación, Para los primeros dos parámetros se utilizaron la misma metodología y las mismas pruebas estadísticas, pero esta vez utilizando el área que indicara el HPLC. 2.5.2.1 Exactitud. También conocida como error sistemático o de tendencia, corresponde a

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la diferencia entre el valor obtenido (media) y el valor verdadero. (QUATTROCHI et al., 1992) Aquí se midieron la desviación estándar, el C.V., recuperación y t de student con una hipótesis nula de ttabla mayor que texperimental, para 3 concentraciones con estándar con un

mínimo de 5 repeticiones 2.5.2.2 Sensibilidad. La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. Se medirán los siguientes límites: 2.5.2.2.1 Límite de detección. Se define como la menor concentración de analito que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse en una muestra (QUATTROCHI et al., 1992) También se define como aquella concentración que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de la señal de blanco o ruido de fondo (MILLER, 2002). Se utiliza la formula concentración del blanco más tres veces la desviación estándar del blanco

Límite detección (LOD) = YB + 3SB

2.5.2.2.2 Límite de cuantificación Corresponde, según la misma referencia, a la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración (QUATTROCHI et al., 1992 y MILLER, 2002). Según MILLER (2002), en determinaciones múltiples de blanco consumen mucho tiempo, el uso de Sxy es muy adecuado en práctica. Es decir Sxy es igual

a SB; este cálculo se hizo partir de los datos iniciales de linealidad.

Límite cuantificación (LOQ) = YB + 10SB

2.6 Características para la elaboración de las curvas de linealidad para cada antibiótico La fijación de las condiciones dentro del equipo, el solvente para los estándares, los reactivos de las fases móviles, las diferentes operaciones que se realicen antes de elaborar la curva tienen diferentes variaciones, las cuales fueron detalladas de forma individual. 2.7 Determinación de los distintos antibióticos 2.7.1 Oxitetraciclina. El solvente que se utilizó en la elaboración del estándar fue el metanol calidad HPLC. La fase móvil utilizada estaba compuesta por acetonitrilo y una solución acuosa de ácido oxálico 0.01 M (pH2.1), en una proporción de 35:65.

Para la extracción se suplementó 1,0 g de propóleos libre de antibióticos (tomada a partir de un apiario donde no se utiliza ningún tipo de antibióticos), con cantidades adecuadas de solución estándar de oxitetraciclina en acetona. Se realizó una doble extracción con 6 mL de acetona en cada paso. El solvente se evaporó a seco bajo corriente de aire a 30ºC. El extracto seco se resuspendió en 200 mL de H2O, y se inyectó en el HPLC siguiendo el

protocolo señalado por DIEGUEZ et al. (2002)

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Las condiciones del HPLC para oxitetraciclina fueron:

Longitud de onda 275-350 Volumen inyección 50 µL Flujo 1 mL/min Columna Eclipse XB-C18 T° columna 30 °C

2.7.2 Tetraciclina. Para la preparación de los estándares se utilizó el metanol calidad

HPLC como disolvente en la solución. En la elaboración de fase móvil se obtuvo a partir de una solución de ácido oxálico regulado a pH 4,0 (se pesan 1,7636 g de ácido oxálico dihidratado y se regula pH con hidróxido de sodio 0.01 M) con metanol y acetonitrilo en proporción de 70/10/30 V/V/V. Para la extracción se tomó una alícuota de la muestra conservada a 4°C de 2,0 g y se colocó en un vaso de 100mL, se le agregó 20 mL de la solución tampón Na2EDTA- Mcllvaine 0.1M

que fue preparada disolviendo 11.8 g de ácido cítrico monohidratado,13.72 g de Na2HPO4

y 32.62 g de Na2EDTA en un litro de agua destilada que fue ajustada a pH 4.0 ± 0.05 por un tiempo de 0.5 horas usando el ultrasonido que mejora el rendimiento de la extracción (poder 100w, frecuencia 40 Hz), la temperatura fue mantenida a 50°C (ZHOU et al., 2008) Las condiciones del HPLC para tetraciclina fueron:

Longitud de onda 275-350 Volumen inyección 50 µL Flujo 1 mL/min Columna Eclipse XB-C18 T° columna 30 °C

2.7.3 Sulfamidas. En la elaboración de las soluciones estándares se utiliza el reactivo

acetonitrilo. La fase móvil está compuesta por una solución de ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% mas una combinación de TFA al 0.08% con acetonitrilo. En forma gradiente de flujo de la fase móvil de 94% hasta 60% de TFA 0.1%, lo que significa que en un inicio el 94% del flujo será de TFA al 0.1% e irá disminuyendo, al final del tiempo de muestreo será el 60% del flujo total. Para la extracción, POZO et al. (2004), propone que las muestras de propóleos refrigeradas previamente, se pesan 5 gramos y se mezclan con 20 mL de acetonitrilo mas TFA al 0.1% durante un tiempo de 30 segundos a un 1 minuto, agitando manualmente. Luego se filtra el sobrenadante sobre un papel Whatman n°1. Se hace evaporar el acetonitrilo a 40°C en rotavapor, al vacío; luego se resuspendieron en 1mL de fase móvil (95:5), de este volumen se inyecta al HPLC.

