tor-henning iversen, plantebiosenteret (pbs),botanisk …folk.ntnu.no/bejo/kapittel19.pdf · d e...

Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 19. april 2001

Cell Motility - Microtubules and Intermediate Filaments - Kap. 19

➟➟ Tor-Henning Iversen,Tor-Henning Iversen,PlantebiosenteretPlantebiosenteret(PBS),Botanisk institutt,NTNU(PBS),Botanisk institutt,NTNU

➟➟ e-mail : Tor-e-mail : [email protected]@chembio.ntnu.no

➟➟ Tlf. 73 59 60 87Tlf. 73 59 60 87➟➟ PBS`s hjemmeside (hvor forelesningene erPBS`s hjemmeside (hvor forelesningene er

samlet) ;samlet) ;www.stud.ntnu.no/studorg/pbs


Emner som gjennomgåesInnledning

➟ Mikrotubuli :➟ Mikrotubuli struktur - tubulin

➟ Mikrotubuli - dynamikk og assosierte proteiner:➟ Mikrotubuli - organisering av oppbyggingen av mikrotubuli➟ Forbindelser som påvirker mikrotubuli-dynamikken

➟ Kinesin, dynein og intracellulær transport :➟ Mikrotubuli - et spor for vesikel- og organell-transport ?➟ Kinesin og dynein - mikrotubuli motor proteiner

➟ Cilier og flageller :➟ Struktur og bevegelse - mikrotubuli

Dynenin


Emner som gjennomgåes

➟ Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitoseMikrotubuli maskin og kromosom-separasjonKinetochore - kromosom-sentromerSpindelfunksjonKromosom-bevegelseAnafaseCytokinesePlantecellevegg

➟ Intermediære filamenter (IF)Struktur og funksjon av IFIF proteiner og organisering i filamenterIF som dynamiske polymereIF og kobling til andre cellestrukturerIF - membraner, cell junctions, sarcomerer og keratin


Innledning➟ Mikrofilamenter som er den minste typen av cytoskjellettfibre, er gjennomgått i

Kap. 18.

➟ Kap. 19 tar for seg Mikrotubuli og Intermediære filamenter (IF) som er viktigefor bevegelse og form hos cellen - begge er lange protein-polymere

➟ Lokalisert i cytosol - mellom kjerne og cellemembran

➟ I en overordnet sammenheng så er :

➟ Mikrotubuli - ansvarlig for cellebevegelse gjennompolymerisering/depolymerisering (cilier, flageller, transport av vesikler,kromosomforflytning, bevegelse av nervecelle-axoner)

➟ IF - kun strukturell funksjon


Mikrotubuli

Mikrotubuli struktur - tubulin➟ Mikrotubuli er en polymer av globulære tubulin-underenheter arrangert i et sylindrisk

rør

➟ Byggeblokker er α - og β - tubulin i en heterodimer (også en tredje form - γ-tubulindeltar under polymeriseringen ). GTP deltar ved irreversibel og reversibel binding på toseter til α - og β - tubulin. I β - tubulin-setet hydrolyseres GTP --> GDP. Dette er etutbyttbart sete hvor GDP kan erstattes av GTP. Den fysiske lokalisering er vist påFigure 19-2.

➟ Den tubulære form opprettholdes gjennom laterale og longitudinelle interaksjonermellom de tubulin-underenheter. Det longitudinelle protofilament er lateralt assosiertgjennom sylindre til et enkelt (singlet) rør - dvs. en mikrotubulus (Figure 19-2b).

➟ Hver mikrotubulus består vanligvis av 13 protofilamenter - kan også være dubletter(f.eks. i cilier) og tripletter (f.eks. i sentrioler) av rørene (Figure 19-3). Mikrotubuli harogså en (+) og (-) ende.

➟ Mikrotubuli kan være både lang- og kortlivet. De siste (ustabile ) deltar i mitosen - delanglivete finnes i ikke-replikerende celler mens f.eks. neuroner (axoner) har en indrekjerne av stabile mikrotubuli av fundamental betydning(Figure 19-4b).


Mikrotubuli (forts.)

