ue2 biopathologie tissulaire et méthodes d’étude
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UE2
Biopathologie tissulaire et Méthodes d’étude
Anatomie Pathologique
Introduction - Techniques
2018-2019
Dr Aurélie Cazes - Département de Pathologie- Bichat
Anatomie pathologique Modalités d’enseignement 2017-2018
En DFGSM2
Moodle Anatomie Pathologique DFGSM2
• 5 cours magistraux : Introduction et techniques, lésions élémentaires, inflammation x2, métabolisme
– Dont 2 cours interactif à préparer sur Moodle Paris Diderot
– Venir avec un smartphone
• 2 ED 2 heures
– Lames virtuelles à consulter avant la séance : Moodle Paris Diderot
– RESPECTER SON GROUPE ++++
• Examen L2 : Question rédactionnelle et QRM portant sur cours et ED
En DFGSM3
• Anatomie pathologique dans d’autres UEs (respiratoire, cardiovasculaire…)
• Anatomie pathologique (ou Pathologie) = discipline médicale
• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules
• Utilise des techniques principalement morphologiques
• Lésions = altérations morphologiques des organes, décelables par tout moyen d’observation.
• Ensemble de lésions:
• +/- spécifiques d’une maladie
• Évocatrices d’un diagnostic
• Exemples = nécrose, inflammation, prolifération, fibrose….
Anatomie pathologique Introduction
• Etudie les lésions au cours d’une maladie, survenant sur les organes, tissus ou cellules
• Prélevés puis examinés
- A l’œil nu = « Macroscopie »
- Au microscope optique
Anatomie pathologique Introduction
Démarche diagnostique
Symptômes
Examen clinique
Imagerie
Biologie
Anatomie Pathologique
Diagnostic
TraitementPronostic
Surveillance
Analyse lésions cellulaires et tissulaires Compte-rendu
Anatomo-pathologique
Patient
Synthèse Anatomo-radio-clinique
Patient
A partir de quels prélèvements?
• Cellules isolées = Cytologie • Tissus = Histologie
A partir de quels prélèvements?
• Cellules isolées = Cytologie
• Quel que soit le prélèvement: – Toujours envoyé en anapath
accompagné d’une feuille de demande
– Etat civil du patient
– Coordonnées du préleveur
– Renseignements cliniques +++
– +/- Imagerie, Biologie….
– Nature du prélèvement +++
• Tissus = Histologie
Cytologie - Techniques
• Etude de cellules isolées, déposées sur une lame de verre
• Catégories de prélèvement – Liquides
Physiologiques : liquide céphalo-rachidien Epanchements des séreuses : pleurésie, asciteLavage : broncho-alvéolaire
– Grattage ou brossage : muqueuses (buccale, génitale) « frottis » col utérin
– Appositions de pièces opératoires (ganglion)– Ponction à l’aiguille masse ou organe plein / kyste: gg, nodule
sein, thyroïde
– NB: L’analyse des cellules du sang (numération formule) n’est pas réalisée en anatomie pathologique mais en hématologie biologique
Cytologie - Techniques
• Techniques « traditionnelles »
– Frottis : étalement sur lame du matériel rapidement après prélèvement
– Cytocentrifugation d’un liquide
– Appositions ou empreintes d’un tissu sur lame de verre
• Séchage à l’air ou fixation par une laque
• Colorations spécifiques de cytologie : Papanicolaou, MGG
• Pas de « réserve » de matériel une fois lame colorée
• Techniques plus récentes
Cytologie en milieu liquide = immersion immédiate des cellules dans le milieu de conservation
• Concentration et transfert en couche mince sur une lame puis coloration
• « réserve » de matériel en cas de besoin .