Las condiciones del HPLC para tetraciclina fueron: Longitud de onda 254 nm Volumen

inyección 90 µL

Flujo 1mL Columna Lichospher RP-18 5(µm) T° columna 25°C

2.7.4 Estreptomicina. El mecanismo utilizado para la estreptomicina (STR) fue diferente ya

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Programa de gradiente de

fases Agua (%) Acetonitrilo (%)

0.0–0.1 80 20

0.1–7.0 0.0 100

7.0–7.3 80 20

7.3–20 80 20

que se usó el equipo Varioskan flash debido a que el comportamiento de la STR por el método HPLC es muy complicado y puede que las lecturas no sean muy fiable. Usando esta técnica espectrofotométrica que combina la fluorometría, luminometría y fotometría, se procedió a la preparación de los estándares. Se pesaron 0,1 g de estándar de STR y se disolvieron en 100 mL de agua destilada, su concentración será de 1mg/mL, se procede a las respectivas diluciones y se almacenan a 4°C fuera del contacto de la luz. Luego, se preparó una solución que tiene como fin, la mezcla de esta con el estándar, la reacción provoca el color en la solución, la que fue medida por el equipo y arrojó la lectura. La solución de 1% nitroprusiato de sodio (SNP), 1% de ferrocianuro de potasio y 1% hidróxido de sodio fue preparada disolviendo las tres sustancias en agua, pesando en cada una 1,0 g y aforando hasta 100 mL, luego esta solución se mezcló con 300 mL de agua destilada, se almacenó fuera de la luz y a 4°C la solución de SNP, ferrocianuro de potasio, hidróxido de sodio hasta ser utilizada esta solución. Para lograr la reacción se mezcló 1,0 mL de STR con 2,5 mL de la solución SNP, ferrocianuro de potasio, hidróxido de sodio. Se dejó a luz natural por 20 minutos y se llevó a la placa las diferentes concentraciones, más el blanco (SNP, ferrocianuro de potasio, hidróxido de sodio), luego se introducen en el equipo y se registran las lecturas a una longitud de onda de 495 nm, con un tiempo del haz de luz por muestra de 0.5 segundos. 2.7.5 Cloranfenicol. Para la preparación de los estándares se utilizó acetonitrilo calidad HPLC como disolvente en la solución. La fase móvil está compuesta por una solución acetonitrilo y agua en proporciones que variaran a través del tiempo según la siguiente tabla.

Las condiciones del HPLC para cloranfenicol fueron:

Longitud de onda 254- 280 Volumen inyección 50 µL Flujo 1 mL/min Columna Lichospher RP-18

5(µm) T° columna 40 °C

En la extracción se pesó 1 gramo de propóleos, y se diluyó en 2,0 mL de agua; luego se agregan 2,0 mL de hexano se mezclan por vortex, luego pasan a centrifugado; la capa superior se desechó. Seguidamente se agregan 4 mL de acetonitrilo, se mezcla nuevamente en vortex, se centrifuga y se hace evaporar el acetonitrilo por rotavapor a 45°C. El residuo seco se redisolvió en 0,5 mL de acetonitrilo fase móvil: agua (50:50, v/ v) y se filtró a través de un filtro de 0,45 micras desechable. Y se inyecta en el HPLC. Este método fue extraído y reacondicionado del estudio de RODZIEWICZ y ZAWADZKA.( 2007)

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3 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

A continuación se describe los resultados obtenidos en laboratorio para la validación y determinación de los diferentes antibióticos. 3.1 Sulfameter 3.1.1 Linealidad. En el CUADRO 2 se presentan los datos de la curva de calibración; además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. En la FIGURA 1 se muestra la representación gráfica de la curva de calibración junto a sus respectivas concentraciones con las área obtenidas. La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y =91232.95 X -79626.97, con un coeficiente

de r2 de 0.9955, lo que significa que la linealidad es bastante “buena”, encontrándose una relación directa entre las concentraciones y las áreas medidas por el HPLC. Además, se comprobó por medio de la prueba estadísticas t de student el resultado inicial de linealidad (Ver CUADRO 2). Según los resultados de la prueba estadística t-student, al encontrar un texperimental mayor que el ttabla se acepta la hipótesis de una correlación lineal para un nivel de

confianza del 95% (p=0.05), considerando lo señalado por QUATTROCHI et al. (1992) en su texto de validación, que indica la condición para que sea aceptada la hipótesis y se pueda concluir sobre la linealidad. CUADRO 2 Valores obtenidos de la ecuación de linealidad Sulfameter.

b A r r2 t tabla t experimental

91232.95 -79626.97 0.99778 0.9955 3.182 25.852

A continuación se presenta la FIGURA 1, donde se muestra la relación entre el área detectada por el HPLC y la concentración que fue colocada en el equipo.

FIGURA 1 Curva de Calibración Concentración de Sulfameter (µg/mL) v/s Área (mVxmin)

3.1.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los cuales se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 3.

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CUADRO 3 Valores obtenidos para precisión del equipo

Mediciones \ variable Repetividad Reproducibilidad

Promedio 13.48 13.51 S.D. 0.011 0.012 %C.V. 0.08 0.0916

La desviación estándar de la repetividad y la reproducibilidad es baja; tomando el C.V. se puede decir que la homogeneidad de los valores es alta, son resultados parecidos entre cada medición. Según la tabla de la AOAC la precisión se ajusta al C.V.(%) que exige un valor inferior a 7.3% para este nivel de concentración 3.1.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 4 se muestras los valores de estos parámetros. CUADRO 4 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. C.V.% Recuperación ttabla texperimental

Exactitud 3.4885 3.5178 99.1657 1.729 0.9184

Repetividad 17121.5306 5.4297

reproducibilidad 3659778 5.0575

Sensibilidad lim detección (µg/mL) 0.8471

lim cuantificación (µg/mL) 2.8239

Tiene una exactitud aceptable ya que sus valores de desviación estándar y C.V. son bajos; resultados aceptables, además en la prueba de t de Student según QUATTROCHI et al. (1992), cuando el valor experimental es menor que el teórico, se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación y la exactitud es adecuada. Según la A.O.A.C. que tiene un criterio de aceptación del parámetro de exactitud tabulado, este es aprobado con un valor de 99.1657; ya que se encuentra en el intervalo que impone A.O.A.C. que es entre un 80 y 110% de porcentaje de recuperación para este nivel de concentración. La repetividad y reproducibilidad del método es bastante aceptable ya que el valor de C.V. esta alrededor de 5%. Según la A.O.A.C. para este nivel de concentración los valores deberían estar por debajo de un 7.3%, por ende se admite la reproducibilidad y repetividad El límite de detección del método es de 0.8471µg/mL y el de cuantificación 2.8239µg/mL 3.2 Sulfametoxipiridina 3.2.1 Linealidad. En el CUADRO 5 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. En FIGURA 2 se muestra la representación gráfica de la curva de calibración.