➟ Mikrotubuli - organisering av oppbyggingen av mikrotubuli➟ I interfase vil cytosol struktureres av et hjul med skjeker (spoke) -mønster hvor

skjekene går ut fra et sentral sete - en sentrosom (i dyreceller) eller generelt etmikrotubuli-organiserende senter (MTOC) som i dyr (men ikke planter og sopp) kaninneholde et par sentrioler (Figure 19-5b).

➟ Depolymerisering av mikrotubuli kan skje eksperimentelt ved endringer i temperatur(0o-37oC) eller ved bruk av f.eks. colcemid. Når dette fjernes deltar sentrosomen i enrepolymerisering av mikrotubuli (Figure 19-6).

➟ MTOC er ansvarlig for organisering og derved polariseringen av de cellulæremikrotubuli i ulike celler og cellefaser (Figure 19-7).

➟ I organiseringen (assembley) og polymeriseringen av av mikrotubuli underenheterdeltar også proteinet γ-tubulin (Figure 19-8).


Mikrotubuli - dynamikk og assosierte proteiner

Hvordan skjer assembley, disassembley og polarisering av mikrotubuli ?➟ Mikrotubuli samles ved polymerisering av α /β - tubulin-dimerene. Dette skjer primært

ved (+)-enden. Etter samlingen er mikrotubuli-stabiliteten temperatur- ogkonsentrasjons- avhengig (Figure 19-9). Den kritiske konsentrasjonen (Cc) er hvordimere α /β - tubulin er i likevekt med mikrotubuli.

➟ Mikrotubuli samlingen omfatter tre trinn : 1. Dannelse av protofilamenter fra α /β -underenheter, 2. Assosisering av protofilamentene til å danne vegg i mikrotubuli og 3.Forlengelse av protofilamentene ved påføring av nye underenheter (Figure 19-11).

Forbindelser som påvirker mikrotubuli-dynamikken➟ Dynamisk ustabilitet er en fremtredende egenskap ved mikrotubuli (se Figure 19-13) -

påvist både in vitro og in vivo. Vekst og reduksjon i lengde av mikrotubuli kan følgespå video.

➟ Over og under den kritiske konsentrasjonen (Cc) gir resp. vekst og reduksjon av dentotale masse av mikrotubuli.

➟ Lokalisering av GTP ellerGDP på det utbyttbare setet på β - tubulin ved (+) endenpåvirker også stabiliteten til mikrotubuli (Figure 19-15).

➟ Drugs som påvirker stabiliteten av mikrotubuli er colchicine, taxol og vinblastine - alleisolert fra planter. Bruk av colchicine - og colcemid - blokkerer metafase. Taxolpåvirker forlengelse/avkorting og vinblastine blokkerer ved å danne vinblastineparakrystaller.


Mikrotubuli - dynamikk og assosierte proteiner (forts.)

Mikrotubuli -assosierte proteiner (MAP)➟ Mikrotubuli-assosierte proteiner er blitt isolert sammen med tubuliner.

➟ D e såkalte assembley-MAPs som er ansvarlig for kryss-binding av mikrotubuli icytosol, er organisert i to domains. De ulike grupper av MAPs er presentert i Table 19-1. For detaljer i funksjon og struktur av disse vises til tabellen og teksten i boken.

➟ Når MAP dekker den ytre veggen av et mikrotubulus er tubulin-underenhetene ikkeistand til å til å dissosiere fra endene av mikrotubuli dvs. MAP hindrer cytosoliskemikrotubuli fra å depolymerisere.

➟ Lengden av mikrotubuli kontrolleres ved modulering av bindingen av MAP. Sentralt idette er fosforylering av MAP.

➟ To enzymer - MAP-kinase som er viktig i fosforyleringen av MAP - og cdc2 kinase,har stor betydning i celle signalisering og kontroll (Kap. 20) av cellesyklus (Kap. 13).


Kinesin, dynein og intracellulær transport

➟ Mikrotubuli - et spor for vesikel- og organell-transport ?

