tuberkulose i allmennpraksis - beta.legeforeningen.no · genexpert: enkel prøvepreparering 2. add...
TRANSCRIPT
Tuberkulose i allmennpraksis
DNLF kurs Diakonhjemmet November 12 2015
Tone Tønjum
Avdeling for mikrobiologi
Mycobacterium tuberculosis og tuberkulose Oversikt
• Tuberkulose (TB) – Epidemiologi, klinikk,
patogenese
• M. tuberculosis-komplekset og NTM
• Diagnostikk – agens, resistens,
epidemiologi
• TB behandling
• Diagnostikk av vertsrespons ved TB
Mykobakteriediagnostikk -
OUS-RH
TB-utfordringen
De 22 mest TB-belastede land
1/3 av verdens befolkning er infisert med Mtb
Global TB insides Drug-resistant Mtb
1/3 av verdens befolkning er kolonisert med Mtb Data from WHO, 2014
TB-utfordringen
• WHO anslag for 2020:
– 1 milliard personer nylig infisert
– 200 millioner TB-tilfeller
– 35 millioner dødsfall
1.3 millioner dødsfall
8.6 million nye TB tilfeller
2.0 milliarder PPD+ individer
Den globale TB-sitasjonen!
TB-insidensen er nå fallende…!
Insidens-ratene fra
2010-11 faller i alle
deler av verden,
fallet var 0.5% i
Øst-Europa,
2.0% I Sørøst-Asia,
3.1% i Afrika, 3
.8% i Amerikas og
8.5% per år i Europa
7 Men: MDR- og –XDR-TB er økende…!!
TB i Norge • Jevn stigning i forekomst av tuberkulose i Norge, fra 201 tilfeller i
1996 til 405 tilfeller i 2014
• Insidensen blant norskfødte var i 2014 blant de laveste i verden,
på under ett tilfelle per 100 000 innbyggere
8
Årsaken til TB
Mycobacterium tuberculosis:
Medlem av Mtb-komplekset
Ikke-bevegelig og ikke-sporulerende
staver (1-10 μm i lengde, 0.2-0.6 μm i
bredde)
En aerob bakterie
Deler seg hver 16-20 time (svært
langsomtvoksende)
Klassifisert som Gram-positiv, men er
vanskelig å farge pga svært høyt lipid- og
mykolsyre-innhold i celleveggen
Siden MTB beholder visse farger selv
etter syrebehandling, kalles de syrefaste
bakterier
Tuberkulose kan forårsakes av andre medlemmer av
M. tuberculosis-komplekset enn Mtb
• Mycobacterium bovis
• Mycobacterium africanum
• Mycobacterium microti
• M. canettii: mindre virulent enn den klassiske
M. tuberculosis H37Rv
• M. caprae: en art som finnes primært hos spanske geiter, samt hos mennesker
• M. pinnipedii: gir TB hos marine vertsdyr
Tuberkulosens historie
• 1679, Sylvius identifiserte “tuberkelen” som
en konsistent og karakteristisk forandring i
lungene, og beskrev progresjonen til
abscesser og kaviteter
• 1720, Benjamin Marten foreslo en ny teori for
årsaken til TB - “vidunderlige bittesmå
levende skapninger”
Tuberkulosens historie
1882 Robert Koch
oppdaget en fargemetode
for å påvise
Mycobacterium
tuberculosis
mikroskopisk
1874 Armauer-Hansen:
Mycobacterium leprae
Tuberkulosens historie
• 1895, Roentgen oppdaget røntgenstråling/x-ray
• 1921, BCG vaksine
• 1944, streptomycin og para-aminosalicylic
acid (PAS) ble utviklet
• 1950-1960/70-tallet, isoniazid, rifampicin og
andre anti-TB medikamenter utviklet develped
• 1980 - HIV
• 1990-tallet - DOTS
Aerosolspredning fra pasient med TB
Aerosoldråpnene må ha riktig størrelse (1-5 um) for å nå alveolene
Tuberkulose – overføring av smitte
• Høy sittsomhet
