truseq dna & rna サンプル調製の ベストプラク …...5...
TRANSCRIPT
© 2012 Illumina, Inc. All rights reserved.
Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium,
iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of
Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
TruSeq DNA & RNA サンプル調製の
ベストプラクティスとトラブルシューティング
渡辺 真子 (Masako Watanabe, PhD) テクニカルアプリケーションサイエンティスト
2
Outline
TruSeq DNA & RNA サンプル調製
• 成功へのベストプラクティス
• よくある問題のトラブルシューティング
3
次世代シーケンス (NGS) のためのTruSeq ライブラリー
4
ライブラリーの評価
qPCR を用いたTruSeq DNA ・ RNA ライブラリーの定量
- プライマーはイルミナシーケンシングライブラリーのアダプター末端に一致
Bioanalyzerを用いた品質の評価
5
ライブラリー調製のベストプラクティスとトラブルシューティング
TruSeq DNA
– ワークフロー
– インプットに用いるサンプル
– 断片化
– ゲルによるサイズセレクション
TruSeq RNA
– ワークフロー
– インプットに用いるサンプル
– 断片化
TruSeq DNA と RNAに共通すること
– 試薬の取り扱い
– サーマルサイクラ―の設定とキャリブレーション
– AMPure ビーズを用いた精製
– バイオアナライザートレースの評価
TruSeq DNA & RNA サポートツール (Illumina Website)
6
TruSeq DNA -ワークフロー
-インプットサンプル
-断片化
-ゲルによるサイズセレクション
7
TruSeq DNA ワークフロー
http://www.illumina.com/documents//products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf
Gel size selection
A. ゲノムDNA の断片化
B. End repair とリン酸化
C. A-tailing
D. Index adapter のligation
8
TruSeq DNA ライブラリー
Gel-free method for TruSeq Enrichment
Gel-method for whole-genome resequencing
9
べストプラクティス:
インプットサンプル, DNA
TruSeq DNA 1ug ゲノム DNA
定量 蛍光ベースの方法
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い
期待していないピークの検出
Nanodropなど紫外分光法による定量は推奨しておりません。
10
べストプラクティス:
インプットの品質, TruSeq DNA
純度 260/280nm比: 1.8-2.0
サイズの確認 ゲル電気泳動
ゲノムDNA のサイズの確認
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い
期待していないピークの検出 不正確なライブラリーサイズ
11
ベストプラクティス:
TruSeq DNA 断片化
断片化方法: Covaris
Covaris での断片化
(whole-genome resequencing)
12
断片化
気泡の混入
不正確なインプット
15 100 200 300 500 850 [bp]
[FU]
100
50
0
DNA インプット
– 品質
– 量
Covaris
– 気泡を防ぐ
– 脱気
– 水量
– ウォーターバスの温度 (6-8°C)
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い
不正確なライブラリーサイズ
改善策：既知のDNAでのcovaris の動作確認
Air これはどういう意味なのか？
気泡が含まれている場合
13
ベストプラクティス:
ゲルによるDNA のサイズセレクション
プロトコルに準じて実施して下さい。
サンプル毎に異なるレーン、またはゲルあたり1サンプルを流すことにより、 コンタミネーションを最小にして下さい。
サイズマーカー
– 推奨のプロメガ社製のマーカーをご使用下さい。
– DNA ラダーをオーバーロードしないようご注意下さい。 (load 3µl)
SyBr Gold Nucleic acid gel stainで前染色をしたゲルをご使用下さい。
400-500bp for
whole-genome
resequencing
14
正確なサイズセレクションのためには、SYBR Gold で前染色したゲルが必要
TruSeq DNA ゲルによるサイズセレクション– Part I
400-500 bpを選択
SYBR Gold, 前染色
470 bp
SYBR Gold, 後染色
400-500 bpを選択
360 bp
起こりうる問題：不正確なライブラリーサイズ
15
Life Technologies (Invitrogen) 社製 E-gels
ターゲットとしていないサイズを選択してしまう
TruSeq DNA ゲルによるサイズセレクション – Part II
ゲル電気泳動, 300-400 bp を選択
増幅前
340 bp
増幅後
270 bp
起こりうる問題：不正確なライブラリーサイズ
ここはどのような説明をすればよいか？
16
TruSeq RNA - ワークフロー
- インプットサンプル
- 断片化
17
TruSeq RNA ワークフロー
http://www.illumina.com/documents//products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf
18
最終産物 ~260bp
TruSeq RNA ライブラリー
Lower
Maker
Upper
Maker
Sample
Peak
Baseline
19
ベストプラクティス:
インプットサンプル, RNA
TruSeq RNA 0.1-4ug total RNA
定量 蛍光ベースの方法
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い 期待していないピークの検出
不正確なライブラリーサイズ
Nanodropなど紫外分光法による定量は推奨しておりません。
20
ベストプラクティス:
RNA Integrity (RIN ≥ 8)
From: Agilent’s Bioanalyzer Applications for Next-Gen Sequencing: Updates and Tips March 1, 2011
Human
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い
不正確なライブラリーサイズ
例：分解したサンプルを使用すると 、ライブラリー収量が低くなる。
21
ベストプラクティス:
RNA の断片化
二価陽イオンと温度 (94°C) によるRNA の断片化
不十分な断片化
– インプットRNA の量が多い
– 不正確な温度
起こりうる問題：ライブラリー収量が低い 不正確なライブラリーサイズ
不十分な断片化
22
TruSeq DNAとRNAに共通すること -試薬の取り扱い
-サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション
- AMPure ビーズを用いた精製
-バイオアナライザートレースの評価
23
ベストプラクティス:
試薬の取り扱い
A-テーリングミックス(ATL) とライゲーションミックス (LIG) は 粘性有
試薬を分注してマスターミックスの凍結融解を回避
ユーザーガイドにリストされた順序で試薬を添加
DNA RNA
- End Repair Mix
- A-Tailing Mix
- Ligation Mix
- PCR Master Mix
- First Strand Master Mix
- Second Strand Master Mix
- End Repair Mix
- A-Tailing Mix
- Ligation Mix
- PCR Master Mix
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い 期待していないピークの検出
24
ベストプラクティス:
サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション
加熱 有り 加熱 無し
A B
起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い
サーマルサイクラーのフタは
100ºC に加熱
– チューブのフタへの凝縮
– 酵素活性効率の低下
– 高い塩濃度
サーマルサイクラーのキャリブレーション
推奨の粘着シールを使用
25
Agencourt AMPure XP Beads を用いたDNA のサイズ選択
磁気ビーズを用いたDNA 精製法
ビーズ溶液:サンプル比に基づくサイズセレクション
あるサイズ以上の核酸をキャプチャー。
よりサイズの小さい核酸や夾雑物を除去。
Beads Double stranded DNA Enzymes, primers, adapters, etc.
