BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN

THẢO DƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN

THẢO DƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS. Phùng Thanh Hương

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa sinh

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự

giúp đỡ và hướng dẫn quý báu của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng

kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:

- Ban giám hiệu, các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình

dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa học này.

- Các thầy, cô trong bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

hoàn thành khóa luận.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phùng Thanh Hương –

người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều

kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên

và ủng hộ tôi trong suốt khóa học.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời

gian qua.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013

Tác giả

Nguyễn Thị Hải Yến

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ….…………………………………………………………………...1

Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành

nhận diện thảo dược……………………………………………………………..…..3

1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược………………………………...……3

1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược……...…….4

1.2.1. Phương pháp hình thái……………………………………………………...4

1.2.2. Phương pháp vi học…………………………………………………...……5

1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6

Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong

nhận diện thảo dược………………………………..………………………………..9

2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9

2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)………..………..….10

2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN

có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)…..…………………………………...13

2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)……...…14

2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18

2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)……………………..…20

2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)…………………….22

2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)…………..25

2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)…………………………...…27

2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)…………………………....31

2.1.10. Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS)

và multiplex-ARMS (MARMS)………………………………………………….33

2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN…………………..38

2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)………………………………………….………40

2.2.2. Vùng trnH – psbA…………………………………………………………42

2.2.3. Maturase K (matK)…………………………………...……………………43

2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44

2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược…………………45

2.3. Phương pháp ADN microarray…………………………………..………...…..47

2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………….....…47

2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen……………...……………..…49

Chương 3. Bàn luận…………………………………………………………..……51

3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng

công cụ sinh học phân tử…………………………………………………...….51

3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……………………….56

KẾT LUẬN…………………………………………………………………...……59

ĐỀ XUẤT……………………………………………...…………………………..59

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

Bảng Tên Trang

1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29

2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học

phân tử để nhận diện thảo dược

55

Hình

1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch

đại ngẫu nhiên – RAPD

11

2 Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia,

S. sophera, S. tora

12

3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP 16

4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS 18

5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1,

ITS5 và được cắt bằng enzym giới hạn EaeI

19

6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản

SSR

21

7 Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR 23

8 Dấu vân tay ISSR của R. palmatum, R. officinale và R.

tanguticum sử dụng mồi UBC-811

24

9 Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 26

10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu 27

từ marker RAPD)

11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax

notoginseng

28

12 Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP 32

13 Sơ đồ vùng ITS và vị trí các mồi được sử dụng 34

14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel

của năm loài thuộc chi Citrus

35

15 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự

gen matK giữa năm loài thuộc chi Panax

36

16 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự

gen 18S rADN giữa năm loài thuộc chi Panax

37

17 Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom 41

18 Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là

oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược

48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

A Adenine

ADN 2’- deoxyribonucleic acid Axít 2’- deoxyribonucleic

AFLP Amplified fragment length

polyphorphism

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài

các đoạn được khuếch đại

AP-PCR Arbitrarily primed- Polymerase

chain reaction

Kĩ thuật PCR với mồi tùy

chọn

ARMS Amplification refractory mutation

system

Kĩ thuật khuếch đại hệ thống

đột biến bền vững

AS-PCR Allele specific - Polymerase chain

reaction

Kĩ thuật khuếch đại đặc trưng

cho allel

ATP-P33 Adenosine triphosphate -

phosphorus 33

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

C Cytosine

CAPS Cleaved amplified polymorphism

sequence

Kĩ thuật sự đa hình các trình

tự khuếch đại được phân cắt

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

DAF DNA amplification fingerprinting Kĩ thuật vân tay khuếch đại

ADN

DALP Direct amplification of length

polymorphisms

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài

của các đoạn ADN có thể

khuếch đại trực tiếp

DAMD Directed amplification of

minisatellite - region DNA

Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp

vùng ADN tiểu vệ tinh

G Guanine

IR Infrared Vùng hồng ngoại

ISSR Inter-simple sequence repeat

polymorphism

Kĩ thuật sự đa hình trình tự

giữa các vùng lặp

ITS Internal trancribed spacer Vùng phiên mã nội

MARMS Multiplex amplification refractory

mutation system

matK Maturase K

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi

rADN DNA ribosome ADN ribosom

RAPD Random amplified polymorphic

DNA

Kĩ thuật sự đa hình các đoạn

ADN được khuếch đại ngẫu

nhiên

rbcL Ribulose-bisphosphat carboxylase

RFLP Restriction fragment length

polymorphism

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài

các đoạn giới hạn

RP-PCR Random primed - Polymerase chain

reaction

Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu

nhiên

SCAR Sequence characterized amplified Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc

regions trưng

SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid

SSCP Single strand conformation

polymorphism

Sự đa hình hình dạng sợi đơn

SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản

T Thymine

UV Ultraviolet Vùng tử ngoại

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng thảo dược để chữa bệnh. Trong vài

thập kỉ gần đây, mặc dù thuốc có nguồn gốc hóa dược được ưa chuộng do có nhiều

ưu điểm, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược vẫn có những đóng góp quan trọng trong

lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới

(WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe, đặc

biệt là ở các nước đang phát triển [44]. Xu hướng sử dụng các thuốc này hiện nay

ngày càng phát triển. Thị phần thảo dược của toàn thế giới đạt khoảng 60 tỉ đôla

mỗi năm và con số này không ngừng tăng lên với tỉ lệ tăng 6,4% / năm [53]. Tuy

nhiên, bên cạnh sự tăng lên về nhu cầu sử dụng thảo dược, một vấn đề nghiêm trọng

xuất hiện trên thị trường dược phẩm là sự nhầm lẫn, giả mạo các vị thuốc một cách

vô tình hoặc do cố ý. Việc sử dụng các thảo dược giả mạo có thể dẫn đến làm mất

tác dụng điều trị và gây những hậu quả không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí

là tử vong. Do đó, việc nhận diện chính xác cây thuốc, vị thuốc là một bước quan

trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Các thảo dược giả mạo có thể là các loài họ

hàng gần của cây thuốc hoặc các loài từ các họ khác. Do đó, việc nhận diện thảo

dược liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với

các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của

loài giả mạo.

Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo

dược. Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc

rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo

dược ở dạng đã sơ chế. Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của

phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo

dược ở dạng dịch chiết và khi phải tiến hành với số lượng lớn các mẫu. Các phương

pháp dựa vào thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược

và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết. Tuy nhiên, nhược

điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của

cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái

2

và bảo quản. Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân

tử ra đời đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học.

Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương

pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo

dược.

Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo

dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử

trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước. Do đó, đề tài này được thực

hiện với mục đích:

- Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận

diện thảo dược.

- Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật

sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược.

3

Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo

dược

1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược

Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài

dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng

thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Việc nhận diện thảo dược là một

yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng

tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới. Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng

nhầm lẫn các các thảo dược có tên hoặc kiểu hình tương tự nhau hoặc do người kinh

doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn. Tuy nhiên, dù là nguyên

nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác

dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong. Tại Mỹ, Trung

tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do

dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi. Trong Podiphyllum emodi

có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính. Hậu quả trên bệnh nhân này

là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41]. Ở Bỉ, trong

suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là

Aristolochia fangchi dùng thay thế cho Stephania tetrandra đã làm cho hơn 100 phụ

nữ bị suy thận [13]. Năm 2004, ở Hồng Kông có một báo cáo về độc tính do dùng

thảo dược mà nguyên nhân là do sự nhầm lẫn một thảo dược được kê trong đơn.

Bệnh nhân đã được kê Aristolochia mollissima thay vì Solanum lytatum. Trên thực

tế, hai loại thuốc này có nguồn gốc và tác dụng dược lý khác nhau, điểm chung duy

nhất là cùng có tên thông dụng là “Baimaoteng”. Sự nhầm lẫn này đã dẫn đến hậu

quả làm suy giảm chức năng thận và ung thư đường tiết niệu trên bệnh nhân [81].

Bên cạnh đó, năm 2004, ở Mỹ và các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, Tây Ban

Nha, các báo cáo về tình trạng ngộ độc ở trẻ em sau khi dùng một loại trà có nguồn

gốc từ Illicium verum không ngừng được tăng lên. Những trẻ bị ngộ độc thấy xuất

hiện tình trạng co giật, buồn nôn, bồn chồn, nhãn cầu chuyển động nhanh. Nguyên

4

nhân được xác định là do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium

verum khi sản xuất loại trà này [63]. Do những tác dụng không mong muốn nêu trên

nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết. Có

nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến

phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại. Phương

pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là

phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và phương pháp dựa vào công

cụ sinh học phân tử.

1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược

1.2.1. Phương pháp hình thái

Phương pháp hình thái là phương pháp dựa vào các đặc điểm hình thái tổng

quát để nhận diện cây thuốc và các bộ phận của nó. Phương pháp truyền thống yêu

cầu sử dụng hầu hết các giác quan (quan sát, sờ nắn, nếm, ngửi) để nhận biết một

dược liệu [81]. Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng trong nhận diện thảo

dược và cho đến nay vẫn đang được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.

Đối với một cây thuốc, các đặc điểm dùng để định danh bao gồm các đặc

điểm như: cây gỗ hay cây thảo, kích thước, hình dạng lá (ví dụ như mép lá có răng

cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng

chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay

bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng

hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ

chùm, thân rễ hay thân hành) [63].

Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là

dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81]. Ví dụ như để

nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử

dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu

không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với

5

nhiều vòng giống nhau và lớn dần, có các vết lõm, mùi thơm, vị đắng, cay, để lại

cảm giác tê nóng sau đó thì hơi ngọt [69]. Bên cạnh cách thức mô tả như trong

Dược điển, còn có nhiều cách mô tả trong đời thường như thân rễ Polygonati như

đầu gà trống, rễ Codonopsis pilosulae như đầu sư tử, thân rễ Coptidis như cựa gà…

Đây là những cách mô tả rất sinh động giúp dễ dàng nhận diện được vị dược liệu

quan tâm [81].

Phương pháp nhận diện thảo dược dựa vào hình thái là phương pháp đơn

giản nhất, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào kinh

nghiệm của người nhận diện và khó phân biệt các cây thuốc có quan hệ họ hàng gần

như các cây cùng một chi hay họ có hình thái bên ngoài tương tự nhau [81]. Bên

cạnh đó, việc nhận biết thảo dược ở dạng bột bằng phương pháp hình thái là không

thể thực hiện được. Phương pháp vi học ra đời có thể giúp khắc phục được nhược

điểm này.

1.2.2. Phương pháp vi học

Phương pháp vi học liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu

cấu trúc đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào. Khi thảo dược ở dạng

chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi. Phương pháp vi học thích

hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã

bị cắt chẻ hoặc ở dạng bột. Nó cũng rất có ích trong việc nhận diện các loài có kiểu

hình tương tự nhau [81].

Một ví dụ sử dụng phương pháp vi học để nhận diện thảo dược là trường hợp

ở loài Illicium verum. Quả của Illicium verum có tác dụng trừ hàn, kích thích tiêu

hóa, giảm khó tiêu. Ở Mỹ và các nước phương Tây, loại thuốc này được sử dụng

dành cho trẻ em ở dạng trà gói để chữa đau bụng. Tuy nhiên, một số lượng lớn trẻ

sơ sinh sau khi sử dụng loại trà này xuất hiện triệu chứng thần kinh kích thích do

Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium verum. Illicium anisatum chứa

các sesquiterpenes có độc tính như anisatin, neoanisatin, và 2-oxyneoanisatin sẽ gây

6

ngộ độc cho người sử dụng. Hai loài này có thể phân biệt với nhau qua hình dạng,

màu sắc, vị, mùi, số lượng nang. Tuy nhiên, rất khó để phân biệt chúng khi ở dạng

bột. Phương pháp vi học đã được sử dụng để phân biệt hai loài này. Dưới ánh sáng

huỳnh quang, hai loài bộc lộ sự khác nhau về đặc điểm tế bào ở vỏ quả ngoài nang.

Nang của Illicium verum có các tế bào hình đa giác với lớp màng ngoài có vằn, kích

thước thay đổi chiều dài từ 250 – 300 µm và chiều rộng 100 µm, có màu nâu xanh

dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm. Trái lại, nang

của Illicium anisatum có thành mỏng hơn. Tế bào lớp ngoài của nang có chiều dài

từ 15 – 20 µm, có hình trứng hoặc hình thuôn và khác nhau đáng kể về kích thước,

chúng có màu xanh vàng nhẹ dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước

sóng 330 – 380 µm. Sự khác nhau này là đặc điểm rất quan trọng để nhận biết được

hai loài Illicium verum và Illicium anisatum [63].

Phương pháp vi học là phương pháp rất thông dụng để nhận diện thảo dược.

Nó có mặt trong Dược điển của nhiều nước như Dược điển Anh, Dược điển thảo

dược Mỹ, Dược điển Nhật Bản, Dược điển thảo dược Hàn Quốc… Phương pháp

này đơn giản, dễ thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái

là có thể xác định thảo dược đã được chế biến hoặc ở dạng bột. Tuy nhiên, nó cũng

có nhược điểm là không thể xác định chính xác các loài của một hỗn hợp có quá

nhiều thành phần, đồng thời nó không thể giúp phân biệt loài khi ở dạng dịch chiết

[81]. Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này.

1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học

Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về

thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó. Các phương pháp

phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện

di và phương pháp quang phổ [81].

Phương pháp sắc ký được sử dụng để thu được dấu vân tay sắc ký của một

thảo dược. Dấu vân tay sắc ký là sắc ký đồ của các hoạt chất và các thành phần hóa

7

học đặc trưng có trong dịch chiết của cây đó. Dựa vào dữ liệu của dấu vân tay sắc

ký thu được có thể xác định được cây thuốc ngay cả khi lượng mẫu là khác nhau

hoặc có thể xác định sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các mẫu khác nhau. Tuy

nhiên, dịch chiết của một cây thuốc chứa hàng trăm hoạt chất khác nhau. Một số

hoạt chất lại tồn tại với tỉ lệ khác nhau trong các mẫu của cùng một loại thảo dược.

Do vậy, điều quan trọng là cần phải chọn phương pháp sắc ký tin cậy để thể hiện

thành phần hoạt chất và các thành phần hóa học đặc trưng trong cây thuốc [52].

Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng trong nghiên cứu thảo

dược do có khả năng tách tốt [31]. Dấu vân tay đặc trưng của Flos carthami [16] và

Gingo biloba [71] đã được xây dựng để nhận diện hai loài này ở dạng thảo dược

thô đồng thời giúp phân biệt với loài giả mạo, thay thế.

Ngoài ra phương pháp sắc ký và điện di, phương pháp quang phổ cũng được

sử dụng trong nhận diện thảo dược. Nguyên tắc chung của các kĩ thuật là sử dụng

phương pháp thăm dò nghiên cứu quang phổ điển hình của toàn bộ các chất hóa học

được chiết xuất từ mẫu quan tâm. Các phương pháp thường dùng là phổ khối, phổ

cộng hưởng từ hạt nhân proton và phổ hồng ngoại (IR) [63].

Các kĩ thuật dựa trên phân tích thành phần hóa học của cây là những công cụ

rất hữu ích trong nhận diện thực vật. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của các kĩ

thuật này là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây, nhưng thành phần hóa học

của cây chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi môi trường sống, vào giai đoạn sinh trưởng và

phát triển. Đồng thời, nó còn phụ thuộc vào quá trình thu hái và điều kiện bảo quản

mẫu. Trong điều kiện bảo quản không tốt, mẫu có thể bị phân hủy làm biến đổi các

thành phần hóa học trong đó, dẫn đến việc nhận diện là không thể [26].

Với sự phát triển của sinh học phân tử và di truyền học thực vật trong những

năm gần đây, công cụ di truyền được xem như là một phương pháp đáng tin cậy

trong nhận diện nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ở cấp độ ADN. Phương pháp

này tỏ ra chính xác, thuận tiện, đặc hiệu và ổn định. Hơn nữa, một lượng nhỏ mẫu là

8

đủ cho nghiên cứu ADN. Trái ngược với các dấu vân tay hóa học chịu ảnh hưởng

nhiều bởi giai đoạn sinh trưởng, phát triển, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái,

làm khô và bảo quản, ADN là một đại phân tử tương đối bền vững, ít chịu ảnh

hưởng của các yếu tố bên ngoài, có thể thu được từ mẫu tươi, mẫu đã làm khô, thậm

chí là cả ở mẫu đã qua chế biến. Bên cạnh đó, các ADN không đặc trưng cho mô

nên có thể thăm dò ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào của cây [26]. Do đó, công cụ

sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược.

9

Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược

Trong sinh học phân tử, việc nhận diện thảo dược được thực hiện dựa vào

các marker di truyền (hay các marker ADN). Marker ADN có thể được hiểu là đoạn

ADN đặc trưng thể hiện sự khác biệt ở cấp độ bộ gen. Các marker này có thể thu

được nhờ sử dụng các phương pháp như phương pháp PCR, phương pháp giải trình

tự ADN và phương pháp ADN microarray [78].

2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)

Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR) là một kĩ thuật

cơ bản của sinh học phân tử. Đây là một phản ứng khuếch đại ADN ở bên ngoài cơ

thể sống. Trước đây, để giải quyết những trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần

có, các kĩ thuật tạo dòng in vitro thường được sử dụng để tạo số lượng lớn vật chất

di truyền. Tuy nhiên, kĩ thuật này đòi hỏi thao tác rất phức tạp và tốn rất nhiều thời

gian. Kĩ thuật PCR ra đời đã khắc phục những khuyết điểm của phương pháp hiện

có. Áp dụng kĩ thuật PCR cho phép làm tăng nhanh lượng vật chất di truyền trong

thời gian ngắn [2].

Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một phản ứng chuỗi, trong đó một phân tử

ADN được sử dụng để từ đó tạo ra hai bản sao, sau đó là bốn, tám…Sự nhân đôi

liên tục được thực hiện nhờ enzym ADN polymerase [33]. Tất cả các ADN

polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới đều cần sự hiện diện của

những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với

một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch

mới [2].

Trên cơ sở kĩ thuật PCR, bằng việc sử dụng các mồi khác nhau sẽ thu được

các marker ADN khác nhau. Các mồi sử dụng có thể là mồi ngẫu nhiên, không yêu

cầu thông tin trước về bộ gen hoặc các mồi đặc hiệu khuếch đại một vùng nhất định

trên bộ gen mà thông tin về bộ gen cần được biết trước [26]. Sau bước khuếch đại

10

nhờ PCR sử dụng các mồi đặc trưng cho từng kĩ thuật, các sản phẩm thu được sẽ

được điện di trên gel để thu được sản phẩm khuếch đại và đánh giá kích thước [78].

