1

To Enrich or Not To Enrich: How Target Enrichment Can Advance Your Research 

 [0:00:00] Sean Sanders:  Hello  and  welcome  to  this  Science/AAAS  webinar.  My  name  is  Sean 

Sanders and I’m the commercial editor and webinar editor at Science.  Slide 1    Today’s  webinar  will  focus  on  the  methodologies  for  DNA  target 

enrichment  prior  to  next‐generation  sequencing.  As  the  price  of  next‐generation sequencing continues to  fall, the debate  is heating up about whether it is viable and prudent to perform some type of target selection procedure before sequencing. A number of variables must be considered to make the best decision  including the number of samples, the amount of DNA available, the sequencing platform used, budgets, reproducibility requirements, and the availability of automation. We hope to expand on and  clarify  some of  these  issues  today, discussing  the pros and  cons of various  target  enrichment  procedures  and  how  they  can  be  applied  to your next‐generation workflow. 

   We’re using a slightly different format for this webinar today. We are for 

the  first  time broadcasting  live  from  the headquarters of  the American Association for the Advancement of Science, the publisher of the journal Science here  in Washington, D.C.  in  front of a  live audience.  I trust that everything  will  go  smoothly,  but  if  we  have  some  technical  hiccups, please bear with us. 

   Joining me today are three expert scientists to share their knowledge and 

expertise in this field. Just to my left is Dr. Dale Hedges from the Hussman Institute for Human Genomics in Miami, Florida. Next, we have Dr. Elaine Mardis from Washington University in St. Louis, Missouri. And finally, we have  Dr.  Jun Wei  from  the  National  Institutes  of  Health  in  Bethesda, Maryland. 

   A reminder to our online viewers that you can see an enlarged version of 

any of the slides by clicking the enlarge slides button and that  is  located just  underneath  the  slide window  of  your web  console.  You  can  also download a PDF copy of the slides by using the download slides button. If you’re joining us live you can submit a question to the panel at any time by  typing  it  in  to  the  ask‐a‐question  box  to  the  bottom  left  of  your viewing  console  just  under  the  video  screen  and  clicking  the  submit 

2

button. Please remember to keep your questions short and to the point as this will give them the best chance of being put to the panel. We’ll get to  as  many  questions  as  we  can  in  the  Q&A  session  following  the presentations  at which  time we will  also  take  questions  from  our  live studio audience. 

   Finally, thank you to Agilent Technologies for their sponsorship of today’s 

webinar.    So  I’d  like now  to  introduce our  first  speaker  for  the webinar, Dr. Dale 

Hedges.  Slide 2    Dr. Hedges is an assistant professor of Human Genetics and serves as the 

Assistant  Director  of  the  Center  for  Genome  Technology,  part  of  the Hussman  Institute  of  Human  Genomics  at  the  University  of  Miami. Through  his  role  in  the  University  of  Miami  Center  for  Genome Technology, Dr. Hedges  is actively  involved  in the  incorporation of novel genomic technologies  into the process of searching for genetic variation underlying human disease risk. 

   So welcome, Dr. Hedges.  Dr. Dale Hedges:  Thank you, Sean, for the introduction.  Slide 3    I thought I’ll start today by discussing the essential problem that targeted 

enrichment  seeks  to address, which  is  the  fact  that despite all we hear about  the  increased  throughput of next‐generation  sequencing  and  it’s almost becoming a cliché now,  I was  talking about  the volumes of data that  we’re  producing,  the  actual  ability  for  us  to  selectively  provide material  for  those  platforms  to  leverage  or  to  take  advantage  of  that increasing throughput, actually this remains surprisingly limited. 

 Slide 4    And  so  why  would  we  want  to  selectively  provide  material  to  these 

platforms? Well, despite the fact that we have this capacity, we still can’t routinely go out and sequence human genomes, at least not at the sort of skills  that we would need  for  instance at  the  ‐‐  for  the  institute  I work with where we’re looking at complex genetic disorders. The populations, the  sizes  that we  actually need  to examine  for many of  these diseases 

3

where  the  odds  ratios  aren’t  very  high  can  be  in  many  hundreds  to sometimes thousands before you could expect to actually detect a novel ‐ a locus conveying risk for a disease. 

   So  being  that we’re  not  there  yet, what  can we  do  in  the meantime 

between sort of routine sequencing of whole human genomes and where we are now? And  I  think  that’s  ‐‐ and  I  think everyone  recognizes  that we’re sort of  in a  temporary phase right now and we would  like  to  just sort of sit around in some sense and wait till we could leapfrog over this whole problem and just routinely sequence all the genomes we want. But we  all  know  you  just  can’t  sit  around  twirling  your  thumbs  and  that’s exactly where targeted resequencing comes in. 

 Slide 5    It’s sort of the idea of let’s scale up the process of reaching down into the 

genome and grabbing those particular regions that we’re interested in in much  the  same way  that we  are  doing with  conventional  ‐‐ we were doing with conventional PCR, but at a  larger  scale  to  sort of match  the capacity  of  these  next‐generation  sequencing  platforms.  And  so hopefully, that will help bridge the gap between where we are now and where we see ourselves going in the next few years. 

 [0:05:17]  Slide 6    So what  are  the primary  strategies  that  are employed  right now  to do 

this?  I’ll  very briefly go over  these. My  colleagues will go over  them  in more  detail  soon.  But  on  the  one  hand,  you  have  array‐based oligonucleotide selection, which  is a solid phase substrate where so you grab those regions of  interest on a physical array, or the solution‐phase capture, which  is  a  same  basic  idea  of  hybridization  but  removing  the array from the picture. 

   An entirely different set of approaches  involve essentially using PCR but 

just  at  a  larger  scale.  One  of  those  is  molecular  inversion  probe sequencing  and  also  very popular  right now  is RainDance Technologies which  uses  a  massively  parallel  PCR  approach  that  leverages  their particular microfluidics emulsion system. 

 Slide 7  

4

  And  the  power  of  target  enrichment  can’t  really  be  utilized  effectively unless you can combine it right now at least with a barcoding strategy or indexing. So simply providing some sort of  identifier onto  the sequence very near preparation process for sequencing allows you to sort out the particular samples after the fact bioinformatically. 

 Slide 8    And  so  there  are  several  commercially  available  options  right  now  for 

targeted  enrichment.  Agilent  and  Nimblegen  both  offer  array  and solution‐based  approaches,  RainDance  as  I  mentioned  the  PCR‐based approach. Febit is newer on the scene and offers an array‐based capture in  a more  automated  ‐‐  complete  automated  system,  and  LC  Sciences offers services for both array and solution‐based capture. 

