TUGAS TERSTRUKTURPEMULIAAN TANAMAN TOLERAN LINGKUNGAN RAWAN

Oleh:Gani Husni MA1L012150Sella WulandariA1L012151Adellyana R.F.A1L012154AldyEiZa

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS PERTANIANPURWOKERTO2015

I. ABSTRAKPada tahun 1996 Lin, X. H., Zhang, D. P., Xie, Y. F., Gao, H.P., and Zhang, Q. mengidentifikasi dan menggambarkan gen baru yang resisten terhadap hawar bakteri pada padi berdasarkan penanda RFLP.Hawar bakteri disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, yang merupakan penyakit yang paling serius menyerang pada tanaman padi di dunia. Sebelumnya telah diidentifikasi kultivar padi Zhachanglong yang berasal dari Yunnan, China yang resisten terhadap 10 strain X. oryzae pv. Oryzae. Kemudian ditaksir identitas gen pada Zhachanglong untuk diketahui letak kromosom dengan menggunakan RFLP. Ditemukan bahwa Zhachanglong yang resisten terhadap hawar bakteri dikendalikan oleh gen yang dominan yang tidak allelic terhadap XaI, Xa2, Xa4 atau Xa14. Gen yang baru tersebut dipautkan terhadap lokus Xa4, dengan frekuensi rekombinasi 13.34.5%. analisis RFLP menyatakan gen tersebut berada pada bagian terakir dan terpendek pada kromosm nomor 11 pada tautan, dan semuanya resisten terhadap hawar bakteri. Gen yang reristen terhadap hawar bakteri strain Xa22(t).

II. PENDAHULUAN

Hawar bakteri, disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, merupakan penyakit serius tanaman padi di seluruh dunia. Mengembangkan kultivar yang tahan umumnya dianggap cara yang paling efektif dan ekonomis untuk mengendalikan penyakit ini. Studi yang banyak dilakukan di beberapa negara telah mengidentifikasi adanya 18 gen resisten utama terhadap berbagai jenis patogen yang telah diberi nomor dari Xa1 ke Xa2l. Selain itu, ada beberapa gen yang korespondensi dengan gen dalam belum ditentukan.Upaya penelitian telah banyak diarahkan untuk dapat memanfaatkan gen ketahanan dalam program pemuliaan tanaman. Upaya penangkaran tersebut telah membuat sejumlah besar kultivar dan hibrida yang membawa berbagai gen resistensi terhadap hawar bakteri, memberikan perlindungan terhadap penyakit di banyak daerah penghasil beras di dunia. Namun, dalam sistem inang patogen lainnya banyak kultivar dengan gen resistensi yang baru menjadi rentan setelah beberapa tahun budidaya. Sebagai contoh, hampir semua gen yang telah digunakan di Cina telah rusak dan tidak lagi efektif karena munculnya tipe patogen baru. Dengan demikian, perlu adanya gen baru dalam upaya ketahanan yang diperlukan untuk memerangi hawar bakteri.Banyak digunakan untuk sumber gen ketahanan baru, termasuk kerabat liar tanaman tanaman dan plasma nutfah dari pusat keanekaragaman. Contoh baru secara relaif beras memperoleh resistensi penyakit liar gen Xa2l dari nasi, Oryza longistaminata yang menunjukkan berbagai perlawanan terhadap hawar bakteri. Gen yang telah resistensi terhadap penyakit banyak diambil dari sampel pusat keanekaragaman dan dimasukkan ke dalam program pemuliaan untuk sejumlah besar spesies tanaman.Provinsi Yunnan di barat daya Cina pada umumnya telah dianggap sebagai pusat asal serta pusat keanekaragaman budidaya tanaman padi di Asia, O. Sativa L. Dalam pencarian gen tahan yang baru terhadap hawar bakteri, Chen et all total sekitar 6.184 kultivar padi indegenous diseleksi dari Provinsi Yunnan dengan inokulasi setiap 10 X. oryzae pv. Oryzae yang tahan yang diperoleh dari China, Jepang, dan Filipina. Mereka menemukan 345 kultivar yang tahan setidaknya strains 1 dari 10. Satu kultivar japonica (O.sativa subsp. Japonica) , Zhachanglong, dipamerkan terhadap semua perlawanan 10 X.oryzae strain pv.oryzae diuji (YF Xie, XH Lin, DP Zhang, Y. Chen, dan G. Yu, data tidak dipublikasikan) menunjukkan harapan besar sebagai sumber baru perlawanan hawar bakteri untuk pengembangan kultivar padi.Penelitian yang dilaporkan dalam makalah ini dilakukan: (i) untuk mengkarakterisasi dasar genetik resistensi hawar bakteri di Zhachanglong; (ii) untuk menilai identitas gen baru dengan menguji allelism dengan dilaporkan sebelumnya bakteri gen resistensi hawar; dan (iii) untuk menentukan lokasi chmossomal gen ini.

