uji endotoksin sediaan injeksi intravena natrium klorida

Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)

28

UJI ENDOTOKSIN SEDIAAN INJEKSI INTRAVENA NATRIUM KLORIDA DENGAN METODE GEL-CLOT

Insan Sunan Kurniawan Syah, Sohadi Warya, Yessy Christina

Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran

ABSTRAK

Endotoksin merupakan bagian kompleks lipopolisakarida membran bakteri Gram negatif yang dapat menyebabkan reaksi pirogenik. Uji Limulus Amebocyte Lysate (LAL) metode gel-clot telah banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan endotoksin dalam sediaan parenteral. Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan kadar endotoksin pada sediaan injeksi natrium klorida 0,9% yang dibuat dengan menggunakan karbon aktif sebagai penjerap endotoksin dan tanpa karbon aktif. LAL yang digunakan adalah Pyrotell Single Test Vial (STV) yang memiliki sensitivitas 0,25 EU/mL. Sebagai pembanding dilakukan pengujian terhadap standar kontrol endotoksin 0,5 EU/mL sebagai kontrol positif dan LAL Reagent Water (LRW) sebagai kontrol negatif. Dari pengujian sampel didapatkan hasil negatif tetapi dengan konsistensi gel yang berbeda. Hal ini membuktikan bahwa karbon aktif berpengaruh terhadap pembebasan endotoksin. Kata kunci : endotoksin, injeksi natrium klorida, metode gel-clot

ABSTRACT

Endotoxin is part of lipopolysaccharide complex from Gram negative bacteria membran that can cause pyrogenic reaction. The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) gel-clot method assay have been used for detection of endotoxin in parenteral preparation. This research was done to compare endotoxin content of preparations of sodium chloride injection 0,9% made by using activated carbon as endotoxin adsorbent and without activated carbon. LAL which used is Pyrotell Single Test Vial (STV) with sensitivity 0,25 EU/mL. As comparator, the examination to endotoxin control standar 0,5 EU/mL as positive control and LAL Reagent Water (LRW) as negative control was done. From examination samples, was got negative result but with different gel consistency. This showed that activated carbon have influence to Iiberation of endotoxin. Key words : endotoxin, sodium chloride injection, gel-clot method

Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009

29

PENDAHULUAN

Suplai larutan steril bertakaran besar

pada manusia secara intravena kadang–

kadang muncul reaksi demam tinggi, yang

disertai rasa menggigil, cemas, kesulitan

bernafas, lemahnya peredaran darah, nyeri

kepala, dan nyeri bagian tubuh. Pada

hipertermi ini mula–mula akan terjadi

leukopeni (pengurangan jumlah leukosit)

dan belakangan menjadi leukositosis

(Voigt, 1995).

Salah satu syarat dari sediaan injeksi

intravena ialah harus bebas pirogen (Ansel,

1989). Pirogen adalah senyawa molekular

tinggi, yang dinyatakan sebagai senyawa

lipopolisakarida, yang diproduksi kira–kira

5 – 10% dari masa total bakteri (Voigt,

1995). Pirogen dari satu sediaan dapat

dihilangkan dengan cara adsorpsi,

diantaranya dengan menggunakan karbon

aktif 0,1 – 0,3 % b/v. Namun demikian

karbon aktif tersebut selain mengadsorpsi

pirogen, juga mengadsorpsi zat–zat

terkandung dalam larutan itu sendiri

(ChemicaCom, 2006).

Untuk menjamin tidak adanya pirogen

dalam sediaan injeksi intravena volume

besar maka dilakukan uji pirogen. Uji

pirogen menggunakan kelinci dilakukan

dengan cara menginjeksikan larutan

sediaan steril secara intravena, kemudian

diukur peningkatan suhu tubuh kelinci

melalui rektal (Departemen Kesehatan RI,

1995).

