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8/14/2019 Una mirada a los distintos tipos de familias. Un estudio de caso en la Universidad Simón Bolívar. María Teresa Torr…

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Identificación y caracterización parcial del gen de la enzimaprofenoloxidasa en Dactylopius coccus

Fernando García, Patricia Aguilar, Ana Beatriz Celma,Humberto Lanz, Ignacio del Río y Fidel Hernández

Introducción

En los insectos, el sistema de la profenoloxidasa es

un mecanismo regulador del sistema inmune cuya

activación depende de reacciones en cascada en

las que participan enzimas tipo serina proteasas,

las cuales son activadas por la presencia de compo-

nentes micóticos y bacterianos como los lipopoli-sacáridos (LPS) y β1-3 glucanos (Zymosan). La acti-

vación del sistema de la fenoloxidasa desencade-

na mecanismos de defensa de la integridad corporal

del insecto, incluyendo la síntesis de melanina, polí-

mero capaz de recubrir el cuerpo de organismos

invasores y de participar en el cierre de heridas,

entre otras funciones.

La melanización consiste en una serie de reaccio-

nes que se inician con la hidroxilación de tirosina

para formar L-hidroxifenilalanina (L-DOPA) la cual,

a su vez, se oxida y da lugar a diferentes compues-

tos llamados dopacromos, y éstos, por su parte,producen indolquinonas que se polimerizan y for-

man la melanina como producto final (Söderhall e

Iwanaga, 1996). La molécula clave en esta ruta es

la proFO, la cual es una enzima bifuncional que

posee actividad de oxidoreductasa y de mono-

oxigenasa y presenta, además, dos sitios de unión

al cobre. La proFO está asociada a tres procesos

fisiológicos diferentes pero interrelacionados: a)

endurecimiento de la exocutícula, proceso donde

se añaden a esta estructura las moléculas quitina y

Resumen

La profenoloxidasa (proFO) es la enzima clave de la ruta bioquímica de la fenoloxidasa, la cual

es responsable de activar varios mecanismos de defensa de los invertebrados, tanto para evitar

la entrada de microorganismos invasores, como para realizar la coagulación y cierre de heridas.

En este trabajo se obtuvo la secuencia parcial del gen de la proFO del insecto Dactylopius

coccus o grana fina del nopal, la cual presentó alto grado de homología con la enzima de

dípteros. Por otra parte, se observó que el RNA mensajero (RNAm) de la proFO se expresa en las

ninfas de primer y segundo estadio, así como en las hembras oviplenas del insecto.

melanina (Ashida y Brey, 1995); b) encapsulación y

melanización de microorganismos extraños, reac-

ciones que forman estructuras que inmovilizan

microorganismos invasores, y c) la producción de

quinonas citotóxicas, compuestos capaces de ma-

tar agentes infecciosos (Sugumaran y Nellaiappan,

1991).

El sistema inmune de la grana fina (Dactylopius

coccus Costa) –insecto parásito del nopal que se cul-

tiva para obtener ácido carmínico (colorante rojo

de uso comercial) (Llanderal y Nieto, 1999)– ha sido

poco estudiado. Las células originadas en el cuer-

po graso de esta especie son portadoras de gránu-

los de ácido carmínico (Maza, 1999), y cuando en-

tran en contacto con azúcares propios de la pared

celular bacteriana y de hongos –como el zymosan

y la laminarina, entre otros–, se produce degranu-

lación y ennegrecimiento del pigmento de los grá-

nulos, lo que sugiere una reacción similar a la

melanización, la cual podría depender de la rutade la fenoloxidasa. También se ha observado que

cuando a la hemolinfa (HL) de D. coccus se le agre-

gan zymosan o péptidoglicanos, se presenta cierto

consumo de carmín durante la reacción. Por otra

parte, en la HL tratada con feniltiourea (FTU), un

inhibidor específico de la proFO, se inhibe el con-

sumo de carmín y no ocurre obscurecimiento de la

HL, esto sugiere que el carmín podría ser meta-

bolizado por la proFO (García, Lanz, Rojas y

Hernández, 2002).

