TROMBOSİT

AGREGASYONU

BİO. ÜMİT AKMAN

PRİMER HEMOSTAZ LABORATUVAR TESTLERİ

• TROMBOSİT SAYIMI– CBC VE PERİFERİK YAYMA (TROMBOSİTOPENİ OLMADIĞINDAN

EMİN OLUNMALI)• KANAMA ZAMANI

– IVY YÖNTEMİ– IN VITRO KANAMA ZAMANI (PFA-100 Platelet Function Analyzer)

• TROMBOSİT AGREGASYONU• AKIM SİTOMETRİ• ÖNEMLİ DİĞER TESTLER

– FİBRİNOJEN– vWF:Ag– vWF:Ris.Co.– vWF:CB– vWF Multimer Analizi

TROMBOSİT AGREGASYON YÖNTEMLERİ

• TURBİDİMETRİK (OPTİK) AGREGOMETRİ :

(BORN METHOD) BULANIKLIK FARKINA BAĞLI ÖLÇÜM

• İMPEDANS AGREGOMETRİ:

(ELEKTRİK RESİSTANSI, INGERMAN-WOJENSKI AND SILVER METHOD) ELEKTRİK AKIMINA KARŞI OLUŞAN DİRENCE BAĞLI ÖLÇÜM

• TROMBOSİT SAYIM YÖNTEMİ:

• FİBRİNOJEN BAĞLANMASININ TETKİK EDİLMESİ:

GP IIb/IIIa RESEPTÖRÜNÜN İŞARETLENMİŞ FİBRİNOJEN İLE BAĞLANMASININ RADIOIMMUNOASSAY YÖNTEMİ İLE ÖLÇÜLMESİ

GEREKLİ MALZEME VE MATERYALLER

• CİHAZ:– AGREGOMETRİ (Turbidimetrik Yöntem ör.CHRONO-LOG)– AÇILIR AYAKLI SANTRİFÜJ

• MİKRO PİPET (ör.HAMILTON)

• KARIŞTIRICI BALIK (STIR BAR) (TROMBOSİTLERİN SÜSPANSİYON HALİNDE KALMASINI SAĞLAR)

• KÜVET: – SLİKONİZE CAM TÜP VEYA PLASTİK TÜP

• KAN ALIM İÇİN SODYUM SİTRATLI TÜP veya TROMBİN İNHİBİTÖRLÜ TÜP

TÜP TÜRÜ

• SODYUM SİTRATLI TÜPKANDAKİ Ca2+ TUTALARAK PIHTILAŞMANIN DOĞAL OLARAK BAŞLAMASININ ÖNÜNE GEÇER (SİLKONİZE CAM VEYA PLASTİK TÜP) (4 ml)

• TROMBİN İNHİBİTÖRLÜ TÜP HİRUDİN İÇERİR. TROMBİNİ BAĞLAR.(3 ml)

a) KLİNİKLERDE ALINAN KANLARIN MAKUL SÜREDE LABORATUVARA ULAŞMASI,

b) KAN ALAN KİŞİLERİN TÜPLER ÜZERİNDEKİ İŞARET VE MİKTARLARA DİKKAT ETMESİ,

c) KAN ALINDIKTAN SONRA TÜPLERİN ÇALKALAMADAN ALT ÜST EDİLMESİ “BİR KAÇ KEZ”,

d) ÖZELLİKLE KLİNİKLERDEN GELEN KANLARDA PIHTI OLUP OLMADIĞINA DİKKAT EDİLMESİ GEREKMEKTEDİR.

• HASTA MÜMKÜNSE SON 10-14 GÜNDÜR HERHANGİ BİR İLAÇ KULLANMAMIŞ OLMALIDIR.İLAÇ KULLANIMINDA TEST İLAÇTAN ETKİLENEN TROMBOSİTLERİN SİSTEMDEN TEMİZLENMESİ VE YENİLERİNİN ÜRETİLMESİ İÇİN 10-14 GÜN ERTELENİR. (TROMBOSİT ÖMRÜ ORTALAMA 7-10 GÜN OLUP YAŞLANAN TROMBOSİTLER RETİKÜLOENDOTELYAL SİSTEM TARAFINDAN DOLAŞIMDAN TEMİZLENİR. )

• SABAH AÇ KARNINA KAN VERMELİDİR.YAĞLI GIDALAR (SÜT, KATI YAĞ vb) PLAZMANIN LİPEMİK OLMASINA NEDEN OLABİLİR.

