transfiera sus mÉtodos de hplc … · analisis/control de calidad objetivos primarios respuesta a...
TRANSCRIPT
TRANSFIERA SUS
MÉTODOS DE HPLC
CONVENCIONAL A
FAST LC
Tecnologias para mejorar los
tiempos de análisis y la
productividad
Julián de la Mata
13 de Diciembre de 2012
1
Agenda
En este eSeminario hablaremos sobre:
- Pasos a seguir para convertir un método de HPLC
convencional en un método rápido.
- Aumento de la eficacia de la separación con
columnas UHPLC (superficial y totalmente porosas )
- Guía de selección de columnas para el desarrollo de métodos
rápidos
2
Pasos a seguir para convertir un método de HPLC
convencional en un método rápido.
Consideraciones acerca de la justificación de un método rápido: revalidaciones/beneficios
Consideraciones acerca de las columnas: fase estacionaria, dimensiones, tecnología de partículas
Consideraciones del método:
Cálculos de conversión de métodos
Fase móvil, pH , temperatura
Consideraciones acerca del instrumento.
Objetivos perseguibles: mantener la resolución ,evitar la dispersión de picos, anticipación de limitaciones de presión o flujo.
3
Page 4
Beneficios de la Fast LC en la calidad de los
analisis/Control de calidad
Objetivos primarios
Respuesta a la fabricación– producción más rápida
Posibilidades de expansión – analizar más productos por día
Manejar mayor carga de muestras con menos personal
Reducir costo por análisis (carga de trabajo, gastos generales)
Objetivos secundarios
Reducir consumo de disolventes (compra, desechos)
Procesar más muestras con menos instrumentos.
Page 5
¿por qué mucha gente no hace nada al respecto?
La Revalidación es vista como algo costoso y
tedioso, a pesar de los beneficios a largo plazo.
Hay un sentimiento histórico– “no funciona tan
fácilmente como decís en vuestros seminarios”
Hay quien piensa que se requiere un equipo
especialido de UHPLC para hacer cromatografía
rápida.
Y que las opciones de mejora sin una posible
degradación de la selectividad/resolución son
limitadas.
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 4/2009
L
PACKING
BRAND NAME
MANUFACTURER
L1
L1
Octadecyl silane chemically bonded to
porous silica or ceramic micro-
particles, 1.5 to 10 µm in diameter, or a
monolithic rod
Octadecyl silane chemically bonded to
AminoQuant
AQUASIL C18
Ascentis C18
Ascentis Express C18
ASI C18
ASI microC18
Atlantis dC18
Atlantis T3
Axxi-Chrom C18, ODS
Bakerbond C18
BetaBasic 18
BetaMax Neutral
BETASIL C18
Bio-C18
BioBasic 18
Bio-Sil ODS
Bio-Sil ODS-10
Bondclone C18
BR-C18
Burdick & Jackson C18
Cadenza CD-C18
Cadenza 5CD-C18
Cadenza CL-C18
Cadenza 5CL-C18
Cadenza CW-C18
Cadenza 5CW-C18
Cadenza HS-C18
Capcell C18 AG 120
Capcell C18 SG 120, 300
Capcell C18 UG 80, 120, 300
Capcell C18 MG
Capcell C18 MGII
Capcell C18 MGIII
Capcell C18 ACR
Capcell C18 AQ
Capcell C18 IF
Chemcosorb 5-ODS-H
Chromegabond C18
Chromegabond WR-C18
Chromolith RP-18e
Clarity Oligo-RP
Clipeus C18
Cogent HPS C18
Cogent hQ C18
Cogent Simulare C18
Cogent MicroBee C18
Cogent Bidentate C18
Cogent e-Column C18
Cosmosil C18 MS-II
Cosmosil C18 AR-II
Cosmosil C18 AR-300
Cosmosil C18 PAQ
Delta-Pak C18
Agilent Technologies
Thermo Scientific
Supelco
Supelco
Analytical Sciences Inc.
Analytical Sciences Inc.
Waters Corp.
Waters Corp.
Axxiom
JT Baker
Thermo Scientific
Thermo Scientific
Thermo Scientific
Sepax Techonologies
Thermo Scientific
BIO-RAD Laboratories
BIO-RAD Laboratories
Phenomenex
Sepax Techonologies
B&J
Imtakt - Silvertone Sciences
Imtakt - Silvertone Sciences
Imtakt - Silvertone Sciences
Imtakt - Silvertone Sciences
Imtakt - Silvertone Sciences
Imtakt - Silvertone Sciences
Imtakt - Silvertone Sciences
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Shiseido
Dychrom
ES Industries
ES Industries
Merck KgaA
Phenomenex
Higgins Analytical
MicroSolv Techn. Corp.
