unidad 2 modulo espectroscopia 401539

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA CONTENIDO DIDACTICO DEL CURSO: 401539 –Espectroscopía

2. UNIDAD 2. MÉTODOS BASADOS EN LA EMISIÓN DE ENERGÍA

Introducción

Como se explicó en la unidad anterior, cuando una sustancia química absorbe un

tipo de radiación, sus electrones pasan de un estado basal a un estado electrónico

excitado. Al suceder el fenómeno de absorción muchas sustancias disipan el

exceso de energía en forma de calor, sin embargo, solo un grupo de especies

pierde una cantidad del exceso de energía en forma de calor, y emite la energía

restante en forma de radiación electromagnética de distinta longitud de onda que

la absorbida, a una longitud de onda mayor, puede utilizarse con fines analíticos.

De acuerdo con este fenómeno de emisión remanente de energía con que

cuentan las especies químicas luego de ser irradiadas, es que se puede emplear

la espectroscopia de emisión atómica (E.E.A.) y la espectroscopía de

Fluorescencia tanto para la identificación de sustancias atómicas como para la

cuantificación de las mismas. Al igual que la técnica instrumental de absorción

atómica, la E.E.A. genera espectros de emisión conformados por picos muy

estrechos, los cuales explican las transiciones energéticas de los electrones que

conforman los átomos de un elemento en particular. También, estos espectros

representan una huella digital inequívoca de los elementos metálicos, al igual que

cualquier otra propiedad física, como por ejemplo, el punto de fusión, el índice de

refracción, etc.

En el último capítulo se abordaran algunas técnicas espectroscópicas modernas

de caracterización y análisis de superficies actualmente utilizadas como son

espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), microscopia electrónica de

barrido (SEM) y Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM).

En la presenta unidad se abordará la información necesaria para entender el

fenómeno de emisión de energía a escala atómica y todo lo relacionado con la

técnica de análisis instrumental de superficies.


CAPITULO 4: ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA

Lección 16: La radiación electromagnética

Es de vital importancia enfatizar en algunos aspectos sobre la radiación

electromagnética, por su repercusión en la espectroscopia en general, haciendo

énfasis en la de emisión atómica. La radiación electromagnética es un tipo de

energía que se transmite a enormes velocidades por el espacio y que adopta

muchas formas; entre las más conocidas se encuentran la luz y el calor radiante.

Muchas de las propiedades de la radiación electromagnética se describen con

certeza según el modelo clásico de los fenómenos ondulatorios. Este modelo

considera la radiación electromagnética como una serie de ondas constituidas por

un campo eléctrico perpendicular entre sí y a la dirección de propagación de dicha

onda.

Figura 54. Ondas electromagnéticas

Ciertos fenómenos suceden cuando interacciona la radiación electromagnética

con la materia, como la absorción y emisión de dicha radiación. Para explicar

estos fenómenos es necesario considerar que la radiación electromagnética es

una corriente de paquetes discretos de energía. Estos paquetes de energía se

comportan como partículas individuales, llamadas fotones. Cada fotón se

http://www.monografias.com/trabajos5/natlu/natlu.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/adolmodin/adolmodin.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/elso/elso.shtml#ondas

http://www.monografias.com/trabajos15/direccion/direccion.shtml


caracteriza por una frecuencia. Estas dos formas de ver la radiación

electromagnética como partícula y como onda no se excluyen sino que se

complementan.

La espectroscopia es la medición e interpretación de la radiación electromagnética

absorbida, dispersada o emitida por átomos, moléculas u otras especies químicas.

Estos fenómenos están asociados con cambios en los estados de energía de las

diferentes especies; por consiguiente, dado que cada especie posee estados

energéticos característicos, la espectroscopia puede utilizarse para identificarlas.

El método espectroscópico se ha usado durante largos años para el

reconocimiento sensible de muchos elementos. El análisis del espectro con fines

cuantitativos fue introducido por Lockyer y Roberts en 1873, pero estos tuvieron

poca repercusión. Posteriormente la introducción del principio de estandarización

interna propuesta por Gerlach en 1925 determina un nuevo período en la

elaboración de procedimientos analíticos cuantitativos.

http://www.monografias.com/trabajos37/interpretacion/interpretacion.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/metods/metods.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/metods/metods.shtml#ANALIT

http://www.monografias.com/trabajos13/discurso/discurso.shtml

http://www.monografias.com/trabajos13/mapro/mapro.shtml


Lección 17: Principios básicos de la espectroscopia de emisión atómica

(E.E.A).

Los métodos espectroscópicos atómicos se basan en la interacción entre la

radiación electromagnética y la materia. La espectroscopia de emisión atómica

(E.E.A.), es un método instrumental de análisis químico, que se fundamenta en el

estudio de la radiación emitida por átomos en todas las regiones del espectro.

Cuando estos absorben energía, se excitan y en dicho estado permanecen un

tiempo muy corto (del orden de 10-6 s.), luego el átomo o molécula vuelve a su

estado fundamental o no excitado emitiendo el sobrante de energía en forma de

luz o cuantos luminosos.

A

B

Figura 55. A. Explicación de las transiciones electrónicas; B. Espectro de emisión del hierro.

Esto ocurre cuando una muestra es sometida a una descarga eléctrica

suministrada por una fuente de excitación. El proceso descrito puede expresarse

http://www.monografias.com/trabajos12/elorigest/elorigest.shtml

http://www.monografias.com/trabajos901/evolucion-historica-concepciones-tiempo/evolucion-historica-concepciones-tiempo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/atomo/atomo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/administ-procesos/administ-procesos.shtml#PROCE


de acuerdo a la condición de frecuencia de Bohr. Si E1 y E2 son los estados inicial

y final respectivamente, la energía emitida se expresará como:

Ecuación 2.1

Donde: = Frecuencia de la radiación emitida

Los iones o moléculas gaseosas, cuando se excitan térmica o eléctricamente

emiten una radiación característica en la zona del ultravioleta visible que puede

ser medida y utilizada para el análisis cualitativo y cuantitativo, ya que la

intensidad de las líneas es proporcional cantidad de átomos excitados, en

dependencia de las condiciones de excitación y a la concentración de la muestra.

Mientras que la mayoría de las técnicas espectroscópicas sirven para el análisis

de moléculas y de átomos, la espectroscopia de emisión sólo sirve para análisis

de átomos. Esto se debe a la gran energía que se necesita para excitar la mayoría

de las especies químicas, de forma que esta energía disocia los compuestos en

átomos o iones. La espectroscopia no al ser excitada la muestra, se rompe la

estructura e ioniza el átomo. Como consecuencia de lo señalado anteriormente se

puede concluir que, esta técnica no es útil para la determinación del estado

químico de combinación.

En Espectroscopia de Emisión Atómica la cantidad física que es usada para

caracterizar y medir la concentración que será determinada, se refiere como

intensidad.

El análisis cuantitativo determina la concentración o cantidad de una sustancia a

partir de una medición, que puede ser la lectura de un voltímetro, que se refiere a

la energía radiante, en mediciones fotográficas. En la práctica no es necesario

decir que tipo de energía radiante se está midiendo. Entonces la expresión

intensidad puede ser empleada para expresar la fuerza relativa de una línea

espectral. Luego la intensidad de una línea espectral o del fondo es una expresión

relativa al referirse a la cantidad medida por el receptor de dicha señal. La

dimensión es pues la unidad, sin embargo, no es necesario referirse a unidades

pues queda explícito en el término intensidad por su valor relativo respecto a otra

línea de referencia interna en el espectro usado.

La base del análisis cuantitativo por emisión atómica lo constituye la simple

relación empírica entre el contenido de un elemento en la muestra y la intensidad

de la línea espectral de dicho elemento, característico para una longitud de onda

http://www.monografias.com/Fisica/index.shtml

http://www.monografias.com/trabajos16/metodo-lecto-escritura/metodo-lecto-escritura.shtml

http://www.monografias.com/trabajos12/eleynewt/eleynewt.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/nuevmicro/nuevmicro.shtml


determinada, en la zona del espectro analizada. Esta relación se conoce

usualmente como la ecuación de Lomakim-Scheibe:

Ecuación 2.2

Donde, I = Intensidad lineal espectral.

c = Contenido del elemento.

a = Coeficiente de proporcionalidad

donde se asume en principio que la intensidad es proporcional a la concentración.

Las desviaciones de esta proporcionalidad están causadas fundamentalmente por

la autoabsorción, tomada en cuenta a través del exponente b. Cuando el registro

es fotográfico, la ecuación se representa gráficamente en coordenadas

logarítmicas

Ecuación 2.3

En la espectroscopia de emisión, son los electrones de valencia de los elementos

los que se excitan, para dar lugar a espectros atómicos formados por picos bien

definidos y estrechos, empleándose como líneas analíticas las líneas últimas o de

referencia

4.17.1 Ventajas

Este método tiene una serie de ventajas que se describen a continuación:

Excelente método para el análisis de trazas (contenidos <1 mg·l-1)

Empleado la determinación de metales, metaloides y otros elementos

Se requiere una pequeña cantidad de muestra (un nanogramo)

Determinación simultáneamente de varios elementos, sin necesidad de

separaciones previas.

Es un método rápido y fácilmente automatizado.

La exactitud y la precisión suele ser del 2 %

http://www.monografias.com/trabajos7/regi/regi.shtml


4.17.2 Desventajas

Este método también posee una serie de desventajas como lo son:

Equipamientos relativamente caros.

Destrucción total de la muestra, cuando es en polvo.

Se realiza solo la determinación en forma de elementos.

4.17.3 Fuentes de energía.

Las fuentes de energía para la emisión pueden ser provocadas por energía

térmica o eléctrica. Esta fuente ejerce una gran influencia en el tipo de

intensidades de los picos que constituyen el espectro de cada uno de los

elementos. De acuerdo a lo anterior se puede decir que la fuente de energía tiene

dos funciones:

Debe proporcionar suficiente energía como para convertir los compuestos

en átomos e iones gaseosos. En este proceso es importante que la

distribución de los elementos en el vapor se relacione reproduciblemente

con la concentración y la distribución en la muestra.

Debe proporcionar suficiente energía como para excitar los electrones de

los átomos gaseosos de forma también reproducible.

Al excitar a una sustancia se obtiene un espectro de emisión típico, parecido al de

una llama de O2 y H2, donde se observan tres tipos de radiación o espectros:

De líneas estrechas y bien definidas.

De bandas.

Continuo.

Los espectros de líneas se deben a emisiones atómicas o iónicas. En relación a

ello se expone que sólo existen niveles electrónicos en los átomos y, por lo tanto,

las emisiones procedentes de ellos serán picos más o menos estrechos y bien

definidos.

Por su parte Skoog, indica que los espectros de bandas se deben a emisiones de

radicales o moléculas sencillas. Pero en realidad, son espectros de líneas que se

superponen y que el instrumento no es capaz de resolver. Estos espectros de

bandas se eliminan utilizando fuentes de energía a mayor temperatura, que

romperán los radicales.

http://www.monografias.com/trabajos7/mafu/mafu.shtml

http://www.monografias.com/trabajos11/travent/travent.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/termodinamica/termodinamica.shtml


4.17.3.1 Energía de excitación

Resulta evidente que para que un elemento en estado de oxidación cero emita

una única línea espectral, es necesario que previamente haya absorbido una

energía equivalente a su potencial de excitación, que es la energía necesaria para

subir un electrón del estado fundamental al primer estado excitado; pero para que

un elemento muestre una emisión completa, debe absorber una energía

equivalente a su potencial de ionización. Como cada fuente de energía tiene una

cantidad de energía fija, los potenciales de ionización pueden servir como vía para

conocer las sensibilidades relativas de los distintos elementos en espectroscopia

de emisión. Así, aquellos elementos que tienen bajos potenciales de ionización,

como son los alcalinos, se podrán determinar con gran sensibilidad, mientras que

los elementos no metálicos con alto potencial de ionización, se determinarán con

poca sensibilidad.

Por lo expresado anteriormente se puede concluir que la complejidad de los

espectros de emisión dependerá de la configuración electrónica del elemento, por

lo que los metales alcalinos presentan espectros muy simples, mientras que los de

transición los presentan muy complejos.


Lección 18: Instrumentación de la E.E.A.

Los componentes básicos de un espectrómetro de emisión son: una fuente de

excitación, que proporcione energía a la muestra, un monocromador, que

seleccione las diferentes radiaciones emitidas y un sistema de detección.

4.18.1 Fuentes de excitación

La energía suministrada para la excitación de la muestra en análisis

espectroquímico procede de una descarga eléctrica entre dos electrodos. Uno de

ellos normalmente contiene la muestra, pulverizada, en forma sólida, o el residuo

procedente de una disolución.

Si la muestra es un metal o una aleación, uno de los electrodos, normalmente el

inferior, constituye la propia muestra. Cuando la muestra no es conductora, suele

colocarse en una pequeña cavidad practicada en un electrodo de grafito. También

se utilizan como soporte varillas de cobre y plata cuando estos elementos no

deben analizarse. El otro electrodo (contra-electrodo) suele ser grafito en todos los

casos.

Cuando se trata de muestras líquidas o disoluciones, lo normal es evaporar una

determinada cantidad depositada sobre el propio electrodo.

Para la excitación de la muestra se utilizan los siguientes dispositivos: la llama, el

arco eléctrico de corriente alterna, el arco eléctrico de corriente directa, y la chispa

eléctrica. Cada uno tiene ventajas y aplicaciones especiales. Sin embargo, la

función de cada unidad de excitación es que la muestra se vaporice y excitar los

electrones en los átomos vaporizados a niveles de energía superiores.