➟ Vesikler og proteiner transporteres inne i cellen langs mikrotubuli-spor

➟ Et meget konkret eksempel er den axonale transport . Hastighet og formen på dennetransporten kan bestemmes ved puls-radioaktivitetsforsøk (Figure 19-19). Den axonaletransport skjer i begge retninger ; anterograde transport fra cell-body til de synaptiskejunctions og retrograde transport mot cell-body.

➟ Også i melanoforer dvs. spesialiserte pigmentceller som amfibier og fisk bruker for åendre farge, skjer transporten av pigment-kornene langs mikrotubuli-spor.

➟ Mest alment kjent er transporten av Golgi-vesikler og det at ER-membraner bindes medbestemte proteiner til mikrotubuli og at membranene synes å forlenges langs slike spor.Begge systemer er tett koblet opp mot MTOC.



Kinesin og dynein - mikrotubuli motor proteiner➟ For å avklare de axonale mekanismer er det undersøkt i in vitro-forsøk hvilke

proteiner som kan fremme transporten av synaptiske vesikler langs mikrotubuli.➟ Ved eksperimentelt bruk av vesikler, nerve cytosol, AMPPNP (analog til ATP) og ATP

ble det påvist at kinesin er et motor-protein som transporterer vesikler, proteiner ogorganeller langs mikrotubuli.

➟ Strukturen av kinesin er vist i Figure 19-23 ; tre domains - to tunge kjeder (hode), et α-helix nakke-område og to lette kjeder ( hale) . Respektive oppgaver ; 1. Hode: ATP-hydrolyse + binding av mikrotubuli (ansvarlig for motor-aktiviteten) og 2. Hale :binding til vesikler (cargo).

➟ Kinesin ligner strukturelt Ras (guanin-nukleotid-bindingsprotein) og har også likhetermed myosin-motor-domain - viser felles opphav.

➟ Kinesin-motor transport er anterograde dvs. transporterer vesikler fra (-) til (+) endenpå et mikrotubuli (Figure 19-24).

➟ Kinesin tilhører en familie (12 medlemmer) av beslektede motor-proteiner men medbl.a. forskjell i hale-domain. Kinesin kan også deles i to funksjonelle grupper -cytosolisk- og spindel-kinesin - avhengig av cargo (se oversikt i Table 19-2).



Kinesin og dynein - mikrotubuli motor proteiner (forts.)➟ Dynein tilhører en annen gruppe av ekstra store motor-proteiner, men med

transportretning motsatt (retrograde) av kinesin - dvs.mot (-)enden av mikrotubuli.

➟ Dynein er delt i to funksjonelle klasser (Table 19-2); cytosolisk (vesikler ogkromosomer) og axonemal (cilia og flageller).

➟ Strukturelt ligner dynein kinesin pga de to hoder (Figure 19-25). Men -dynein kan ikkefremme transport uten hjelp av komplekser av mikrotubuli-bindingsproteiner (MBP).Best karakterisert er dynactin med 8 underenheter bl.a. dynamatin, actin-cappingprotein Arp 1 og Glued.

➟ I Figure 19-26 er vist en generell - men forenklet modell - for kinesin-(anterograde) ogdynein-(retrograde) fremmet transport i cellen.Retningen av vesikeltransporten er ogsåavhengig av orienteringen av mikrotubuli som er bundet av MTOC.


Cilier og flageller - struktur og bevegelse

Struktur og bevegelse - betydning av mikrotubuli➟ Bølgebevegelsen er karakteristisk for cilier og flageller - illustrert i Figure 19-27 med

sædcelle og Chlamydomonas.Merk at bøyningen presser på omgivende medium ogpresser cellen forover eller beveger væske langs et fiksert epitel. Merk ogsåforskjellen mellom de to faser ; effective og recovery stroke.

➟ Axonem er den sentrale samling av mikrotubuli i et ”9 + 2” mønster (Figure 19-28)avgrenset av en plasmamembran. Hver dublett mikrotubulus inneholder A og B -rørbundet sammen med proteinet tektin. Forøvrig finnes 13 og 10 protofilamenter meddynein-armer, nexinbinding, inner sheat og radielle skjeker (spoke) med hode på.

➟ Axonemet er festet til et basal-legeme (Figure 19-29) som hver består av ni triplett-mikrotubuli(Figure 19-3).