La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y =140348.65X -35649.22 con un r2 de 0.9971, con una linealidad bastante alta, encontrándose una relación positiva entre la

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concentración y las áreas medidas por el HPLC; conjuntamente se comprobó por medio de la prueba estadísticas t de student, que resultó con un t experimental mayor al t tabla con tres

grados de libertad, lo cual significa que existe una linealidad, corroborado también por el dato de coeficiente de correlación con un valor de 0.995793, lo que indica una linealidad y una correlación positiva, las dos variables dependen una de la otra. CUADRO 5 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfametoxipiridina. b a r r2 t tabla t experimental

140348.65 35649.22 0.9985 0.9971 3.182 32.1393

A continuación se presenta la FIGURA 2, en donde se muestra la relación entre el área detectada por el HPLC y la concentración que fue colocada en el equipo.

FIGURA 2 Curva de Calibración Concentración de Sulfametoxipiridina (µg/mL) v/s Área(mVxmin) 3.2.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se midió la repetividad y reproducibilidad para los cuales se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 6. CUADRO 6 Valores obtenidos para precisión del equipo.

La repetividad y la reproducibilidad son aceptadas, debido a su desviación estándar es baja y el coeficiente de variación es menor al 1%. Lo que significa que la dispersión de los datos es muy baja, Según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta al valor C.V (%) que exige un valor inferior a 7.3% para este nivel de concentración.

El tiempo de retención determinado por el HPLC en este análisis fue de 14.55 minutos.

3.2.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente cuadro se muestras los valores de


Promedio 14.5538 14.55

S.D. 0.0211 0.0133

C.V. 0.1451 0.0911

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estos parámetros. CUADRO 7 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. C.V. (%) Recuperación t tabla t experimental

exactitud

9.720398

9.622444 101.018

1.734

0.448836

repetividad 27457.13 13.3327

reproducibilidad 52425.8 3.5458



La exactitud fue comprobada con la prueba de t de Student, según QUATTROCHI et al. (1992). Si la hipótesis planteada el valor texperimental es menor que el tteórico, es aceptada la

hipótesis nula, lo que significa que no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación. Los valores obtenidos en t de student indican que la exactitud es adecuada según lo indicado por las condiciones que exige el autor, esto es también respaldado por A.O.A.C. en su tabla de criterio de aceptación del parámetro de exactitud. Este parámetro es aprobado con un porcentaje de recuperación de 101.018%, el cual se encuentra en el rango de 80 y 110% que es el que se considera aceptable para este nivel de concentración. Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación de la exactitud del método son un poco altos pero aceptables ya que son respaldados por la prueba de t de student y la tabla de la A.O.A.C. La repetividad del método es bastante tolerable, aun cuando están un poco elevados los valores de C.V. y desviación estándar, no así ocurre con la reproducibilidad en el cual se ajusta a los parámetros exigidos por la A.O.A.C.

El límite de detección del método es 2.3118 µg/mL y el de cuantificación 4.7580 µg/mL. 3.3 Cloranfenicol 3.3.1 Linealidad. En el CUADRO 8 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., también se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva.

De la ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 116643x - 2360.5, con un r2 de 0.999, también se deduce que la relación es del tipo positiva, además se comprobó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad. En esta se comprueba la hipótesis que texperimental es mayor que t tabla, por ende existe linealidad. CUADRO 8 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Cloranfenicol.

b a r r2 ttabla texperimental

116643.2067 -2360.5069 0.9999 0.9999 3.182 232.0623

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A continuación se presenta la FIGURA 3 en donde se muestra la relación entre el área detectada por el HPLC y la concentración que fue colocada en el equipo.

FIGURA 3 Curva de Calibración Concentración de Cloranfenicol (µg/mL) v/s Área ( mVxmin) 3.3.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad, para los cuales se obtuvo los valores que aparecen en el CUADRO 9.



Promedio 5.7864 5.78765 S.D. 0.0083 0.0091

%C.V. 0.1449 0.1576

La repetividad y reproducibilidad es “muy buena”, los valores de desviación estándar son muy bajos, por ende la dispersión de los datos es mínima; con el coeficiente de variación (0.1449) se respalda la buena precisión del instrumento. Según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el C.V. (%) que exige un valor inferior a 5.3% para este nivel de concentración. El tiempo de retención para cloranfenicol fue de 5.7864 minutos, siendo unos de los más bajos de todos los antibióticos estudiados. RODZIEWICZ y ZAWADZKA (2007) en su estudio encontraron un valor para tiempo de retención de 6.8 minutos, las diferencias que se pudieran encontrar básicamente se debe al tipo de columna utilizada, el equipo utilizado y a las pequeñas variaciones que se hicieron en el método. 3.3.3 Precisión del método Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además, de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 10 se muestran los valores de estos parámetros.

22

CUADRO 10 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. RSD Recuperación t tabla t experimental

exactitud 2.4298 2.4264 100.1391 1.6990 0.3141

repetividad 102570.4 1.9644




Para la exactitud de este antibiótico se probó con la prueba estadística de t de Student, donde la hipótesis fue un ttabla > texperimental, lo que significa que no existe diferencia con el

100% de la recuperación. La exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992) la desviación estándar y desviación estándar relativa (RSD) igual es bajo, reafirmando el resultado de t de student. Según la tabla de la A.O.A.C. de criterio de aceptación del parámetro exactitud, este es aprobado con un porcentaje de recuperación entre 90 y 107%. La repetividad registró un RSD bajo el 2%, lo que indica un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las repeticiones en donde se aplica este método. El límite de detección del método fue 2.0535 µg/mL y el de cuantificación 4.8691 µg/mL 3.4 Sulfadoxina 3.4.1 Linealidad. En el cuadro 11 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y 124831x - 6076.5; se probó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad según los resultados de esta prueba al encontrar un texperimental mayor que el ttabla se aprueba la hipótesis de una correlación lineal para un nivel de confianza del 95% (p=0.05) (QUATTROCHI et al, 1992);

conjuntamente respaldado por el coeficiente de correlación r2 de 0.9997, que indica una alta linealidad. CUADRO 11 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfadoxina.

b a r r^2 t tabla t experimental 124830.8 -6076.46 0.999854 0.9997 3.182 101.2183


23

FIGURA 4 Curva de Calibración Concentración de Sulfadoxina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.4.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad, obteniéndose los valores que aparecen en el siguiente cuadro.