III. BAHAN DAN METODEKultivar dan populasi untuk studi pengembangan dan pengujian alelDua segregasi populsi yang dibangun untuk menentukan bakteri yang resisten hawar. 1. Populasi F2 diperoleh dari persilangan antara Zhachanglong dan Zhenzhu Ai rentan terhadap semua strain X. oryzae pv oryzae. 2. Populasi hasil backcross (BC1F1) dari Zhachanglong/Zhenzhu Ai// Zhenzhu Ai.Tetua dari F1, F2, dan BC1F1 yang berada di kebun bibit Huazhong Agricultural University di Wuhan, China sejak 1992 terinfeksi hawar bakteri strain Pxo61 (X. oryzae pv. Oryzae yang berasal dari Filipina).Pengujian alel antara gen yang terdapat pada Zhachanglong telah dikarakterisasi sebelumnya, Zhachanglong disilangkan menghasilkan empat kultivar yang diketahui membawa gen yang resisten terhadap hawar bakteri. Kulivar tersebut yaitu Kogyoku yang membawa strain Xa1 (19); Tetep yang membawa Xa2 (19); IR26 yang membawa strain Xa4 (17); dan TNI yang membawa strain Xa14 (22). Tetua dari F1 dan F2 diinokulasi dengan strain X. oryzae pv oryzae untuk mengidentifikasi gen yang tahan.

Strain X. oryzae pv oryzae, persiapan inokulum, inikulasi dan penilaian keparahanJumlah total dari 17 strain X. oryzae pv oryzae yang digunakan, strain 72-67, HB17, JL691, Js49-6, Ks-6-6, LN42, LN44, OS75, dan strain ZJ173 yang berasal dari China (Q. Zhang and L. Zhu). Strain Pxo61, Pxo79, Pxo71, Pxo112, dan Pxo99 yang berasal dari Filipina (T.M.Mew), dan strain T7147, T7174, dan t7133 yang berasal dari jepang (T. Ogawa).Persiapan inokulum, setiap strain bakteri dibiakan pada medium agar dan diingkubasi pada suhu 300C selama 3 hari. suspensi kultur bakteri disterilkan dengan air dengan konsentrasi 6x108 sel/ml, pengukuran barium sulfat menggunakan turbidimeter.Bibit padi ditanam di kebun bibit selama 30 hari setelah penanaman. Jarak tanam 12 cm, dan jarak setiap baris 24 cm. Dalam percobaan, tetua dan populasi F1 telah direplikasi dua kali, dengan 10 tanaman per replikasi. Populasi F2 dan BC1F1 masing-masing diuji. Pada tahap mulai munculnya malai 40 hari setelah penanaman, lima sampai tujuah dari bagian daun yang teratas pada setiap tanaman diinokulsi dengan cara daun digunting dan diinokulasi dengan suspense bakteri.Penilaian keparahan untuk setiap dua tau tiga daun yang tidak terserang tiap tanaman diamati selama 14 hari setelah inokulasi. Tanaman yang resisten apabila rata-rata luka 3 cm, tanaman yang rentan memiliki lebar luka antara 3 dan 6 cm, serta 9 cm. dalam analisis dikombinasikan tanaman yang resisten dan yang agak resisten menjadi kelas resisten dan agak resisten.

