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EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON VITAMINA A SOBRE LOS
NIVELES DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS Y QUÌMICA
SANGUÌNEA EN ADULTOS SANOS
Autor
LORENA PAOLA ÁLVAREZ HERNÁNDEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
BACTERIOLOGÍA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ, D.C.
JULIO 1 DEL 2008
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique
nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no
contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea
en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
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Bogotá, Agosto 8 del 2008 Señores PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Cuidad Estimados Señores: Yo Lorena Paola Álvarez Hernández identificada con C.C. No. 53123807 de Bogotá, autor del trabajo de grado titulado EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON VITAMINA A SOBRE LOS NIVELES DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS Y QUÍMICA SANGUÍNEA EN ADULTOS SANOS, presentado como requisito para optar al título de Bacteriología en el año de 2008; autorizo a la Pontificia Universidad Javeriana a: a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para la consulta en la Biblioteca General: Si b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web de la Facultad, de la Biblioteca General y en redes de información con las cuales tenga convenio la Universidad Javeriana: Si c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado: Si d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de información, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de documentación de las respectivas entidades: Si e) Todos los usos, que tengan finalidad académica: Si Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su autor. Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor pacte con la Unidad Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir de la actividad académica.
Lorena Paola Álvarez Hernández Valentina Guzmán Pérez C.C 53123807 Director Autor
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EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON VITAMINA A SOBRE LOS
NIVELES DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS Y QUÌMICA
SANGUÌNEA EN ADULTOS SANOS
Autor
LORENA PAOLA ÁLVAREZ HERNÁNDEZ
APROBADO
VALENTINA GUZMÀN PÉREZ PEDRO MONTERREY
Director Asesor
ALEXANDRA MONDRAGÒN S. ALFONSO BARRETO P.
Jurado Jurado
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FORMATO DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO AUTOR: Álvarez Hernández Lorena Paola DIRECTOR: Guzmán Pérez Valentina ASESOR: Monterrey Pedro TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE: Bacteriología TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON VITAMINA A SOBRE LOS NIVELES DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS Y QUÍMICA SANGUÍNEA EN ADULTOS SANOS. FACULTAD: Ciencias PROGRAMA: Pregrado NOMBRE DEL PROGRAMA: Bacteriología CIUDAD: BOGOTA. AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: 2008 NÚMERO DE PÁGINAS: 73 TIPO DE ILUSTRACIONES: - Tablas, gráficos y diagramas DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES: Acido retinoico, citocinas proinflamatorias, citometría de flujo, química sanguínea. RESUMEN DEL CONTENIDO: INTRODUCCIÓN. MARCO TEÓRICO: Generalidades de la vitamina A, Metabolismo, Funciones, Requerimientos, Dosis toxicas, Manifestaciones de toxicidad, Generalidades de las citocinas, Citocinas de la inmunidad innata y adaptativa, Citocinas proinflamatorias, Citocinas y retinol, Efecto del AR en enfermedad cardiovascular, Efecto de la suplementación con retinol en enfermedades infecciosas, Evaluación de la concentración de citocinas. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN. OBJETIVOS. HIPOTESIS. MATERIALES Y MÉTODOS. Diseño de la investigación, Población de estudio, Selección de la muestra, Tamaño de la muestra, Criterios de inclusión, Criterios de exclusión, Variables del estudio. METODOLOGÍA. Evaluación al inicio, Toma de muestras y procesamiento, Química sanguínea, Procesamiento de citocinas proinflamatorias. Análisis de consumo de alimentos. Seguimiento. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS. DISCUSION. CONCLUSIONES. RECOMENDACIÓNES. REFERENCIAS. ANEXOS
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AGRADECIMIENTOS
Gracias a todas las personas que creyeron en mí y en el proyecto, a los
104 voluntarios que participaron en él, a mis padres Manuel Álvarez y
Matilde Hernández y hermano, a Juan Becerra y a Dios por no dejarme
caer en los momentos difíciles. Doy gracias por ponerme en mi camino a
Alejandra Carreño, estudiante de Maestría, compañera y amiga de la
Universidad Javeriana porque ella más que nadie sabe el esfuerzo,
trabajo, empeño y dedicación para la realización de este trabajo.
Agradezco a la directora del proyecto Valentina Guzmán por darme la
oportunidad de pertenecer a él y a todas las personas que hicieron
posible esta investigación con su apoyo científico y financiero pues son la
pauta para la realización y continuación de otros proyectos que de seguro
contribuirán al progreso de la ciencia y de Colombia.
Junio del 2008
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
ABSTRACT
1. INTRODUCCIÓN
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades de la vitamina A
2.1.1 Metabolismo
2.1.2 Funciones
2.1.3 Requerimientos
2.1.4 Dosis toxicas
2.1.5 Manifestaciones de toxicidad
2.2 Generalidades de las citocinas
2.2.1 Citocinas de la inmunidad innata y adaptativa
2.2.2 Citocinas proinflamatorias
2.3 Citocinas y retinol
2.4 Efecto del AR en enfermedad cardiovascular
2.5 Efecto de la suplementación con retinol en
enfermedades infecciosas
2.6 Evaluación de la concentración de citocinas
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
3.2 Justificación
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
4.2 Objetivos específicos
5. HIPÓTESIS
5.1 Hipótesis verdadera
5.2 Hipótesis nula
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Diseño de la investigación
6.1.1 Población de estudio
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6.1.2 Selección de la muestra
6.1.3 Tamaño de la muestra
6.1.4 Criterios de inclusión
6.1.5 Criterios de exclusión
6.1.6 Variables del estudio
6.2 METODOLOGÍA
6.2.1 Evaluación al inicio
6.2.2 Toma de muestras y procesamiento
6.2.2.1 Química sanguínea
6.2.2.2 Procesamiento de citocinas
proinflamatorias
6.2.3 Procedimiento para la suplementación
6.2.4 Análisis de consumo de alimentos
6.2.5 Seguimiento
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
8. DISCUSION
9. CONCLUSIONES
10. RECOMENDACIÓNES
11. REFERENCIAS
ANEXOS
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RESUMEN
La vitamina A es un nutriente esencial que se deriva de fuentes
alimentarias. Hay diferentes formas de vitamina A: el retinol, el retinal y el
ácido retinoico (AR); el AR influye sobre la actividad génica del núcleo
celular al inducir las secreción de citocinas, por la unión de isómeros de
AR con factores de transcripción activados por ligando que son los
receptores del ácido retinoico (RAR) y los receptores X de retinoides
(RXR). Los receptores actúan por medio de la formación de
heterodímeros (RAR/RXR). Algunos estudios muestran que la unión de
AR a sus receptores RAR y RXR y heterodimerizando con PPAR-γ
aumenta la expresión de citocinas proinflamatorias y moléculas de
adhesión. Estudio pre-experimental que evaluó el efecto de la
suplementación con 50 000 UI de palmitato de retinol (AROVIT) cada
semana durante un mes sobre las citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e
IFN-γ inducidas por retinol en 38 sujetos sanos con edades entre los 18 y
60 años de la Pontificia Universidad Javeriana. Se avaluó el colesterol
total (CT), HDL (Col HDL), LDL (Col LDL), triglicéridos (TG), glucosa
(GLU) y proteína C reactiva (PCR) antes y después de la suplementación,
la evaluación de citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α, IFN-γ se realizó
por citometría de flujo. El bajo coeficiente de correlación para las curvas
de IFN-γ y la baja intensidad media de fluorescencia (IMF) para las tres
citocinas no permite la extrapolación confiable de los valores de la IMF de
las muestras para la determinación de la concentración; no fue posible en
este documento dar información del efecto del suplemento sobre el nivel
de citocinas pero se analiza el efecto del suplemento sobre la química
sanguínea que mostró una diferencia estadísticamente significativa
(p<0.05) entre los niveles de CT, Col LDL y TG, antes y después del
consumo del suplemento.
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ABSTRACT
A Vitamin is an essential nutrient which derives from different food
sources. There are different forms of vitamin A: retinol, retinal and retinoic
acid (RA); the RA influences directly over the genetic activity of the cellular
nucleus in the citoquine secretion induction, by joining the RA isomers to
the ligand-activated transcription factors which are the receptors of the
retinoic acid (RAR) and the X receptors of the retinoids (RXR). This
receptors act through the formation of herterodimers (RAR/RXR). Some
studies show that the RA binding to their receptors RAR and RXR, and
heterodimerizing with PPAR-γ increases the proinflamatory citoquine
secretion and adhesion molecules expression.
The objective of this pre-experimental study is to evaluate the effect of 50
000 UI of retinyl palmitate (AROVIT) over the pro-inflammatory, retinol-
induced citoquines IL-6, TNF-α e IFN-γ , by its supplementation, each
week for one month, to 38 healthy subjects from Pontificia Universidad
Javeriana, between 18 and 60 years old.
Total cholesterol, HDL, LDL, triglycerides, glucose and C-reactive protein
were determined before and after supplementation. Pro-inflammatory
citoquines IL-6, TNF-α, IFN-γ evaluation was done by flow citometry.
The low correlation coefficient for the IFN-γ curve and the low median
fluorescence intensity (MFI) of citoquines, does not allow to determine
samples concentrations; this was concluded based on the high variation
coeficient from the sample’s concentrations analized in all the trials.
Despite it is not possible to provide further information of the effect of the
supplement over the citoquines levels yet, it was interesting to find a
difference statistically significant (p<0.05) between the total cholesterol
levels, LDL cholesterol and triglycerides before and after the supplement
ingestion.
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1. INTRODUCCIÒN
La vitamina A es un nutriente esencial que se deriva de fuentes
alimentarias. El retinol lo obtenemos de alimentos de origen animal como
el hígado, riñón, huevos y productos lácteos y el ß caroteno (precursor de
la vitamina A) de los alimentos de origen vegetal de color amarillo, rojo o
verde oscuro; sus concentraciones en sangre dependen de la ingesta de
alimentos fuentes de este nutriente.
La vitamina A se necesita para un vasto número de procesos biológicos
como desarrollo del ciclo visual, diferenciación y proliferación celular,
integridad de las membranas epiteliales, embriogénesis, función inmune,
hemopoyesis, reproducción, antioxidante y crecimiento. De estas
funciones algunas como la diferenciación celular y la función inmune se
explican por la unión de isómeros del ácido retinoico a receptores
nucleares. Hasta la fecha existen dos familias de receptores nucleares de
ácido retinoico (RAR) y RXR cada una con tres miembros: RAR α, RAR β,
RAR γ y RXR α, RXR β, RXR γ, respectivamente. Las interacciones entre
los isómeros del retinol con sus receptores estimulan o inhiben la
expresión de genes.
Estudios in vitro e in vivo muestran que los retinoides mediante la
regulación de la expresión de genes, actúan en varios procesos del
sistema inmune como: proliferación y diferenciación linfocitica, equilibrio
entre la respuesta de células T ayudadoras 1 y 2 (TH1 y TH2) modulando
la expresión de Interferon γ (IFNγ), IL-2, IL-10 e IL12 y regulación de la
apoptosis durante la selección tímica. El ácido retinoico promueve la
diferenciación celular de monocitos e influye en la secreción del factor de
necrosis tumoral α (TNF-α), IL-1β, IL- 6 e IL-12.