• Luftveiene er hovedinnfallsport
• Oftest overført via luft pga hoste, nysing og tale
• Tre tusen aerosoldråper spres ved 1 host, 1 minutt sang og 5
minutters samtale
Klassiske symptomer lungetuberkulose utgjør 85% av tilfellene
• Langvarig hoste (over tre uker), etter
hvert med oppspytt
• Vekttap
• Nedsatt allmenntilstand
• Feber
• Nattesvette
• Sjeldnere symptomer er:
Brystsmerte, tung pust,
blodtilblandet oppspytt
Tuberkulose - klinikk
Ekstrapulmonal TB TB-lymfadenitt Hud-TB Potts sykdom
TB peritonitt
og lever-TB Intestinal TB
Tuberkulose - klinikk
Ekstrapulmonal TB
Meninger Extrapulmonal TB 15%
Hjerne Ryggmarg/Ryggsøyle
Binyre-TB
Testes TB
Tuberkulose - klinikk
Ekstrapulmonal TB TB endometritt Ovarie-TB
19
Vandal, O. H., et al. (2009). J. Bact.191:4714-4721 Pieters, J. (2008). Cell Host and Microbe 3:399-407
TB patogenese
Mycobacterium tuberculosis: patogenese og latens
FEMS Microbiology Reviews 36, 514-532, 2012
Tuberkulose – utfall av infeksjon
Faktorer som kan bidra til progresjon av
latent infeksjon til aktiv TB sykdom omfatter:
– Immunstatus
– HIV infeksjon
– Genetikk
– Miljøfaktorer
– Ernæring, alkohol
– Underliggende medisinske vertsforhold
– Bakterielle virulensfaktorer – lite kartlagt
Diagnostikk
Prøvetaking ved mistanke om TB
Rekvirer dir mikro, PCR og dyrkning
NB! Utfylling av rekvisisjon!
• Lungetuberkulose: Luftveisprøver
(larynksaspirat, ekspektorat, BAL): 3X
• Ekstrapulmonal TB:
– 6X uriner
– 10 ml spinalvæske
– Prøver fra lokale lokalisasjoner: glandler,
halscyster, biopsier, etc
http://www.fhi.no/publikasjoner-og-haandboker/tuberkuloseveilederen
Diagnostikk
Flyt-
skjema
TB: Den diagnostiske
utfordringen
• Mål: Høy sensitivitet og spesifisitet i
både direkte påvisning og dyrkning!
25
Klinisk prøvemateriale TB-lab Dekontaminasjon +/-
Kultur
BACTEC MGIT 960
0.8 ml Panta + 0.5 ml prøve
Tumor colli: + FOS 0.5 ml
Tumor colli/sår: + 30oC
Kultur pos:
Ring svar
Identifikasjon, MSIS
Direkte påvisning
- Mikroskopi: Auraminfarging
Auramin pos: Ring svar,
Mtb PCR, meld MSIS
- Mtb PCR for identifikasjon
PCR pos: Ring svar
- Mtb Rifampicinresistens/ rpoB,
RpoB pos/neg: Ring svar
Resistensbestemmelse
-Rifampicin-resistens (PCR sequencing rpoB)
Ring svar
- Kultur Mtb res.best. Ring svar
NB! Meld multiresistente stammer
(samtidig Rifampicin og Isoniazid resistens)
Direkte påvisning ved mikroskopi
• Auramin-farging
• Ziehl-Neelsen-farging
27
Direkte påvisning ved PCR:
Cobas TaqMan MTB Test
Sensitivitet Taqman:
Luftveisprøver: 98.9% (Direkte mikro neg: 98.1%)
Ekstrapulmonale prøver: 88.9% (Direkte mikro neg: 85.4%)
28
Rifampicin-resistens som
surrogat-markør for MDR- og XDR-Mtb
• RIF-resistens som mono-resistens er ikke
vanlig (5-15%)
• 80-95% av RIF-resistente stammer er også
resistente overfor INH
29
Genetikk ved Mtb rifampicin-resistens
30
GenXpert MTB/RIF:
direkte påvisning av Mtb og
rifampicin-resistens
Boehme et al NEJM 2010
Helb et al., JCM 48:29-237, 2010
Blakemore et al., JCM 48:2495-2501, 2010 31
GeneXpert: Enkel prøvepreparering
2. Add 1.5ml Sample
Reagent to 0.5ml deposit 3. Shake then
stand10 min.
