1

The Epigenetics Challenge: DNA Methylation Research from Basics to Biomarkers 

 [0:00:00] Sean Sanders:  Hello  and  welcome  to  this  Science/AAAS  webinar.  I’m  Sean  Sanders, 

commercial editor and webinar editor at Science.    The topic for today’s discussion  is epigenetics. This rapidly growing area 

of research examines how the covalent attachment of chemical groups to DNA and its associated histone proteins can influence phenotype without alteration of  the DNA  sequence.  Such modifications often  result  in  the alteration of gene expression  levels  that determine cell  fate. Epigenetic marks  are  somatically  inherited  and  therefore  can  be  passed  on  as disease cells replicate. 

   In  this  webinar,  viewers  will  gain  insight  into  the  current  status  of 

epigenetic research with an emphasis on understanding  the mechanism and  effects  of  DNA  methylation.  Current  methods  associated  with epigenetics research will be discussed as well as how these technologies are advancing the development of new diagnostics and biomarkers. 

   It gives me great pleasure to  introduce our three panelists for today. To 

my  left  we  have  Dr. Michael  Teitell  from  the  David  Geffen  School  of Medicine at UCLA in Los Angeles, California; next we have Dr. Adam Karpf from the Roswell Park Cancer  Institute  in Buffalo, New York; and finally, Dr.  Alex  Meissner  from  the  Broad  Institute  of  MIT  and  Harvard  in Cambridge, Massachusetts. Thank you all  for being with us today. Good to have you here. 

   Each of our speakers is going to give a short presentation, after which we 

will have a Q&A session during which the panel will address the questions submitted by  you,  the  live  audience. A  reminder  to  the online  viewers that you can see an enlarged version of the slides by clicking the enlarge slides button located underneath the slide window of your web console. You  can  also  download  a  PDF  copy  of  all  of  the  slides  by  using  the download slides button. As I mentioned, if you’re joining us live, you can submit a question  to  the panel at any  time by  typing  it  into  the ask‐a‐question  box  on  the  bottom  left  of  your  viewing  console  below  and clicking  the  submit  button.  Please  remember  to  keep  your  questions short and to the point. That will give them the best chance of being put to our panel. 

 

2

  Finally, thank you to New England Biolabs for the sponsorship of today’s webinar. 

   Now,  I’d  like to  introduce our first speaker for this webinar, Dr. Michael 

Teitell.  Slide 2    Dr.  Teitell  received  his M.D.  and  Ph.D.  degrees  emphasizing Molecular 

Immunology  in  the Medical  Scientist  Training  Program  at UCLA  before pursuing  postdoctoral  studies  at  UCLA,  Harvard  Medical  School,  and UCSF.  He  trained  clinically  in  Anatomic  Pathology  at  Brigham  and Women’s  Hospital,  in  Clinical  Pathology  at  UCSF,  and was  a  fellow  in Pediatric Pathology at the Los Angeles Children’s Hospital. 

   Dr.  Teitell  is now  a professor of Pathology  and  chief of  the Division of 

Pediatric and Neonatal Pathology  in the UCLA School of Medicine. He  is co‐director  of  the  Jonsson  Comprehensive  Cancer  Center  Cell  Biology Program Area and  co‐director of  the UCLA Center  for Cell Control. The Teitell  lab  studies  the  immune  system,  developments  in  the  immune system  and  cancer,  focusing  most  strongly  on  DNA  methylation  and genetic  regulation. His group uses genome‐wide and gene‐specific DNA methylation  analysis  to  identify  aberrantly  silenced  tumor  suppressor genes in B cell leukemias and lymphomas. 

   Welcome, Dr. Michael Teitell.  Dr. Michael Teitell:  Thanks very much, Sean.  It’s a pleasure  to be here. Today,  I’m going  to 

discuss studies related to DNA methylation in cancer.  Slide 3    The outline for my talk will include the general topic of epigenetics, some 

basics  about DNA methylation,  an overview of  the DNA methylation  in cancer,  some of  the methods used  for analyzing DNA methylation, and the work that we’ve done in our lab on DNA methylation and TCL1‐driven B cell malignancies. 

 Slide 4    So,  epigenetics  is  the  heritable,  reversible  modification  of  DNA  and 

chromatin  that  doesn’t  change  the  primary  nucleotide  sequence.  In particular,  there’s  DNA  methylation  which  can  be  a  methyl  group appended to the 5’ carbon of cytosine and another type of methylation 

3

that I will not discuss much in this discussion, which is the hydroxymethyl alteration of that same carbon in cytosine by the TET1 molecule. 

   There’s  also  histone  modifications  such  as  acetylation,  methylation, 

phosphorylation,  ubiquitylation,  and  SUMOylation,  which  modify  the chromatin  structure  and  probably  other  modifications  that  alter  the ability to express genes such as microRNAs, particularly in plants. 

 Slide 5    The  human  genome  project  actually  sequence  four  or  five  nucleotides 

because  cytosine  at  the  5’  position  that’s  methylated  within  a  CG dinucleotide sequence usually  is not distinguishable from cytosine that’s unmethylated by the usual methods of DNA sequencing. 

 Slide 6    It’s  been  established  that  some  of  the  roles  for  DNA  methylation  in 

mammals  include  X  chromosome  inactivation,  genomic  imprinting, suppression  of  parasitic  sequences  and  repetitive  elements  as  you  see here,  and  what  I’ll  focus  on  most,  which  is  the  regulation  of  gene expression. 

 Slide 7    DNA  methylation  can  block  transcription  factor  binding  simply  by 

interference.  Slide 8    And it can also cause the recruitment of methyl‐CpG binding proteins and 

associated  co‐repressors  to  drive  the  compaction  of  chromatin  into heterochromatin and make unavailable genes for expression. 

 [0:05:00]  Slide 9    Methylation  can  occur  in  a  de  novo  fashion  from  regular  cytosine  in 

which  case  the DNMT  or DNA methyltransferase  3a  and  3b molecules along  with  the  cofactor  S‐Adenosyl  methionine  will  append  a  5‐methylcytosine  group  onto  cytosine.  This  occurs  in  pre‐implantation embryos, germ cells, and probably in somatic cells with aging. 

 

4

  DNA replication also causes a methylated position, the CpG dinucleotide to  become  heavily  methylated,  in  which  case  the  maintenance methyltransferase  DNMT  1,  along  with  S‐Adenosyl  methionine  can remethylate  that position and maintain methylation within an organism at  that  position,  or  if  DNMT  1  doesn’t  work,  then  passively  the methylation  at  that  position  can  be  lost.  In  addition,  there’s  probably mechanisms of active DNA demethylation such as by activation‐induced cytidine deaminase or AID and also potentially the TET1 molecule. 

 Slide 10    Prokaryotes use DNA methylation on two distinct sequences  in order to 

protect  their  genome  from  invasion  by  parasitic  elements  such  as bacteriophage,  in  which  case  their  restriction  enzymes  that  are methylation  sensitive  can  cut  the bacteriophage  invading  sequence but not their own sequence. 

   Vertebrates,  on  the  other  hand,  have  DNA methylation  that’s  mainly 

found outside of promoter regions of genes that contain so‐called CpG or CpG‐rich  islands,  and  these  genes  number  about  50%  to  60%  in  the human genome. 

 Slide 11    In normal cells, the CpG islands are protected from methylation, and the 

methylation in these slides is shown by those filled‐in circles that you can see in the slide. Methylation mainly occurs outside the CpG islands of the normal cells. But in cancer, there is a global demethylation because most methylation  is  outside  of  the  CpG  islands  and  CpG  island hypermethylation that can affect as an example tumor suppressor genes that  represses  their  transcription.  There  can  also  be  CpG  island demethylation of as an example imprint genes. 