 Slide 9    So  where  exactly  this  is  targeting  inter  into  the  workflow  for  next‐

generation sequencing?  It really depends on what sort of system you’re using.  Basically,  if  your  capture  results  in  fragments  that  aren’t  really amenable to sonication basically or they’re below 2000 base pairs or so and  they  don’t  really  fragment  efficiently,  you  have  to  go  through  an additional  procedure  of  concatenation  and  refragmentation  of  those larger fragments. On the other hand, depending on what combination of capture  and  platform  you’re  using,  the  capture  can  actually  very seamlessly work into your sequencing library preparation and go straight forward, straight directly to the sequencing platform. 

 Slide 10    And  so  one  of  the  things  I wanted  to  address was  this  sort  of major 

considerations that you have to think about when you talk about ‐‐ when you’re going about target enrichment, and one is the fact that you’re not going to get everything that you target and that a lot of what you actually will sequence is going to be off target. And this is very important to note and think about beforehand that you have some at least rough estimate of  how much  that  is  going  to  be  so  that  you  can  calculate  how much sequence  throughput  to  dedicate  to  each  particular  sample  that  you have. If you’re planning a very large project, this is a huge deal. 

 Slide 11    First a few sort of notes on semantics. Even I think a lot of as mix this up 

often  including myself  but  just  to  sort  of  keep  the word  usage  sort  of 

5

standardized. We  like  to  talk  about when we  talk  about  coverage,  the horizontal coverage, basically how much of my intended target is covered by one or more reads of sequence and sometimes people will specify a particular  depth  at  which  they’re  getting  that  target,  that  coverage estimate; as opposed to depth which is the more vertical dimension, how many reads are stacked up at one given nucleotide position. 

   And so one of the metrics and  I’m going to show a  little bit of our own 

data later that I like to use is basically the percent that’s covered at a 20 to 30 fold, which is very important for how the reliability of the genotype information that you can extract from that sequencing. 

 Slide 12    Another  important  issue  to  think  about  is  the number of unique  reads 

that you actually have in your data.  [0:09:58]    As many  of  you  are  aware, when  you’re  going  through  the  process  of 

library  preparation,  there  are  some  amplification  steps  and  that  can actually  produce  clonal  copies  of  what  were  originally  independent fragments, and so those don’t actually represent truly unique sources of data. And so there are many informatics pipelines right now that toss out those  duplicate  reads.  There’s  basically  through  the  process  of  de‐duplification. 

   Now,  there  are  some more  recent  algorithms  that  claim  to  be  able  to 

actually  use  those  non‐unique  reads  to  increase  the  robustness  of  the actual unique  reads. So basically, understand  that  they’re not unique.  I mean understand that they’re not representing independent data points, but nevertheless using that redundancy to increase the robustness of the one data point that they do represent. 

 Slide 13    Another  important  concept  is  the  idea of uniformity among  targets. So 

you can have on average 50X coverage, but if that includes having 6000‐fold coverage at one region and three‐fold coverage at a bunch of others, that doesn’t, you know, work well  for your downstream  inferences that you  can make. And  so  be  very wary when  you  hear  about,  you  know, people giving you their average read depths, you know, after the fact of the  study.  It  really  tells  you  very  little  about  how  reliable  that  data  is going  to be  for  inferences.  You  really need  some  sort of metric of  the 

6

dispersion  around  the mean,  and  people  have  come  up  with  various approaches to measure that. 

 Slide 14    Ultimately,  this  sort of depth and coverage come down  to at any given 

base  position  that  I’m  looking  at  for  my  sequencing  data  how  many independent  samples do  I have of  fragments  for my  sequencing  library and how  reliable  is my  inference  for a diploid  genome  for  the  state of that particular position.  Is  it heterozygous, homozygous  for a particular variant? And all those off‐screen metrics that I was talking about in terms of depth and coverage and  so  forth ultimately  for us at  least  is what  it comes down to is do I have enough independent sampling events at any position to reliably call a genotype. 

   And I should also mention that the particular algorithms that you then go 

on to use to call that variation and also call and decide what to toss out and what to keep in when you make those calls can tremendously affect the  numbers  that  you  find  and  the  quality  of  the  genotype  calls themselves. 

 Slide 15    So very briefly,  I wanted to go over some preliminary data from a study 

we  very  recently  concluded  in  our  laboratory  where  we  looked  at essentially the same region on three different platforms: the Nimblegen array capture, RainDance massively parallel PCR, and Agilent SureSelect. Now,  as  many  of  you  are  aware,  these  actually  allow  you  to  target different‐sized  regions,  and  at  that  time, Nimblegen  could  ‐‐  the  385K array  could  target  5 megabases when we’re  planning  the  experiment. Agilent was about 3.3 megabases and RainDance could target about 1.6. 

   So  we  basically  picked  5  megabases  essentially  randomly.  It’s  like 

sampling from across the genome. And then for Agilent ‐‐ that was used for Nimblegen and  then  the 3.3 megabase  subset of  that was used  for Agilent and the 1.6 megabase subset of that was used for RainDance, and at least some portion was covered by all three platforms. 

 Slide 16    And  sort  of  highlighting  the  importance  of  some  of  the metrics  that  I 

mentioned earlier,  the very  first  thing you’ll want  to discuss or want  to think about when you’re designing  the  study  is not every platform  can actually target everything that you might be interested in, and I think this 

7

is  ‐‐  in our particular  instance, we  looked  at what each platform  could actually  target  out  of what we  gave  it,  and  this  is  an  instance where RainDance actually comes out  looking very well because they can adjust the primers that they’re using to avoid repetitive regions then get a more comprehensive  coverage  of  the  regions  of  interest.  Hybridization approaches  are  a  little more  limited  by what  they  can  actually  design probes  to because of  repetitive sequences and other  temperature  (TM) considerations. 

 Slide 17    As  far  as  percent  on  target,  we  didn’t  really  see  any  appreciable 

differences between one capture platform or  the other  in  terms of  the number of reads we got per SOLiD octet spot. Basically, we got 28 to 39 million  reads and each of  these were  independently  loaded on a SOLiD octet spot I neglected to mention. 

 [0:15:15]    As far as how many, 60 to 65% of those reads mapped somewhere on the 

genome, which is about what one expects from the SOLiD data.    Where  things  really  start  to  get  interesting  is  when  you  look  at  the 

percent  on  target  of  that  fraction  that mapped what  percent were  on target. So Nimblegen, we saw about 55% on target. Oh, the little asterisk there  indicates  that  we  actually  had  to  ‐‐  they  were  captured  using Nimblegen’s  standard  protocol,  which  included  attaching  their  own anchors so we actually had to re‐concatenate and shear again, and they actually  lost  some efficiency due  to  that process. So  it probably  should have another 6 to 10% coverage to that number. 

