Über den zusammenhang zwischen positiv inotroper wirkung von digitoxigenin, kaliumflux und...

Naunyn-Sehmiedeberg's Arch. exp. Path. u. Pharmak. 242, 480--496 (1962)

Aus dem Pharmakologischen Institut der Universit~t Mainz (Direktor: Prof. Dr. G. KUSCHINSKY)

~ber den Zusammenhang zwischen positiv inotroper Wirkung yon Digitoxigenin, Kaliumflux

und intracelluHiren Ionenkonzentrationen im Herzmuskel* * *

Von W. KLAUS~ G. KUSCHINSKY und H. Lt]LLMANN

Mit 6 Textabbildungen

(Eingegangen am 17. November 1961)

0bwohl sehr zahlreiehe Untersuehungen fiber den Wirkungsmechanis- mus der Herzglykoside durchgeffihrt worden sind, ist die eigentliche Ursache ffir das Zustandekommen eines positiv inotropen Effektes bei Anwendung dieser Substanzen immer noch unbekannt (siehe z.B. MORAN U. COTTEN 1960). Neben einem Angriifspunkt an den contractilen Proteinen oder im Zellstoffwechsel ist in neuerer Zeit immer wieder eine Beeinflussung des Ionenhaushaltes der Herzmuskelzellen erSrtert worden (HARRISO~ 1939; HAJDU U. LEONARD 1959; CERL~TTI 1960). Diese Vorstellung stfitzt sich auf Befunde, die an vielen Gewebearten erhoben werden konnten: die Iterzglykoside hemmen in einem bestimmten Konzentrationsbereich den aktiven Ionentransport durch die Zellmembran und ffihren damit zu einer Verminderung der Gradienten, also zu einer Abnahme der intracellul~ren Kalium- und zu einer Zunahme der intracellul~ren Natrium- konzentration.

Die Frage, warum eine derartige Veri~nderung der intracellul£ren Ionenzusammensetzung zu einer Besserung der Kontraktionsf~higkeit der Herzmuskelzellen ffihren soll, beantworten HAJDU U. SZENT-GY6RGY (1952) und HAJDU (1953) auf Grund yon Untersuchungen fiber das Treppenphi~nomen am Frosehherzen mit dem Hinweis auf eine Verst~r- kung der Actomyosinkontraktion in einem entspreehend ver~nderten Ionenmilieu, vor allem bei einem gegeniiber dem normalen Zustand redu- zierten Kaliumgehalt der Zellen. Die l~bertragbarkeit dieser Versuche und Vorstellungen auf die lebende Herzmuskelzelle des Warmblfiters erseheint jedoeh zweifelhaft (LOLT,MA~ 1961). Aul3erdem ist zu fragen, ob allein eine Verminderung der Ionengradienten, ein Vorgang also, der energetisch

* Durchgefiihrt mit Unterstfitzung durch das Ministerium fiir Atomkernenergie und Wasserwirtschaft.

** Auszugsweise vorgetragen auf dem First International Pharmacological Meeting, Stockholm 22.--25. August 1961.

Digitoxigenin, Kaliumflux u. intracelI. Ionenkonzentration im Herzmuskel 481

freiwil l ig ver l~uf t und desha lb bei Zel lseh~digungen verschiedener A r t u n d ebenso be im A b s t e r b e n der Zel len auf t r i t t , e igent l ich Bed ingungen schaffen kann , die einen pos i t iv i no t ropen Ef fek t zur Fo lge haben. Aus der k l in ischen und t i e rexper imente l l en Medizin is t ein solehes Verha l ten des Herzmuske l s jedenfal ls n ieh t bekann t .

Weiterhin ist zu erw~hnen, dalt die unter sehr versehiedenen Bedingungen er- hobenen Befunde fiber den Einflufl der Herzglykoside auf den cellul~ren Kalium- und Natriumgehalt im Herzmuskelgewebe nicht einheitlich sind: ein Tell der Autoren findet eine Verminderung der Gradienten (Wood u. MoE 1940, 1942; ORaBONa U. MANOa~ELLI 1954; HELLEMS et al. 1955; SCHREIBER 1956; RaYNER U. WEaTHERaLL 1957; VICE u. K~r~ 1957; REGAN et al. 1959; HOLLAND 1960), w~hrend andere keine J~nderungen der Ionenkonzentrationen naehweisen konnten (CALtIOUN U. HARRISON 1931; HAGEN 1939; WEDD 1939; BOYER U. POINDEXTER 1946; REITER 1956). Zur genaueren Analyse yon even~uell auftretenden Ionenversehiebungen wurden aueh vereinzelt Fluxmessungen mit radioaktiven Ionen vorgenommen, die aber ebenfalls nicht zu fibereinstimmenden Resultaten fiihrten (JacoEs u. BRENZ 1957 ; RaYNER U. WEATHERALL 1957 ; KLEIN U. EVANS 1961 ; SCHREIBER et al. 1961).

Diese Untersehiede in den Versuehsergebnissen sind sicher zum Tefl auf die sehr differenten experimentellen Bedingungen zurfickzuffihren, wie Art und Konzen- tration der Herzglykoside bzw. Aglucone, Speeiesempfindliehkeit, Art des Herz- pr~,parates, Dauer der Einwirkung und anderes. Gerade die Einwirkungszeit seheint ffir die vorliegende FragesteUung yon groBer Bedeutung zu sein, wie LEE et al. (1961) bei der Untersuehung der Strophanthinwirkung am Katzenpapillar- muskel zeigen konnten: bei konstanter Strophanthinkonzentration trat zun~ehst nur ein positiv inotroper EiTek~ ohne Beeinflussung des Ionengehaltes auf, sparer folgte eine leichte Ver~nderung der Ionenkonzentrationen, und naeh l~ngerer Eim wirkung bildete sieh schlieBlieh eine Kontraktur mit starken Ionenverschiebungen aus. Bei Verwendung kumulierender Substanzen wird demnach das Ergebnis einer Untersuehung weitgehend yore Zeitpunkb des Messens abh~ngig sein. Da dies ffir die Durehffihrung und Bewertung der Experimente eine zus~i~zliche Komplikation dar- stellt, ffihrten wir unsere Versuehe mit einem Aglucon (Digitoxigenin) durch.