MicroSolv Techn. Corp.
MicroSolv Techn. Corp.
MicroSolv Techn. Corp.
MicroSolv Techn. Corp.
MicroSolv Techn. Corp.
Nacalai Tesque, Inc.
Nacalai Tesque, Inc.
Nacalai Tesque, Inc.
Nacalai Tesque, Inc.
Waters Corp.
L
Page 6
Poroshell 120
Criterios de Ajuste de Métodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Métodos de Dimensiones de Columna
Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/Ejemplos
Longitud de Columna 70% 250mm 75mm
150mm 50mm
Diámetro Interno de
Columna
25% (FDA ORA-LAB 5.4.5*)
USP – 25% ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante**
4.6 mm 3.0 mm (-35%)
4.6 mm 2.1 mm (-54%)
3.0 mm 2.1 mm (-30%)
Flow Rate 50%
Volumen de Inyección
Reducir tanto como se necesite–
debe cumplir los límites de
detección y precisión
Si cambia a una columna más
corta , haga el cambio apropiado
en el volumen de inyección
Tamaño de Partícula Reducir hasta el 50%
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamaño de partícula para mantener la misma
Rs
5um 3.5um (-30%)
5um 2.7um (-46%) *Cambiado en 2/24/09 – Para la copia oficial y actual , ir a
http://www.fda.gov/ScienceResearch/FieldScience/default.htm
** USP 30 Second Supplement Revisions, PF34(5), en proceso.
Ver “ Stimuli article” en Pharmacopeial Forum 2009; 35(6)
Page 7
Pasos generales para desarrollar un método
robusto en LC/LCMS
• Usar el tipo de cromatografía adecuado– normalmente fase
reversa (C18, polar embebida, etc…) o fases HILIC.
• Elegir las condiciones adecuadas para una separación
isocrática o en gradiente.
• Ajustar el pH para una optima retención de los analítos
• Elegir la fase ligada adecuada para obtener una separación
y resolución adecuada de los picos.
8
Consideraciones en la elección de la fase
estacionaria de su columna.
• Diferentes interacciones para compuestos polares y no
polares.
• Explotar otras interacciones con la fase ligada (e.g., pi-pi)
• El cambio de la fase móvil puede mejorar la
selectividad/resolución y reducir el tiempo de análisis
• Cuando se usan columnas Poroshell 120 la comparación
de las fases ligadas puede hacerse rápidamente!
• Con columnas de distintas fases ligadas y tecnologías de alta
velocidad el traslado de métodos es muy fácil.
Una nueva herramienta para la selección de
columnas en el desarrollo de métodos
El “Column and Sample Prep NAVIGATOR”:
http://www.agilent.com/chem/navigator
10
Ayuda en la selección de columna y en la Preparación de Muestra!
Consideraciónes en el desarrollo de métodos en LCMS
• Selección de fase móvil
• A menudo se prefieren los gradientes debido a las diferencias en las características de retención.
• Elección del tampón
• Por ejemplo un tampón volátil para LCMS (Fórmico,acético, etc)
• Dimensiones de columna para una mayor sensibilidad y velocidad
• Elija columna estrechas para una mayor sensibilidad y más cortas para análisis rápidos.
11
Page 12
¿Qué parámetros afectan a la resolución?
Opciones positivas con bajo riesgo:
• Aumentar el flujo (en condiciones isocráticas)
• Disminuir el tiempo de gradiente, aumentando el flujo proporcionalmente
• Utilizar columnas con menor tamaño de partícula (permite utilizar columnas más cortas)
• Optimizar los parámetros del detector, reducir la dispersión del sistema.
Opciones con mayor riesgo:
• Quimica de la Columna o de la fase móvil (cambios de selectividad)
• Temperatura de la columna (posibles cambios de selectividad)
Ruerde siempre– que cambios en la selectividad química son a menudo tan beneficiosos como perjudiciales. Pruebe primero las opciones positivas, luego explore las opciones con mayor riesgo. La disminución de la viscosidad de la fase móvil invariablemente mejora la eficaciá de la columna.