   RainDance,  50%,  and  they  also  had  to  go  through  a  concatenation 

process  as well  although  that’s  sort  of  unavoidable  in  their  particular instance. Agilent, we saw on average, and this is an average of a couple of samples that I’ve looked at so far, 66%. So we’re quite happy. 

 Slide 18    How much did we cover for each given depth? So at 1X, all the platforms 

did particularly well. At 5, 10, 20X you can see  things start  to slowly go down, but actually, we’re pleasantly surprised with or happy, you know, to  see what  the  sort  of  numbers we were  getting  for  each  platform. Really at 20X is where we start to pay attention because that’s where we begin to get confident calling genotypes across millions of base pairs and 

8

not worry so much that our false negative array is going to be extremely low, and obviously, 30, 50X is even better. 

   But  it’s  important that  I mention here that when  I get back and actually 

publish the data, I’m going to adjust for the actual total amount targeted for  each.  So  if  one made  those  adjustments,  then  you would  see  a  ‐‐ actually, Nimblegen’s numbers actually come out a little better than they look  here  because  they’re  actually  targeting  more  sequence  and  so they’re  leveraging  ‐‐  I mean, so  the  throughput  that’s dedicated  to  that sequence  is a  little  less  than Agilent and a  little  ‐‐ and even more  cells since RainDance. So Nimblegen would actually  come off  looking a  little better  in  this case once  that adjustment  is made and RainDance a  little worse. 

 Slide 19    Just from what we’ve seen so far in our hands, we certainly can say that 

each method has its own strengths and weaknesses and it depends a lot on what  the goal of your particular project  is.  If you absolutely have  to cover everything and you can’t afford to miss 10% here or there that you simply can’t even target, then RainDance is a really attractive option. 

   We’ve also found that in the process of working with the arrays and with 

the solution capture that we certainly find the solution to be a  lot more amenable to scaling up. And also,  it’s really  important to know that you won’t be getting every base position. So  if your downstream analysis  is completely  dependent  on  getting  every  bit  of  information  from  the regions that you’re interested in, then you’re going to be disappointed at the end because you miss a lot and you won’t always miss the same thing from  the  same  region.  You won’t  always  drop  out  on  every  different individual. You’ll miss different things  in different people although there is some consistency about which from what you miss. 

 Slide 20    So very briefly,  I wanted to acknowledge  in terms of the data  I was  just 

speaking about the few technicians that actually did all the SOLiD library preparation work for that, our Ashley team from UM. 

 Sean Sanders:  Okay, thank you. Okay, thank you very much, Dr. Hedges.  Slide 21  Slide 22 

9

  Our next speaker today is Dr. Elaine Mardis and Dr. Mardis holds a Ph.D. in Biochemistry and Chemistry and a B.S.  in Zoology from the University of  Oklahoma.  Prior  to  joining  The  Genome  Center,  she  was  a  senior research  scientist at Bio‐Rad Laboratories  in Hercules, California, and  in her  current  position,  Dr.  Mardis  has  played  a  pivotal  role  in  the evaluation,  optimization,  and  application  of  novel  sequencing instrumentation,  chemistry,  and  molecular  biology  toward  improving genome sequencing. 

 [0:20:00]    She  also  orchestrates  the  center’s  efforts  to  explore  next‐generation 

sequencing  technologies  and  to  transition  them  into  production sequencing capabilities. 

   So welcome, Dr. Mardis.  Dr. Elaine Mardis:  Thanks very much, Sean, for the  introduction and for the opportunity to 

be here to present some data from our center regarding our experiences with targeted hybridization capture of exomes. 

 Slide 23    So  I  thought  it would  be  interesting  to  at  least  give  you  an  overview 

briefly  of  some  of  the  targeted  resequencing  projects  that  we  have ongoing  that  involve  re‐examining  portions  of  the  human  genome  and they’re  listed  here,  and  essentially  range  from  studying  ovarian tumor/normal pairs  as part of  the  cancer  genome  atlas  to  a  variety of complex  disease  studies  ranging  from  eye  diseases  such  as  retinitis pigmentosa, macular  degeneration,  to  broad  skill  studies  that  involve thousands  of  samples  including  this  Allelic  Spectrum  of  Metabolic Disorders project  that we’re  involved  in now. And  the  scale of  some of these studies actually hasn’t required us to invent automation around the solution phase capture results that I’ll talk about today. 

   For  the purposes of  today’s presentation,  I’m going  to  focus on  results 

from five matched tumor/normal pairs of ovarian cancer samples, and in particular,  I should  tell you  in advance  that  these are also samples  that our  sequencing  center  has  sequenced  by  whole  genome  methods  to complete full depth suitable for genome‐wide analysis. And I’ll come back round to that  in the very  last slide to show you some comparative data between exome capture and whole genome sequencing analysis. 

 Slide 24 

10

   So  the  next  slide  essentially  looks  at  the  overlap  between  the  two 

commercially available platforms, which  shall  remain nameless because of  our  confidentiality  and  disclosure  agreements  that we  have  signed with both companies that offer this, and the conserved coding sequences defined by  the NCBI, which  is  shown  in  the green circle. And what you can  see  is  that  there’s  a  large  amount  of  overlap  but  that  it’s  not complete. Now, both of  these exome capture platforms actually offer a nice  increase  amount  over  and  above  coding  sequences  for  genes  of which  include  non‐coding  RNAs  and  other  regions  of  interest  in  the human genome, but most people, for the purposes of capturing exomes, would like to be able to say that they are at least targeting the majority of the conserved coding sequences available through NCBI. So that’s sort of our metric for comparison. 

 Slide 25    And Dale did a really nice job of explaining coverage depth and breadth. I 

just  have  a  couple  of  slides  to  illustrate  this  from  real  data.  This  is  a region on chromosome 8 that’s been targeted by both platforms A and B, and what you can see is across the breadth of coverage for the region, at 1X coverage, both of the platforms actually provide  full coverage. 100% of the base is covered at 1X. But of course, this is not a sufficient depth at which one would call variants. 

 Slide 26    So  if  you  fast  forward  to  change  the  y‐axis  now  to  start  at  20‐fold 

coverage  and on up, what  you  can  see  is  that  the picture  very  rapidly changes;  namely,  about  7%  of  the  target  region  has  no  coverage whatsoever  by  either  exome  capture  set,  and  the  shared  coverage between  the  two  reagents drops  to  about  10.5%. And  as  you  can  also see, the coverage depth varies quite a bit still. 