➟ Biokjemiske og genetiske studier av Chlamydomonas reinhardtii og mutanter av dennehar gitt mye kunnskap om flageller.

➟ Axonem- bevegelsen er en gliding av protein-filamenter relativt til hverandre. Herspiller dynein en sentral rolle.


Cilier og flageller - struktur og bevegelse

Betydning av dynenin➟ Mekanismene for dynein-fremmet gliding av de axonemale ytre dublett-mikrotubuli er vist i

Figure 19-31 og 19-32.➟ Sentrale elementer i bevegelsen er :

✳ Dynenin er flerhodete motor-proteiner✳ Kraften som kreves for aktiv gliding krever ATP✳ Cilier og flageller har en aktiv ATPase er forbundet med dynein-armene✳ Binding og hydrolyse av ATP medfører at dynein-armene suksessivt frigjøres fra og bindes til

nærliggende dublett✳ Glidingen (lineær) skjer relativt mellom dublett A og B subfiberen og mot (-)-basis av B

➟ Axonemalt dynein består strukturelt av basis og hode, basis er festet til A-delen og hodet tilB-delen, ATP hydrolyseres i A-delen, ATP bindes til hodet.

➟ Bøyningen i cilier og flageller dannes i områder hvor gliding og motstand mot glidingforekommer. Kontrollen av bøyningen har sin basis i respektiv bøyning i to halvdeler avdynenin-armen.

➟ De radielle skjeker (spokes), de to sentrale mikrotubuli og indre-arm dyneiner (Figure 19-28) spille en viktig rolle i flagell-bøyningen.

➟ Dynamikk, oppbygging og stabilitet i axenomale mikrotubuli er vist i fusjonsforsøk medChlamydomonas (Figure 19-33).


Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose

Mikrotubuli maskin og kromosom-separasjon➟ Regulering av cellesyklus - herunder mitose - ble gjennomgått i Kap. 13. De fire

hovedtrinn (profase, metafase, anafase og telofase) er vist i Figure 19-34.➟

➟ Det mitotiske apparatet - dannet av mikrotubuli - endres kontinuerlig under mitose medden primære oppgave å separere kromosomene.

➟ I metafase er det mitotiske apparatet en kort tid statisk og organisert i to deler ; 1. Enmitotisk spindel (bilateral, symmetrisk samling av mikrotubuli) og 2. Et par med asters(dannet av astrale mikrotubuli) (Figure 19-36).

➟ I hver halvdel av spindelen organiserer en sentrosom tre sett av mikrotubuli; 1. Astralemikrotubuli, 2. Kinetochore mikrotubuli og 3. Polare mikrotubuli. Spindelen utgjøresav kinetochore og polare mikrotubuli.

➟ Organiseringen i gjærceller avviker noe fra overnevnte. Planteceller mangler synligsentriole (Figure 19-5b).


Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose (forts)

Kinetochore - kromosom-sentromer➟ Søster-kromatidene i metafase-kromsomene transporteres til hver pol langs

kinetochore mikrotubuli. Kinetochoren (Figure 19-39) observeres først i sen profasemen før etableringen av det mitotiske apparatet.

➟ Kinetochoren ligger i sentromeren som er høyst spesialisert område av kromosomethvor søster-kromatidene ligger tettest. Lokaliseringen av ¨kinetochoren og dermedsentromeren er direkte kontrollert av en spesifikk sekvens av kromosomalt DNA kaltsentromerisk (CEN) DNA..

➟ CEN DNA er organisert i tre regioner kalt CDE I-III (Figure 19-41) eller sentromerDNA-elementer I, II og III. Den siste er viktigst for sentromer-funksjonen og samvirkermed en sentromer-bindingsfaktor (CBF3).

➟ Sentrosomen skal dupliseres i mitosen og beveges mot polen. Prosessen kalt sentriole-syklus (eller sentrosom-syklus) starter i G1-fasen (Figure 19-40).