Page 13
Cómo las dimensiones de la columna, el flujo y el tamaño
de partícula influyen en la resolución y la velocidad
Dimension
Columna
Tamaño
partícula
Eficiencia
teórica,N
Flujo
(ml/min)
Bar* Eficiencia
estimada,N
Veloc.
neta
Cambio
neto en
Resol.
4.6x250mm 5um 20,000 1.0 73 18,300 -- --
4.6x250mm 5um 20000 2.5 183 9,300 2.5x -29%
4.6x150mm 3.5um 17,100 1.0 90 15,000 1.6x -9%
4.6x150mm 3.5um 17,100 2.5 224 13,200 4x -15%
4.6x100mm 1.8um 22,200 1 226 17,700 2.5x -2%
4.6x100mm 1.8um 22,200 2.0 452 17,500 5x -2%
* Presión en bares, fase móbil acetonitrilo/agua 60/40 v/v,
25oC temperatura de operación
Nota: Eficacia estimada para un pico con k’ o k* = 4, dispersión=20ul
LC Calculator –Web Version
14
https://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-
Preparation/LC-LC-MS-Columns/Pages/lccalcweb.aspx
LC Calculator Home Get the Mobile App Get the Desktop App How do I use this app?
Dimensiones de la columna
Elección de solvente y
porcentaje de composición
Temperatura
Flujo
Porosidad
Page 15
Cálculos simples para la conversión de métodos
Muchos usuarios quieren y necesitan trasladar métodos LC
antíguos a métodos nuevos con columnas de tecnología avanzada.
Muchos usuarios quieren convertir métodos LC-UV a métodos LC-
MS predominantemente en modo ESI.
Las Columnas con menores diametros son apropiadas para
trabajar a flujos menores sin reducir la velocidad lineal ni la
velocidad del análisis.
Convertir estos métodos no es siempre tan fácil como parece.
Los fabricantes de cromatografía pueden guiar a los usuarios a
encontrar una solución eficaz bajo condiciones óptimas de
operación.
Page 16
Conversión del flujo
Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las
dimensiones de columna, el flujo y el tiempo.
1. Modificación del flujo, para columnas de diferentes diametros
ml/minmm
mmml/min 21.0
4.6
2.11.0 i.e.
2
2 col.
2
column1
column21 col. Flujo
.Diam
Diam.Flujo
Page 17
Conversión de tiempo Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las
dimensiones de columna, el flujo y el tiempo.
2. Segmento de gradiente o modificación del tiempo de análisis*
.15250
150.25 i.e. min
mm
mmmin
*asume un flujo proporcional para las columnas 1 y 2, según Equación 1
2 col.
columna1
columna21 col.
L
LongitudTiempo
ongitudTiempo
Page 18
Pendiente del gradiente vs. Tiempo y flujo Efectos k* (“K asterisco”) de la pendiente del gradiente – el parámetro en gradiente equivalente al factor de capacidad k’ (“K prima”) en las separaciones isocráticas
Aumentando k’ o k* generalmente aumenta la resolución. Esto puede hacerse disminuyendo la fuerza del solvente o disminuyebdo la pendiente del gradiente, respectivamente
3. Tiempo/ pendiente del gradiente
columna volumenes10
20%)-(100% 8% i.e.
# volumenes de columna= (Flujo x Tiempo Gradiente) / volumen columna
Volumen columna Zorbax = 3.14 x r2 x L x 0.6 (r y L en cm)
columna de Volumenes #
%Inicial)-(%Final gradiente del Pendiente %
Page 19
Conversión del volumen de inyección
Hay cuatro cálculos simples que definen la cantidad de muestra, las dimensiones de columna, el flujo y el tiempo.
4. Modificación del Volumen de Inyección
2 col.
columna1
columna21 col. ..V
Volumen
VolumenVol.iny Inyol
2 col.
columna1
columna21 col. 4
2.0
4.020 i.e. μl
ml
mlμl
Volumen columna Zorbax = 3.14 x r2 x L x 0.6 (r y L en cm)
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Restricciones del sistema: dispersión de picos,
limitaciones de flujo y presión
La reducción del volumen de columna aumenta el efecto negativo del sistema en el ensanchamiento de picos.(recom. utilizar capilares 0.12mm y celda de pequeño volumen)
El aumento del flujo puede afectar al rendimiento del desgasificador y la estabilidad de la presión – comprobar especificaciones y precauciones con el fabricante.