12 INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPL INARIA

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Objetivo

La finalidad de este trabajo es identificar y secuenciar el gen de la proFO de la grana fina Dactylopius coccus,

así como analizar su expresión en diferentes estadios del ciclo de vida de este insecto.

Metodología

Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compa-

ñías Sigma Chem (St. Louis Missouri), Invitrogen y PE Applied Biosystems. Los reactivos para electroforesis

provinieron de Gibco-BRL (Life Technologies).

Insectos. Se utilizaron insectos de la especie D. coccus cultivados en módulos de experimentación tipo cober-

tizo, ubicados en Coyotepec, Oaxaca, en terrenos de la compañía productora de grana Tlapanochestli.

Obtención de DNA genómico y amplificación de un fragmento de proFO. Para extraer el DNA de D. coccus

se utilizaron tres hembras adultas oviplenas. El tejido que se obtuvo fue homogenizado en un tubo demicrocentrífuga con 700 µl de DNAzol (Life Technologies, Rockville, Maryland) Las muestras fueron

centrifugadas a 4,000 x g durante 10 min a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante (fase viscosa) y se agregaron

0.5 vol de etanol absoluto para precipitar el DNA. Posteriormente, se centrifugaron a 4,000 x g durante 3 min

a 4 °C. La pastilla recuperada se lavó dos veces con etanol a 75% y se resuspendió en 100 µl de NaOH 8 mM

(Ausubel et al., 1989).

Un fragmento del gen de la proFO fue amplificado por PCR usando iniciadores degenerados (amplifican un

dominio fuertemente conservado de la proFO en dípteros) usados previamente en Anopheles gambiae (Müller,

Dimopoulos, Blass y Kafatos, 1999):

PO-CuA 2.5mM

(5'CAICA(TC)TGGCA(TC)TGGCA(TC)CTIGT(GATC)TA(TC)CC-3')

PO-CuB 2.5 mM

(5'-CITGCCAAICG(AG)TA(AG)AAIAA(ACT)CG)GG(AG)TCIC(TG)CAT3')

Las reacciones se obtuvieron mediante 25 ciclos de 2 min a 94 °C, 1.5 min a 50 °C y 1 min a 72 °C. Las

reacciones de PCR incluyeron 0.2 U de TaqPolimerasa, d´NTPs 10 mM, MgCl2 2.5 mM y se llevaron a cabo en

un termociclador PE-2400.

Los fragmentos de DNA obtenidos por PCR se analizaron a través de electroforesis en geles de agarosa (Gibco-

BRL) a 1.5%, en amortiguador Tris-acetato-EDTA (TAE 1X: tris-acetatos 40 mM, EDTA 1 mM pH 8.0), como

marcador de tamaño molecular se utilizó una escalera de moléculas de DNA en múltiplos de 100 pb.

Análisis de expresión por RT-PCR. La expresión del gen de la proFO en los diferentes estadios del ciclo de vida

de D. coccus fue examinado mediante transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR).

Para esta prueba, el RNA total de ninfas de primer estadio, ninfas de segundo estadio y hembras adultas fue

purificado usando TrizolMR (Life Technologies, Rockville, Maryland). Se utilizó un microgramo de RNA para

sintetizar cDNA, para la cual sirvió como iniciador oligo(dT17), también se usó la enzima SUPERSCRIPT IIMR

(purificada de E. coli recombinante que contenía el gen de la retrotranscriptasa del virus de leucemia murina).

La amplificación de la secuencia de la proFO se hizo con los oligos PO-CuA y POCuB con el cDNA de D. coccus,

como se mencionó anteriormente. Para controlar el experimento de RT-PCR se usó el gen de actina, conside-

rado de expresión constante. Para la amplificación de la actina se utilizaron los iniciadores:

13INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPL INARIA

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ActFOR 5´- ACATGGAAAATCTGTGCACCACA-3´ y

ActREV 5´- ACAGCTTTTCTTTGATGTCGCGAA -3´

que amplifican un fragmento de actina de Anopheles albimanus. La amplificación se realizó a través de 28 ciclosde 3 min a 94 °C, 1 min a 50 °C y 2 min a 72 °C (oligos amablemente donados por el D. en C. J. Martínez

Barnetche).