Cytologie - Techniques
Cytologie - Exemples
Liquide pleural contenant des lymphocytes tumoraux (=lymphome)Coloration MGG
Frottis cervico-vaginal (Papanicolaou)
Normal Tumoral
Cytologie - Exemples
Cytologie
• Indications -Accès non chirurgical à une lésion profonde, nature? -Dépistage, surveillance (peut être répété)-Complément d’examen histologique
• Avantages: peu invasif, rapide, performant
• Limites -Qualité technique pas tjrs optimale -Morphologie des cellules en suspension différente des cellules ds le tissu (compétence du cytologiste)-Matériel peu abondant pour techniques complémentaires-Si suspicion de malignité un prélèvement tissulaire de “contrôle” est souvent indiqué
Prélèvements tissulaires
• Biopsie : prélèvement d’un fragment de tissu pour analyse anatomo-pathologique
– par ponction (aiguille coupante ou trocart) (foie, rein, os, etc.) : « à l’aveugle » ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur une lésion focale
– au cours d’une endoscopie (pince montée sur l’endoscope)
– Au bistouri, au punch….
Biopsie pulmonaire à l’aiguille Biopsie bronchique à la pince Biopsie exérèse d’un polype colique
• Pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d’un ou de plusieurs organes
Prélèvements tissulaires
Valve aortique
Tumorectomie du sein
Pneumonectomie avec pariétectomie
1 cm
• Autopsie (ou nécropsie) = examen anatomopathologique pratiqué sur un cadavre.
- Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice dans tous les cas de mort suspecte
- Les autopsies à but scientifique sont pratiquées dans les hôpitaux, généralement à la demande des médecins.
Prélèvements tissulaires
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
• Etape cruciale et irréversible: Fixation du tissu
Fixation= méthode permettant de conserver les cellules et le tissu dans un état fixe le plus proche possible de l'état physiologique, pour éviter qu'ils ne se dégradent.
rapide après le prélèvementla plus utilisée = fixation au Formol, par immersionDurée variable selon taille (de quelques heures à quelques jours)
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
Film réalisé à St Antoine, illustrant la prise en charge macroscopique d’une pièce opératoirehttps://youtu.be/6-HdKZFb9xo
Biopsie
Examen microscopique
Prélèvements tissulaires
Pièce opératoire
Mise en cassettesInclusion en paraffine
Coupe du tissu Coloration HES (Hématoxyline Eosine Safran)
Examen macroscopiquesur tissu fixé
Fixation au Formol
Tem
ps
tech
niq
ue
24
à 7
2h
+/- techniques complémentaires
Compte -rendu
Examen macroscopiquesur tissu frais
Enregistrement des prélèvements au
laboratoire
Prélèvements tissulaires
Pièce opératoire fixée au formol
Inclusion en paraffine du tissu:Déshydrater dans bains d’alcool Remplacer alcool par solvant (toluène /xylène)Imprégner de paraffine liquide chaudeCréer un « bloc de paraffine » refroidie contenant le tissu à analyser
Examen macroscopique:Description - Mesure de la pièce
Choix des lésions à analyser (ex: tumeur, marges de résection,
ganglion)
Zones d’intérêt mises en cassettes
Prélèvements tissulaires
Coloration standard = HES (Hématoxyline Eosine Safran)
Automate à colorations
Le tissu coupé et étalé sur lame est « déparaffiné » puis réhydraté et trempé dans différents bains de colorants
Prélèvements tissulaires
Coloration standard = HES Hématéine (hématoxyline): bleu, noyaux Eosine: rose, cytoplasme Safran: jaune, tissu conjonctif , collagène
Prélèvements tissulaires
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
Film réalisé à St Antoine illustrant la prise en charge complète d’une biopsie, avec inclusion et coloration https://youtu.be/pPe1CAVRibg
0,2 cm
Biopsie sous fibroscopie Lobectomie pulmonaire
Biopsie: Tumeur: 5 cm
Prélèvements tissulaires
Blocs de paraffine se conservent et sont exploitables pendant des dizaines d’années si fixation de bonne qualité….
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de l’examen extemporané
• Examen histologique rapide • Réalisé en cours d’intervention chirurgicale • Résultats orientent les suites de l’intervention
Technique • Prélèvement frais (=non fixé +++) : 1 à 2 cm max.