W e n n auch die zahlre iehen Unte r suehungen an verschiedenen Ge- weben ohne Zweifel gezeigt haben, da~ die Herzg lykos ide in geeigneten K o n z e n t r a t i o n e n den ak t i ven I o n e n t r a n s p o r t zu hemmen vermSgen (siehe WILBRAI~DT u. ROSEI~BERG 1961), SO is t die F r a g e noeh vSllig often, ob diese W i r k u n g i rgeudwie m i t dem pos i t iv ino t ropen Effekt der Herz- g lykos ide verknf ipf t i s t oder gar seine Ursache dars te l l t . I n der vorl iegen- den A r b e i t i s t deshalb un te r such t worden, bei weleher Dig i toxigeninkon- zen t r a t ion der pos i t iv ino t rope Ef fek t au f t r i t t und ob gleichzeit ig dami~ Anderungen im I o n e n h a u s h a l t des Herzmuske l s s t a t t f inden oder ob ffir diese W i r k u n g andere K o n z e n t r a t i o n e n erforder l ich sind.

Durch die Messung der K o n t r a k t i o n s a m p l i t u d e , des Ka l i um- In f lux und -Eff lux und des in t race l lu l~ren Ka l ium- , Na t r ium- , Calcium- und Chlor idgehal tes yon Herzmuske lgewebe un te r dem Einflul3 verschiedener D ig i tox igen inkonzen t r a t ionen sollte en tsehieden werden, ob ein unmi t t e l - ba re r Z u s a m m e n h a n g zwischen pos i t iv ino t roper W i r k u n g und der Beein- flussung der I onenkonzen t r a t i onen bes teh t oder nicht .

482 W. KLAUS, G. Kvscm~sxr und H. L~LL~NI~ :

Methodik Die Versuche wurden an isolierten MeersehweincheuvorhSfen durchgefiihr~. Die

400--600 g schweren Tiere warden dureh Genickschlag getStet, das Herz schnell aus dem Thorax entfernt und in TyrodelSsung, die mit 95o/0 02 und 50/0 C02 durch- perlt wurde, verbracht. Die VorhSfe wurden an der Vorhofkammergrenze abgetrenn~, yon Gef~resten und Bindegewebe befreit und in die VersuchsapparaSur iibertragen. Vom TSten der Tiere bis zu diesem Schritt vergingen 6--7 mill. In einem Tell der Versuche wurde statt der ganzen VorhSfe nur das linke Herzohr benutzt. Die isolierten Organpr~parate wurden mit Reehteckimpulsen (2,5 msee, 4 mA) konstant gereizt (140--160/rain). Die Badtemperatur betrug bei allen Versuchen 30--32°C.

Die TyrodelSsung hatte folgende Zusammensetzung: 8,0 NaC1, 0,2 KC1, 0,2 CaC12, 0,1 MgC12, 1,0NattCOa, 0,05 NaHPO v Glucose 1,0, Aqua dest. ad 1000,0. Zur Messung der K-Fluxe wurde eine ,,aktive TyrodelSsung" bereitet, in der ein Teil des inaktiven KC1 durch 42KC1 ersetzt worden war. 4~K wurde als Carbonat aus Harwell bezogen und dutch Umsetzen rait 2n HC1 in Kaliumehlorid fiberfiihrt. Ffir die Effluxmessung lag die Aktivit~t der TyrodelSsung um 0,5 mC/1, fiir die Influx- messungen um 0,1 mC/l.

Digitoxigenin 1 wurde entweder durch tagelanges Erw~rmen direkt in Aqua dest. gelSst oder mit Hiffe einer geringeren Alkoholmenge in LSsung gebracht. Die Digitoxigenin-Konzentration in diesen StammlSsungen betrug 10 -5 g/ml, die Alko- holkonzentration fiberschritt nie 0,30/0. Diese AusgangslSsungen wurden in ent- sprechender Menge bei der Herstellung der Versuchs-TyrodelSsungen verwendet. Wirkungsunterschiede zwischen den verschieden bereiteten DigitoxigeninlSsungen bestanden nicht.

Chemische Bestimmungen Der K- und ~a-Gehalt wurde flammenphotometrisch im feueht veraschten Vor-

hofgewebe nach dem friiher verSffentliehten Vorgehen bestimmt (KLAvS, L~LLMANI~ U. MUSCJZOL~ 1960a).

Zur Messung des Calciumgehaltes benutzten wir eine komplexometrische Titra- tion in Anlehnung an LANGE~DOI~F (1958) und MORI (1959). Die VorhSfe wurden ffir diese Bestimmung im Muffelofen bei 500°C verascht, I)er zuriiekb|eibende anor- ganische Rest wurde in einigen Tropfen 0,1 n HC1 gelSst, mit Aqua bidest, auf 3,8 ml aufgefiillt und 0,2 ml Indicatorl5sung hinzugeffigt. Als Indicator diente ein 1 : 1- Gemisch yon Calceiu 0,02°/0 in 0,25n Na0H und Thymolphthalein 0,01°/o in 800/0 igem Alkohol. Auschliel~end wurde die Probe mit 1,0 ml 3 m Na0H alkalisch gemacht. Die Titration erfolgte mit einer 0,0005 m L5sung des Dinatriumsalzes der Athylen- diamintetraessigsiiure (Titriplex III, Merck). Wegen der geringen Ca-Konzentration war bei der Titration kein Farbumschlag mehr zu erkennen. Da jedoch in diesem Konzentrationsbereich der Calcium-Calcein-Komplex noch deutlich starker fluores- ziert als der Indicator allein, wurde im UV-Licht gegen eine fibertitrierte VergleiehslSsung titriert. Der Umschlag in die schwache Restfluorescenz des Indi- cators war dann noch mit ausreichender Genauigkeit zu erfassen.

Der Chloridgehalt der Vorh5fe wurde mereurimetrisch nach den Angaben yon KVscn~sKY u. LA~GECKER (1947) bestimmt: das getrocknete Gewebe wurde nach dem Pulverisieren mit dem 50fachen seines Gewichtes mit Aqua dest. versetzt und 3 Tage lung unter gelegentlichem Schiitteln extrahiert. Die fiberstehende LSsung wurde nach SoMooy enteiweii~t und anschlieflend das Chlorid im Filtrat mit Hg(N03) ~ bei Anwesenheit des Indicators Diphenylcarbazon titriert.