 Slide 27    So how does  this  look  if you  flesh out now  to  the entire genome‐wide 

coverage with these two reagents, both at 1X depth and 20X depth? As you can see, this  is a quite different coverage model at these two  levels and  varies  a  little  bit  between  the  two  platforms  depending  upon whether  you’re  looking  for  1X  coverage  or  20X  coverage  across  the totality of regions that are represented by the exome capture reagents. 

 Slide 28 

11

   Now, let’s look very carefully at a number of slides that follow the course 

of  analysis  across  some  of  these metrics  that Dale  just  introduced  for these five ovarian tumor/normal pairs. So you can see the graph showing here represents on the y‐axis the total number of high quality nucleotides that were aligned onto  the genome and  then how  they broke out  into different  categories.  So  if  you  look  carefully  at  the blue bars  along  the bottom, this represents truly unique. 

 [0:25:00]    These are paired‐in  reads  from  the  Illumina System. On‐target  so  these 

conform to the targeted regions defined by the BED files for these exome capture  reagents A  and  B. And  on  average,  about  50%  of what  you’re looking  for  in  terms  of  unique  on‐target  reads  actually  is  representing that category. 

   Dale also mentioned that there are problems with PCR biasing that  lead 

to  true  duplicate  reads  with  the  same  start  and  stop  site.  These  are represented by the varying levels of the small intermediate red bars. And then the green bars and the purple bars above those actually represent the  combination  of  unique  and  duplicate  off‐target  reads.  So  this  is  in many cases approximately equal  to  the amount of on‐target  reads  that you obtain. 

   And then at the very top, one can see the number of unaligned reads that 

don’t map  to  the  human  genome,  and  this  can  be  due  to  a  variety  of reasons  that  include  the overall quality of  the  read but more  likely  just that  there  are  regions  of  the  reference  genome  that  often  don’t correspond. 

 Slide 29    So  now  let’s  look  at  these  ovarian  tumor/normal  pairs  broken  out  by 

exome  reagent A and B at  the  level of depth  relative  to  the  conserved coding sequences that I talked about earlier. And if you can establish for yourself what  depth  you’re  comfortable with  in  terms  of  truly  calling variants  typically  falls  somewhere  in  the  range  between  10X  and  20X coverage. So what you can see from sort of looking at this varying level of blue bars  is  that on average, you’re getting on  the overall about 75  to 80% coverage across the CCDS regions of the exomes. If you want to have your coverage higher at 30X,  then  the  levels drop commensurately, but they’re  roughly  equal  across  all of  the  tumor/normal pairs  shown with the  exception  of  ovarian  cancer  5  in  the  B  reagent  where  we 

12

unfortunately encountered some low data quality that was not related to the quality of the capture reagent in that particular case. 

 Slide 30    Let’s  just  break  this  out  now  for  one  of  these  ovarian  tumor  samples, 

again showing the percent of base pairs for the CCDS on the y‐axis. The blue bars  represent  the shared amount of coverage between  reagent A and B at various  levels of overall coverage, ranging from 1X to 20X, and you  can  see  that  the  levels again drop as  you  go out  to  the 10  to 20X range, which is where you truly need to be calling variants. The red bars represent sequences that are unique to the A reagent, the green ones to the  blue  reagent,  and  then  the  purple  bars  on  top  are  regions  of  the exome that are defined but not covered by these reagents. 

 Slide 31    And  then  lastly,  I  have  some  specific  gene  examples  that would  be  of 

interest  for example  in  studying ovarian  cancer  and how well  they  are covered. So you see at the top level the canonical BRCA1 and 2 loci where in particular, BRCA1  is  covered quite nicely by both  reagents, BRCA2  a little bit less so, and the two genes along the bottom, ERCC2 and STK11, have varying levels of coverage, STK11 in particular being not terribly well covered at all. 

   So  I mentioned the comparison to whole genome shotgun data and this 

really describes  for me, even though  I spend a  lot of time talking about capture  and  coverage,  we  have  to  have  coverage  in  order  to  define variants. But at the end of the day, what we really care about is detecting variants,  and  so  that’s  to  me  the  key  metric  of  success  for  these methodologies. 

 Slide 32    And  what  you  can  see  is  again  the  five  ovarian  tumors  now  just 

specifically  represented. Whole genome  shotgun data  is  represented  in the first column, the two exome capture reagents in the second and third columns.  And  parenthetically  after  the  number  of  high  quality  genic variants detected is the number that we’ve actually now been able to go back  and  validate  using  directed  PCR  in  an  orthogonal  sequencing method. 

   And  what  you  can  see  quite  readily  is  that  in  every  case  for  whole 

genome  sequencing, we’re  able  to  detect  a  larger  number  of  somatic 

13

mutations and also validate a  larger number of somatic mutations  from that dataset. 

 Slide 33    And so I’ll finish there and acknowledge the group that provided me with 

these slides, especially Todd Wylie and Jason Walker, who  in association with Jasreet Hundal, Dan Koboldt, and Will Schierding produced a  lot of the data analysis that was shown in these slides and these views, and Bob Fulton overseas, the production of all the capture data at our center. 

 Sean Sanders:  That’s great. Thank you very much, Dr. Mardis.  Slide 34  [0:30:00]    So we’re on to our final speaker for today and that is Dr. Jun Wei.  Slide 35    Dr. Wei completed his undergraduate degree in Biology at the University 

of  Houston  before  doing  his  doctoral  work  at  the  Baylor  College  of Medicine,  also  in  Houston.  Following  a  postdoctoral  fellowship  at  the National Human Genome Research Institute at the National Institutes of Health, Dr. Wei stayed on at  the NIH and  is now a staff scientist  in  the Pediatric Oncology Branch  of  the National Cancer  Institute. He  and  his laboratory  are  currently  focused  on  using  next‐generation  sequencing technologies to identify causative genes for pediatric cancers. 

   Welcome, Dr. Wei.  Dr. Jun Wei:  Thank you, Sean, for the nice introduction, and I would like to share with 

you  our  experience  with  the  target  enrichment  and  the  next‐gen sequencing project in our lab. 

 Slide 36    Here  is  the outline of my portion  of  the  talk.  I will  introduce  you why 

we’re  doing  this  next‐generation  sequencing,  and  also,  I  wanted  to introduce  to  you  the  application  of  the  next‐generation  sequencing technology. And as our previous two speakers eloquently elaborated the necessity of the enrichment at this step, so it’s majorly the two points we needed  during  enrichment  is  the  cost  and  the  coverage  of  the 

14

sequencing. So  I will show you some data produced  in our  lab using the AB  SOLiD  platform  as  well  as  the  Agilent  SureSelect  whole  exome enrichment. 