Sur pièce opératoire ou biopsie • Congélation dans un cryostat (-20°C): durcit le prélèvement permet la coupe 4 microns • Coloration rapide à la main • Résultat rendu immédiatement (téléphoné)• Durée environ 20 mn
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de l’examen extemporané
• Examen histologique rapide • Réalisé en cours d’intervention chirurgicale • Résultats orientent les suites de l’intervention
• Film réalisé à St Antoine illustrant la prise en charge d’un examen extemporané
https://youtu.be/kH1Z0A_TxTE
Prélèvements tissulaires
Limites de l’examen extemporané
• Réalisé dans des conditions d’analyse non optimale:• Congélation altère la morphologie• Analyse partielle (1 à 2 cm)• Coloration rapide manuelle
• Sera toujours confirmé par un examen après fixation/inclusion en paraffine du reste du prélèvement
• Moins fiable que l’examen définitif
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de la congélation des tissus pour conservation
• Possibilité de conserver les tissus/cellules à -80° après congélation en azote liquide
• Banque de tissu « Tissuthèque », « Tumorothèque »
• En vue d’études de biologie moléculaire (ARN++)• En vue d’études protéiques• En vue d’immunofluorescence….
• Dans le cadre du soin (=utile au diagnostic)• Dans le cadre de la recherche biomédicale = tissuthèque gérée
en conformité avec la loi (information et non opposition des patients)
Prélèvements tissulaires
Cas particulier de la congélation des tissus pour conservation
• Différent d’un examen extemporané• Se fait à partir d’un prélèvement frais (=non fixé)• Le plus rapidement possible à réception• Souvent réalisé à l’étape de « macroscopie fraîche »
• Stockage à -80° jusqu’à utilisation
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
?
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration
Analyse au microscope optique
?
Principes d’analyse d’une coupe histologique
• Examen à faible grossissement :
architecture du tissu
Organe normal résiduel ou pas ?
repérage des zones lésionnelles
• Examen à plus fort grossissement :
détails cellulaires
• Diagnostic (s)
X 25
X 400
Faible grossissement
Principes d’analyse d’une coupe histologique
B
B
Grossissement intermédiaire
Principes d’analyse d’une coupe histologique
B
Grossissement intermédiaire
Principes d’analyse d’une coupe histologique
B
Fort grossissement
Principes d’analyse d’une coupe histologique
Pathologie 2.0…du microscope à la lame virtuelle
Principe:Numériser une lame à l’aide d’un scanner de lames
Stockage du fichier sur un serveur
Consultationavec logiciel approprié
Pathologie 2.0…du microscope à la lame virtuelle
Exemple : lame virtuelle ED1
Principales applications actuelles: EnseignementPrésentation de cas aux réunions de concertation multidisciplinairesDemande d’avisGroupes d’experts……
Nécessite adaptation +++ des moyens matériels/des compétences
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration HES
Analyse au microscope optique
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration HES
Analyse au microscope optiqueTechniques complémentaires (spéciales)
ColorationsImmunohistochimieBiologie moléculaire « in situ »
Mise en évidence de constituants particuliers « in situ »
• Des cellules : mucus, glycogène, pigments…• De la matrice extracellulaire : fibres élastiques, amylose• Agents infectieux : bactéries, parasites, champignons…
Colorations histochimiques « spéciales »
Techniques histochimiques basées sur des réactions biochimiques
Exemple: identification du glycogène, des mucopolysaccharidesneutres dans la réaction de Schiff (coloration de PAS)Oxydation de certains polysaccharides par l’acide Révélée par une coloration rouge
Coloration PAS
Mucines
Glycogène
Colorations histochimiques « spéciales »
Colorations histochimiques « spéciales »
Coloration de Perls : colore le Fer en bleu
Colorations de la fibrose : Rouge Sirius se fixe sur le collagène
Colorations histochimiques « spéciales »
Colorations histochimiques « spéciales »
Grocott: colore les champignons (mycoses), filaments, levures, kystes
Filaments d’AspergillusKystes de Pneumocystis jirovecii
Colorations histochimiques « spéciales »
Coloration de Ziehl-Neelsen : coloration permettant l'identification des
mycobactéries (Bacille Acido-Alcoolo Resistants, BAAR).