HASTANIN UYMASI GEREKEN ŞARTLAR

SANTRİFÜJ

• AÇILIR AYAKLI SANTRİFÜJ KULLANILIR.

•PPP (TROMBOSİTTEN FAKİR PLAZMA)2500 g‘DE 7 DAKIKA SANTRİFÜJ EDİLİRREFERANS PLAZMA PPP’DE PLATELET SAYISI <10 BİN OLMALI

•PRP (TROMBOSİTTEN ZENGIN PLAZMA)

700 RCF’DE 7 DAKIKA SANTRİFÜJ EDİLİR. PRP’DE PLATELET SAYISI <100 BİN OLMAMALI

ÇALIŞMA• Cihaz çalışma yöntemine göre ayarlanır.• Trombositten fakir plazma (kör tüp) cihazın

referans kısmına yerleştirilir.Her hastanın kendi fakir plazması (referans plazması) kullanılmalıdır.

• Trombositten zengin plazma örneği pipetle sitratlı tüpten Buffy-coat’a en yakın bölümden 500 µl (her bir test için) alınır. (Alınan PRP içine kırmızı küre kontaminasyonu olmamalı.) Alınan örnek silikonize tüpe (küvet) konur.

• Hasta silikonize tüpteki PRP örneği cihazın inkübasyon alanında 3 dakika inkübe (37 0C) edilir.

• İnkübasyon sonunda silikonize tüpe karıştırıcı (stirr-bar) konur.

• Ölçüm alanına yerleştirilir.• Çalışmaya başlanır.

PRP

ADP 1 µl DÜŞÜK DOZ

3 µl YÜKSEK DOZ

500 µl

500 µl

2 µ M

6 µ M

EPİNEFRİN 0.5 µl 500 µl 10 µ M

COLLAGEN 0.5 µl (KAYNAK AT TENDONU)

500 µl 1 µg/mL

TROMBİN 50 µl 500 µl 1 Unit

ARACHIDONIC ACID

5 µl 500 µl 0.5 mM

RİSTOSETİN 5 µl YÜKSEK DOZ

2 µl DÜŞÜK DOZ

500 µl

500 µl

1.25 mg/mL

0.5 mg/mL

TEST ADI PİPETLENECEK

REAKTİFMİKTARI

PRP HACMİ FİNAL DERİŞİM

HANGİ TESTLERİ ÇALIŞABİLİRİZZ

AY

IF

AG

ONİS

TL

ER

GÜ

ÇL

Ü

AG

ONİS

TL

ER

Trombosit Fonksiyon Bozuklukları

• Trombosit adezyon bozuklukları:Bernard Soulier sendromu,GP Ib/IX Eksikliği• Trombosit aggregasyon bozuklukları:Glanzmann trombastenisi (GPIIb-IIIa eksikliği)• Sekresyon bozuklukları:“Release” bozuklukları ve granül bozukluklarıGri platelet sendromu• Plazma faktör eksikliklerine bağlı trombosit işlev

bozuklukları:von Willebrand Hastalığı, Afibrinojenemi

AGREGASYONREAKTİF ASPİRİN ETKİSİ VON WILLEBRAND

BERNARD SOULIER

SEKRESYON BOZUKLUĞU

GLANZMANN’S THROMBASTHENIA

ADP İKİNCİL DALGA İZLENMEZ

NORMAL İKİNCİL DALGA İZLENMEZ

İZLENMEZ

KOLLAJEN NORMAL,

AZALMIŞ

NORMAL NORMAL

AZALMIŞ

İZLENMEZ

EPINEFRIN İKİNCİL DALGA İZLENMEZ

NORMAL NORMAL

İKİNCİL DALGA İZLENMEZ

İZLENMEZ

RISTOSETIN NORMAL

AZALMIŞ

İZLENMEZ,

AZALMIŞ,

NORMAL HAFİF

ARTMIŞ TİP2B PSEUDOvWH

NORMAL AZALMIŞ,

NORMAL

TİP 2B VE PSEUDO vWH’DA RİSTOSETİNLE (DÜŞÜK DOZ) NORMAL VEYA YÜKSEK AGREGASYON CEVABI VERİRPSEUDO vWH’DA PLATELET YÜZEYİNDE GP I ANTİJENİ DEFEKTİ VARDIR. BU DEFEK BAĞLANMAYI ARTIRIRvWH TYPE 2B DE PLAZMADA BÜYÜK vWF MULTİMERLERİ YOKTUR.