1 Wir danken der Fa. C. F. Boehringer & Soehne, Mannheim, f'dr die ~ber- lassung der Substanz.

Digitoxigenin, Kaliumflux u. intracell. Ionenkonzent ra t ion im Herzmuskel 483

Der Wassergehalt der Vorh6fe wurde durch die Gewichtsdifferenz zwischen Feucht- und Trockengewicht in / ib l icher Weise ermittelt . Da die GrSBe des Feucht- gewichtes davon abh~ingig ist, wie die am Organ haftende TyrodelSsung vor der Messung entfernt wird, s tandardisierten wir dieses Vorgehen, indem die VorhSi% ffir 90 sec zwischen zwei Blaubandfi l ter gelegt und mit 250 g belastet wurden.

Bei der Berechnung der intracellul/iren Ionenkonzentrat ionen wurde der Extracel lul~rraum des Vorhofgewebes mit 30°/o beriicksichtigt. Dieser Wert war yon BAYER (1961) mit der Inul inmethode in vivo und in vitro und yon GOODFORD U. LiiLLMAN~ (1961) mittels aSS-markiertem Athylsulfonat un te r vergleichbareu Bedingungen ermit tel t worden.

Kalium-In/lux-Messung Die Aufnahme yon 42K aus der akt iven TyrodelSsung wurde nach demselben

Prinzip gemessen, wie wir es fiir Rattenzwerchfelle beschrieben h~ben (KLAus, L(~LLMANN U. MUSCttOLL 1960a). Die Belastung der Vorh6fe betrug um 0,5 g.

Nach verschieden langem Aufenthal t in der akt iven LSsung (15, 30, 60 oder 120 min) wurden die Vorh6fe in inakt iver TyrodelSsung ffir 4 • 2 rnin gespiilt, um das anhaftende und im Extracellul~rraum beflndliche a2K weitgehend zu entfernen, anschlie~end wurden sie nach der Best immung des Feuchtgewichtes nab ver~scht. Die aufgenommene Aktivit i i t wurde dann mit einem Fliissigkeitsz~hlrohr gemessen und a u f d e n jeweiligen K-Gehal t bezogen. Die somit errechnete spezifische Akti- vit/~t der Vorh6fe wurde in Prozenten der spezifischen Aktivi t~t der Auflade- 15sung ausgedrfickt.

Die Errechnung des K - I n f u x in pmol cm -e sec 1 wurde nach dem frfiher mitgeteilten Formulierungen durchgefiihrt (KLAUS, LiJLLMANN U. MUSCIIOLL 1960a). Die ben6tigten Werte sind: spezifische Akt ivi t~t des Muskels und der TyrodelSsung, Aufladedauer, intracellul~rer Kaliumgehalt , spezifisches Gewicht des Vorhofs, Extracelluliirraum und Volumen-Oberfl/ichenverh/iltnis der Herzmuskelzellen. Bis auf die zuletzt genannte GrSBe ergeben sich alle Werte mit geniigender Sicherheit aus experimentellen Daten. Das Volumen-Oberfl~chenverh~ltnis ist dagegen am Vorhof wegen methodischer Schwierigkeiten sehr schwer exakt zu erfassen. Als beste Sch~tzung fiir diesen Wert sehen wir 2 # an. Da diese GrS8e mSglicherweise nicht ganz zutrifft, aber direkt in die Berechnung des Influx und Efflux eingeht, sind die yon uns angegebenen absoluten Fluxwerte mit einem gewissen Vorbehalt zu betrachten. Weitere Vorbehalte gegen die Methode der Fluxberechnung sind yon uns an anderer Stelle erSrtert worden (KLAuS, LULLI~IANNU. MUSCHOLL 1960a,b). Relative J~nderungen der Fluxwerte unter unseren experimentellen Bedingungen werden davon jedoch uicht betroffen, so dab ein Vergleich der Fluxwerte verschiedener Versuchsgruppen durchaus berechtigt ist.

Da der intracellul~re Kaliumgehalt -- bedingt durch die unterschiedlichen Gewichte der einzelnen VorhSfe -- s tark schwankt, wurde der Influx fiir jedes Organ individuell ausgerechnet. Dadurch konnte die Streuung der Influxwerte erheblieh verminder t werden.

Kalium-E//lux-Messung Nachdem der isolierte Vorhof bzw. das linke Herzohr in aktiver TyrodelSsung

einen Teil seines intracellul~iren Kal ium gegen a2K ausgetauscht hat te , wurde dieses ,,aufgeladene Pr~iparat" in eine Versuchsapparatur iibertragen, die mit inaktiver Tyrodel6sung durchst rSmt wurde und das gleichzeitige Messen der Gesamtaktivit / i t im Herzen, der in der Zeiteinheit abgegebenen Aktivit / i t und des Mechanogramms gestattete. In Abb. 1 ist das Prinzip dieser Versuchsanordnung dargestellt: Der ,,aufgeladene" Muskel befand sich in einer Plexiglaskammer (6 ml Inhal t ) mi t einem

Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak., Bd. 242 33

484 W. KLAUS, G. KUSCHII~SKY und H. Lt~LLMANN:

seitlichen Glimmerfenster, dem ein Geiger-Mfiller-Endfensterz~hlrohr zur Messung der Aktivit~t im Organ anlag. Eine Schlauchpumpe (Sigmamotor) saugte mit konstanter Geschwindigkeit (10 ml/min) die BadlSsung aus der Kammer durch ein dahintergeschaltetes Spiralfliissigkeitsz~hlrohr (Fassungsverm6gen 1,5 ml). Dureh diese zus~tzliehe Messung der Aktivit~t im Perfusat wurden kleine J~nderungen der 42K-Abgabe sehr viel besser erfai]t als dureh die Registrierung der Gesamtaktivit~t im Muskel. Die Plexiglaskammer war oben often, damlt eine Durchperlung des

iliplliillrll[i4ipll,lrrllll~o

02+C02

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Abb. 1. Sehematisehe Darstellung der Versuehsanordnung ffir die K-Effluxmessung. Einzelheiten siehe Text

Organbades mit O2-CO2-Gemisch m6glich war. Der ZufluI~ der inaktiven Tyrode- 16sung wurde fiber eine Pegelregelungsanlage elektronisch gesteuert; die Spiegel- schwankungen betrugen 1--2 mm. Die Tyrodel6sung wurde bereits vor dem Eintri t t in die MeBkammer mit 95o/o 02 und 5°/0 CO 2 ges~Lttigt und auf die ge- wfinschte Temperatur erw~rmt. Die zu prfifenden Substanzen wurden in einigen F~illen yon einer Infusionspumpe in sehr kleinen Volumina (0,015 ml/min) in den Zuleitungsschlauch kurz vor der Mel~kammer injiziert, so dab praktisch keine Ver- 5nderung der Zusammensetzung der Tyrodel6sung resultierte. Meistens waren sie bereits in der gewfinschten Konzentration in einer zweiten Tyrodel6sung enthalten, die in das Durchflu~system eingeschaltet werden konnte.