Secuenciación de los fragmentos de cDNA y DNA genómico amplificados. Los productos amplificados que

presentaron el tamaño esperado fueron purificados y clonados mediante el sistema TA CloningMR (Invitrogen),

de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los fragmentos de DNA de las clonas obtenidas se secuenciaron

con el método de amplificación por PCR en presencia de dideoxinucleótidos como terminadores de la reacción

(Big DyeMR Applied Biosystems). Como iniciadores de la reacción de secuenciación se usaron los oligonucleótidos

M13 (forward y reverse). Las reacciones fueron analizadas con el secuenciador automático ABI-PRISMMR (PE

Biosystems).

Análisis de secuencias. Las secuencias de DNA obtenidas se tradujeron en los marcos de lectura posibles por

medio del programa Sixframe, y las secuencias de DNA y productos de traducción deducidos se compararoncon las secuencias almacenadas en los bancos de datos GenBank Invertebrates y Swissprot mediante los pro-

gramas BlastX y BlastN. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las clonas (proFO 900 y proFO

680) de D. coccus se hizo utilizando el programa de alineamiento múltiple CLUSTALW (Múltiple Sequence

Alignment). Basados en las similitudes de secuencia entre las proFO, se construyeron árboles filogenéticos

utilizando el programa PHYLIP (Felsenstein, 1993). Estos programas y bases de datos se encuentran dispo-

nibles en los portales de internet del National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://

ncbi.nlm.nih.gov y San Diego Supercomputing Center (SDSC) http:// workbench.sdsc.edu.

Figura 1. Amplificación por PCR de la proFO de D.coccus a partir

de DNA genómico

El DNA genómico de D. coccus fue usado como molde para ampli-

ficar mediante PCR un fragmento de la proFO, para la cual se uti-

lizaron los oligos PO-CuA y PO-CuB del modo descrito en el apar-

tado de Metodología. Carril 1: escalera de moléculas de DNA en

múltiplos de 100 pb, utilizada como marcador de tamaño molecular.

Carril 2: amplificación en la cual se usó como molde DNA genómico

de D. coccus. Carril 3: reacción de control negativo de PCR, carente

de DNA molde. Las muestras fueron analizadas en un gel de agarosa

a 1.5% preparado en amortiguador TAE 1X.

Resultados

Amplificación y análisis de un fragmento de la proFO

de D. coccus. A partir del DNA genómico de D.

coccus, se amplificó un fragmento de aproxima-

damente 900 pb (proFO-900) de la enzima PROFO

(Figura 1). Por otra parte, utilizando el cDNA de

D. coccus como molde, se obtuvo un producto de

680 pb (proFO-680) (Figura 5). Los dos fragmentos

fueron secuenciados.

Ambas amplificaciones poseen un marco de lectu-

ra abierto (ORF) que puede codificar para un seg-

mento de proteína de 295 aminoácidos (Figura 2).

El amplificado proFO-900 mostró, además, una se-cuencia no codificante de 165 pb (Figura 4). Al com-

parar la proFO de D. coccus con las bases de datos

de invertebrados, se observó que posee una

homología de 23.6% con la proFO-A1 de Drosophila

melanogaster (Fujimoto et al., 1995); 21.1% con la

proFO-2 de Bombyx mori (Ashida et al., 1998); 35.3%

con la proFO-2 de hemocitos de larvas de Sarcophaga

bullata (Chase, Raina, Bruno y Sugumaran, 2000), y

18% con la proFO-8 de Anopheles gambiae (Müller

et al., 1999).


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La secuencia de la proFO de D. coccus mostró características típicas de las proFO descritas: los residuos del

aminoácido 393 al aminoácido 418, que forman uno de los sitios de unión al cobre, son similares, en especial

las posiciones para los residuos metionina-arginina-ác. aspártico y prolina, que están conservados en las cua-

tro especies de insectos descritas anteriormente (Figura 2) (Chase et al., 2000). Al generar el árbol filogenético

mediante el programa PHYLIP, la proFO de D. coccus fue agrupada próxima a la proFO de S. bullata en unarama independiente a las otras proFO (Figura 3).