 Slide 12    The process of deamination actually links genetics and epigenetics in the 

sense that a position 5‐methylcytosine can be transversed into a thymine by  the  loss  of  an  amine  group,  and  that’s  a  spontaneous  irreversible mechanism and occurs mainly  in the CpG‐suppressed regions outside of islands  to yield a very high content of TG sequences as opposed  to  the expected frequency of CG sequences. 

 Slide 13  

5

  So  going  back  to  original  biology  related  to  Knudson’s  “two‐hit” hypothesis in cancer for tumor suppressor genes, we’ve often of that as a genetic  alteration  of  a  tumor  suppressor  gene  where  there  can  be  a mutation or a deletion, but now you have to add to that potential at least the process of methylation causing the loss of expression of a genome in both alleles. 

 Slide 14    There’s  many  methods  for  DNA  methylation  detection  and  all  these 

strategies really are based upon three approaches or their combinations. Digestion  of  DNA  with methylation  sensitive  and  insensitive  enzymes, followed  by  some  form  of  identification,  is  one  method.  Chemical modification of DNA by bisulfite and alkali, followed by identification, is a second  method.  And  purification  of  methylated  or  unmethylated fractions  of  the  genome  using  antibodies  or  methyl‐binding  protein fragments, followed by identification, is a third method. 

 Slide 15    Some  of  these methods  provide mainly  sequence‐specific  information 

and in my talk at least I’ll focus a little bit on genomic bisulfite sequencing and there’s a large list of this here. 

 Slide 16    And  there’s  also methods  of  genome‐wide  DNA methylation  profiling. 

Again, this is an incomplete list and I’m actually going to focus a little bit on an older method for this restriction landmark genome scanning. 

 Slide 17    So my  lab  studies very heavily  tumors  that originate  from  the germinal 

center  of  lymphoid  tissues,  and  what  you  see  here  in  the  histologic depiction  is a  lymph node germinal center  that’s a very special place  in which B cells actually proliferate a very high rate of speed and they have ongoing active DNA damage. 

 Slide 18    We asked a question a  long  time ago what are  transforming genes  that 

are  implicated  in  driving  tumors  that  arise  from  that  stage  in development  and  identified  too much  TCL1  expression  in many  of  the tumors  that you  see  listed here  from human  samples. We also made a 

6

TCL1  transgenic mouse  and  you  can  see  that  in  the  bottom  right  two panels, where  the  spleen would  become  the  size  of  the  liver  and  the mouse  would  also  succumb  to  disease  related  to  too  much  TLC1 expression. 

 Slide 19    But  too  much  TCL1  expression  driving  tumors  from  this  stage  in 

development  doesn’t  happen  all  at  once  and  there  must  be  other alterations that actually drive the development of these tumors, not only genetic changes but also epigenetic changes. And so we ask the question, do epigenetic changes cooperate with TLC1 to transform B cells. 

 Slide 20    To address this question, we used restriction landmark genomic scanning 

which  is  really  a  technique  that  uses  a  methylation‐sensitive  enzyme Not1  to  survey  selected  CpG  islands  within  the  genome  and  typically surveys  about  2000  spots.  What  you  get  in  a  two‐dimensional  gel electrophoresis that’s analyzed here is a representative and reproducible pattern of spots within the genome that are hypermethylated. 

 [0:10:00]  Slide 21‐22    As  an  example, what  you  see  here  in  the  left  panel  is  a  normal  TCL1 

transgenic spleen where you have spots that are reproducible in the two tumors,  a  diffuse  large  B  cell  lymphoma  and  the  Burkitt  lymphoma, except for the spots 2E3 and 2E5 where the spots in the diffuse large cell lymphoma  are missing  and  the  spot  2E5  in  the  Burkitt  lymphoma  has actually  lighter  intensity.  This  indicates  positions  of  hypermethylation potentially in these gene fragments. 

 Slide 23    We  can  go  on  and  figure  out  whether  or  not  this  is  a  validated 

hypermethylation  by  genomic  bisulfite  sequencing  where  a  5‐methylcytosine  can’t  be  converted  to  uracil,  but  a  cytosine  can  be converted to uracil by sodium bisulfite treatment. 

 Slide 24  

7

  That conversion  to uracil  is  then picked up by sequencing algorithms or by a genomic southern blot. 

 Slide 25    So what we’ve found was that one of the spots that I showed you in the 

previous  slide was actually  the Sprouty 2  tumor  suppressor gene  that’s known  to  repress  signaling  through  the  MAP  kinase‐ERK  signaling pathway. As you can see  in  the  top panel of clones,  the spleen,  there’s basically no methylation which is identified by filled‐in circles, but on the top bottom two tumors that arise from this animal model, a Burkitt‐like lymphoma  and  a  diffuse  large  cell  lymphoma,  you  can  see hypermethylation. And  in  a work not  from our  lab  shown on  the  right panel, what you can see is that methylated Sprouty 2 actually has a poor outcome  for  patients who  have  diffuse  large  cell  lymphoma  providing clinical relevance for this process. 

   Sprouty 2 RNA expression  in many of the tumors  in our mouse model  is 

repressed during development of  tumors and  the Sprouty 2 expression can be reactivated by treatments that block DNA methyltransferases such as 5‐azacytidine. 

 Slide 26    Sprouty  2 methylation  is  also  found  in  human  lymphomas  as  well  as 

silencing  and  the  transformed  cell  lines  and  the  epigenetic  silencing process can be reactivated with methyltransferase inhibitors. 

 Slide 27    What makes us particularly  interested,  in  the  right panel, what you can 

see  is  that  TCL1  transgenic B  cells  actually  hyperactivate upstream  the MAP kinase‐ERK signaling pathway, but Sprouty 2 in the left panel as you can  see  blocks  this  pathway,  indicating  that  usually,  this would  not  be seen in these cells. 

 Slide 28    But if you silence Sprouty 2 by DNA methylation treatments, then you can 

hyperactivate ERK pathway signaling, hyperproliferate the cells, and end up with a TCL1 B cell lymphoma, at least in some of our modeling. 

 Slide 29  

8

  Finally,  and  this  is my  last  slide,  it  turns  out  that  if  you  have  different models of TCL1 transgenic animals, you can actually find unique patterns of  DNA  methylation.  For  example,  in  this  particular  example  of  a  B chronic  lymphocytic  leukemia,  FOXD3  is  hypermethylated  by  the  dark blue  circles  that  you  see  in  the CLL patient  samples or within a mouse model, whereas the Sprouty 2 allele is not methylated here in contrast to what we showed within diffuse  large cell  lymphoma and the Burkitt‐like lymphoma. 

   Lastly,  in  the  bottom  panel,  what  you  can  see  is  that  mouse  tumor 

models  actually  replicate  each  other  best  for  overall  epigenetic alterations and they can actually be segregated by sequence and genome analysis. 

   So thank you very much, Sean.  Slide 30  Sean Sanders:  Great.  Thanks  very much,  Dr.  Teitell. Great  introduction  for  us. We’re 

going to move on to our second speaker now and that is Dr. Adam Karpf.  Slide 31    Dr. Karpf completed his B.S.  in Biology at the University of South Florida 

in  Tampa  and  his  Ph.D.  in Biology with  a Virology  specialization  at  the University of  Texas  in Austin. After  completing postdoctoral  training  at the Huntsman Cancer Institute, University of Utah Medical Center in Salt Lake City, Dr. Karpf held  a Research Assistant Professorship position  in the  Department  of  Oncological  Sciences.  He  then moved  to  the  State University  of  New  York  in  Buffalo  where  he  held  an  Assistant Professorship in the Department of Pharmacology and Therapeutics, and he  served  as  the  Director  of  Graduate  Studies  in  the  Molecular Pharmacology and Cancer Therapeutics Graduate Program. 

   Currently,  Dr.  Karpf  is  an  Associate  Professor  of  Oncology  in  the 

Department  of  Pharmacology  and  Therapeutics  at  the  Roswell  Park Cancer  Institute. His research  interests focus on the role of altered DNA methylation  in  cancer  and  in designing  rational  interventions based on targeting these epigenetic changes. Dr. Karpf is also the Vice‐President of the  Epigenetics  Society  and  a  standing  member  of  the  NIH  Cancer Etiology Study Section. 