Metode yang lebih baik adalah uji in

vitro yang telah memiliki tingkat

sensitivitas lebih tinggi dari pada uji

pirogen kelinci yaitu uji LAL (Limulus

Amoebocyte Lysate). Uji ini menggunakan

ekstrak cair dari Limulus polyphemus

(kepiting ekor tapal kuda) untuk

mendeteksi tingkat endotoksin bakterial

dalam sampel. Tiga jenis metode uji

endotoksin (metode bekuan gel, metode

turbidimetri, metode kromogenik) telah

dijelaskan dalam British Pharmacopoeia

untuk evaluasi akhir konsentrasi

endotoksin dalam suatu produk steril

(Department of Health, 1980).

Metode yang digunakan dalam

penelitian ini adalah metode bekuan gel

(Gel-Clot Method). Metode bekuan gel

melibatkan penggunaan pembekuan

protein yang dipotong pada suatu enzim

pembekuan aktif, dimana bagian tidak larut

produk membentuk gel. Walaupun reaksi

keseluruhan belum ditemukan, dapat

dimengerti bahwa reaksi pembentukan

bekuan diaktivasi oleh enzim tertentu

(Joiner, et al., 2002).

Penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui keberadaan endotoksin yang

masih tersisa dalam sediaan injeksi

intravena natrium klorida setelah

dibebaskan dengan karbon aktif,

menggunakan metode gel-clot.


30

METODE PENELITIAN

Alat-alat yang digunakan dalam uji

endotoksin ini antara lain botol infus, alat

gelas yang lazim, inkubator (Memmert),

Laminar Air Flow (LAF) cabinet

(Minihelic®II Zero 0), mikropipet

(Finnpipette Campus S69054), otoklaf

(MC 03000011), oven (Heraeus RT360),

pencampur vortex (VM 300), syringe steril

(York), dan timbangan analitik digital

(Mettler Toledo).

Bahan-bahan yang digunakan dalam uji

endotoksin ini antara lain alkohol 70%

(Nurfarindo), aqua pro injectionum

bidestilata bebas pirogen (PT.

Ikapharmindo Putramas), indikator pH

universal (Merck), karbon aktif

(Shirasagi), natrium klorida (Merck), LAL

Reagent Water (Associates of Cape Cod

Incorporated), Pyrotell® Limulus

Amebocyte Lysate (Associates of Cape

Cod Incorporated), Pyrosol®

Reconstitution Buffer (Associates of Cape

Cod Incorporated), dan Standar Kontrol

Endotoksin (Associates of Cape Cod

Incorporated).

Tahapan kerjanya adalah sebagai berikut :

1. Penyiapan Alat dan Bahan

Seluruh alat yang digunakan dibungkus

menggunakan kertas perkamen kemudian

disterilisasi menggunakan otoklaf pada

suhu 121ºC selama 15 menit. Setelah itu,

alat kualitatif yang telah disterilisasi

dimasukan ke dalam oven dengan suhu

250ºC selama 30 menit atau 200ºC selama

1 jam.

2. Formulasi

Sediaan yang akan diuji pada

penelitian ini adalah injeksi natrium

klorida 0,9%. Injeksi natrium klorida

dibuat sendiri di laboratorium dengan

menggunakan formula berdasarkan

Formularium Nasional edisi II tahun 1978

dimana tiap 100 mL injeksi mengandung

natrium klorida sebanyak 0,9 gram.

3. Pembuatan Injeksi Natrium Klorida

Injeksi natrium klorida yang dibuat 2

sediaan, yaitu dengan menggunakan

karbon aktif dan tanpa karbon aktif.

Volume yang dibuat untuk masing-masing

sediaan adalah 120 mL.

a. Pembuatan sediaan injeksi intravena

NaCl 0,9% tanpa karbon aktif.

Natrium klorida ditimbang sebanyak

1,08 gram kemudian dilarutkan dalam

sebagian aqua pro injectionum.

Larutan ditambahkan aqua pro

injectionum hingga mendekati volume

akhir lalu cek pH larutan. Larutan

ditambahkan aqua pro injectionum

hingga 120 mL dan disaring

menggunakan kertas saring, filtrat

pertama dibuang. Larutan injeksi yang

telah dibuat dimasukkan dalam botol

infus sebanyak 102 mL, kemudian

tutup dan disterilisasi dalam otoklaf

1210C selama 15 menit.

b. Pembuatan sediaan injeksi intravena

NaCl 0,9% dengan karbon aktif 0,1%.