 Slide 37    So currently  in pediatric oncology field, as any other cancers, metastatic 

disease  is  treated  uniformly with  a  standard  therapy.  However,  some people respond to this therapy but some people with the cancer will die eventually. 

 Slide 38    And  in order to  improve the successful rate of the therapy and now we 

employ  the  genomics  to  device  a  biomarker  to  further  categorize  this group into different groups with either good signature. 

 Slide 39    So  this  group  of  patients  that  can  be  treated with  a  standard  therapy 

have a good outcome.  Slide 40    Or  this  poor  signature  group  of  people  hopefully  will  use  this  new 

technology to discover the cause or the driver of mutation or the cause of disease  so  we  can  do  targeted  individual  combinational  therapy  to improve the survival in this group of patients. 

 Slide 41    So  next‐generation  sequencing  allowed  us  to  do  the  comprehensive 

analysis  of  cancer  genomes  on  the  same  platform.  Currently, we  have DNA and RNA derived  from either germ  line or  tumor  samples and we can use  the  same platform  to acquire all  the genomic  information  that we  need  to  either  discover  the  new  biomarkers  or  the  biology  of  the tumor,  and  hopefully, we  can  identify  the  therapeutic  targets.  So  this information  including on the DNA side,  including the DNA copy number, gene  arrangement,  the  structure  change,  and  the  methylome information, and then of course the damaging mutations. 

   On the RNA side, we can acquire the information of the gene expression 

levels and  chimeric genes and  the  splice variants, novel  transcripts and then also the damaging mutations. 

15

 Slide 42    Sequencing is all about the coverage as you see Dale and Elaine has gone 

through  all  this  technology.  So  the  more  coverage  means  the  higher accuracy in the data. 

 Slide 43    However, the high coverage is also associated with the high cost.  Slide 44    And  this  is  the  chart  I  listed  here  to  compare  the  different  types  of 

sequencing experiments,  the cost  for  those kind of experiment done  in the SOLiD 3 Plus platform. 

 [0:35:00]    So  currently,  to  sequence  a  whole  human  genome  at  about  the  20X 

coverage, the cost is about $16,000, but if you do the whole exome, you will only need  to sequence about a quarter of  the  flow cell. The cost  is about $2400. And  if you do  the whole genome, a whole  transcriptome sequencing,  it will  cost about  like double  the  cost of  the whole exome currently. 

 Slide 45    So  the  whole  exome  sequencing  cost  only  is  a  fraction  of  the  whole 

genome  sequencing,  and  also,  it’s  about  a  half  of  the  transcriptome sequencing  at  adequate  coverage.  And  also  here  at  the  cost,  I  didn’t include  the  cost  of  the  data  storage  and  the  analysis.  It’s  not  counted here. So if we associate those kinds of data storage and analysis, the cost is even more. 

 Slide 46    And  this  is  the  genome  partition  platform we use. We  use  the Agilent 

SureSelect system. I’m not going to go into the detail because I think this audience  isn’t familiar with this system. And when we use this platform, we  can  capture  a  certain  region of  the  genome,  targeted  genome.  For example, a part of the 1p36, that’s the region that we are  interested  in the disease of neuroblastoma, a pediatric cancer. 

 

16

  And also, Agilent now has a valuable kit to target a whole exome, which is targeting a coding region of all the genes. It’s about a worth of about 38 megabase. So  instead of you sequence  the whole genome, which  is a 3 billion  base  pair,  now  we  can  reduce  the  complexity  to  about  a  38 megabase, and this 38 megabase  is equivalent to about 20,000 genes  in the  consensus  coding  regions.  And  as  I  previously  showed,  that  will reduce  the cost. However,  this platform has  ‐‐ using  this system  to pull out the exome, we’re going to lose the structural information. 

 Slide 47    What do we mean about  coverage?  So  the  coverage  is equivalent  to a 

particular  base  how many  times  a  unique  sequence was  covered.  For example,  as  you  see  here,  every  sequence  reads  start with  a  different site. So they are coming from the different molecule from the genome. It will give you unique  information as Dale and Elaine already alludes. So you need this kind of unique reads to acquire adequate information, but if  you  do  not  exclude  those  reads  that  is  duplicated,  then  you  don’t increase  your  information.  You  just  sequence  the  same  thing over  and over, which is not good with sequencing. 

 Slide 48    And now we’re  looking at  the coverage. As  I previously said,  this whole 

genome we sequenced at about the 16X coverage, and at that time, we used the SOLiD 3 platform which took us three sequence runs equivalent to  six  flow  cells  of  sequencing  reactions.  And  the  total  base  pair  we covered for sequencing is about 53 billion base and it cost a whole bunch of dollars. And if you see this, the y‐axis is a representation of the bases, of the 3 billion base pair, and then you can see that by 10X coverage or more, we have about 90% of these mappable reads to cover. 

 Slide 49    And this  is an experiment of the transcriptome sequencing. What we do 

here  is we use SureSelect  to cover  the  region as a baseline  to  see how much sequence of a transcriptome were covered. The reason we use this is  because we want  to  see  how much  of  the  transcriptome  sequence were mapped through the exon region. And from this figure, you can see that  at  the  10X  coverage, we  only  covered  about  38%  of  a  SureSelect targeted region. That’s represented by the 7500 CCD coding genes. 

 [0:40:13]  

17

Slide 50    However,  if we use  SureSelect, we only needed  to  sequence on  SOLiD 

platform a quarter of the flow cells. We only needed about 3 billion base pair sequencing and a fraction of the cost; and this  is a typical coverage applied  for this kind of exome sequencing, what we’re usually routinely generating in our lab. 

   Here you can see that at the 10X or more coverage, we covered about 70 

to  80%  of  the  Agilent  targeted  region.  So  this  is  represented  by  the 16,000 CCD coding genes. 

 Slide 51    What about  the on  target  rate? And  the definition we use  in our  lab  is 

very simple. It’s any base of a read falls into a SureSelect region is called on target. 

 Slide 52    So  if we  calculate,  a  SureSelect whole exome  target equals  about 37.8 

megabase. The on target rate is ‐‐ routinely what we’ve got is 70 to 80% of all the mappable reads. 

 Slide 53    And this is the IGV viewer of the three different experiments. You look at 

the coverage. The first one  is the whole genome germ  line sequencing  I just  showed  you.  This  is  about  the 16X  average  coverage.  You  can  see there’s  a  lot  of  reads,  but  it’s  up  and  down  throughout  the  whole genome.  But  if  you  look  at  the  whole  exome,  the  reads  is  very concentrated  on  the  exome  region  that  show  us  at  the  bottom  is  the exome, this gene structure. This is the FGFR4 gene which is important in rhabdomyosarcoma tumor. 