2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)

Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Random-primed PCR – RP-PCR) là kĩ

thuật mà trong đó phản ứng khuếch đại được xảy ra trong điều kiện nhiệt độ gắn

mồi thấp, sử dụng một hoặc hai mồi ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng PCR để tạo ra

các đoạn ADN đặc trưng. Các mồi này sẽ gắn vào các vị trí ngẫu nhiên trên ADN

khuôn để khuếch đại. Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt

của một băng điện di nhất định [78].

Trong kĩ thuật RP-PCR bao gồm: kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn (Arbitrarily

primed-PCR – AP-PCR), kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu

nhiên (random amplified polymorphic DNA – RAPD) và kĩ thuật vân tay khuếch

đại ADN (DNA amplification fingerprinting – DAF). Với các kĩ thuật khác nhau thì

mồi được sử dụng có chiều dài khác nhau. Kĩ thuật DAF có tính nghiêm ngặt thấp

nhất do sử dụng mồi có chiều dài 5 – 8 nucleotid, tiếp đó là RAPD sử dụng mồi có

chiều dài 10 nucleotid, AP-PCR sử dụng mồi có chiều dài khoảng 20 nucleotid [78].

Kĩ thuật DAF do sử dụng các mồi ngắn nên mô hình các băng thu được là rất phức

tạp [57]. Khi chiều dài của mồi tăng lên, số lượng vị trí gắn trên bộ gen mục tiêu

giảm đi do giảm cơ hội tìm thấy các vị trí mục tiêu tương đồng hoặc gần tương

đồng trên bộ gen [29].

Trong ba kĩ thuật trên, kĩ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi nhất do sự sẵn

có của mồi RAPD trên thị trường [55]. Mồi RAPD có chiều dài 10 nucleotid thường

chứa hàm lượng GC từ 50% đến 80% vì trong quá trình lai ADN, nếu hàm lượng

GC nhỏ hơn 50 % thì sẽ không chịu được nhiệt độ của quá trình tổng hợp chuỗi

[19].

11

Hình 1. Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại

ngẫu nhiên – RAPD [8]

Một trong các ứng dụng kĩ thuật RAPD trong nhận diện thảo dược là trường

hợp của Senna angustifolia. Mục đích của nghiên cứu là nhận diện Senna

angustifolia và phân biệt nó với các loài thân thuộc là S. acutifolia, S.tora và

S.sophera. Trong nghiên cứu này, 32 mồi RAPD được sử dụng để khuếch đại ADN

chiết từ các mẫu, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose và hiện màu bằng

ethidium bromid dưới ánh sáng UV. Trong 32 mồi được sử dụng có sáu mồi thu

được các băng đặc trưng cho loài. Dựa trên điện di đồ thu được thì thấy bốn loài

khác nhau và cho thấy sự đa hình cao (Hình 2). Do đó, kĩ thuật này thích hợp để

phân biệt các loài Senna có kiểu hình giống nhau được bán trên thị trường [37].

12

Hình 2. Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia, S. sophera,

S. tora [37]

Mồi OPC-3 (hàng: 1–8), mồi OPC-4 (hàng: 9–16). S. angustifolia (hàng: 1, 2, 9,

10), S. acutifolia (hàng: 3, 4, 11, 12), S. sophera (hàng: 5, 6, 13, 14), S. tora (hàng:

7, 8, 15, 16). Thang ADN 100 bp và 1 kb .

Qua nghiên cứu này, kĩ thuật RAPD bộc lộ ưu điểm là nhanh, dễ thực hiện.

Bên cạnh đó, lượng mẫu yêu cầu là rất nhỏ, tính bằng đơn vị nanogram (lượng

ADN cần là 30ng/µl), trong thử nghiệm không sử dụng bất kì chất phóng xạ nào

nên rất an toàn. Ngoài ra, kĩ thuật RAPD còn không yêu cầu bất kì thông tin nào của

bộ gen cần nghiên cứu.

Bên cạnh những ưu điểm trên, RAPD cũng cho thấy nhược điểm là độ lặp lại

(reproducibility) thấp. Phản ứng RAPD-PCR chịu ảnh hưởng rất nhiều về điều kiện

phản ứng, độ sạch của mẫu. Trong nghiên cứu với Senna angustifolia và các loài

thân thuộc, để khắc phục nhược điểm này, các tác giả chỉ xem xét các băng rõ ràng

và tin cậy. Cùng với đó, quá trình chuẩn hóa quy trình chiết ADN từ mẫu và lựa

13

chọn các thông số kĩ thuật thích hợp cho phản ứng cũng được thực hiện. Các ADN

thu trong nghiên cứu được làm sạch khỏi các chất chuyển hóa thứ cấp bằng phương

pháp CTAB cải tiến của Khan và cộng sự [37]. Áp dụng phương pháp chiết tách

này cho thấy ADN thu được có độ tinh sạch và chất lượng cao, tỉ lệ hấp thụ

A260/A280 là 1,8 – 2,0 [39]. Tiếp đó là quá trình chuẩn hóa điều kiện của phản

ứng. Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ MgCl2 khác nhau 0,5mM, 1mM,

1,5mM đồng thời giữ nguyên các thông số khác. Nồng độ MgCl2 1,5mM được xác

định là tối ưu nhất đã được sử dụng trong phản ứng khuếch đại. Ban đầu phản ứng

khuếch đại được thử với nồng độ enzym là 0,9 đơn vị Taq polymerase nhưng quá

trình thực hiện không cho kết quả tốt. Do đó, lượng enzym này được giảm xuống

0,5 đơn vị cho mỗi 25µl dung dịch phản ứng. Trong các thử nghiệm PCR, nhiệt độ

gắn mồi là 360C được xác định. Quá trình biến tính ADN là một quá trình nghiêm

ngặt trong PCR. Trong hầu hết các phản ứng khuếch đại, thời gian ủ để thực hiện

quá trình biến tính ADN là một phút ở nhiệt độ 940C. Cùng với đó, với mỗi mẫu

quá trình được làm ba lần để đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm [37].

Mặc dù tồn tại nhược điểm nêu trên, nhưng do có ưu điểm là nhanh và đơn

giản, kĩ thuật RAPD vẫn được ứng dụng rộng rãi để phân biệt các loài dùng làm

thuốc với loài giả mạo thuộc các chi như Echinacea, Typhonium, Dendrobium và

các sản phẩm từ nó, rễ của Astragalus, loài Dendrobium officinale, Tinospora

cordifolia, Piper nigrum, Mimosae tenuiflorae, Rahmannia glutinosa [37],

Glycirrhiza glabra [38], Cuscuta reflexa và Cuscuta chinensis [35], Ruta

graveolens [36] và Picrorhiza kurrooa và loài giả mạo [29].

2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực

tiếp (DALP)

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp

(Direct amplification of length polymorphisms – DALP) được sử dụng để thu được

dấu vân tay ADN của bộ gen và cho phép giải trình tự trực tiếp sản phẩm thu được

nếu cần. Hai mồi được sử dụng, trong đó một mồi xuôi bao gồm phần trung tâm là

14

mồi giải trình tự phổ biến M13 (universal M13 sequencing primer) và các trình tự

ngẫu nhiên. Một mồi ngược chỉ bao gồm mồi M13. Cặp mồi này giúp tạo ra mô

hình nhiều băng rất phức tạp. Các sản phẩm PCR được thăm dò trên gel

polyacrylamid biến tính. Do sự thiết kế đặc biệt của mồi, mỗi băng của các mô hình

khác nhau có thể được giải trình tự trực tiếp với mồi giải trình tự chung khi cần thiết

[58].

Một ví dụ sử dụng kĩ thuật DALP để nhận diện cây thuốc là ở loài Panax

ginseng. Sâm là một loại dược liệu quý nên sự giả mạo thường xuyên xảy ra. Rất

nhiều nghiên cứu với nhiều kĩ thuật khác nhau đã được khai thác nhằm phân biệt

các loài Panax. Ngoài RAPD, kĩ thuật DALP cũng đã được khai thác trong nhận

diện Panax ginseng và Panax quinquefolius. Trong nghiên cứu sử dụng DALP,

phản ứng khuếch đại được thực hiện với mồi xuôi là (5’-GTT TTC CCA GTC ACG

ACG C-3’) và mồi ngược là (5’-AAC AGC TAT GAC CAT GA-3’). Một trong hai

mồi được đánh dấu bằng ATP-P33. Kết quả thu được cho thấy một đoạn đặc hiệu

636 bp chỉ xuất hiện ở mẫu Panax ginseng nhưng không xuất hiện tại mẫu Panax

quinquefolius [25].

Như vậy sử dụng DALP có thể giúp phân biệt được hai loài sâm với nhau.

Cũng như các kĩ thuật RP-PCR, kĩ thuật này có ưu điểm là không yêu cầu bất kì

thông tin nào về bộ gen cần nghiên cứu. Hơn thế nữa, do sử dụng mồi dài hơn cũng

như mức độ chính xác yêu cầu cao hơn, kĩ thuật này cho thấy độ tin cậy cao hơn so

với các kĩ thuật RP-PCR.