31

Ditimbang natrium klorida sebanyak

1,134 gram dan karbon aktif sebanyak

0,12 gram. Natrium klorida dilarutkan

dalam sebagian aqua pro injectionum

kemudian ditambah aqua pro

injectionum hingga mendekati volume

akhir dan pH larutan dicek. Larutan

ditambahkan aqua pro injectionum

hingga 120 mL dan ditambahkan

karbon aktif kemudian dipanaskan

sampai suhu 600 – 700C sambil diaduk

selama 15 menit. Larutan disaring

panas-panas menggunakan kertas

saring, filtrat pertama dibuang. Filtrat

yang telah disaring ditampung dalam

botol infus sebanyak 102 mL,

kemudian tutup dan disterilisasi dalam

otoklaf 1210C selama 15 menit.

4. Penyiapan Endotoksin dan LAL

a. Penyiapan Endotoksin

Standar kontrol endotoksin yang

tersedia adalah 2500 EU/vial.

Sebanyak 10 mL LAL Reagent Water

dimasukkan ke dalam vial endotoksin

sehingga diperoleh endotoksin 250

EU/mL. Kemudian dilakukan

pengenceran endotoksin sebagai

berikut :

1. Endotoksin 25 EU/mL

Sebanyak 1 mL endotoksin 250

EU/mL ditambah dengan 9 mL

LAL Reagent Water (LRW).

2. Endotoksin 2,5 EU/mL

Sebanyak 1 mL endotoksin 25

EU/mL ditambah dengan 9 mL LRW.

3. Endotoksin 0,5 EU/mL

Sebanyak 1 mL endotoksin 2,5

EU/mL ditambah dengan 4 mL LRW.

b. Penyiapan LAL

Pereaksi LAL yang digunakan dalam

penelitian ini adalah Pyrotell® LAL

Single Test Vial yang hanya dapat

digunakan untuk sekali pakai.

Sensitivitas dari LAL ini adalah

sebesar 0,25 EU/mL. Vial yang berisi

LAL dapat langsung digunakan untuk

menguji endotoksin dalam sediaan

injeksi natrium klorida yang telah

dibuat.

5. Prosedur Metode Gel-Clot

a. Kontrol positif

Penelitian dilakukan di dalam Laminar

Air Flow (LAF). Pyrosol®

Reconstitution Buffer dimasukkan ke

dalam larutan endotoksin 0,5 EU/mL

sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh

pH dengan rentang 6-8 . Kemudian

larutan endotoksin yang telah ditambah

buffer diambil sebanyak 0,2 mL

menggunakan mikropipet dan

dimasukkan ke dalam Pyrotell® LAL

Single Test Vial (STV). Campuran

dalam vial dikocok menggunakan

pencampur vortex selama 1-2 detik,

kemudian vial dimasukkan ke dalam

inkubator dan diinkubasi pada suhu

37±1oC selama 60±2 menit.


32

b. Kontrol Negatif

Pyrosol® Reconstitution Buffer

dimasukkan ke dalam LAL Reagent

Water (LRW) sebanyak 2-3 tetes

sampai diperoleh pH dengan rentang 6-

8 . Kemudian LRW yang telah diberi

buffer diambil sebanyak 0,2 mL

menggunakan mikropipet dan


Single Test Vial. Campuran dalam vial

dikocok menggunakan pencampur

vortex selama 1-2 detik, kemudian vial

dimasukkan ke dalam inkubator dan

diinkubasi pada suhu 37±1oC selama

60±2 menit.

c. Pengujian Sediaan Injeksi Intravena

Natrium Klorida 0,9%

Pyrosol® Reconstitution Buffer

dimasukkan ke dalam sediaan injeksi

natrium klorida sebanyak 2-3 tetes

sampai diperoleh pH dengan rentang 6-

8 . Kemudian larutan uji yang telah

ditambah buffer diambil sebanyak 0,2

mL menggunakan mikropipet dan


Single Test Vial. Campuran dalam vial

dikocok menggunakan pencampur

vortex selama 1-2 detik kemudian vial

dimasukkan ke dalam inkubator dan

diinkubasi pada suhu 37±1oC selama

60±2 menit. Prosedur ini dilakukan

untuk kedua sediaan, yaitu injeksi

natrium klorida dengan karbon aktif

dan tanpa karbon aktif.