CUADRO 12 Valores obtenidos para precisión del equipo. Mediciones/variable Repetividad Reproducibilidad

Promedio 22.53 19.4747

S.D. 0.01762715 0.0169

C.V. 0.07823691 0.0876

En la repetividad y reproducibilidad, los valores de desviación estándar son bajos, la dispersión de los datos es mínima, con el coeficiente de variación (0.078). Según la tabla de la AOAC la precisión se ajusta con el C.V.(%) que exige un valor inferior a 7.3%; para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento. El tiempo de retención medido por el HPLC para Sulfadoxina fue de 22.53 min. 3.4.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 13 se muestran los valores de estos parámetros. CUADRO 13 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. RSD Recuperación ttabla texperimental

exactitud 3.147766 3.127499 100.648 1.761 0.8025

repetividad 30829.48 5.050192


sensibilidad lim detección (µg/mL) 1.1022


Tiene una exactitud aceptable ya que los valores de desviación estándar y C.V. son bajos, la dispersión es mínima y el valor de RSD está alrededor del 3%. En la prueba de t de Student el valor experimental es menor que el teórico, por ende se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación y la exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). La repetividad del método es bastante aceptable ya que el valor de C.V. esta alrededor de 5%. Mientras que para reproducibilidad el valor de 5.9%, también es aceptable para la A.O.A.C. según la tabla de aceptabilidad para este nivel de concentración. El límite de detección del método es 1.1022 µg/mL y el de cuantificación 1.7930 µg/mL 3.5 Sulfaguanidina 3.5.1 Linealidad. En el CUADRO 14 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva.

24

La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 38777X + 106089; se probó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad, según los resultados de la prueba estadística t-student al encontrar un t experimental mayor que el t tabla se aprueba la hipótesis de una correlación lineal para un nivel de confianza del 95% (p=0.05) (QUATTROCHI et al, 1992). Haciendo una lectura del coeficiente de correlación de valor 0.9993. Este reafirma la linealidad y una correlación positiva. CUADRO 14 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfaguanidina

b

a

r

r2

t tabla

t experimental

38776.55 106088.8 0.999671 0.9993 3.182 67.51


FIGURA 5 Curva de Calibración Concentración de sulfaguanidina (µg/mL) v/s

Área (mVxmin) 3.5.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los cuales se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 15


Mediciones \ variable Repetividad Reproducibilidad Promedio 7.54 7.55

S.D. 0.043096 0.04 C.V. 0.570723 0.56

Para la repetividad, los valores de desviación estándar indican una mínima dispersión de los datos, con un coeficiente de variación (0.5707). Según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el valor C.V.(%) que exige un valor inferior a 5.3%; para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento. El tiempo de retención para Sulfaguanidina fue de 7.54 min. Para la reproducibilidad se obtuvieron valores bastantes aceptables para este nivel de concentración, el CV es inferior al 1%, valor que está muy por debajo de los que acepta la A.O.A.C. 3.5.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 16 se muestran los valores

25

b a r r^2 t tabla Texperimental

26405.39 9537.339 0.9978 0.9957 3.182 19.3397

de estos parámetros. CUADRO 16 Valores obtenidos para precisión del método. S.

D. RSD Recuperación ttabla texperimental

Exactitud 11.4642

11.3437 101.0623 1.699 0.5129

Repetividad 179560.9 7.2935

Reproducibilidad 139544

3.5964

Sensibilidad lim detección (µg/mL) 3.4145 lim cuantificación (µg/mL)

6.6319

Tiene una exactitud aceptable; en la prueba de t de Student el valor experimental es menor que el teórico, por ende se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación y la exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). La repetividad del método es bastante aceptable ya que el valor de C.V. esta alrededor de 7%; para reproducibilidad igual es aceptable, el parámetro C.V está en un 3.59%. El límite de detección del método es 3.4145 µg/mL y el de cuantificación 6.6319µg/mL. 3.6 Sulfapiridina 3.6.1 Linealidad. En el CUADRO 17 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. En FIGURA 6 se muestra la representación gráfica de la curva de calibración. La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 26405 X+ 9537.3. Se probó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad, que resultó con un texperimental mayor al ttabla

con tres grados de libertad, lo cual significa que existe una linealidad, corroborado también por el dato de coeficiente de correlación con un valor de 0.9957. Lo que indica una linealidad y una correlación positiva (QUATTROCHI et al, 1992).

CUADRO 17 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfapiridina.


26

FIGURA 6 Curva de Calibración Concentración de Sulfapiridina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.6.1 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los cuales se obtuvo los valores que aparecen en el CUADRO 18. CUADRO 18 Valores obtenidos para precisión del equipo.

Mediciones/variable Repetividad Reproducibilidad Promedio 9.0859 7.801

S.D. 0.04705 0.0503 C.V. 0.517732 0.6435

Para repetividad y reproducibilidad, los valores de desviación estándar indican una mínima dispersión de los datos, los coeficientes de variación (0.5177 y 0.6435) se ajustan a los rangos de la tabla de la A.O.A.C., la precisión se ajusta en el valor C.V. (%) que exige un valor inferior a 7.3%, para este nivel de concentración se respalda la “buena” precisión del instrumento. El tiempo de retención para Sulfapiridina fue de 9.0859min. 3.6.2 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad además de la exactitud y sensibilidad; en el CUADRO 19 se muestras los valores de estos parámetros.

27

CUADRO 19 Valores obtenidos para precisión del método. S.