El aumento de flujo, junto con la disminución en el tamaño de partícula , producirá un aumento significativo de presión – este efecto debe ser calculado antes de usar las condiciones de operación para asegurar unos valores aceptables
Consejo: Una mayor Temperatura puede mejorar la
velocidad y la resolución
La alta temperatura es un parametro a considerar en la optimización de métodos de Fast LC.
•Proporciona una transferencia de masa más rápida:
– Mejora la Eficiencia ( resolución)
– Disminuye el tiempo de analisis– separaciones más rápidas sin pérdida en resolución.
•Disminuye la viscosidad de la fase móvil
– Baja la presión – permite flujos mayores, separaciones más rápidas, mayor eficiencia
•Pueden cambiar la selectividad– optimizar la resolución
•No es necesario llegar al límite-los valores medios tambien proporcionan beneficios
Viscosidad de los solventes Presión del sistema con MeOH/Agua
Porcentaje de
MeOH (%)
Presión (bar)
0 142
10 169
20 203
30 229
40 249
50 252
60 240
70 216
80 184
90 145
100 98
Columna de 4.6 x 50mm y partículas de 1.8um a 1 ml/min,30oC
0
50
100
150
200
250
0 50 100
pressure
per cent age of MeOH
Pr essure cur ve
•Use P de 4.6 x 50mm como punto de partida
•Multiplique P por Lcol2 / Lcol1
•Si P es menor que la P Max del Instrumento
puede usar esa longitud
Viscosidad de los solventes Presión del sistema con ACN/Agua
Porcentaje de ACN
(%)
Presión (bar)
0 142
10 154
20 159
30 156
40 150
50 135
60 120
70 104
80 88
90 70
100 59
Columna de 4.6 x 50mm y partículas de 1.8um a 1 ml/min,30oC
Syst em pr essur e wi t h t he change of
per cent age of ACN
0
50
100
150
0 50 100
Per cent age of ACN
Pressure
•Use P de 4.6 x 50mm como punto de partida
•Multiplique P por Lcol2 / Lcol1
•Si P es menor que la P Max del Instrumento
puede usar esa longitud
El Cambio en la Retención por el pH para
compuestos Ionizables es clave en el desarrollo de
métodos
• Los analitos no cargados tienen mejor retención en fase
reversa (i.e. acidos a bajo pH y bases a alto pH)
• Los Silanoles de la silica ionizan a pH medio,
incrementando la retención de los analitos básicos (i.e
posibles interacciones de intercambio iónico)
• Elija el pH de la fase móvil para optimizar la retención y la
selectividad durante el desarrollo de métodos.
• Las columnas Poroshell 120 EC-C18 pueden usarse en
un amplio rango de pH.
El Cambio en la retención con el pH para compuestos
ionizables depende del tipo de compuesto
Fase Movil: 45% MeOH, 55% 20 mM Tampón fosfato
Más retención para los analitos no cargados (i.e. acidos a bajo pH y bases a alto pH)
0
2
4
6
8
10
12
pH 2.5 pH 6.5 pH 8 pH 11.5
Acetylsalicylic acid (pka 3.5)
Pyridine (pKa 5.2)
Codeine (pKa 8)
Procainamide (pKa 9.2)
Amphetamine (pKa 9.9)
Caffeine (pKa 14)
Rete
nti
on
Tim
e
Conversión del
volumen de inyección
Recomendación de
parámetros del
Detector
Conversión de método
gradiente e isocrático
(auto-detección)
Consejo: Method Translator facilita los cambios Truco: Deje que el Method Translator haga los cálculos Modo básico para una Fácil Transferencia de un Método Convencional a Fast LC
Método Original Nuevo Método
Detailed Output Detailed Input
Agilent Method Translator – Modo avanzado Información más detallada, pero aún fácil de usar
Aumento de la eficacia de la
separación con columnas UHPLC
(superficial y totalmente porosas )
28
¿Es fácil la transferencia de métodos?
¿Cuales son los crietérios de ajuste de métodos de la USP y la FDA?
• Las columnas Poroshell 120 superficialmente porosas pueden usarse cumpliendo
los requerimientos de la USP para el traslado de métodos sin necesidad de
revalidar.