Die Kontraktionen wurden fiber eine mechano-elektrische Umwandlerr6hre (RCA 5734) aufgenommen und mit einem Gleichstromdirektschreiber (Cardiopan, Liechti AG), der ffir eine langsame Laufgeschwindigkeit (2 mm/min) umgebaut war, registriert. Die Z~ihlimpulse der beiden Mei3systeme wurden nach Integrierung ebenfalls fortlaufend mit Direktschreibern aufgezeichnet.

Aus diesen Aktiviti~tskurven wurde nach Berficksichtigung der unterschiedlichen geometrischen Verh~ltnisse und Empfindlichkeit der beiden ZKhlrohre und nach Korrekturen fiir Nulleftekt bzw. Totzeit ein Quotient gebildet, der die prozentuale 42K-Abgabe pro Zeiteinheit ffir die ganze Versuchsperiode angab.

Digitoxigenin, Kaliumflux u. intracelL Ionenkonzentra~ion im Herzmuske| 485

Ergebnisse ~ InVorversuchenwaren ~ ~

zwei Digitoxigeninkon- ,~"~ ~ zentrationen ermittelt ~ .a worden, die unter den "~ ~ gew/~hlten Bedingungen :¢ ~ zu folgenden Effekten ~ fiihrten: ~ "~

1. Eine positiv inotrope .~ ~ .~ Wirkung, die auch bei ~ : ~ 1/~ngerem Bestehen nicht ~ ~ mit einer Sch/idigung des ~ ~ Organs verbundenwar: ~ i 3"10 -~g/ml (=, , thera- ~ - peutische Konzentra- .~ --- tion"). Die durchschnitt- ¢ ~ liche maximale Zunahme "~ ~ ~'~ der Kontraktionsampli- ~ ~ tude betrug etwa 450/0. ~ ~ ~ ~

2. Entwicklung einer ~: ~ ~ Kontralctur ira Laufe yon ~ ~ "~ 10--20 min mit ent- ~ - " ~ sprechender Abnahme ~ ~ ~ der Kontraktionsampli- ~ & ~ rude : 10 -~ g/ml (= ,,toM- ~ ~. 2 sahe Konzentration"). ttierbei kam es vor dem 2~ _~ Beginn der Sch~digung ~ ~.~ zu einem voriibergehend ~ ~, stark positiv inotropen ~ ~ Effekt. AmVersuchsende ~ "~ ® betrug dieKontraktions- ~. ~ .~ amplitude maximal noch ~ "~ i0°/0 des Anfangswertes. ~ ~ 2

Die Ionenkonzentrations- ~ ~ bestimmungen ~ ~ . ~ ~ ~ ~

In der Tabelle sind die ~ ~ ~littelwerte aller Messun- ~ ~ ~ ~'~

DieK-,Na- undCI-Werte - sind in m~q/1 Faser- "~ ~ wasser, die Ca-Werte in ~ .~

r~

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v v

~ - H ~ ~

33*

486 W. KLAUS, G. KUSCHINSKY und H. Li3r,r,M~N~:

m~q/1 Intracellul/irraum und der Wassergehal$ in ml/kg Feuchtgewich$ angegeben. Die intracellul/iren Konzen~rationen yon K, Na und Ca/inderten sich bei den Kontrollen w/ihrend des ganzen Badaufenthaltes nicht. Es konnte deshalb jewefls ein gemeinsamer Mittelwert ffir die gesamSe

%

/0g

80

70

I I I [ % ,: .,o :o ,,i, b

Abb. 2. Der EinfluB einer therapeutischen (3 • 10 -7 g/ml) und einer toxischen (10 -a g/ml) Digitoxigenindosis auf d i e intracellul~re K-Konzentration isolierter l~eer- schweinchenvorhSfe. Ordinate: Prozentuale Abweichung der Versuchswerte yon den Kontrollwerten (100']0). Dargestellt s i n d d i e l~Iittelwerte :t= mittlere Fehler der

Mittelwerte. Abszisse: Badaufenthalt in Minuten

/30 %i /20

//0

/oo

yo

80

70

i I l I RIO ~ ~ 0 /5 30 6"0 rain 120

Abb. 3. Der Einflul3 einer therapeutischen und einer toxischen Digitoxigeninkonzentration auf die intracellul~re Na-Konzentration. Einzelheiten siehe Legende zuAbb. 2

i D/yi/ox/ye/.n 3xv-g/~U

Versuchsperiode gebildet werden, der zum Vergleich mit den Werten der Versuchs- gruppen gleich 100 gesetzt wurde. Die Abweichungen der Versuchswerte wurden dann in Prozenten hiervon angegeben. Der Wassergehalt der Kontrollen zeigte wiihrend des zweistfindigen Badaufent- haltes keine Ver~nderungen; nur der Chloridgehalt schien anzusteigen. Wegen der gro- ~en Streuung dieser MeJ3werte mSchten wir dieser Zunahme aber keine Bedeutung bei- messen.