Restriction Fragment length polymorphism (RFLP)Populasi antara Zhachanglong dan Zhenzhu Ai, diuji dengan mengunakan strain Pxo61, dengan menggunakan penggambaran populasi. Sampel DNA yang disiapkan dari jaringan daun segar dari pertanaman F2 dengan metode sebelumnya di kromosom. Sebagian besar resisten terbentuk dari percampuran dengan jumlah DNA yang sama dari 30 tanaman yang sangat resisten pada populasi F2 dari 300 tanaman., dan ketahan terbentuk dari percampuran DNA yang berasal dari 42 tanaman sangat tahan. Sampel DNA dari kedua tetua dan kedua bulk dipendekan dengan 6 enzim restriksi. (BamHI, Dral, EcoRI, HindIII, dan XbaI) dan diuji dengan RFLP menggunakan 99 fragmen klon (S.D. Tanksleys group) dan NIAR/STAFF. Ekstrak DNA, elektroforesis, dan hibridisasi mengikuti prosedur sebelumnya. Sampel dari 121 tanaman diperoleh secara acak dari populasi F2 yang sama diuji dengan penanda yang dihubungkan dengan gen resisten hawar bakteri, ditentukan dengan analisi bulk extreme. Lokasi gen resisten di tautan RFLP ditentukan oleh Mapmaker/Exp 3.0.

IV. HASIL DAN PEMBAHASANKeturunan dari Resisten Hawar Bakteri di ZhaochanglongSemua tanaman F1 dari persilangan antara cvs. Zhaochanglong dan Zhenhu Ai yang resisten terhadap patoghen strain P x 061. Segregasi dari resisten dan tanaman peka (Fig. 1) cocok dengan Rasio 3:1 pada populasi F2 (x2 = 0,86 ; P > 0,25) dan rasio 1:1 pada populasi BC1F1 (x2 = 0,86 ; P>0,25). Resisten hawar bakteri dari Zhaochanglong P x 061 dikontrol oleh sebuah gen yang dominan.

Tes AlelJika gen resisten di Zhaochanglong merupakan alel gen yang diketahui untuk resisten hawar bakteri, resisten tidak akan di segresi pada keturunannya, dan semua tanaman pada populasi F2 akan menjadi resisten. Disisi lain, jika alel gen ini bukan lah gen yang diketahui sebagai resisten hawar bakteri, tanaman pada populasi F2 akan bersegregasi, dan rasio segregasi akan bergantung pada keterkaitan 2 lokus ini.Seperti yang dapat dilihat pada Table 1, tidak ada dari gen yang diketahui termasuk dalam tes (Xa1, Xa2, Xa4 dan Xa14) merupakan alel untuk gen yang resisten dari Zhacanglong. Dan jelas pada Tabel 1. Bahwa ketiga (Xa1, Xa2 dan Xa14) dari keempat gen yang tersegregasi secara mandiri dari gen di Zhachanglong dan IR64 (Xa4) secara signifikan telah terlalu menyimpang dari yang diperkirakan dengan rasio 15:1 berdasarkan pada keturunan yang mandiri, hal ini menunjukkan bahwa gen pada Zhacanglong terkait pada lokus Xa4. Rekombinasi berulang dihitung dengan menggunakan metode maximum likehood (1) adalah sebsesar 13,3 + 4,5 %.Kemungkinan resistensi dari Zhachanglong untuk berbagai strain X. oryzae pv. oryzae adalah dikondisikan oleh lebih dari 1 gen, kita menginokulasikan 3-4 tanaman pada populasi F2 (Zhachanglong/Kogyoku, Zhachanglong/Tetep, dan Zhachanglong/TN1) dengan strain X. oryzae pv. oryzae kedua, JL691, yang memiliki perbedaan kisaran inang dari T71754 dan Pxo112. Sekitar 97, 97 dan 94% dari tanaman di 3 populasi, masing-masing menunjukan keseragaman resisten atau kerentanan pada semua strain yang diuji. Mungkin pula adanya semua kemungkinan eror pada saat percobaan 1 strain atau lainnya, hasil ini mengindikasi keresistensian dari Zhachanglong T7174, Pxo112 dan JL691 dikontrol oleh gen yang sama. Kita mengacu untuk resisten hawar bakteri dari Zhachanglong sebagai gen baru.

Identifikasi potensi daerah pada kromosom yang mengandung gen baru

Dari 99 kemungkinan RFLP yang digunakan pada studi ini, 35 terdeteksi polimorf antara kedua tetua (Zhachanglong dan Zhenzhu Ai). Ke-35 kemungkinan mewakili sekitar 855 cM (58%) dari peta keterkaitan RFLP. Rantai polimorf diselesaikan oleh 29 dari 35 kemungkinan yang ditampilkan memiliki kemiripan intensitas pada resisten dan bulks yang rentan, mengindikasi bahwa marker tidak terikat kepada lokus baru yang resisten. Sedangkan untuk RFLPs dideteksi oleh 6 kemungkinan tersisa (semua berasal dari kromosom 11, yang terdaftar pada (Table 3), rantai polimorf dari tetua rentan akan lebih intens daripada tetua resisten pada bulk rentan, menunjukan bahwa mereka terkait kepada gen resiten yang baru. Kita melihat keenam marker ini sebagai positif marker.