4.18.1.1 La llama

Proporciona una menor temperatura por lo que solo se excitarán unas cuantas

líneas, principalmente los elementos con baja energía de ionización, como los

metales alcalinos y alcalinos térreos, pero esto puede constituir una ventaja, ya

que las interferencias que pueden producir otros elementos quedan eliminadas al

estos no emitir energía.

http://www.monografias.com/trabajos10/riel/riel.shtml#corr

http://www.monografias.com/trabajos7/mafu/mafu.shtml


4.18.1.2 El arco eléctrico con corriente directa

Producido por un voltaje entre 50 - 300 Voltios, es un método común para

introducir la muestra en la descarga. La vaporización tiene lugar por el

calentamiento causado por el paso de la corriente. Las temperaturas del arco

están en un rango de 4000 - 8000 K. Las líneas de emisión producidas son,

principalmente, aquellas debidas a átomos neutros. Esta fuente es muy sensible,

con una buena relación línea-fondo. Generalmente se usa para la determinación e

identificación de sustancias presentes en una muy baja concentración, ya que

puede detectar elementos con bajo límite de detección.

4.18.1.3 El arco eléctrico con corriente alterna de alto voltaje.

En este caso se utiliza una corriente alterna entre 2000 y 5000 V. con intensidades

comprendidas entre 1 y 5 amperios. El arco se establece entre los electrodos,

separados alrededor de 1 mm, sin necesidad de contacto previo.

Si la frecuencia de la corriente es 50 Hz, el arco se extingue e invierte su dirección

100 veces por segundo, lo cual mejora considerablemente la reproducibilidad

respecto al arco de corriente continua, pues el arco se establece ("pica") en una

zona nueva en cada ciclo. Sin embargo, la naturaleza intermitente de la descarga

hace que la temperatura alcanzada sea inferior a la que se consigue con el arco

de corriente continua, con la correspondiente disminución de la sensibilidad. De

cualquier forma, este dispositivo no se utiliza demasiado en el trabajo analítico

ordinario.

4.18.1.4 La chispa eléctrica con corriente alterna

Da energías da excitación mucho más altas que el arco, con menor efecto de

calentamiento. Se ha comprobado que una chispa intermitente que siempre se

propaga en la misma dirección, proporciona mayor precisión que los métodos

considerados anteriormente. En la Figura 57 se muestran los componentes

esenciales de un circuito para una fuente de chispa.


Figura 56. Circuito para una fuente de chispa.

La línea de voltaje se ajusta a 10–40 kV con un transformador. El circuito

secundario contiene un condensador, C, y un motor, M, cuya rotación es

sincrónica con las alternancias de la línea de corriente. Durante medio ciclo el

condensador almacena la carga y cuando está cargado al máximo, el rotor

sincrónico permite que el circuito se cierre y salte la chispa, produciéndose una

descarga amortiguada.

La intensidad máxima puede ser hasta de 2000 A, pero la corriente media es solo

de unos pocos amperios o menos.

La excitación de la muestra con este tipo de fuente se produce por bombardeo de

electrones, en lugar de ser térmica, como en otras fuentes de excitación. Los

electrodos se mantienen relativamente fríos y la cantidad de muestra vaporizada

es muy pequeña.

No se trata de una fuente muy sensible, y por ello, no demasiado conveniente para

análisis cualitativo. Sin embargo, es una fuente muy estable y reproducible,

resultando muy adecuada para análisis cuantitativo. Operando con esta fuente se

pueden llevar a cabo análisis de forma rápida y precisa. Por ejemplo, en análisis

de control de calidad de aceros se puede efectuar un análisis en menos de 10

segundos.


4.18.1.5 La microsonda láser

es una fuente de excitación, que se encuentra comercializada, y que parece muy

prometedora. En esta fuente (Figura 58) se utiliza el láser para vaporizar la

muestra en el espacio entre dos electrodos de grafito, que se utilizan como fuente

de excitación de chispa.

Figura 57. Microsonda láser

El dispositivo permite analizar materiales no conductores y, posiblemente la mayor

ventaja sea el poder enfocar sobre determinadas zonas de tamaño muy pequeño,

entre 10 y 50 μm de diámetro.

4.18.2 Monocromadores.

Como elementos dispersantes en espectrometría de emisión se emplean prismas

y redes, cuyas características se consideraron en el capítulo 3. Actualmente

parece que las redes tienden a desplazar a los prismas, por una serie de razones,

entre las que se incluye el precio y, sobre todo, el hecho de que las redes

proporcionan dispersiones lineales, con lo que el problema de la identificación de

las líneas espectrales sobre una placa fotográfica se simplifica considerablemente.

La desventaja que supone la presencia de distintos órdenes de difracción se

elimina fácilmente utilizando filtros adecuados.


4.18.3 Detectores.

Los espectrógrafos utilizan una película fotográfica para registrar la radiación

emitida por la muestra problema, mientras que en los espectrómetros, la detección

se lleva a cabo por métodos fotoeléctricos.

Detección fotográfica. Casi todos los antiguos instrumentos de emisión utilizan

emulsiones fotográficas para detectar la energía radiante. Estos métodos se

pueden usar con fines cualitativos y cuantitativos. Su empleo en análisis cualitativo

se considerará más adelante (ver: aplicaciones), mientras que aquí se

mencionarán algunas de sus características para su empleo en medidas

cuantitativas.

Cuando una película fotográfica se expone a radiación electromagnética, y

posteriormente se revela, la imagen obtenida se mide normalmente como la

densidad de ennegrecimiento (peso de plata metálica producida por unidad de

área).

Una vez revelada la placa, la densidad de ennegrecimiento, D, (similar a la

absorbancia) se mide con un micro-fotómetro llamado densitómetro. Para ello, se

mide primero en una parte de la película no impresionada, Io, y después sobre la

línea de interés, obteniendo la intensidad de radiación transmitida, I. La densidad

es:

Ecuación 2.4

La densidad de ennegrecimiento está relacionada con la exposición, E, que se

define por

Ecuación 2.5

donde I es la intensidad de la radiación a una longitud de onda y t es el tiempo

de exposición.

Para convertir densidad de ennegrecimiento, D, de una línea, en exposición, es

necesario obtener experimentalmente la denominada curva de trabajo o curva H y

D, que consiste en una representación gráfica de D en función de log t (Figura 59)


Figura 58. Curva característica H y D para una emulsión fotográfica a dos longitudes de onda.

La medida de la pendiente de la zona lineal de la curva se conoce como gamma

de la emulsión y es una medida del contraste, el cual depende, a su vez, de la

longitud de onda.

Con ayuda de la curva característica puede relacionarse la densidad de

ennegrecimiento con el tiempo de exposición, y si éste se mantiene constante

(que es como normalmente se opera con fines analíticos) con la intensidad

relativa. Estas intensidades relativas son el parámetro dependiente de la

concentración. Por supuesto, que en espectroscopia analítica, las intensidades

relativas deben relacionarse con las concentraciones a través de la curva de

calibrado.

Detección fotoeléctrica. En los espectrómetros se utiliza como sistema de

detección una serie de tubos fotomultiplicadores, en lugar de una placa fotográfica.

Esto requiere la colocación precisa de toda una serie de rendijas de salida a lo

largo de la curva focal del espectrómetro, para seleccionar líneas espectrales

individuales, o grupos de líneas, con objeto de detectar muchos elementos

simultáneamente.

Normalmente, los espectrómetros tienen espacio para unas 90 rendijas, si bien,

solo entre 20 y 35 detectores y lectores, llamados canales, se utilizan para un

determinado análisis. Estos instrumentos se denominan de "lectura directa".


Asociado a cada tubo fotomultiplicador se dispone un sistema electrónico que

integra la señal del detector durante un periodo de tiempo, almacenada en un

condensador, leyéndose al final de la exposición.

La medida de la pendiente de la zona lineal de la curva se conoce como gamma

de la emulsión y es una medida del contraste, el cual depende, a su vez, de la

longitud de onda.

Con ayuda de la curva característica puede relacionarse la densidad de

ennegrecimiento con el tiempo de exposición, y si éste se mantiene constante

(que es como normalmente se opera con fines analíticos) con la intensidad

relativa. Estas intensidades relativas son el parámetro dependiente de la

concentración. Por supuesto, que en espectroscopia analítica, las intensidades

relativas deben relacionarse con las concentraciones a través de la curva de

calibrado.


Lección 19: Espectrometría de emisión atómica con fuente de plasma

Las fuentes de excitación consideradas como tradicionales, y que se han

considerado anteriormente, presentan una serie de inconvenientes, entre los que

destacan:

Llamas. La temperatura que se alcanza en las llamas es relativamente baja,

por lo que resulta difícil, si no imposible, analizar elementos refractarios o

elementos con grandes energías de excitación. Además, los productos de

combustión y los gases de la llama dan lugar a interferencias químicas y

espectrales.

Arco y chispa. Los arcos y las chispas son capaces de proporcionar altas

temperaturas de excitación, pero la naturaleza de la descarga eléctrica es

afectada fuertemente por el tipo de muestra. Así, pequeñas variaciones en la

composición pueden originar cambios importantes en las condiciones de

excitación.

Para tratar de evitar estos inconvenientes, se ha venido desarrollando una técnica

para el análisis multi-elemental por espectroscopia de emisión atómica basada en

el empleo de plasmas.

Las fuentes de plasma ofrecen varias ventajas comparadas con los métodos de

llama y electrotérmicos. Una de las ventajas constituye la de ser una técnica para

elementos múltiples y tiene un amplio rango de trabajo. Las fuentes de plasma

actuales brindan un método mucho más fácil para la manipulación de muestras

gaseosas y líquidas. El espectro para docenas de elementos puede ser registrado

al mismo tiempo, algo muy importante cuando la muestra es pequeña.

Figura 59. Espectrómetro de emisión con plasma de acoplamiento inductivo

http://www.monografias.com/trabajos34/el-trabajo/el-trabajo.shtml


Las altas temperaturas alcanzadas aumentan el número de elementos que se

pueden determinar, tanto cualitativa como cuantitativamente, ya que la

temperatura se puede estabilizar. Presenta una gran versatilidad, exactitud y

reproducibilidad, permitiendo trabajar con pequeños volúmenes de muestra,

rebajando considerablemente los límites de detección. Se emplea en el análisis de

metales, líquidos biológicos, usándose junto a la cromatografía de gases en la

determinación del plomo en sangre, arsénico, antimonio, plomo en aire y agua.

Un plasma se define como un gas ionizado, esto es, una mezcla gaseosa que

contiene una concentración significativa de cationes y de electrones. El plasma de

argón es el que se utiliza para la mayoría de los espectrómetros, puede llegar a

tener una temperatura de 10000 K, estableciéndose el siguiente equilibrio:

Ar Ar + + e-

En función de como se aporte esta energía externa, se han desarrollado tres tipos

de fuentes de alimentación: una fuente de corriente continua (DCP), consistente

en dos electrodos sumergidos en la corriente de gas argón, y otras dos que

utilizan potentes campos de microondas (MIP) y de radiofrecuencia (ICP). De las

tres, la de radiofrecuencia (ICP) es la más interesante desde el punto de vista

analítico.

Figura 60. Típica fuente de plasma de acoplamiento inductivo

Bobina de inducción

de radiofrecuencia

Flujo tangencial que soporta

el plasma de argón Muestra en forma de

aerosol o vaporizada

en argón

+

-

http://www.monografias.com/trabajos6/lide/lide.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/mese/mese.shtml

http://www.monografias.com/trabajos13/termodi/termodi.shtml#teo

http://www.monografias.com/trabajos/sangre/sangre.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/aire/aire.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/problemadelagua/problemadelagua.shtml


La Figura 61 muestra un esquema de una fuente típica de plasma de

acoplamiento inductivo denominada antorcha. Esta consiste en tres tubos

concéntricos de cuarzo a través de los cuales fluyen corrientes de argón.

El gas argón fluye a través de un tubo de cuarzo de unos 2.5 cm de diámetro,

rodeado en su extremo superior por tres o cuatro anillos de una bobina de

inducción alimentada por un generador de radiofrecuencias. La frecuencia de

operación estándar es de unos 27 MHz y la potencia de 1 a 3 kW.

Figura 61. Representación esquemática de la formación del plasma.

La corriente de alta frecuencia fluyendo a través de la bobina de inducción genera

campos magnéticos oscilantes cuyas líneas de fuerza están orientadas axialmente

en el interior del tubo. La ionización del argón que fluye por el interior del tubo se

inicia por medio de una descarga producida por una bobina Tesla. Los iones

originados en esta descarga y sus electrones asociados interaccionan entonces

con el campo magnético oscilante, como consecuencia de lo cual hace que se

muevan en trayectorias anulares cerradas, encontrando resistencia a ese

movimiento, lo que origina un calentamiento óhmico. El plasma, una vez formado,

se auto-mantiene, y el resultado es un gas altamente ionizado con temperaturas

entre 6000 y 10000 K. Por el mecanismo explicado anteriormente, se origina una

especie de "llama" fuertemente luminosa, pero no hay combustión.

En el plasma pueden distinguirse dos zonas: un núcleo blanco brillante que

termina en una cola en forma de llama. En el núcleo tiene lugar una intensa

emisión continua procedente de la recombinación de los electrones con los iones

argón. Esta emisión se desvanece unos 10 mm por encima del núcleo, por lo que

la región situada entre unos 15 y 20 mm es ópticamente transparente, y es donde

se llevan a cabo las medidas analíticas. La antorcha de plasma está constituida

por tres tubos concéntricos. La muestra, normalmente en disolución, es aspirada

por un sistema nebulizador y transportada por el tubo central, arrastrada por el gas


portador (argón) a una velocidad relativamente pequeña (≈1 mL/min). Como la

temperatura obtenida es muy elevada, es necesario aislar térmicamente el plasma

para evitar el sobrecalentamiento del tubo de cuarzo. Para ello, se introduce argón

tangencialmente por el tubo más externo a la velocidad de 10-15 L/min. Este flujo

de argón enfría las paredes internas del tubo de cuarzo externo, y a la vez,

estabiliza y centra el plasma.

Figura 62. Plasma acoplado inductivamente

4.19.1 Introducción de la muestra

Aunque la muestra puede ser introducida en el plasma en forma gaseosa, líquida,

o incluso como polvo muy fino, casi siempre se usan dispositivos semejantes a los

que se emplean en los métodos de llama.