2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (Amplified fragment

length polyphorphism – AFLP) là kĩ thuật liên quan đến sự khuếch đại toàn bộ các

đoạn ADN giới hạn từ ADN bộ gen sau khi đã được cắt nhờ các enzym giới hạn

[60].

AFLP là sự kết hợp giữa kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn giới hạn

(Restriction fragment length polymorphism – RFLP) và kĩ thuật PCR. RFLP là một

15

kĩ thuật dựa trên kĩ thuật lai phân tử. Trong RFLP, đoạn ADN được cắt bằng enzym

giới hạn sau đó điện di trên gel agarose. Các băng ADN đa hình được chuyển lên

màng lai và lai với mẫu dò được đánh dấu hóa học. Sự đa dạng được đánh giá bằng

sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng [26].

Trong kĩ thuật AFLP, ADN bộ gen sẽ được cắt nhờ các enzym giới hạn tại

nhiều vị trí giới hạn khác nhau ở nhiều locus để tạo ra các đoạn giới hạn có đầu

dính, các enzym cắt được sử dụng là sự kết hợp giữa một enzym cắt hiếm (rare

cutter) (EcoRI hoặc PstI) với một enzym cắt thường (frequent cutter) (MseI hoặc

TaqI). ADN cần phải tinh sạch khỏi các chất ức chế ảnh hưởng đến enzym giới hạn.

Sau đó, các đoạn giới hạn sẽ được gắn với các adaptor ở cuối đoạn tạo ra trình tự đã

biết cho phản ứng khuếch đại PCR tiếp theo. Sau khi thực hiện bước gắn adaptor,

phản ứng khuếch đại ban đầu được thực hiện sử dụng mồi có bổ sung thêm một

nucleotid chọn lọc. Kế đó, phản ứng khuếch đại chọn lọc được thực hiện với mồi bổ

sung thêm 3 nucleotid chọn lọc, một trong hai mồi được đánh dấu huỳnh quang

hoặc phóng xạ. Quá trình khuếch đại được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid biến tính với

thiết bị tự ghi phóng xạ, hiện màu bằng AgNO3 hoặc dùng máy giải trình tự tự động

[60].

16

Hình 3. Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP [60]

Kĩ thuật AFLP đã được nghiên cứu trong nhận diện các loài thuộc chi

Swertia. Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân biệt loài Swertia chirayita với các

loài cùng chi là Swertia angustifolia, Swertia bimaculata, Swertia ciliata, Swertia

cordata và Swertia alata thông qua các marker AFLP đặc trưng. Sau khi chiết tách

được ADN của các loài này, các đoạn ADN được cắt bằng enzym EcoRi và Tru9I,

quá trình gắn adaptor được thực hiện đồng thời trong một hỗn hợp phản ứng. Phản

ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Quá trình khuếch đại ban đầu được thực

hiện với mồi MseI gắn thêm nucleotid C ở đầu 3’ và mồi EcoRI gắn thêm nucleotid

A ở đầu 3’. Bước khuếch đại tiếp theo sử dụng mồi MseI 5’-[Primer-Cxx]-3’ và mồi

17

EcoRI 5’-[Primer-Axx]-3’, trong đó mồi EcoRI được đánh dấu huỳnh quang. Sản

phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamid. Kết quả thu được cho thấy trong 64

cặp mồi được sử dụng thì có 46 cặp tạo các băng ADN. Trong tổng số 5312 băng

thì có đến 5304 băng đa hình. Trong các băng này, 743 băng đặc trưng cho các loài

khác nhau được nghiên cứu. Các đoạn đặc trưng cho sáu loài nghiên cứu đã được

xây dựng dựa vào nghiên cứu này cho thấy AFLP hoàn toàn có thể sử dụng để nhận

biết Swertia chirayita và các loài họ hàng của nó [51].

Trong nghiên cứu trên có một số điểm đặc biệt. Thứ nhất là trong hỗn hợp

phản ứng cắt và gắn adaptor, ngoài các thành phần thông thường còn có sự có mặt

của albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin – BSA). BSA được cho vào

nhằm mục đích ngăn cản các thành phần lẫn trong ADN chưa tinh sạch gắn vào

enzym, có thể ngăn cản hoạt động của enzym [42]. Thứ hai là một trong hai mồi

dùng trong bước khuếch đại chọn lọc cần phải được đánh dấu để phục vụ cho bước

tiếp theo là thăm dò các đoạn AFLP trên gel polyacrylamid. Thứ ba là nhiệt độ gắn

mồi là 560C. Nhiệt độ này cao hơn so với kĩ thuật RAPD. Đây chính là ưu điểm của

phương pháp AFLP so với RAPD vì nhiệt độ phản ứng thấp sẽ làm giảm tính đặc

hiệu của phản ứng.

So sánh kĩ thuật AFLP và kĩ thuật RAPD cho thấy kĩ thuật AFLP đáng tin

cậy hơn và có tính lặp lại cao hơn. Đồng thời, số lượng băng ADN đa hình thu được

trong một loài với kĩ thuật AFLP lớn hơn so với kĩ thuật RAPD [45]. Tuy nhiên,

RAPD lại nhanh, đơn giản và quá trình thực hiện không trải qua nhiều bước phức

tạp như kĩ thuật AFLP. Một nhược điểm nữa của AFLP so với RAPD là phương

pháp này còn sử dụng gel polyacrylamid kết hợp hiện hình bằng muối bạc đồng thời

sử dụng phương pháp thăm dò bằng huỳnh quang do đó sẽ làm chi phí cao hơn và

tốn công sức hơn RAPD.

Kĩ thuật AFLP ngoài sử dụng để nhận diện Swertia chirayita còn được sử

dụng để nhận diện các loài thuộc chi Zingiber là Zingiber officinale, Z. montanum

và Z. zerumbet [22].

18

2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)

Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (Cleaved amplified

polymorphism sequence – CAPS), với tên gọi ban đầu PCR-RFLP, là sự kết hợp

của kĩ thuật PCR với kĩ thuật RFLP. Quá trình tạo marker CAPS được thực hiện

qua hai bước. Đầu tiên, một trình tự xác định được khuếch đại sử dụng mồi đặc

hiệu. Tiếp theo, sản phẩm thu được sẽ được cắt bằng enzym giới hạn, thường là

enzym nhận biết đặc hiệu bốn base. Các đoạn cắt ra sẽ được tách trên gel agarose

[26].

Cả hai kĩ thuật CAPS và AFLP có điểm giống nhau là dựa trên hai kĩ thuật

RFLP và PCR. Tuy nhiên, điểm khác nhau giữa CAPS và AFLP là thứ tự thực hiện

của hai kĩ thuật này. Trong kĩ thuật AFLP, bước cắt bằng bằng enzym giới hạn được

thực hiện trước, tiếp đó là bước khuếch đại PCR. Trái lại, trong kĩ thuật CAPS bước

khuếch đại lại được thực hiện trước, kế đó mới là bước cắt bằng enzym giới hạn.

Hình 4. Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS [6]

Một ví dụ sử dụng CAPS trong nhận diện cây thuốc là ở loài Paris

polyphylla var. yunnanensis. Trong nghiên cứu này, kĩ thuật CAPS đã được sử

dụng nhằm mục đích phân biệt loài P. polyphylla var. yunnanensis với các loài

19

thân thuộc có kiểu hình giống nhau và việc nhầm lẫn thường xuyên xảy ra. Mẫu

dùng để khuếch đại được lấy từ 12 loài bao gồm Paris polyphylla var. yunnanensis

và 11 loài thân thuộc là P. dunniana, P. daliensis, P. vietnamensis, P. mairei, P.

cronquistii, P. delavayi var. delavayi, P. thibeitca, P. fargessi, P. delavayi var.

petiolata, P. marmomata và P. axialis. Phản ứng khuếch đại được thực hiện sử

dụng hai mồi là ITS1 và ITS5 để khuếch đại toàn bộ vùng ITS. Các trình tự thu

được sau đó được đem so sánh và kết quả thu được cho thấy Paris polyphylla var.

yunnanensis có một vị trí đặc trưng (C/GGCCA) có thể cắt được bằng enzym giới

hạn EaeI tại vị trí 200. Nghiên cứu trên 11 loài còn lại không thấy có vị trí này.

Điều này cho thấy rằng vùng ITS của Paris polyphylla var. yunnanensis có thể được

cắt thành 2 đoạn trong khi ở các loài còn lại thì không. Sau khi được phân cắt nhờ

enzym giới hạn, hai đoạn thu được từ mẫu Paris polyphylla var. yunnanensis và các

mẫu cho kết quả âm tính được quan sát thấy trên bản điện di trên gel. Do có kích

thước khác nhau nên hai đoạn này có thể phân tách nhau trên gel agarose 1,5% điện

di. Như vậy, việc nhận diện Paris polyphylla var. yunnanensis bằng CAPS là có thể

thực hiện được [49].

Hình 5. Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS5 và

được cắt bằng enzym giới hạn EaeI [49]

1. Paris daliensis; 2. P. vietnamensis; 3. P. mairei; 4. P. cronquistii; 5. P.

delavayi var.delavayi; 6. P. thibeitca; 7. P. fargessi; 8. P. delavayi var. petiolata; 9.

P. marmomata;10. P. axialis; 11. P. dunniana; 12. P. polyphylla var.

yunnanensis; M: Thang ADN.