En enfermedad cardiovascular se ha visto que el RAR induce la expresión
del receptor scavenger (basurero) CD36 en macrófagos, los cuales
captan las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que se encuentran en
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estado de oxidación (LDLox), contribuyendo a la formación de la placa
aterosclerótica y de la estría grasa. La expresión de los receptores
scavenger CD36 está regulada por otra familia que responde a lípidos
oxidados, el receptor activado proliferador de peroxisomas gamma
(PPARγ). El ácido retinoico mediante su unión a RXR y RAR por
heterodimerización con PPARγ opera para la trascripción de diferentes
citocinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN-γ) y moléculas de
adhesión (ICAM y VCAM). Actualmente se desconoce el efecto de la
suplementación con retinol sobre la secreción de citocinas
proinflamatorias (IL-6, TNF-α e IFN-γ) en sujetos sanos puesto que la
mayoría de los estudios que relacionan la respuesta inmune y los niveles
de retinol son realizados en sujetos con alguna enfermedad.
El retinol es imprescindible para la modulación de la respuesta
inflamatoria, sin embargo en cantidades excesivas puede tener un efecto
indeseable.
Los requerimientos diarios de la vitamina A estimado por la FDA (Food
and Drug Administration) son en mujeres de 2 300 UI (700 ER) y en
hombres de 3 000 UI (900 ER). Dado el papel del retinol en la respuesta
inflamatoria y al desconocimiento de la modulación de la misma en
sujetos sanos, en este estudio pretendemos evaluar en adultos sanos de
diferentes edades el efecto de la suplementación con 50 000 UI (15.152
ER) de retinol semanales durante un mes, sobre la secreción de IL-6,
TNF-α e IFN-γ.
El estudio permitirá saber si la suplementación con vitamina A en sujetos
sanos y sin deficiencia puede generar una respuesta inflamatoria no
deseada y será el punto de partida para estudios posteriores en donde se
evalúen estos mismos efectos pero en personas con distintas
enfermedades infecciosas o crónicas en donde se sabe que la vitamina A
cumple un papel importante.
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2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades de la vitamina A
El término vitamina A se asocia a un gran grupo de compuestos
retinoides, que consisten en cuatro unidades isoprenoides con cinco
enlaces dobles carbono-carbono (Morgan et al, 1999). La vitamina A esta
representada principalmente por la vitamina A1 o retinol el cual tiene un
anillo trimetileciclohexenilico y una cadena lateral metilada que contiene
cuatro enlaces dobles conjugados y puede presentarse en formas
isoméricas diferentes con actividades biológicas distintas cada una
(figura1a,b) (Stipanuk, 2000).
Fig 1a. Vitamina A (Retinol) Fig 1b. Vitamina A (Palmitato de retinil)
La forma más activa de los isómeros del retinol y la que usualmente se
encuentra en los tejidos de los mamíferos, es el trans retinol A, la
principal forma comercial. Los vertebrados no son capaces de sintetizar
los compuestos con actividad de vitamina A, ni sus precursores los
carotenoides sintetizados exclusivamente por las plantas y
microorganismos (Morgan et al, 1999), por lo que la vitamina debe ser
aportada por la dieta a partir de fuentes de alimentación animal (hígado, el
hígado de pescado, aceites, huevos y productos lácteos) como palmitato
de retinol, o en forma de carotenoides a partir de fuentes vegetales (de
hoja verde oscura, hortalizas y frutos color naranja), estos últimos pueden
ser convertidos en retinol dentro de numerosas células del organismo
humano (Stipanuk, 2000). Los carotenoides precursores de vitamina A
son α y β carotenos; nutricionalmente la forma más importante es la del β
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caroteno el cual tiene un 16.7% de actividad biológica (Villamor et al,
2005). La vitamina A es un compuesto cristalino de color amarillo pálido
soluble en el alcohol, metanol, cloroformo, éter, grasas y aceites, no se
destruye fácilmente con el calor pero se oxida fácilmente con el aire y es
menos estable en soluciones acidas alcalinas. Los esteres de la vitamina
A1 son más estables a la oxidación, los más importantes son el acetato
de vitamina A (C22 H33 O2) y el palmitato de retinil ( C36 H60 O2 ), este
último se empleará como suplemento en este estudio (figura 1 b)
(Stipanuk, 2000).
Los alimentos son la fuente natural de vitamina A cuyo contenido se
expresa en equivalentes de retinol así:
Un equivalente de retinol: 1 µg de Retinol.
6 µg de β-caroteno.
12 µg de otros carotenoides.
33 UI derivadas de retinol.
10 UI derivadas de βcaroteno (Furr et al, 1997)
2.1.1 Metabolismo
El retinol (RO) se ingiere de la dieta en forma de retinil esteres (RE) o
como carotenoides, de los cuales el más importante es el β- caroteno
(Parra et al, 2005). Ver figura 2.
Figura 2. Digestión, absorción y transporte de la vitamina A. RE: Retinil-ester;
RO: Retinol; REH: Retinil-éster hidrolasa; CAR: β - caroteno; CRBP: Proteína
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celular de unión al retinol; LRAT: lecitin- retinol aciltransferasa; QM: Quilomicron;
RA: Retinal; CDIO: Caroteno-15, 15´ dioxigenasa; RETRED: Retinal reductasa;
TTR: Transtirretina; RBP: Proteína de unión al retinol. Figura tomada de la
revista nacional de enfermedades respiratorias de México. 2005 (Parra et al,
2005).
El retinol, en forma de RE y el β- caroteno obtenidos de la dieta son
transportados hacia las células intestinales en micelas; en los enterocitos
se unen a los quilomicrones y de esta forma el retinol y carotenoides
pasan al torrente sanguíneo de donde son tomados por los hepatocitos
para su almacenamiento en forma de retinol, conversión a retinal o a
ácido retinoico (Parra et al, 2005).
Aproximadamente el 75% del retinol de la dieta es tomado por los
hepatocitos. En estas células, los RE son hidrolizados a RO y pueden
tomar dos rutas:
1. Ser secretado por los hepatocitos en la circulación
2. Ser transportados a las células estrella (también llamadas células
almacenadoras de grasa o lipocitos) para su almacenamiento (Dancis et
al, 1992).
En los hepatocitos y células estrella el RO se une a la proteína celular de
unión al RO tipo I (CRBP–I); para poder ser transportados en la
circulación, el RO forma un complejo con la proteína de unión al RO
(RBP) y con la transtirretina (TTR) (complejo RO–RBP–TTR).
En el torrente circulatorio el complejo RO–RBP–TTR representa el 90–
95% de la vitamina A presente en la circulación y de esta forma es
transportado a los órganos blanco, entre ellos ojo, piel, tejido adiposo,
riñón, testículos, médula ósea y pulmón (Napoli, 1996).
La conversión intracelular del β- caroteno a retinal, retinol o ácido retinoico
ocurre mediante reacciones oxidativas, esto se explica por una ruptura
central en el doble enlace central 15,15´ del β- caroteno por la enzima
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15,15´ dioxigenasa, el producto de esta reacción son dos moléculas de
retinal. El retinal a su vez puede oxidarse a ácido retinoico mediante
retinal oxidasa o reducirse a retinol mediante una retinal reductasa
(Glover, 1996).
2.1.2 Funciones
La vitamina A cumple un papel muy importante en el organismo, en
procesos como:
� Visión normal
� Integridad de las membranas epiteliales
� Reproducción, desarrollo embrionario
� Regulación de la diferenciación y proliferación celular
� Función inmune
� Crecimiento
� Hemopoyesis
� Antioxidante
� Previene anemia (Chambon, 1996).
Visión normal: en el segmento exterior de los bastoncillos de la retina, el
11-cis retinal se combina con la opsina, proteína unida a la membrana,
para producir la rodopsina que participa en la visión en condiciones de la
iluminación baja. Complejos similares se forman en los conos para
producir tres rodopsinas específicas con diferentes máximos de absorción
dando lugar a los conos azules, verdes y rojos utilizados para la visión a
colores. Cuando la luz llega a la retina ocurre una serie de cambios
bioquímicos complejos lo cual resulta en la generación de un impulso
nervioso. El 11-cis retinal se convierte a la forma todo-trans y se disocia
del pigmento visual. La regeneración de más pigmento visual requiere la
isomerización nuevamente a la forma 11-cis (Giguere, 1996).
Integridad de las membranas epiteliales: estudios realizados indican
que el ácido retinoico (AR) y varios de sus hidroxi y oxo derivados, están
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implicados en el control de la diferenciación de los epitelios (Morgan et al,
1999). El AR es el principal metabolito activo intracelular, su función en la
replicación de células mucosas, reproductoras e inmunes las ejerce
gracias a que actúa como mensajero intracelular combinándose con
receptores nucleares y modificando la expresión de genes, se conocen
dos tipos de receptores a los que se pude unir: RAR y RXR; además,
participa en los mecanismos que controlan la reacción inflamatoria
relacionada con la generación de oxido nítrico (NO) y citocinas; todos
estos mediadores actúan en la generación o el mantenimiento de la
sensibilización al dolor debido a la inflamación y son diana de muchos
analgésicos (Lemke et al, 2003).
Desarrollo embrionario: en la embriogénesis la deficiencia de vitamina A
es grave, por un lado y la dosificación excesiva con vitamina A y AR, por
otro, resultan en malformaciones del embrión que afectan a la mayoría de
los órganos del cuerpo en muchas especies de vertebrados. Hasta la
fecha no se ha demostrado de manera concluyente que la deficiencia de
vitamina A ocasione malformaciones congénitas en el ser humano.
Actualmente se sabe que muchos de los efectos son mediados por la
expresión regulada por retinoides de genes de homeosecuencias y otros
genes formadores de patrones. Los receptores de AR participan en gran
medida en este proceso (Mclaren et al, 1999).
Antioxidante: los organismos aeróbicos están expuestos a una gran
variedad de proxidantes capaces de causar daño relevante a sus
moléculas (DNA, proteínas, carbohidratos y lípidos); los antioxidantes se
encuentran entre sus muchas estrategias de defensa. Uno de los
antioxidantes más poderosos son los carotenoides, pudiendo capturan o
neutralizar a los radicales libres y por consiguiente detener su reacción en
cadena minimizando el daño (Stahl et al, 2003).
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2.1.3 Requerimientos
El requerimiento alimentario recomendado en la actualidad para la
vitamina A fue establecido por el último informe presentado por la junta de
expertos de la FAO/OMS, expresada en equivalentes de retinol. El
requerimiento alimentario recomendado actualmente para lactantes se
basa en la cantidad de retinol que se encuentra en la leche humana. Para
adultos se basa en las concentraciones sanguíneas y reservas hepáticas
adecuadas y se ajusta a las diferencias en tamaño corporal promedio (ver
tabla 1) (Matarese et al, 2004)
Tabla 1 Requerimientos de Vitamina A en adultos
Edad
Requerimiento RDA
Género
µg RE UL
18 años 900 9333 Masculino 18 años 700 9333 Femenino
19-65 años 900 10000 Masculino 19-60 años 700 10000 Femenino Embarazo 770 10000 Lactancia 1300 10000 > 70 años 900 10000 Masculino > 70 años 700 10000 Femenino
RDA, (requerimientos diarios recomendados) RE = Equivalentes de Retinol Un µg retinol= 1 RE Un µg ß caroteno = 0.167 µg RE Un µg de otra provitamina A = 0.084 µg RE UL=0.30 µg RE UL = Es la máxima cantidad de ingesta del nutriente permitida diariamente
2.1.4 Dosis tóxicas
La ingesta excesiva de vitamina A puede producir toxicidad aguda o
crónica (Penniston et al, 2006). La toxicidad aguda se produce con un
aporte 100 veces mayor a la cantidad recomendada (CR) en los adultos y
20 veces mayor a la CR en los niños, durante un periodo de horas o unos
pocos días. La toxicidad crónica resulta de la ingesta de grandes
cantidades de la vitamina A durante meses o años. De esta forma, resulta
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tóxica una dosis diaria que supere los 25.000 UI durante 6 años o una
dosis diaria superior a las 100.000 UI por más de 6 meses, pero existe,
según investigaciones, una variación muy importante entre las personas
(Souza et al, 2004). En el presente estudio se administró a cada individuo
una dosis de 50 000 UI por semana durante cuatro semanas; es decir que
la dosis diaria equivale a 7142 UI, un valor inferior al límite superior
recomendado diariamente para el micronutriente.