Figura 63. Nebulizador concéntrico


En la Figura 64, se muestra un nebulizador concéntrico acoplado a la antorcha de

plasma. Aunque este tipo de nebulizadores se utiliza muy extensamente en ICP,

se han desarrollado otros con objeto de aumentar el rendimiento. Así, con

nebulizadores ultrasónicos, se incrementa la sensibilidad entre 3 y 10 veces.

4.19.2 Características del plasma de acoplamiento inductivo (ICP)

La fuente ICP proporciona gran calidad en análisis multi-elemental, pues

con ella se obtienen óptimos resultados para muchos elementos. Además,

es posible trabajar con casi las mismas condiciones de operación para

muchos de ellos.

La mayor temperatura del ICP, comparada con la combustión en las llamas,

permite la determinación de elementos refractarios, tales como P, B, W, Zr,

U.

Los límites de detección para muchos elementos son excelentes. Suelen

ser mejores que con llama, arco o chispa, si bien no siempre más

favorables que con horno de grafito.

La mayor temperatura alcanzada, y también el mayor tiempo de residencia

del analito en la antorcha de plasma, hace que la atomización sea más

completa y haya menos problemas de interferencias químicas. Este hecho

también está favorecido porque la atomización tiene lugar en un medio

inerte, que evita la formación de óxidos.

Por otra parte, a pesar de la mayor temperatura, hay menos problemas de

interferencias de ionización. Ello se debe al efecto tampón de los electrones

procedentes de la ionización del argón.

En la zona del plasma situado entre 10 y 30 mm por encima de la bobina de

inducción, la emisión debida al fondo es mínima.

Al no haber electrodos, no hay problemas relacionados con su

contaminación, como en los métodos de arco o chispa.

La fuente presenta una gran estabilidad durante largos periodos de

operación. Por ello, no es necesario un recalibrado frecuente, a diferencia

de los métodos de llama, arco o chispa.


La temperatura en la sección transversal del plasma es relativamente

uniforme y como consecuencia de ello, no se producen los efectos de auto-

absorción y auto-inversión, por lo que se obtienen curvas de calibrado con

amplios márgenes lineales. Este gran margen lineal permite la

determinación simultánea de constituyentes mayores, menores y de trazas,

sin necesidad de diluciones ni otras operaciones sobre la muestra.

4.19.3 Aplicaciones de la ICP

Las fuentes de plasma acoplado inductivamente proporcionan datos analíticos

mejores que otras fuentes de emisión. La calidad de estos resultados radica en la

gran estabilidad, bajo ruido, poca radiación de fondo y en la ausencia de

interferencias de las fuentes, cuando se opera en las condiciones experimentales

apropiadas.

Esta técnica se emplea para una amplia variedad de aplicaciones, ya que un gran

número de elementos pueden ser determinados rápidamente a niveles traza (ppm,

ppb), y porque una amplia variedad de tipos de muestras pueden ser analizados

utilizando esta técnica.

Agricultura y alimentos:

Análisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos...

Requiere una rigurosa preparación de la muestra.

Biología y clínica:

El mayor problema de los ensayos de este campo, está en la contaminación

de las muestras antes del análisis. Ejemplos de determinaciones:

- Cr, Ni y Cu en orina.

- Al en sangre.

- Cr en heces.

- Ni en leche materna.

- B, P y S en huesos.

Geología:

Las aplicaciones van desde los elementos mayoritarios, minoritarios y las

trazas.

Medio ambiente y aguas:


Se requiere un tratamiento previo de la muestra con digestiones ácidas,

microondas... Incluyen análisis de suelo, sedimentos, tejidos animales y

vegetales, además de varios tipos de aguas.

Metales:

Una dificultad asociada es el gran número de interferencias espectrales de

algunos metales. Aun así, se obtienen buenos resultados.


Lección 20: Espectroscopia de emisión con fuentes de arco y chispa

Fueron los primeros métodos instrumentales utilizados en el análisis. Están

basados en la obtención mediante la excitación del espectro de emisión de los

elementos por medio de arco eléctrico o chispa eléctrica. Estos espectros permiten

la determinación cualitativa y cuantitativa de elementos metálicos en varios tipos

de muestras incluyendo metales, aleaciones, suelos, minerales y rocas.

En las fuentes de arco y chispa, la excitación de la muestra se produce en el

pequeño espacio existente entre un par de electrodos. El paso de electricidad

entre los electrodos a través de este pequeño espacio proporciona la energía

necesaria para atomizar la muestra y producir átomos o iones en el estado

electrónico excitado.

4.20.1 Tipos de muestra y manipulación de la muestra

En esta técnica se utilizan muestras sólidas y se clasifican en muestras metálicas,

y no metálicas. En las muestras metálicas, si el metal es una aleación, uno o

ambos electrodos se pueden preparar fresando, torneando o vertiendo el metal

fundido en un molde. Para algunas muestras es más conveniente emplear la

superficie plana pulimentada de un trozo grande de metal como uno de los

electrodos y tomar una varilla de grafito o de metal como el otro.

En caso de muestras solidas no metálicas la muestra se coloca a menudo sobre

un electrodo cuyo espectro de emisión no interfiera en el análisis. Los electrodos

de carbono son ideales para muchas aplicaciones.

Los fabricantes ofrecen electrodos de carbono de muchos tipos, tamaños y

formas. Normalmente, uno de los electrodos tiene forma cilíndrica con un pequeño

cráter abierto en uno de los extremos, en el cual se introduce la muestra finamente

pulverizada. El otro electrodo es, en general, una varilla de carbono en forma

cónica, con la punta ligeramente redondeada. Esta configuración, proporciona el

arco o la chispa más estables y reproducibles.


Figura 64. Algunas formas características de los electrodos de grafito.

Otro método se normalmente se utiliza para la atomización de muestras

pulverizadas consiste en la compactación, conocida también como briquetting, o

peletilización de la muestra. En este caso la muestra finamente triturada se mezcla

con una cantidad relativamente grande de polvo de grafito, cobre u otra sustancia

conductora y compresible. La mezcla resultante se comprime a elevada presión

para darle la forma de un electrodo.

4.20.2 Instrumentos para la espectroscopia con fuentes de arco o de

chispa

Las fuentes de arco y de chispa, debido a su inestabilidad, requieren integrar las

señales de emisión durante al menos 20 s, y a menudo, durante un minuto o más.

Este requisito hace que el empleo de espectrómetros secuenciales no sea práctico

para la mayoría de las aplicaciones y esto exige instrumentos multicanal

simultáneo. Se han aplicado 2 tipos de instrumentos multicanal a la

espectroscopia de arco y chispa, los cuales son: espectrógrafos y espectrómetros

multicanal.

4.20.3 Espectroscopia de emisión con fuente de arco

La fuente de arco usual para un análisis espectroquímico está constituida por un

par de electrodos de grafito o de metal separado por unos milímetros. El arco se

enciende por una chispa de baja intensidad de corriente que provoca la formación

momentánea de iones que transforman en conductor el espacio entre los

electrodos, una vez iniciado el arco, la ionización térmica mantiene la corriente,

luego se separan a la distancia deseada.


4.20.3.1 Características de las fuentes de arco

La electricidad es producida en un arco mediante el movimiento de los electrones

y los iones que se forman por ionización térmica; la elevada temperatura que se

produce es el resultado de la resistencia de los cationes a este movimiento en el

espacio donde se produce el arco, por tanto, la temperatura del arco depende de

la composición del plasma que a su vez depende de la velocidad de formación de

partículas atómicas a partir de la muestra y de los electrodos. Esta temperatura del

plasma se encuentra en un rango de 4000 a 5000 K.

En el caso de átomos, los espectros obtenidos en un típico arco son ricas en

líneas intensas y contienen un número menor de líneas en el caso de especies

iónicas.

4.20.3.2 Bandas espectrales debido al cianógeno

Cuando con un electrodo de carbono o grafito se produce el arco en una

atmosfera de aire, se emiten unas bandas muy intensas de cianógeno, por eso se

utiliza una atmosfera controlada de nitrógeno o dióxido de carbono para controlar

esas emisiones.

4.20.3.3 Velocidad de emisión

Se ha demostrado experimentalmente que la velocidad a que las especies se

volatilizan y se excitan diferente considerablemente unas que otras. Los espectros

de unas especies aparecen pronto y después desaparecen a medida que la

muestra se consume; los espectros de otras especies alcanzan su máxima

intensidad a tiempos mayores. Por ello es necesario integrar señales de emisión

por un minuto más.

4.20.3.4 Aplicaciones de la fuente de arco

Las fuentes de arco son muy útiles para el análisis cualitativo y semicuantitativo de

muestras no metálicas, como suelos, muestras vegetales, rocas y minerales.

Normalmente, de 2 a 50 mg de muestra en forma de polvo, molienda, pequeños

trozos o limaduras se mezclan con una cantidad pesada de grafito y se introducen

en la cavidad de los electrodos de grafito, donde generalmente, el electrodo

portamuestras hace de ánodo y el segundo contraelectrodo actúa de cátodo.


En el análisis cualitativo de muestras no rutinarias, se utiliza de manera habitual el

registro fotográfico obteniéndose varios espectros en una placa moviendo

verticalmente la cámara tras cada excitación.

La excitación con arco también se utiliza para análisis cuantitativo. Sin embargo, la

precisión obtenida con el arco es significativamente más pobre que con la chispa y

mucho más pobre que con el plasma o la llama. Además, las intensidades de

emisión de las muestras sólidas dependen en gran medida de la muestra y debido

a esto es necesario igualar la matriz en los patrones y en las muestras para

obtener resultados satisfactorios.

4.20.4 Fuentes de chispa y espectros de chispa.

Se han desarrollado diversos circuitos que producen chispas de alta tensión para

espectroscopia de emisión. Una chispa intermitente que siempre se propaga en la

misma dirección proporciona mayor precisión y menor deriva de la emisión

radiante. Se utiliza un conjunto de circuitos de estado sólido para el control de la

frecuencia y la duración de la chispa que por lo general con una corriente de 60 Hz

se producen cuatro descargas de chispa por cada semiciclo.

Con una chispa de alta tensión. La corriente promedio es generalmente bastante

menor que en un arco típico. Por otra parte, en la fase inicial de la descarga, la

corriente instantánea puede sobrepasar los 1000 A; en este caso, la electricidad

circula por un canal estrecho que ocupa una minúscula parte del espacio total en

el que se produce la chispa. La temperatura en esta región puede llegar a ser de

40 000 K. Así, mientras la temperatura media de una fuente de chispa es mucho

menor que la de un arco, la energía en el pequeño volumen del canal puede ser

varias veces mayor. Como consecuencia, los espectros los espectros de iones son

más pronunciados en una chispa de alta tensión que en un arco.

4.20.4.1 Aplicaciones de la espectroscopia con fuente de chispa

Los análisis cuantitativos con chispa requieren el control preciso de muchas

variables que intervienen en la preparación y excitación de la muestra, y también

en el procesado de la película en los espectrógrafos. Además, las medidas

cuantitativas requieren la preparación cuidadosa de una serie de patrones para el

calibrado los cuales deberían aproximarse lo más posible a la composición y

propiedades físicas de las muestras a analizar.


Actualmente, la principal aplicación de la espectroscopia de emisión con fuente de

chispa es la identificación y análisis de metales y otros materiales conductores. La

detección se realiza normalmente con un policromador equipado con tubos

fotomultiplicadores. Los espectrómetros con fuente de chispa, y en menor grado

los de fuente de arco, se utilizan habitualmente y de manera importante en

fundiciones, fábricas, chatarrerías e industrias metalúrgicas. Los instrumentos

utilizados en estas aplicaciones son con frecuencia móviles y están equipados con

una pistola portátil con la fuente de arco o chispa que el operador puede poner en

contacto con la superficie metálica para producir la excitación. Dichos equipos se

utilizan para la identificación rápida de aleaciones y para el análisis de la mezcla

fundida antes de obtener la pieza de fundición.


Ejercicios (Unidad 2 – Capítulo 4)

1. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones NO es cierta para la espectroscópica

de emisión atómica?

a. Es un buen método para análisis de trazas con concentraciones del

orden de ppm.

b. Se necesita mucha cantidad de muestra.

c. Las muestras pueden analizarse sin preparaciones, sin separaciones

químicas previas.

d. Ninguna de las anteriores.

2. ¿Cuál de las siguientes NO hace parte de la instrumentación de un equipo

de emisión atómica?

a. La llama

b. El arco eléctrico con corriente directa

c. La chispa eléctrica con corriente alterna

d. Los prismas

e. La microsonda láser

3. Cuál de las siguientes es una aplicación de la emisión atómica?

a. Análisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos, entre

otros.

b. Detección de elementos presentes en la superficie.

c. Investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y

petrológicas.

d. Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, características

texturales.


4. El plasma de argón es el que se utiliza para la mayoría de los

espectrómetros, puede llegar a tener una temperatura de 10000 K. ¿cuál de

los siguientes equilibrios se establece para el argón?

a.

b.

c.

5. Cuál NO hace parte de la emisión atómica

a. Fuente de plasma

b. Plasma de acoplamiento inductivo

c. Cañón electrónico

d. Fuentes de chispa

e. Fuentes de arco


CAPÍTULO 5: ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Introducción

La espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS) es una técnica de emisión que

ofrece una gran sensibilidad en la región ultravioleta. Sin embargo, su sensibilidad

es mucho menor en la región visible debido a las intensas interferencias que

experimenta en la línea base y a procesos de “quenching” en esta zona espectral.

Para que pueda producirse el proceso de emisión fluorescente, previamente debe

haber tenido lugar un proceso de absorción que implicará dos o más transiciones

electrónicas. El proceso emisivo fluorescente puede producirse de diversas formas

lo que implica que existan distintos tipos de fluorescencia: fluorescencia

resonante, fluorescencia sensibilizada, fluorescencia Stokes o anti-Stokes,

fluorescencia retardada.

