Trascrizione del DNA nei procariotiLa trascrizione è il processo attraverso il quale viene sintetizzato RNA messaggero a partire dal DNA. Nonostante ci siano alcune differenze tra procarioti ed eucarioti in entrambi la trascrizione può essere suddivisa in 3 fasi: inizio, allungamento e terminazione.

inizio: riconoscimento del promotore e apertura del DNA a formare la bolla di trascrizione allungamento: l'RNA polimerasi sintetizza l'RNA utilizzando come stampo uno dei due filamenti di

DNA terminazione: viene riconosciuto il terminatore e l'RNA polimerasi si arresta

Un tipico promotore di E.coli è costituito da 3 componenti: 1. sequenza consenso TTGACA -35 (ricca in A-T)2. sequenza consenso TATAAT -10 o pribnow box (ricca in A-T)3. sito d’inizio della trascrizione.

Alcuni promotori contengono l’elemento UP ancora più a ?monte? della sequenza -35, altri possono mancare della sequenza -35 ma avere una sequenza -10 estesa, altri ancora a valle della sequenza -10 contengono un discriminatore che controlla il legame della RNA polimerasi.

L’RNA polimerasi è un enzima a forma di pinza o chela di granchio costituito da più subunità, come la DNA polimerasi sintetizza in direzione 5' 3' ma non necessita di primer. Nei procarioti c’è una sola RNA polimerasi che presenta 5 subunità:

1. 2 sub α: responsabili dell’assemblaggio del complesso della trascrizione e partecipano al riconoscimento del promotore nei promotori contenenti l’elemento UP, contengono 2 domini con funzioni diverse:

a. dominio C-terminale, che lega l’elemento UP del promotore che, se presente, è responsabile dell’inizio della trascrizione

b. dominio N-terminale, che interagisce con le altre subunità2. β: che contiene il sito catalitico e quindi è responsabile dell’attività polimerasica3. β’: che lega il DNA (NB Il canale dove passa il DNA è formato dalle 2 subunità β e β’)4. ω: che stabilizza il complesso

Inoltre l’RNA polimerasi lega una subunità σ che riconosce il promotore.

Come anche la DNA polimerasi la RNA polimerasi lega 2 ioni bivalenti Mg +2 che neutralizzano le cariche negative dei gruppi fosfato e stabilizzano il pirofosfato; precisamente un Mg+2 è strettamente legato mentre l’altro viene introdotto ad ogni ciclo con il nucleotide trifosfato. La reazione consiste nell’attacco dell’OH in 3’ della catena nascente di RNA sul P del fosfato α del nucleotide trifosfato entrante con formazione di un legame fosfodiestereo e rottura del legame fosfoanidridico e rilascio di pirofosfato. L’energia per la formazione del legame è fornita proprio dalla rottura del legame fosfoanidridico che può essere considerato come una riserva di energia libera.

Assemblaggio dell’oloenzima (RNA pol + fattore σTutto inizia dalla subunita α che contatta la subunità α’, questo eterodimero lega il DNA in maniera aspecifica e promuove l'assemblaggio delle restanti subunità, si legano quindi le subunità β e β'; la subunità β' partecipa al legame aspecifico della polimerasi con il DNA mentre la subunità β è responsabile dell’attività catalitica vera e propria. Così com’è (α2ββ’) l'enzima non è in grado di riconoscere il promotore ma necessita del fattore σ, questo si lega alle altre subunità formando l'oloenzima completo il quale scorre lungo il DNA e quando incontra il promotore vi si lega tramite il fattore σ.Esistono più fattori σ che regolano l'espressione genica:

σ70 è espresso in condizioni normali (permette all'RNA polimerasi di legarsi ai geni house-keeping), riconosce un promotore che contiene 2 sequenze consenso di 6 nucleotidi poste a -35 e a -10 rispetto al sito di inizio della trascrizione. La sequenza -35 è riconosciuta dalla regione σ4 del fattore σ (NB Il fattore σ è composto da 4 regioni σ1, σ2, σ3 e σ4) mentre la sequenza -10 o Pribnow box, ricca in A e T, è riconosciuta da σ2 o anche σ3 se è estesa. Quando è libero il fattore σ70 lega il DNA mediante il dominio N-terminale, quando si associa al complesso α2ββ’ formando l’oloenzima completo la regione N-terminale viene spostata dal DNA

σ32 è espresso quando i batteri sono esposti al calore e permette la trascrizione dei geni che codificano per le heat-shock proteins permettendo ai batteri di sopravvivere a temperature più elevate (fa sì che l'RNA polimerasi leghi i geni heat-shock).

alcuni promotori contengono anche 1 o + elementi a monte detti elementi UP che vengono legati direttamente dalla subunità α della RNA polimerasi mediante il dominio carbossiterminale. Infatti il dominio carbossiterminale della subunità α è legato al resto dell’RNA polimerasi tramite una struttura proteica detta “giunto flessibile” che permette di raggiungere l’elemento UP anche se non si trova immediatamente vicino alla regione -35.