2.1.5 Manifestaciones de toxicidad
La ingestión, aguda o crónica de elevadas cantidades de vitamina A
puede generar diversas manifestaciones clínicas como dolor de cabeza,
vómitos, diplopía, alopecia, sequedad de las membranas mucosas,
descamación cutánea, anormalidades óseas y daño hepático (Penniston
et al, 2006). Sin embargo al presentarse cualquiera de estos síntomas la
desaparición de estas manifestaciones se realiza con la suspensión
inmediata de la vitamina ya que es un proceso reversible.
2.2 Generalidades de las citocinas
Una característica esencial del desarrollo de la respuesta inmune es la
capacidad que tienen sus diferentes componentes de interactuar directa o
indirectamente, mediante contacto célula-célula o mediadores llamados
citocinas. Estas son secretadas por las células del sistema inmunitario o
por células de otros órganos o sistemas; y realizan su acción mediante la
unión a receptores presentes en las células sobre las cuáles actúan
(Razelle et al, 1996).
Fueron descritas a partir de la segunda mitad del siglo XX como factores
solubles producidos en cultivos celulares incubados con antígenos.
Tomando en consideración su origen y actividad fundamental, han
recibido diversas denominaciones: linfocinas, monocinas, interleucinas y
citocinas (Mora et al, 2003).
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Las citocinas son glicoproteínas solubles de bajo peso molecular,
producidas por numerosas células del organismo: linfocitos,
monocitos/macrófagos, polimorfonucleares, endoteliales y epiteliales. Son
sintetizadas como respuesta a estímulos específicos y son capaces de
generar, estimular y favorecer la diferenciación de diferentes líneas
celulares, así como, de regular (incrementar o disminuir) la síntesis de las
propias citocinas y otros mediadores humorales del sistema inmune
(Kuchroo et al, 2001)
2.2.1 Citocinas de la Inmunidad Innata y Adaptativa
� Las citocinas que median la inmunidad innata actúan frente a
diferentes clases de microorganismos y se sintetizan principalmente
en los macrófagos activados e incluyen las siguientes: TNF e IL-1,
mediadores de las reacciones inflamatorias agudas frente a los
microorganismos, IL-12 estimula la síntesis de la citocina IFN-
γγγγ activadora de los macrófagos y la IL- 6 sintetiza proteínas de fase
aguda (Abbas et al, 2002).
� Las citocinas que median y regulan las respuestas inmunitarias
adaptativas se producen sobre todo en los linfocitos T estimulados por
antígenos e incluyen las siguientes: IL-2 es el principal factor de
crecimiento de linfocitos T, IL-4 estimula la síntesis de IgE y el
desarrollo de los linfocitos TH2 a partir de linfocitos T cooperadores
vírgenes, IL-5 activa a los eosinófilos y el IFN-γγγγ es un activador de los
macrófagos (Abbas et al, 2002).
2.2.2 Citocinas proinflamatorias
Cuando existen procesos de naturaleza infecciosa o traumática, una de
las primeras respuestas es la síntesis por los macrófagos, células
endoteliales, fibroblastos, mastocitos, basófilos, células NK (natural killer,
citolíticos naturales) y linfocitos, de un grupo de citocinas mediadoras de
procesos inflamatorios, locales o sistémicos, agudos o crónicos. Entre las
21
citocinas proinflamatorias tenemos: IL-1, IL-6, IL-8, Il-12, IL-16, IL-17, IL-
18, IL-23, Il-24, TNF, quimiocinas e INF-γ (Mora et al, 2003).
Las citocinas proinflamatorias son producidas por células de la inmunidad
innata desde la primera etapa de la RI (respuesta inmunitaria), como
respuesta a estímulos del tipo de endotoxinas, muramil dipéptido (MDP),
lectinas, complejos inmunitarios y otros agentes (ver tabla 2) (Kuchroo et
al, 2001). Una vez producidas las citocinas proinflamatorias son
distribuidas a través de la circulación hacia diversos tejidos donde se
enlazan con receptores específicos presentes en las membranas
celulares y ejercen su actividad, desencadenando un fenómeno de gran
importancia en clínica llamado: respuesta de fase aguda (Abbas et al,
2002).
En una segunda etapa de la RI, los linfocitos T sintetizan citocinas que
contribuyen al desarrollo de la respuesta adaptativa y a amplificar la
respuesta inflamatoria (ver tabla 3) (Abbas et al, 2002).
Tabla 2 Citocinas proinflamatorias de la inmunidad innata
Citocina Tamaño Principal fuente celular
Principales células diana y efectos biológicos
Factor de
necrosis
tumoral
(TNF)
17kD;
homotrímero
de 51 kD
Macrófagos,
linfocitos T.
Células endoteliales: activación
(inflamación, coagulación)
Neutrófilos: activación
Hipotálamo: Fiebre
Hígado: síntesis de proteínas de
fase aguda
Músculo, grasa: catabolismo
(caquexia)
Muchos tipos celulares: apoptosis
Interleucina-6
IL-6
19 – 26 kD Macrófagos,
células
endoteliales,
linfocitos T.
Hígado: síntesis de proteínas de
fase aguda.
Linfocitos B: proliferación de
células productoras de
anticuerpos
22
Tabla 3 Citocinas proinflamatorias de la inmunidad adaptativa
Citocina Tamaño Principal
fuente celular
Principales células diana y
efectos biológicos
Interferón
gamma
(IFN-γγγγ)
50kD
(glucosilado);
homodímero
de
subunidades
de 12.5 kD
Linfocitos T (TH1,
CD8+)
Linfocitos T NK
Macrófagos: activación (aumento
de las funciones microbicidas)
Linfocitos B: cambio a isotipos de
subclases de IgG opsonizadoras y
fijadoras del complemento
Linfocitos T: diferenciación TH1
Varias células: mayor expresión
de moléculas de las clases I y II
del CPH, mayor procesamiento y
presentación de antígenos a los
linfocitos T
2.3 Citocinas y Retinol
Se ha demostrado la función de las diferentes formas de la vitamina A
(retinol, retinal y ácido retinoico), y sus metabolitos (all trans- acido
retinoico y 9-cis-acido retinoico) en la modulación de procesos
inflamatorios y respuesta inmune en diferentes tipos celulares incluyendo
macrófagos, células endoteliales, células vasculares y células del músculo
liso (Marlétaz et al, 2000).
El AR influye sobre la actividad génica al inducir las secreción de
citocinas, esto se explica por la unión de isómeros de AR con factores de
transcripción activados por ligando que son los receptores del ácido
retinoico (RAR) y los receptores X de retinoides (RXR). La manera de
actuar de los receptores es por medio de la formación de heterodímeros
(RAR/RXR) que reconocen secuencias conocidas como elementos de
respuesta al ácido retinoico (RARE) (Chambon et al 1996; Lemke et al,
2003)
23
En el núcleo de las células hay dos conjuntos de receptores nucleares
conocidos como RAR y RXR cada una con tres isoformas diferentes: RAR
α, RARβ y RARγ y RXR α, RXRβ y RXRγ respectivamente, los cuales
activan genes blanco incluyendo enzimas, factores de transcripción,
citocinas y receptores de citocinas (Neerven et al, 2007) Figura 3.
Figura 3. Mecanismo de acción del ácido retinoico (AR) sobre la expresión de
citocinas. Unión de los isómeros del AR con sus receptores y formación de
heterodímeros (RAR/RXR) que reconocen secuencias conocidas como
elementos de respuesta al ácido retinoico (RARE) que activa genes para
citocinas.
Los receptores activados del proliferador de peroxisomas (PPAR) son
receptores nucleares que también operan para la trascripción de citocinas
tras heterodimerizarse con RXR. Se han descrito tres tipos principales de
PPAR designados como α, δ y γ, estos receptores se encuentran
involucrados en la regulación de diferentes procesos metabólicos
descritos más adelante (Neerven et al, 2007).
Estudios in vivo e in vitro relacionan la vitamina A con la expresión,
síntesis o inhibición de las citocinas (proinflamatorias o antiinflamatorias)
utilizando diferentes modelos. Los autores de estos estudios han
24
encontrado resultados contradictorios porque diferentes líneas celulares
estimuladas con AR tienen tanto aumento como reducción de las
concentraciones de las citocinas. La expresión de las citocinas puede ser
diferente dependiendo de las condiciones previas de la célula u
organismo y del estimulo proveniente de las isoformas del ácido retinoico
(Neerven et al, 2007). En la tabla 4, se muestran los efectos de las
diferentes formas de vitamina A sobre las citocinas anti y proinflamatorias.
Tabla 4 Efecto del retinol sobre la secreción de citocinas
La vitamina A en forma de AR participa en: diferenciación, proliferación y
señalización de linfocitos T, diferenciación en la línea mieloide modulando
la expresión de IFN-γ e IL-12 (Rühl, 2007), inducción e inhibición de
apoptosis durante la selección tímica, regulación de los genes
involucrados en mantenimiento del equilibrio entre TH1 y TH2, esta última
es una de las funciones más importantes del AR dentro del sistema
AUTOR/ FECHA
TIPO DE ESTUDIO
MODELO
EFECTO
Wuttge et al, 2001
Efecto suplementación con All - trans ácido retinoico (AtRA)
Cultivo de la línea celular de monocitos con atRA
- Supresión del TNF por atRA -Producción de IFN-γ
Wågsäter et al, 2006
Efecto suplementación con ácido retinoico
Células de músculo liso de placas ateroscleróticas.
Aumento expresión receptores IL-1 β.
Dawson et al, 2006
Efecto suplementación con atRA y 9-cis –RA
Cultivos celulares de linfocitos T.
Incremento niveles de IL-4, IL-5 y IL-13 Reducción niveles de IFN-γ, IL-2, IL-12 y TNF-α
Dzhagalov et al, 2006
Deficiencia del receptor del ácido retinoico (RARγ).
Células de ratones carentes del RAR γ.
En Linfocitos T CD4 aumento IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-13
Wang et al, 2006
Efecto suplementación con All - trans ácido retinoico (AtRA)
Cultivos células mononucleares, del cordón umbilical.
Aumenta producción de IL-10, reducción de IL-12 y TNF-α secretado por macrófagos y monocitos.