➟ Høy omsetning av tubulin i mikrotubuli under mitosen viser betydningen avmikrotubuli-dynamikk i mitosen (Figure 19-41). Levetiden for mikrotubuli går ned fra10 min i interfase til 30 sek i mitotisk spindel dvs. raskere organisering/deorganisering.

Forelesninger i BI 316 - Cellebiologi III - 19. april 2001Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose (forts)

Kinetochore - kromosom-sentromer (forts.)Spindelfunksjon

➟ Kinsein-relaterte proteiner (KRP) eller spindel-kinesiner deltar i bevegelsen avsentrosomen og dermed i organiseringen av spindel og spindel-aster. I tillegg virkercytosolisk dynein i sentrosom-bevegelsen og spindel-orienteringen (Figure 19-42).

➟ KRP, dynein og NuMA kryssbinder (-)enden av spindel-mikrotubuli i dannelsen avspindel-polen koblet mot sentrosomen (Figure 19-43b).

➟ Hurtige fluktuasjoner i lengden av (+)enden av mikrotubuli, brukes for å fange oppkromsomene i kinetochoren under profase mens kjernemembranen brytes ned (Figure19-44).

Kromosom-bevegelse➟ Kromsomene bundet til kinetochor-mikrotubuli beveger seg ved ”hoppende”

(=saltatory) bevegelser på veien mot ekvator av spindelen. Før alle mikrotubuli erbundet til kinetochorer vil ikke anafase inntre.

➟ Det er tenkt alternative mekanismer for hvordan samlingen av kromsomene i ekvatorskjer. Dette omfatter bl.a. polymerisering og depoylymerisering av vil tubulin-underenheter, CENP-E og dynein (Figure 19-45)


Mikrotubuli - dynamikk og motorproteiner i mitose (forts)

Anafase➟ De samme krefter som virker ved dannelsen av spindelen i pro- og metafase, er også med å

trekke kromosomene mot de motsatte poler i anafase. Denne deles i tidlig (Anafase A) ogsen (Anafase B) anafase.

➟ Ved at mikrotubuli forkortes gjennom depolymerisering fra (+)enden i Anafase A vilkromosomene forflyttes mot (-)enden og derved mot polene (Figure 19-46).

➟ I Anafase B vil spindelen forlenges ved påleiring av tubulin til (+)enden av de polaremikrotubuli (Figure 19-47).

Cytokinese➟ Når kromosomene er kommet til polene, gjendannes kjernemembranen rundt

kromosomene og cellen deles (cytokinese - Figure 19-34).➟ Delingsplanet og delingsfuren bestemmes ikke av spindelen selv men av to asters

(Figure 19-48) som sender signaler som aktiverer actin og myosin med påfølgendedannelse av delingsfuren.

PlantecelleveggI planteceller dannes i cytokinesen en fragmoplast (--> celleplate) fra Golgi-vesikler. I

gjendannelsen av celleveggen deltar kortikulære mikrotubuli (cMT) - Figure 19-49.


Intermediære filamenter (IF)

Struktur og funksjon av IF➟ IF er det tredje settet av cytoskjellett-fibre i eukaryote celler (Figure 19-50 :

mikrofilamenter, mikrotubuli og IF)➟ IF`s primære funksjon er struktur-styrking av cellen og organisering til vev. I hår og

klover er IF-proteiner i sin mest ekstreme funksjon.➟ Forskjell fra mikrofilamenter og mikrotubuli ; IF deltar ikke i bevegelser, er ekstremt

stabile (tåler detergenter, salter, urea), mellom-størrelse, alfa-heliks som samles itaulignende filamenter, krever ikke GTP/ATP, bindes ikke til nukleotider.

➟ IF-proteiner er klassifisert i 6 typer (Table 19-3) av stor variasjon og MW ;* Sure og basiske keratiner (Type I og II) i ”harde” epitelceller (negler etc.) og cytokeratiner* Vimentin (leukocytter,fibroblaster m.fl.), desmin (muskelceller), glial-sure proteiner (GFAP;

filamenter i glial-celler omkring neuroner og ascocyter) og peripheriner (neuroner i perifertnervesystem) - Type III IF

* Neurofilamenter (NFs) i neuronale axoner - Type IV polypeptider. Ansvarlig for radiell vekst(diameter) av et axon dvs. bestemmer hastigheten av ledningsimpulsen.