   Welcome, Dr. Karpf. Good to have you.  

9

Dr. Adam Karpf:  Thank you, Sean.  Slide 32    So  today,  I’d  like  to  talk  about DNA  hypomethylation,  cancer‐germline 

antigens, and ovarian cancer which is of interest in my laboratory.    So as Dr. Teitell went through, I’ll briefly go over again. In cancer, a very 

well‐studied  phenomenon  is  the  hypermethylation  of  classical  CpG islands which results  in the transcriptional silencing of tumor suppressor genes.  Another  phenomenon which  is  actually  discovered many  years earlier was  that CpG‐poor  intergenic  regions of  the genome, which are normally  methylated  in  normal  somatic  tissues,  can  become hypomethylated and  those can  lead  to  the activation of  repetitive DNA elements in the genome. 

   A much  less studied phenomenon  is the fact that there’s a select region 

of CpG‐rich gene promoters  that correspond  to genes on  these cancer‐germline  antigens,  which  are  actually  methylated  in  normal  somatic tissues  and  can  become  hypomethylated  both  in  germ  cells  and  in tumors. 

 [0:15:10]  Slide 33    So  the causes and consequences of hypomethylation  in cancer  involves 

one  or  more  mechanisms  that  include  loss  of  DNMT  function,  the activation of demethylases, and altered chromatin structure, all of which likely  impact on  the  genomic DNA hypomethylation phenotype  seen  in cancer. And the consequences of this phenotype include the activation of certain  oncogenes,  the  induction  of  genomic  instability,  and  also  the activation of cancer‐germline antigens. 

 Slide 34    The link between global DNA hypomethylation and genomic instability is 

supported by some work from our laboratory in which we showed that a normal diploid human colorectal cancer cell line HCT116, when you knock out  the  function  of DNMT1  or DNMT3b  or  both  enzymes,  you  have  a profound induction of aneuploidy and also the induction and persistence of  chromosomal  rearrangements  which  correspond  to  non‐reciprocal translocations. 

 

10

Slide 35    With  regards  to  cancer‐germline  antigens,  their  link  with  global 

hypomethylation is indicated both by the fact that decitabine or 5‐aza‐2’‐deoxycytidine,  which  is  a  DNA  methyltransferase  inhibitor,  robustly induces the expression of many members of the cancer‐germline antigen gene family in most tumor cells treated with this agent. In addition, these genes  are  activated  by  genetic  disruption  of  DNA  methylation  in  the HCT116 system that I described on the previous slide. 

 Slide 36    The  cancer‐germline  antigens  are  also  known  as  cancer‐testis  antigens, 

and there’s about 150 members of this gene family of which about half of those genes are  localized on the X chromosome and half are autosomal. They often exist in multi‐gene families. The MAGE genes are a prominent family  of  these.  They  show  restricted  expression  to  germ  cells  and cancers. Much  of  the  interest  in  these  genes  is  because  they’re  highly immunogenic. They promote both cell‐mediated and humoral responses in  cancer  patients,  and  there’s  been  a  large  translational  interest  in moving vaccines that target tumors that express these antigens  into the clinic, and  the  two vaccines  that are  in  the most advanced clinical  trials are MAGE‐A3 and NY‐ESO‐1. 

   In the last few years, it’s been recognized that in addition to serving as ‐‐ 

existing as antigens in cancer, the proteins themselves may participate in oncogenesis.  For  instance,  MAGE‐A  genes  are  involved  in  negative regulation of p53  function,  and  a particular MAGE  gene, MAGE‐A11,  is involved  as  a  co‐activator  of  androgen  receptor  in  castration‐recurrent prostate cancer. Another example or one characteristic of these genes is that they show heterogeneous expression in tumors. 

 Slide 37    So my  lab  is  focused on one particular CG antigen gene  in some of our 

studies called NY‐ESO‐1 in the context of epithelial ovarian cancer as our system, human epithelial ovarian cancer. So on the left side of this slide is shown  the  methylation  pattern  of  the  NY‐ESO‐1  promoter  in  normal ovary on the top and in ESO‐1 negative ovarian tumor in the middle, and then  an  ESO‐1  positive  ovarian  tumor  on  the  bottom,  and  the  data  is shown  as  traditional  sodium  bisulfite  sequencing which  in  this  case  is covering 41 CpG sites throughout the promoter CpG island. And so what you  can  see  here  is  this  unusual  pattern  of  a  gene with  a  CpG  island promoter  that  is  heavily  methylated  in  the  normal  tissue  and  then 

11

becomes hypomethylated  in some  tumors, and  that corresponds  to  the expression status. 

   On the right side of this slide  is shown a more high throughput method 

for analyzing DNA methylation, which  is called bisulfite pyrosequencing, where we were  able  to  determine  the methylation  pattern  at  15  CpG sites  throughout  a  larger panel of  tumors  versus normal ovary. And  as you can see, there’s hypomethylation in many of those tumors. 

 Slide 38    Another  interesting fact about these genes that  I mentioned earlier was 

their  heterogeneous  expression  in  tumor.  So  in  these  experiments, we microdissected  tumors  based  on  their  NY‐ESO‐1  expression  status  as determined  by  immunohistochemistry  and  then  took  that  DNA, which was  taken  from paraffin‐embedded  tissues, and subjected  it  to bisulfite pyrosequencing. And as you can see on the top, the tumors on the right side of the panel are from NY‐ESO‐1 positive tumors, which show a lower methylation level of NY‐ESO‐1. 

   And  more  interestingly,  on  the  bottom  of  the  slide,  when  we 

microdissected  different  regions  of  the  same  tumor  that  showed different  NY‐ESO‐1  expression  status,  we  were  able  to  show  that hypomethylation corresponded with those regions of the tumor that are expressed, providing some evidence that it’s involved in the regulation of the heterogeneity phenotype. 

 [0:20:02]  Slide 39    So the global hypomethylation in cancer doesn’t only include CpG antigen 

genes.  It  includes  repetitive  regions of  the  genome,  and we wanted  to test  whether  there  was  a  simple  association  between  these  two phenomenons.  So  shown  on  this  figure  are  pyrosequencing  assays  in which  in panel A, we’re comparing  two different CG antigen promoters and we see  that  the methylation  level of  those  two promoters  in  these tumors  is  highly  correlated.  In  panel  B, we’re  looking  at  two  different repetitive elements,  the Alu element and  the  line 1 element, and  those are also highly correlated. And then most interestingly, in C we’re looking at  one  CG  antigen  promoter  versus  one  of  the  global  methylation measures as an example and they’re highly correlated. So this phenotype appears to be correlated and coordinated in epithelial ovarian cancer. 

 

12

Slide 40    The  pathological  significance  of  the  hypomethylation  phenotype  is 

suggested by the fact that hypomethylation of either the  line 1 element or  the  BORIS  promoter,  which  is  an  autosomal  CG  antigen, hypomethylation  correlates  with  advanced  disease  stage  in  ovarian tumors, and this has been shown by other groups  in other malignancies as  well.  As  hypomethylation  progresses,  you  have  a  more  aggressive clinical phenotype. 

 Slide 41    So  in the very  last couple of slides, I want to mention that NY‐ESO‐1  is a 

target  for  immunotherapy  in ovarian  cancer and vaccines  targeting NY‐ESO‐1 are undergoing phase  I and  II  trials at our  institution and others, and what’s been seen  in the clinic  is that the vaccines against NY‐ESO‐1 are  safe  and  they  clearly  promote  immune  responses.  However,  the clinical  responses  have  been  relatively  sporadic,  and  it  appears  that  at least  one  limitation  of  this  is  the  lack  of  antigen  expression  in many tumors, the loss of antigen expression in the context of therapy, and also the heterogeneous expression which I mentioned. 