1. Inoculate media and prepare
smear from deposit
5. Transfer the
2ml to cartridge
Begin Test…
4. Shake then stand
further 5 minutes
32
PAGE | 33
Molecular
Beacon
Target
Hybrid
GeneXpert MTB/RIF molecular beacon-testen
5 Probes bind to wildtype
Probes do not bind to mutant sequence
6 fluorescent dyes detected simultaneously
5’- 3’-
-3’ -5’
A
B
C D
E rpoB gene
33
Mtb GenXpert sensitivitet/spesifisitet
• Sensivity in smear positive, culture positive (S+C+) was 100%
(275/275)
• Sensitivity in smear negative, culture positive (S-C+) was
90.9% (70/77)
• Specificity of the assay was 98.3%
• Sensitivity observed for rifampicin resistance was 96.7%
• Specificity observed for rifampicin resistance was 98.6%
Smear
Positive
Culture
Positive
Culture
Negative
Culture
Positive
Xpert
Positive70 5 275
Xpert
Negative7 289 0
Smear negative
34
GenXpert TB/Rif
• Resultater like i alle geografiske områder
• Mulig begrensning: Elektrisitet tilgjengelig,
høy temperature
• Høyere sensitivitet enn mikroskopi
• Xpert MTB/RIF – kort opptrening ila 2-3 dager
– Ziehl-Neelsen opptrening tar 2 uker
• Xpert MTB/RIF – kort hands-on tid < 15 minutter
35
PAGE | 36
Xpert MTB/RIF: biosafety levels required
Ikke nødvendig med laboratorium med sikkerhetsbenk (CDC) 36
Dyrkning av mykobakterier Löwenstein-Jenssen fast
medium:eggeplommer m.m.
Høy kompleksitet
Deteksjon ved visuell
inspeksjon
BACTEC MGIT 960
medMiddlebrook liquid 7H9
medium
Deteksjon av fluorescence
ved
oksygenreduksjon/forbruk
BACTEC MGIT 960
• 1. Helautomatisert dyrkningssystem for
mykobakterier
• 2. Inkubering og påvisning/deteksjon i det
samme systemet
• 3. Gulvmodell med 3 skuffer med plass til 320
MGIT-rør i hver skuff. Total kapasitet 960 rør;
8000 kulturer hvert år
• 5. Fluorescens-basert teknologi: Oksygen
forbruk fluorescens
Resistensbestemmelse
Gjelder Mtb, sjelden NTM
Førstelinje-medikamenter:
Rifampicin, isoniazid, pyrazinamid,
etambutol, streptomycin – testes i TB rutinelab
Andrelinje-medikamenter:
Fluoroquinoloner, capreomycin,
kanamycin, amikacin, .. Bedaquiline..
Mer underveis.. – testes TB referanselab
Resistensbestemmelse
• Löwensten-
Jenssen’s medium
(LJ)
BACTEC MGIT
960
Økt deteksjon og hurtigere
vekst av mykobakterier ved
tilsetning av næringscocktail
Fastidious Organism Supplement (FOS)
0
10
20
30
40
50
60
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73
No supplements
Supplements added
Time
until
growth
Specimen no.