* Laminer -Type V IF proteiner - i kjernen➟ Kunnskap om IF proteiner brukes i kreftdiagnostisering og behandling. Tumorceller

uttrykker de IF proteiner den opprinnelige normale cellen hadde og man kandiagnostisere celletypen på basis av spesifikke Mabs.


Intermediære filamenter (IF) - forts.

IF proteiner og organisering i filamenter➟ Felles domain-struktur : α-helix-kjerne flankert av globulære N- og C-terminale

domains (Figure 19-51, øverst) separert av 4 spacers (ikke-helixer).➟ To monomerer danner en parallel dimer med hode (NH-grupper) og hale (COOH-

gruppe) som videre danner antiparallele tetramerer som bindes sammen ende til endeog danner underenheten (protofilamentet) i IF.

➟ Protofilamenter parres sammen til protofibriller - fire av disse danner et enkelt IF.➟ Ulike IF proteiner kan danne både homopolymere og heterodimere filamenter.IF som dynamiske polymere➟ Man diskuterer fortsatt om tetrameren er grunnenheten for organisering av IF.➟ Eksperimenter med bl.a. biotin-merket Type 1 keratin i tidstudier (Figure 19-53) og

FRAP-teknikk (Figure 5-36) har vist at IF-proteiner kan erstatte IF-cytoskjelletet. IF-underenheter fra en løselig pool i cellen vil derfor påleires og avsnøres fra intakte IF.

➟ Det er viktig for cellen å ha et dynamisk system av IF - spesielt i mitotiske celler hvorbl.a. filamenter av vimentin, desmin og laminer nedbygges tidlig og reorganiseres ettercelledelingen.

➟ I dette dynamiske systemet deltar kinaser (cdc2-kinase) og fosfataser.



IF og kobling til andre cellestrukturer➟ IF-assosierte proteiner (IFAPs) kryssbinder IF til hverandre og danner en samling

(tonofilament) eller et nettverk som også er bundet til andre cellestrukturer.Kun noen fåIFAP er identifisert.

➟ En forutsetning for den fysiske bindingen mellom IF og mikrotubuli er tilstedeværelseav sammenbindende proteiner (IFAP) og mikrotubuli.

➟ Et slikt IFAP er påvist - kalt plectin. Dette kan også samvirke med andre cytoskjellett-proteiner (f.eks. spectrin), MAPs og lamin B.

➟ På Figure 19-54 demonstreres immuno-gullmerket MAbs til plectin som viser de tynneplectin-forbindelser mellom mikrotubuli og vimentin.

IF - membraner, cell junctions, sarcomerer og keratin➟ Et nettverk av IF danner en mekanisk støtte for cellulære membraner - f.eks. kjerne-

lamina.➟ Epitel-celler i organer i kroppen og i huden holdes sammen av IF i spesialiserte cell

junctions kalt desmosomer (celle-celle-tiltrekning) og hemidesmosomer (binding tilunderliggende membraner) - se Figure 19-56. Bindingene som IF her representerer ermed å gi mekanisk støtte til hele cellen.



IF - membraner, cell junctions, sarcomerer og keratin (forts.)➟ IF av Type III - desmin - omgir sarcomeren i muskelceller (Figure 19-57). Desmin

filamentene er kryssbundet til plasmamembranen av flere typer IFAP.

➟ I lengderetningen finnes også desmin-filamenter som holder sammen Z-skiver innen ogmellom myofibriller. Desmin deltar ikke i kontraktile bevegelsre i muskelen.

➟ I epidermis som bl.a. hindrer vanntap, er bunter av keratin kryssbundet av filaggrin (enIAFP) og forankret i endene til desmosomer.

➟ Alvorlige degenerative sykdommer i huden, muskler og neuroner forårsakes avnedbrytning av IF cytoskjellettet eller dets forbindelser til andre cellestrukturer.

tor-henning iversen, plantebiosenteret (pbs),botanisk …folk.ntnu.no/bejo/kapittel19.pdf · d e...

Documents