25
inmune pues es la responsable de regular la expresión de diferentes
citocinas como IL-2, IL4, IL-5,IL-12 e IFNγ, ( Rühl, 2007). Figura 4
Figura 4 Regulación del ácido retinoico (AR) sobre linfocitos T ayudadores (Th) 1
y Th2. El AR a partir de la interacción con sus receptores en la APC promueve
en Th-1 la síntesis de IL-12, IL-2 e inhibe IFN-γ. IL-4 y en Th-2 promueve IL-4 e
IL-5 e inhibe IFN-γ. APC, célula presentadora de antígeno. EO,
eosinófilo. Promueve, Inhibe, Efecto sobre las citocinas. Figura
tomada de la revista nutrition society. p 458-469 (Rühl, 2007)
2.4 Efecto del AR en enfermedad cardiovascular
Modelos ateroscleróticos muestran que la unión de AR a sus receptores
RAR y RXR y heterodimerizando con PPAR-γ aumenta la expresión de
CD36, el cual es objeto de estudio por su relación con dicha patogénesis;
esto se explica porque el CD36 puede ser inducido por lipoproteínas de
baja densidad oxidadas (LDLox) por medio de dos vías diferentes de
señalización RAR/RXR y PPAR-γ/RXR, ver figura 3. Las isoformas de
PPAR: PPARα, PPAR β/δ y PPARγ median la respuesta inflamatoria en
26
los procesos ateroescleróticos al activar o inhibir genes de citocinas; la IL-
4 induce la diferenciación de linfocitos T ayudadores (TH2) el cual activa
la expresión de PPARγ, esta activación va a inhibir la producción de IL-12
e IL-2 pero induce la producción de INF-γ, moléculas de adhesión como
VCAM y otros mediadores proinflamatorios como la inducción de la
síntesis del oxido nítrico (Schiffrin, 2003).
En células humanas aisladas de placas ateroscleróticas se han descrito
receptores para el AR, lo que sugiere que los retinoides participan en la
señalización del proceso aterosclerótico y en esta condición podrían
cumplir un efecto nocivo diferente al descrito en varios estudios en donde
la vitamina A podría tener un efecto protector. (Nicholson, 2004) Figura 5.
Figura 5 Diagrama de la inducción de CD36 por dos vías. 1. Heterodimerización de
RAR/RXR por atRA 2. Heterodimerización de PPAR-g/RXR por oxLDL. Ambas vías
promueven la formación de células espumosas y desarrollo de la ateroesclerosis. Figura
tomada de la revista médica cardiovascular, 2004. (Nicholson, 2004)
Los isómeros del AR se unen a sus receptores en el núcleo celular y
heterodimerizan con PPAR para modular la expresión de citocinas
proinflamatorias y antiinflamatorias, la consecuencia de esta interacción
depende de las condiciones de la célula, por ejemplo en deficiencia,
algunos estudios muestran que la vitamina aumenta la respuesta
antiinflamatoria pero se desconoce si el exceso de la vitamina podría por
los mismos mecanismos ya descritos promover la respuesta
27
proinflamatoria, puesto que estudios de toxicidad muestran un aumento
en el perfil de inflamación.
2.5 Efecto de la suplementación con retinol en enfermedades
infecciosas
La vitamina A puede tener el potencial de aumentar la respuesta con
anticuerpos contra el toxoide tetánico, este efecto parece estar limitado en
niños (Morgan et al, 1999). Cuando se administra la vacuna contra el
sarampión a la edad de nueve meses la suplementación con vitamina A
puede aumentar la respuesta de anticuerpos en los niños con bajo peso.
Además de los efectos con suplementos de vitamina A en la producción
de anticuerpos contra antígenos seleccionados, también es conocido el
papel que desempeña en la inmunidad celular dentro de la diferenciación
linfocitica en niños infectados por VIH (Morgan et al, 1999).
Estudios en Perú y Estados Unidos muestran que la suplementación con
vitamina A puede aumentar algunos síntomas en infecciones respiratorias
tales como neumonía, virus sincitial respiratorio y tuberculosis; por otro
lado en estudios clínicos recientes la suplementación con vitamina A en
pacientes tuberculosos no presento ventaja alguna pero si modifico la
respuesta inmune al inducir e inhibir moléculas de adhesión y células
propias del sistema inmune (Sthephensen, 2001). Sin embargo otros
estudios muestran que el suplemento con vitamina A disminuye la
infección contra la malaria en niños de seis meses a cinco años de edad,
la suplementación disminuye el número de episodios febriles y la
densidad parasitaria (Omer et al, 2000), en respuesta inmune contra los
parásitos intracelulares se ve involucrada la inmunidad innata (células NK)
y la producción de IFN-γ e IL-2 (Rühl, 2007). Los anticuerpos juegan un rol
importante en disminuir la severidad de la enfermedad (Sthephensen,
2001).
28
La investigación sobre los efectos de la suplementación con vitamina A en
la producción de citocinas en adultos es escasa, puesto que la deficiencia
de la vitamina A es más común en niños y gestantes la mayoría de las
veces con compromiso nutricional, al ser esta la población más
vulnerable; por esta razón en este estudio pretendemos describir los
efectos de un suplemento de este nutriente sobre los niveles de citocinas
proinflamatorias en adultos sanos.
2.6 Evaluación de la concentración de citocinas
Los anticuerpos específicos que se unen a la superficie de las
glicoproteínas (citocinas) se utilizan de manera habitual para identificarlas
en tejidos y suspensiones celulares. En estos métodos, el anticuerpo
puede marcarse con radioactividad, unirse a enzimas o, lo que es más
frecuente, se puede marcar con fluorescencia; para emplear después un
sistema de detección que permita identificar al anticuerpo unido (Abbas et
al, 2002).
Marcaje de citocinas con radioactividad
Existen varios tipos de marcaje con elementos radioactivos de diferente
naturaleza como el Indio- 111 (In-111) o el Tecnecio 99 metaestable
(Tc99m), siendo este último el más utilizado. El principio de la técnica in
vitro se basa en la unión de anticuerpos monoclonales a la citocina en
particular, el isótopo radioactivo se une al complejo antígeno-anticuerpo y
la emisión de radiación gamma es capturada por detectores del equipo
utilizado para este análisis (gammacámara) que permite la obtención de
imágenes planares o tomográficas. Esta técnica no es utilizada de rutina.
(Pérez et al, 1994)
Marcaje de citocinas con enzimas
La técnica de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) se utiliza para
la cuantificación de citocinas pues emplea anticuerpos monoclonales
específicos para cada analito de interés, así por ejemplo para la
29
determinación de TNF-α se utiliza como anticuerpo de captura un
monoclonal específico para TNF alfa humano y como segundo anticuerpo,
un policlonal generalmente de conejo anti-TNF-α purificado por
inmunoafinidad. Este segundo anticuerpo tiene pegada una enzima que
vira de color al unirse al inmunocomplejo, la longitud de onda emitida por
esta enzima es capturada por los lectores de ELISA (espectrofotómetros).
Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de la señal que permite el segundo anticuerpo (Mora et al,
2003)
Marcaje de citocinas con fluorescencia
El marcaje de citocinas con fluorocromos es la técnica (citometría de flujo)
más utilizada pues permite el análisis multiparametrico de cada una de las
citocinas (Herzenberg et al, 2002); el fundamento se basa en hacer pasar
una suspensión de partículas (citocinas) alineadas y de una en una por
delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el
rayo de luz excita al fluorocromo y se produce señales que corresponden
a diferentes parámetros de la glicoproteína y que son recogidos por
distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales
electrónicas que posteriormente serán digitalizadas por el citómetro de
flujo para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una
misma población de citocinas (Autor, manual de citometria de flujo, 2001).
30
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
La vitamina A o retinol esta relacionada con la prevención de ceguera
nocturna, la aparición de enfermedades infecciosas como la malaria,
tuberculosis y enfermedades crónicas como las cardiovasculares (Mclaren
et al, 1999) Varios estudios han evaluado sus efectos después de la
suplementación con diferentes dosis durante periodos variables de tiempo
y los resultados han sido contradictorios. Myhre et al evaluaron el efecto
de un suplemento de vitamina A sobre el nivel de toxicidad crónica y
evidenciaron que un consumo de 2 equivalentes de retinol/kg de peso
durante meses o años puede provocar hipervitaminosis A crónica al igual
que un consumo de 0.2 mg retinol /kg de peso por pocas semanas.
Cartmel et al midieron la relación de la vitamina A y enfermedad
cardiovascular y encontraron que dosis de 300 000 UI de los retinoides
sintéticos eleva los triglicéridos y el colesterol. Aunque se reconoce el
papel regulador de la Vitamina A sobre los diferentes procesos fisiológicos
y biológicos del organismo, se tiene que resaltar que en exceso puede
tener efectos adversos.
Diferentes estudios han relacionado el efecto de la suplementación con
vitamina A sobre la respuesta inmunitaria encontrando aumento o
inhibición de citocinas en animales y cultivos celulares, Wuttge et al
suplementaron con all - trans ácido retinoico (AtRA) y encontraron un
aumento de IFN-γ e inhibición de TNF, Wågsäter et al suplementaron con
all - trans ácido retinoico (AtRA) y hallaron un aumento de la IL-1β,
Dawson et al suplementaron con atRA y 9-cis–RA, y encontraron
aumento de IL-4, IL-5 y IL-13 y una reducción de IFN-γ, IL-2, IL-12 y TNF-
α; estos son ejemplos de algunos de los estudios que demuestran que la
vitamina A tiene un efecto en la expresión de citocinas y que ésta es
diferente dependiendo de las condiciones previas de la célula y de la
forma química de la vitamina que realice el estímulo.
31
El interés de la población mundial en los suplementos vitamínicos es
enorme, del 20 al 30 % de la población en países en vía de desarrollo los
emplea. Aunque en España y otros países europeos no hay estadísticas
confiables, se estima que en EEUU, una tercera parte de la población los
consume regularmente y lo hace en cantidades que superan diez veces la
ingesta recomendada. La popularidad del uso de elevadas cantidades de
vitaminas se basa en ideas erróneas de que la ingesta excesiva ayuda a
prevenir procesos que van desde el resfriado común hasta el cáncer.
Estudios in vitro e in vivo muestran que el retinol en exceso puede inducir
una respuesta inflamatoria no deseada en procesos inflamatorios crónicos
como la enfermedad cardiovascular al inducir una sobreproducción de
citocinas proinflamatorias (Redlich et al, 1999).
Se desconoce el papel que tiene el retinol sobre el nivel de citocinas
proinflamatorias IL-6, TNF-α e IFN-γ en personas adultas sanas, puesto
que la mayoría de los estudios que relacionan la vitamina A con
enfermedad se desarrollan con gestantes o niños al ser esta población la
más vulnerable; en este estudio se pretende en personas adultas sanas
entre los 18 y 60 años responder a la siguiente pregunta: La
suplementación con retinol modifica el nivel de citocinas proinflamatorias?
3.2 Justificación
Existe una relación entre la vitamina A y la respuesta inmune, aunque
existen mecanismos claves en el sistema inmunológico en donde la
vitamina A desempeña un rol importante que aún no se comprenden
plenamente; por eso es adecuado evaluar el efecto que tiene la
suplementación con vitamina A en diferentes estados fisiológicos y de
salud.
Actualmente existe un interés en el consumo de suplementos
nutricionales por los beneficios descritos para estos, sin embargo quienes
suplementan sin ninguna prescripción médica ni nutricional y sin
32
antecedentes de deficiencia, no han considerado las consecuencias que
la alta ingesta de una vitamina liposoluble como la A puede generar.
Evaluar el efecto de la suplementación con vitamina A (palmitato de
retinol) sobre la concentración de citocinas proinflamatorias en sujetos
sanos permitirá saber si una ingesta alta de retinol a partir de fuentes
sintéticas en sujetos sin previa deficiencia nutricional induce una
respuesta inflamatoria no deseada; este estudio será el punto de partida
para estudios posteriores en donde se evaluará estos mismos efectos
pero en personas con enfermedades infecciosas o crónicas de forma que
a futuro puedan emplearse medidas correctivas para el expendio ilimitado
y sin prescripción médica de suplementos nutricionales como el de la
vitamina A.
33
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL � Evaluar el efecto de la suplementación con Vitamina A sobre las
citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e IFN-γ y química sanguínea
inducidas por retinol en sujetos sanos.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
� Cuantificar por citometría de flujo el nivel de citocinas IL-6, TNF-α e
IFN-γ antes y después de la suplementación con palmitato de retinol
en pacientes adultos sanos.