   In addition, all of these antigens have to be presented by Class I MHC at 

the cell surface and MHC‐I’s expression loss is very common cancer, and so  our  group  has  been  working  under  the  guise  that  epigenetic modulation using drugs that target the DNA methylation machinery could overcome some of the limitations of NY‐ESO‐1 vaccine therapy in ovarian cancer. 

 Slide 42    And so we have a clinical trial ongoing at the institute which I won’t talk 

about today, but I will show you on this slide preclinical data showing on the  top  that  the  RNA  level  of  NY‐ESO‐1  is  highly  activatable  by combination  treatments  between  5‐azacytidine  and  trichostatin  A  or other HDAC  inhibitors, and also the protein  is well  induced.  In addition, we are able  to activate  the  recognition by cytotoxic T  lymphocytes  that recognize NY‐ESO‐1. 

 Slide 43    So this sets up a paradigm that our group and many others are pursuing 

that you could use epigenetic therapy to modulate the immune response against cancers  in combination with vaccines that target CG antigens or 

13

adopt  a  cell  transfer  therapy.  That’s  based  on  the  fact  that  you  can upregulate  these  genes  and  upregulate  Class  I  MHC  as  well  as  co‐stimulatory molecules. 

 Slide 44    So to summarize, global DNA hypomethylation  is common  in cancer. It’s 

associated  with  genomic  instability  and  advanced  disease  stage.  In ovarian cancer, the hypomethylation coordinately effects repetitive DNA elements and also the CpG‐rich promoters of the CG antigen genes. And tumors  that  show  this phenotype may be amenable  to  targeting by CG antigen  vaccines,  either  alone  or  in  combination  with  epigenetic modulators. 

 Slide 45    I’d  like  to  thank  the  folks  in  my  lab  and  collaborators  and  funding 

support. Thank you.  Sean Sanders:  Great. Thanks so much, Dr. Karpf.  Slide 46    Our final speaker for today  is Dr. Alex Meissner. Dr. Meissner undertook 

both his  graduate  and postdoctoral  training  at  the Whitehead  Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. 

 Slide 47    He is currently an assistant professor in the Department of Stem Cell and 

Regenerative  Biology  at  Harvard  University  and  a  principal  faculty member  of  the  Harvard  Stem  Cell  Institute.  Research  in  the Meissner laboratory focuses on how stem cells achieve and maintain pluripotency and  the  role  that  epigenetic  modifications  play  in  this  process.  Dr. Meissner sits on the editorial board of the journal Stem Cell Research and was recently named a Pew Scholar in the Biomedical Sciences. 

   Welcome, Dr. Meissner.  Dr. Alex Meissner:  Thank  you.  All  right.  So  you  already  heard  in  the  two  previous 

presentations a  lot about DNA methylation  itself as well as some of the approaches to  look at  it, and so  I  just want  to  try  to close with  the  last presentation  to  give  you  an  overview  of  the  technologies  that  we’ve 

14

recently used and studied and then just close on a final example of how to use these genome‐wide maps. 

 [0:24:54]  Slide 48    As you already heard, there’s more than 20 different methods to look at 

DNA  methylation  and  I’m  not  going  to  go  into  the  detail  'cause  you already heard about the three different categories that are being used to analyze DNA methylation patterns.  I  just want to point out that a  lot of them  have  been  recently  adapted  to  genome  scale  approaches  by combining it with high throughput sequencing approaches. 

 Slide 49    And so depending on the application that you’re actually trying to use the 

methylation detection for, there are different regions for example in the genome that you are particularly  interested  in. As you already heard for cancer, you’re particularly interested for example in the CpG islands and other  regions  of  the  genome.  A  lot  of  our  studies  are  sort  of  focused around stem cell and developmental biology. Here again there might be different regions in the genome that you’re particularly interested in. And then  finally,  my  lab  is  also  part  of  the  NIH  Roadmap  Reference Epigenome Mapping  Centers,  and  as  such  you want  to  actually  try  to provide  reference maps  of  the  epigenome,  and  in  these  cases,  you’re shooting for the most global and comprehensive mapping. 

 Slide 50    Now,  if you  think about  these different approaches, what we are  really 

interested in is trying to detect DNA methylation differences. And so then obviously,  the  next  questions  to  ask,  which  of  the  methods  that  are available  currently  are  the  most  accurate,  as  well  as  the  effective  in identifying differentially methylated  regions between  any  two different or many different samples? 

   And so the goal of one of the studies that we recently undertook was to 

really  try  to  identify  and  compare  different  approaches  that  are commonly available to different labs. And so it shows MeDIP‐seq using an antibody  from  methylcytosine,  MethylCap‐seq  using  a  recombinant methyl  binding  protein,  RRBS which  uses  the  high  throughput  bisulfite sequencing  based  approach,  and  then  it’s  not  a  sequencing‐based 

15

approach  but  we  could  use  also  the  Illumina  Infinium  array  which  is because it’s a commonly available research tool. 

   And so then the goal was to try to ask between any two different sample 

pairs. In this case, we selected a normal and colon tumor pair as well as two  different  embryonic  stem  cell  lines  and  wanted  to  see  how  the different methods perform. 

 Slide 51    And so  in order to actually try to compare them  fairly, we did about an 

equal  number  of  sequencing  reads  for  the  three  sequencing‐based approaches and as you can see in this table, they range between 30 and 40  million  aligned  reads  for  the  three  methods,  and  obviously  the Infinium  array  focuses  on  the  limited  number  of  CpG  dinucleotides featured on the array. 

 Slide 52    And  so  this  shows  you  a  screenshot  of  how  the  different  methods 

compare to each other for a particular region or on the HOX cluster. You can  see on  top  two  sequencing  lanes  for MeDIP‐seq, below  that  three lanes of the MethylCap‐seq. then below that you can see tracks for two RRBS samples, as well as below that the Infinium reads. 

   And  just  to  zoom  in  so  you  can  ‐‐  so  the  first  thing  you  can  see 

immediately  on  the  zoomed‐out  view  is  this  very  large  agreement between the different approaches, so you can see the MeDIP as well as the MethylCap, both enriched  in  the same  regions. And  then  the RRBS, it’s a  little bit harder to see, but basically, the color coding  indicates the levels  of methylation  and  so  darker  bars  indicate  high  levels  of  DNA methylation. 

 Slide 53    And just to zoom in a little bit and show you this so there’s peaks for the 

MeDIP capture seq and below that you can see a  lane for the RRBS. We can see very accurately whether MeDIP capture enriches for methylated fragments.  You  can  also  see  confirmed methylation  using  the  bisulfite sequencing‐based approach. 

 Slide 54  

16

  And so zooming out further, it’s showing you now for example one arm of the  chromosome  21.  You  can  see  that  again  overall  there’s  very  good agreement.  You  can  also  see  that  MeDIP‐seq  has  a  little  bit  higher background  compared  to  the  MethylCap‐seq,  but  again,  overall  the agreement  is quite high. What you will also notice when you  look at the Infinium data on  the bottom,  you  can  see  that  the  coverage obviously genome‐wide is fairly limited compared to the other three approaches. 

 Slide 55    Now, a different way to look at the coverage of the approaches is to look 

at these pie charts, and what you can see here now  is from  left to right the  MeDIP,  MethylCap,  RRBS,  and  Infinium,  and  then  three  different genomic  features where we  looked at promoter regions on the top and CpG islands in the middle and then using a whole genome sliding window approach to compare the coverage. 

   And so what you can see  if you start with the whole genome approach, 

obviously  you  can  see  that  the  bisulfite  sequencing‐based  approach because we’re  enriching  for  particular  regions  of  the  genome  only  has less  genome‐wide  coverage  compared  to  the  other  two methods,  the MeDIP and the MethylCap. However, if you look for example at particular regions  that  are  obviously  important  for  gene  regulation  such  as promoters  and  CpG  islands,  you  can  see  that  for  example,  RRBS  very nicely  enriches  to  a  high  degree  for  this  particular  genomic  features, giving  you  very  good  coverage  and  very  in‐depth  reads  for  these particular regions of the genome. 