D. RSD Recuperación ttabla texperimental

exactitud 9.720398 9.622444 101.018 1.734 0.44884

repetividad 27457.13 13.3327




La exactitud comprobada con la prueba de t de Student arrojó que el valor experimental fue menor que el teórico, por lo que se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación. La exactitud es adecuada según los parámetros que aparece en la literatura de QUATTROCHI et al (1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación son un poco altos, pero aceptables ya que son respaldados por la prueba de t de student. La A.O.A.C. en su tabla de criterio de aceptación del parámetro de exactitud, el valor obtenido en laboratorio se aprueba, debido a que está dentro del intervalo de recuperación entre 80 y 110% que exige A.O.A.C. La repetividad del método el C.V. llega al 13%, siendo un poco elevado, mientras que para reproducibilidad se obtuvo un valor de 5.13%, según tabla de la A.O.A.C. este valor es aceptado, ya que debe ser inferior a 7.3%. El límite de detección del método es 1.3182 µg/mL y el de cuantificación 2.0824 µg/mL 3.7 Sulfameracina 3.7.1 Linealidad. En el CUADRO 20 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva.

La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 122030x - 6304; con un r2 de 0.9994. Se comprobó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad, que resultó con un texperimental mayor a ttabla con tres grados de libertad, lo cual significa que existe

una linealidad (QUATTROCHI et al, 1992). Corroborando con el coeficiente de correlación

(r2) que indica una linealidad y una correlación positiva. CUADRO 20 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfameracina.

b a r r2 t tabla t experimental

122030.185 -6304.094 0.9997 0.9994 3.182 77.2986017

A continuación en la FIGURA 7 se muestra la relación entre el área detectada por el HPLC y la concentración que fue colocada en el equipo.

28

S.D. RSD Recuperación ttabla texperimental

6.2284 6.2593 99.5053 1.703 0.4106

repetividad 39220.7619 6.3178




FIGURA 7 Curva de Calibración Concentración de Sulfameracina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.7.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad, parámetros para los que se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 21. CUADRO 21 Valores obtenidos para precisión del equipo

Mediciones/variable Repetividad Reproducibilidad

Promedio 9.27 8.80

S.D. 0.04 0.07

C.V. 0.43 0.74

Para estos parámetros los valores de desviación estándar son bastante bajos y los coeficientes de variación son menores al 0.5%, lo que significa que la dispersión de los datos es mínima; según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el valor C.V. (%) que exige un valor inferior a 7.3% para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento. El tiempo de retención medido por HPLC es de 9.27 minutos. 3.7.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad, en el siguiente CUADRO se muestran los valores de estos parámetros. CUADRO 22 Valores obtenidos para precisión del método

exactitud

En relación a la exactitud comprobada con la prueba de t de Student el valor experimental es menor que el teórico, por lo que se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia

29

significativa con el 100% de recuperación. La exactitud es adecuada

(QUATTROCHI et al, 1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación son aceptables ya que son respaldados por la prueba de t de student. De acuerdo a la A.O.A.C. en su tabla de criterio de aceptación del parámetro de exactitud es aprobado con un porcentaje de recuperación que fluctúa según tabla entre 80 y 110%. La repetividad del método es bastante tolerable debido a que el valor de C.V. esta alrededor del 6%, al igual que para reproducibilidad, ya que parámetro arrojó un valor de 4.76% en su C.V., cifra aceptada por la A.O.A.C. El límite de detección del método es 1.1826 µg/mL y el de cuantificación 2.0669 µg/mL 3.8 Sulfacitamida 3.8.1. Linealidad. En el CUADRO 23 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva.

La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 65415x + 4544.7. Se probó la linealidad por medio de la prueba estadísticas t de student, que resultó con un texperimental mayor que el

ttabla con tres grados de libertad, lo cual significa que existe una linealidad, corroborado

también por el dato de coeficiente de correlación con un valor de 0.9994 lo que indica una linealidad y una correlación positiva (QUATTROCHI et al, 1992) CUADRO 23 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfacitamida. b a r r2 ttabla texperimental

65414.6775 4544.717 0.9997 0.9994 3.182 72.2924


FIGURA 8 Curva de Calibración Concentración de sulfacitamida (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.8.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad

30

y reproducibilidad por lo que se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 24.



Promedio 6.14 5.76

S.D. 0.0335 0.08

C.V. 0.5461 1.33

La repetividad es aceptable, su desviación estándar es baja y el coeficiente de variación es menor al 1%, lo que ratifica la dispersión de los datos es baja, según la tabla de la A.O.A.C. La precisión se ajusta en el C.V.(%) que exige un valor inferior a 7.3%. Para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento. Aquí también se puede observar un tiempo de retención de 6.14 minutos. La reproducibilidad cumple también con los parámetros de la A.O.A.C. por ende la precisión del instrumentos es aceptada. 3.8.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO se muestran los valores de estos parámetros. CUADRO 25 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. RSD Recuperación ttabla texperimental

exactitud 6.3616 6.3530 100.1 1.699 0.1163





De acuerdo a la exactitud, comprobada con la prueba de t de Student, el valor experimental es menor que el teórico, por lo que se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación. La exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación son aceptables ya que son respaldados por la prueba de t de student. Al observar la tabla de la A.O.A.C. según criterio de aceptación del parámetro de exactitud éste está dentro del rango de porcentaje de recuperación que fluctúa entre 80 y 100%. La repetividad del método es bastante buena debido a el valor de C.V es de un 2.7223%, lo que significa que la variabilidad de los datos es pequeña, mientras que la reproducibilidad igualmente es aceptada ya que su valor de C.V. es de 6.61% y está por debajo de lo que permite la A.O.A.C en sus rangos de aceptabilidad. El límite de detección del método es 1.1398 µg/mL y el de cuantificación 1.6466 µg/mL.