Figura 2. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de proFO de diferentes insectos

Figura 3. Relaciones de parentesco entre las proFOs de diferentes insectos

La secuencia de aminoácidos deducida de las clonas proFO de D. coccus se alineó, mediante el programa CLUSTAL W, con las proFOs indicadas

de B. mori, An. gambiae, S. bullata y D. melanogaster. Los números señalados sobre los alineamientos corresponden a la numeración de

aminoácidos de la proFO de S. bullata tomada como referencia. = indica el sitio de unión al cobre; * = residuos idénticos; := grupos

fuertemente conservados; .= grupos débilmente conservados.. —— = “Gap” entre las secuencias.

Los alineamientos entre las proFOs de insectos fueron procesados mediante el paquete de programas PHYLIP para generar un árbol filogenético.


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Figura 4. Secuencia del producto proFO-900 de D. coccus

Figura 5. Expresión de la proFO en los diferentes estadios del ciclo de vida de D. coccus

Las letras subrayadas indican la presencia de un probable intrón; las letras en tono claro, codones que bloquean el marco de lectura.

El cDNA de ninfas I y II y hembras adultas oviplenas de D. coccus se usó como molde para amplificar a través de PCR un fragmento de la proFO,

para lo cual se utilizaron los oligos PO-CuA y PO-CuB del modo descrito en el apartado de Metodología. Como control de calidad del cDNA,

se amplificó el gen de actina. Las muestras fueron analizadas en un gel de agarosa a 1.5% preparado en amortiguador TAE 1X.

Análisis de expresión de la proFO de D. coccus. Para conocer la expresión del gen proFO-680 en diferentes

estadios del ciclo de vida de D. coccus, se preparó cDNA de ninfa I, ninfa Il y hembras adultas, y esto se ampli-

ficó por PCR. El fragmento amplificado fue del tamaño esperado (680 pb) en todos los casos, aunque con

diferente intensidad (Figura 5). Como control de calidad del cDNA, se usaron oligonucleótidos que amplifican

el gen de actina considerado de expresión constante (Figura 5).


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Discusión

En este trabajo se identificó, a través de la amplifica-

ción por PCR y secuencia del producto, la presencia

de un gen que codifica para la proFO de D. coccus.

El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida

de proFO-680 mostró identidad de 17-43% con las

proFOs descritas para B. mori, An. gambiae, S. bullata

y D. melanogaster. La secuencia de proFO-900, am-

plificada a partir de DNA genómico, mostró la mis-

ma identidad de los genes de proFO de las especies

de insectos mencionados anteriormente. Sin embar-

go, el tamaño de proFO fue mayor en comparación

con la secuencia obtenida a partir de cDNA, lo cual

indicó la existencia de un intrón, éste fue localiza-

do y, a la manera típica, presentó codones de paro

(Figura 4).

Las proFO descritas son moléculas con regiones con-

servadas evolutivamente. La proFO descrita en este

trabajo mostró características comunes de proFO,

incluyendo la presencia de residuos de aminoácidos

conservados en el sitio de unión al cobre, además

de otras dos posiciones conservadas hacia el extre-

mo C- terminal. Estos residuos se conservan princi-

palmente en las proFO de diversos dípteros (Chase

et al., 2002; Müller et al., 1999; Jiang et al., 1997;

Ashida et al., 1998 y Hall et al., 1995).

La proFO se expresó en los estadios analizados del

ciclo de vida de D. coccus, aunque mostró intensi-

dades diferentes en las fases de ninfa I y II respecto

al control de actina, lo que sugiere que la expresión

de este gen varía durante el ciclo de vida. Por otra

parte, dado que se sabe que las proFOs son una fa-

milia multigénica en todos los grupos de insectos

estudiados a la fecha, resulta difícil saber si la ex-

presión observada durante los diferentes estadios

correspondió a la de un solo gen o a la de varios.

Actualmente, trabajamos para obtener la secuencia

completa del gen de la proFO de D. coccus, con el finde estudiar sus funciones en el sistema inmune de

este insecto y, por otra parte, también investigamos

si esta enzima modifica al ácido carmínico.*

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* Agradecemos el apoyo brindado por la Coordinación de Investi-

gación de la Universidad Simón Bolívar, del Laboratorio de Ento-

mología Molecular del Cinvestav-IPN y de la Fundación Tlapano-

chestli para la elaboración de este trabajo.


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