6. Penafsiran Hasil

Setelah proses inkubasi selesai, STV

dikeluarkan dari dalam inkubator.

Kemudian diamati apakah di dasar STV

tersebut terbentuk gel atau tidak. STV

dibalik 180o secara perlahan dan dilihat

apakah gel yang terbentuk di dasar STV

jatuh atau tidak.

HASIL PEMBAHASAN

1. Pengujian Endotoksin Kontrol

Positif

Dari pengujian standar kontrol

endotoksin 0,5 EU/mL dengan

menggunakan LAL Pyrotell Single Test

Vial (STV) didapatkan hasil gel yang

kompak. Gel yang terbentuk tidak tumpah

ketika STV diputar sampai terbalik 180o.

Hasil diperlihatkan pada gambar di bawah

ini :

Gambar 1. Hasil Pengujian Endotoksin

Kontrol Positif

Seperti yang tertera pada USP, standar

kontrol endotoksin yang digunakan untuk

kontrol positif adalah dua kali sensitivitas

LAL yang digunakan (2λ). Sensitivitas ini

merupakan batas konsentrasi endotoksin


33

yang dapat terdeteksi oleh LAL Pyrotell

STV . Menurut Guidance for Industry

yang dikeluarkan oleh US Department of

Health and Human Services, Food and

Drug Administration (FDA), salah satu

persyaratan sediaan injeksi volume besar

memiliki batas toleransi endotoksin

sebesar 0,25 EU/mL. Reaksi positif terjadi

karena bakteri Gram negatif (endotoksin

dari Escherichia coli) mengkatalisis

aktivitas proenzim dalam pereaksi LAL

Pyrotell STV. Enzim yang diaktivasi

(koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik

pada protein penggumpal (koagulogen)

yang terdapat dalam pereaksi LAL menjadi

bagian yang larut dan tidak larut

(koagulin). Bagian tidak larut ini yang

membentuk gel. Pada saat vial dibalikkan

tidak boleh ada guncangan karena gel yang

terbentuk sangat sensitif dan mudah rusak

sehingga hasil yang seharusnya positif

menjadi negatif. Hasil yang positif

menunjukkan bahwa kadar endotoksin

yang digunakan lebih besar dari

sensitivitas LAL.

2. Pengujian Endotoksin Kontrol

Negatif

Dari pengujian LAL Reagent Water

(LRW) bebas endotoksin dengan

menggunakan STV didapatkan hasil yaitu

tidak terbentuknya gel. Larutan langsung

tumpah ketika STV diputar sampai terbalik

180o. Hasil diperlihatkan pada gambar di

bawah ini :


Kontrol Negatif

Hasil yang negatif disebabkan karena

tidak adanya endotoksin dalam LRW. Hal

tersebut menunjukkan bahwa LRW yang

digunakan memenuhi persyaratan untuk

digunakan dalam pengujian LAL.

Hasil kontrol positif dan kontrol

negatif digunakan sebagai pembanding

hasil pengujian endotoksin terhadap injeksi

natrium klorida yang dibuat tanpa karbon

aktif dan dengan karbon aktif.

3. Pengujian Endotoksin Injeksi

Natrium Klorida 0,9% Tanpa Karbon

Aktif

Dari hasil pengujian sampel dengan

menggunakan STV didapatkan gel yang

tidak sempurna. Gel yang terbentuk

tumpah secara perlahan ketika STV diputar

sampai terbalik 180o.


34


Injeksi Natrium

Klorida 0,9% Tanpa Karbon Aktif

Dari gambar 3. dapat dilihat hasil yang

negatif tetapi terbentuk gel yang tidak

sempurna. Gel yang terbentuk jatuh secara

perlahan ketika vial dibalikkan. Hasil

tersebut menunjukkan bahwa di dalam

larutan uji terdapat endotoksin yang

mengaktivasi enzim membentuk gel, tetapi

kadar endotoksin dalam larutan uji berada

di bawah sensitivitas pirotel. Hasil yang

negatif menunjukkan bahwa kadar

endotoksin dalam larutan uji kurang dari

sensitivitas STV (0,25 EU/mL).