31

3.9 Sulfatiazol 3.9.1 Linealidad. En el CUADRO 26 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 74062X – 11510; se prueba la linealidad por medio de la prueba estadísticas t de student. Según los resultados de la prueba estadística t-student al encontrar un t experimental mayor que el t tabla se aprueba la hipótesis de una correlación lineal para un nivel de confianza del 95% (p=0.05)

(QUATTROCHI et al, 1992). Para respaldar t de student se puede observar el valor de r2 de 0.9982, que indica una correlación positiva y una linealidad bien marcada. CUADRO 26 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfatiazol.

b a r r2 ttabla texperimental

74062.158 -11509.74 0.9991 0.9982 3.182 41.0178


FIGURA 9 Curva de Calibración Concentración de Sulfatiazol (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.9.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los que se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 27 CUADRO 27 Valores obtenidos para precisión del equipo


Promedio 9.89 9.53

S.D. 0.0506 0.036

C.V. 0.5114 0.3781

La repetividad y la reproducibilidad del instrumento son aceptadas, debido a que la desviación del estándar y el coeficiente de variación son bajos, lo que significa que la dispersión de los datos es baja. Según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el valor C.V. (%) que exige un valor inferior a 7.3%; para este nivel de concentración se

32

respalda la buena precisión del instrumento. Se encontró un tiempo de retención de 9.89 minutos. 3.9.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 28 se muestran los valores de estos parámetros. CUADRO 28 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. RSD Recuperación ttabla texperimental

Exactitud 4.0246587 4.0450185 99.5 1.699 0.6815445

Repetividad 10392.5472 3.37494589

Reproducibilidad 367497.8 3.2126



Para este compuesto se obtuvo una exactitud aceptable, ya que los valores de desviación estándar y C.V. fueron bajos; resultados aceptables, además con la prueba de t de Student se encontró un valor experimental que fue menor que el teórico, por ende se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación y por ende la exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). Respaldando la exactitud del método se analizó a través de la A.O.A.C., en su tabla de criterio de aceptación del parámetro de exactitud, el valor de recuperación es aprobado debido a que se encuentra en el intervalo de aceptación entre 80 y 100% de recuperación. La repetividad del método es bastante aceptable ya que el valor de C.V. esta alrededor de 3%. Mientras que para reproducibilidad los valores de C.V. son igualmente aceptados ya que son similares a los de repetividad y cumplen con las condiciones que impone la A.O.A.C. El límite de detección del método es 1.1800 µg/mL y el de cuantificación 2.1915 µg/mL 3.10 Sulfacloropiridina 3.10.1 Linealidad. En el CUADRO 29 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin; además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 74062x – 11510. Se probó por medio de la prueba estadísticas t de student que resultó con un texperimental mayor al ttabla con tres grados

de libertad, que indica la existencia de una linealidad, corroborado también por el coeficiente de correlación con un valor de 0.9974, lo que indica una linealidad y una correlación positiva.

33

CUADRO 29 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfacloropiridina. b a r r2 t tabla t experimental

154733.902 -32565.4835 0.99873148 0.9974 3.182 34.3544221

A continuación se presenta la FIGURA 10 donde se muestra la relación entre el área detectada por el HPLC y la concentración que fue colocada en el equipo.

FIGURA 10 Curva de Calibración Concentración de Sulfacloropiridina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.10.2 Precisión del instrumento

Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad parámetros para los que se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 30. CUADRO 30 Valores obtenidos para precisión del equipo

Mediciones \variable Repetividad Reproducibilidad Promedio 20.26 20.31

S.D. 0.1879 0.20 C.V. 0.9279 0.9986

La repetividad es aceptada, ya que la desviación estándar es baja y el coeficiente de variación es menor al 1%. Lo que significa que la dispersión de los datos es “pequeña”. Según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta al C.V. (%) que exige un valor inferior a 7.3%. Para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento con los resultados obtenidos en la reproducibilidad, que son casi idénticos a los obtenidos en repetividad. Además, se identificó a través del HPLC que para este antibiótico se detectó un tiempo de retención de 20.26 minutos. 3.10.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 31 se muestran los valores de estos parámetros.

34

CUADRO 31 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. C.V.% Recuperación t tabla t experimental

Exactitud 4.2437 4.2258 100.4252 1.706 0.5229

Repetividad 26960.0765 4.0211




La exactitud comprobada con la prueba de t de Student permitió establecer que el valor texperimental es menor que el tteórico, por lo que se acepta la hipótesis nula y no existe

diferencia significativa con el 100% de recuperación. La exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación se puede señalar que estos son adecuados. La A.O.A.C. en su de criterio de aceptación del parámetro de exactitud tiene un rango de aprobación en porcentaje de recuperación entre 80 y 100%, el valor obtenido fue de 100.4252% La repetividad del método es bastante tolerable ya que el valor de C.V. llega al 4% aproximadamente, mientras que para reproducibilidad su valor de 4.55% es aceptado por la A.O.A.C en su tabla de rangos para este nivel de concentración de antibiótico. El límite de detección del método es 0.0477 µg/mL y el de cuantificación 0.6501 µg/mL 3.11 Estreptomicina 3.11.1 Linealidad. En el CUADRO 32 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva. La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 0.000591982X +0.14922; se probó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad, que resultó con un texperimental

mayor al ttabla con tres grados de libertad. Esto significa que existe una linealidad,

corroborado también por el coeficiente de correlación con un valor de 0.9961, que indica una linealidad y una correlación positiva. CUADRO 32 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Estreptomicina. b a r r2 t tabla t experimental

0.000591982 0.14922 0.9980 0.9961 3.182 27.7019


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FIGURA 11 Curva de Calibración Concentración de Estreptomicina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.11.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los cuales se obtuvieron los valores que aparecen en el CUADRO 33. CUADRO 33 Valores obtenidos para precisión del equipo.