Supplements added
No supplements
1. 22.7% høyere sensitivitet og signifikant kortere tid
nødvendig for vekst av M. tuberculosis isolater når
cocktail-supplement tilsatt, økt sensitivitet 38% for NTM
2. 4-7 dager kortere dyrkningstid
TB-diagnostikk - utfordringer
• Oppdaterte metoder høy sensitivitet
og spesifisitet, også i direkte påvisning
• Optimal logistikk rask diagnostikk
• Hyppig telefonbeskjeder og foreløpig
elektronisk svar god og rask service
All antibiotikaresistens hos
mykobakterier skyldes
punktmutasjoner eller andre
endringer i kromosomale gener
Gener som kan kode for
Mtb resistensutvikling • Rifampicin: rpoB (RNA polymerase B subunit)
• Isoniazid: katG (katalase-peroxidase), inhA
(enoyl-acyl carrier protein reductase), aphC
(alkyl-hydroperoxide reductase), kasA (keto-acyl
synthase), ndh (NADH dehydrogenase), etc.
• Pyrazinamid: pncA(pyrazinamidase)
• Streptomycin: rpsL (S12), rrs (16S rDNA)
• Ethambutol: embB (arabinosyl transferase)
• Kinoloner: gyrA, gyrB (DNA gyraser)
• Flere..
TB molekulær epidemiologi
Metoder
• IS6110 Spoligotyping
• Minisatelitter: Variable Number Tandem
Repeats (VNTR)/ Mycobacterial
Interspersed Repetitive Units (MIRU)
• Multiple Locus VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats) Analysis (MLVA):
basert på polymorfi i tandem-repeterte
DNA sekvenser
IS6110-basert fingerprinting: Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP av
# IS6110-kopier i TB-genomer (0 - 25)
Mest diskriminerende metode
Tidkrevende metode (2-4 uker)
Vanskelig å sammenligne store datasett
PCR-RFLP Hemi-nested Inverse PCR (HIP) RAPD 1353
603
310
Spoligotyping: Spacer Oligonucleotide Typing
Direkte repeterte (DR) elementer 36bp, frekvens varierer
Bruker primere for DR til å amplifisere flankerende ikke-repetitive
spacer-sekvenser 34-41bp Identifiserer spacerne ved hybridisering
Mindre diskriminerende enn IS6110 typing … MEN...
Raskere å utføre, kortere turnaround time
Digitale resultater, muliggjør sammenligning fra stamme til stamme
Kan gjøres direkte, krever ikke kultur
Variable Number of Tandem Repeats
Measures variability in 6 (av 24) loci
Mycobacterial Interspersed Repetitive Units
Measures variability in 12 loci
Molekylær epidemiologi kan spore utbrudd:
Spoligotyping & MIRU-VNTR
IS 6110 RFLP
Current gold standard
MIRU-VNTR
Up to DR 24 loci in genome
Nye utfordringer innen TB
• Antibiotikaresistens: MDR XDR
• Immun-evasjon & tilpasning /
adaptasjon
• Økt virulens / overlevelse
M. tuberculosis genom-karakteristika
• 4,411,532 basepar
• 3,959 ORFs
• 90.80% ORFs encodes proteins
• G-C content of 65.6 %
• Relatively constant G-C content
• 1 rRNA operon
Cole et al., Nature 393, 537-44, 1998
Lineage 7; New lineage
Dance-academy outbreak;
Beijing strains
200 Mtb genomes, 43000 polymorphic sites
Mycobacterium tuberculosis
Genomsekvensering: short-term & long-term evolution
Tuberkulose - behandling
WHOs anbefaling:
– Kombinasjonsbehandling:
– Isoniazid
– Rifampicin
– Pyrazinamide
– evt ethambutol, streptomycin
NB! Direkte observert terapi!