La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas

por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan

al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Una

de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su

sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de

magnitud mejor que las de la espectroscopia de absorción. No obstante, los

métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de absorción

debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden

hacer fluorescer.


Lección 21: Teoría de la fluorescencia molecular

Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque

hay diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada liberan su

exceso de energía y se relajan a su estado fundamental. Dos de las más

importantes de estos mecanismos son la relajación (desactivación) no radiante y la

relajación fluorescente.

Relajación vibracional

Relajación no radiante

Conversión interna

5.21.1 Fenómeno de relajación vibracional

Señalada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energía

vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las

moléculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energía

vibracional se transfiere a las moléculas del disolvente en una serie de etapas

como se indica en la Figura 66.

Figura 65. Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente


La ganancia de energía vibracional del disolvente se refleja en un ligero

incremento de la temperatura del medio. La relajación vibracional es un proceso

tan eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es

de 10-15 s aproximadamente.

También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior

de un estado electrónico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado

electrónico. Este tipo de relajación llamado algunas veces conversión interna, se

ilustra por las flechas onduladas largas. En la figura se ilustra el otro proceso de

relajación: la fluorescencia. Se puede observar que las bandas de radiación son

producidas cuando las moléculas fluorecen debido a que las moléculas

electrónicamente excitadas se pueden relajar a cualquiera estados vibracionales

del estado electrónico fundamental. De igual forma que las bandas de absorción

molecular, las bandas de fluorescencia molecular están formadas por una multitud

de líneas espaciadas tan estrechamente que son muy difíciles de resolver. El

camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el

tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivación por

fluorescencia es rápida con respecto a los procesos sin radiación, se observa tal

emisión. Por otro lado, si un camino sin radiación tiene una constante de velocidad

favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa.

La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de

sistemas que incorporan características estructurales y ambientales que hacen

que la velocidad de los procesos de desactivación sin radiación se reduzcan hasta

el punto que la reacción de emisión puede competir cinéticamente.

Se observa que las bandas de fluorescencia molecular están formadas

principalmente por bandas que tienen longitudes de onda más largas y, por tanto,

energías menores que la banda de radiación responsable de su excitación. Este

desplazamiento hacia longitudes de onda mayores se llama desplazamiento de

Stokes. En aquellos casos en los que la radiación absorbida sea emitida sin

cambio en la longitud de onda (misma energía) se conoce como radiación de

resonancia o resonancia fluorescente.

Debido a que las diferencias de energía entre los estados vibracionales es

aproximadamente el mismo, tanto para el estado fundamental como para el

excitado, la absorción, o espectro de excitación, y el espectro de emisión o

fluorescencia de un compuesto frecuentemente aparece como una imagen

especular de uno a otro con una sobreposición que ocurre en la línea de

resonancia.


Figura 66. Espectro de fluorescencia de antraceno en alcohol. (a) espectro de excitación; (b) espectro de emisión.

5.21.2 Variables que afectan la fluorescencia

5.21.2.1 Rendimiento cuántico

El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente

la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al

número total de moléculas excitadas. Las moléculas altamente fluorescentes, por

ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones,

se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que

son prácticamente cero.

5.21.2.2 Estructura

La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos que

contienen grupos funcionales aromáticos. Los compuestos que contienen

estructuras alifáticas y alicíclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces

muy conjugados pueden presentar también fluorescencia. La mayoría de los


hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la

eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y con su grado de conjugación.

La sustitución en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de

onda de absorción máxima y los cambios correspondientes en los picos de

fluorescencia. Además, la sustitución afecta frecuentemente la eficiencia de la

fluorescencia como se demuestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Efecto de la sustitución en la fluorescencia del benceno

Compuesto Fórmula Longitud de onda de

la fluorescencia, nm

Intensidad relativa de

la fluorescencia

Benceno C6H6 270-310 10

Tolueno C6H5CH3 270-320 17

Propilbenceno C6H5C3H7 270-320 17

Fluorobenceno C6H5F 270-320 10

Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7

Bromobenceno C6H5Br 290-380 5

Iodobenceno C6H5I - 0

Fenol C6H5OH 285-365 18

Ion fenolato C6H5O- 310-400 10

Anisol C6H5OCH3 285-345 20

Anilina C6H5NH2 310-405 20

Ion anilinio C6H5NH3+ - 0

Acido benzoico C6H5COOH 310-390 3

Benzonitrilo C6H5CN 280-360 20

Nitrobenceno C6H5NO2 - 0


5.21.2.3 Rigidez estructural

Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente favorecida

en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias cuánticas

para el fluoreno y el bifenilo están próximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo

condiciones similares de medida.

La influencia de la rigidez también tiene importancia en el aumento de la

fluorescencia de ciertos quelatantes orgánicos cuando están formando un

complejo con un ion metálico. Por ejemplo, la fluorescencia de la 8-

hidroxiquinoleína es mucho menor que la de su complejo con zinc.

5.21.2.4 Temperatura y disolvente

La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en muchas moléculas con el

aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a

temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivación no radiante

(conversión externa). Una disminución en la viscosidad del disolvente también

aumenta la probabilidad de conversión externa y produce el mismo resultado.

5.21.2.5 Efecto del pH

La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos

en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la

intensidad de emisión son probablemente diferentes para la forma ionizada y no

ionizada del compuesto. Por lo tanto será muy frecuente en los métodos

fluorimétricos el control estricto del pH.

Fluoreno Binefilo


5.21.2.6 Efecto de la concentración

La potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante

del haz de excitación que es absorbido por el sistema.

( ) Ecuación 2.6

Donde P0 es la potencia del haz incidente sobre la disolución y P es su potencia

después de atravesar la longitud b del medio. La constante K' depende de la

eficacia cuántica del proceso de fluorescencia. Con objeto de relacionar F con la

concentración c escribimos la ley de Beer así:

Ecuación 2.7

Sustituyendo nos queda:

( ) Ecuación 2.8

Si desarrollamos el término exponencial como una serie de Maclaurin será;

[ ( )

( )

] Ecuación 2.9

Siempre que 2'303bc < 0'05 podemos escribir que,

Ecuación 2.10

y si P0 se mantiene constante,

Ecuación 2.11

Cuando c es suficientemente elevada como para que la absorbancia multiplicada

por 2'303 sea mayor que 0'05, los términos de mayor orden de la expresión

anterior no son despreciables y la linealidad se pierde. Este efecto es un resultado

de autoapagamiento, en el cual las moléculas del analito absorben la fluorescencia

producida por otras moléculas de analito.


Lección 22: Instrumentación

Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los métodos

espectroscópicos, los componentes principales de un fluorímetro son: una fuente

de radiación, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador),

una célula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia

importante entre la fluorimetría (también la fosforimetría) y los demás métodos

espectroscópicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para

seleccionar la longitud de onda de excitación y otro para la de emisión.

En la Figura 67 se han representado los componentes básicos de un fluorímetro.

En espectrómetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiación más

intensas que las lámparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las

medidas de absorción. Anteriormente se indicó que la intensidad de fluorescencia

es directamente proporcional a la potencia del haz incidente.

La lámpara de arco de xenón presenta un espectro esencialmente continuo que se

extiende por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectro-

fluorímetros de red. Por otra parte, en los fluorímetros de filtro, suele utilizarse la

lámpara de arco de mercurio, la cual emite un intenso espectro de líneas sobre un

fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar una mayor sensibilidad,

debido a la alta intensidad de las líneas del mercurio.

Figura 66. Componentes básicos de un fluorímetro

Los sistemas para seleccionar la longitud de onda más empleados en

instrumentos de luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se

clasifican en fluorímetros de filtro y espectrofluorímetros de red. De los primeros,


los más utilizados son los filtros de interferencia, por proporcionar pequeñas

anchuras de banda.

Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolución

uniforme y dispersión lineal a todas las longitudes de onda. El mayor

inconveniente es que pasan varios órdenes espectrales, lo cual puede evitarse

usando filtros en el camino óptico.

5.22.1 Los prismas

Se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque proporcionan

una gran dispersión en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan muchas

medidas, y, además, para obtener una sensibilidad adecuada se necesitaría un

prisma muy grande, lo cual no es económico.

5.22.2 Las cubetas

Son utilizadas para contener la muestra, suelen ser de cuarzo para permitir el

paso de la radiación ultravioleta. Las más típicas son de 1 cm de espesor, como

las utilizadas para medidas de absorción, excepto que todas las caras son

transparentes a la radiación (están pulidas), ya que generalmente las medidas de

fluorescencia se realizan en un ángulo de 90º respecto a la radiación incidente; a

otros ángulos, la dispersión por la disolución y las propias paredes de la cubeta

puede originar mayor ruido de fondo.

5.22.3 Los detectores

La mayor parte de los fluorímetros y espectrofluorímetros actuales usan tubos

fotomultiplicadores como sistemas para detectar la radiación de fluorescencia.

Finalmente, mencionar que mientras que los más precisos espectrofotómetros de

absorción ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operación

no es práctica en instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta

siempre los problemas inherentes al empleo de haz sencillo.


Lección 23: Relación entre intensidad de fluorescencia y concentración

La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la concentración,

C, de la sustancia absorbente, pero solo a concentraciones relativamente bajas, lo

cual puede demostrarse como sigue: la fracción de radiación transmitida, según la

Ley de Beer, es:

Ecuación 2.12

donde, Po = potencia del haz incidente

P = potencia del haz transmitido

ε = absortividad

b = espesor de la cubeta (camino óptico)

C = concentración

La fracción de radiación absorbida es:

Ecuación 2.13

y la cantidad de radiación absorbida es:

( ) Ecuación 2.14

La intensidad de la radiación fluorescente, If, está relacionada con la cantidad de

radiación absorbida de la forma siguiente:

( ) Ecuación 2.14

Donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parámetros

instrumentales (eficacia del sistema detector y geometría) y φf es el rendimiento

cuántico de la fluorescencia (relación entre el número de fotones emitidos y los

absorbidos por unidad de tiempo).

El término 1–10–εbC puede desarrollarse como una serie de McLaren,

Ecuación 2.15


[ ( )

( )

]

( )

( )

Ecuación 2.16

de donde,

[ ( )

( )

] Ecuación 2.17

Para bajas concentraciones, cuando el término εbC sea menor que

aproximadamente 0.05, todos los términos de la Ecuación 2.17, excepto el

primero, son muy pequeños, y la expresión se reduce a

Ecuación 2.18

Así, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia será

directamente proporcional a la concentración:

Ecuación 2.19

En la Figura 68 se muestra una representación gráfica de la variación de la

intensidad de fluorescencia con la concentración.

Figura 67. Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración


A concentraciones relativamente altas, los términos de mayor orden de la

Ecuación 2.19, pueden ser lo suficientemente importantes, para que se pierda la

linealidad, como ya se comentó anteriormente. Sin embargo, existen otras causas

para la no linealidad a concentraciones altas. Son las siguientes:

5.23.1 Autoatenuación.

Se produce como consecuencia del choque entre moléculas excitadas, lo cual

origina una desactivación en forma de energía no radiante. Lógicamente, al

aumentar la concentración, aumentará la probabilidad de que se produzcan esas

colisiones.

5.23.2 Autoabsorción.

En este caso, la fluorescencia de una molécula es absorbida por otra molécula del

mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales eventos crece al

aumentar la concentración. La auto-absorción reduce la intensidad de

fluorescencia, salvo que φf sea la unidad. Por ello, la representación gráfica de If

frente a C puede hacerse incluso descendente para altos valores de C.

Como ya se vio, If es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorción,

mayor fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorción es demasiado grande y la

disolución bastante concentrada, la porción de la disolución más próxima a la

fuente luminosa absorbe mucha radiación, de forma que queda muy poca

disponible para el resto. Si la concentración es tan grande que toda la radiación

incidente es absorbida, If = k φf (Po – P) = k φf Po, en cuyo caso, If tiende al valor

de k Po (ver Figura 68).

Muchas moléculas aromáticas (especialmente aquellas con grupos funcionales

capaces de unirse por enlaces de hidrógeno) forman dímeros u otros agregados

en disolución. Esta tendencia, lógicamente será mayor a altas concentraciones de

soluto. Considerando que, con frecuencia, los dímeros son menos fluorescentes

que el correspondiente monómero, se observará un descenso de If como

consecuencia de la formación de estas especies dímeras.


Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen tendencia a

formar asociaciones con moléculas de su misma especie en estado fundamental.

El espectro de emisión de estas asociaciones suele estar desplazado hacia

mayores longitudes de onda respecto al del correspondiente monómero.


Lección 24: Aplicaciones de los métodos de fluorescencia

En cuanto a las aplicaciones de los métodos fluorimétricos, y ante la imposibilidad

de dar cuenta de todas ellas, se citarán algunos ejemplos específicos, dentro de

los grupos que se relacionan seguidamente.

5.24.1 Sustancias inorgánicas

Las sustancias inorgánicas pueden determinarse por los métodos siguientes:

5.24.1.1 Análisis directo

Aunque, bastantes especies inorgánicas presentan fluorescencia en estado sólido,

pocos son los sistemas de este tipo aplicables analíticamente. En disolución,

tampoco son demasiado numerosas las determinaciones directas; prácticamente

se circunscriben a compuestos de uranilo (las sales de uranio tetravalente y los

uranatos no son fluorescentes), algunos elementos pertenecientes a las tierras

raras [Ce(III), Eu(III), Tb(III), Dy(III)] y Tl(I). Este último, en presencia de cloruro

(TlCl43–) muestra una intensa emisión fluorescente a 450 nm. Un ensayo

cualitativo para Tl(I) se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl.

5.24.1.2 Formación de quelatos fluorescentes.

La formación de quelatos fluorescentes por combinación de un ión metálico con un

ligando orgánico proporciona uno de los métodos más sensibles y selectivos para

la determinación de muchos elementos. En la Tabla 6 se muestran algunos

ejemplos.