20

Nghiên cứu tương tự được thực hiện với Actinidia macrosperma là một dược

liệu nổi tiếng về tác dụng kháng ung thư cùng với các loài giả mạo với nó là A.

valvata và A. melanandra. Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên trình tự trnK,

là một trình tự ADN lục lạp. Do Actinidia macrosperma có mô hình điện di trên gel

đặc trưng sau khi cắt bằng enzym nên việc nhận diện nó cũng có thể được thực hiện

nhờ kĩ thuật CAPS [80].

Qua các nghiên cứu trên có thể thấy rằng khả năng của kĩ thuật này trong

thăm dò đa dạng ADN là không cao như phương pháp AFLP vì sự thăm dò bằng

CAPS yêu cầu cần có sự thay đổi nucleotid ảnh hưởng đến vị trí giới hạn thì mới có

thể thực hiện được. Nghiên cứu trên thực hiện được là vì có các sự thay đổi vị trí cắt

giới hạn cần thiết. Nếu không có những sự thay đổi này thì việc áp dụng CAPS

trong nhận diện là không thể thực hiện được. Cũng có thể thấy rằng trong các

nghiên cứu trên, việc lựa chọn vùng nghiên cứu của tác giả là hợp lý. Vùng ITS của

ADN ribosom và vùng trnK của ADN lục lạp là hai vùng mà sự đa hình thường

xuyên xảy ra. Sự lựa chọn vùng nghiên cứu hợp lý đã đóng góp vào thành công của

các nghiên cứu.

Ngoài nhận diện hai loài trên. CAPS còn được ứng dụng để nhận diện nhiều

loài khác thuộc các chi Alisma, Angelica, Sinopodophyllum và Dysosma, Ephedra,

Fritillaria, Artemisia, Panax, Atractylodes, Glehnia, Astragalus, Den-drobium,

Duboisia và Codonopsis [26].

2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)

Các ADN siêu vệ tinh là các trình tự ADN lặp lại song song, với các đơn vị

lặp lại dài 1 – 6 bp, phân bố trên khắp bộ gen [26]. Đặc điểm nổi bật của các siêu vệ

tinh là tính không vững bền. Tần số đột biến của các siêu vệ tinh cao, nằm trong

khoảng 10-2 đến 10-6 tại mỗi locus trong mỗi thế hệ do đột biến thêm vào hoặc mất

đi các đơn vị lặp lại, xuất hiện do trượt lỗi trong quá trình sao chép (ADN

replication slippage) và tái tổ hợp. Do đó, số lượng các đơn vị lặp lại tại mỗi vị trí

trong bộ gen là khác nhau giữa các loài [56]. Trái ngược với các trình tự siêu vệ

tinh, các đoạn ADN nằm cạnh chúng lại có sự bảo tồn cao giữa các cá thể trong

21

cùng một loài và đôi khi là giữa các loài khác nhau [59]. Sự khác nhau về số lượng

các đoạn lặp lại ở siêu vệ tinh và sự bảo tồn của các vị trí bên cạnh nó chính là cơ sở

để tạo ra các marker về sự đa dạng sử dụng trong sinh học phân tử.

Trong kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (Simple sequence repeats

analysis – SSR), các siêu vệ tinh được khuếch đại nhờ sử dụng mồi là trình tự ở

vùng bên cạnh các siêu vệ tinh này. Các mồi PCR được thiết kế đặc hiệu với một vị

trí trên bộ gen. Cặp mồi đặc hiệu có thể sử dụng được cho mỗi cá thể trong loài và

tạo ra nhiều sản phẩm với kích thước khác nhau ứng với mỗi chiều dài khác nhau

của các siêu vệ tinh [8].

Hình 6. Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR [6]

Nghiên cứu SSR đã được ứng dụng trong nhận diện các loài sâm. Trong

nghiên cứu SSR, Panax ginseng cho thấy mô hình điện di khác nhau so với Panax

22

quinquefolius. Hơn nữa, kĩ thuật này còn có thể giúp nhận diện giữa loài Panax

quinquefolius được trồng với loài này mọc ở trong tự nhiên [40].

Nhìn chung sử dụng SSR trong nhận diện cây thuốc đã đem lại một công cụ

hiệu quả, chính xác và có độ tin cậy cao trong nhận diện cây thuốc. Tuy nhiên, sử

dụng phương pháp này cũng tồn tại những nhược điểm là tốn kém và tốn công sức

khi phải nghiên cứu các đoạn thu được trên gel polyacrylamid, hiện màu bằng muối

bạc vì các đoạn ADN thu được có sự sai khác nhau rất ít về kích thước [28].

2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)

Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (inter-simple sequence repeat

polymorphism – ISSR) là một kĩ thuật sử dụng PCR để khuếch đại đoạn ADN nằm

giữa hai vùng siêu vệ tinh có trình tự giống nhau nhưng định hướng ngược chiều

nhau. Khoảng cách giữa hai vùng này phải nằm trong khoảng có thể khuếch đại

được. Mồi được sử dụng là các trình tự ADN có chiều dài từ 15 – 30 bp bổ sung với

2 siêu vệ tinh kế tiếp nhau, do đó giúp khuếch đại đoạn ADN ở giữa [60]. Thông

thường, các mồi sử dụng trong phản ứng khuếch đại này thường được gắn thêm một

mỏ neo là các nucleotid chọn lọc ở đầu 3’ hoặc 5’ để ngăn cản mồi gắn vào trình tự

nằm giữa hai siêu vệ tinh, từ đó, có thể làm giảm số băng ADN thu được khi mồi

gắn vào vùng siêu vệ tinh có đơn vị lặp lại chứa hai nucleotid [78]. Sản phẩm thu

được có thể được thăm dò bằng điện di trên gel agarose hoặc điện di trên gel

polyacrylamid [60].

Hai kĩ thuật SSR và ISSR đều liên quan đến siêu vệ tinh. Tuy nhiên, trình tự

mồi và đoạn ADN mục tiêu thu ở hai kĩ thuật là khác nhau. Kĩ thuật SSR dùng các

mồi bổ sung với trình tự bên cạnh các siêu vệ tinh để thu được các đoạn ADN mục

tiêu chính là các đoạn siêu vệ tinh. Trái lại, kĩ thuật ISSR sử dụng mồi là các trình

tự lặp lại, bổ sung với hai siêu vệ tinh, đoạn ADN mục tiêu nằm giữa hai siêu vệ

tinh đó. Hay nói cách khác, đoạn ADN mục tiêu trong kĩ thuật ISSR là đoạn nằm

ngoài đoạn siêu vệ tinh.

23

Hình 7. Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR [60]

Tái hiện quá trình khuếch đại với một mồi đơn (AG)8

(a) Mồi (AG)n không gắn mỏ neo có thể bắt cặp ở bất cứ vị trí nào trên vùng lặp

lại (TC)n của phân tử ADN khuôn dẫn đến việc tạo ra kết quả nhiễu trên băng

điện di ADN

(b) Mồi (AG)n gắn thêm 2 nucleotid (NN) tại đầu 3’ được bắt cặp với vùng đặc

hiệu trên phân tử ADN khuôn tạo dạng băng sạch trên điện di đồ.

(c) Mồi (AG)n được gắn thêm 2 nucleotid (NN) tại đầu 5’ bắt cặp với vùng đặc

trưng trên phân tử ADN khuôn tạo băng có kích thước lớn hơn.

24

Kĩ thuật ISSR đã được áp dụng để nhận diện các loài Rheum officinale,

Rheum palmatum và Rheum tanguticum. Các loài này có kiểu hình về cây cũng như

sản phẩm chế biến rất giống nhau, do đó việc nhầm lẫn thường xuyên xảy ra.

Nghiên cứu ISSR được thực hiện sử dụng 15 mồi chọn lọc và tạo ra 132 đoạn ADN

đa hình. Số lượng vị trí được thăm dò với mỗi mồi là từ 7 đến 14 vị trí và kích

thước sản phẩm thay đổi từ 200 – 1700bp. Điều này cho thấy các trình tự ADN nằm

giữa các vùng siêu vệ tinh rất mở rộng và có độ phân tán cao trong các bộ gen của

ba loài này. Trong 15 mồi này, 3 mồi tạo ra các băng có độ đa hình cao và đáng tin

cậy trong ba loài được lựa chọn để tạo ra các marker đặc hiệu trong nhận diện

chúng (Hình 8). Việc nhận diện ba loài này bằng phương pháp ISSR là hoàn toàn có

thể [72].

Hình 8. Dấu vân tay ISSR của R. palmatum, R. officinale và R. tanguticum sử

dụng mồi UBC-811 [72]

R. palmatum (hàng1 – 5), R. officinale (hàng 6 – 10) và R. tanguticum (hàng 11 –

15), M: thang ADN 2000 bp.