 [0:29:57]  Slide 56    And  so  as  I  said  initially, we  are  interested  in  trying  the  differentially 

methylated regions between the methods. And so  if you now  just  focus on  the  Venn  diagram  on  the  bottom  right,  this  is  now  comparing  for example between two different samples, trying to  ‐‐ between the three different approaches,  trying  to  find how many differentially methylated CpG islands do we find using the different approaches. And if you look at the numbers, you can see first of all that there’s quite some overlap of all three  methods  to  take  the  fair  number  of  the  same  differentially methylated regions in the genome, but overall, MethylCap let in the first largest number of these regions compared to the other two approaches. 

 Slide 57 

17

   So  just to summarize some of the results that I  just showed you, overall 

we  find  that MethylCap‐seq  seems  to  be  less  prone  to  the  global  bias than MeDIP so  it has  less background than MeDIP. RRBS and MethylCap are surprisingly similar in their power to detect differentially methylated regions, but then there are sort of individual considerations for using the different methods. For example, one advantage of the RRBS approach  is that  it  actually works on  formalin‐fixed and paraffin‐embedded  tissues, which is very relevant for cancer studies. It’s also, compared to the other methods, it’s much more sensitive so it works on nanogram quantities of DNA versus the other ones are still in the microgram range. 

   On  the  other  hand,  MethylCap  and  MeDIP  provide  genome‐wide 

coverage, whereas  RRBS  does  provide  only  focused  coverage  or more focused  coverage. RRBS, however, provides  single base pair  resolution, which  is  another  advantage.  Compared  to  that, MethylCap  and MeDIP protocols are a bit simpler in terms of their experimental execution than RRBS, but RRBS, because it’s bisulfite sequencing based, has the potential to  be  continuously  scaled  until whole methylome  sequencing  becomes feasible. 

 Slide 58    And so with this, I just want to close with the last two slides. I’m showing 

you one example if you would now actually apply this in a bigger scale to particular samples. And so in this case we’re interested now in stem cells and trying to understand a bit more about the variation that you observe among  human  embryonic  stem  cell  lines  and  also  induced  pluripotent stem cell lines. 

   And so what we chose here to do is establish a reference and so we took 

19  high‐quality  human  embryonic  stem  cell  lines  and  performed  the genome‐wide bisulfite sequencing for them, as well as a test set of 11 iPS cell lines. 

 Slide 59    And so showing you now here is an example from a number of different 

genes, and calculating the average methylation variation that you can see for  individual  genes  across  the  19  different  human  ‐‐  just  the  human embryonic  stem  cell  lines.  And  so  if  you  look  at  the  left,  you  see  for example a number of genes that show very  little variation and all of the cell  lines  across  the  19  lines  show  very  little  evidence  of  DNA methylation. 

18

   There’s  other  regions  in  the  genome,  however,  that  show  a  lot more 

variation if you look at the different cell lines. And if you go to the right, you can see fairly widespread distribution of methylation found at these individual genes. 

   And so what we sort of considered this  is sort of as a reference map or 

you could also reference ‐‐ use it as a reference corridor that now defines DNA  methylation  values  for  any  particular  feature  in  the  genome throughout  the  genome,  and  so  having  this  established  as  a  reference allows you now obviously to compare it to any particular question. In our case, we wanted  to  compare  it  to  induced  pluripotent  stem  cells,  but again,  you  could  also  use  this  similar  approach  for  looking  at  normal versus cancer. 

 Slide 60    And  so  this  slightly  more  busy  slide  just  shows  you  the  exact  same 

corridor that I showed you just before, but now plotting on the left of this numbered x/+ ES cell lines, on the right plotting iPS cell lines. And so what you  can  immediately  see  is  that  on  the  left  genes  that  show  little variation  and  very  tight  DNA  methylation  patterns  are  very  similar between  the ES cells as well as  the  iPS cell  lines. But  if you  then move further  to  the  right  and  look  at  genes  that  are  highly  variable  among embryonic  stem  cell  lines,  you  also  find  that  the  same  genes  are  very variable among the iPS cell lines suggesting rather then there is some sort of systematic differences between ES cells and  iPS cells that they’re sort of more  of  the  same  variation  among  pluripotent  cell  lines  in  general. And  so  having  this  reference  corridor  allows  you  obviously  now  to immediately search for outlier genes among the different individual lines. 

 Slide 61    And so this is I just like to thank all the people in my laboratory as well as 

collaborators and the funding agencies, and thank you for your attention.  Sean Sanders:  Great. Thank you very much, Dr. Meissner, and many thanks to all of our 

speakers for the superb presentations.  Slide 62    And we’ve received a lot of questions so we’re going to move right onto 

our Q&A session so that we can answer some of the questions submitted by you, the viewers. 

19

   A quick reminder to those watching us live that you can still submit your 

questions  by  typing  them  into  the  ask‐a‐question  box  and  clicking  the submit button. 

 [0:35:00]    So  the  first question  I have  for our panel, and  I’ll address  it  to you Dr. 

Teitell to start off with, is you talked about a lot of different methods that are available, but do you see a need anywhere for new methods to study DNA methylation? 

 Dr. Michael Teitell:  Thanks, Sean. That’s a great question. I can partially address that I think. 

So  there’s  regions  I  believe  that  have  been  relatively  overlooked  and there’s  also  new  types  of  methylation,  as  an  example hydroxymethylcytosine  positions  that  at  least  as  yet  we  haven’t developed really great techniques to address it at least quantitatively. So that  along  with  perhaps  some  continuing  needs  I  guess  in  the bioinformatics  realm  suggest  that yes, absolutely,  that  there’s needs  to develop techniques, but I think as you’ve heard from the others as well, it maybe depend on the actual application that’s involved. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Karpf?  Dr. Adam Karpf:  Yeah.  I  mean,  I  agree  with  Mike  and  we  do  have  an  evolution  of 

techniques  going  on,  but  I  do  think  that  we  do  have  a  lot  of  good methods now  to  study DNA methylation and  it’s  just a matter of what questions are being addressed. With regards to 5‐hydroxymethylcytosine, that’s a very exciting area and I think the methodology development for that is going to be something in the next couple of years that is going to really take off. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Meissner?  Dr. Alex Meissner:  Yes. I would just resonate that this is mostly application driven and going 

to be dictating what kind of method is the method of choice. And again, there’s  obviously  the  natural  evolution  that we want  for  example  for certain  studies  to  have more  high  throughput.  So we want  to  look  at thousands, tens of thousands of cancer samples so their cost is certainly a factor. Other projects will  look more  at discovery‐based directions  and those  obviously will  be more  comprehensive  and  perilous  throughput. So… 

 

20

Sean Sanders:  Great. Now, a couple of you mentioned hydroxymethylation and then a question was sent  in by a  live viewer asking you to talk a  little bit more about that. I know it’s failing you. Maybe you could address sort of where we stand at the moment as far as research  is concerned.  I know there’s maybe a little bit of discussion still as to how real this phenomenon is. So, Dr. Teitell? 

 Dr. Michael Teitell:  There’s  a  few  papers  on  hydroxymethylation  and  it’s  at  least  in  my 

reading  not  clear  yet  whether  or  not  this  is  an  intermediate  stage between  the  demethylation  of  a  methylcytosine  position  and  the conversion  to  a  cytosine,  but  whether  or  not  hydroxymethylcytosine actually has a physiological. One consideration of course is that there’s a lot  of  hydroxymethylcytosine  present  in  the  central  nervous  system apparently, and  so  if  it’s  related  to  simply a DNA  repair effect or  some phase of DNA repair, then you would imagine that that would be repaired early on. And so it’s curious that we find a lot of that there. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Karpf?  Dr. Adam Karpf:  Yeah.  I mean,  we  don’t  work  on  this  in my  laboratory,  but  there  do 

appear to be antibodies now available to 5‐hydroxymethylcytosine that I think are going to enable analysis of that question as well as some other techniques that are based on the differential chemistry of the two bases between 5‐methylcytosine and 5‐hydroxymethylcytosine, and  I think  it’s a  really  unknown  area  right  now,  the  physiological  significance  of  this mark as Dr. Teitell said. 