TROMBOSİT FONKSİYON BOZUKLUKLARI

αααα-granül

ß-tromboglobulinPlatelet faktör 4

Platelet-derived Growth Factor

Fibrinojen

Faktör V

Gri platelet sendromu

Dense Granül

ADP

Lizozom

Hydrolase

Chédiak-

Higashi anomalisi

Hermansky-Pudlak

sendromu

Gri platelet sendromunda periferik yaymada trombositler hayalet gibi gri soluk renkte görülür.

TROMBOSİT AGREGASYON

IIIaIIbIIIaIIb

IIIaIIb

ADP

ADP

FibrinojenED

DD

Dense Granül

Gp IbvWF

Release Defects

Thrombasteni

Afibrinojenemi

COLLAGEN İLE AGREGASYON

Reaktif ekleme

Baseline

Trombositlerde şekil değişikliği

100

0

ZAMAN (Dak:sn)

a

b

Agregasyon

YÜ

ZD

E

c

a b c Agonist ile uyarılmayı takiben ilk anda trombositler diskoidyapıdan sferik forma dönüşür (şekil b). Bu sırada, agregometreturbiditede hafif bir artış kaydeder. Bu transformasyon trombositagregasyonu için şart değildir. Örneğin, epinefrin kaydedilebilenbir şekil değişikliğine neden olmadan agregasyon oluşturur

TROMBOSİT SFERIK FORM AKTİVE HALİ

FLOPODIAL UZANTILAR

TROMBOSİT DISKOID FORMİSTİRAHAT HALİ

Baseline

Reaktif ekleme

Trombositlerde şekil değişikliği

Sekonder Agregasyon(İkincil dalga)

ADP İLE AGREGASYON

Agregasyon plato

0

100

ZAMAN (Dak:sn)

YÜ

ZD

E

Agregasyonun ilk aşaması tersinebilirdir.Trombosit aktivasyonunu başlatan agonistler zayıf ve güçlü olarak sınıflanırlar. Güçlü agonistler (kollajen, trombin vb.) agregasyonun engellendiği şartlarda dahi (örn. Glanzman trombastenisi) granül sekresyonunu uyarabilirler. Zayıf agonistler (ADP, epinefrin vb.) ise yalnız başlarına granül sekresyonunu uyaramazlar; ancak agregasyonu uyarabilirler. Agregasyon neticesinde sekresyon gerçekleşebilir.

Baseline

Reaktif ekleme

RİSTOSETİN İLE AGREGASYON

YÜ

ZD

E100

0

ZAMAN (Dak:sn)

BİO. ÜMİT AKMAN

EPİNEFRİN İLE AGREGASYON

Baseline

Reaktif ekleme

Sekonder Agregasyon(İkincil dalga)

Agregasyon plato

100

0

ZAMAN (Dak:sn)

YÜ

ZD

E

Primer Agregasyon(birincil dalga)

BİO. ÜMİT AKMAN

Epinefrinle plateletlerde kaydedilebilen bir şekil değişikliğine neden olmadan agregasyon oluşur.

Baseline

Reaktif ekleme

ADP İLE AGREGASYON

SEKRESYON BOZUKLUĞU

DisagregasyonYÜ

ZD

E

100

0

Fibrinojen ile GPIIb/IIIa bağlanması başlangıçtatersinebilir bir reaksiyondur. Divalan iyonların ya daagonistlerin ortadan kalkması ile fibrinojen reseptöründenayrılabilir. Trombosit sekresyonunu uyaramayacak kadardüşük konsantrasyonda ADP veya epinefrin kullanılarakya da sekresyon bozukluğu olan trombositlerleagregasyon incelendiğinde küçük bir agregasyon dalgasıortaya çıktığı, ancak agregasyonu amplifiye edecekyoğun ve α granül içerikleri salınamadığından dolayıtrombositlerin fibrinojen moleküllerinden ayrılarakçözündükleri (= disagregasyon) izlenir.