Ejemplo de transferencia de un método USP a Poroshell 120 – paso por
paso.Ajuste de parámetros para optimizar la separación
• Volumen de inyección,
• gradiente
• flujo,
• Velocidad de adquisición de datos
• Volumen extra columna
29
Separación inicial de 10 sulfamidas en 30 minutos
Columna 4.6 x 250 mm, 5-um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm
G1315B , celda de flujo de 2 ul , 0.1s 30C
Par Crítico
Rs=1.21
Presión = 110 bar
Vamos a convertir esta separación a Poroshell 120 EC-C18. El objetivo será acelerar la
separación y no perder resolución del par críticio.
Tiempo %B
0 8
30 33
33 33
34 8
1 ml/min 254 nm 5 ul inyección
A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua
B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN
Eclipse Plus C18, 4.6 x 250mm, 5um
Escalado del volumen de Inyección y del gradiente de una
columna de 250 mm,5um a una Poroshell de 100 mm, 2.7um
min 2 4 6 8 10 12
3.6
33
4.2
18
4
.35
6
4.6
91
5.6
13
5.9
81
6
.06
4
7.4
60
8.2
70
10
.40
0
Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm
G1315B , celda de flujo de 2 ul , 0.1s 30C
Presión = 172 bar
Separacion de 10 sulfamidas en una Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 100 mm, 2.7-um en
12 minutos usando un gradiente de ácido fórmico/acetonitrilo.
(100/250 x30 min) = 12 min
(5 ul a 2 ul)
Tiempo %B
0 8
10 33
11 33
12 8
1 ml/min 254 nm 2 ul injection
A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua
B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN
Poroshell120 EC-C18
4.6 x 100mm, 2.7um
Rs=1.23
Aumentamos el flujo de 1 mL/min a 1.5, y luego a 2 mL/min
para optimizar por el menor tamaño de partícula
min 2 4 6 8
2.4
30
2.8
26
2
.92
1
3.1
45
3.7
74
4.0
17
4
.07
5
5.0
02
5.5
39
6.9
74
min 2 4 6
1.8
21
2.1
21
2
.19
2
2.3
58
2.8
33
3.0
10
3
.05
5
3.7
39
4.1
35
5.2
19
Agilent 1100 sin Mixer Capilares verdes 0.17mm
G1315B , celda de flujo de 2 ul , 0.1s 30C
Escalando del gradiente para un aumento de flujo de 1.0 mL/min a 1.5 mL/min y a 2.0 mL/min, resulta
en una separación de 6 minutos en la Poroshell 120 EC-C18 column. La resolución no cambia.
Time %B
0 8
6.7 33
7.4 33
1.5 ml/min
254 nm
2 ul inyección
A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua
B: 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN
Poroshell 120 EC-C18
4.6 x 100mm, 2.7um
Time %B
0 8
5 33
5.5 33
2.0 ml/min
254 nm
2 ul inyección
A: 0.1 % Ácido Fórmico en agua
B 0.1 % Ácido Fórmico en MeCN
Rs=1.22
Rs=1.21
Gradiente rápidamente optimizado para la mejor
selectividad en la Poroshell 120 EC-C18
min 0 2 4 6 8 10
mAU
0
20
40
60
80
100
3.7
06
4.3
71
4.5
12
4.8
77
5.9
29
6.3
75
6.4
72
8.0
38
8.9
82
11.5
32
min 0 2 4 6 8 10
mAU
0
20
40
60
80
100
2.4
75
2.9
23
3.0
21
3.2
63
3.9
77
4.2
66
4.3
34
5.3
68
5.9
90
7.7
05
min 0 2 4 6 8 10
mAU
0
20
40
60
80
1.8
56
2.1
94
2.2
68
2.4
48
2.9
89
3.2
02
3.2
54
4.0
23
4.4
80
5.7
76
min 0 2 4 6 8 10
mAU
0
20
40
60
2.3
57
3.2
52 3
.352
3.7
23
5.5
45
6.5
17
6.8
35
8.4
79
9.1
34 1
0.5
16
min 0 2 4 6 8 10
mAU
0
20
40
60
0.6
36
1.7
59
2.2
53 2
.369
2.6
69
3.9
74
4.5
21
4.6
32
5.5
11
5.9
74 7
.078
La resolución se mejora optimizando la separación del gradiente.