 Sean Sanders:  Great.  Dr. Alex Meissner:  All right. So it is mostly unknown because people have mostly overlooked 

it  in  the  past  and  obviously  our  laboratory  is  very  focused  on  bisulfite sequencing,  which  does  not  unfortunately  discriminate  between  the methylcytosine  and  the  hydroxymethylcytosine.  But  as  such,  as  Adam also just mentioned, so there’s no antibodies available. Enzymes become available so that one in the very near future should probably get a bunch of  better  feeling  or  where  this  mark  sits  and  how  it’s  distributed throughout the genome and that usually helps at least as the first step to inform about its function. So… 

 Sean Sanders:  Okay.  I’m  going  to  stay  with  you  Dr.  Meissner.  The  question:  You 

mentioned high throughput technology so the viewer asked if there’s any that are  currently available, and  if not, are  there any  current obstacles preventing high throughput epigenetic screens and where do you see this in the near future. 

21

 Dr. Alex Meissner:  Yeah. Well, this  is an area that has very much evolved over the  last few 

years with high  throughput sequencing per se becoming more available to  individual  labs  that used  to be only big sequencing centers, but now most departments have sequencing course available or it can pay as a fee for service different places to do the sequencing for you. 

   So sequencing probably becomes more available. At the same rate, a lot 

of companies have developed  for example kits  for antibodies as well as bisulfite sequencing kits, and a lot of the tools that basically are required for this have become much more user‐friendly. And so  I think there has been a great, great advance  in terms of making  it much more accessible to the end user. 

 [0:40:00]    A  more  problematic  part  that  Mike  was  referring  to  is  sort  of  the 

bioinformatics  entity  end  because  the  more  sequencing  data  you produce, the more data you have to analyze. And so at some point, you run into this challenge that you have to actually deal with the data. But so far, it’s been certainly helped by a lot of developments on these technical funds. 

 Sean Sanders:  Great.  So maybe  I’ll  come  to  you  Dr.  Karpf  for  this  question.  They’re 

asking sort of essentially, what is the critical mass of methylation that you need  in  order  to  get  activation  or  deactivation?  So  is  it  a  single nucleotide? Is it, you know, a number? Is there a cutoff? 

 Dr. Adam Karpf:  I think in the cancer realm, we generally see a pretty robust conversion of 

unmethylated  CpG  islands  and  many  contiguous  CpG  sites  becoming hypermethylated  concordantly,  and  that  relates  to  and  results  in silencing. There are a few papers out there where you can have single or very  limited  CpG  sites  at  key  regions  that  for  instance  are  bound  by methylation‐sensitive  transcription  factors  that  occlude  the  binding  of those factors that can lead to silencing as well. But I think that at least in the  cancer  realm,  we  generally  see  large  scale  conversion  of  larger regions of a CpG island from unmethylated to methylated. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Okay.  Dr.  Teitell,  a  question  for  you.  This  is  asking  about 

studying  the methylation  status  of  specific  genes  using  blood.  Is  this  a good proxy  for  tissue, easier  to obtain? And  in  this case,  they’re asking specifically about breast tissue but, you know, more generally. 

 

22

Dr. Michael Teitell:  Sure.  That’s  a  great  question.  I  think  it  has  been  pretty  reasonably established  that  different  tissues  and  different  states  of  tissues  have unique  DNA methylation  and  chromatin modification  patterns.  And  so blood as a surrogate for breast tissue or for any other type of tissues such as  colon  or  brain  or what  have  you might  not  be  the most  accurately appropriate surrogate. There also may be a variation within the tissues of course and the technique that you use, whether  it’s a sequencing‐based technique  or  a  more  blending  technique  if  you  will  such  as  array techniques could also obscure that. So I think as surrogates go, probably there’s tissue‐specific factors that have to be considered. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Karpf?  Dr. Adam Karpf:  Yeah. And  I’d  also  point  out  that  even  in  the  context  of  blood,  you’re 

talking  about many  different  cell  lineages  and  cell  types  and  it  hasn’t been well  established  that  the methylation  patterns  of  those  different cell  types  are  highly  conserved  or  not.  So  you’re  introducing  another heterogeneity into the issue as well. 

 Sean Sanders:  Great. So this I thought was an interesting question which does relate to 

what we’ve just been talking about, asking about obtaining personalized epigenome maps.  Do  you  think  this  is  something  that  is  possible  and would it be useful? So I’m going to start with Dr. Meissner. 

 Dr. Alex Meissner:  It certainly becomes more and more feasible. So we’ve seen sort of  last 

year the first whole methylome maps. There have already been dozens, hundreds of chromatin modification maps genome‐wide. So it’s certainly doable. Whether  it’s  just  like a personalized genome,  it’s going  to be a while  before  everybody  has  their  own  epigenome  sequenced.  It’s certainly going  to be useful  to  see a  lot more epigenomes  just  to get a better understanding  'cause  there’s  a  lot of  variables  that are not well understood. So while there are certain very clear cut cases where genes were  silenced,  overall  we  don’t  have  a  very  good  understanding  of variation  for example between  individuals, between again different age groups, different sex, and so there’s a lot of environmental influence that may  change  these.  And  so  I  think  having  a  large  number  of  these available will certainly help. 

 Sean Sanders:  Great.  Dr. Michael Teitell:  I mean  to  add  to  that,  Alex,  with  your  study,  it  was  very  interesting 

actually with embryonic  stem  cells  and  iPS  cells  that  there were  genes that  seem  to  have  specific  amounts  of  methylation  that  was  quite invariant  and  then  you  had  genes  that  had  very  wide  ranges  of 

23

methylation. So on top of tissue heterogeneity, you might have gene to gene variability as you’re seeing in the pluripotent state even in the tissue of interest. 

 Dr. Alex Meissner:  Right.  Dr. Michael Teitell:  And that could be complicating.  Dr. Alex Meissner:  But  in  this case, part of  the reason  that we could actually detect  it was 

looking at large numbers in this case, and so I think the more we get, the better we  can  actually understand both,  so of  constant  versus  variable regions, and that will again feedback into your development of assays of how you want to actually  look at certain parts. Because once you know where  to  look  for most variations, you probably can narrow  it down  to fewer CpG sites in the genome. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum, uh‐hum.  Dr. Adam Karpf:  There may not be  really an equivalent of  the personal genome and  the 

personal  epigenome  due  to  the  fact  that  you  have  different  tissues, different cell types. And so  it might be that you can evolve down to key markers to follow rather than sequencing genome. 

 [0:45:11]  Dr. Alex Meissner:  Well,  it’s  actually  yes.  That’s  a  very  good  point.  So  I mean,  obviously, 

every  single  tissue might be different, and again,  just  like your genome might  take quite a  few mutations, your epigenome  is certainly going  to change probably over time. And so even though when you’re 20 you got your  epigenome  sequenced,  when  you’re  80  it  might  look  quite differently. So… 

 Sean Sanders:  Right, right. Is it possible to look at a single cell, the epigenome of a single 

cell currently or  to analyze a  single cell, or  is  it  just, you know, beyond what we can do right now? 