Trong nghiên cứu này, nhiệt độ gắn mồi dao động từ 51 – 560C tùy thuộc

vào mồi được sử dụng. Nhiệt độ gắn mồi là một yếu tố rất quan trọng trong phản

ứng khuếch đại. Nhiệt độ thấp sẽ dẫn đến những bắt cặp sai của mồi, trong khi đó,

nhiệt độ cao có thể tăng sự gắn đặc hiệu, nhưng lại giảm mức độ gắn giữa mồi và

mẫu. Nhược điểm của phương pháp ISSR là độ tin cậy thấp do kết quả phụ thuộc

vào nồng độ Mg2+ và nhiệt độ gắn mồi. Do đó, trong nghiên cứu này, các nhiệt độ

25

51, 52, 53 và 560C đã được thử nghiệm với tất cả các mồi để chọn ra nhiệt độ cho

kết quả tối ưu nhất. Một điều đáng lưu ý nữa là để việc nhận diện hiệu quả và kiểm

soát sự biến dị cá thể, chỉ các băng chọn lọc có mặt ở tất cả năm cá thể trong mỗi

loài mới được chọn lựa để nghiên cứu.

Nhìn chung, cũng như RAPD và AFLP, phương pháp này có ưu điểm là

không yêu cầu phải biết trước thông tin về bộ gen. So với RAPD, phương pháp này

cũng đơn giản và nhanh nhưng lại cho độ chính xác cao hơn RAPD. So với AFLP,

ISSR có ưu điểm là đơn giản hơn, dễ thực hiện hơn và không cần phải giải trình tự.

Do đó, sử dụng ISSR trong nhận diện thảo dược, đặc biệt là trong những mẫu nhiều

thành phần, thì chi phí sẽ thấp hơn so với sử dụng kĩ thuật AFLP.

Do những ưu điểm của nó, ISSR còn được dùng để nhận diện nhiều loài khác

như các loài thuộc chi Cistanche bao gồm Cistanche deserticola, C. tubulosa, C.

salsa và C. sinensis [62], các loài thuộc các chi Dendrobium, Fritillaria, Salvia,

Vitex, Cannabis, Rhodiola và Houttuynia [26].

2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)

Tiểu vệ tinh cũng là một loại ADN lặp lại song song có mặt trong bộ gen của

sinh vật nhân chuẩn. Chúng tương tự như siêu vệ tinh ngoại trừ các đơn vị lặp lại

dài hơn 10bp. Các tiểu vệ tinh cho thấy sự đa dạng chiều dài các allel. Kĩ thuật

khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (Directed amplification of minisatellite-

region DNA – DAMD) là kĩ thuật liên quan đến việc khuếch đại vùng giàu tiểu vệ

tinh với mức độ nghiêm ngặt khá cao nhờ sử dụng mồi đặc hiệu là trình tự trung

tâm của đoạn lặp lại song song [30], [78].

Kĩ thuật này được khai thác để nhận diện Panax ginseng và Panax

quinquefolius. Trong nghiên cứu với hai loài này, phản ứng khuếch đại được thực

hiện với mồi Pge2 là trình tự tiểu vệ tinh ở trung tâm dài 22 bp. Kết quả thu được

cho thấy bên cạnh các băng có mặt ở cả hai loài sâm thì có ba băng 990, 1490 và

1640 bp đặc trưng chỉ có mặt Panax quinquefolius nhưng không thấy ở Panax

26

ginseng. Nghiên cứu này cho thấy bằng việc sử dụng mồi tiểu vệ tinh Pge2 (Hình 9)

có thể giúp phân biệt P. ginseng và P. quinquefolius [24].

Hình 9. Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 [24]

Bên cạnh sử dụng để nhận biết hai loài sâm ở trên, kĩ thuật DAMD còn được

sử dụng nhằm mục đích nhận diện năm loài Salvia là Salvia tomentosa, Salvia

sclarea, Salvia virgata, Salvia fruticosa và Salvia dichroantha. Trong nghiên cứu

này, 22 mồi có trình tự giống vùng trung tâm tiểu vệ tinh được sử dụng để khuếch

đại các mẫu từ năm loài Salvia cùng với mẫu từ hai loài khác là Origanum

majorona và Sideritis pisidica. Điểm đặc biệt của phản ứng khuếch đại này là sử

dụng nhiệt độ gắn mồi cao ngay từ đầu là 600C, sau đó giảm dần nhiệt độ xuống

550C nhằm mục đích loại trừ việc thu được các sản phẩm khuếch đại không chính

xác. Sau bước giảm nhiệt độ, nhiệt độ gắn mồi được áp dụng ở 550C. Kết quả thu

được 70 marker đặc hiệu cho các loài có kích thước từ 186 – 2000 bp. Trong các

marker đặc hiệu thu được thì S. virgata có 20 marker đặc hiệu, S. tomentosa có 9

marker đặc hiệu, S. fruticosa có 13 marker đặc hiệu, S. dichroantha có 11 marker

đặc hiệu và S. sclarea có 17 marker đặc hiệu [30].

Kết quả trên cho thấy có thể sử dụng kĩ thuật DAMD để nhận diện các loài

Salvia khác nhau. So với RAPD, phương pháp này tỏ ra có độ tin cậy cao hơn do sử

dụng nhiệt độ gắn mồi cao làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng gắn mồi.

27

2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)

Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (Sequence characterized amplified

regions – SCAR) là một kĩ thuật mà trong đó các đoạn ADN đặc trưng cho một vị

trí xác định trên bộ gen được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc

hiệu [6]. Mồi SCAR là các đoạn oligonucleotid có chiều dài 15 – 30 bp được thiết

kế dựa vào các đoạn đa hình thu được sau các phản ứng RAPD-PCR [6], ISSR-PCR

[6] hoặc AFLP-PCR [45]. Để thu được mồi, các đoạn đa hình này được nhân dòng

và giải trình tự. Trình tự này được dùng để thiết kế mồi. Sự đa hình được đánh giá

bằng sự có mặt hay vắng mặt của đoạn SCAR trên băng điện di [6].

Hình 10. Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu từ

marker RAPD) [61]

28

Kĩ thuật AFLP-SCAR đã được áp dụng để phân biệt Panax notoginseng với

các loài khác trong chi Panax là Panax ginseng, Panax japonicus, Panax

quinquefolius. Đầu tiên, phản ứng khuếch đại AFLP-PCR được thực hiện với các

loài này. Một băng AFLP rõ ràng và đặc trưng cho Panax notoginseng được tạo ra.

Sau khi tách và giải trình tự đoạn AFLP này thu được một trình tự PNG8 dài 509bp.

Dựa trên trình tự PNG8, hai mồi đặc hiệu cho Panax notoginseng là PNG8-1 và

PNG8-2 đã được thiết kế, từ đó lần lượt cho các đoạn ADN dài 402 và 260 bp.

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng mô hình băng khuếch đại đặc

trưng của Panax notoginseng so với các loài Panax ginseng, Panax japonicus,

Panax quinquefolius. Từ đó, cho thấy việc nhận diện Panax notoginseng sử dụng

mồi SCAR đặc hiệu là hoàn toàn có thể [45].

Hình 11. Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax notoginseng [45]

Tổng chiều dài của đoạn ADN (PNG8) là 509 bp. Mồi được thiết kế cho phản ứng

PCR được gạch chân và đặt tên là PNG 8-1 (-----) và PNG 8-2 (–––)

29

Bảng 1. Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR [45]

Marker SCAR Trình tự (5’ đến 3’)

PNG 8-1 Xuôi: CTCCGACAAGGGTGGCTGGAA

Ngược: GCCACTTCCAACAATGATACCAT

PNG 8-2 Xuôi: CTTAGACCAAAGCCTCAGCA

Ngược: GAGGGTGGGAGGAGGTAAA

Sau bước khuếch đại sử dụng mồi SCAR đặc hiệu, sản phẩm thu được sau đó

được điện di trên gel agarose, hiện màu bằng ethidium bromid. Sự có mặt hoặc vắng

mặt của các băng thu được được so sánh với các mẫu của các loài khác. Trong quá

trình thực hiện phản ứng khuếch đại SCAR, việc tối ưu hóa các các điều kiện là cần

thiết để đảm bảo độ tin cậy của nghiên cứu. Hai nhiệt độ 580C và 620C lần lượt

được thử nghiệm. Nhiệt độ 620C cho thấy tối ưu hơn cho nhận diện P. notoginseng

với các loài khác do cho các băng rõ nét hơn. Do đó, điều kiện tối ưu được lựa chọn

là 5 phút 950C, 32 chu kì với 30 giây tại 950C, 30 giây tại 620C và 30 giây tại 720C

và cuối cùng là giai đoạn kéo dài trong 10 phút ở 720C. So sánh với marker AFLP,

marker SCAR ổn định hơn, rõ ràng hơn và đặc biệt là thuận tiện hơn trong thực

hành. Do đó, việc chuyển từ marker AFLP sang SCAR đem lại một phương pháp

hiệu quả hơn để nhận diện các loài thảo dược khác nhau.

Các mồi SCAR cũng có thể được xây dựng từ các đoạn RAPD đa dạng.

Trường hợp Phyllanthus amarus là ví dụ. Phyllanthus amarus là một loài cây được

sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền tại Thái Lan do có tác dụng lợi tiểu, chữa các

bệnh về gan và các bệnh truyền nhiễm do virus. Hai loài thân thuộc của Phyllanthus

amarus là Phyllanthus debilis và Phyllanthus urinaria với tác dụng khác và ít hiệu

quả hơn thường dễ bị nhầm lẫn với Phyllanthus amarus do có kiểu hình tương tự.