Rs=1.23
Rs=1.22
Rs=1.21
Rs=2.2
Rs=1.9
Mejora de la resolución y la velocidad con Poroshell Traslado de método de una columna Eclipse Plus C-18 4.6 x 250 mm 5 um a una
Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
9.7
12
11.1
16
11.5
96
12.6
74
15.2
48
16.1
51
16.4
35
20.6
87
23.0
76
29.2
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
1.7
19
2.1
89
2.3
11
2.6
06
3.8
67
4.4
37 4.5
58
5.4
50
5.9
20
7.0
37
Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)
Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)
Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)
Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas.
325 bar
110 bar
Sulfadiazina,
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina,
Sulfametazina,
Sulfametazol,
Sulfametoxipiridazina,
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol,
Sulfadimetoxina
Tiempo %B
0 8
33 33
34 33
Columna: Eclipse Plus C18
4.6 x 250mm, 5um
Flujo: 1 mL/min
Fase Móvil:
A: 0.1% Ácido Fórmico en Agua
B: 0.1% Ácido Fórmico en ACN
Tiempo %B
0 8
12 33
13.2 33
Columna: 4.6 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18,
2.7um
Flujo: 1.85 mL/min
Page 34
Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
9.7
12
11.1
16
11.5
96
12.6
74
15.2
48
16.1
51
16.4
35
20.6
87
23.0
76
29.2
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
1.7
19
2.1
89
2.3
11
2.6
06
3.8
67
4.4
37 4.5
58
5.4
50
5.9
20
7.0
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 35
Mejor Resolución ,
linea base!!
Rs=1.21
Rs=1.9
Optimización de los parámetros del instrumento
para el uso de columnas de pequeño volumen
Los parámetros críticos del instrumento incluyen:
Velocidad de adquisición de datos
Tamaño de la celda de flujo
Tubos capilares
Volumen de mezcla (parte del volumen de
retraso del gradiente)
Volumen de retraso del gradiente (dwell volume)
Isocrático y
Gradiente
Gradiente solo
Optimización de resultados con columnas sub-2um
- Comparación de la velocidad de adquisición de datos
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Velocidad de adquisicion de datos = 2 seg
Velocidad de adquisicion de datos = 0.1 sec
Platos #3 Platos #4
3478 4384
Platos #3 Platos #4
6613 6138
Columna: ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 4.6 x 30 mm, 1.8 µm Fase Mobil: 60% Metanol: 40 agua Flujo: 1mL/min
Temperatura: RT Detección: UV 254 nm Muestra: QC Test 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cl-Nitrobenzeno 4. Tolueno
Contribución del Instrumento HPLC al rendimiento en Isocrático y en Gradiente
ECV = volumen de muestra+ volumen tubos de conexión + volumen conectores+ volumen celda del detector Dwell Volume = volumen desde la formación del gradiente a
la cabeza de la columna.
Extra Column
Volume (ECV) {
Dwell
Volume
Fase
móvil
Detector
Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent
Poroshell 120 Evaluacion de N para la Poroshell 120 150 mm × 4.6 mm column
39
Muestra:Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene
Column: Agilent Poroshell 120 SB-C18 150 mm × 4.6
mm, 2.7 μm
Fase Movil: Agua: ACN = 30:70
Flujo: 1.5 mL/min
Volumen de Inyección: 1 μL
Temperatura columna: 50 °C
Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz,
celda estandar
Pressure: 200 bar
Maximizar la Eficacia usando columnas Agilent
Poroshell 120 100.000 platos en menos de 5 min usando 3 columnas en serie
40
Muestra: Thiourea, Acetophenone, Benzene, Toluene
Columna: Tres columnas Agilent Poroshell 120 SB-
C18, 150 mm × 4.6 mm, 2.7 μm
Fase Movil: Water: ACN = 20:80
Flujo: 1, 1.5, 1.8 mL/min
Volumen de inyección: 1 μL
Temperatura columna: 60 °C
Detector: DAD 254 nm/10, Ref 360/100 nm, 20 Hz,
celda estandard
Video para la transferencia de métodos con
Poroshell 120 en la web de Agilent
41
https://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Columns-Sample-Preparation/LC-LC-MS-
Columns/Analytical-HPLC-UHPLC/Poroshell-120/Pages/poroshell120video.aspx
UHPLC – ¿Porqué usar columnas diferentes?
Los instrumentos UHPLC incluyen una variedad de opciones de alta presión además de las diseñadas para Alta productividad y Cromatografía Rápida.
Estos instrumentos operan a presiones superiores a los 400 bar/6000 psi.
El objetivo es tener columnas de pequeño tamaño de particula <2-3um para obtener una mejor eficacia, resolución y productividad en estos instrumentos.