Standard medikamentregime
ved tuberkulose
• Fortsettelsesfase
4 måneder
• Isoniazid; Rifampicin
• Intensivfase
2 måneder
• Isoniazid;
Rifampicin;
Pyrazinamid;
Etambutol
Standard medikamentregime
ved tuberkulose
Medikament
(Forkortelse)
Dosering
Daglig behandling
Dosering
Behandling 3x/uke
Isoniazid (H) 5 mg/kg* (Maks 300 mg ) 10–15 mg/kg (Maks 900 mg)
Rifampicin (R) 10 mg/kg (Maks 600 mg) 10 mg/kg (Maks 600 mg)
Pyrazinamid (Z) 25 mg/kg (Maks 2 g) 35 mg/kg (Maks 3 g)
Etambutol (E) 15 mg/kg** (Maks 1,6 g) 30 mg/kg (Maks 2,4 g )
Streptomycin (S) 15 mg/kg (Maks 1,0 g) 15 mg/kg (Maks 1,5 g)
Dosering: En gang daglig, evt til fettrikt måltid Evt supplere med pyridoksin 40 mg daglig, gis til pasienter i dårlig ernæringsstatus, gravide og
ammende og ved økt risiko for nevropati for å forebygge nevrologiske bivirkninger av isoniazid
TB behandling
Førstelinje-medikamenter:
Rifampicin, isoniazid, pyrazinamide,
ethambutol, streptomycin
Andrelinje-medikamenter:
Fluoroquinolonex, capreomycin,
kanamycin, amikacin, .. Bedaquiline..
Behov for flere..
Trussel: MDR-Mtb XDR Mtb
Tidspunkt Blodprøver Lungerøntgen/
skjermbilde Andre
tester
Tuberkulose-undersøkelse
av luftveisprøve
Ved behandlingsstart hemoglobin (Hb), leukocytter
(LPK), SR, CRP ASAT,
ALAT, bilirubin, urinsyre,
kreatinin, urinstoff, hivtest,
ev.hepatitt B og hepatitt C
Lungerøntgen(hvis
ikke nylig tatt), ev.
supplert med CT
thorax
direkte mikroskopi, PCR og
dyrkning
Etter 2 uker Hb, LPK, SR, CRP, ASAT,
ALAT, bilirubin, kreatinin,
urinstoff, trombocytter
direkte mikroskopi
Etter 2 måneder Hb, LPK, SR, CRP ASAT,
ALAT, bilirubin, kreatinin,
urinstoff, trombocytter
Lungerøntgen direkte mikroskopi og
dyrkning
Etter 4 måneder Hb, LPK, SR, CRP ASAT,
ALAT, bilirubin, kreatinin,
urinstoff, trombocytter
direkte mikroskopi og
dyrkning
Ved opphør av
behandling, vanligvis
etter 6 måneder
Hb, LPK, SR, CRP, ASAT,
ALAT, bilirubin, kreatinin,
urinstoff, trombocytter
Lungerøntgen direkte mikroskopi og
dyrkning
Prøver og undersøkelser som utføres ved
oppfølging av TB- behandling
Tuberkulintest: Mantoux
58
Mantoux-metoden med standard
Purified Protein Derivate:
PPD med styrke 2 tuberkulinenheter (TU)
Tuberkulinreaksjonen: intrakutan injeksjon
en typisk type IV-reaksjon =
forsinket hypersensitivitet /
cellemediert immunitet:
Makrofager og Th1-lymfocytter
Mantoux - avlesning
72 t - - 16-18 mm
59
Interferon gamma release assays (IGRA)
Tilgjengelige tester
Quantiferon TB Gold
(In Tube)-ELISA: Utføres ved alle regionale
mikrobiologiske laboratorier
ELISpot - Utføres ved referanselaboratoriet, FHI
Steps to T Cell Activation: T cells recognize antigen not in its natural form; rather the antigen is presented
by reference structures encoded by the major..T cell groups. Cell Host & Microbe, Volume 4, Issue 3, 2008, 219 - 228
TB Aktivering vs latens
Immunologisk hukommelse: Tidligere sensitiviserte celler
Immunologisk diagnostikk: Interferon Gamma Release Assay (IGRA)
Prinsipper
Presentasjon av myko antigen
PPD
Mantoux hudtest: måler indurasjon/erytem
In vitro blodtest: Måler IFNgamma-produksjon
IGRA Antigen: ESAT-6,
CFP-10. TB7.7
62
Immmunologiske prinsipper
TB IGRA
Mtb antigenene ESAT-6, CFP-10, and
TB7.7 finnes i:
• M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum
