ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--------------------------------

Vũ Thị Hoa Phƣợng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG

TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY

(Solanum tuberosum L.)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

Công trình được hoàn thành tại:

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Quỳnh Mai

Phản biện 1: TS. Lê Thị Nguyên Bình

Phản biện 2: TS. Phạm Thị Lý Thu

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại:

Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên.

Vào hồi 14 giờ 00 ngày 3 tháng 2 năm 2016.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là thành phần quan trọng trong hệ

thống lương thực thế giới (FAO). Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây tập

trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ nhỏ và một số bệnh cây

hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại cây này

trước các điều kiện phi sinh học. Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây (Solanum

tuberosum L.)”.

Các nghiên cứu trong luận văn này nằm trong đề tài “Nghiên cứu các mối

liên quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ

cao, hạn hán, độ mặn cao” được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc

gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14.

Các mục tiêu được đặt ra cho đề tài như sau:

- Đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây giống.

- Xác định cường độ hạn trong giai đoạn tập chống chịu cho hiệu quả

nâng cao khả năng chống chịu hạn của khoai tây.

- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng proline, một chất điều hòa thẩm thấu

trong tế bào được coi là chỉ thị cho quá trình đáp ứng bất lợi về áp suất thẩm

thấu của thực vật, ở cây khoai tây đã qua tập chống chịu hạn.

- Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây tương đồng

với các gen liên quan đến khả năng đáp ứng với hạn ở A. thaliana.

2

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về khoai tây

1.1.1. Nguồn gốc lịch sử

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ

cà, có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao

2000-5000m.

1.1.2. Phân loại học

Phân loại học của khoai tây trong hệ thống học thực vật (USDA, NRCS,

2010):

Giới: Plantae (plants)

Ngành: Magnoliophyta (flowering plants)

Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)

Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Chi: Solanum L.

Loài: Solanum tuberosum L.

1.1.3. Đặc điểm của cây khoai tây

Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ. Lá khoai tây là

lá kép lông chim, không đối xứng. Hoa khoai tây mọc thành chùm, là hoa lưỡng

tính. Khoai tây là cây tự thụ phấn nhưng cũng có trường hợp giao phấn. Sau

thời kỳ ra hoa, một vài loài kết quả.

1.1.4. Vai trò của khoai tây

Khoai tây là thực phẩm cung cấp năng lượng và là nguồn dinh dưỡng có

giá trị. Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát

triển sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc. Bên cạnh đó, khoai tây còn

được dùng nhiều trong công nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit

xitric; các dung môi hữu cơ như ethanol, butanol, xeton, …

1.2. Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trƣớc điều kiện hạn

Ngày nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, hiện tượng hạn, mặn, úng, nóng,

lạnh, … (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ra ngày càng

3

nhiều. Trong đó, hạn là một trong các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới

sinh trưởng và năng suất cây trồng.

1.2.1. Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn

Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền,

thể hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý.

1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước

Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là

ngừng sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng xảy ra ở chồi, ở rễ. Trong điều kiện

hạn, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng trong điều kiện

bình thường được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các chất điều chỉnh

thẩm thấu.

Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp

Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA. Sự hạn chế carbon

dioxide do kéo dài thời gian đóng khí khổng dẫn đến sự tích lũy các hợp chất

làm giảm khả năng vận chuyển electron, làm giảm các phân tử oxy và tăng

cường các dạng ROS. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu

trúc và cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn

đến sai hỏng hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào.

Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào

Trong điều kiện hạn, các quá trình mà chúng sửa dụng sản phẩm của hô

hấp bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng cường hô hấp.

Ảnh hưởng của hạn đến hormone

Khi thiếu nước, ABA được tổng hợp ở rễ và vận chuyển lên lá làm khí

khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng của thực vật. Bên cạnh sự tăng

cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật

chống chịu với hạn. Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin và gibberellin nội

sinh cũng đã xảy ra ở lá ngô để đối phó với hạn. Bên cạnh đó, hàm lượng và

khả năng hoạt động của cytokinin cũng giảm trong điều kiện hạn.

Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật

chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học.

4

1.2.3. Đáp ứng hạn của thực vật

Thực vật đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường:

phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. Các tín hiệu được dẫn truyền đến

nhân gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố phiên mã. Các

yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến tính

chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất đi khi điều kiện bất lợi mất đi.