� Evaluar el colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos,
glicemia y proteína C reactiva (PCR) antes y después de la
suplementación.
� Analizar el efecto del suplemento sobre los distintos parámetros de la
química sanguínea.
34
5. HIPÓTESIS
5.1 HIPÓTESIS VERDADERA
La suplementación de sujetos adultos sanos con 50 000 UI/semana de
retinol durante cuatro semanas modifica las concentraciones de las
citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e IFN-γ.
5.2 HIPÓTESIS NULA
La suplementación con 50 000 UI/semana de retinol durante cuatro
semanas días no tiene ningún efecto sobre la concentración sérica de las
citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e IFN-γ.
35
6. MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio fue aprobado por el comité de ética del la Pontificia
Universidad Javeriana (PUJA) (ver certificado anexo 1) y se deriva de otro
registrado y financiado por la universidad y por Colciencias.
6.1 Diseño de la investigación
Estudio prospectivo de tipo pre-experimental en el que cada individuo fue
su propio control. No se empleó un grupo de control puesto que la
intervención con el suplemento de retinol fue inferior a 30 días y en ese
tiempo no se espera se produzcan efectos hormonales, medio
ambientales o de otro tipo que influyan sobre las relaciones a investigar.
Se realizó un seguimiento de la ingestión de la vitamina A antes y durante
la suplementación y aquellos casos en los que el consumo varió de forma
relevante de lo evaluado como patrón de consumo habitual, fueron
excluidos del estudio.
6.1.1 Población de estudio
Se trató de representar la población constituida por los sujetos sanos
mayores de 18 años y menores de 60 en quienes el metabolismo hepático
del micronutriente mediado por el citocromo P450 fuese normal. Como
población marco para el estudio y la selección de la muestra se utilizó la
constituida por los empleados y estudiantes de la PUJA. Esta población
representa, de manera adecuada, el marco mayor de los individuos
sanos.
6.1.2 Selección de la muestra
Se realizó una convocatoria en la PUJA a voluntarios sanos dispuestos a
ingresar en el estudio, se difundió los anuncios en el portal y boletín
electrónico de la universidad, se envió un correo electrónico general al
personal docente y administrativo invitando a participar en el estudio y se
visitaron algunos salones de clase de los estudiantes de la facultad de
36
Ciencias y Medicina. Cada individuo se analizó para verificar si cumplía
con los criterios de participación. Los individuos que durante el
seguimiento tuvieron que excluirse del estudio por abandono voluntario,
fueron compensados con el ingreso de nuevos.
6.1.3 Tamaño de la muestra
El estudio del cual se deriva el aquí descrito incluyó un tamaño muestral
de 60 personas; teniendo en cuenta la disponibilidad de sólo cuatro
meses para realizar el ingreso y el procesamiento de las muestras, se
decidió tomar sólo 38 personas para este análisis, este número de sujetos
coincide con el de otros estudios similares en los cuales se evaluó el
efecto de diferentes suplementos nutricionales sobre otros parámetros.
6.1.4 Criterios de inclusión
1. Tener entre 18 y 60 años de edad
2. Presión arterial <140 mmHg la sistólica/< 90 mmHg la diastólica
3. Glicemia en ayunas < 110 mg/dL
4. Triglicéridos plasmáticos (TG) <150 mg/dL
5. Colesterol Total < 200 mg/dL
6. Colesterol HDL >35 mg/dL en hombres o >39 mg/dL en mujeres,
7. Colesterol LDL<<160mg/dL
8. IMC <28 Kg/ m2
9. PCR ≤ 6 mg/L
10. No ingesta de compuestos que interfieran con la absorción del retinol
(Olestra, Orlistat, aceite mineral)
11. No ser fumador
12. No consumir suplementos de vitaminas o minerales dos semanas
previas a la evaluación
13. Firmar el consentimiento informado (ver anexo 4)
37
6.1.5 Criterios de exclusión
1. Presentar positivamente cualquiera de los criterios de inclusión
2. Presentar en el mes previo al ingreso enfermedad de tipo infeccioso o
inflamatorio
3. Retirar el consentimiento voluntario
4. Aparición de efectos adversos por la suplementación
5. Contraer alguna enfermedad infecciosa en el transcurso del estudio
6.1.6 Variables del estudio
Tabla 5 Variables del estudio Tipo
Variable
Unidad de Medición
Cuantitativa
Edad
Presión arterial
IMC
Retinol dietario
Perfil Lipídico: colesterol total,
HDL, LDL y triglicéridos.
Glicemia
PCR
Citocinas
años
mm Mg
kg/(mts)2
E.R
mg/dL
mg/dL
mg/L
pg/mL
Cualitativa
Morbilidad sentida
Sano/enfermo
38
6.2 METODOLOGÍA (ver resumen de los procedimientos de evaluación en la figura 6) Figura N. 6 Procedimiento para el ingreso y evaluación de los sujetos
Sujetos sanos PUJA entre 18 a 60 años
Evaluación al inicio: nutricional, antropométrica y del estado de salud /responsables profesoras de nutrición
Firma consentimiento informado: /responsables profesoras de nutrición
Apto No Apto
Sale del estudio
TOMA DE MUESTRA Y PROCESAMIENTO: Dos Tubos secos de 10 mL c/u
Química sanguínea: perfil lipídico, glicemia y proteína C reactiva (PCR).
2.5mL distribuidos en tubos eppendorf c/u con 200uL para evaluación de citocinas.
Almacenamiento a -70oC
Valores normales
SEGUIMIENTO Día 0 a 28. Instrucciones de Procedimiento para: 1. Administración de 50.00 UI de retinol una vez por semana durante un mes; 2. Seguimiento semanal para descartar manifestaciones de intolerancia al suplemento. 3. Recolección de registro diario del consumo de alimentos. (Responsables profesoras de nutrición)
Análisis de las citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e IFN-γ por medio de citometría de flujo.
Día 28 -Se tomaron nuevamente 2 tubos secos con 10 ml: para química sanguínea y citocinas proinflamatorias (estudiante de pregrado en bacteriología)
Apto
Valores anormales
No Apto Sale del estudio
39
6.2.1 Evaluación al inicio
Para verificar que los sujetos cumplieran con los criterios de inclusión, su
estado de salud y nutrición fue evaluado en el momento de la captación
(Ver anexo 2 y 3). Dichas evaluaciones estuvieron a cargo de las
nutricionistas: Valentina Guzmán (Directora de proyecto) y Yadira Cortés
(coinvestigadora). La firma del consentimiento informado se realizó dentro
de esta primera evaluación. (Anexo 4)
6.2.2 Toma de muestras y procesamiento
La toma de muestras fue realizada por la autora de este proyecto, se
tomaron 20 mL de sangre periférica en el día 0 (antes de la
suplementación) y en el día 28 (post suplementación). El suero fue
extraído en dos tubos secos cada uno de 10 mL en donde se midieron las
citocinas proinflamatorias (IL-6, TNFα, IFNγ) y la química sanguínea que
incluyó: perfil lipídico (Colesterol total, Colesterol LDL, Colesterol HDL y
triglicéridos) glicemia y PCR. A continuación se describe la metodología
para la determinación de las distintas variables en las muestras
recolectadas.
6.2.2.1 Química Sanguínea (días 0 y 28)
Las muestras de sangre se recolectaron después de un ayuno de ocho
horas. El suero obtenido tras una centrifugación de diez minutos a 2 500
gravedades, fue transferido a tubos eppendorf de 1.5 mL para ser
almacenados a -200C. Las mediciones de perfil lipídico y glicemia se
realizaron en el equipo stat fast 3300 con kits de la casa comercial
spinreact .
Algunos de los analitos como triglicéridos, colesterol total y glucosa se
evaluaron por medio de reacciones enzimáticas acopladas de oxidación
con producción de peróxido de hidrogeno, el producto final es un
colorante aromático policiclico el cual absorbe a 505 nm; la intensidad de
color a 505 nm es directamente proporcional a la concentración del suero
del analito medido en el equipo stat fast 3300. Colesterol HDL: su
40
medición se realizo al precipitar las lipoproteínas de baja y muy baja
densidad (LDL y VLDL respectivamente). Colesterol LDL: se realizo según
la fórmula de Friedewald. LDL= colesterol total – colesterol-HDL–
(triglicéridos / 5) y la proteína C reactiva se detectó en suero por
aglutinación de partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti – PCR
humana con moléculas de PCR presentes en la muestra del paciente
(spinreact ). Los valores de referencia empleados para la selección de
sujetos fueron descritos en los criterios de inclusión.
6.2.2.2 Procesamiento de Citocinas Proinflamatorias
Los sueros obtenidos antes y después de la suplementación fueron
almacenados en viales de 1.5 mL con 200 µl a -70 o C y fueron analizadas
por duplicado. La cuantificación de las citocinas proinflamatorias IL-6,
TNFα, IFNγ se realizó por citometría de flujo; se empleó un kit CBA
Human Th1/Th2 Cytokine Kit II de Becton Dckinson que contiene perlas
de captura (anticuerpos monoclonales) para cada una de las citocinas a
evaluar; la adición de un fluorocromo (PE= ficoeritrina)( Robinson, 2005)
y la unión de este al complejo anticuerpo-citocina permite mediante el
citómetro de flujo detectar la intensidad media de fluorescencia y su
concentración dada en pg/ml de cada citocina (Ver figura 7a. y 7b).
Figura 7 a. Figura 7b.
Figura 7a. Intensidad media de fluorescencia vs cuentas de las citocinas TH1 y
TH2. 7b Escala logarítmica de la intensidad media de fluorescencia de las 6
bandas de citocinas detectada en 2 canales diferentes. Figuras tomadas del
41
manual de instrucción del kit CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II de Becton y
Dckinson.
El análisis de las muestras se realizó en dos citometros de flujo
dispuestos en la unidad de citometría de flujo de la Pontificia Universidad
Javeriana, BD FACSTM ARIA y BD FACS Calibur™ con el software para
análisis de citocinas que estos poseen (BD CellQuest™). La comparación
de la intensidad media de florescencia de las citocinas de una muestra
frente a la intensidad media de florescencia de la curva con los
estándares de citocinas con concentraciones conocidas (Fahey et al,
2007), permite al software expresar los resultados en pg/ml para cada una
de las proteínas evaluadas. El kit permite la cuantificación de las
citocinas TH1 y TH2 de las cuales para efectos de este estudio se
analizaron la IL-6, TNFα, IFNγ.
6.2.3 Procedimiento para la suplementación
Posterior a la toma de muestra de sangre del día 0, se administró a cada
paciente cuatro cápsulas de Arovit (Laboratorios Roche), que contiene 50
000 UI (15 152 ER) de palmitato de retinol/cápsula durante un mes. Se les
instruyó para que ingirieran una pastilla ese día y sólo el primer día de las
siguientes tres semanas con la última comida del día; 50.000 UI
administradas cada siete días equivalen a un consumo diario de 7.142 UI
(2.164 ER)/día. La recomendación o requerimiento diario de consumo de
retinol/día estimado por la FDA (Food and Drug Administration) en
mujeres es 2 300 UI (700 ER) y en hombres es 3 000 UI (900 ER). Lo que
se administró supera las recomendaciones diarias, sin embargo, está por
debajo del límite superior de consumo diario permitido: 10 000 UI/día (3
000 ER/día) y por debajo de las dosis empleadas en estudios de
suplementación con retinol por períodos de tiempo mayores a los
establecidos en este trabajo. No se emplearon las recomendaciones
nutricionales para la población Colombiana puesto que se encuentran en
proceso de revisión y no se han publicado. Todo este procedimiento para
la suplementación fue realizado por la directora de proyecto.