Mediciones \variable Repetividad Reproducibilidad S.D. 0.00290254 0.00105 C.V. 1.61110799 0.5445

La repetividad es aceptada, la desviación estándar es baja y el coeficiente de variación es 1.611% lo que significa que la dispersión de los datos es pequeña, según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el valor C.V. (%) que exige un valor inferior a 7.3% para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento 3.11.3 Precisión del método Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad, en el siguiente CUADRO 34 se muestras los valores de estos parámetros. CUADRO 34 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. C.V. Recuperación t tabla t experimental

exactitud 13.6918 13.7556 99.5359 1.769 0.1847





La exactitud comprobada con la prueba de t de Student el valor t experimental es menor que

el tteórico, por lo tanto se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el

100% de recuperación. La exactitud por ende es adecuada según las condiciones que propone QUATTROCHI et al. (1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación de la exactitud, se observa que estos son un tanto elevados, sin embargo, son aceptados ya que están respaldados por la prueba de t-student, además de ser

36

revisado por los criterios de la A.O.A.C. que en su tabla de aceptación del parámetro de exactitud, este aprueba con un porcentaje de recuperación que se encuentra entre 80 y 100%.. La repetividad del método es adecuada debido a sus valores de S.D. y C.V. son mínimos, lo que arrojó una variabilidad baja en los valores, mientras que para reproducibilidad se repite esta tendencia, por lo que se puede concluir que el equipo actúa de manera adecuada para este nivel de concentración de antibiótico. El límite de detección del método es 0.87278895µg/mL y el de cuantificación 0.8727µg/mL. 3.12 Tetraciclina 3.12.1 Linealidad. En el CUADRO 35 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin; además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva

La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 249410.92 X – 1310.162; se probó por medio de la prueba estadísticas t de student que resultó con un t experimental mayor al ttablacon

tres grados de libertad, lo cual significa que existe una adecuada linealidad, corroborado también por el coeficiente de correlación con un valor de 0.9974 lo que indica una linealidad y una correlación positiva. CUADRO 35 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Tetraciclina. b a r r2 t tabla t experimental

249410.92 -1310.162 0.9955766 0.9911728 3.182 18.353719


FIGURA 12 Curva de Calibración Concentración de Tetraciclina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.12.2 Precisión del instrumento Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los cuales se obtuvieron los valores ubicados en el CUADRO 36.

37

CUADRO 36 Valores obtenidos para precisión del equipo. Mediciones \variable Repetividad reproducibilidad

Promedio 3.5996 3.8788 S.D. 0.00751 0.0072 C.V. 0.20865 0.1862

La repetividad es muy buena, su desviación estándar es baja y el coeficiente de variación es menor al 1% los que significa que la dispersión de los datos es pequeñísima; según la tabla de la AOAC la precisión se ajusta en el valor C.V.(%) que exige un valor inferior a 5.3%; para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento, con los resultados de reproducibilidad son muy parecidos a los repetividad, el C.V. es bajo y se acepta la condición impuesta por la A.O.A.C, además se identificó para este antibiótico un tiempo de retención es de 3.59 minutos, muy cercano a los descrito por ZHOU et al (2008) en el que encuentra un tiempo de retención de 4.42 min. 3.12.3 Precisión del método

Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad además de la exactitud y sensibilidad, en el siguiente CUADRO 36 se muestras los valores de estos parámetros. CUADRO 37 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. C.V.% Recuperación t tabla t experimental

exactitud 3.4046348 3.5921817 94.7790 1.699 7.9607492

repetividad 105487.74 0.9196309




La exactitud comprobada con la prueba de t de Student el valor t experimental es mayor que

el t tabla, por lo que no se acepta la hipótesis nula y existe diferencia significativa con el

100% de recuperación al obtenerse un valor de 94.7790%, por ende la exactitud no es la adecuada según QUATTROCHI et al (1992). Pero al comparar con los rangos de la A.O.A.C el criterio de aceptación del parámetro de exactitud es aprobado con un porcentaje de recuperación entre 90 y 107%. Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación se puede señalar que son valores adecuados que indican una variabilidad de los valores baja. La repetividad del método es bastante aceptable ya que el valor de C.V. está por debajo del 1% aproximadamente, mientras que para reproducibilidad el C.V. % es igualmente aceptado por su valor de 1.212%, no existe mucha dispersión entre los valores obtenidos por el HPLC. El límite de detección del método es 0.1368739 µg/mL y el de cuantificación 0.46850 µg/mL

38

3.13 Oxitetraciclina 3.13.1 Linealidad. En el CUADRO 38 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 307491.6X – 156096.929. Se probó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad, que resultó con un texperimental mayor que el de ttabla, con tres grados de libertad, lo cual significa que existe una

linealidad, corroborado también por el coeficiente de correlación con un valor de 0.9996, lo que indica una linealidad y una correlación positiva. CUADRO 38 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Oxitetraciclina.

B a r r2 t tabla t experimental 307491.6 -156096.929 0.99983 0.9996 3.182 95.88745


FIGURA 13 Curva de Calibración Concentración de Oxitetraciclina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.13.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los que se obtuvieron los valores presentados en el CUADRO 39. CUADRO 39 Valores obtenidos para precisión del equipo

Mediciones \variable Repetividad Reproducibilidad Promedio 3.47 3.41

S.D. 0.0062 0.02 C.V. 0.1656 0.55

La repetividad es aceptable debido a su desviación estándar es baja y el coeficiente de variación es menor al 1%; lo que significa que la dispersión de los datos es mínima. Según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el valor C.V. (%) que exige un valor inferior a 5.3%; para este nivel de concentración, se respalda la aceptable precisión del instrumento.