   You  can  see  that  the  exome  sequencing,  the  reads,  these  are 

concentrated on the exome which is supposed to. And if you look at the same  kind  of  experiment  I  described  earlier  for  the  transcriptome sequencing for this gene, the coverage is very poor. 

 Slide 54    And this  is one of the samples that we previously  identified has this CTT 

mutation which would change  the amino acid  from winning  into  losing. 

18

We  published  it  last  year. And with  this whole  exome  sequencing, we were able to  identify these mutations only exist  in tumor but not  in the germ  line  just  as we  reported  before,  but  you  can  see  if we  use  the transcriptome sequencing,  likely we’re not going to  find this because of the low coverage. 

 Slide 55    So  in  the  summary,  I  put  down  these.  All  the  different  kind  of 

experiments,  you  have  to  consider  the  advantages  and  disadvantages. And  for  the  whole  genome  sequencing,  of  course  this  is  the  most complete genome  information you can get. You get everything  including the chromosome structure information, copy number, and the mutation. But  the  disadvantage  is  it’s  still  very  expensive  with  the  current platforms, and another disadvantage  is that  it’s difficult to  interpret the data  especially  those  operations  that  you’ll  find  outside  of  a  coding region. 

   The  whole  exome  sequencing,  the  advantage  is  it’s  relatively  less 

expensive,  easy  to  achieve  high  coverage  on  the  targeted  region  for mutation detection. However, it lacks coverage outside of CCD region and the loss of the structure information. 

   The whole  transcriptome  sequencing  still  had  the  advantage  of  it  can 

detect RNA editing events and also can detect the transcript variants and the  novel  transcripts  and  detection  of  the  fusion  genes,  mutation detections,  and  also  can  yield  gene  expression  level  information. However,  the  disadvantage  is  uneven  coverage  and  currently,  it’s expensive due to the different level of the gene expression. 

 [0:45:00]  Slide 56    I would  like  to  acknowledge  the  chief  of  our  section,  Javed  Khan who 

heads these sections, and also the biologists in our labs who generated all these  data,  and  the  support  from  the  bioinformatics  group  in  our  lab. Thank you. 

 Sean Sanders:  Thanks.  Slide 57  

19

  Okay,  thank you very much, Dr. Wei. So  thank you all  for  the excellent presentations and we are going  to move on  to  the Q&A portion of  the webinar  now.  Just  a  reminder  to  everyone  online  that  you  can  submit your  questions  by  simply  typing  them  into  the  ask‐a‐question  box  and clicking  the  submit  button.  Also  to  our  live  audience,  if  you  have  any questions,  just step up to the mike and  I’ll acknowledge you when  I see you. 

   So the first question is all of you talked a little bit about current available 

options, but maybe we can talk a little bit more about target enrichment and sample tagging. We’ve had a couple of questions come in on that. So maybe I’ll start with Dr. Hedges and we can work our way down. 

 Dr. Dale Hedges:  Well,  in terms of tagging, pretty much all the major platforms out there 

right now have some amenable tagging available to work with and can be used  in  conjunction with  capture.  You  just  have  to,  you  know,  get  to know  beforehand  what  you’re  working  with  and make  sure  that  you integrate  that  tagging appropriately  in  the  library preparation step. You know,  if you’re not  thinking  things  through ahead of  the  time, you  can find  yourself,  you  know,  having  to  stop  and  redo  some  part  of  the protocol  because  you  haven’t  used  the  appropriate  anchor  or  primer sequence  at  some  point. Right  now, we  are working with  16  barcodes available for SOLiD and buy potentially more on the way, 12 for Illumina and  I’m  sure  they’re  also  working  on more  ‐‐  and  we  have  as  far  as Nimblegen… 

 Dr. Elaine Mardis:  I think it’s 12.  Dr. Dale Hedges:  12, yeah.  Dr. Elaine Mardis:  Of the 454.  Dr. Dale Hedges:  Of the 454.  Dr. Elaine Mardis:  Yeah.  Dr. Dale Hedges:  Okay. But basically, each platform, each major capture technology, they 

have worked directly with  indexing method or because of the way their output  is  produced,  for  instance  RainDance,  you  can  just move  in  to whatever  library platform and  indexing mechanism you wish, essentially starting with double‐stranded DNA. 

 Sean Sanders:  Dr. Mardis?  

20

Dr. Elaine Mardis:  Yeah.  I mean,  I would agree with Dale.  I think the push to do additional indexing  or  barcoding  has  really  risen  commensurate  with  the  rising capacity.  So,  you  know,  you  see  yourself  at  a  point  on  these  different platforms where  a  single  lane  or  region  of,  you  know,  the microfluidic chip can yield an ever‐increasing number of reads and you know this sort of drives that equation, that need for more, you know, figuring out how many  samples  you  can multiplex  together  onto  the  region.  You  know really it’s sort of a complex calculation that goes directly to what average local coverage you would like to achieve, the number of samples that you have available,  the amount  that you expect on average of  sequence  to get out of that region, you know, and so on. So  it really  falls doing that calculation and then figuring out what the right combination is. And then, you know, there’s also the de‐convolution piece on the other end which goes  to  actually  sorting  the  different  reads  into  bins  so  that  you  can associate them with the appropriate sample that they originated with. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Wei?  Dr. Jun Wei:  Yeah,  I  agree  with  Elaine  about  this  throughput  thing  because  the 

advantage of barcoding  is you can sequence much more samples  in one goal, one sequencing goal. But this is really in the condition that you have enough throughput. If you don’t have enough throughput on a platform, there’s almost no point to do that. 

 Dr. Elaine Mardis:  Yeah.  Dr. Jun Wei:  And  another  thing  is  I  think  we  have  to  pay  attention  to  the 

bioinformatics side of this exercise to have a tag because any platform, if you  add  another  layer  of  complexity,  you’re  subjected  to more  error happening in this decoding process. For example, in our experience with SOLiD  that you have  to  really match up which  tag you use  to mix  them because  you  cannot  be  using  these  two  together.  You  will  cause  an imbalance of the color and that will cause the increase of the error when sequencing  the  tag. So  those  factors need  to be considered before you design this kind of experiment. 

 [0:50:15]  Dr. Dale Hedges:  Let me  just chime  in also once again briefly. When you actually  ‐‐  if you 

have  the  luxury  to  do  so,  if  in  a  larger  project  for  instance,  instead of trying to just empirically calculate how much throughput you are going to need  for  each  individual,  one  of  the  strategies  we  have  been implementing  is simply to empirically sort of do a ramp‐up phase where we start by undershooting what we know pretty certain is going to be our 

21

general  ballpark  of  how many we’ll  be  able  to  index  and  then  sort  of ramp up from there, and that’s how we sort of empirically can see how many samples we can  index. Because  in all the empiric calculations you can  think of,  you  know,  there’s always  some other  factor you may not have  to  think about  in your particular  target set  that may cause you  to undershoot your predictions. 