La mayor parte de las aplicaciones inorgánicas de la fluorimetría se han

desarrollado para elementos que no son de transición, pues aunque muchos iones

metálicos de transición forman quelatos muy estables y complejos con ligandos

aromáticos, un número relativamente pequeño de ellos son fluorescentes. Ello se

debe a lo siguiente: en primer lugar, muchos iones de transición son

paramagnéticos, lo cual favorece el cruzamiento entre sistemas y, en


consecuencia, disminuye la probabilidad de desactivación por fluorescencia.

Además, muchos complejos de metales de transición poseen una gran cantidad

de niveles energéticos poco espaciados, lo cual aumenta la probabilidad de

desactivación por conversión interna.

Tabla 6. Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas.

Especie Reactivo Sensibilidad (μg/mL)

Ag+ Butilrodamina S 0.01

Al3+

Morina 0.05

Al3+

Rojo de alizarina 0.007

Cu2+

Luminocupferrón 0.1

Li+ 8-hidroxiquinoleína 0.2

Sn4+

Flavonol 0.1

Determinaciones indirectas

Especie Reactivo Sensibilidad (μg/mL)

Cl- Nitrato de uralino 1.0

F- Al-morina 0.2

PO43-

Al-morina 0.05

5.24.1.3 Determinaciones indirectas.

Algunos aniones, tales como F– o CN– pueden determinarse indirectamente por

medida de la disminución de la intensidad de fluorescencia de un determinado

quelato (Ver Tabla 6). Así, por ejemplo, el fluoruro puede determinarse

indirectamente mediante el descenso de la fluorescencia que su presencia ejerce

sobre la fluorescencia del complejo aluminio–morina, con un límite de detección de

0.2 μg/mL. En otros casos tiene lugar la liberación de un ligando y la formación


posterior de un quelato fluorescente con otra especie. Así, es posible la

determinación de cianuro mediante el proceso descrito en la Figura 69.

Figura 68. Determinación fluorimétrica del cianuro.

5.24.2 Sustancias orgánicas

Existe una amplia variedad de compuestos orgánicos que pueden determinarse

por métodos fluorimétricos a niveles inferiores a 1 ppm (μg/mL), y algunas de las

especies más fluorescentes, tales como la fluoresceína o la quinina a niveles

considerablemente inferiores.

Hay que recordar que, en principio, presentarán fluorescencia molecular especies

altamente absorbentes, como compuestos no aromáticos altamente conjugados,

aromáticos y heterocíclicos. Por eso, gran cantidad de hidrocarburos, colorantes,

ácidos, aldehídos, alcoholes, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono,

pesticidas, porfirinas, esteroides, fármacos, etc. son susceptibles de ser

detectados o determinados por métodos fluorimétricos.

A modo de ejemplo, puede citarse la determinación de vitaminas, interesante

desde el punto de vista histórico, por ser uno de los primeros grupos de

compuestos biológicamente activos para los que se describieron métodos

fluorimétricos. Muchos de estos compuestos tienen estructuras que presentan

fluorescencia nativa, mientras que otros pueden convertirse en fluoróforos por

procedimientos sencillos (Tabla 7).


Tabla 7. Determinación fluorimétrica de vitaminas

Vitamina Reactivo λex λem

A Fluorescencia nativa 340 480

B1 + ferricianuro 365 445

B2 Fluorescencia nativa 370 440

B6 + KMnO4 350 450

B12 Fluorescencia nativa 275 305

C Ac. Dehidroascórbico +

o-fenilendiamina 350 430

D2

D3 + Ac. tricloroacético 390 480

E Fluorescencia nativa 270 370

K -- -- --

La vitamina A puede determinarse aprovechando la fluorescencia nativa que

presenta, midiendo la radiación emitida a 480 nm.

Figura 69. Estructura química de la vitamina A.

Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa, como

la B2 (riboflavina) y la B12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B1

(tiamina) y la B6 (piridoxina) necesitan una transformación previa, lo cual se

consigue por oxidación con ferricianuro y permanganato respectivamente.


La vitamina C requiere la transformación previa en ácido dehidroascórbico y

posterior condensación con o-fenilendiamina, para originar un fluoróforo azul. Por

su parte, las vitaminas D2 y D3 dan productos altamente fluorescentes cuando se

tratan con ácido tricloroacético y otros ácidos.

El tocoferol (vitamina E) puede determinarse fluorimétricamente haciendo uso de

su fluorescencia nativa, o bien, puede condensarse con o-fenilendiamina, después

de oxidación para dar un derivado fluorescente de fenacina.

Para la vitamina K no se han descrito métodos fluorescentes debido a que sufre

descomposición a la luz ultravioleta.

Dentro de este epígrafe general en el que se trata de las aplicaciones de la

fluorimetría a la detección y determinación de compuestos orgánicos, se indican

seguidamente algunas aplicaciones dentro de campos concretos.

5.24.3 Química clínica

La más extensa aplicación de los métodos fluorimétricos, en términos de número

de análisis realizados por día, tiene lugar, probablemente, en química clínica.

Muchas determinaciones clínicas importantes se realizan rutinariamente por estos

métodos en muchos laboratorios. La alta sensibilidad, simplicidad y bajo coste de

la instalación son factores importantes en la adopción de estos métodos. De los

centenares de métodos descritos para decenas de compuestos diferentes, se

citan, a modo de ejemplo, y como curiosidad algunos de ellos.

La determinación de fenilalanina es posible fluorimétricamente usando solamente

25 μL de suero. Es importante esta determinación para la prevención de ciertos

tipos de subnormalidad, ya que, la incapacidad para metabolizar este aminoácido

hace que tenga lugar su acumulación en los tejidos, originando daños en el

cerebro y retraso mental progresivo.

Asimismo, pueden determinarse estrógenos en orina, en concentraciones del

orden de 0.05 μg/mL, corticosteroides, de gran importancia para evaluar la función

de las glándulas suprarrenales, catecolaminas, importantes por su influencia sobre

el sistema vascular, porfirinas en orina, que pueden servir para indicar defectos en

la médula ósea, trastornos hepáticos e incluso envenenamiento por plomo, así

como otras especies de gran importancia práctica en muchos casos de interés

clínico.


La fluorimetría también se utiliza con éxito en análisis bioquímico. Así, por

ejemplo, es posible la determinación de la secuencia de nucleótidos en el ADN

con marcas fluorescentes, lo cual es fundamental para la elaboración de los

códigos genéticos. La forma de proceder consiste en "marcar" las unidades

fundamentales de terminación de cadena con grupos fluorescentes que emitan a

longitudes de onda determinadas.

5.24.4 Análisis forense

La gran sensibilidad de muchos métodos fluorimétricos hace que sean

particularmente adecuados en muchas determinaciones relacionadas con análisis

forense. Como ejemplo se muestra seguidamente la forma de detectar huellas

digitales latentes por fluorescencia producida por láser.

Cuando un dedo presiona sobre una superficie, aproximadamente 0.1 mg

de material permanece adherido a ella. De él, el 98-99 % es agua, que se

evapora, quedando un residuo del orden de 1 μg. Aproximadamente, la

mitad son sustancias inorgánicas (por ejemplo, NaCl) y el resto una mezcla

de sustancias orgánicas (aminoácidos, lípidos, vitaminas). La detección de

los restos de aminoácidos se lleva a cabo por tratamiento con ninhidrina (I),

la cual reacciona con ellos originando un producto púrpura (II), no

fluorescente, invisible si la cantidad es muy pequeña (ver Figura 71).

Figura 70. (I) Ninhidrina reactivo empleado en la detección de huellas; (II)

producto obtenido de la reacción con ninhidrina.

Posteriormente, por tratamiento con cloruro de cinc, se forma un producto

fluorescente (III) que se pone de manifiesto mediante su fluorescencia

inducida por láser.


Figura 71. Producto fluorescente obtenido en la reacción realizada en la detección

de huellas.

5.24.4 Fármacos y drogas

La fluorimetría también encuentra amplia aplicación en el análisis de fármacos y

drogas. Su importancia se basa en la gran sensibilidad y selectividad de las

técnicas fluorimétricas. Hay que considerar que la farmacología requiere métodos

analíticos capaces de distinguir entre varios medicamentos y sus productos

metabólicos. Debido a que muchos fármacos se administran en dosis muy

pequeñas, con frecuencia inferiores a 100 μg diarios, los métodos analíticos deben

ser altamente sensibles, sensibilidad que debe ser suficiente para detectar las

pequeñas cantidades expulsadas del organismo.

En la Tabla 8 se muestran algunos ejemplos de determinaciones fluorimétricas

para este tipo de sustancias.

Tabla 8. Determinación fluorimétrica de fármacos y drogas

Sustancia Condiciones λex (nm) λem (nm) Sensibilidad (μg/mL)

Adrenalina pH 1 295 335 0.1

Ac. salicílico pH 11 310 435 0.1

Ampicilina Hidrólisis 346 422 0.05

Aspirina HAc-CHCl3 280 335 0.01

Atropina eosina 365 556 1.0

Codeina pH 1 245.285 350 0.1

Digital HCl-glicerina 350 465 0.1


Estreptomicina pH 13 366 445 0.1

LSD pH 7 325 365 0.002

Morfina pH 1 285 350 0.1

Pentotal pH 13 315 530 0.1

Quinina pH 1 350 450 0.002

5.24.5 Química Agroalimentaria

También se utilizan las técnicas luminiscentes con cierta extensión. Así, por

ejemplo, los antioxidantes son sustancias que se añaden a los alimentos que

contienen grasas o aceites para evitar su degradación durante el proceso de

elaboración. Una de las sustancias empleadas es el hidroxianisol butilado (BHA).

Esta sustancia está permitida por la legislación vigente y puede separarse por

destilación con arrastre en corriente de vapor y determinarla directamente en el

destilado por espectrofluorimetría ( ex=293 nm; em=323 nm).

5.24.6 Contaminación ambiental

Muchas aplicaciones de los métodos fluorimétricos en relación con la

contaminación atmosférica se refieren a la determinación de hidrocarburos

aromáticos polinucleares, muchos de los cuales son cancerígenos. En ocasiones,

pueden cuantificarse productos no fluorescentes mediante una reacción previa

que origine un fluoróforo y en combinación con técnicas de separación

cromatográfica. Así, por ejemplo, se han encontrado isocianatos alifáticos (muy

perjudiciales para la salud) en el aire de lugares de trabajo donde se emplean

espumas de poliuretano. El procedimiento consiste en tratar con 1-naftil-

metilamina para formar derivados fluorescentes que pueden separarse por

cromatografía líquida.


Figura 72. Método fluorimétrico para la determinación de hidrocarburos

aromáticos polinucleares.

Respecto a la contaminación de aguas, se encuentra un interesante ejemplo en

el uso del espectro de fluorescencia casi como "huella digital" para la identificación

de crudos y otros materiales petrolíferos procedentes de vertidos. La técnica,

relativamente moderna, proporciona unos resultados tan dignos de confianza, al

menos, como los obtenidos por procedimientos de identificación convencionales,

habiendo sido adoptada por los servicios de guarda costas de algunos países.

Ejemplo

Se desea analizar vitamina B1 en un preparado comercial de 2.000 g por el

método del tiocromo. Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 mL. Se

purifica una alícuota de 15 mL pasándola por una columna cromatográfica, y por

causas inherentes al proceso se diluye a 25 mL. De la anterior solución, se forman

dos porciones de 5 mL, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a

10 mL para examen fluorimétrico. Una solución de referencia de 0.2 ppm de

tiamina se somete al mismo tratamiento que la muestra problema, con excepción

de que la porción introducida en la columna conserva su volumen original. Se

toman dos alícuotas de 5 mL y una se oxida y ambas se aforan a 10 mL. Se mide

la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de fluorescencia

de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de

vitamina B1 en la muestra.

Solución:

Como el tratamiento del patrón y de la muestra problema son idénticos, salvo la

dilución de 15 a 25 mL en la columna cromatográfica, hacemos referencia a la

concentración de patrón de 0.2 ppm de tiamina, que da una fluorescencia de 13


unidades. Por tanto, 18 unidades de fluorescencia se corresponden a una

concentración de tiamina de:

Esta concentración debe ser corregida por la exclusiva dilución cromatográfica que

sufre la muestra problema. Luego la concentración de tiamina en los 100 mL es:

( ⁄ )

Para obtener los mg de tiamina en la muestra, se multiplica la concentración por el

volumen expresado en litros:

mg de tiamina en 100 mL o 2 gramos de muestra = 0.4615 (mg/L) * 0.1 L =

0.04615 mg.

Para obtener los ppm (mg analito / Kg muestra) de tiamina en la muestra:

ppm de tiamina en la muestra = 0.04615 (mg) / 2x10-3 Kg = 23.1 ppm

Ejemplo

En ausencia de autoabsorción, la intensidad de fluorescencia de una muestra es

proporcional a la concentración, solo a concentraciones bajas. Calcular el

porcentaje de error que se comete suponiendo que la respuesta es lineal cuando

se mide la intensidad relativa de fluorescencia de disoluciones 2.5x10-5 y 2.5x10-6

M de un compuesto cuya e=4000 L mol-1 cm-1 si el valor de b es 1 cm.