1.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng hạn đến khoai tây

Hạn thường tác động mạnh ở 3 giai đoạn: sinh trưởng sinh dưỡng, phình

to củ và chín.Đã có những nghiên cứu chứng minh sự đáp ứng hạn của khoai tây

có liên quan đến biểu hiện gen. Khoai tây tăng cường biểu hiện gen StMYB1R-1

cho khả năng chống chịu cao với hạn mà đồng thời lại không ảnh hưởng tới các

tính trạng nông học khác. Trong điều hiện hạn khoai tây tăng cường biểu hiện

của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã họ NAC.

1.4. Tính tập chống chịu của thực vật

Khả năng tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trường

của thực vật cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với các điều kiện bất

lợi ở ngưỡng lớn sau giai đoạn được tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng

nhỏ và vừa.

Hình 1.3. Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp

ứng tập chống chịu

5

Cơ chế tập chống chịu được biết đến bao gồm cơ chế nhận tín hiệu từ các

biểu hiện bất lợi từ môi trường, tiếp đến là quá trình truyền tín hiệu đó từ “cảm

biến” vào nhân. Trong nhân, một số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại

với yếu tố bất lợi sẽ được hoạt hóa và các protein được biểu hiện các đáp ứng

thích hợp (Hình 1.3). Các đáp ứng đó sẽ đảm bảo tái lập cân bằng nội môi trong

tế bào, bảo vệ chức năng màng sinh chất và protein nhằm chống chịu lại điều

kiện bất lợi. Rất nhiều gen được hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân bằng trao

đổi nước và các ion của tế bào, bảo vệ chức năng các chaperone, giảm oxi hóa

và bảo vệ áp suất thẩm thấu. Riêng trong cơ chế cân bằng thẩm thấu của mô, tế

bào, các cây có xu hướng tăng sinh proline và một số loại đường như galactinol,

glucose, fructose, sucrose, raffinose những chất này được biết đến là các chất

bảo vệ thẩm thấu khi thực vật cần chống lại những bất lợi từ môi trường. Những

hoạt động đáp ứng qua gen biểu hiện như thế của thực vật đa phần được điều

hòa qua các yếu tố phiên mã.

Các cơ chế liên quan đến quá trình đáp ứng của thực vật với các yếu tố

bất lợi từ môi trường từ lâu đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu về sinh

học nói chung và thực vật nói riêng [21]. Đề tài “Nghiên cứu tính tập chống

chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.)” được thực hiện theo định

hướng đó và mong muốn góp phần tìm hiểu thêm về sức sống của thực vật

trong các biến đổi của môi trường.

6

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn được tiến hành trên cây khoai tây có

nguồn gốc từ hạt, giống HH7.

2.1.2. Hóa chất

2.1.3. Thiết bị

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu

Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng và được gieo trên môi trường

khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l

agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau. Các nồng độ sorbitol sử dụng là: 0

mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM. Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các

hạt nảy mầm trên môi trường có bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn

tập chống chịu.

2.2.2. Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý

Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang

2 lá chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy

mầm và cao hơn (Hình 2.2).

Hình 2.2. Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu

7

Sau 4 - 6 tuần, tiến hành đánh giá khả năng tập chống chịu bằng cách so

sánh giữa mẫu đã qua tập chống chịu và mẫu chưa qua tập chống chịu trong

từng nhóm TN, thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá,

số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl. và hàm lượng proline.

Hệ số nhân chồi

Hệ số nhân chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢

𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔

Chiều cao chồi

Chiều cao chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐á𝑐 𝑐ℎồ𝑖

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢 (cm)

Số lá

Số lá = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑙á

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖

Số rễ

Số rễ trung bình=Tổng số rễ

Số chồi ch ính

Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

Trọng lượng tươi = Tổng trọng lượng tươi của các mẫu

Tổng số mẫu

Trọng lượng khô = Tổng trọng lượng kh ô của các mẫu

Tổng số mẫu

2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll

Hàm lượng Chl. được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J.

Porra [60]. Hàm lượng Chl. được tính toán theo công thức:

Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng

Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu

Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu

(Bates và cs., 1973). Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so

sánh với đường chuẩn.

8

Hình 2.3. Đường chuẩn proline

Công thức xác định nồng độ proline là:

x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM)

Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức:

Hàm lượng proline (µg/mg) = 𝑋∗𝑉∗𝐻𝑆𝑃𝐿

𝑚

Trong đó:

x: nồng độ proline (mM)

V: thể tích dịch chiết proline

(ml)

HSPL: hệ số pha loãng

m: khối lượng mẫu tươi

(mg)

2.2.5. Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai

tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng

tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana

Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy

mô, hàm lượng Chl. và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50

mM mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7. Tiến

hành xác định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con

khoai tây thu được từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và

môi trường không có sorbitol ( mẫu ĐC).

y = 0.007x - 0.001

R² = 0.993

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 20 40 60 80 100 120

Độ h

ấp

th

ụ ở

520 n

m

Nồng độ proline (mM)

A520

Linear (A520)

9

2.2.5.1.Thu mẫu

Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi

trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol.

Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120h.

2.2.5.2.Tách RNA tổng số

RNA tổng số được tách bằng TRIzol. RNA trong pha nước được hút ra

sau đó tủa bằng isopropanol và NaCl 2M, li tâm và rửa lại bằng ethalnol 70%

và sau đó thu hồi RNA tinh khiết.

2.2.5.3.Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số

RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Hàm

lượng RNA tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ định lượng và chất

lượng được đánh giá sơ bộ qua đường cong hấp thụ. Các mẫu RNA có giá trị

A260/280 trong khoảng 2,0 và giá trị A260/230 > 1,8 là những mẫu RNA đạt tiêu

chuẩn.

2.2.5.4.Xử lý DNA

Để đảm bảo không còn lẫn DNA hệ gen trong cDNA sau này, mẫu được

xử lý bằng DNAse.

2.2.5.5.Tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp theo bộ kit The Thermo Scientific RevertAid First

Strand cDNA Synthesis Kit.

2.2.5.6.Kiểm tra chất lượng cDNA

Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng qPCR. Cặp mồi được sử dụng để

kiểm tra chất lượng cDNA là cặp mồi GAPDH 3’ (G3) và GAPDH 5’ (G5).

2.2.5.7.Chọn gen đích

2.2.5.8.Thiết kế mồi

2.2.5.9.Xác định tương quan mức độ biểu hiện

Gen tham chiếu và gen đích đã chọn được tiến hành qPCR với các cặp

mồi tương ứng.

2.2.5.10. Xử lý số liệu

Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt

của Livak và cs 2001 để xác định tương quan

mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và mẫu ĐC.

10

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà

7

Kết quả cho thấy giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ rệt

của điều kiện hạn. Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng

(Hình 3.1).

Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên

môi trường có bổ sung sorbitol

11

Hình 3.2. Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt

Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy các cây con

trong môi trường có nồng độ sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân

ngắn hơn (hình 3.2).

3.2. Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu

3.2.1. Hệ số nhân chồi

Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng

cao trong môi trường nuôi cấy. Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển

sang các môi trường có nồng độ sorbitol tăng có hệ số nhân chồi giảm dần. Các

mẫu đã qua tập chống chịu không thể hiện khả năng nhân chồi trong nuôi cấy

khi được chuyển sang các môi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo hoặc

nâng cao mức hạn.

12

Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng

độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

3.2.2. Chiều cao chồi

Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

Ở những mẫu chưa qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu

ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng sorbitol trong môi trường. Những mẫu đã qua tập

0

1

2

3

4

5

6

7

Hệ

số n

hân

ch

ồi

(lần

)

Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)

4 tuần

6 tuần

0

2

4

6

8

10

12

Ch

iều

cao c

hồi

tru

ng b

ình

(cm

)

Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)

4 tuần

6 tuần

13

chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không thể hiện rõ sự phát triển

về chiều cao chồi. Nhìn chung có thể nhận thấy các công thức TN có hệ số nhân

tương đối cao thì chiều cao chồi thấp và ngược lại. Điều này thể hiện sinh khối

của mẫu in vitro có những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn. Việc đánh giá

khối lượng mẫu sẽ cho thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây

trong điều kiện hạn nhân tạo.

3.2.3. Số lá

Trong môi trường không có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị

thấp nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5). Ở những mẫu đã qua tập chống

chịu, trong các công thức 50-50, 100-100, 100-200 và 200-200, cho số lá trung

bình lớn hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu khi được cấy chuyển

sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương hoặc cao hơn cả sau 4 tuần

và 6 tuần. Tuy nhiên sự khác biệt này tương đối nhỏ.

Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng

độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

3.2.4. Số rễ

14

Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng

độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi

hàm lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu

so với những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy.

Đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM

sorbitol trong các công thức chuyển môi trường 50-50 và 100-100 có số rễ

trung bình cao hơn cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn.