• 4 atypiske mykobakteriearter/NTM:
M. kansasii, M. szulgai, M. flavescens,
M. marinum
• Finnes ikke i BCG
Kilde: The Lancet, 2000
TB IGRA – Tester Source: Nature Clinical Practice Rheumatology (2007)
• QuantiFERON® TB-GOLD (QFT) måler nivået av frigjort IFN-g i
plasma med ELISA-teknikk (enzyme linked immunosorbent assay)
etter stimulering og inkubering av fullblod over natt. ESAT-6 og CFP-
10 er tilsatt direkte i bunnen av tapperøret. ELISA-prosedyren kan
gjøres neste dag, eller plasma kan lagres i rørene i opptil 8 uker på
kjøl eller 3 måneder i -20 °C frys før analyse analyse av OD-verdier
og kalkulering av resultater minus neg kontroll IU/ml verdien
IFN-gamma = 0.35 IU/ml anses som sannsynlig tuberkuloseinfeksjon
• T- SPOT-TB® er en ELISPOT basert test som detekterer IFN-g-
produserende T celler (spots) etter antigen-stimulering av et definert
antall mononucleære celler isolert fra blod. mer sensitiv enn
tuberkulintest og QFT for individer med immunsvikt, inkludert lavt CD4
tall. Stimulering av celler og inkubering over natt må gjøres samme
dag som prøven tas, og ELISPOT prosedyren må gjøres dagen etter.
Med T-Cell XtendTM kan imidlertid blodet transporteres eller lagres
ved romtemperatur i opptil 32 timer før celler isoleres og testen utføres
64
Quantiferon i praksis
• Spesielle prøvetakingsglass:
3 glass, 1 ml i hver
• Forbehandling av prøven
–Inkubering(37oC, 16-24t)
–Sentrifugeres før forsendelse
• Positiv og negativ kontroll
IGRA
Sensitivitet og spesifisitet
• Sensitivitet: 75-97%
• Spesifisitet: 90-100%
God ”spesifisitet”
Usikker sensitivitet, særlig i spesielle pasientgrupper:
• Små barn
• Pasienter med immunsvikt
• Mulig TB-smitte - lang tid tilbake
• Usikker negativ prediktiv verdi
Pai M. Expert Rev. Mol. Diagn. 2006; 6 (3), p 413-422
Pai M., Ann of Int Med 2008
Diagnostikk av latent
tuberkulose: Hvorfor? • Identifisere de som skal ha profylaktisk
behandling
• Reaktivering - viktigste årsak til ikke-
importert sykdom i områder med lav
forekomst av TB
• Ved positiv Mantoux for å utelukke falsk
positiv test
• Ved negativ Mantoux der mistanke om falsk
negativ test pga anergi
Når skal IGRA-tester anvendes?
• Mantoux er fortsatt første test
• Supplement til tuberkulin hudtest utført på
risikogrupper
• –Ved positiv tuberkulintest for å utelukke
falsk positiv test (NTM/BCG-vaksine)
• –Ved negativ tuberkulintest som mistenkes
å være falsk negativ på grunn av T celle-
anergi
• Pasienter som skal tilbys forebyggende
behandling dersom testen er positiv
Spesielle grupper
• Utredning av tuberkulosesmitte ved
svekket immunitet
– Små barn 0-5 år
– Immunsvekkede
– HIV
• Før oppstart immunosuppressiv
behandling
• Aktiv tuberkulose
• Helsearbeidere
• Asylsøkere
IGRA: Oppsummering
• Ingen gullstandard!
• Resultat må sees i sammenheng med:
• –Smitterisiko
• –Klinisk vurdering
• –Øvrig diagnostikk
• –Alder og generell immunstatus
• Nyttig hos definerte risikogrupper
• Best egnet i lavendemisk land med BCG
vaksinasjon
Behandling av latent TB
• Behandling bør tilbys med mindre det er
tungtveiende grunner for ikke å gjøre
det
• Behandling bør vurderes, men risiko for
bivirkninger må vurderes nøye
• Behandling er vanligvis ikke indisert,
med mindre det foreligger annen risiko
Stopp TB