Đầu tiên, khuếch đại RAPD-PCR được thực hiện để thu được các marker RAPD

30

đặc trưng cho từng loài. Từ các marker RAPD đặc trưng, các mồi SCAR đã được

xây dựng. Các mồi này khuếch đại cho các đoạn SCAR 408, 501 và 319 bp lần lượt

đặc trưng cho từng loài Phyllanthus amarus, Phyllanthus debilis và Phyllanthus

urinaria. Nghiên cứu tính hiệu lực của mồi SCAR được thực hiện với mỗi loài với

các mồi SCAR riêng. Sau đó, mồi SCAR của một loài được được dùng để kiểm tra

một hỗn hợp ADN vẫn cho băng đặc hiệu của các loài đó cho thấy việc sử dụng kĩ

thuật SCAR trong nhận diện ba loài Phyllanthus này là rất hiệu quả [68].

Trong nghiên cứu trên, có thể thấy rằng chỉ cần dựa vào kết quả nghiên cứu

RAPD là đã có thể nhận diện và phân biệt ba loài Phyllanthus với nhau. Tuy nhiên,

kĩ thuật RAPD lại có nhược điểm là độ lặp lại thấp. Việc chuyển marker RAPD

thành SCAR, do sử dụng mồi dài hơn, đặc hiệu nên độ tin cậy của phản ứng PCR

được tăng lên đáng kể. Kĩ thuật SCAR ra đời giúp khắc phục nhược điểm của

RAPD, đem lại một phương pháp tin cậy để nhận diện thảo dược.

Bên cạnh các đoạn AFLP và RAPD, các mồi SCAR còn có thể được thiết kế

từ các đoạn ISSR đa dạng. Trường hợp Sinocalycanthus chinensis là một ví dụ.

Loài cây này vừa có tác dụng làm cảnh, vừa được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ

truyền. Tuy nhiên, S. chinensis, một số loài thuộc chi Chimonanthus và loài

Calycanthus floridus trên thị trường dễ bị nhầm lẫn do hạt của chúng có kiểu hình

tương tự nhau. Đầu tiên, kĩ thuật ISSR đã được áp dụng với S. chinensis và các loài

thuộc chi Chimonanthus và Calycanthus floridus. Kết quả thu được một băng ADN

đặc trưng 748 bp cho tất cả các mẫu Sinocalycanthus chinensis. Từ kết quả này cho

thấy, bản thân việc sử dụng kĩ thuật ISSR đã có thể nhận diện được loài

Sinocalycanthus chinensis. Tuy nhiên, do độ lặp lại của ISSR thấp nên phương pháp

SCAR đã được sử dụng để tăng độ tin cậy trong việc xác định các cây thuốc. Từ

đoạn 748bp đặc trưng thu được, mồi SCAR dài 25bp đã được thiết kế. Cùng với đó,

điều kiện nhiệt độ gắn mồi cũng được thử nghiệm từ 60 – 650C để lựa chọn ra nhiệt

độ tối ưu nhất là 650C. Với mồi dài hơn (25bp) và nhiệt độ gắn mồi cao (650C),

SCAR marker rất hiệu quả để nhận diện Sinocalycanthus chinensis [77].

31

Nhìn chung, quá trình tạo ra mồi SCAR là một quá trình phức tạp. Tuy

nhiên, khi đã có mồi SCAR đặc hiệu thì việc nhận diện thảo dược lại trở nên dễ

dàng. So với tất cả các kĩ thuật RAPD, AFLP và ISSR, SCAR tỏ ra là một kĩ thuật

ưu việt nhất, chính xác nhất. Do các ưu điểm của nó, ngoài các ví dụ nêu trên, kĩ

thuật này còn được sử dụng nhiều trong nhận diện các thảo dược khác như Bacopa

monnieri [74], Atractylodes lancea [64], Clematidis armandii và Clematidis

montana với các loài giả mạo với chúng [23] và đặc biệt kĩ thuật SCAR còn được

dùng để nhận biết hai loài giả mạo trong bột nghệ Curcuma longa là Curcuma

zedoaria và Curcuma malabarica. Việc có thể phát hiện một lượng nhỏ hai loài này

trong bột nghệ (10g/1kg bột nghệ) cho thấy hiệu lực cao của kĩ thuật SCAR [17].

2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)

Sự đa hình hình dạng sợi đơn (Single strand conformation polymorphism –

SSCP) là kĩ thuật dựa trên việc phân tích sự di chuyển của các trình tự ADN sợi đơn

sau khi biến tính trong quá trình điện di trên gel polyacryamid trung tính. Mục đích

của việc phân tích này nhằm thăm dò các đa dạng được tạo ra bởi sự gấp lại khác

nhau của các ADN sợi đơn do những khác biệt không dễ phát hiện trong trình tự

(thường là một cặp base duy nhất). Sự thay đổi một base làm thay đổi cấu trúc ba

chiều của các sợi ADN, dẫn đến sự di chuyển khác nhau giữa chúng [6].

Nghiên cứu SSCP tỏ ra là một công cụ mạnh trong nghiên cứu sự phức tạp

của các sản phẩm PCR. Hai sợi ADN bắt nguồn từ một sản phẩm PCR thường chạy

tách nhau trên các gel SSCP, do đó đem lại hai cơ hội để thăm dò được sự đa dạng

[6].

32

Hình 12. Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP [6]

Kĩ thuật SSCP đã được ứng dụng để nghiên cứu loài Astragalus

membranaceus trên thị trường Đài Loan. Astragalus membranaceus là một dược

liệu được sử dụng trong dược cổ truyền. Trên thị trường, dược liệu này thường bị

thay thế bằng Hedysarum polybotrys do Hedysarum polybotrys có giá rẻ hơn

Astragalus membranaceus. Kĩ thuật SSCP được thực hiện trên các sản phẩm PCR

từ vùng ITS1 của ADN ribosom để từ đó phân biệt hai loài này. Sau khi các đoạn

ITS1 được khuếch đại, chúng được điện di trên gel agarose 2% và được đánh giá là

dài khoảng 300bp. Do các sản phẩm đều có chiều dài xác định khoảng 300bp nên

việc phân biệt các sản phẩm trên gel không thực hiện được. Các sản phẩm này sau

đó được tách ra khỏi gel và được nghiên cứu nhờ SSCP. Kết quả cho thấy một mô

33

hình dấu vân tay khác biệt có thể giúp phân biệt Astragalus membranaceus với

Hedysarum polybotrys. Trong nghiên cứu này, SSCP đã đem lại thành công trong

việc phân biệt hai loài Astragalus membranaceus và Hedysarum polybotrys [15].

Nghiên cứu này thực hiện vào năm 1999, kĩ thuật SSCP trong nghiên cứu

được đánh giá là kĩ thuật triển vọng, hứa hẹn sẽ được ứng dụng nhiều trong tương

lai. Nhưng cho đến nay, việc ứng dụng SSCP trong nhận diện thảo dược vẫn chỉ

dừng lại ở nghiên cứu này. Nguyên nhân giới hạn khả năng ứng dụng của nó có thể

là do việc phát triển marker SSCP rất tốn công sức, tốn kém và không thể tự động

hóa được.

2.1.10. Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS) và multiplex-

ARMS (MARMS)

Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (Amplification refractory

mutation system – ARMS) (còn gọi là kĩ thuật khuếch đại đặc trưng cho allel AS-

PCR) là một công cụ hữu ích để thăm dò bất kì đột biến nào liên quan đến sự thay

đổi một nucleotid duy nhất (SNPs) [26]. Sự đa hình đơn nucleotid (SNPs) là sự

khác nhau về một nucleotid trong trình tự gen của các cá thể trong một quần thể.

Các SNP tạo thành các marker phân tử mở rộng nhất và phân bố rộng khắp trong bộ

gen. Sự xuất hiện và phân bố của chúng là khác nhau giữa các loài [6].

Trong kĩ thuật ARMS, phản ứng khuếch đại chỉ xảy ra khi mẫu có chứa các

allel mục tiêu và không khuếch đại các allel khác. Sau phản ứng, dựa vào sự có mặt

hay không của sản phẩm PCR để đánh giá sự có mặt hay vắng mặt của allel mục

tiêu. Cách đơn giản nhất là sử dụng điện di trên gel agarose và chất nhuộm màu

ethidium bromid [26].

Kĩ thuật ARMS đã được áp dụng trong nghiên cứu các loài Citrus. Trần bì là vị

thuốc quan trọng trong y học cổ truyền, được lấy từ vỏ quả của hai loài Citrus

reticulata và Citrus unshiu. Tuy nhiên trên thị trường nó thường bị giả mạo bằng vỏ

của Citrus japonica, C. maxima và C. trifoliata. Nghiên cứu ARMS đã được thực

hiện để nhận diện Citrus reticulata và Citrus unshiu đồng thời phân biệt chúng với

các loài giả mạo. Đầu tiên vùng ITS của các loài này được khuếch đại sử dụng mồi

34

ITSPF (5′-TACCGATTGAATGGTCCG-3′) và ITSPR (5′-

ATATGCTTAAACTCAGCG GGT-3′). Giải trình tự sản phẩm PCR và đem so

sánh vùng ITS của các loài cho thấy hai SNP đặc trưng cho hai loài C. reticulata và

C. unshiu tại vị trí số 99 và 551. Tại vị trí 190 có SNP đặc trưng cho C. unshiu. Tại

vị trí 99 và 51, nucleotid là T ở C. reticulata và C. unshiu nhưng là C ở các loài

Citrus khác. Từ đó, mồi đặc hiệu được thiết kế cho C. unshiu ở vị trí 190. Vị trí 99

T được sử dụng để thiết kế mồi chung cho hai loài C. reticulata và C. unshiu vì

không có SNP nào đặc trưng cho C. reticulata. Dựa vào các SNP này, hai mồi unsF

và retF lần lượt được thiết kế cho C. unshiu và C. reticulata. Mồi citR được thiết kế

là mồi ngược cho cả hai mồi unsF và retF [70]. Có một điểm đặc biệt trong quá

trình thiết kế mồi là mồi unsF có một nulceotid G được thay thế bằng C và ở mồi

retF nucleotid C được thay thế bằng T. Mục đích của sự thay thế này là nhằm tạo là

các bắt cặp sai nhân tạo để đạt được độ đặc hiệu cần thiết.