Mycobacterium tuberculosis (Bacille de Koch, BK), agent de la tuberculose
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Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration HES
Analyse au microscope optiqueTechniques complémentaires (spéciales)
ColorationsImmunohistochimieBiologie moléculaire « in situ »
Immunohistochimie
• Mettre en évidence certaines protéines cellulaires (antigènes)
– Cytoplasmiques, membranaires, nucléaires
• A l'aide d'une réaction antigène (Ag) – anticorps (Ac)
• Complexe formé rendu visible par un marqueur
– Localisation
– Quantification
• Système révélateur : chromogène, fluorochrome (immunofluorescence)
Immunohistochimie
Antigène cible
Anticorps primaire
Ac secondaire couplé
Substrat
• Méthode indirecte :
Sur une coupe tissulaire ou lame de cytologie
Appliquer un anticorps primaire spécifique de la ciblePuis un anticorps secondaire couplé à une enzyme, à laquelle on fournit un substrat Le produit coloré de la réaction enzymatique apparait au niveau du complexe Ag-Ac si la liaison a eu lieu
Immunohistochimie
Antigène cible
Anticorps primaire
Ac secondaire couplé
Substrat
Antigène: cytokératine 7 Antigène: TTF-1
Marqueur épithélial Marqueur pulmonaire
• Intérêt diagnostique : classification d’une tumeur (épithéliale, lymphoïde, conjonctive….)
• Mise en évidence d’un agent infectieux : CMV, herpès.. • Mettre en évidence une sécrétion• Détection de molécules ayant une importance pronostique (Ki-67)• Intérêt thérapeutique : recherche d’une cible : recherche de
récepteurs aux oestrogènes, protéine HER2 dans les cancers du sein….
Immunohistochimie : applications
Cancer du sein:IHC HER2Surexpression du récepteur membranaire
Indication d’un traitement par trastuzumab
Immunohistochimie : applications
Immunohistochimie : applications
Lésion inflammatoire colique chez un greffé
Immunohistochimie : applications
IHC anti-CMV (cytomégalovirus)Positive
Diagnostic: Colite à CMV
Prélèvements tissulaires
• Prise en charge d’un prélèvement: du tissu à la lame….
Technique standard:FixationMacroscopieInclusion en paraffineCoupeColoration HES
Analyse au microscope optiqueTechniques complémentaires (spéciales)
ColorationsImmunohistochimieBiologie moléculaire « in situ »
• Hybridation in situ (HIS) ou In situ Hybridization (ISH)
• But: mise en évidence et localisation sur coupes tissulaires ou étalements cellulaires, de séquences connues d’ARN ou ADN
• Par des sondes d’acides nucléiques complémentaires le plus souvent couplées à une enzyme ou un fluorochrome (Fluorescent ISH, nécessite un microscope à fluorescence +++)
• Fait appel aux propriétés de la molécule d'ADNpossibilité de la dénaturer (séparation des 2 brins)tendance a se réassocier avec complémentarité des bases
Techniques de biologie moléculaire in situ
Techniques de biologie moléculaire in situ
• Localisation de l’expression d’un gène dans un tissu (quelles cellules ?)
• Mise en évidence de l’amplification d’un gène
• Mise de la perte d’un gène
• Mise en évidence de la cassure d’un gène (translocation protéine chimérique)
Cancer du sein:FISH gène HER2Amplification du gène (marqué en rouge) par rapport au centromère du chr17 en vert
Indication d’un traitement par trastuzumab
• Anatomie pathologique = discipline médicale
• Etudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules
• Lésions analysées en intégrant la connaissance de la clinique +++ et de l’imagerie
• Interprétation et non mesure exacte
• Utilise des techniques principalement morphologiques en constante évolution (veille technologique ++)
• Aboutit à la rédaction d’un compte-rendu comportant:
– diagnostic / hypothèses diagnostiques,
– indications sur potentialité évolutive des lésions
– éléments permettant d'orienter le pronostic/le traitement
Anatomie pathologique
http://campus.cerimes.fr/anatomie-pathologique/Lien vers le texte
Ouvrage de référence