42
6.2.4 Análisis de consumo de alimentos
El consumo de retinol y β carotenos a partir de fuentes alimentarias, se
controló a partir de diarios de consumo de alimentos (ver anexo 5), esta
información la realizó la directora del proyecto y permitió controlar el
consumo de retinol a partir de la dieta.
A cada sujeto apto para participar en el estudio, el día del ingreso (día 0),
se le instruyó para que registre, cada día y durante 28, los alimentos
ingeridos durante el día en un diario de consumo; para esto se emplearon
módulos de alimentos de diferentes porciones que facilitaron el
entendimiento del proceso.
6.2.5 Seguimiento
La directora del proyecto hizo un seguimiento semanal a cada uno de los
sujetos ingresados. Cada semana se contactó al participante para 1.
Realizar la administración vigilada del suplemento; 2. Recoger los 7
diarios de consumo correspondientes a esa semana de evaluación; 3.
Indagar acerca de la presentación de efectos adversos por la ingesta de
la vitamina y 4. Verificar que el sujeto permanezca sano o no haya
padecido en los últimos días algún proceso infeccioso o inflamatorio que
pueda interferir con la absorción o asimilación del suplemento o que
modifique los parámetros inflamatorios a evaluar al final del seguimiento.
43
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
Ajustes al proyecto
Este estudio se deriva de otro cuya muestra es de 60 individuos, durante
este periodo de trabajo se alcanzaron a ingresar más individuos de lo que
se esperaba, por lo que en este documento se describe y analiza la
información proveniente de 38 sujetos.
No fue posible estandarizar todas las técnicas requeridas para dar
cumplimiento al 100% de los objetivos, por lo tanto en este documento se
presenta sólo una parte de los resultados y del análisis obtenido hasta el
momento.
Características demográficas de la población
Se incluyeron 38 voluntarios sanos de la Pontificia Universidad Javeriana
de 18 a 51 años de edad (Media 26.1); del total de los voluntarios el
71.1% fue de sexo femenino.
Todos los sujetos fueron valorados física y nutricionalmente, en total se
evaluaron 104 personas pero se excluyeron 44 por presentar alguno de
los criterios de exclusión: sobrepeso, tensión arterial elevada, IMC >28
Kg/ m2, toma de algún tipo de suplemento multivitaminico, retiro
voluntario, química sanguínea alterada o difícil venopunción.
De los 38 sujetos ingresados a este estudio, 35 pertenecieron a la PUJA
en calidad de estudiantes o personal administrativo, el restante era
externo a la universidad pero asistieron puntualmente al seguimiento.
Química sanguínea
Todos los sujetos ingresados cumplieron con los criterios de inclusión en
el momento del día 0, es decir, al momento del ingreso el 100% presentó
valores de colesterol total (CT) < 200 mg/dL, triglicéridos (TG) <150
44
mg/dl, presión arterial <140 mmHg, glicemia (GLU) <110 mg/dL y PCR<6
mg/L (ver tabla 6). Con respecto al HDL se decidió permitir el ingreso a
aquellas personas que tuvieran valores inferiores al establecido (>35
mg/dL en hombres o >39 mg/dL en mujeres) siempre y cuando ese valor
fuera superior o igual a 30 mg/dL tanto en mujeres como en hombres,
este fue el caso de un 30% de las mujeres (8/27) y un 18% de los
hombres (2/11).
En la evaluación del día 28 un 3% (1/38) de los sujetos presentó
colesterol total > 200 mg/dL, 8% (3/38) TG >150 mg/dL, 15% (4/27)
colesterol HDL < 39 mg/dL en mujeres y 9% (1/11) colesterol HDL < 35
mg/dL en hombres, y un 5% (2/38) presentó PCR ≥6 mg/L.
Tabla 6. Estadística descriptiva de la química sanguínea día 0 y 28
Colesterol
mg/dL
Triglicéridos
mg/dL HDL mg/dL LDL mg/dL
Glucosa
mg/dL
Día 0 Día 28 Día 0 Día 28 Día 0 Día 28 Día 0 Día 28 Día 0 Día 28
MEDIA
D E
138.19
+
26.56
163.83
+
26.41
73.85
+
34.17
90.52
+
49.64
47
+
10.39
49.49
+
10.92
76.26
+
24.10
96.83
+
21.05
77.09
+
12.95
85.29
+
11.36
El promedio de la diferencia entre el día 0 y el día 28 (concentración Final
– Inicial (F-I)) para CT, TG, HDL, LDL y GLU, se muestran en la tabla 7.
La media de la diferencia muestra un incremento de cada una de las
variables al día 28 excepto para HDL para la que se observa una
reducción en su concentración. Lo que indica que tras una
suplementación con 50 000 UI de vitamina A durante un mes la
concentración de los anteriores analitos aumentan, aunque los valores
para la mayoría se mantienen por debajo del limite de referencia
establecido en este estudio.
La diferencia para todas las variables es estadísticamente significativa
(p<0.05) excepto para HDL. En la tabla 7 se indican los intervalos de
45
confianza (IC) los cuales estiman la cuantía del incremento para la
diferencia (F-I) de los analitos.
Tabla 7. Análisis de la diferencia de la química sanguínea entre el día
0 y 28.
En el gráfico 1 se indica la variación de la diferencia de los datos de
química sanguínea al día 0 y 28. Puede observarse una homogeneidad
de la diferencia entre sujetos, puesto que su diferencia se mantiene en un
rango entre 0 y 50, excepto en el caso de 3 sujetos para TG en quienes
estuvo por fuera de estos valores.
Grafico 1. Variación de la diferencia de la química sanguínea al día 0 y 28. En el
eje y de la gráfica el cero indica el no cambio final inicio (F-I) de los resultados de
Media D.E
95% IC para la diferencia p
Inferior Superior
F-I CT 23.26 29.11 13.69 32.83 0.000
F-I TG 16.67 39.75 3.60 29.73 0.014
F-I HDL 2.85 12.95 -1.40 7.11 0.182
F- I LDL 20.56 28.32 11.25 29.87 0.000
F- I GLUCOSA 6.56 14.34 1.84 11.27 0.008
46
la química sanguínea, valores por encima de cero significan aumento y por
debajo disminución.
Se analizó el efecto de la edad sobre la química sanguínea, para esto se
conformaron dos grupos de edad, población < de 30 y > de 30 años; la
insuficiencia de sujetos entre los 30 y 40 años impidió que se conformaran
3 grupos de edad. La media de la diferencia de la química sanguínea (ver
tabla 8) en sujetos menores de 30 años muestra un efecto positivo para
todas las variables y una diferencia estadísticamente significativa para
todas las variables exceptuando HDL, vale la pena aclarar que el tamaño
de la muestra de los sujetos menores de 30 años fue 26 frente a 12 del
otro grupo, lo que seguramente está influyendo en la significancia de la
relación.
Tabla 8. Análisis de la diferencia de la química sanguínea por edad
Se realizo una agrupación por género (femenino y masculino) para
determinar la influencia de este sobre los cambios final (post
suplementación) e inicio para cada analito de la química sanguínea. Se
observa significancia estadística en mujeres para todas las variables
excepto TG y HDL y en hombres sólo se observa una diferencia en CT y
en LDL, aquí al igual que en la relación por edades el análisis vale la pena
realizarlo con un mayor número de sujetos para tener datos más
relevantes.
MENORES DE 30 MAYORES DE 30
Media D.E p Media D.E p
F-I CT 19.21 30.63 0.00012 18.49 31.75 0.05760
F-I TG 9.58 25.06 0.03332 24.81 56.97 0.14232
F-I HDL 3.89 13.70 0.32340 3.29 13.27 0.38964
F-I LDL 17.08 27.95 0.00016 12.53 28.88 0.14381
F-I GLU 6.84 14.34 0.01471 4.28 13.85 0.28724
47
Determinación de la concentración de citocinas
La cuantificación de las citocinas proinflamatorias (TNF-α, IFN-γ e IL-6) no
fue posible hacerla, los análisis de los ensayos de estandarización
sugirieron un deterioro en algunos estándares del kit, por lo que fue
necesario solicitar reposición de este. A continuación sólo se describen
los resultados de cuatro de seis ensayos realizados durante la
estandarización de la técnica, puesto que la casa comercial no entregó los
estándares a tiempo para presentar los resultados de la cuantificación en
este documento.
Se realizaron seis ensayos realizando, para cada uno, curvas de los
estándares de las tres citocinas. Todos los ensayos se realizaron con
cinco muestras del día cero y cinco muestras post- suplementación. La
realización de curvas con concentraciones conocidas (de 20 pg/ml a 5000
pg/ml) de cada citocina es necesaria en la extrapolación de la intensidad
media de fluorescencia de la muestra problema para la determinación de
su concentración. En la figura 8 se observan las curvas esperadas, según
la literatura, para las tres citocinas evaluadas.
Figura 8 a. Concentration (pg/ml) Figura 8 b. Concentration (pg/ml)
48
Figura 8 c. Concentration (pg/ml)
Figura 8 Curvas de los estándares de a:TNFα, T b: INFγ y c:IL6. En el eje x se
observan las concetraciones conocidas que van desde 20 hasta 5000pg/mL y en
el eje y la respectiva intensidad media de fluorescencia para cada concentración.
Figuras tomadas del manual de instrucción del kit CBA Human Th1/Th2
Cytokine Kit II de Becton y Dckinson.
En el proceso de estandarización se determinaron los parámetros de
linealidad y precisión inter ensayo, para esto se analizó el coeficiente de
correlación (C.C) para las curvas y el coeficiente de variación (C.V) para
cada uno de los puntos de las curvas y de las muestras. A continuación
se presentan los resultados de algunos de los ensayos:
Ensayo 1.
Figura 9 a. Figura 9 b.
49
Figura 9 c.
Figuras 9 a, b y c. Curvas de los estándares de IFN-γ, TNF-α e IL-6
respectivamente, con estándares recién reconstituidos.
No hay linealidad ni congruencia entre los puntos de las curvas. Puede
observarse que el C.C (observar en la curva como R^2) es bajo para IFNγ
(0.9233) comparado con el de las curvas de TNFα (0.9893) e IL-6
(0.9810).
La intensidad media de fluorescencia (IMF) es una medida que detecta el
citómetro de flujo y se relaciona con la concentración de las citocinas, a
mayor concentración, mayor IMF; esta varía de acuerdo al equipo y kit
utilizados pero da una idea aproximada de los valores que se podrían
esperar de acuerdo a la concentración de cada estándar. De acuerdo a lo
anterior, llama la atención que en este ensayo con estándares recién
restituidos la IMF fue inferior a la esperada según el fabricante: En el caso
de INF- γ a una concentración de 5000 pg/mL el valor en intensidad
media de fluorescencia (IMF) observado fue de aproximadamente 15
unidades frente a 550 reportado por la casa comercial. Para el TNF-α a
una concentración de 5000 pg/mL el valor obtenido fue de 800 IMF en
comparación al reportado por la casa comercial de 2000 IMF.
50
Para la curva de IL-6 a la misma concentración de las anteriores el valor
obtenido fue de 1500 IMF frente a un esperado de 3000 IMF.
Desde el primer ensayo el deterioro del INF-γ era notorio pero era
necesario confirmarlo con más ensayos para descartar errores aleatorios
o sistemáticos.
Ensayo 2.