NORMAL AGREGASYON

2 µM ADP İLE SEKONDERAGREGASYONİZLENMEMİŞTİR.

6 µM ADP İLE AGREGASYONİZLENMİŞTİR.

‘Release Defects’

2 ve 6 µM ADP İLESEKONDER AGREGASYONİZLENMEMİŞTİR.‘Storege Pool Deficiency’

SEKRESYON BOZUKLUĞU

RİSTOSETİNLE BOZUK AGREGASYON

(VON WILLEBRAND HASTALIĞI – BERNARD SOULIER SENDROMU)

VWF eksikliğine bağlı olarak gelişen vWH hem primer hem de sekonder hemostaz bozukluğuna neden olur.

Bernard Soulier Sendromunda trombosit sayısı düşük, trombositler iri (MPV yüksek) olur. Bernard Soulier: Flow sitometrik olarak cd42 (GP Ib/IX) özelliği saptanabilir.

BERNARD SOULIER ve vWH MIX TESTİ

HASTA TROMBOSİT

NORMAL PLAZMA

VEYA KRİYOPRESİPİTAT

MİX HAZIRLAMA

HAZIRLANAN MIX PLAZMA RİSTESETİN REAKTİFİYLE ÇALIŞILIR

RİSTOSEİNLE NORMAL AGREGASYON İZLENİRSE vWH

RİSTOSETİNLE NORMAL AGREGAYON İZLENMEZ İSE BERNARD SOULIER’DİR

PSEUDO vWH ve 2B vWH MIX TESTİ

NORMAL TROMBOSİT

HASTA PLAZMA

HASTA TROMBOSİT

NORMAL PLAZMA

MİX HAZIRLAMA

DÜŞÜK DOZ (0,5 mg/ml) RİSTOSETİNLE AGREGASYON İZLENİR

TİP 2B

DÜŞÜK DOZ RİSTOSETİNLE AGREGASYON İZLENİR

Reaktif eklenmeden Kriyoprespitat eklendiğinde de agregasyon izlenir.

PSEUDO vWF

1 2

KOLLAJENLE60 SANİYEDEN UZUN LAG FAZI

KOLLAJENLE UZAMIŞ LAG FAZI

KOLLAJENLE UZAMIŞ LAG FAZI TROMBOSİT FONKSİYON BOZUKLUĞUNU İŞARET EDER

GLANZMANN TROMBASTENİSİ

2 – 6 µM ADP İLE AGREGASYON

ADP ve EPİNEFRİN İLE AGREGASYON

GP IIb/IIIa eksik veya hatalıdır.Bu hastalıkta antikoagülansız yapılan periferik yaymada trombositlerin küme yapmadığı ve dağınık durdukları gözlemlenir. Flow sitometride CD41 ve CD61 eksikliği saptanabilir.

GLANZMANN TROMBASTENİSİ

RİSTOSETİN İLE AGREGASYON

KOLLAJEN İLE AGREGASYON

GP IIb / IIIa fibrinojen reseptörü eksikliğinde trombosit agregasyonu gerçekleşmez. Glanzman trombastenisi ristosetinle agregasyon gözlenenir ki aslında aglütinasyondur vWF köprüleri aracılığıyla trombositlerin yan yana gelmeleridir.

GLANZMANN TROMBASTENİSİGP IIb/IIIa İNHİBİTÖR TESBİTİ

NORMAL TROMBOSİT

HASTA PLAZMA

NORMAL TROMBOSİT

NORMAL PLAZMA

KONTROLHASTA

MİX HAZIRLAMA

•MIX HAZIRLANIR

•30 DAKİKA İNKÜBASYON

•HASTA VE KONTROL MIX TROMBİN VE/VEYA KOLLAJENLE ÖLÇÜM

GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ POZİTİF

HASTA PLAZMA+ NORMAL TROMBOSİT

NORMAL TROMBOSİT+ NORMAL PLAZMA

GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ POZİTİF

NORMAL TROMBOSİT+ NORMAL PLAZMA

HASTA PLAZMA+ NORMAL TROMBOSİT

GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ NEGATİF

HASTA SAYISI YÜZDE (%)