Therapeutische Digitoxi- geninkonzentration. Unter der Einwirkung yon Digitoxi- genin 3 • 10 -~ g/ml wurden folgende Mel3ergebnisse er- halten: Die intracellul~re K-Konzentrat ion ver~nderte sich w~hrend der gesamten Versuchsdauer nicht; sie unterschied sich zu keinem Zeitpunkt yon den Kontroll- werten (Abb. 2). Dagegen wurde die intracellul~re Na- Konzentration deutlich be-

einflul}t. Bereits nach 15 rain dauernder Einwirkung der ~herapeutischen Digitoxigeninkonzentration war sie gegenfiber den Kontrollwerten be- tr~chtlich abgesunken; nach 1 Std hatte sie um etwa 10 mJ~qfl Faser- wasser (dies entspricht etwa 200/0) abgenommen. Durch l~ngeren Bad- aufenthalt bei dieser Digitoxigeninkonzentration konnte diese Abnahme des cellulhren Na nicht weiter verst~rkt werden (Abb. 3).

•hnlich wie der Na-Gehalt verhielt sich auch der Ca-Gehalt der Vor- hofmuskulatur unter dem Einflu~ der therapeutischen Digitoxigeninkon-

Digitoxigenin, Kaliumflux u. intracell. Ionenkonzentration im Herzmuskel 487

zentration : Nach 30 und 60 min langer Einwirkung war die Ca-Konzen- trat ion um 2,7 m~q/1 In t race l lu l~raum abgesunken; das entspricht einer Abnahme um etwa 300/0 (Abb.4). Der Chlorid- und Wassergehalt zeigte keine mel~baren Ver~nderungen gegenfiber den Kontrollwerten.

Toxische L)igitoxigeninkonzentration. Unter dem Einflul3 yon Digitoxi- genin 10 -6 g/ml nahm das intracellul~re K kontinuierlich ab. Nach zweistfindiger Einwirkung waren etwa 30 m~q/1 Faserwasser ausgetreten; das entspricht einem etwa 25°/oigen Verlust (Abb.2). Dieser K-Verlust war bei l~ngerer Einwirkungszeit der hohen Digitoxigeninkonzentration von einer etwa entsprechenden Na-Aufnahme in den In t ra- '~/~ cellul/irraum begleitet (Abb. 3). ::0 Auffallend ist jedoch, dab sich /00 nach kurzer Einwirkungszeit eine Abnahme der intraeellu- y0 1/iren Na-Konzentrat ion fand. 80 Die toxisehe Digitoxigenin- 70 konzentration wirkte also kurzfristig, d.h. ehe eine Kontrak- ¢0 tur auftrat , so wie die niedrige 50 Konzentrat ion w/ihrend der ganzen Einwirkungsdauer. Ein ~hnliehes Verhalten zeigte auch der intracellul/ire Ca-

[ca]~ l

[ i I 15 30 min 60

Abb. 4. Der Einflul3 einer therapeutischen und einer toxischen Digitoxigenindosis auf die intracellul~re Ca-Konzentratiola. Einzelheiten siehe Legende z t t

Abb.2

Gehalt: Nach 15 min langer Einwirkung der toxischen Konzentra t ion war er um etwa 10°/0 auf 7,7 m•q/1 Intraeellul/irraum abgefallen (die niedrige Digitoxigeninkonzentration ffihrte erst bei 1/~ngerer Einwirkungszeit zu einer Abnahme), ansehlieBend stieg er w/ihrend der Ausbildung der Sch/idigung wieder um rund 250/0 fiber diesen Minimal- wert an (Abb. 4). Der C1- und der Wassergehalt ver/inderten sich unter diesen Bedingungen ebenfalls nicht.

Der Kalium-In/lux Die Werte ffir den K-Influx der Kontrollen, gemessen fiber Zeiten von 15,

30, 60 und 120 min, waren statistisch nicht verschieden, so dal] ein gemeinsamer Mittelwert errechnet werden konnte. Er betragt 4,1 =k 0,18 pMol cm -2 see -1 (~ ! s~) (n --~ 42). Dieser Wert ist mit den Vorbehalten zu betrachten, die in der Methodik auseinandergesetzt wurden. Unter dem EinfluB der niedrigen Digitoxigeninkonzentration erfolgte keine Ver- /~nderung (3,93 ± 0,17 pMol em -2 sec -1, n ~ 31), die hohe Konzentra t ion dagegen hemmte den K-Influx betriichtlich (3,28 =£ 0,16 pMolcm -~ sec -1, n ~ 26). Diese Werte ergeben sich ebenfalls aus der Zusammen- fassung verschieden langer Aufladezeiten.

488 W . KLAUS, G . KUSCItINSKY u n d H . Li~J~MANN:

Genauere Informationen fiber das Verhalten des K-Influx unter dem :Einflul~ der versehiedenen Digitoxigeninkonzentrationen gibt eine Auf- gliederung der einzelnen MeBwerte in Abhiingigkeit yon der Einwirkungs- zeit des Genins im Vergleich zu den Kontrollen. In Abb. 5 ist die prozentuale Abweichung der Versuchswerte yon den Kontrollwerten (~- 100°/o)

120

,gO #O K-/nf/ux D@#o~,~en/n ~ 9 ~ f ~

,FO

0 15 30 6'0 rain 120 Abb. 5. Der Einflu• einer therapeutischen und eiuer £oxiscaaem Digitoxigenindosis auf den K-Influx.

• inzelheiten siehe Legende zu Abb. 2

Diyi/ox~enz~ Yi z0-79/? ~ 2 * 10-7g/~L Pigi/ox(yenm

43- °/o/min

o,s

0 0 20 qO 6"0 80 100 /20minlqO Abb.6 . ne r EinfluB einer therapeutischen und einer toxischen Digitoxigenindosis auf das Mechanogramm und den K-Efflux eines isolierten Meerschweinchen- vorhofs. Obere Kurve: Mechanogramm, Spannungs- entwicklung in Gramm. Untere Kurve: *~K-Abgabe

in Prozent/min

ffir die einzelnen Aufladezeit- punkte dargestellt. Unter dem EinfluB vou Digitoxigenin 3 • 10 -7 g/ml stieg der K-Influx wKhrend der kurzen Ein- wirkungszeiten geringffigig an, die maximale Zunahme liegt bei 200/0 gegenfiber den Kon- trollen. Bei 60 und 120 min langer Einwirkungszeit unterschied sich der K-Influx aber nicht mehr yon dem der Kon- trollen. Wi~hrend der ganzen Versuchsperiode liel~ sich keine Verminderung beobachten. Die hohe Digitoxigeninkonzentra- tion ffihrte kurzfristig ebenfalls zu einer Zunahme des K-Influx um etwa 350/0, bei li~ngerer Einwirkungsdauer nahm dagegen der K-Influx erheblich ab, bei zweistfindiger Expo- sition war er z.B. bereits auf etwa die Hi~lfte der Kontroll- werte reduziert.