4. Pengujian Endotoksin Injeksi

Natrium Klorida 0,9% dengan

Karbon Aktif

Dari pengujian sampel dengan

menggunakan STV didapatkan hasil yaitu

tidak terbentuknya gel. Larutan langsung

tumpah ketika STV diputar sampai terbalik

180o. Hasil ditunjukkan pada gambar di

bawah ini :


Injeksi Natrium Klorida 0,9% dengan

Karbon Aktif

Dari gambar 4. dapat dilihat hasil yang

negatif, ditandai dengan tidak terbentuknya

gel. Hasil pengujian jatuh secara langsung

ketika vial dibalikkan. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa kadar endotoksin

dalam larutan uji kurang dari sensitivitas

STV.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Dari hasil penelitian dapat disimpulkan

bahwa :

1. Pengujian endotoksin kontrol positif

dengan penambahan standar kontrol

endotoksin 0,5 EU/mL pada STV

membentuk gel yang kompak. Hasil

menunjukkan bahwa standar kontrol

endotoksin memenuhi persyaratan.

2. Pengujian endotoksin kontrol negatif

dengan penambahan LAL Reagent

Water (LRW) pada STV tidak

membentuk gel. Hasil menunjukkan

bahwa dalam LRW tidak mengandung

endotoksin.


35

3. Pengujian endotoksin pada injeksi

natrium klorida tanpa karbon aktif,

menghasilkan pembentukan gel yang

tidak kompak. Hal ini menunjukkan

masih terdapat endotoksin dengan

konsentrasi yang lebih kecil daripada

sensitivitas STV.

4. Pengujian endotoksin pada injeksi

natrium klorida dengan karbon aktif,

tidak menghasilkan pembentukan gel.

Hal ini menunjukkan bahwa dalam

larutan uji tidak terdapat endotoksin

dan membuktikan efek karbon aktif

terhadap pembebasan endotoksin

dalam sediaan yang dibuat.

Saran

Pada penelitian selanjutnya disarankan :

1. Penggunaan metode lain yang lebih

baik dalam pembebasan endotoksin.

2. Penggunaan cara pengujian lain dalam

mendeteksi endotoksin, seperti uji

Neutrophil Chemiluminescence.

DAFTAR PUSTAKA

Akers, M. J. 1994. Parenteral Quality Control. 2nd Edition. New York : Marcel Dekker, Inc. p. 101-147

Ansel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Penerjemah : Farida Ibrahim. Edisi ke-4. Jakarta : UI Press. hal. 399-400

ChemicaCom. 2006. Carbon Based Adsorbent. http:// www.chemica.com/ consultationsery.html. diakses tanggal 30 November 2006

Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi ke-4. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. hal. 300-301, 908-909

Department of Health. 1980. British Pharmacopeia. Volume II. London : Pharmaceutical

Press. p. A222 – A227

Joiner, T. J., Paul F. K., Thomas C. K., Ph.D. 2002. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. International Journal of Pharmaceutical Compounding. Volume 6. p. 408-409

Lukas, S. 2006. Formulasi Steril. C.V. Yogyakarta : Andi Offset. hal. 11-14, 81-98

Society’s Department of Pharmaceutical Sciences. 1994. The Pharmaceutical Codex : Principles and Practice of Pharmaceutics. 12th Edition. London : Pharmaceutical Press. p. 92-94

Suwandi, U., Drs. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyte

Lysate.http://www.kalbefarma.com/files/cdk/files/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.pdf/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.html. diakses tanggal 12 April 2007

United States Pharmacopeial Convention. 2005. The United States Pharmacopeia 28 : The

National Formulary 23. Volume III. Twinbrook Parkway : United States Pharmacopeial Convention, Inc. p. 2201


36

Voigt, R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Edisi ke-5. Penerjemah : Soendani NS dan Mathilda BW. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press. hal. 462 – 463

uji endotoksin sediaan injeksi intravena natrium klorida

Documents