Inizialmente l’oloenzima (RNA pol + fattore σ) si lega a qualsiasi sequenza di DNA in modo reversibile e scorre lungo il DNA fino a incontrare il promotore formando il cosiddetto complesso chiuso in cui il DNA è a doppia elica. Quando l’oloenzima incontra e lega il promotore si ha il passaggio dal complesso chiuso al complesso aperto in cui delle variazioni conformazionali nell'enzima provocano l'apertura della doppia elica del DNA. A questo punto la RNA polimerasi può iniziare a sintetizzare l’RNA utilizzando uno dei filamenti di DNA come stampo. Inizialmente si può avere una fase abortiva in cui altri l’RNA polimerasi si muove avanti e indietro (modello transiente) o si muove tipo bruco (modello a bruco) sintetizzando corti filamenti di 9-12 nucleotidi senza però procedere oltre e quindi rilasciandoli. Dopodiché alcuni cambiamenti conformazionali nella subunità α permettono all’RNA polimerasi di scorrere lungo il DNA e iniziare quindi la fase di allungamento in cui i nucleotidi vengono aggiunti all’estremità 3’ della catena nascente di RNA formando un ibrido DNA-RNA nella regione srotolata. In questa fase può sempre succedere che la RNA pol rallenti o si blocchi.

Inoltre, per correggere l’eventuale inserzione di un nucleotide sbagliato, l’RNA polimerasi ha 2 meccanismi di correzione di bozze o proofreading:

editing pirofosforolitico: meccanismo che è in grado di eliminare il nucleotide sbagliato perché l’appaiamento non corretto fa sì che l’RNA polimerasi rallenta molto e prevale la reazione inversa cioè il nucleotide rilega il pirofosfato riformando il nucleotide trifosfato e viene quindi rilasciato.

editing idrolitico: in questo caso il fattore Gre fa invertire la direzione della sintesi, perciò l’RNA polimerasi torna indietro di uno o più nucleotidi provocando il distacco della catena contenente errori e poi l’RNA polimerasi riprende l’allungamento da dove è stato tagliato l’ultimo tratto che conteneva errori.

Durante l’allungamento sono molto importanti come nella replicazione le topoisomerasi perché secondo l’ipotesi dei domini gemelli man mano che si sposta in avanti la RNA polimerasi genera davanti a sé dei superavvolgimenti positivi e si lascia alle spalle dei superavvolgimenti negativi (per ogni giro d’elica percorso si genera un superavvolgimento +1 anteriormente all’enzima e un superavvolgimento -1 posteriormente), poiché si può avere un’eccessiva compattazione che provoca il blocco della trascrizione sono importanti la DNA girasi (una topoisomerasi tipo 2 che introduce avvolgimenti negativi) e la topoisomerasi I (che rimuove i superavvolgimenti negativi) per correggere la struttura.Infine nella fase di terminazione quando l’RNA polimerasi incontra un terminatore si ha il distacco dell’enzima e la fine della trascrizione. Ovviamente si devono anche separare l’RNA messaggero dal DNA e questo può avvenire in 2 modi:

i terminatori intrinseci sono caratterizzati da una sequenza palindromica ricca in C e G ~20 bp seguita da una sequenza ricca in A e T ~8 bp, l’RNA polimerasi trascrive queste sequenze in mRNA e, poiché quelle ricche in G-C sono simmetriche, l’mRNA si ripiega a forcina per cui l’RNA polimerasi non può avanzare ulteriormente, si stacca e viene rilasciato l’RNA. NB la sequenza ricca in A-U nell’ibrido RNA-DNA favorisce la dissociazione dell’RNA (minori legami Idrogeno e interazione di stacking) e il distacco dell’enzima

i terminatori Rho-dipendenti, invece, codificano per una sequenza di RNA ad alta affinità per la proteina esamerica rho; la proteina rho è un’elicasi che lega l'mRNA in zone ricche di C dette RUT (RHO UTilization) e separa l’ibrido RNA-DNA.

NB L’enzima completo o oloenzima ha una composizione α2ββ’σ, il nucleo enzimatico o core ha una composizione α2ββ’. Il nucleo enzimatico grazie alla subunità β’ può legare il DNA in maniera non specifica sul “sito di legame debole”, in questo caso però il DNA resta a doppia elica.