Solución:

Teóricamente, la intensidad de fluorescencia, IF, es proporcional a la eficacia

cuántica, F, y a la intensidad de radiación absorbida por la muestra (I0-I),

diferencia entre la intensidad incidente y la intensidad transmitida:

( ) Ecuación 2.20

Por otra parte, la transmitancia se define como la relación entre la Intensidad

transmitida, I, y la intensidad incidente I0, siendo la Absorbancia, A, el logaritmo

decimal de la transmitancia cambiado de signo:


Por tanto:

( ) ( )

10-εbc se puede aproximar, a concentraciones bajas a la serie de Taylor. Para ello

es necesario hacer un cambio de base:

por lo tanto ( )

El desarrollo de la serie de Taylor para ex cuando x tiende a cero es:

( ) ( )

( )

( )

( )

( ) ∑

( )

De tal manera que, cuando x tiende a cero (bajas absorbancias):

Entonces

( )

( )

( )

Si la absorbancia es pequeña, (A < 0.05) se pueden despreciar los términos de

orden 2 y superiores, por tanto:

y la intensidad de fluorescencia aproximada;

( )

El porcentaje de error que se comete:


(

) (

)

(

)

- Si la concentración es 2.5x10-5 M:

que supera el valor de 0.05

(

)

- Si la concentración es 2.5x10-6 M:

(

)



1. La forma reducida del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) es

una coenzima importante y muy fluorescente. Tiene un máximo de

absorción de 340 nm y un máximo de emisión a 465 nm. Las soluciones

patrón de esta sustancia generan las siguientes intensidades de

fluorescencia:

La ecuación de calibración de los anteriores datos, para hallar la

concentración del NADH en función de las intensidades relativas es:

a. Irel = 19,45 cNADH + 2,8 x 10-4

b. Irel = 20,65 cNADH + 6,1 x 10-4

c. Irel = 22,35 cNADH + 3,6 x 10-4

d. Irel = 21,43 cNADH + 2,5 x 10-4

2. De acuerdo con el enunciado del ejercicio 1. calcule la desviación estándar

de la pendiente y la que corresponde a la regresión de la curva.

a. 0,1747 y 0,2696

b. 0,2134 y 0,2576

c. 0,1853 y 0,2787

d. 0,2046 y 0,2448


3. Con los datos consignados en la tabla del enunciado 1 desarrolle el

siguiente ejercicio: una solución desconocida tiene una fluorescencia

relativa de 12,16. ¿Cuál será su concentración en NADH?

a. 0.614 μM

b. 0.454 μM

c. 0.735 μM

d. 0.544 μM

4. En algunos métodos fluorimétricos, el amortiguamiento de la fluorescencia

es proporcional a la concentración de las especies deseadas, por ejemplo,

el metal X puede suponerse que amortigua la fluorescencia del ligando L.

En una serie de medidas se obtuvieron los siguientes datos:

La relación molar del complejo formado entre X y L es:

a. 6,42 x 10-34 M

b. 3,46 x 10-34 M

c. 2,36 x 10-34 M

d. 5,63 x 10-34 M


5. A cuatro alícuotas de 10,0 mL de una muestra de agua se adicionaron 0.00,

1.00, 2.00 y 3.00 mL de una solución estándar de NaF que contenía 10.0

ppb de F- tal y como se muestra resumido en la tabla. Se adicionaron a

cada una 5.00 mL exactos de una solución que contenía un exceso de

complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente

fluorescente, y las disoluciones se diluyeron a 50.0 mL. La intensidad de de

fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco fueron las

siguientes:

Las partes por billón (ppb) de F¯ en la muestra son:

a. 0,361 ppb

b. 0,634 ppb

c. 0,381 ppb

d. 0,564 ppb


CAPÍTULO 6: ANÁLISIS DE SUPERFICIES POR MÉTODOS

ESPECTROSCÓPICOS

Introducción

Mediante éste capítulo se pretende introducir al estudiante en una nueva rama de

la química analítica: la química analítica de superficies o análisis de superficies. Su

presentación como entidad propiamente dicha, ha surgido gracias a dos

eventualidades preponderantes: 1. El desarrollo de tecnologías cada vez más

complejas ha permitido el diseño y utilización de instrumentos poderosos que

pueden revelar la estructura atómica y la composición química de las superficies;

2. la información que se obtiene a partir de los análisis de superficies e interfaces,

se ha constituido como una base potente para conocer procesos químicos

fundamentales de gran importancia, tales como: corrosión, adsorción,

quimisorción, reactividad, oxidación, pasivación, o difusión entre otros, lo que ha

permitido avanzar enormemente en el desarrollo de otras ramas de la Ciencia y la

Tecnología (producción de catalizadores, semiconductores, circuitos

microelectrónicos, polímeros, etc.).


Lección 25: Espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS)

6.25.1 Descripción de la técnica

La espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), es el método de

caracterización de superficies más ampliamente utilizado hoy en día. La

popularidad de esta técnica deriva del alto contenido de información que

suministra y la flexibilidad para ser utilizada en una gran variedad de muestras.

La técnica XPS se cataloga dentro de las técnicas analíticas de espectroscopias

electrónicas, denominadas de este modo porque se miden electrones. El más

básico análisis XPS de una superficie puede proporcionar información cualitativa y

cuantitativa de todos los elementos presentes, excepto H y He.

Figura 73. Equipo de espectroscopia fotoelectrónica de rayos X

Con aplicaciones más sofisticadas de la técnica se obtiene información detallada

de la química, organización y morfología de la superficie. La gran potencia de esta

herramienta de trabajo se vislumbra en las siguientes aplicaciones, realizadas en

los primeros 10 nm de una superficie:


Identificación de todos los elementos presentes (excepto H, He) en

concentraciones mayores al 0.1%.

Determinación semicuantitativa de la composición elemental de la superficie

(error < ± 10 %).

Información acerca del entorno molecular: estado de oxidación, átomos

enlazantes, orbitales moleculares, etc.

Información sobre estructuras aromáticas o insaturadas a partir de las

transiciones Π* → Π.

Información de grupos orgánicos utilizando reacciones de derivatización.

Perfiles de profundidad de 10 nm no-destructivos y destructivos de

profundidades de varios cientos de nanómetros.

Variaciones laterales en la composición de la superficie.

Estudio sobre superficies hidratadas (congeladas).

6.25.2 Interacción de la radiación X sobre la materia.

Para conocer la técnica XPS se ha de comprender el efecto fotoeléctrico y de

fotoemisión. Cuando un fotón se encuentra con un átomo puede ocurrir:

que pueda atravesarlo sin interacción alguna

que sea dispersado por un electrón de un orbital atómico con lo que ocurre

una pérdida de energía.

que el fotón interaccione con electrón de un orbital atómico con una

transferencia total de la energía del fotón hacia el electrón, ocurriendo la

emisión del electrón del átomo.

El segundo proceso es conocido como Compton scattering y puede ser importante

en procesos de alta energía, mientras que el tercer proceso resulta ser básico

para la técnica XPS. Cuando ningún electrón ha sido emitido por el átomo, se

debe a que la frecuencia de excitación del fotón es demasiado baja. Cuando

aumentamos gradualmente la energía del fotón se comienza a observar la

fotoemisión de electrones del átomo. Una vez superada la frecuencia umbral, el

número de electrones emitidos será proporcional a la intensidad de iluminación

(mayor número de fotones de alta frecuencia de excitación).


Figura 74. (Izquierda) Superficie irradiada con una fuente de fotones de alta energía que provoca la emisión de electrones. (Derecha) El fotón imparte su

energía a un electrón de un nivel electrónico interior, y este es emitido

Por otra parte, la energía cinética de los electrones emitidos es linealmente

proporcional a la frecuencia de los fotones excitantes, si se utiliza fotones de

energía muy superior a la umbral; el exceso de energía es transmitido al electrón

que se emite. El proceso de fotoemisión resulta ser extremadamente rápido, 10-16

s, y su física básica se describe mediante la ecuación de Einstein:

Ecuación 2.21

Donde EB es la energía de enlace del electrón en el átomo, hν es la energía de la

fuente de rayos X, y KE es la energía cinética del electrón detectado que es

medida por el espectrómetro del XPS.

Un electrón cargado negativamente se unirá al átomo por atracción con su núcleo

positivo. Cuanto más interno es el electrón, más fuerte será su enlace. La energía

de enlace de un electrón variará según el tipo de átomo (valor absoluto de su

carga nuclear) y de los átomos que a él se unan (los cuales pueden alterar la

distribución electrónica). En el caso de los isótopos, estos poseen distinto número

de neutrones pero igual carga nuclear, por tanto no varía la energía de enlace.

Las interacciones débiles entre átomos, como fuerzas de cristalización o enlace de

hidrógeno, no alteran suficientemente la distribución electrónica como para que se

pueda observar un cambio en la energía de enlace medible. La energía de enlace


que se mide por XPS se asocia siempre a enlaces de tipo iónico o covalente entre

átomos.

Para los gases, la energía de enlace de un electrón es igual a su energía de

ionización. En cambio, en los sólidos existe una influencia por parte de la

superficie, y una energía adicional es necesaria para remover un electrón de la

misma, esta energía extra es denominada función de trabajo. Cuando un sólido es

irradiado por rayos X, también puede ocurrir la emisión de electrones Auger. Estos

electrones se diferencian de los fotoelectrones, y se caracterizan porque su

energía es independiente de la energía de irradiación.

6.25.3 Energía de enlace y ajuste químico

La energía de enlace de un fotoelectrón emitido es simplemente la diferencia de

energía entre el electrón n-1 del estado final y el electrón n del estado inicial de

energía:

( ) ( ) Ecuación 2.21

Si durante el proceso de fotoemisión no ocurre un reordenamiento de electrones

en el átomo o molécula, entonces la energía de enlace será la igual al valor

negativo de la energía orbital, -εk, para el electrón fotoemitido:

Ecuación 2.22

Pero durante el proceso de fotoemisión otros electrones en la muestra no han de

permanecer imperturbables, sino que pueden responder a la creación del hueco

electrónico mediante un reordenamiento de las capas internas, o minimizando la

energía del átomo ionizado.

La reducción de energía que se produce de esta manera se conoce como energía

de relajación, y ocurre tanto para electrones del átomo que contiene el hueco

electrónico (relajación atómica), como para electrones de átomos vecinos

(relajación extra-atómica). De este modo la energía de enlace queda definida:

( ) Ecuación 2.23

El estado inicial de energía es el estado fundamental de energía del átomo antes

de ser sometido a un proceso de fotoemisión. El cambio de energía de enlace es

lo que se conoce como ajuste químico, y en principio este ajuste químico será el


mismo para todos los niveles electrónicos de un elemento. Los efectos de

relajación (atómica y extra-atómica) pueden tener una significativa importancia en

la energía de enlace medida. En todos los casos, el reordenamiento de electrones

que ocurre durante el proceso de fotoemisión resulta en una disminución de EB.

La mayoría de las componentes de la relajación atómica derivan del

reordenamiento de los electrones de las capas más externas, los cuales poseen

una EB menor que el fotoelectrón emitido. Los electrones más internos y con EB

mayor que la del electrón fotoemitido, realizan una pequeña contribución a la

energía de relajación atómica y se puede considerar despreciable. La contribución

de la relajación extra-atómica depende del material que se está examinando. La

magnitud de reducción de la EB por relajación extra-atómica es superior en

muestras metálicas que en sólidos iónicos.

Figura 75. (a) Ajuste químico para el orbital 1s del S vs estado de oxidación en especies inorgánicas. (b) Energía de enlace del orbital 2p del S vs carga calculada

en especies inorgánicas y orgánicas de azufre.

Otros tipos de efectos sobre el estado final de energía y que contribuyen a la EB

son el desdoblamiento en multipletes y la aparición de picos satélites. El primero


se origina por la interacción del hueco electrónico con electrones desapareados de

orbitales más externos, mientras que el segundo surge cuando el fotoelectrón

emitido pierde parte de su energía cinética para excitar a un electrón de valencia

hacia un orbital desocupado (transición Π→Π*).

6.25.3.1 Energía de enlace de referencia

Dado que la EB se determina midiendo la energía cinética del fotoelectrón emitido,

esto se ha de realizar de un modo riguroso, por lo que se requiere que el

espectrómetro XPS sea calibrado y referenciado.

Se utilizan metales conductores que son colocados en contacto con el

espectrómetro, uniéndose ambos, muestra e instrumento, a una toma de tierra.

Esta operación coloca el nivel de Fermi (Ef), el nivel más alto de energía ocupado,

de ambos al mismo nivel de energía.

La suma de la energía cinética y la de enlace no es igual a la energía de la

radiación X. La diferencia es la función de trabajo del espectrómetro, Φsp. La

función de trabajo se relaciona con el nivel de Fermi y el nivel al vacío (Evac) en la

forma:

Ecuación 2.24

La función de trabajo es la energía mínima requerida para impulsar un electrón

hacia el más alto nivel ocupado en el vacío. De este modo EB queda:

Ecuación 2.25

Se necesita medir la energía cinética y conocer la función de trabajo del

espectrómetro, siendo EBf la energía de enlace referenciada al nivel de Fermi.

Para muestras conductoras se ajusta el espectrómetro mediante el empleo de Au

estándar, conociendo que los valores de su energía de enlace son Ef = 0.0 eV,

4f7/2 = 83.98 eV. Para conseguir una linealidad en la escala de la energía de

enlace se ajusta la diferencia de energía entre líneas bastante separadas de una

muestra, por ejemplo los picos 3s y 2p3/2 del Cu.

La calibración se realiza por medidas reiteradas y al ultra alto vacío, que nos

asegure que las superficies de las muestras no tienen contaminación alguna.


Decir que la técnica XPS es sensible a la superficie. Esto se debe a que los

electrones poseen menos habilidad para atravesar sólidos que los rayos X. Así,

una radiación X de 1 KeV puede penetrar más de 1000 nm en un sólido, mientras

que electrones de esta energía sólo penetran unos 10 nm. Por tanto los electrones

que son emitidos por los rayos X que han penetrado más allá de las primeras

capas de la superficie, no pueden escapar de la muestra y alcanzar el detector.

6.25.4 Características de los espectros

Para realizar el análisis de un espectro de XPS se requiere conocer las

características del mismo. En un análisis de XPS se ha de realizar un amplio

barrido del espectro, cubriendo un rango de unos 1000 eV, y posteriormente se ha

de mirar con más detalle rangos más pequeños, de unos 20 eV.