3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

Số

rễ t

run

g b

ình

(rễ

)

Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)

4 tuần

6 tuần

15

Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7

trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu

hạn ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)

Trọng lượng tươi của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện

hạn. Khi chuyển cây con nảy mầm sau 30 ngày sang các môi trường có chứa

sorbitol, hàm lượng sorbitol càng cao thì trọng lượng tươi của mẫu càng giảm.

Trong khi đó trọng lượng khô có giảm khi chuyển cây sang các điều kiện hạn

tăng cao nhưng mức giảm là tương đối ít so với biến động của trọng lượng tươi

(Hình 3.7). Kết quả cho thấy điều kiện hạn trong nuôi cấy đã làm giảm nhanh

khả năng hấp thu nước của khoai tây in vitro nhưng không làm giảm khả năng

tích lũy chất khô. Và, nếu các chồi khoai tây đã qua giai đoạn tập chống chịu

khi nảy mầm thì khả năng tích lũy chất khô của chúng được cải thiện đáng kể.

16

3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống

chịu

Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có

các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy

mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)

Kết quả nghiên cứu cho thấy, những mẫu đã qua tập chống chịu đều có

hàm lượng Chl. cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu và cao hơn

so với môi trường đối chứng 0-0. Đặc biệt trong môi trường tiếp xúc hạn ở

ngưỡng 50 mM sorbitol cho thấy sự tăng về cả hàm lượng Chla, Chlb và tăng cả

về tỷ lệ hàm lượng Chla/ Chlb.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Hà

m l

ƣợ

ng

Ch

l. (

µg

/mg

)

Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)

Chla

Chlb

17

3.4. Hàm lƣợng proline

Hình 3.9. Hàm lượng proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi

trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai

đoạn nảy mầm (đánh giá sau 4 tuần)

Xét tính tập chống chịu, hầu hết những mẫu đã qua tập chống chịu đều có

hàm lượng proline cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu. Hàm

lượng proline đã thể hiện rất rõ ràng vai trò của giai đoạn tập chống chịu với độ

hạn thấp (50mM sorbitol) và vừa (100mM sorbitol) của cây con khoai tây đã

gia tăng hàm lượng proline ở tất cả các các điều kiện hạn ngang mức và cao

hơn.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Hà

m l

ƣợ

ng

pro

lin

e (µ

g/m

g)

Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM)

18

3.5. Mức độ biểu hiện của một số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính

chịu hạn của khoai tây

3.5.1. Hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng số

Bảng 3.1. Hàm lượng RNA tổng số và các giá trị đánh giá mức độ tinh sạch

Mẫu Hàm lƣợng (ng/µl) A260/280 A260/230

0 2963,7 1,9 1,99

1h0 854,1 2,03 2,32

1h50 1158,67 2,01 2,22

2h0 1075,19 2,03 2,04

2h50 1226,52 2,01 1,82

4h0 1260,5 2,05 2,13

4h50 1193,56 2,03 2,19

6h0 544,03 2 1,5

6h50 985,77 2,03 2,14

8h0 837,12 2,03 1,86

8h50 916,73 2,04 2,16

12h0 1286,44 2 2,17

12h50 1870,35 2 2,22

24h0 1177,5 2,02 2,3

24h50 1125 2,03 2,29

72h0 557,4 2,04 2,06

72h50 700,48 2,06 1,86

120h0 1407,28 2,02 2,2

120h50 568,8 2,02 1,99

RNA tổng số thu được hầu hết đều đạt chất lượng tốt ngoại trừ mẫu 6h0 có

chỉ số A260/230 thấp.

19

3.5.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA

Mẫu

Giá trị Ct

Mồi GAPDH 3’ Mồi GAPDH 5’ ΔCt

0 24,54 25 0,46

1h0 16,89 17,51 0,62

1h50 25,67 24,34 1,33

2h0 23,82 23,09 0,73

2h50 19,77 20,43 0,66

4h0 15,72 16,41 0,69

4h50 18,36 19,54 1,18

6h0 22,89 22,1 0,79

6h50 21,88 20,55 1,33

8h0 21,77 21,06 0,71

8h50 22,71 21,98 0,73

12h0 22 20,9 1,1

12h50 21,22 20,17 1,05

24h0 16,09 16,54 0,45

24h50 16,65 16,87 0,22

72h0 24,58 23,92 0,66

72h50 24,63 23,26 1,37

120h0 24,03 23,28 0,75

120h50 26,8 25,37 1,43

3.5.3. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMG400014309 (P1)

Trong 12h đầu, mức độ biểu hiện của gen P1 ở mẫu TN có dao động lớn

so với môi trường ĐC. Mẫu cấy trên môi trường 50 mM sorbitol có biểu hiện

mạnh hơn mẫu ĐC ở các mốc thời gian: 1h, 4h, 8h, 24h và 72h nhưng lại có

biểu hiện kém hơn ở các mốc: 2h, 6h, 12h và 120h. Sự tăng cường biểu hiện

của gen P1 ở khoai tây HH7 khi tập chống chịu hạn ở điều kiện 50mM sorbitol

20

in vitro so với mẫu trên môi trường không có sorbitol có sự dao động tương đối

lớn và với mỗi lần gia tăng sự biểu hiện của gen này lại cao hơn so với lần tăng

trước đó.