SEKRESYON BOZUKLUĞU 113 18,3

VON WILLEBRAND

HASTALIĞI 68 11

GLANZMANN’S THROMBASTHENIA 48 7,8

BERNARD SOULIER 7 1,1

NORMAL 383 62

TOPLAM 617 100

2001-2005 YILLARI ARASINDA TOPLAM 617 HASTA ÇALIŞILMIŞTIR

DISTRIBUTION OF PLATELET AGGREGATION TESTS RESULTS IN A REFERENCE LABORATORY

1Yahya Büyükaşık, 2Zelal Adıbelli, 1Nihan Erarslan, 1Nilgün Sayınalp, 1Ebru Koca, 1Deniz Çetiner, 1Salih Aksu, 1Hakan Göker, 1İbrahim C. Haznedaroğlu, 1Şerafettin Kirazlı, 1Osman I. Özcebe1 Hacettepe University, Department of Internal Medicine, Division of Hematology, 2 Hacettepe University, Department of Internal Medicine, Ankara, TURKEY

• TROMBOSİT SAYISIPRP >100 BİN OLMALI BU SEBEPTEN HASTA TROMBOSİT SAYISI >50 BİN OLMALI (TAM KAN SAYIMI VE PERİFERİK YAYMA)

• KAN ALIMKAN ANTİKOAGÜLAN OLARAK %3.2 - %3.8 LİK TRİSODYUM SİTRATLI (9 KISIM KAN + 1 KISIM SİTRAT) TÜPLERE ALINMALI, TÜP PLASTİK VEYA CAM TÜP İSE SİLİKONİZE OLMALIPIHTILI, AŞIRI LİPEMİK VEYA AŞIRI HEMOLİZLİ OLMAMALI

• LABORATUVARA ULAŞMA VE ÇALIŞMA ZAMANI– TEST 30 DAKİKA İLE 3 SAAT İÇERİSİNDE ÇALIŞILMALI– ALINAN KAN SOĞUK ORTAM İLE TEMAS ETMEMELİDİR.

KAN ALINDIKTAN SONRA KAPAĞI AÇILMADAN ODA SICAKLIĞINDA (240-270C) BEKLETİLEBİLİR.

• HASTAYA BAĞLI SEBEPLER– İLAÇ KULLANIMI

DENEYSEL HATAYA SEBEP OLAN NEDENLER

TROMBOSİTLERİ ETKİLEYEN İLAÇLAR

ANTİBİYOTİKLER

Penicillins, cephalosporins, nitrofurantion, miconazole

KEMOTERAPÖTİK AJANLAR

Mithramycin, daunorubicin, BCNU

THIENOPYRIDINES

Ticlopidine, cloidogrel (P2Y12 inhibe eder)

ÇEŞİTLİ İLAÇLAR

Serotonin antagonists, antihistamines, radiographix contrast drugs,

GP IIb/IIIa ANTOGONİSTLERİ

Abciximab, tirofiban, eptifibatide

PSİKOTROPİK İLAÇLAR

Imiprimine, amitriptyline, nortrypaline, chlorpromazine, flufenazine, trifluoperazine, haloperidol

PLATELET cAMP SEVİYESİNİ DEĞİŞTİREN İLAÇLAR

Prostacyclin, iloprost, dipyridamole, Cilostazol

ANESTEZİK İLAÇLAR

Dibucaine, tetracaine, metycaine, cyclaine, butacaine, nepercaine, procaine, cocaine, plaquenil, halothane

ANTİKOAGÜLANLAR ve FİBRİNOLİTİK AJANLAR

Heparin, streptolinase, tissue plasminogenactivator,urokinase, e-aminocaproic acid

KARDİYOVASKÜLER İLAÇLAR

Nitroglycerin, isosorbide dinitrate, propranolol, nitroprusside, nifedipine, verapamil, diltiazem, quinidine

SUNUMA KATKILARIDAN DOLAYI

PROF. DR. YAHYA BÜYÜKAŞIK

HOCAMIZA TEŞEKÜRLERİMİ SUNUYORUM.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ HASTANELERİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI HEMATOLOJİ BİLİM DALIBİO. ÜMİT AKMAN