transgenesi in m. musculus
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TRANSGENESI IN M. musculus. Creazione di animali geneticamente modificati per: conferma di gene candidato responsabile patologia umana - studio della funzione e della regolazione genica modelli animali per lo studio delle malattie umane modelli animali sperimentali: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
TRANSGENESI IN M. musculus
Creazione di animali geneticamente modificati per:
- conferma di gene candidato responsabile patologia umana
- studio della funzione e della regolazione genica
- modelli animali per lo studio delle malattie umane
- modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (“rescue” fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica
Un organismo si considera transgenico quando il gene esterno è:
• integrato nel suo genoma;• espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale;• integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.
TRANSGENESI IN M. musculus
KNOCK INIntroduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo.
L’inserzione di un gene esogeno può contemporaneamente determinare l’inattivazione del gene endogeno attraverso il suo inserimento.
KNOCK OUTIntroduzione di sequenza genica per l’abolizione della funzione genica endogena
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
3) Metodi:
- Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato- Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. -Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti
4) Tipi di inserzione:- ectopica- mirata
1) Trasferimento genico diretto:
-Trasfezione DNA libero con microiniezione
2) Trasferimento tramite vettori (adenovirus, virus adeno associati, retrovirus): infezione virale
TRANSGENESI IN M. musculus
Inserzione ectopica: effetto di posizione
Influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori)
Influenza struttura cromatina (eterocromatina, DNA ipermetilato)
Controllo di espressione del transgene
Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40) per geni sempre attivi e molto espressi
Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo
Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente
Inserzione mirata
Inserimento nel genoma in una posizione occupata da sequenza omologa
TRANSGENESI IN M. musculus
- Gene da esprimere fuso con cDNA proteina GFP
- Gene da esprimere fuso con peptidi target di anticorpi fluorescenti.
DNA esogeno
DNA genomico
Produzione di organismo Knock-in o Knock-out per ricombinazione omologa
Produzione di organismo Knock-out per ricombinazione
Produzione di organismo Knock-out/in per ricombinazione
Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
Accoppiate con maschi vasectomizzati
Oocita fecondato
Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile
Si microiniettanomolti oociti
Trasferimento genico tramite trasferimento nucleare
Riprogrammazione delnucleo che ripercorreràl’intero sviluppo
fecondato
Metodi per produzione di topi transgenici
- Microiniezione nel pronucleo: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico (comprese cellule germinali)
- Trasferimento nucleare: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico
- Trasfezione (o elettroporazione) di cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti, l’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali sono transgenizzate)
Mutagenesi di cellule ES
NO è una CHIMERA!!!
Zigote Mutazione genetica due popolazioni cellulari Mosaico
Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari ChimeraZigote 2 (cellule ES)
Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo KO
Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovirVettore con:gene tk (timidino-chinasi) (tk+ ) dell’Herpes virus (tk HSV),gene della Neomicina resistenza = neoR
Gene endogeno inattivato per inserzione mirata del gene neoR
Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA
G418: analogo della neomicinaGanciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito
Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir
Gcv Gcv-P Gcv-PPP
Incorporazione DNA
Terminazione catenarottura DNA
Tk HSV Tk mammifero
Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir
Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata
Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko
Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata
Produzione di topo ko (in omozigosi) successivo a mutazione mirata
Aguti
Fenotipo ko =Coda arricciata
1) Ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali (topo marrone)
2) Selezione con G418 e gancyclovir
3) Iniezione delle cellule transgeniche in una blastocisti e impianto in unamadre pseudogravida (topo nero)
4) Progenie chimerica
5) Incrocio di eterozigoti per ottenere topo omozigote
CREAZIONE TOPO KnockOut
ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI
Malattia Gene Metodo
Fibrosi cistica CFTR Inattivazione da inserzione mirata
Beta talassemia Beta globina Inattivazione da inserzione mirata
Malattia di Gaucher GBA Inattivazione da inserzione mirata
Sindrome dell’X fragile
FMR1 Inattivazione da inserzione mirata
Sindrome da prioni
umana
PRNP Integrazione del gene murino mutante della proteina prionica
Atassia spinocerebellare I
SCA1 (atassina) Integrazione del gene umano espanso
I topi sono sempre un buon modello?
Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane
Topo NOD: diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulino-dipendente umano
Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lievedella DMD
Modelli per malattie con perdita di funzione: identificazione ortologo e creazione topo knock-out. Produzione di: alleli nulli (assenza completa di funzione), mutazioni leaky, (inattivazione geni con funzione simile)Differenza nel fenotipo possibile per presenza di geni modificatori in differenti ceppi murini
Modelli per malattie umane con acquisto di funzione: topo knock-in (es inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse)
I topi sono sempre un buon modello?
Differenze nelle vie biochimiche
Differenze nei percorsi di sviluppo
Durata della vita media (esordio tardivo nell’uomo)
Differenze nel contesto genetico