Hình 3.10. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được

xử lý hạn và mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương

đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A ở Arabidopsis thaliana

3.5.4. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (P2)

Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (gen P2) của khoai tây

giống HH7 trong nghiên cứu này cũng có chiều hướng biến động tương tự như

gen P1 (Hình 3.11). Tuy nhiên có thể thấy rõ tương quan mức độ biểu hiện của

gen P2 thấp hơn so với gen P1 và mốc thời gian P2 có biểu hiện của mẫu tập

chống chịu 50 mM sorbitol so với mẫu đối chứng cao nhất là ở 6h. Sau 72h,

tương quan mức độ biểu hiện có cao lên nhưng không vượt mức 6h.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60 80 100 120

Tƣ

ơn

g q

ua

n m

ức đ

ộ b

iểu

hiệ

n (

lần

)

Thời gian (h)

21

Hình 3.11. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được

xử lý hạn và mẫu đối chứng của của gen PGSC0003DMP400026903 (P2),

tương đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 ở Arabidopsis thaliana

3.5.5. Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMT400045091 (P3)

Gen P3 mã hóa cho protein thuộc lớp thứ nhất của họ AP2/ERF protein,

tương đồng với gen At4G13040 ở A. thaliana. Ở A. thaliana, At4G13040 có

chức năng điều khiển sự tích lũy salicylic acid, chống lại các bệnh liên quan đến

vi khuẩn. Mức độ tương đồng giữa gen P3 và At4G13040 là 100%.

Hình 3.12. Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện của gen

PGSC0003DMT400045091 (Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã

At4g13040 ở Arabidopsis thaliana

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60 80 100 120

Tƣ

ơn

g q

ua

n m

ức đ

ộ b

iểu

hiệ

n (

lần

)

Thời gian (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60 80 100 120

Tƣ

ơn

g q

ua

n m

ức đ

ộ b

iểu

hiệ

n (

lần

)

Thời gian (h)

22

Từ biểu đồ, chúng ta nhận thấy rằng mức độ biểu hiện của gen P3 trong

các mẫu TN thấp nhất so với 2 gen nghiên cứu trên. Chiều hướng biến động giá

trị tương quan mức độ biểu hiện của gen P3 tương tự với gen P2.

Trong 3 gen nghiên cứu, khi so sánh tương quan giữa khoai tây trong giai

đoạn tập chống chịu trước điều kiện có sorbitol gây hạn mức 50mM với mẫu

nuôi cấy trên môi trường đối chứng thì gen P1 có mức độ biểu hiện mạnh mẽ

hơn cả, tiếp đến là gen P2 và thấp nhất là gen P3. Điều này khẳng định vai trò

của yếu tố phiên mã DREB1A trong cơ chế chống chịu hạn của thực vật nói

chung và của khoai tây nói riêng.

23

KẾT LUẬN

1. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà

7 giảm khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng.

2. Sự tăng lên về số lượng rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng

chlorophyll, hàm lượng proline của mẫu đã nảy mầm trong môi trường

hạn so với các mẫu chưa tiếp xúc hạn bước đầu cho thấy cây con khoai

tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 có khả năng tập chống chịu

hạn.

3. Hàm lượng sorbitol 50 mM trong môi trường mang lại hiệu quả tập

chống chịu tương đối cao cho khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống

Hồng Hà 7.

4. Với nồng độ 50 mM sorbitol trong môi trường đã làm tăng cường đáng kể

biểu hiện của gen mã hóa yếu tố phiên mã PGSC0003DMG400014309 ở

khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 (tương đồng với gen

DREB1A).

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu ảnh hưởng khả năng tập chống chịu hạn đến khả năng tập

chống chịu một số yếu tố bất lợi khác của khoai tây (Solanum

tuberosum L.) giống HH7.

2. Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn của một số giống khoai tây (Solanum

tuberosum L.) khác.