 Dr. Adam Karpf:  I have to defer to Dr. Meissner.  Dr. Alex Meissner:  It’s  in  theory  possible.  So  obviously,  it’s  a  big  challenge.  The  high 

throughput sequences help a lot because they use very small amounts in the  molecule  range.  But  for  example,  the  technology  that  we  use  is bisulfite sequencing based which is very DNA degrading, so that certainly creates some challenge. So going back to the very  first question, having new methods available that do not use bisulfite will probably help that a 

24

little bit. But  in  theory, DNA methylation,  I would  say yes,  it’s possible; chromatin,  much  harder  because  again,  you  need  to  enrich  using antibodies  and  capture  enough  fragments  to  actually  get  to  your sequencing  libraries. So  it’s  I think for methylation possible; for ChIPs or chromatin, most likely not. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Now,  I assume when you’re doing these studies you’re  looking 

at  nuclear DNA. Has  anyone  studied mitochondrial DNA  and  are  there differences  in  methylation,  the  way  it’s  methylated,  the  genes,  the proteins involved? 

 Dr. Adam Karpf:  Yeah. So mitochondrial DNA doesn’t have  ‐‐ mitochondria doesn’t have 

histones. To my knowledge it doesn’t have DNA methylation and the DNA methyltransferase enzymes are not present in the mitochondria. There is at  least one  interesting paper  showing  that  the presence or absence of the  mitochondrial  genome  can  impact  epigenetic  DNA  methylation changes  in  the nucleus, but  in  terms of  the mitochondrial genome,  I’m not aware of studies that have shown any epigenetic regulation of it. 

 Dr. Michael Teitell:  I mean,  linking back  to  immunity  for a  second which  is very  interesting 

you  bring  that  up,  non‐methylated  CpG  sequences  in  bacteria  for example are very stimulatory to the  innate  immune system, and I really, you know,  I’ve wondered whether or not  if you had mitochondrial DNA that  actually  leaked out of  a  cell  that was either undergoing  apoptosis and  not  completely  fragmented  or  necrotic,  if  that  would  actually stimulate the innate immune system as well. 

 Dr. Adam Karpf:  Yeah, that’s interesting.  Sean Sanders:  Uh‐hum. So  the next question  is  for you, Dr. Karpf. You concluded  that 

global hypomethylation  is a hallmark of cancer.  Is this based on ovarian cancer and do you  think  the  conclusion  is more generally applicable  to other genotypes? 

 Dr. Adam Karpf:  Yeah.  It’s  not  confined  to  ovarian  cancer.  There’s  really  quite  a  bit  of 

literature for the last 25 years showing global hypomethylation in various malignancies.  Prostate  cancer  for  instance  is  one  of  the  early  studies. Colon cancer  is another. So  it’s pretty well established  in many different systems.  I would say  that  it probably hasn’t been as well established as hypermethylation has been just because there’s probably a hundred to a thousandfold  more  studies  that  have  been  published  on hypermethylation in cancer. 

 

25

  So it’s kind of really ran the gamut of every tumor type you can think of. There’s evidence for silencing by DNA hypermethylation, but in general, it does appear to be very common in malignancy and somewhat unrelated to  the  hypermethylation  phenotype.  So  studies  that  have  tried  to determine  whether  hypermethylation  and  hypomethylation  are associated  have  generally  shown  no  association  between  those  two phenomenon even though sometimes they do occur  in the same tumor. So at this point, it’s a little bit paradoxical what’s going on. 

 Sean Sanders:  Great. So coming back to you Dr. Meissner, here’s a question back about 

asking  how  dynamic  DNA  methylation  patterns  are  and  can  they  be altered during  the  course of an  infection? Or  I mean, we know disease definitely, but do you have any idea of infection? 

 Dr. Alex Meissner:  So we  have  not  studied  any  infections  in  terms  of  their  dynamics.  So 

obviously, during normal development, the patterns of DNA methylation are fairly dynamic at different phases. Once you established a cell type, in principle they are fairly stable, but then again, that may be influenced by diseases  or  again  acquiring  for  example  changes  in  the  epigenetic patterns  of  particular  sites,  and  so we  don’t  have  any  data  to  sort  of support  or  comment  on  that.  Yeah,  I  don’t  know  if  there’s  any  other comments. 

 [0:50:07]  Dr. Michael Teitell:  Yeah.  I think Adam discussed this earlier.  I think that perhaps there’s at 

least  a  smattering  of  evidence  in  the  case  of  Helicobacter  pylori  and infection of the GI tract  in which case the epithelial cells of the GI tract and  the  lymphocytes  in  the GI  tract  seemed  to  have  some  changes  of methylation,  although  how  that will  pan  out,  I’m  not  100%  sure.  And Helicobacter  has  been  associated  with  the  development  of  multiple lymphoma  in the GI tract, so  it’s possible at  least but  I don’t know from personal experience. 

 Sean Sanders:  Okay. So I’m going to move on to a little bit more on the clinical side since 

we’re  talking  about  infection,  and  this  viewer  asks  if  there  are  any complications  when  using  therapies  that  target  the  methylation machinery since it’s needed for regulatory function of normal cells. So Dr. Teitell, would you like to start us off with that? 

 Dr. Michael Teitell:  Well, I think that’s a complicated question. There are two or three drugs I 

believe  in  trials  and  actually  use  these  for  underlying  therapies particularly in the disease myelodysplastic syndrome, which seem to be if you will  epigenetic  static  in  that  they  can  as  an  example  demethylate 

26

methylated  tumor  suppressor genes as an example, but when you  take the  patients  off  of  those  drugs,  then  they  can  revert  to  the  prior phenotype. 

   But those drugs also are very nonspecific. They’re not targeted. And so, 

you know, one would have to always question and  I’m sure that there’s literature that is out there of alterations in genes that are unintended in those  cells and  the  treatments and also  in  the bystander  cells  that are not, you know, related to the tumor that you might have under therapy. So  there  is  promise  obviously  with  treatment  in  myelodysplastic syndrome with  some of  these nonspecific  agents  such  as  5‐azacytidine derivatives and histone‐deacetyl‐lysine derivatives, but  it probably does affect much more  than  just  simply  the  genes  that  have  gone  array  to drive this dysplasia. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Karpf?  Dr. Adam Karpf:  Yeah.  So  the  drugs  that  we  have  now,  5‐azacytidine  and  5‐aza‐2’‐

deoxycytidine which are  cytidine analogs and essentially antimetabolite driven mechanism of action, the specificity of those drugs is really driven by the same specificity that other antimetabolites are driven by, which is the  proliferative  index  of  the  target  tissue.  So  it  is  quite  interesting though that in the case of MDS, the proliferation rate might not be really the  issue  in  that malignancy. But more generally,  I  think  in  these drugs and  in other contexts  it’s thought that the specificity for tumor tissue as opposed to normal tissue is really derived from the proliferation index of those tissues. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Great. Dr. Meissner, anything to add?  Dr. Alex Meissner:  I think they just summarized it.  Sean Sanders:  Great.  So  the  discovery  of  5‐hydroxymethylcytosine,  do  you  think  we 

know yet whether it plays into any therapeutic or diagnostic areas, or is it too early to tell? 

 Dr. Adam Karpf:  Well,  it  appears  to  have  a  function  in  the  brain.  I  think  the  best 

established literature is the detection of that mark in the brain. So I guess one  could  envision  neurodegenerative  disorders  might  have  altered levels  of  that  base  and  certainly  it’s  distinct  from  5‐methylcytosine  in terms of  its ability  to be  recognized by  certain elements of methylated DNA binding protein  family  that can  repress gene expression which are unable  to  bind  5‐hydroxymethylcytosine.  So  I  think  it’s  an  intriguing molecule, it exists, but the jury is out. 

27

 Sean Sanders:  Uh‐hum. So talking about the brain, a question came  in asking  ‐‐ saying 

that DNA methylation has been welcomed by researchers in psychiatry to form a basis for looking at how gene and environment interact and result in different behavior. Do you have any opinions on this type of research? Dr. Karpf? 

 Dr. Adam Karpf:  It’s kind of outside of my area. From what  I surmise  from the  literature 

though,  I  mean,  it’s  clear  that  some  of  these  disorders  do  have  an epigenetic component, but exactly what epigenetic marks constitute that component or whether we’re even studying  the right ones at  this point I’m not sure about, but I don’t know of the other panelists. 