Der Kal ium-E/ f lux

Der Einflug yon Digitoxi- genin 10 - 7 _ 10 .6 g/ml auf den K-Efflux wurde an insgesamt 38 elektrisch gereizten Herz- ohren bzw. Vorh6fen mi t

gleiehzeitiger Registrierung des Meehanogramms gemessen. Aus den Kontrollperioden ergab sich ffir die 4~K-Abgabe ein durchschnittlicher Wert von 0,9°/0/min. Daraus erreehnete sieh ein K-Efflux yon 6,5 pMol cm -2 sec -1, wobei jedoch wiederum die in der Methodik erli~uterten Vor- behalte berficksichtigt werden mfissen. Ferner war auffallend, dab sich die prozentuale Abgabe von 4°'K pro Zeiteinheit w~hrend eines Versuehes

Digitoxigenin, Kaliumflux u. intracell. Ionenkonzentration im Herzmuskel 489'

n i ch t als k o n s t a n t erwies, sondern l angsam abnahm. E in solches Ver- ha l t en des K - E f f l u x war bere i ts am normalen und besonders a m dener - v ie r ten Ra t t enzwerchfe l l beobach te t worden (KLAuS, LOLLMANN U. MUSCHOV,L 1960a). Wahrsehe in l i ch is t dieser Effekt au f die Inhomogen i - t / i t des Gewebes (z. B. unterschiedl iche Zel ldurchmesser) zurfickzuffihren (CRE~S~, NElL u. STEr~ENSO~ 1956). D a m i t e rg ib t sich fiir die A n g a b e eines verb ind l ichen Absolu~wertes ffir den K-Ef f lux eine wei tere Schwie- r igkei t .

Tro tz dieser Vorbeha l t e lassen sich aber Beeinf lussungen der K - A b - gabe aus dem Gewebe mi t der yon uns ve rwende ten Methodik sehr emp- findlich messen. U n t e r der E inwi rkung von Dig i tox igen inkonzen t ra t ionen zwischen 10 -7 und 4 . 1 0 -7 g /ml wurde der K-Ef f lux nicht beeinflul~t, obwohl ein deu t l ich pos i t iv ino t roper Effekt vorlag, im Konzen t r a t i ons - bereich 5 • 10 -~ bis 10 -8 g/ml dagegen nahm der K-Ef f lux immer deut l ich zu (siehe Einzelbeispie l in Abb. 6). Eine solche Ste igerung des K-Ef f lux war immer von Sch/ idigungserscheinungen ( I r regular i t / i ten oder Kon- t r a k t u r ) begle i te t . It/~ufig t r a t e n diese ers t einige Minuten naeh dem An- s te igen der a2K-Abgabe auf.

Diskussion Ein Vergleich dieser Befunde m i t den in der L i t e r a t u r mi tge te i l t en

Ergebnissen erschcint notwendig .

Auf Grund der Publikationen von Scm~E~SER (1956), RAYNER U. WEATHERALL (1957) und VICE u. KAH~ (1957) ist bekannt, dab die Herzglykoside die K-Aufnahme in den Herzmuskel zu hemmen vermSgen. Eine solche BeintrKchtigung des aktiven Ionentransportes hat sich aul~erdem an einer groBen Zahl anderer Gewebe demon- strieren lassen, entweder direkt durch Messung der Ionenbewegungen durch die Zellmembran oder indirekt (und damit nicht ganz zuverl~ssig und eindeutig) durch Bestimmung der intracellul~iren Ionenkonzentrationen bzw. der Nettoaufnahme oder -abgabe. Folgende Beispiele seien aus der Fiille dieser Untersuchungen heraus- gegriffen: E in Einflul~ konnte gezeigt werden an Erythrocyten (ScI~ATZMA~¢ 1953; KA~N U. ACHESON 1955; SOLOMON et al. 1956; GLYNN 1957) an Skeletmuskeln (CATTEL 11. GOODELL 1937; SCHATZMANN U. WITT 1954; GREEF U. WESTER~AN~" 1955; EDWARDS U. HARRIS 1957), an glatten ~uskeln (ACKERMAN~ u. SC~ATZMAN~ 1959; GODFRAIND et al. 1961), an Tumorzellen (MAIZELS et al. 1958), an Nerven (CALDWELL U. KEYNES 1959), am Him (WOLLENBERGER U. WAHLER 1956), an der Froschhaut (KoEFo]~I)-Jo~NsoN 1957; WI~BRA~DT U. Wmss 1960) und am Nieren- tubulus (HYMA~¢ et al. 1956; SULSER et al. 1959; ORLOFF U. BURO 1960).

Unsere Befunde fiber den Einflu$ der hohen Digi tox igen inkonzen t ra - t ion auf den K - F l u x und die K- und N a - K o n z e n t r a t i o n in Meerschwein- chenvorh6fen s tehen h ie rmi t in gu te r Ubere ins t immung . Aul3er e iner Ver- minde rung des K - I n f l u x beobach te t en wir aber auch eine Ste igerung des K-Eff lux , so dal3 zus/~tzlich zur H e m m u n g des ak t iven T ranspo r t e s eine Zunahme der Membranpermeabi l i t /~ t anzunehmen ist , d ie die auf t re ten- den Ionenver sch iebungen noch begfinst igt . Diese Beeinflussung der t rans- m e m b r a n e n K-Bewegungen mi t den resu l t i e renden ver/~nderten in t ra -

490 W. KLAUS, G. KUSCHIlVSKY und H. Li~LLMANN:

cellul~ren K- und Na-Konzen t ra t ionen Rind aber jeweils von Kont rak- turen, also toxischen Erscheinungen, begleitet.