 Sean Sanders:  Excellent.  Our  next  question  is  how  could  small  insertions  of  lesions 

possibly  impact enrichment?  So Dr. Mardis,  you had mentioned earlier that you’ve done some work within those. 

 Dr. Elaine Mardis:  Yeah. We have a little bit of experience with this especially in the ovarian 

capture  where  you  actually  see  quite  a  large  number  of  insertion deletions and important genes like TP53 for example. And, you know, the experience there has been that these regions are capturable I think, you know,  to a  certain extent. Typically, what you’re going  to  find  in genes are  along  the  lines  of  one,  two,  or  three  base  pair  insertion  deletion events,  and  within  that  region,  you  can  probably  capture  those  with reasonably good efficiency and then beyond that sort of all bets are off, right? ‘Cause you’re going to lose hybridization efficiency at some level. 

 Sean Sanders:  Right, right. So we have a question from the audience.  Audience Member:  Yes.  For  Dr.  Hedges  and  Mardis,  can  you  speak  a  little  bit  to  the 

amplification  bias  and  how  that  your  results  compared  and  how  that weighs into the amount of material that goes under the sequencer? 

 Sean Sanders:  Okay.  In  case  the  online  audience  didn’t  hear,  that  was  about  the 

amplification bias and how that might affect your results.  Dr. Elaine Mardis:  I’ll  start.  So  yeah,  so  the  biasing  really  goes  to  the  following 

phenomenology, you know. Duplication in and of itself is not necessarily a bad thing.  It’s a bad thing when errors creep  into the PCR step sort of early  on,  and  then what  you  end  up  doing  is  sort  of  biasing  an  error‐containing amplicon if you will, but when you align it to the genome can masquerade  as  a  true  variant. And  so  the  region  for  eliminating  these duplicate reads is so that you just represent that erroneous PCR product once  if you will and then all others should represent the true sequence. So that’s really the reason for removing those. 

   The problem becomes more severe actually as you go down  in terms of 

the  size  and  number  of megabases  that  you’re  targeting.  So  below  a certain  threshold,  I  don’t  even  recommend  that  people  try  and  do targeted  capture mainly  because  the  yield  coming  off  of  the  solution 

22

phase,  you  know,  the  beads  that  are  used  to  pull  these  biotinylated fragments down  is going  to be so  infinitesimally small compared  to  the size of the genome that you’re trying to capture out of, that to get that material  then  ready  to  do  sequencing  on,  you’ll  have  to  do  a  large number  of  PCR  steps,  and  therein,  you  know,  enhance  the  bias  even more  than you would  if you did. So we  typically do a very, very  limited number of PCR cycles somewhere in the range of 10 to 13, and we don’t go  any  higher  than  that  because  beyond  that,  the  duplication  rate becomes too severe. 

 Dr. Dale Hedges:  I completely agree with Elaine and the primary thing you really need to 

worry about is not simply duplication itself but what sort of biases you’re introducing  there,  and  if  those  errors  have  crept  up  early  on  in  the amplification,  then  those  looked  just  like a  real  legitimate  reason. Even your  SOLiD  color  correction will  not  filter  those  out.  And  so what we continually  try  to  do  internally  is,  you  know,  try  to  reduce  the  total amplifications. We have to do it in any step we can, and that’s something we’re always working on because  if we didn’t, you know,  leave as much of that out as possible, then that problem gets less and less. 

   Although I have to say sort of anecdotally, we’ve had a couple of datasets 

and  I  wasn’t  working  directly  with  them  so  I  didn’t  have  a  hands‐on experience with the data, but we have had a couple of cases with really high coverage where if you ‐‐ we’ve actually done genotype concordance, turning  undue  duplification  and  turning  it  off  and  not  seeing  a  lot  of difference, but  those were particularly cases of extremely high average coverage. So  I would not  recommend  it as a general, you know,  rule of thumb. 

 [0:55:20]  Sean Sanders:  Great.  I’m  going  to  address  this  question  to  Dr. Wei.  It’s  a  couple  of 

maybe  related  questions.  The  first  is  are  there  regions  of  the  genome that can’t be hybridized and enriched, and the other part of that is could repeated elements cause problems with enrichment procedures? 

 Dr. Jun Wei:  Yeah,  that  certainly  is a problem. You  saw  the data  I  showed  from  the 

whole exome sequencing. There’s about 5% we never have coverage of the targeted region. So the cause can be, you know, maybe the probe has the  issues  because  there  are  so many  probes  and  then  some  perform better  and  some  doesn’t  perform  as  it  should  be  so  that’s maybe  the cause of that. So the repeated region definitely is a problem especially for the  human  genome  is  such  a  complex  genome.  It’s  always  a  problem. Even with the whole genome sequencing, the data will show that always 

23

about a half genome base pair  is really hard  to map with anything, any method, unless you do a special like a main pair and allow the main pair to try to spin across that kind of region. So it is a problem, yeah. 

 Sean Sanders:  Okay.  Dr. Elaine Mardis:  Okay. Most of the off‐target effects we see actually map really nicely to 

line  and  sign  elements  through  the  predominant  class  of  repetitive elements in the genome. Yeah, they may be capturing actually something that’s  unique.  It’s  just  that  that  comes  along  for  the  ride.  And  these repetitive regions can be in introns, you know, intergenic regions. They’re sort  of  all  over  the  place.  So  that’s  really  the  major  problem  that repetitive content brings into the picture. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. So I’m going to stay with you, Dr. Mardis, for this question. Are 

the  off‐target  reads  random  or  reproducible  across  runs  and  across enrichment platforms? 

 Dr. Elaine Mardis:  I would say that based on my last comment, they’re largely reproducible 

across,  you  know,  regardless  of  the  platform  because  the  genome remains  the  same,  right?  And  so,  you  know,  there will  be  some  small differences  just  based  on  differences  and  how  the  different  capture platforms are better able or  less well able  to, you know,  reliably  target that particular  region. But  it’s  a  general phenomenon  that  just  kind of goes with the territory. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. A question for you, Dr. Hedges; online viewer asking if you could 

spend a  little bit more about Febit’s technology and how  it compares to the others available. 