Figura 10 a. Figura 10 b.
Figura 10 c.
51
Figura 10 Segundo ensayo de las curvas de los estándares de a: IFNγ, b: TNFα
y c: IL6
Los resultados muestran al igual que en el ensayo uno, una variación en
los coeficientes de correlación: El IFN-γ presenta, comparado con las
otras citocinas, el C.C más bajo 0.9792, frente a 0.9984 del TNF-α y de
0.9987 de la IL6. Adicionalmente, se presentó una baja IMF en cada uno
de los puntos de las concentraciones de las citocinas con respecto a la
IMF esperada, al relacionar la IMF problema frente a la IMF que se desea
obtener, de esta forma se realizó un control de calidad en cada una de las
citocinas evaluadas.
Ensayo 3
Figura 11 a. Figura 11 b.
52
Figura 11 c.
Figura 11 Tercer ensayo de las curvas para los estándares a: IFNγ, b: TNFα y c:
IL6.
A pesar de que la fluorescencia para el TNF-α y la IL6 en ninguno de los
experimentos, aun con estándares recién restituidos, alcanzó la esperada,
su C.C mostró linealidad (TNF-α 0.9992 y 0.9993 IL-6), esto en ninguno
de los ensayos se observó para IFNγ, por lo que se concluyó que la
concentración de este estándar estaba disminuida desde la compra del
reactivo, probablemente por el deterioro del mismo. Esto lo sustenta
también el control de calidad realizado para las concentraciones de cada
citocina determinado por el resultado de la IMF que presentaban cada uno
de los puntos de la curva.
Además del análisis del C.C y la IMF para cada una de las curvas, se
analizó el coeficiente de variación para cada una de estas, lo cual nos
indica la reproducibilidad de los experimentos (Ver tabla 9)
53
Tabla 9. Coeficiente de variación entre ensayos para la IMF de cada
uno de los puntos de la curva y C.C para cada citocina
Concentración (pg/mL) y C.C
20 40 80 156 312 625 1250 2500 5000 C.C
IFN-γ 93.9 144.9 158.5 166.1 96.7 87.7 67.5 53.2 42.5 2.6
TNF-α 71.9 74.2 24.5 13.6 10.1 8.0 8.1 6.4 5.6 0.5
IL-6 67.1 11.9 5.7 6.2 4.2 3.5 3.4 3.2 3.6 0.9
En la tabla anterior se observan valores muy altos de los coeficientes de
variación (CV), por ejemplo en todas las concentraciones de la curva para
IFN-γ hay valores por encima del 30%; el CV para las otras citocinas es
muy alto en los menores puntos de la curva pero se reduce a mayores
concentraciones, los bajos CV para los C.C de TNF-α e IL-6 muestran
mayor linealidad de las curvas entre ensayos para estas citocinas, distinto
a lo que ocurrió para IFN-γ.
En el análisis de la concentración de las muestras procesadas en cada
unos de los ensayos se obseva un notorio aumento de los CV, teniendo
en cuenta que estas muestras se realizaron por duplicado en cada ensayo
(tabla 10)
Tabla 10. Coeficiente de variación de la concetración en pg/mL para
IFN- γ,γ,γ,γ, TNF-α α α α e IL- 6 en todas las muestras procesadas
IFN- γ TNF-α IL- 6
MUESTRAS CV CV CV
DIA 0 DIA 28 DIA 0 DIA 28 DIA 0 DIA 28
1 199.3 140.1 155.0 141.4 111.1 171.5
3 103.3 116.8 115.7 77.4 95.5 117.1
5 200.0 68.7 a 200.0 131.0 141.1
7 59.0 125.5 134.0 138.6 200.0 200.0
9 200.0 164.8 200.0 200.0 200.0 155.7
a : El citómetro de flujo no detecto presencia de TNF-α en esta muestra.
54
El limite de detección para cada citocina es definida como la
correspondiente a 2 DE por encima de la intensidad media de
fluorescencia del estándar, de acuerdo a esto si la IMF de éste es inferior
a la esperada se subestimará la concentración de esa citocina en las
muestras (ver tabla 11), en nuestro caso esto es grave si se tiene en
cuenta que la concentración de citocinas proinflamatorias en las muestras
se espera sean bajas puesto que la población de sujetos ingresada fue
sana. En algunas de nuestras muestras en varios ensayos, la
concentración de IFN-γ y TNF-α dio por debajo del límite de detección.
Tabla 11 Limite de detección de cada citocina. Tabla tomada del
manual de instrucción del kit CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II de
Becton Dckinson.
Después de analizar los ensayos descritos se decidió suspender la
medición de las citocinas hasta que la casa comercial suministre unos
nuevos estándares.
55
8. DISCUSIÓN
Este estudio es derivado de otro más grande que pretende evaluar el
efecto de la vitamina A o retinol sobre distintos parámetros relacionados
con el metabolismo de lípidos y con la respuesta inmune. Para efectos de
este proyecto se decidió evaluar el efecto del suplemento sobre la
concentración de citocinas. Al momento del análisis de la información se
contaba con un número mayor de voluntarios del que se esperaba (n=38),
así que se decidió incluir este número total de sujetos ingresados y con
evaluación completa que se tenían hasta el momento.
El grupo de voluntarios fue expuesto a 50.000 UI de retinol por semana
durante un mes, estudios similares se han realizado en distintas
poblaciones para evaluar el efecto del retinol en enfermedades
infecciosas y en enfermedades crónicas (Morgan et al, 1999;
Sthephensen, 2001; Omer et al, 2000; Vargas et al, 2003). A pesar de que
aun no es posible dar información del efecto del suplemento sobre el nivel
de citocinas fue interesante hallar una diferencia estadísticamente
significativa (p<0.05) entre los niveles de colesterol total (p=0.000),
colesterol LDL (p=0.000) y triglicéridos (p=0.014) antes y después del
consumo del suplemento. La media de la diferencia para cada una de
estas variables fue positiva, lo que indica que al día 28 estos parámetros
estaban por encima de los hallados en el día cero. Un estudio similar a
este en donde se suplementó con 25 000 UI de palmitato de retinol a
pacientes con enfermedad cardiovascular halló un aumento de
triglicéridos (Cartmel et al, 2005).
Diferentes autores han descrito que tras una elevada dosis de vitamina A,
los niveles sanguíneos de colesterol total, HDL y triglicéridos no muestran
cambios significativos (Redlich et al, 1999; Goodman et al, 1996; Ringer
et al, 1991); sin embargo, otros estudios concluyeron que la
suplementación con vitamina A y con isómeros del AR como 13-cis ácido
56
retinoico disminuyen la concentración sanguínea de colesterol HDL y
aumentan los niveles de colesterol total y triglicéridos (Marsden, 1996;
Tangrea et al,1992), cabe resaltar que el HDL en nuestro estudio también
mostró una reducción posterior a la suplementación; no obstante no ha
sino bien investigada la relación del nivel lipídico tras una suplementación
crónica con retinol. Otro estudio sugiere que el uso generalizado de la
vitamina A justifica una investigación más a fondo en los efectos de su
uso a largo plazo, en enfermedades cardiovasculares y diabetes (Redlich
et al, 1999). Así, las diferencias en los resultados entre estudios puede
deberse al tipo de compuesto empleado, a la dosis administrada y al
tiempo de administración.
Las razones fisiológicas que explican el efecto sobre el colesterol y
triglicéridos con dosis elevadas de vitamina A se relacionan con la
actividad biológica del ácido retinoico sobre la expresión de genes
relacionados con el metabolismo de lípidos (Blaner et al, 1994).
Los valores de química sanguínea se afectan de forma importante por la
dieta, no obstante, cabe resaltar que todos los sujetos en el día cero
tenían valores de química sanguínea normales y el patrón dietario de
cada individuo antes de la primera muestra de sangre se esperaría que
fuese similar durante el mes de seguimiento, por lo que sería posible
excluir un efecto solamente dependiente de la dieta. Es necesario hacer
un análisis cuantitativo de los registros diarios de consumo para confirmar
si el suplemento fue el único responsable de ese efecto.
Los niveles de glucosa en sangre post-suplementación fueron
estadísticamente significativos (p<0.05), resultados similares han sido
publicados en estudios con ratas blancas jóvenes, en quienes la
suplementación con dosis altas de vitamina A genera un aumento en la
actividad enzimática de la glucosa-6-fosfatasa que esta implicada en el
aumento de la glucosa en sangre por la vía de la gluconeogénesis
57
(Corredor et al, 2007), Aunque los estudios son basados en
experimentación animal, estos hallazgos deben ser tomados en cuenta
como indicadores de la posible ocurrencia de efectos similares en los
humanos.
Existen diferentes métodos para la medición de citocinas, la citometría de
flujo fue la técnica de elección por ser más sensible (sensibilidad
fentomolar 10-15 M) (Robinson, 2005) que otras técnicas como la ELISA
(enzyme linked immunosorbent assay) (Abbas et al, 2002) y por la
posibilidad de evaluar en un ensayo varias citocinas simultáneamente.
Algunos estudios demuestran que la medición de niveles séricos o
plasmáticos de citocinas por ELISA es poco comparable entre diferentes
laboratorios, a pesar de que se aplica en cada caso el mismo principio de
reacción (Rodríguez et al, 2005), los reactivos empleados en la
determinación de citocinas no provienen en todos los países de la misma
fuente lo que dificulta la homogenización y correlación de los resultados
obtenidos por diversos investigadores al nivel mundial (Rodríguez et al,
2005).
La vitamina A es un potente modificador de la respuesta TH1 y TH2, la
mayoría de los estudios relacionan la deficiencia de esta vitamina en la
inducción de la respuesta TH1 la cual interfiere con el desarrollo de una
respuesta humoral de protección (Dawson et al, 2006). Por otro lado la
suplementación de retinol en lactantes y niños con deficiencia en esta
vitamina reduce la morbilidad o la mortalidad por sarampión, malaria y
ciertas formas de diarrea (Omer et al, 2000; Corredor et al, 2007). En
nuestro estudio se quiere analizar el efecto de la suplementación con
vitamina A sobre las citocinas proinflamatorias en sujetos sanos porque
varios estudios han mostrado el efecto de este nutriente sobre la
respuesta antiinflamatoria pero en condiciones de deficiencia y en
enfermedades infecciosas. Adicionalmente algunos estudios muestran
que dosis altas pero por debajo del limite superior recomendado y por
58
encima de este generan un respuesta inflamatoria no deseada en sujetos
enfermos (Redlich et al, 1999) por lo que quisiéramos estimar a cuanto
ascienden los niveles de citocinas proinflamatorias en sujetos sanos
después de la suplementación con cantidades muy superiores a la media
de los requerimientos pero por debajo del limite superior recomendado de
consumo.
Desafortunadamente debido al deterioro de los estándares empleados
para los ensayos y a la escasa reproducibilidad de estos no fue posible
presentar en este documento la concentración de citocinas y la discusión
de estos resultados.
59
9. CONCLUSIÒNES
Después de una suplementación de 50 000 UI de vitamina A en sujetos
voluntarios sanos, los niveles sanguíneos de colesterol total, colesterol
LDL, triglicéridos y glicemia aumentaron significativamente, a pesar de
que ninguno de estos sobrepaso el valor establecido por este estudio
como normal, vale la pena resaltar este efecto porque esto puede suponer
un riesgo patológico en personas con valores cercanos al umbral o
superiores a este.
Es necesario analizar un número mayor de sujetos para determinar si
efectivamente existe una variación significativa del nivel de HDL y
evidenciar un efecto significativo de la edad y el sexo sobre las variables
anteriormente descritas.