Bei genauer Durchsicht der erw~ihnten Publikationen yon SCm~EIBER, RAYNER U. WEATt~ERALL und VIcK u. KAHN ist diesen Arbeiten ebenfalls zu entnehmen, daft die verwendeten Glykosidkonzentrationen im Laufe der Versuche zu Sch~digungen der Herzpr~parate geffihrt haben. ~hnliches gilt ffir die meisten fibrigen Beobachtun- gen fiber eine Hemmung des aktiven Ionentransportes bzw. fiber eine intracellul~re K-Abnahme und Na-Zunahme als Wirkung der Herzglykoside. Bei den meisten dieser Untersuchungen wurden entweder deutlich toxische Erscheinungen beschrieben oder es wurden solch hohe Glykosidkonzentrationen benutzt, die bei einer An- wendung am Herzen zu einer Sch~digung geffihrt h~tten.

Die Wirkung der niedrigen, therapeut isch bedeutungsvoflen Digitoxi- geninkonzentra t ionen unterscheidet Rich dagegen prinzipiell yon diesen Effekten: Der K-Inf lux wird nicht beeintr~chtigt, sondern vorfibergehend sogar gefSrdert, der K-Eff lux bleibt unbeeinflul~t. Es resultiert daraus ein unver~nder ter intracellul~rer K-Gehal t , gleichzeitig wird der Na-Gehal t sogar vermindert .

Dieses Verhalten therapeutischer Konzentrationen steht in Obereinstimmung mit Befunden yon CALHOU~ u. HARRISO~ (1931), WEI)D (1939), REITER (1956) und L~E et al. (1961), die bei niedrigen, aber herzwirksamen Glykosidkonzentrationen ebenfalls keinen K-Verlust fanden. Einige Untersucher konnten unter diesen Bedin- gungen sogar eine Zunahme des cellul~ren K-Gehaltes nachweisen (HAGEN 1931; BOYER U. POINDEXTER 1940; TUTTLE et al. 1961). Bei einer exakten Trennung zwischen therapeutischer und toxischer Wirkung, wie sie CALHOUN u. HARRISON, HAGEN, LEE et al., TUTTLE et al. und WEDD vorgenommen haben, wird ein K-Ver- lust aus den Herzmuskelzellen jedenfalls immer erst beim Auftreten yon Sch~di- gungserscheinungen beobachtet. Entsprechende Befunde konnten auch am Herz- Lungenpr~parat des Hundes erhoben werden (K~N, persSnl. Mitteilung).

Auch elektrophysiologische Befunde deuten daraufhin, dal~ die Membraneigenschaften der Herzmuskelzellen durch therapeutische Digi- toxigeninkonzentrat ionen nicht beeinfluBt werden, Membran- und Ak- t ionspotential zeigen n~mlich keine eindeutigen Ver~nderungen (HE,G, KUSCHn~SKY U. LffLLMANN 1961). Bei Anwendung toxischer Dosen wird dagegen die Repolarisationsphase des Aktionspotentials verkiirzt, sowie die GrSl3e des Aktionspotentials und eventuell auch des Membranpoten- rials verminder t (WooDBURY U. HECHT 1952 ; TRAUTWEIN U. WITT 1952 ; STUTZ et al. 1954; HEEG, KUSCmNSKY u. L~LLMAN~ 1961).

Die Schwierigkeiten und Differenzen, die Rich bei der Untersuchung der Wirkungsweise der Herzglykoside ergaben, beruhen somit zum Tell auf dem besonderen Verhalten der Dosisabh~ngigkeit der einzelnen Effekte : Niedrige Konzentra t ionen ftihren zu entgegengesetzten Wirkun- gen wie hohe Konzentra t ionen. Die Dosiswirkungskurve verl~uft also nicht kontinuierlich, sondern weist einen Umkehrpunk t auf. Daher kSn- nen nicht alle Folgerungen, die durch Retropolat ion aus den Ergebnissen mi t hohen Konzent ra t ionen gezogen werden, zu richtigen Schlfissen fiber die therapeutische Wirkungsweise der Herzglykoside ffihren.

Digitoxigenin, Kaliumflux u. intracell. Ionenkonzentration im I-Ierzmuskel 491

Aus den mitgeteilten Befunden muB geschlossen werden, dab eine positiv inotrope Wirkung des Digitoxigenins ohne Itemmung des aktiven Ionentransportes und ohne Beeinflussung der intracellul~ren K-Konzen- tration mSghch ist. Oder anders formuliert: Eine ttemmung des Ionen- transportes oder eine Abnahme des K- und Na-Gradienten bei der Herz- muskelzelle kann nicht die Ursache ffir den therapeutischen Effekt der Herzglykoside sein, sondern ist nur mit den toxischen Glykosidwirkungen korreliert. So fiberrascht auch nieht die gute Ubereinstimmung zwischen der Hemmung des aktiven K- und Na-Transportes am Erythrocyten mit der Toxieit~t verschiedener herzwirksamer Glykoside am Ganztier (MAc~OVA 1960). Beide Effekte sind die Folge desselben Grundmechanis- mus, der bei der Zelle zu ciner erheblichen StSrung des inneren Ionen- milieus und beim Ganztier zum typischen Glykosidtod ffihrt.

Welehe Bedeutung der bei Anwendung therapeutiseher Digitoxigenin- dosen beobachteten Abnahme des intracellul~ren Natrium- und Calcium- gehaltes ffir das Zustandekommen eines positiv inotropen Effektes bei- zumessen ist, vor allem ob ein kausaler Zusammenhang zwischen diesen Vorg~ngen anzunehmen ist oder nicht, kann vorerst nicht entschieden werden, da das Verhalten der transmembranen Natrium- und Calcium- bewegungen unter den gew~hlten Bedingungen bisher nicht untersucht worden ist. Die beschriebenen Konzentrations~nderungen stimmen fiber- ein mit Beobachtungen yon LEE et al. (in bezug auf Ca) und von TUTTLE et al. (in bezug auf Na) bei Anwendung therapeutischer Strophanthin- konzentrationen an isoliertem tIerzmuskelgewebc. Die toxische Digitoxi- genindosis verursacht dagegen nach einer voriibergehenden Abnahme des Ca-Gehaltes (withrend der positiv inotropen Phase) eine allm~hliche Ca- Aufnahme. Eine solche Zunahme des cellul~ren Calcium im Iterzen ist ebenfalls yon LEE et al. (1961) wi~hrend der Glykosidintoxikation gefun- den worden. Eine ErklKrung hierffir kSnnte die yon tIoLLAND U. SEKUL (1959, 1960) bei Anwendung toxischer Strophanthinkonzentrationen beobachtete gesteigerte Ca-Aufnahme bei gleichzeitig unver~nderter Ca. Abgabe sein. Diese Befunde stehen auch in •bereinstimmung mit den Vorstellungen fiber die Bedeutung des Calcium bei der Kontraktur- entstehung in anderem Muskelgewebe (z. B. BRECHT et al. 1960, 1961).