 Dr. Dale Hedges:  Sure. I’ve actually had no personal experience with Febit. I’m  just aware 

that as a system, it is an array‐based hybridization approach that they’ve actually  integrated  into  an  automated  fluidic  system.  It’s  actually apparently  a  very  automatable  process.  My  understanding  at  the moment  is  that  it’s  actually  focusing more  on  targeting  things  in  the neighborhood of 100K to a megabase in scale and in various complexities so that it’s sort of in the bank. In terms of the general approaches, it’s in the array hybridization approach, although as I mentioned earlier, we’ve found  in  our  own  hands  that  solution  was  more  accommodating  for ramping  up  in  the  scale  and  doing  large  projects.  In  this  case,  Febit  is basically  from what  I assume  the  technology offering sort of an array a SOLiD phase array‐based approach that is actually automatable and could potentially be a solution for larger‐scale approaches. 

 

24

Sean Sanders:  Okay.  So we’re  coming  to  the end of  the hour.  So  if  there’s  any more questions from the audience, get them  in now. All right. I have a couple of more questions  I’d  like  to pose. Online  viewers  are  asking how  is  it possible  to  use  these  enrichment  technologies  to  enrich  for  rare transcripts  in the sample sequence analysis. Has anyone had experience with rare transcripts? Dr. Wei? 

 Dr. Jun Wei:  I  saw a paper using  this  technology  to  capture  the  transcript.  I  think  it 

theoretically is possible, but we don’t have any experience with that.  Dr. Elaine Mardis:  There  are  a  number  of  permutations  I  think  that  are  quite  interesting 

about certainly one of them. You know, other people have talked about actually using a pre‐capture step and there is a recent paper published on The  Plant  Genome,  plant  genomes  being  highly  repetitive  in  nature, where  they actually use a capture  technology  to selectively capture out the repetitive content of the genome first and then a second go‐round on the  exome  of  that  particular  plant.  So,  you  know,  give  scientists  the technology and they’ll figure out a number of ways to use it to their great advantage. I thought that was rather clever actually. 

 [1:00:23]  Sean Sanders:  Uh‐hum, great. So maybe a final question for you about the future and it 

seems  that  right  now  there’s  a  balance  between  doing whole  genome sequencing  and  doing  enrichment  or  using  enrichment  technologies. Where do you see the tipping point and how soon or far in the future do you feel that that’s going to be? So why don’t we start with Dr. Wei and work our way back down? 

 Dr. Jun Wei:  Yeah.  As  I  showed  in  the  data,  I  think  the  most  important  factor 

nowadays  is still the cost. The cost of the whole genome  is still too high for every  ‐‐  the  lab or not  like a genome center but  for us,  it  still costs high. And also, the complexity of the informatics. You think about you’re dealing with whole exome coding sequencing about 38 megabase versus 3 billion base pair. That’s a huge difference, the storage, analyze. This  is all very challenging currently. 

   And another thing, it’s difficult nowadays to just make sense of the whole 

genome  sequencing  outside  of  the  coding  area.  You  have  to  really  do experiment  to prove  this  is biologically  relevant; otherwise,  it’s hard  to make sense of  it. So that’s the current status. I think  in the future when the throughput is high enough, the cost is low and the storage, whatever, the price is coming down, yeah, this is the way to go. Yes. 

 

25

Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Mardis?  Dr. Elaine Mardis:  Yes. So I mean for our work, I tend to not see this as an issue of cost but 

rather cost‐to‐benefit. So, you know, our laboratory has done a very large amount  of  whole  genome  cancer  sequencing  comparing  tumor  and normal, you know. We have an excess of probably 160 genome pairs now completed and that rate is going up very dramatically. And to me, whole genome sequencing of cancer makes sense as cost‐to‐benefit comparison because  there’s  so  much  more  going  on  in  the  cancer  genome  than simple point mutations and small windows that it’s a shame if you leave the other important things behind. So I completely agree with Dr. Wei on the cost of analysis being the driver, not the cost of sequencing being the driver. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Hedges, final word to you.  Dr. Dale Hedges:  I  guess  I’m  a  little more of  a  technological optimist  in  the  sense  that  I 

definitely see that sort of inevitable push towards routine whole genome sequencing in the near ‐‐ sooner than later. Probably in the three to five year  range, we’re  going  to  start  to  see  large  studies  that  are  going  to involve whole genome sequencing. 

   And  just  like Dr. Mardis was  saying,  it makes  sense  for  cancer.  I would 

argue  it makes  sense  for everything  really, and  in most of our  cases at least, we don’t know what we’re looking for, and if I have the opportunity to have everything as opposed to a  fraction, then  I would go  for  it. So  I think as  soon as you  see  that point,  it’s going  to all come down  to  the price point. As soon as the price point drops to a point where people ‐‐ or even before  that, would pay a  little bit of premium  to have  that much more information, and I think we’ll get there pretty soon. 

 Dr. Elaine Mardis:  Yeah.  I mean,  I  think  in  the broad  sense of  time, however,  I  get  asked 

questions a lot like well, once X then is Y sort of off the table? And I think that  it’s really fantastic how much effort  in technology development has gone  into  targeted  capture  because  even  if whole  genome  sequencing becomes  the  choice de  jure  for  the original discovery phase,  there will still  be  a  very  compelling  reason  for  targeted  capture.  For  example, moving many of these discoveries into the clinic where you know exactly what  you want  to  go  after,  you don’t need  the  rest of  the  genome  to come along for the ride, and you have an exquisitely sensitive vehicle by which  to  selectively  take  that  from  your  sample  and  sequence  it,  you know,  in  almost  real  time.  And  I  think  that’s  a  really  compelling,  you know, aspect that a lot of what’s going on now is really going to feed into very, very nicely in the upcoming next few years. 

26

 Sean Sanders:  Great. Well,  I think that’s a great way to end this webinar. So  I’d  like to 

thank  our  panelists  for  being  with  us  today  and  for  the  enlightening discussion  that  they’ve  provided:  Dr.  Dale  Hedges  from  the  Hussman Institute  for  Human  Genomics,  Dr.  Elaine  Mardis  from  Washington University in St. Louis, and Dr. Jun Wei from the NIH. 

   Thank  you  also  to  our  online  audience  and  to  those  people  in  the 

audience here. Apologies  that we didn’t get  to all of  the questions. We did have many more  than we  could possibly use  in  just  the  short  time that we have, but thank you for sending them in. 

   Please go  to  the URL at  the bottom of your  slide viewer now  for more 

information on products related  to  today’s webinar, and  just know  that this  webinar  will  be  available  as  an  on‐demand  video  within approximately  48  hours  from  now.  If  you  would  like  to  share  some thoughts  with  us  about  the  webinar,  you  can  email  us  at webinar@aaas.org. 

   And again, thank you to our panel and thank you to Agilent Technologies 

for their kind sponsorship of today’s webinar.    Goodbye.  [1:06:10]  End of Audio