 Dr. Alex Meissner:  I  mean,  we  had  engaged  in  some  of  these  kinds  of  environment 

epigenetic studies, and I think the one thing where we don’t really have a solid answer for you right now is because you really need to build a much stronger baseline of what normal would constitute because a lot of these environmental  influences  made  much  more  subtle  effects  than  for example the particular CpG island like in cancer is fully methylated. 

 [0:55:11]    So you might change  to a mild degree of  the methylation  levels, which 

again was one of the questions earlier, may actually have a mild effect on the  expression  of  the  gene  and  in  that  case  could  also  have  some translation  into  some mild phenotype. But  in order  to  really distinguish sort  of  normal  variation  versus  sort  of  really  environmentally  induced stable  changes  and  whether  these  could  be  passed  on  through  the germline, I think we still need to study a lot more details, but it’s certainly an interesting area. So… 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Do we have any  idea of the  incidence of hypomethylation and 

oncogene  activation  in  cancers?  Do  you  think  this  is  something  that occurs in all cancers or is it going to be a subset? Dr. Teitell? 

 Dr. Michael Teitell:  Sure. So hypomethylation, as Dr. Karpf alluded  to,  there are genes  that 

are  imprinted such as the  insulin‐like growth factor II which can become activated by DNA hypomethylation. There are the major genes which can be activated by DNA hypomethylation. There’s probably isn’t a restricted phenomenon  to  any  particular  cancer.  For  DNA  hypermethylation, we know that as Dr. Karpf alluded to as well and as Dr. Meissner alluded to, there’s a large literature that says that the propensity in the frequency of DNA hypermethylation  in a whole variety of tumors  is quite high. Again, there’s going to be variability in the tissue, the variability in the cells that 

28

you’re assaying unless you do and  it’s difficult to do of course single cell analysis, but I think it’s a very widespread phenomenon. And there’s even a  connection  again  between  epigenetic modifications  particularly  DNA methylation and the trends or the deamination steps that actually lead to the  transversion of CpGs  to  thymidine CpGs and you see  that obviously outside of the CpG islands. So there’s a big connection between the two as well. 

 Dr. Adam Karpf:  Yeah.  I  think  it’s more  pointing  out  that  Dr.  Eason  and  folks  at M.D. 

Anderson  have  really  shown  that  certain  tumors  have  this  so‐called subphenotype which  you  have  a massive  amount  of  hypermethylation and  this  is  pretty  clearly  shown  in  the  colorectal  cancer  area, whereas you have other sets of tumors that don’t show this phenotype, and when you assay hypermethylation events,  they have much  fewer events. And those two different types of tumors actually classify. They have different pathological  characteristics, different mutational profiles, and  so on. So there appears to be evidence for maybe a subset of tumors that have this real propensity to hypermethylate CpG islands in silenced genes. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. So I’m going to come back to a more technical question quickly. 

There’s  been  a  very  rapid  development  in  the  next‐generation sequencing area. Do you have any opinions on how  this might advance epigenetic research? Dr. Meissner? 

 Dr. Alex Meissner:  Well, it has greatly facilitated over the last few years. I mean, if you think 

about  it, all  the principal approaches  to  look at methylation have been available  for quite a  few years, but only  in the  last  few years they have been  sort  of  initially  coupled  with  arrays  that  are  already  sort  of increased the capability of  looking at different parts  in the genome  in a much  sort of more  comprehensive way. Now  that we have  sequencing and it’s fairly standard with a single lane of an Illumina machine, you can get  a  genome‐wide map  of  different  histone modifications.  Similar  for DNA methylation, the whole methylomes have been created and all that is thanks to high throughput sequencing. So it’s very clear that there has been a huge impact, and again, sort of these global maps have obviously quite  significantly  increased  our  understanding  of  sort  of  epigenetic marks where they are in the genome, how they interact with each other and so forth. So… 

 Dr. Michael Teitell:  You  know,  one  of  the  things  I  presented  in  my  talk  was  restriction 

landmark genome  scanning, which was an early global attempt at DNA methylation analysis, and as alluded  to,  that’s evolved  into  the  current technologies  and  the  costs have  come down.  That prior  technique  is  a great technique but  it’s very restricted  in scope and with the assays  it’s 

29

labor  intensive.  It’s  cost  prohibitive  in  terms  of  the  apparatus  and  so forth.  So  I  think  it’s  a  natural  evolution  actually  to move  towards  the sequencing technologies and they’re very, very advanced and helpful. 

 Sean Sanders:  Great.  Dr. Adam Karpf:  Yeah, and it seems like one of the most exciting areas is the phylogeny of 

the  DNA  methylation  when  you  can  take  different  organisms  and compare  the methylome  between  them  using  these  technologies  and really maybe  learn more about the relationship between methylation  in certain  regions  of  the  genome  and  how  that  relates  to  other  cell physiological functions. 

 [0:59:55]  Sean Sanders:  Great.  So  we’re  almost  out  of  time  but  I’m  going  to  throw  the  last 

question over  to you. Where do you want  to  see  things  in  the next 35 years?  I mean, what are the techniques, what are the technologies that you’re looking for in order to really drive your research forward? What do you hope to see in this area? Dr. Teitell? 

 Dr. Michael Teitell:  I think that the developments in the high throughput sequencing and the 

global genome analysis  is  really exciting. The new marks  that are being identified and the different positions of the new marks  is very exciting. I think as the techniques become more accessible as was alluded to earlier by  Alex  and  cost  non‐prohibitive,  I  think  that’s  really  going  to  drive forward  this area of research, and  the bioinformatics has  to keep up as well. 

 Sean Sanders:  Right. Dr. Karpf?  Dr. Adam Karpf:  Yeah. Actually, I see these new technologies and all the data coming out 

of it actually might lead us back to the more basic mechanistic studies to try  and  understand  how  methylation  is  related  to  different  cell phenotypes and gene  regulation. That new hypothesis will probably be generated from the type of work Alex and others are doing that are really going to come back to the laboratory for the mechanistic studies. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Meissner?  Dr. Alex Meissner:  Yes.  I would  just also argue  it’s  just making  it more sensitive, being able 

to  look  for  example  at  single  cells  then  applying  it  to most  interesting tissue  types  will  be  very  reliable.  The  bioinformatics  was  already mentioned. One other  thing  that’s  really critical  is  trying  to  think about 

30

how  to visualize  these kinds of data, so more data and sort of complex sort  of  epigenetic  patterns  because  it’s  not  a  single  sort  of  two‐dimensional sequence. It’s very complex and so you need to really think about how you can actually summarize it and make it accessible through for  example  something  like  the  UCSC  genome  browser  and  how  you display these things and give people tools to actually analyze it and so to make it most useful. 

 Sean Sanders:  Excellent. Well, thank you very much.  Slide 63    And unfortunately, we are now out of time so I’d like to once again thank 

our  panelists  for  being with  us  today  and  for  generously  sharing  their knowledge  and  expertise:  Dr.  Michael  Teitell  from  the  David  Geffen School  of  Medicine  at  UCLA,  Dr.  Adam  Karpf  from  the  Roswell  Park Cancer  Institute, and Dr. Alex Meissner  from  the Broad  Institute. Many thanks  to you all  for your participation  today.  It was great  to have you here. 

   A big thank you to our viewers for the excellent questions you submitted. 

Apologies that we didn’t have time to get to all of them. Please go to the URL at  the bottom of your  slide viewer  right now  to  learn more about products  related  to  today’s discussion  and  look out  for more webinars from  Science  available  at  www.sciencemag.org/webinar.  This  webinar will  be  made  available  to  view  again  as  an  on‐demand  presentation within approximately 48 hours from now. Please tell us what you thought of the webinar by sending an email to the address now up  in your slide viewer; webinar@aaas.org. 

   Again,  thanks  to  the  panel  and  to New  England  Biolabs  for  their  kind 

sponsorship of today’s educational seminar. Goodbye.  [1:02:43]  End of Audio