Zusammenfassung Der Wirkungsmechanismus der tterzglykoside wird yon einer Reihe

yon Untersuehern fiber eine Hemmung des aktiven Ionentransportes, bzw. eine Ver~nderung der intracellul~ren Kalium- und Natriumkonzen- tration, erkl/irt, ttierdurch wfirden Bedingungen gesehaffen, die einen positiv inotropen Effekt zur Folge hatten.

Zur Prfifung dieser Vorstellung wurde an isolierten, elektrisch gereizten MeerschweinchenvorhSfen die Wirkung verschiedener Digitoxigenin-

492 W. KLAUS, G. KvseHi~sxY und H. Li~LLMANN :

konzentrationen auf das Mechanogramm, den K-Influx und -Efflux, die intracelluli~ren K-, Na-, Ca-, C1-Konzentrationen und den Wassergehalt untersucht. Es wurden vorwiegend zwei Digitoxigeninkonzentrationen geprfift : 3 • 10 -7 g/ml, nur positiv inotrop wirkend (---- , therapeutische" Konzentration) und 10 -6 g/ml, kontrakturerzeugend (= ,,toxische" Kon- zentration).

Die KontrollvorhS/e zeigten w/~hrend der zweistfindigen Versuchs- periode keine Ver/~nderungen der intracellul/iren K-, IWa- und Ca-Konzcn- trationen. Ebenso blieb der K-Influx konstant, w~hrend der K-Efflux allmiihlich abnahm. Die C1-Konzentration stieg leicht an, der Wasser- gehalt blieb unveriindert.

Die therapeutische Digitoxigeninkonzentration hatte keinen EinfluB auf den K-Efflux, der K-Influx wurde vorfibergehend sogar gesteigert. Eine Ver£nderung der intracellul/~ren K-Konzentration lieB sich jedoch nicht feststellen. Die intracellul~re Na- und Ca-Konzentration wurde deutlich erniedrigt.

Die toxische Digitoxigeninkonzentration hemmte den K-Influx be- tri~chtlich und steigerte den K-Efflux auf etwa das Doppelte. Dadurch wurde der intracellul/ire K-Gehalt stark vermindert, w/~hrend der Na- Gehalt entspreehend anstieg. Der Ca-Gehalt schien leicht gesteigert zu sein. Vorfibergehend wurden w/~hrend der positiv inotropen Phase der toxischen Digitoxigeninkonzentration gleiche Effekte auf die transmembranen K-Bewegungen und die intracellul/~ren Ionenkonzentrationen beobachtet wie bei der therapeutisehen Konzentration w~hrend der gesamten Einwirkungszeit (gesteigerter K-Influx, verminderte I~a- und Ca-Konzentration). Die C1-Konzentration und der Wassergehalt wurden dureh die verschiedenen Digitoxigeninkonzentrationen nicht beeinfluBt.

Aus den Befunden wird geschlossen, dab die positiv inotrope Wirkung des Digitoxigenins nicht auf eine Hemmung des aktiven Ionentransportes bzw. eine Verminderung des intraeellul£ren K-Gehaltes zurfickzuffihren ist. Diese Effekte charakterisieren vielmehr nur die toxischen Erscheinun- gen bei Anwendung dieser Substanz. Zur K1/irung der unter dem EinfluB therapeutischer Digitoxigeninkonzentrationen erfolgten Verminderung des intraeellul/iren Na- und Ca-Gchaltes sind weitere Untersuehungen erforderlich.

Summary One of the common conceptions concerning the mode of action of the

heart glycosides considers that these substances act through inhibition of the active ion transport, producing a decrease in intraccllular potassium and an increase in intracellular sodium concentrations. I t is assumed that, thereby, conditions are created which improve the contraction of the heart muscle.


This theory was tested by measuring the action of a "therapeutic" concentration (3 • 10 -7 g/ml, producing only a positive inotropic effect) and a "toxic" concentration (10 -e g/ml, producing contracturc) of digi- toxigenia on isolated electrically stimulated guinea pig auricles. The mechanical activity, K influx and efflux, intracellular K, Na, Ca and C1 concentrations and the water content were determined.

During control experiments, the intracellular K, Na and Ca concentrations remained constant. The K influx was unchanged, while the K efflux gradually decreased. The C1 concentration increased slightly, and the water content was unaltered.

Therapeutic digitoxigenin concentrations had no effect on the K efflux. The K influx was initially increased, but an increase in the intracellular K concentration could not be measured. The intracellular Na and Ca concentrations decreased markedly.

Toxic digitoxigenin concentrations produced substantial inhibition in K influx, and a twofold increase in K efflux. The intracellular K concentration was thereby reduced, while the Na concentration increased corres- pondingly. The Ca concentration seemed to be increased. During the initial positive inotropie phase of the toxic digitoxigenin effect changes in transmembrane K movements and intracellular ion concentrations iden- tical to those occuring after therapeutic concentrations were observed (increased K influx, decreased Na and Ca concentrations). The C1 concentration and the water content were not influenced by the various digitoxigenin concentrations.

The results presented here indicate that the therapeutic, positive inotropic effect of digitoxigenin cannot be due to an alteration in the intracellular K concentration or to an influence on transmembrane K exchange. Such changes occur only after application of toxic digitoxigcnin concentrations, and arc most probably caused by inhibition of active ion transport and an increase in membrane permeability. The signifigancc of the decrease in Na and Ca concentrations after therapeutic digitoxigenin doses can only be determined after closer investigation with measurement of the Na and Ca fluxes under these conditions.

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Dr. W. KLAVS und Prof. Dr. G. KtrSCn~NSK¥, Pharmakologisches Insti tut der Universit~t, Mainz, LangenbeckstraBe 1

Priv.-Doz. Dr. H. LULLI~IANN, zur Zeit Department of Pharmacology University of Mississippi, Medical Center,

Jackson, Miss., USA

Über den zusammenhang zwischen positiv inotroper wirkung von digitoxigenin, kaliumflux und...

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