En el eje horizontal se muestran valores de energía de enlace. El eje vertical

representa la intensidad o cuentas medidas. Existe un aumento del ruido de fondo

cuando se incrementa la energía de enlace. Esto es debido a que después de

cada fenómeno de fotoemisión, existe una señal acumulativa de ruido de fondo

asociada con fotoelectrones que han perdido energía debido a colisiones

inelásticas en el sólido, pero que todavía tienen energía suficiente para escapar.

Sobre el ruido de fondo de este espectro se observan: picos de fotoemisión

asociados con sucesos de fotoionización en niveles electrónicos del átomo, y

picos correspondientes a rayos-X inducidos por emisión de electrones Auger.

Las emisiones Auger también se suelen encontrar tabuladas. Además se pueden

distinguir de las líneas de fotoemisión cambiando la fuente de rayos X, ya que la

energía cinética de las líneas Auger es la misma, mientras que las líneas de

fotoemisión varían con la energía de la radiación X. Las líneas de poca intensidad

que aparecen a bajas energías de enlace, 0 – 30 eV, son originadas por la

fotoemisión de los electrones de valencia (orbitales más externos).

Como regla general, un espectro XPS se estudia realizando espectros locales de

alta resolución sobre cada una de las zonas características encontradas en un

primer espectro de barrido amplio, corroborando toda la información que sea

obtenida y procurando que no existan contradicciones. Los registros XPS aportan

gran información tanto en el análisis de sistemas orgánicos como inorgánicos. En

estos últimos suelen aparecer más características sobresalientes en los espectros,

como es la aparición de dobletes spin-orbital, desdoblamientos multipletes y

pérdidas plasmón.


Los análisis cuantitativos se realizan mediante estudio de la relación de áreas

encerradas bajo cada pico para los diferentes elementos. Introduciendo los

apropiados factores de corrección se puede determinar el porcentaje de cada

elemento presente (siempre en los primeros 10 nm de la superficie y exceptuando

H y He). Para estos cálculos se utiliza la ecuación:

( ) ( ) ∫ ( ) ( ) Ecuación 2.25

Donde,

- Iij es el área del pico j para el elemento i.

- K es una constante instrumental que contiene magnitudes como el flujo de rayos X, el

área de muestra irradiada, y el ángulo sólido de fotoelectrones aceptado por el

analizador.

- T(KE) es la función de transmisión del analizador, que incluye la eficiencia de

captación de las lentes, y la energía de analizador y eficiencia del detector.

- Lij (γ) representa el factor de asimetría angular para un orbital j de un elemento i. Tiene

en cuenta el tipo de orbital desde el cual un electrón es emitido, y el ángulo existente

entre la radiación X incidente y los electrones fotoemitidos.

- σij, es la sección transversal de fotoionización, e indica la probabilidad en que la

radiación X creará un fotoelectrón a partir de un orbital j de un elemento i.

- ni (z) indica la concentración de un elemento i a una distancia z por debajo de la

superficie.

- (KE) es la longitud promedia de camino libre inelástico.

- θ es el ángulo que forman los fotoelectrones medidos respecto a la normal de la

superficie.

Para evaluar la validez de la ecuación de cuantificación se ha de trabajar con muestras

estándar, las cuales se caracterizan por tener una composición conocida, ser

homogéneas a diferente profundidad de capas, ser relativamente estables y estar libres

de contaminantes. Estos requisitos los cumplen los polímeros politetrafluoretileno

(PTFE) y polietilenglicol (PGE).


Figura 76. Espectro XPS del poliuretano.

6.25.5 Instrumentación

Los componentes primarios de un instrumento XPS son el sistema de vacío, la

fuente de rayos X, un analizador de energía del electrón y un sistema de datos.

La parte central del equipo lo constituye la cámara principal de vacío en la que la

muestra es analizada. La realización del experimento en condiciones de vacío se

debe a:

Los fotoelectrones han de viajar desde la muestra hasta el detector sin

colisionar con ninguna partícula de fase gaseosa

Algunos componentes tales como la fuente de rayos X requieren

condiciones de vacío para mantener la operatividad.

La composición superficial de la muestra ha de permanecer invariable

durante el experimento.

Las muestras son introducidas en una primera cámara donde se procede a vaciar

la atmósfera existente y acercarse a un vacío de 10-6 torr. Alcanzar el ultra-alto

vacío es una operación lenta, cuya duración oscila entre varios minutos y horas.

La colocación de la muestra en el interior de la cámara se realiza mediante una

barra unida a un portamuestras. Dentro de la cámara principal, la muestra puede


ser orientada en distintas posiciones y se puede elegir la zona de la superficie a

trabajar, todo ello es controlado mediante una cámara de vídeo.

La fuente de rayos X más utilizadas son las que emplean ánodos de Al o Mg, otros

ánodos son Si, Zr, Ag, Ti, Cr. La radiación X es monocromatizada antes de llegar a

la muestra mediante el uso de un cristal de cuarzo. Esto permite aprovechar el

rango de energía en que la intensidad de la radiación X es máxima (normalmente

un ancho de 1–2 eV), evitar los picos satélites de fluorescencia de rayos X, e

impedir que electrones de alta energía provoquen golpes de calor a la muestra y la

degraden.

El área de muestra que puede ser irradiada por los rayos X varía entre zonas

circulares de unos pocos centímetros de diámetro hasta unas 50 micras. Esta

focalización depende de la geometría de la fuente y del tipo de cañón de

electrones utilizado para estimular la emisión de rayos X.

La utilización de un monocromador disminuye la intensidad de rayos X que

alcanzan a la muestra. Esta disminución en el flujo energético es compensada en

el sistema analizador, constituido por lentes eficaces de captación de radiación, un

analizador de energía y un sistema detector multicanal.

6.25.6 Aplicaciones de la espectroscopia fotoelectrónica de rayos X

Una de las aplicaciones fundamentales del XPS es el estudio de las superficies.

Este estudio permite detectar los elementos presentes en la superficie,

cuantificarlos y en casos particulares con los estudios adecuados se puede

obtener los estados de oxidación y entornos de coordinación de los elementos

presentes en esas superficies. Dentro del estudio de superficies, la caracterización

de los catalizadores es de gran importancia. Por ej., en la figura X se representan

los espectros XPS del Ni metal y del NiO.


Figura 77. Diagrama esquemático de un espectrómetro XPS.

Es muy importante en los procesos de hidrogenación de aceites insaturados para

obtener las grasas (p. ej. Margarinas) que se deposite níquel metal sobre el

soporte y que no se oxide a NiO que es inactivo. Se puede observar un

desplazamiento de las energías de ligadura que permite identificar la especie

superficial como Ni metal o como cationes Ni2+ en el óxido. Esta técnica permite

diagnosticar problemas puesto que el proceso de hidrogenación puede ir mal

porque no se esté impregnando el soporte correctamente con Ni.


Figura 78. XPS (nivel 2p) de Ni y NiO.

Se pueden estudiar muchos otros tipos de materiales, p. ej., electrónicos. La

miniaturización de los componentes electrónicos es cada vez mayor y actualmente

se crecen, en algunos casos, capas de dimensiones nanométricas que deben ser

caracterizadas convenientemente.


Figura 79. Perfil de composición atómica de un contacto Au/Cr/Si en función del tiempo de bombardeo de Ar+.

En la fabricación de componentes electrónicos hay que metalizar para mejorar los

contactos pero esto no siempre es posible. Metalizar con Au una superficie de Si

presenta problemas de interdifusión. Por ello se metaliza con capas Au/Cr sobre Si

que dan mejores prestaciones.

El perfil de composiciones que se obtiene por espectroscopia XPS de la muestra

bombardeada con Ar+ se da en la Figura 80. Con estos valores se puede estimar

los tamaños de las capas así como la posible difusión atómica en el proceso de

fabricación de los contactos. Sin embargo, traducir los tiempos de bombardeo a

profundidad de superficie es una tarea muy difícil porque cada muestra responde

de forma particular y se necesitan muchas experiencias para poder dar números

con fiabilidad. Pero una vez calibrada convenientemente, la técnica es poderosa.


Lección 26: Microscopia Electrónica de Barrido (SEM)

La microscopía ha sido una de las herramientas básicas para el establecimiento

de las bases de la biología. La microscopía óptica tiene limitaciones de resolución

debidas a aberraciones cromáticas y a la configuración de campo. La microscopía

electrónica ofrece la posibilidad de obtener mayor resolución que la óptica además

de disponer de herramientas complementarias derivadas de aspectos como la

posibilidad de obtener información ultramicroestructural o de obtener información

química mediante el análisis de Rayos X.

El fundamento de la técnica consiste en la posibilidad de extraer y acelerar

electrones mediante una fuente “termoiónica” o de “emisión de campo”. Se buscan

materiales metálicos con una baja función de trabajo.

El SEM (del inglés Scanning Electron Microscopy) se introdujo en 1965. Desde el

punto de vista biológico su principal ventaja es que permite obtener una imagen

tridimensional (hasta entonces los análisis ópticos se realizaban sobre secciones y

carecían por tanto de perspectiva). Además del incremento de profundidad de

campo se obtiene simultáneamente un notable aumento de la resolución Δ. Δ= 1

nm

Figura 80. Bacterias vistas por un SEM.


6.26.1 Antecedentes

Los primeros instrumentos desarrollados para este propósito, fueron microscopios

ópticos, porque con el ojo humano es imposible visualizar. Estos instrumentos

fueron desde una simple lupa, hasta un microscopio compuesto. Sin embargo, aún

en el mejor instrumento óptico, la resolución está limitada a la longitud de onda de

la luz que se utilice, que en este caso es la luz violeta, cuya longitud de onda es de

aproximadamente 400 nanómetros; por lo tanto, los detalles más pequeños que

pueden resolverse, deberán estar separados no menos de esta longitud. En

términos de amplificación, esto quiere decir que no podemos amplificar más de

1,000 veces.

Una salida inmediata a esta limitante de resolución, es utilizar alguna radiación de

longitud de onda más corta que la de la luz violeta. Los candidatos inmediatos son

los rayos X, que se caracterizan por una longitud de onda del orden de 0.15

nanómetros; desafortunadamente éstos tienen la gran desventaja de ser

absorbidos rápidamente por lentes de vidrio y de no poder ser desviados por

lentes magnéticas.

Otra posibilidad es aprovechar el comportamiento ondulatorio de los electrones

acelerados por alguna diferencia de potencial. Sea el caso, por ejemplo, de

electrones acelerados en un campo de 100,000 voltios que presentan

comportamiento ondulatorio con una longitud de onda de 0.0037 nm, lo que en

principio permitiría tener un aparato que resolviera detalles del mismo orden, lo

cual es más de lo que se necesita para resolver detalles atómicos, puesto que los

átomos en un sólido están separados en un orden de 0.2 nm. Sin embargo, en la

práctica, detalles inherentes a la técnica de observación, o defectos en el

maquinado de las piezas polares producen aberraciones.

6.26.2 Funcionamiento

En el microscopio electrónico de barrido es necesario acelerar los electrones en

un campo eléctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento

ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se

aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000 voltios. Los electrones

acelerados por un voltaje pequeño son utilizados para muestras muy sensibles,

como podrían ser las muestras biológicas sin preparación adicional, o muestras

muy aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metálicas, ya que éstas

en general no sufren daños como las biológicas, y de esta manera se aprovecha la

menor longitud de onda para tener una mejor resolución. Los electrones

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_%C3%B3ptico

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_%C3%B3ptico

http://es.wikipedia.org/wiki/Lupa

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto

http://es.wikipedia.org/wiki/Longitud_de_onda

http://es.wikipedia.org/wiki/Nan%C3%B3metro

http://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_X

http://es.wikipedia.org/wiki/Lente

http://es.wikipedia.org/wiki/Vidrio

http://es.wikipedia.org/wiki/Electrones

http://es.wikipedia.org/wiki/Diferencia_de_potencial

http://es.wikipedia.org/wiki/Voltio

http://es.wikipedia.org/wiki/Aberraci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa


acelerados salen del cañón, y son enfocados por la lente condensadora y objetiva,

cuya función es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en la

muestra un haz de electrones lo más pequeño posible (para así tener una mejor

resolución). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre

la muestra, punto por punto y línea por línea.

Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre

los electrones del mismo haz, y los átomos de la muestra; puede haber por

ejemplo, electrones rebotados como las bolas de billar. Por otra parte, la energía

que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra puede hacer que otros

electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X,

electrones Auger, etc. El más común de éstos es el que detecta electrones

secundarios, y es con el que se hacen la mayoría de las imágenes de

microscopios de barrido.

Podemos también adquirir la señal de Rayos X que se produce cuando se

desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un análisis

espectrográfico de la composición de la muestra.

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81tomo

http://es.wikipedia.org/wiki/Billar

http://es.wikipedia.org/wiki/Electr%C3%B3n_secundario

http://es.wikipedia.org/wiki/Electr%C3%B3n_auger

http://es.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia


Lección 27: Instrumentación y aplicaciones de la microscopía SEM

Un SEM consta de una columna que integra un sistema de producción de

electrones y una serie de lentes electromagnéticas (condensador, barrido y

objetivo) que conforman un haz de electrones focalizado incidente sobre la

muestra. Los electrones incidentes inducen “electrones secundarios” y “electrones

retrodispersados” en la muestra. La topografía y composición de la muestra

inducen un gradiente de emisión que es detectado por un sistema analizador

(Trampa de Faraday+placa fotográfica o cámara CCD).

Figura 81. Instrumentación de la Microscopía electrónica de barrido electrónico

La región activada tiene forma de pera y solo los electrones más superficiales

(secundarios) consiguen escapar de la muestra (la energía restante se disipa

mediante rayos X y un incremento de T). Los electrones retrodispersados son

mucho más energéticos y proceden de lugares más profundos de la muestra.

Salvo excepciones, no son atrapados por la trampa de Faraday (no forman la

imagen).


6.27.1 Formación de la imagen

La trampa de Faraday atrapa electrones en sincronía con el barrido. Los

electrones escapan de la superficie en función de la topografía (escape favorecido

en las cumbres y absorción en los valles) dando lugar al contraste.