Esto nos da la flexibilidad de operar por encima de los 400 bar en muchas aplicaciones – bien para obtener velocidad o bien para mejorar la resolución con columnas largas de 1.8um
El nuevo Agilent 1290 Infinity puede operar hasta 1200 bar.
Esto requiere columnas diseñadas para poder trabajar hasta los 1200 bar – las nuevas columnas RRHD!
Separaciones por debajo de1 Minuto con Columnas
RRHD
ZORBAX RRHD SB-C18, 2.1 x 100mm, 1.8 µm
H2O (0.05% Acido Fórmico) / 2-98% Acetonitrilo
T = 80°C
Inj Vol = 0.5 µl
WL = 210 nm
DR = 80 Hz
F = 2 ml/min
P = 1085 bar
10 Compound Pharma Test Mix
1.0min
Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis y la Rs
Page 44
RRHD 1.8um 1200 bar
Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, Temp: ambiente, Columnas: RRHD SB-C18, 2.1 mm ID, Longitudes
abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona
Rs3,2: 5.64
N6 : 10,700
Presión: 350 bar
Solvente: 1,25mL
Rs3,2: 11.98
N6 : 34,100
Presión :750 bar
Solvente: 2,5mL
Rs3,2: 9.02
N6 : 21,100
Presión : 566 bar
Solvente: 1,75mL
50 mm
100 mm
150 mm
min 0 1 2 3 4
min 0 1 2 3 4
min 0 1 2 3 4
0
La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar alta
resolución con el 1290 Infinity LC.
Aumento de eficacia y Resolución con longitudes
largas 150 + 100 mm = 250 mm 1.8um @ 1100 bar
Page 45
α3,2: 1.20
Rs3,2: 8.76
N6 : 50,200 Pw2: 0.018 min
Pw6: 0.037 min
α3,2: 1.19
Rs3,2: 6.42
N6 : 31,400 Pw2: 0.016 min
Pw6: 0.029 min
150 mm (P:582 bar)
150 +100 mm (P:1095 bar) 1. Uracilo
2. Acetofenona
3. Propiofenona
4. Butirofenona
5. Valerofenona
6. Hexanofenona
Fase Móvil:25:75 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, temperatura ambiente,
Columnas ZORBAX RRHD SB-C18, 1.8um
Alta Rs en 3.5 minutos, 250mm, 1.8um a 1100 bar
La Resolución es buena con la columna de 150mm, pero con una columna más
larga la resolución es mejor
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
50
100
150
200
250
300
min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
50
100
150
200
250
300
¿Dónde cae este ejemplo en el Rango del 1290 Infinity?
Page 46
Esta app. cae en el “Power Range” (0,5ml/min-1.095 bar)
Guía de selección de columnas
para el desarrollo de métodos
rápidos
47
Nuevas tecnologías de columna para el desarrollo
de métodos
Columnas para análisis de alta resolución y alta velocidad
• Columnas Sub-2 µm totalmente porosas para operación a ultra altas presiones
• Columnas superficialmente porosas Sub-3 µm
Considerations when developing methods on new column technologies
• Tamaños de particula < 2 μm, presiones típicas 600-1200
• Tamaños de partícula < 3um, limite de presión 600 bares
Comparando Eficiencia y Presión con Diferentes
Tipos de Columnas
Tamaño de partícula/Tipo
Presión Eficiencia LC Compatibilidad
5µm Totalmente Porosa
40 bar 5,000 Todos los
instrumentos hasta 400 bar
3.5µm Totalmente Porosa
80 bar 7,800 Todos los
instrumentos hasta 400 bar
2.7µm
Poroshell 120 150 bar 12,000
Todos LCs/UHPLCs (hasta 600 bar)
1.8µm Totalmente Porosa
250 bar 12,500 Todos
LCs/UHPLCs (hasta to 1200 bar)
Columnas: 4.6 x 50mm, Fase Movil: 60% ACN:40% Agua Flujo: 2 mL/min
50
1.7um
0.5um
0.5um
Las Columnas Poroshell 120 tienen:
• 80-90% de eficicacia de las sub 2um
• A presiones un ~40-50% más bajas
• Con un tamaño de partícula de 2.7um
• Con una frita de entrada de 2um
• Con el doble de resolución de una
columna de 3.5um
• Con un límite de presión de 600 bar
• La partícula tiene un núcleo sólido
(1.7um) y una cubierta exterior porosa
de 0.5um como zona de difusión
Columnas Superficialmente Porosas Poroshell 120
para HPLC y UHPLC:
Beneficios de la tecnologia de las columnas
Poroshell 120
• Permite aumentar la velocidad de separación (reducción del tiempo de análisis)
• Uso con cualquier instrumento (HPLC o UHPLC)
• Reducción de los costos de solventes y de desecho
• Poroshell 120
• Escalabilidad
• Facilidad de transferencia dé métodos
• Mayor transferencia de masa debido a la menor difusión.