El empleo de los coeficientes de variación para analizar los coeficientes
de correlación y la intensidad media de fluoresecencia de los distintos
puntos de la curva durante el proceso de estandarización, es una
herramienta útil para verificar la reproducibilidad de los ensayos y la
confiabilidad en la determinación de la concentración de citocinas de las
muestras.
60
10. RECOMENDACIONES
1. Es necesario realizar un análisis cuantitativo de los diarios de
consumo de los voluntarios durante la época del estudio para
confirmar si el aumento en algunos parámetros de la química
sanguínea se debió sólo al suplemento.
2. El análisis del colesterol HDL antes y después debe realizarse con
un número mayor de sujetos para corroborar si en efecto no existe
una relación de significancia.
3. Aunque el análisis de la medición de las citocinas proinflamatorias
estuvo fuera del alcance de este documento, se dejan las puertas
abiertas a futuros investigadores interesados en el tema.
4. Solo se encuentra en espera la reposición del kit de citocinas para
continuar con el procesamiento de las muestras, cuyos resultados
hacen parte de un compromiso con Colciencias y con Vicerrectoría
Académica de la PUJA.
61
11. REFERENCIAS
Abbas A, Lichtman A. 2002. Inmunología celular y molecular. Quinta
Edición. Editorial Mc Graw Hill. Madrid. España. p. 243-273
Anónimo. Manual de Citometría de flujo. (2001: Madrid, España).
Fundamentos y aplicaciones [EN LINEA]. Hospital Universitario de
Getafe.(España).http://www.citometriadeflujo.com/HTML/principal.htm.
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Cartmel B, Dziura J, Cullen M, Vegso O, Goodman G, Redlich C.
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Chambon P. 1996. A decade of molecular biology of retinoic acid
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Dzhagalov I, Chambon P, Wen He Y. 2007. Regulation of CD8+ T
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67
ANEXO 1
68
ANEXO 2 HOJA N°1: INGRESO DEL PACIENTE AL ESTUDIO
Fecha (día/mes/año)
Iniciales Paciente*
Código Paciente (# paciente)
*Iniciales de los dos apellidos y del primer nombre
INFORMACION CONFIDENCIAL CODIGO:____________
Nombre completo del paciente
Dirección de la casa
Teléfono donde pueda ser ubicado
Ocupación
INGRESO AL ESTUDIO SI NO
Edad 18 – 60 años (_____años)
Trabaja o estudia en la PUJAV y puede venir a los controles (días 1 ,2, 3 y 4)
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Consumo de suplementos de vitamina A en la última semana
Consumo de sustancias que interfieran con la absorción (Olestra, Orlistat, aceite mineral, otros cual________________)
Ha fumado en la última semana
IMC >24.9 Kg/mt2. Peso________, estatura en mt2________. IMC_________
TA diastólica >90 mmHg, >140 mmHg la sistólica (mayores de 15 años) TA _______
Colesterol >240mg/dL _________
Triglicéridos plasmáticos >140mg/dL_______
HDL <35 mg/dL en hombres o <39 mg/dL en mujeres ________
LDL >160mg/dL_________
Glicemia en ayunas > 110mg________
hsPCR positiva valor: _______
Retinol en plasma < 20 µg/dL_______
Sufre de diabetes, falla renal, cardíaca o respiratoria, cirrosis hepática, VIH/SIDA, enfermedad neuropsiquiátrica.
Acepta participar en el estudio y firma el consentimiento informado (anexar hoja de consentimiento)
Cualquier respuesta en alguna de las áreas sombreadas excluye al paciente de participar en el estudio. Si esto ocurre, el paciente NO es elegible. Por consiguiente, agradezca al paciente la colaboración, suspenda la entrevista.
¿El paciente cumple con los criterios de inclusión para el estudio? SI NO
EN CASO AFIRMATIVO, PREGUNTE SI ACEPTA PARTICIPAR EN EL ESTUDIO Y FIRMA EL CONSENTIMIENTO INFORMADO (ANEXAR HOJA DE CONSENTIMIENTO). SI ACEPTA CONTINÚE CON LA ENTREVISTA DILIGENCIANDO LOS FORMATOS DE ANALISIS DE CONSUMO.
69
HOJA N°2: REGISTRO DEL PACIENTE
TOMA DE MUESTRAS
ADMINISTRACIÓN DEL SUPLEMENTO Y RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN DEL CONSUMO
Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Dosis (numero de tabletas)
Fecha (día/mes/año)
Hora (hora: minutos)
¿Recibió la dosis? (Si o No)
Razón para no recibir la dosis 1: no fue al control, 2: se retiró, 3: otra razón (cuál) _________________________________________
Se repitió la dosis? (Si/No) (hora)
Ha presentado alguna molestia por la ingesta del suplemento. 1. Si, 2. No.
Cuál _______________________________________________________________________________
Ha presentado alguna molestia en su estado de salud. 1. Si, 2. No
Cuál _______________________________
Cuántos diarios de consumo entrega_________.
Razón para no entregarlos completos____________________
SEGUIMIENTO
Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28
Fecha (día/mes/año)
Se administró suplemento?(Si/No)
Se recolecto información completa? Si/No
Se recolecto información parcial? Si/No
Se presentaron efectos adversos? Si/No
Síntoma 1
Síntoma 2
Presentó alguna enfermedad en este periodo? Si/No
Enfermedad 1
Enfermedad 2
Si el paciente presenta un evento adverso serio, informe inmediatamente (menos de 24 horas) a la
profesora Valentina Guzmán, teléfono -3208320 ext 4172.
Muestra N° tubos Día de Seguimiento Si/No Fecha (día/mes/año)
N° tubos y distribución/ N° células
Tubo seco Día ingreso
Química:
Citocinas:
Retinol:
Día 29 Química:
Citocinas:
Retinol:
Tubo con EDTA Día ingreso Células:
Día 29 Células:
70
ANEXO 3
ENCUESTA DE SALUD, NUTRICION Y ALIMENTACIÓN OBJETIVOS:
♦ Describir el consumo de vitamina A y los antecedentes de salud de los sujetos participantes en la investigación
♦ Cuantificar el consumo promedio de retinol
La presente encuesta consta de dos partes, la primera sobre salud y la segunda sobre frecuencia de consumo. PRIMERA PARTE: SALUD Este cuestionario consta de varias preguntas acerca de aspectos relacionados con la salud. Los datos que se suministren serán de carácter estrictamente confidencial. Fecha: Día ____ Mes ____ Año ____ Documento de Identidad ________________________________________________ Dirección: ________________________________________________________ ________________________________________________________ Teléfono: ________________________________________________________ E-mail ________________________________________________________ DATOS GENERALES 1. Lugar de nacimiento: Departamento______________ Ciudad_______________ 2. Fecha de nacimiento Día ____ Mes ____ Año ____ Coloque un X en el cuadro que corresponda a la respuesta ANTECEDENTES MEDICOS 3. Su estado de salud en las dos últimas semanas ha sido:
Excelente �1 Buena �2 Regular �3 Mala �4
Coloque una X en el cuadro que corresponda a la respuesta
4. Alguna vez un médico le ha diagnosticado:
SI NO a) Hipertensión arterial �1 �2 b) Infarto cardiaco �1 �2 c) Aumento de colesterol o triglicéridos �1 �2 d) Diabetes �1 �2 e) Cáncer �1 �2 f) Exceso de peso �1 �2 g) Bajo peso �1 �2 h) Hipotiroidismo o hipertiroidismo �1 �2 5. Le han formulado medicamento para el tratamiento de:
SI NO a) Hipertensión arterial �1 �2 b) Infarto cardiaco �1 �2 c) Aumento de colesterol o triglicéridos �1 �2 d) Diabetes �1 �2
71
e) Cáncer �1 �2 f) Exceso de peso �1 �2 g) Bajo peso �1 �2 h) Hipotiroidismo o hipertiroidismo �1 �2 6. Ha seguido una dieta para el tratamiento de
SI NO a) Hipertensión arterial �1 �2 b) Aumento de colesterol o triglicéridos �1 �2 c) Diabetes �1 �2 d) Exceso de peso �1 �2 e) Bajo peso �1 �2 f) Hipotiroidismo o hipertiroidismo �1 �2 7. A sus padres o abuelos les han diagnosticado:
SI NO NO SABE a) Hipertensión arterial �1 �2 �8 b) Infarto cardiaco �1 �2 �8 c) Aumento de colesterol o triglicéridos �1 �2 �8 d) Diabetes �1 �2 �8 e) Cáncer �1 �2 �8 f) Exceso de peso �1 �2 �8 g) Bajo peso �1 �2 �8 h) Hipotiroidismo o hipertiroidismo �1 �2 �8 ESTILO DE VIDA 8. Usted fuma?
Si �1 No �2
72
ANEXO 4 PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA,
FACULTAD DE CIENCIAS DEPTO NUTRICIÓN Y BIOQUÍMICA Fecha: _________
Yo, el firmante:
_________________________________________________ con
CC._________________, expedida en:________________________
Dirección de residencia:_____________________________
Teléfono:_________
He sido informado en detalle acerca del proyecto de investigación titulado EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON VITAMINA A SOBRE LAS CITOCINAS INDUCIDAS POR RETINOL EN ADULTOS SANOS. Este estudio será realizado por el grupo de investigación relación estructura función de biomoléculas en la fisiopatología de enfermedades no transmisibles, de la Pontificia Universidad Javeriana y he decidido colaborar con el y entiendo que la participación es voluntaria (sin ningún tipo de remuneración). Tengo conocimiento y acepto que se me extraerá en los días 0 y 29 de estudio, un volumen de 20 mL de muestra de sangre total la cual se almacenará para esta investigación y para eventuales investigaciones futuras en la misma línea de trabajo. Toda la información necesaria será documentada y guardada de manera confidencial. La información estará disponible solamente para el personal involucrado en la investigación. Esta cláusula se aplicará tanto a esta investigación como a los eventuales estudios futuros en los cuales se utilizaría la muestra almacenada. Entiendo que no se puede garantizar que mi participación en el estudio me beneficie, ni que recibiré dinero o ningún tipo de compensación. No tendré que pagar costos adicionales. Este consentimiento no otorga ningún derecho legal, ni libera a los investigadores, ni las instituciones de la obligación por negligencia o cualquier acto o conducta mal realizada con la muestra y la información por mi dada. Si tengo alguna duda o pregunta acerca del estudio o de mis derechos con respecto a la participación en el, puede llamar al teléfono anotado anteriormente. Firma del paciente o representante legal C.C. Firma del Testigo Firma del investigador C.C. C.C.
73
ANEXO 5
DIARIO DE CONSUMO NOMBRE: __________________________________ FECHA: ___________ A continuación se presenta un ejemplo de cómo debe reportar su alimentación diaria. Por favor recuerde que debe escribir todo alimento (líquido ó sólido) que consuma durante el día, especificando los ingredientes y cantidad de cada preparación Ejemplo: Hora Comida Preparación Ingredientes Cantidad 7: 30 am
Desayuno Huevos revueltos Pan con mermelada Café con leche sin azúcar Jugo de naranja
Huevos Tomate Cebolla Aceite Pan blanco de molde Mermelada de mora Leche entera Nescafé Jugo natural de naranjas
2 unidades medianas 1 cucharadita 1 cucharadita 2 cucharaditas 2 unidades 1cucharada colmada 1pocillo chocolatero 2 cucharaditas 1 vaso de 8 oz.
DIARIO DE CONSUMO
NOMBRE: ______________________________________ FECHA:
Hora Comida Preparación Ingredientes Cantidad