La focalización del haz permite definir la resolución y la profundidad de campo. El

voltaje de aceleración de los electrones puede regularse para contrarrestar el

efecto del número atómico (Z) y optimizar la dimensión del volumen de excitación.

Las aplicaciones del microscopio electrónico de barrido son muy variadas, y van

desde la industria petroquímica o la metalurgia hasta la medicina forense. Sus

análisis proporcionan datos como textura, tamaño y forma de la muestra. Entre las

áreas de aplicación de esta técnica, se pueden mencionar:

6.27.2 Geología

Investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y petrológicas. Estudio

morfológico y estructural de las muestras.

6.27.3 Estudio de materiales

Caracterización microestructural de materiales. Identificación, análisis de fases

cristalinas y transiciones de fases en diversos materiales tales como metales,

cerámicos, materiales compuestos, semiconductores, polímeros y minerales.

Composición de superficies y tamaño de grano. Valoración del deterioro de


materiales, determinación del grado de cristalinidad y presencia de defectos.

Identificación del tipo de degradación: fatiga, corrosión, fragilización, etc.

6.27.4 Metalurgia

Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, características texturales.

Análisis de fractura (fractomecánica) en materiales (Ver Figura 83), un ejemplo

concreto de este tipo de aplicación se expone en la parte de trabajo práctico.

Figura 82. Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un Microscopio Electrónico de Barrido.

6.27.5 Odontología

En este campo son muchas las aplicaciones de las caracterizaciones morfológicas

que se pueden realizar con el microscopio electrónico de barrido.

Una aplicación específica de este microscopio se obtiene al estudiar la

direccionalidad de las varillas del esmalte dental. El esmalte dental posee varias

fases de formación, en las cuales se van depositando elementos minerales que

llegan al lugar por los vasos sanguíneos circundantes, produciéndose la

mineralización total en la última fase de su formación. En esta etapa se forman

cristales, que al depositarse toman una disposición en todo el tejido formado,

creando las varillas del esmalte, estructura principalmente inorgánica (98%),

adquiriendo una disposición muy particular de acuerdo al sector que se estudie de


la pieza dentaría. Estas varillas son observadas con un microscopio electrónico de

barrido, notando que estas se disponen en diferentes direcciones con un sólo

sentido desde él limite amelodentinario a la superficie, entrecruzándose en las

cúspides y en ciertos sectores de las caras libres y proximales, lo que se

denomina multidireccionalidad de las varillas. Para ello se extraen piezas

dentarías humanas (con indicación quirúrgica), las que son metalizadas con oro-

paladio y luego son estudiadas en el SEM. De este modo se puede observar la

disposición de las varillas, analizar los cambios de direcciones en el espesor del

esmalte y comparar la disposición en los distintos sectores del esmalte (oclusal,

1/3 medio y 1/3 cervical).

Además se pueden analizar a través del SEM las alteraciones que producen los

ácidos producidos por la entrada de microorganismos y restos alimenticios en las

superficies vestibulares de los dientes anteriores, ya que sobre ellos se produce la

retención de los materiales odontológicos en fracturas, fisuras, ferulizaciones, etc.

La entrada de los microorganismos se produce, ya que para la retención del

material de restauración, desde los comienzos de la odontología, se han realizado

tallados en forma de retención mecánica en las piezas dentarias, formándose

estos en la interfase restauración-diente.

6.27.6 Control de Calidad

En este campo, el microscopio electrónico de barrido es de gran utilidad para el

seguimiento morfológico de procesos y su aplicación en el control de calidad de

productos de uso y consumo.


Lección 28: Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM)

El TEM (Transmission Electron Microscopy) se introdujo en sucesivas etapas

durante los años 1930-1940. En esta configuración los electrones atraviesan la

muestra, que debe ser lo más delgada posible. Aunque la exposición electrónica

es en principio destructiva de la materia orgánica, los sistemas criogénicos

avanzados han permitido aprovechar las ventajas resolutivas del TEM en

estructuras biológicas. Δ= 0.05 nm.

El TEM es un instrumento que aprovecha los fenómenos físico-atómicos que se

producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona con

una muestra delgada convenientemente preparada. Cuando los electrones

colisionan con la muestra, en función de su grosor y del tipo de átomos que la

forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, es decir, hay una

gradación entre los electrones que la atraviesan directamente y los que son

totalmente desviados. Todos ellos son conducidos y modulados por unas lentes

para formar una imagen final sobre una CCD que puede tener miles de aumentos

con una definición inalcanzable para cualquier otro instrumento. La información

que se obtiene es una imagen con distintas intensidades de gris que se

corresponden al grado de dispersión de los electrones incidentes.

La imagen del TEM tal como se ha descrito ofrece información sobre la estructura

de la muestra, tanto si ésta es amorfa o cristalina.

Figura 83. Microscopio electrónico de transmisión


Además, si la muestra es cristalina, es decir, hay una estructura de planos

periódica, puede ocurrir que varias familias de esos planos cumplan la condición

de Bragg y difracten de forma coherente la onda electrónica incidente. Esto da

lugar a un diagrama de difracción, que es una imagen de distintos puntos

ordenados respecto a un punto central (electrones transmitidos no desviados) que

nos aportan información sobre la orientación y estructura del/los cristales

presentes.

Una muestra de la capacidad resolutiva viene dada por la capacidad de aumento

de la imagen.

Ecuación 2.26

La profundidad de campo es suficientemente grande como para que la muestra

atravesada por los electrones se proyecte en la pantalla fluorescente o incluso en

una cámara CCD inferior.

Figura 84. Esquema instrumental de un TEM. Cañón y lentes electromagnéticas de condensador, objetivo y proyector.


El microscopio TEM es un instrumento relativista. Los electrones son acelerados

en campos de hasta 500 kV. En esas condiciones el electrón se comporta

dualmente como onda y corpúsculo con una relación directa entre su momento y

su longitud de onda (DeBroglie).

Las limitaciones instrumentales hacen que en realidad la resolución experimental

esté limitada a 1 A aproximadamente.

El aspecto relevante de esta longitud de onda es que, como los Rayos X, permite

obtener información sobre la estructura de la materia, incluso a nivel atómico.

6.28.1 Instrumentación

6.28.1.1 Cañón electrónico

El tipo más usado de cañón electrónico consiste de un filamento de alambre de

tungsteno (10) doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina cilindro

de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de diámetro centrada en el

ápice del filamento. La superficie cóncava hace las funciones de ánodo, y

utilizando una superficie convexa la imagen de la fuente electrónica puede

reducirse en tamaño respecto al electrodo cóncavo. La intensidad total del haz de

cátodo a ánodo puede ser de 10 a 400 microamperios, pero solamente una

pequeña fracción die éste llega hasta la muestra.


6.28.1.2 Condensadores

Los dos condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad

ajustando el cañón electrónico. Esto reduce el área iluminada en la muestra. Sin

embargo, otras partes de la muestra también sufren los efectos del haz

electrónico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el

segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminación.

6.28.1.3 Plataforma para la colocación de la muestra

La plataforma para colocar la muestra está situada en frente del objetivo. Se

introduce la muestra en la columna del microscopio a través de una abertura.

6.28.1.4 Objetivo

El objetivo es la lente más importante en el microscopio electrónico. La distancia

focal de esta lente está comprendida entre 1 y 5 milímetros, siendo 1,1mm la más

frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolución. Debido a

que el haz de imagen tiene la máxima apertura angular en el primer objetivo, esta

lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberración

esférica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite introducir metal

para compensar la inhomogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada

resolución. Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la

cual limita la dispersión de los electrones, evitando así la degradación de la

imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40 micrómetros (pm) los

más frecuentes.

6.28.1.5 Lente intermedia

La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir

esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente.

6.28.1.6 Lente de proyección

La lente (de proyección corresponde al ocular del microscopio óptico. Su función

es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y permite una

amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliación de 100 X hasta 300.000

X usando lentes intermedias y de proyección.


6.28.1.7 Cámara de observación

La cámara de observación y la pantalla fluorescente están situadas en el fondo de

la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el enfoque fino se

consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El diámetro del punto de enfoque es

de 100 µm, por lo tanto la imagen debe ser mayor que este diámetro para ser

resuelta. La cámara de observación está protegida por un vidrio grueso de plomo

para evitar la emisión de rayos X.

6.28.1.8 Cámara fotográfica

La cámara fotográfica está situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla

fluorescente está sujetada por m lado, y al quitar el paso del haz electrónico la

imagen se centra sobre la película fotográfica. Se pueden usar varios tipos de

películas y placas de vidrio.

6.28.2 Modos de formación de la imagen

Existen diferentes modos de formación de la imagen en un microscopio de

transmisión: si la imagen se forma a partir del haz transmitido, que no ha sufrido

dispersión, entonces la imagen del objeto es oscura sobre un fondo brillante. Si,

por el contrario, se utilizan los electrones dispersados en este caso la imagen

aparece brillante sobre un fondo oscuro. Por ello estas dos técnicas se denominan

formación de imagen en campo claro y en campo oscuro respectivamente, la

primera es la más utilizada.

Figura 85. Formación de la imagen.


Por otra parte con este microscopio se puede obtener un diagrama de difracción

de la muestra, lo que nos aporta una valiosa información sobre la estructura

cristalina de la misma. Esto es posible si hacemos incidir el haz de electrones

sobre un cristal con un ángulo capaz de satisfacer la ley de Bragg para una

determinada distancia entre planos atómicos dhkl. Ya que la longitud de onda de

los electrones es muy pequeña ese ángulo también lo es por lo que el haz debe

incidir prácticamente paralelo a los planos reticulares. El diagrama de difracción

está formado por los puntos de corte de los haces difractados y transmitido con el

plano de la pantalla. Representa, por tanto, la sección de la red recíproca del

cristal en el plano normal al haz de electrones.

Figura 86. Proceso de formación del diagrama de difracción

La posibilidad de combinar la difracción de electrones con los distintos modos de

formación de la imagen hace del microscopio de transmisión una de la mejores

herramientas en el estudio de la red cristalina y sus defectos.

http://www.uned.es/cristamine/mineral/metodos/bragg.htm


Lección 29: Aplicaciones de la Microscopia Electrónica de Transmisión

Se utiliza fundamentalmente en dos campos: el de las Ciencias de Materiales en el

que analizan semiconductores, metales, aleaciones, aislantes, cerámicas, etc. y

en el campo de la Biología en el que se estudian bacterias, virus, macromoléculas,

tejidos, etc.

6.29.1 Aplicaciones del TEM en Biología

Se utiliza fundamentalmente en dos campos: el de las Ciencias de Materiales en el

que analizan semiconductores, metales, aleaciones, aislantes, cerámicas, etc. y

en el campo de la Biología en el que se estudian bacterias, virus, macromoléculas,

tejidos, etc.

En cuanto a su aplicación práctica, el microscopio electrónico de transmisión

representa una herramienta fundamental para el análisis estructural de las células

eucariotas, que son aquellas que contienen el material hereditario fundamental y la

información genética. Además, la adaptación de métodos de detección de

proteínas y de ácidos nucléicos a la microscopia electrónica permite la localización

simultánea de diversos componentes moleculares.

Este equipo, de gran utilidad en la investigación biomédica, utiliza un haz de

electrones para visualizar muestras biológicas que precisan una preparación

especial y cuenta con una cámara digital de alta resolución para la adquisición de

imágenes de gran calidad. Por este motivo, este microscopio electrónico de

transmisión se convierte en una herramienta imprescindible en muchos campos de

la biología y la medicina para el estudio de la ultraestructura de las células y

tejidos. Además de contribuir significativamente el estudio de la organización

estructural, molecular de las células y tejidos, la microscopia electrónica de

transmisión ha permitido avanzar en el análisis de bacterias y virus.

TEM es un importante instrumento de diagnóstico de enfermedades virales debido

a su rápido procesamiento. Uno de los principales beneficios es la identificación de

virus gastrointestinales como adenovirus, calicivirus, astrovirus y coronavirus, así

como de otros virus para los cuales no se tiene disponibilidad de pruebas

diagnósticas comerciales o aquellos que no son cultivables. Por esta razón, la

detección de virus entéricos mediante la TEM es esencial para realizar un

diagnóstico epidemiológico correcto de las infecciones gastrointestinales no


bacterianas. En el campo de las patologías humanas, estos estudios tienen gran

valor en el diagnóstico preciso de algunas enfermedades neuromusculares,

renales y pulmonares, y en la tipificación de determinados virus patógenos.

Otras aplicaciones de la microscopia electrónica de transmisión están

relacionadas con la biología animal y vegetal, el estudio de la conformación de

complejos macromoleculares y la investigación de nuevos materiales.

Un ejemplo de otra aplicación del TEM se puede observar en el siguiente gráfico:

En ellas se muestran estructuras globulares de proteína (B, C, D, E) del virus

herpes ORF6 y su autoorganización en filamentos helicoidales. (Soporte en la

replicación del ADN y formación de capside en el interior 300 nm de la célula

infectada).



1. Los análisis cuantitativos se realizan mediante estudio de la relación de

áreas encerradas bajo cada pico para los diferentes elementos. ¿Cuál es la

ecuación correcta para determinar el porcentaje del elemento presente?

( ) ( ) ∫ ( ) ( )

( ) ( ) ∫ ( ) ( )

( ) ( ) ∫ ( ) ( )

2. ¿Cuál de los siguientes componentes primarios NO hace parte de un

instrumento XPS?

a. Sistema de vacío,

b. La fuente de rayos X,

c. Analizador de energía del electrón

d. Monocromador

e. Sistema de datos.

3. La fuente de rayos X más utilizados en los instrumentos XPS son las que

emplean ánodos. ¿Cuál de éstos ánodos NO se emplean en dichos

instrumentos?

a. Al

b. Mg

c. Ag

d. Na

e. Zr

unidad 2 modulo espectroscopia 401539

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