Menentukan peta lokasi dari gen baru dengan kerentanan tanaman tinggi

Frekuensi rekombinasi ( C ) antara marker positive dan lokus gen baru yang dihitung dengan formula yang diberikan Allard (1). Berpendapat bahwa 42 tanaman rentan adalah homozigot untuk alel resesif di lokus ini. Jarak antara marker ini (Table 3) sesuai dengan map yang diterbitkan. Lokasi analisis lokus gen baru berada di akhir kromosom 11, 7.1 cM dari R543, yang terletak pada lengan terpendek dari kromosom ini

Menentukan peta lokasi dari gen baru dengan populasi acakTotal dari 121 tanaman acak dari populasi F2 yangdiujikan dengan RFLPs dengan 6 positif narker. Sebuah analisis dengan program pemetaan juga menempatkan lokus gen baru di akhir lengan terpendek dari kromosom 11 (Fig.2 ) . lokasi kromosom ini berbeda dari dari semua gen yang sebelumnya diidentifikasi, termasuk beberapa map lokus pada kromosom yang sama (Fig.2). Dengan demikian, pemetaan dikonfirmasi bahwa gen pembawa dari Zhachanglong adalah gen baru untuk resisten hawar bakteri.Bagaimanapun, kromosom 11 hanyalah kromosom yang memiliki pemetaan di kedua ujungnya dengan telomere-associated sequences. Marker (R543) yang kita temukan paling dekat dengan gen baru yang terletaj hanya 1.9 cM dari telomere-associated sequence (TEL3) di RFLP peta keterkaitan, sedangkan gen baru terletak pada jarak >7.0cM dari R543. Ini menandakan bahwa lokus baru lebih distal dibandingkan marker telomere-associated sequence. Dengan demikian, lokasi kromosom relative dari gen baru dan TEL3 tetap harus diselesaikan. Bagaimanapun, ini sangat jelas bahwa gen baru ini berlokasi dekat dengan wilayah telomerik dari kromosom 11.Poin lainnya adalah efisiensi relative dari kelas rentan melawan populasi acak F2 pada penempatan gen resisten. Zhang et al. menjelaskan bahwa efisiensi dari penempatan kelas resesif adalah dua kali lebih tinggi dibandingkan populasi F2 acak per tanaman yang diujikan. Lalu, skor penyakit dari tanaman yang ekstrim memiliki reflek genotip yang lebih baik pada lokus resisten dibandingkan dengan skor menengah. Dengan demikian , kemungkinan 42 tanaman memiliki tingakt kerentanan tinggi, kenyataannya, informasi lebih lanjut untuk menentukan jarak lokasi antara marker RFLP dan lokus gen baru lebih dari 121 tanaman acak. Bagaimanapu, kami menyajikan hasil lokasi berdasarkan 121 tanaman acak karena tidak terdapat algorithm untuk konstruksi lokasi menggunakan data dari kelas resesif.Spektrum resesif dari gen baruMengevaluasi kegunaan potensi gen baru ini dalam perbaikan beras. Kami menguji ketahanan dari hachanglong dengan total 17 strains, mewakili jarak yang luas dari pathogen hawar bakteri, dari China, Jepang dan Filiphina. Kami juga memasukan cv. IRBB21, karier dari Xa21, dengan proses resisten broad spectrum. Kedua kultivar menunjukan resisten terhadap 16 dari 17 strain yang diinokulasikan (Table 2). Bagaimanapun, kedua kultivar memiliki perbedaan dalam resisren untuk kedua strain; IRBB21 rentan terhadap strain Jepang sedangkan Zhachanglong resisten terhadap strain China. Demikian, kedua gen baru ini memiliki resisten broad-spectrum dan mungkin sumber yang unggul dai resisten hawar bakteri untukperkembangan kultivar beras.Delapan belas gen untuk resisten hawar bakteri telah teridentifikasi, termasuk Xa21, yang sudah terisolasi oleh pemetaan berdasarkan klonning. Karena gen dari Zhachanglong berbeda dari semua gen yang diketahui melalui tes alel dan lokasi kromosom, kami menyebutkan bahwa gen baru ini sebagai Xa22.

KOMENTAR KELOMPOK