サンプル ビーズの結合 分離 エタノール洗浄 溶出 別のチューブへ
マグネット
26
ベストプラクティス:
AMPure XP ビーズ
ビーズ – 室温
ビーズ をVortex で撹拌
推奨のプレートとマグネットスタンド(Ambion)
注意深いピペッティング
用時調製した80% Ethanolを使用
ドライアップ中は、プレートをマグネットスタンドに置いたままにしておく
エタノールが残ると以降のステップを阻害
magnetic stand
1 2
3 4
1) clear 2) partly
3) in suspension
4) no beads
起こりうる問題: ライブラリー収量が低い
期待していないピークの検出
27
TruSeq DNAとRNAに共通すること -試薬の取り扱い
-サーマルサイクラーのセッティングとキャリブレーション
-AMPure ビーズを用いた精製
-バイオアナライザートレースの評価
28
サイズが大きくブロードなピーク
AMPure ビーズの持ち込み
考えられる原因
– ビーズを用いた分離の際、異なるマグネットを使用
– ピペットを用いた溶出の際、ビーズのペレットを分散
– ライブラリーをマグネット上に推奨時間保持しない
ビーズの持ち込み マグネット上での保持を追加した後
改善策: マグネット上での保持時間の追加
29
ピークが混ざっている場合
Bioanalyzer Chipへのオーバーロード
High Sensitivity DNA 5-500pg/μl
DNA 1000 0.1-50ng/μl
改善策: サンプルの希釈
希釈してロード オーバーロード
30
約100bpのピークの検出
PCR プライマーダイマー
プライマーダイマー
考えられる原因
– AMPure ビーズ
– 低品質または少量のインプットサンプル
起こりうる問題: プライマーダイマーがフローセルに結合
改善策: AMPure XP ビーズ シーケンス
31
約120bp のピークの検出
アダプターダイマー
考えられる原因
– AMPure ビーズ
– 低品質または少量のインプットサンプル
– End Repair Mix または A-Tailing Mix の酵素の効率低下
– ゲルでのサイズセレクション
アダプター
起こりうる問題: アダプターがクラスターを形成
改善策: AMPure XP ビーズまたはゲル精製
32
サイズが大きいピーク
PCR アーティファクト
考えられる原因 : PCRプライマーの枯渇
– サイクル数の増加
– 過剰なインプットサンプル
起こりうる問題: 期待していないクラスター密度
改善策: qPCR 後にシーケンス
33
定量: 蛍光法
サンプルの質: ゲル(DNA) Bioanalyzer (RNA)
断片化: Covaris (DNA)
Fragmentation mix (RNA)
試薬: 粘性試薬の取り扱い
AMPure ビーズ: ベストプラクティスに準拠
ゲルによるサイズセレクション:
ゲル精製のプロトコルに準拠
PCR: PCRプライマーの枯渇を回避
サーマルサイクラ―の設定とキャリブレーション
ライブラリーのバリデーション :
qPCR と Bioanalyzer
TruSeq ベストプラクティス まとめ
プロトコルに準拠
34
ライブラリー トラブルシューティング まとめ
低収量
– インプットサンプル
– 断片化
– AMPure ビーズでの精製
– 試薬の取り扱い
– サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション
異なるライブラリーサイズ
期待していないピーク
– インプットサンプル
– 断片化
– AMPure ビーズでの精製
– ゲルでのサイズ選択
– PCR プライマーの枯渇
35
TruSeq DNA & RNAサンプル調製
サポートツール
36
For More Information Visit www.illumina.com – Support
37
38
39
40
References
TruSeq Sample Preparation Best Practices Guide
https://icom.illumina.com/download/summary/xDKeCXABrEa2bkONskKNAw
TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Support
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_lt_sample_prep_kit.ilmn
TruSeq DNA HT Sample Prep Kit Support
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_ht_sample_prep_kit.ilmn
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support
http://www.illumina.com/support/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v
2.ilmn
Illumina Adapter Sequences Letter
https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw
Sequencing Library qPCR Quantification Guide
https://icom.illumina.com/download/summary/mTte7HhpAEyCxBFbeMVqTw