39

Se identificó para este antibiótico un tiempo de retención de 3.47 minutos, muy cercano a los descrito por ZHOU et al. (2008), que encuentra un tiempo de retención de 4.91 min. 3.13.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad, además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 40 se muestran los valores de estos parámetros. CUADRO 40 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. RSD Recuperación ttabla Texperimental

Exactitud 2.641924 2.62127323 100.787843 1.699 1.64622046

Repetividad 174858.03 1.15012246




La exactitud comprobada con la prueba de t de Student el valor texperimental es menor que el ttabla, por lo que se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación. La exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación son adecuados y corroboran t de student. La A.O.A.C. en su tabla de criterio de aceptación del parámetro de exactitud es aprobado con un valor de porcentaje de recuperación que se encuentra entre 90 y 107%. La repetividad del método es bastante aceptable ya que el valor de C.V. llega al 1.15% aproximadamente, mientras que para reproducibilidad. El límite de detección del método es 2.2841 µg/mL y el de cuantificación 7.6137 µg/mL 3.14 Sulfadiacina 3.14.1 Linealidad. En el CUADRO 41 se presentan los datos de la curva de calibración, concentración en µg/mL y área en mVxmin., además se muestra la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación de dicha curva La ecuación de la recta obtenida del análisis es Y = 38409.659X + 110515.58; se probó por medio de la prueba estadísticas t de student la linealidad, que resultó con un texperimental

mayor al ttabla con tres grados de libertad, lo cual significa que existe una linealidad, corroborado también por el coeficiente de correlación con un valor de 0.9996 lo que indica una linealidad y una correlación positiva. CUADRO 41 Valores obtenidos de la ecuaciones de linealidad Sulfadiacina.

B a r r^2 t tabla texperimental

38409.659 110515.5809 0.99931434 0.99862915 3.182 46.7485


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FIGURA 14 Curva de Calibración Concentración de Sulfadiacina (µg/mL) v/s Área (mVxmin) 3.14.2 Precisión del instrumento. Tomando el tiempo de retención se le midió la repetividad y reproducibilidad para los que se obtuvieron los valores presentados en el CUADRO 41 CUADRO 42 Valores obtenidos para precisión del equipo

Mediciones \variable Repetividad reproducibilidad Promedio 7.54 6.152

S.D. 0.0431 0.05 C.V. 0.57072 0.85

La repetividad y reproducibilidad son aceptables, debido a que sus desviaciones estándar son bajas y el coeficiente de variación es menor al 1% los que significa que la dispersión de los datos es baja, según la tabla de la A.O.A.C. la precisión se ajusta en el valor C.V. (%) que exige un valor inferior a 5.3% para este nivel de concentración se respalda la buena precisión del instrumento. Además, se identificó para este antibiótico un tiempo de retención es de 7.54 minutos. 3.14.3 Precisión del método. Se midieron los parámetros de repetividad, reproducibilidad además de la exactitud y sensibilidad. En el siguiente CUADRO 43 se muestran los valores de estos parámetros. CUADRO 43 Valores obtenidos para precisión del método. S.D. C.V. Recuperación t tabla t experimental

Exactitud 9.20875 9.05111 101.742 1.725 0.88176

Repetividad 129936 5.89897

Reproducibilidad 904318 5.004



La exactitud comprobada con la prueba de t de Student el valor texperimental es menor que el ttabla, se acepta la hipótesis nula y no existe diferencia significativa con el 100% de

recuperación. La exactitud es adecuada (QUATTROCHI et al, 1992). Con respecto a la desviación estándar y el coeficiente de variación son adecuados y corroboran t de

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student. La A.O.A.C. en su tabla de criterio de aceptación del parámetro de exactitud es aprobado con un porcentaje de recuperación entre 90 y 107%. La repetividad y reproducibilidad del método son bastante aceptables ya que los valores de C.V. están bajo la exigencia requerida por la A.O.A.C. El límite de detección del método es 2.2841 µg/mL y el de cuantificación 7.6137 µg/mL

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4. CONCLUSIONES

Se desarrolló e implementó la primera parte del proceso de validación de métodos para la determinación de antibióticos en propóleos de diferentes partes del país, a través de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) y del equipo espectrofotómetro varioskan flash. A partir de muestras patrón se detectó y cuantificó los siguientes antibióticos: Sulfameter, Sulfametoxipiridina, Cloranfenicol, Sulfadoxina, Sulfaguanidina, Sulfapiridina, Sulfameracina, Sulfacitamida, Sulfatiazol, Sulfacloropiridina, Estreptomicina, Tetraciclina, Oxitetraciclina. Se determinó que los métodos son lineales para todos los antibióticos estudiados, dentro de los rangos de concentraciones trabajadas, además de ser respaldados por la prueba estadística de t de Student con las condiciones que propone QUATTROCHI et al. (1992). Así también fueron aceptados los criterios de validación impuestos por la A.O.A.C. La precisión del sistema para cada antibiótico fue probada, resultando en la mayoría un coeficiente de variación cercano al 1% bajo condiciones de repetividad y reproducibilidad, la dispersión de los datos mantuvo esta tendencia baja, lo que habla de que el equipo es confiable en sus lecturas. También respalda el trabajo realizado en el laboratorio. Las diferencias en los tiempos de retención que pudieron verse entre la bibliografía y el trabajo hecho en laboratorio, se debe básicamente a variables como, el uso de columnas diferentes, equipo HPLC, uso de estándares de distintas marcas con diferentes grados de pureza. En la precisión de los métodos, estos fueron aprobados bajo los parámetros tradicionales estadísticos que sugiere la A.O.A.C y cumpliendo con los límites que estos impone esta organización internacional, así también se corrobora con la prueba estadística t-student las respectivas hipótesis planteadas. En antibióticos como Sulfameter, Sulfametoxipiridina, sulfaguanidina, sulfanilamida, sulfacetamida, sulfapiridina y sulfadoxina, donde no existe una amplia bibliografía, más bien es casi nula. El aporte realizado por este estudio, se conoce el comportamiento de estos antibióticos, se especifica el tipo de fase móvil utilizada en HPLC, el tiempo de retención y el tipo de columna. Variables iniciales fundamentales para el estudio y desarrollo de futuros trabajos sobre estos antibióticos. Con los resultados obtenidos en los diferentes antibióticos, en determinación de linealidad, sensibilidad, precisión en equipo y en el método, se concluye que estos resultados son aptos para ser usados en el siguiente paso en la validación de antibióticos, el que consistirá en trabajar específicamente sobre la muestra de propóleos.

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6 ANEXOS

Anexo Nº 1: Criterios de aceptación para el parámetro de precisión en función de la concentración del analito de la AOAC.

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Anexo Nº 2: Criterio de aceptación del parámetro de exactitud, relacionando el porcentaje de recuperación en función de la concentración del analito.

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