• Fases similares a las columnas ZORBAX totalmente porosas.
Mejoras en la transferencia de masas del analíto
gracias a una menor Difusión
Totalmente Porosa
Superficialmente Porosa
• Particulas totalmente porosas • Difusión a través de toda la partícula
• Poroshell 120
• Difusión solo en la capa porosa
• Resultados:
• Menor término C
• Mayor eficiencia
• Y
• Mayores flujos con
• Mínimo impacto en la eficiencia
CBAh /Ecuación van Deemter
Fases estacionarias de las columnas Poroshell 120
Poroshell 120 EC-C18 and C8
• Robustas C18 y C8 desactivadas para las mejores formas de pico a pH 2-9
Poroshell 120 Stablebond C18 and C8
• Química robusta para pH<2
Poroshell 120 Phenyl-Hexyl
• Misma selectividad que las ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl
• Excelente elección para interacciones pi-pi.
• Selectividad alternativa a EC-C18 o SB-C18
• Selectividad similar a columnas fenil, difenil, u otras columnas fenil-hexil
Poroshell 120 SB-Aq
• Fase de ligado propietario que es una
excelente elección para analitos
polares.
Poroshell 120 Bonus-RP
• Su grupo polar embebido proporciona
una selectividad única para
compuestos polares
Poroshell 120 EC-CN
• Química CN desactivada con caracter
flexible para fase reversa y normal
Poroshell 120 HILIC
• Sílica HILIC para uso en Cromatografía
de Interacción Hidrofílica de moléculas
polares.
Agilent tiene 3 tipos de columnas para UHPLC
Hay 3 tipos de columnas UHPLC – la elección depende de las necesidades
Columnas RRHT – columnas 1.8um para LC rápida hasta 600 bar
• Designadas para su uso con el Agilent 1200RRLC
• Compatible con algunos UHPLC’s con límites de presión hasta 800 bar
Columnas RRHD – columnas1.8um hasta1200 bar
• Designadas para uso con el nuevo gilent 1290 Infinity LC
• Para trabajos hasta1200 bar
• Totalmente UHPLC compatible
Poroshell 120 columns
• Límite the presión de 600 bar para uso con HPLC/UHPLC
• Excellent ajuste para LC’s de 400 bar con resultados tipo UHPLC
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Guías de Selección de Columnas Agilent UHPLC
Análisis
Rápido
Alta Rs
(N)
400 bar LC “Compatible”
1000+ bar
UHPLC “Compatible”
Escalabilidad
de Partícula
1.8, 3.5um
etc.
ID’s
4.6, 3.0
& 2.1
mm
Muestras
sucias?
Poroshell
120, 600
bar X only 2.7um
frita
2um
RRHT,
600 bar
<50mm
RRHD,
1200 bar X X
(3.0 &
2.1)
Page 55
Page 56
Conclusiones
Las conversiones de métodos son una oportunidad para aumentar la
productividad en el laboratorio.
Con los cálculos adecuados se obtienen mejoras en la resolución y
en la selectividad.
Para el uso de columnas más pequeñas con menores tamaños de
partícula puede requerirse la optimización del sistema
cromatográfico.
La presión operativa puede verse incrementada– asegúrese de que
su sistema tiene la capacidad adecuada para operar a las presiones
necesarias en el rango de flujos de los métodos optimizados.
Las columnas Poroshell 120 superficialmente porosas están
diseñadas para trabajar en los rangos de presiones de los equipos
convencionales
Guía de Columna y Desarrollo de Métodos
57
Solicite la Guía de
Columnas y Desarrollo de
Métodos:
Una guía de 162 páginas con
recomendaciones de columnas y
pasos en el desarrollo de métodos.
Número de Publicación 5990-7595EN
Soporte Técnico Agilent
Teléfono de Atención al Cliente:
901 11 68 90
email: [email protected]
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