Hình 13. Sơ đồ vùng ITS và vị trí các mồi được sử dụng [70]

Tiếp đó, phản ứng khuếch đại được thực hiện ngoài ba mồi đặc hiệu unsF,

retF và citR còn sử dụng thêm mồi thông thường ITSPF làm chứng dương cho các

loài khác. Nhiệt độ gắn mồi được sử dụng là 620C. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu

cho băng ADN 717 bp với mồi ITSPF và citR. Tuy nhiên, chỉ C. reticulata và C.

unshiu thu được các băng ADN đặc trưng 483 bp. Đoạn ADN đặc trưng 395 bp

được khuếch đại nhờ mồi unsF và citR chỉ đạt được khi có C. unshiu (Hình 14)

[70].

35

Hình 14. Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel của năm

loài thuộc chi Citrus [70]

Hàng M: thang ADN 1 kb; hàng 1 – 3: C. reticulata; hàng 4 – 6: C. unshiu; hàng 7

– 9: C. maxima; hàng 10 – 12: C. japonica; hàng 12 – 15: C. trifoliata

Từ kết quả đạt được cho thấy C. reticulata và C. unshiu có thể dễ dàng phân

biệt với ba loài Citrus còn lại. Độ đặc hiệu allel mong muốn đã đạt được bằng cách

đưa vào một đột biến nhân tạo. Quá trình nhận diện nhanh chóng, đơn giản. Tuy

nhiên, việc nhận diện các loài cũng có giới hạn khi chỉ dừng lại ở hai loài C.

reticulata và C. unshiu. Việc nhận diện từng loài trong ba loài Citrus giả mạo là

không thể thực hiện được. Kĩ thuật MARMS – multiplex ARMS có thể khắc phục

được nhược điểm này của ARMS.

Một ví dụ của MARMS là trong nghiên cứu nhằm nhận diện các loài Panax

khác nhau. Trước MARMS, rất nhiều kĩ thuật khác như RAPD, AFLP và SCAR đã

được ứng dụng trong nhận diện các loài trong chi Panax. Tuy nhiên, nếu như các kĩ

thuật này chỉ chú trọng làm thế nào để phân biệt Panax ginseng với Panax

quinquefolius thì MARMS lại cho phép xác định đồng thời nhiều vị trí SNP khác

nhau và có thể nhận diện được 5 loài Panax khác nhau là Panax ginseng, Panax

japonicus, Panax quinquefolius, Panax notoginseng và Panax vietnamensis. Trong

nghiên cứu này, dựa vào việc so sánh các trình tự của vùng gen 18 rADN và gen

matK của lục lạp, các mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào các SNP. Phản ứng

khuếch đại sử dụng hai cặp mồi được thực hiện với tất cả các ADN từ các mẫu, sau

đó sản phẩm thu được được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Kết quả cho thấy

36

phản ứng khuếch đại với bộ mồi của Panax ginseng thu được hai đoạn 640 bp và

249 bp chỉ với mẫu Panax ginseng. Trái lại chỉ thu được đoạn 649 bp nếu chỉ có P.

japonica và P. quinquefolius và không có băng ADN nào nếu là P. notoginseng và

P. vietnamensis. Khi sử dụng bộ mồi của P. japonicus, hai đoạn 249 bp và 649 bp

thu được với P. japonicus, trái lại một hoặc không đoạn nào thu được với các loài

còn lại. Kết quả tương tự với các trường hợp sử dụng mồi đặc hiệu với P.

quinquefolius, P. vietnamensis, P. notoginseng [82].

Hình 15. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự gen

matK giữa năm loài thuộc chi Panax [82]

37

Hình 16. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự gen 18S

rADN giữa năm loài thuộc chi Panax [82]

Nghiên cứu trình tự 18S và matK thấy P. ginseng và P. japonicus có trình tự

gen matK giống nhau, P. quinquefolius và P. vietnamensis có trình tự 18S giống

nhau. Điều này cho thấy việc chỉ sử dụng ARMS ở vùng gen 18S hay matK thì

không thể phân biệt hoàn toàn năm loài này. Trái lại, khi sử dụng MAMRS thì việc

phân biệt rõ ràng năm loài Panax là hoàn toàn có thể. Hơn nữa, sử dụng cặp mồi

tương ứng với mỗi vùng gen 18S và matK với vị trí khác nhau, tiến hóa khác nhau,

kiểu di truyền khác nhau giúp cho phản ứng khuếch đại có tính đặc hiệu cao. Do đó,

MARMS tỏ ra là một kĩ thuật có độ tin cậy cao trong nhận biệt năm loài Panax này

[82].

Qua các nghiên cứu trên sử dụng kĩ thuật ARMS và MARMS có thể thấy

rằng ARMS là một kĩ thuật rất đơn giản, đáng tin, hiệu quả. So với các kĩ thuật

khác, kĩ thuật này có nhiều ưu điểm vượt trội. Trong hai thập kỉ qua, cùng với sự

phát triển không ngừng của sinh học phân tử, rất nhiều kĩ thuật đã được sử dụng để

nhận diện thảo dược. Các kĩ thuật có độ lặp lại thấp như RAPD và ISSR dễ bị ảnh

hưởng bởi sự thoái biến của ADN do đó không thích hợp cho nghiên cứu thảo dược

ở dạng đã chế biến. Kĩ thuật SSR giới hạn trong nghiên cứu thảo dược vì kích thước

38

giữa các allel sai khác nhau rất ít nên cần nghiên cứu bằng điện di trên gel

polyacrylamid, rất tốn thời gian và công sức. Kĩ thuật ARMS ra đời cho mang lại

một công cụ hữu ích, nhanh chóng và có độ tin cậy cao để nhận diện loài thảo dược

mong muốn. Ưu điểm lớn nhất của kĩ thuật này là bước khuếch đại và bước nhận

diện được kết hợp với nhau. Sự nhận diện sự có mặt hay vắng mặt của sản phẩm

PCR cũng đồng thời là nhận diện sự có mặt hay không của các allel mục tiêu. Cùng

với đó sự thăm dò kết quả chỉ cần nghiên cứu bằng điện di trên gel, không cần

nghiên cứu trình tự của sản phẩm PCR. Điều này cho thấy ARMS là một kĩ thuật

đơn giản, đáng tin cậy, hiệu quả, tiện lợi và có tính ứng dụng cao. Đây là một kĩ

thuật có triển vọng ứng dụng trong nhận diện thảo dược.

Nhìn chung, sự ra đời của các marker dựa trên PCR đã khắc phục được

những nhược điểm khi nhận diện thảo dược dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm vi

học hay các dấu vân tay hóa học. Phương pháp này ngoài mang ưu điểm chung của

các phương pháp dựa trên ADN thì còn có ưu điểm khác là sử dụng lượng mẫu nhỏ

và đa số là quá trình thực hiện rất đơn giản, dễ thao tác. Tuy nhiên phương pháp

marker dựa trên PCR cũng có nhược điểm là phản ứng khuếch đại chịu ảnh hưởng

của các yếu tố ức chế. Cùng với đó là vấn đề nhiễm nấm của dược liệu nếu bảo

quản không tốt sẽ cho các kết quả không chính xác nếu điều kiện phản ứng không

đủ nghiêm ngặt chính xác. Để khắc phục tất cả các nhược điểm trên thì việc chuẩn

hóa các điều kiện trong phản ứng khuếch đại là bước rất quan trọng để thu được

một kết quả tin cậy. Cùng với đó, mẫu ADN cũng cần đảm bảo độ tinh sạch cao. Sự

ra đời của các kĩ thuật dùng mồi đặc hiệu và có điều kiện nghiêm ngặt cao cũng đã

khắc phục được những nhược điểm của các kĩ thuật sử dụng mồi ngẫu nhiên và có

độ chính xác thấp.

2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN

Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự hay còn gọi là các mã

vạch ADN là các trình tự ADN ngắn từ một vùng nhất định của bộ gen được sử

dụng để xác định loài [47]. Để thu được các mã vạch ADN này, toàn bộ ADN bộ

gen được chiết tách. Tiếp sau đó là bước khuếch đại PCR và giải trình tự ADN tại

39

vùng mang mã vạch sử dụng mồi chọn lọc. Giải trình tự ADN là sự xác định vị trí

của các base nitơ – A (adenine), G (guanine), C (cytosine) và T (thymine) có mặt

trong đoạn ADN mục tiêu [8]. Có nhiều phương pháp khác nhau để giải trình ADN

như phương pháp enzym của Sanger, phương pháp hóa học của Maxam – Gilbert và

phương pháp pyrosequencing [18].

Số lượng các vùng ADN có thể giải trình tự tăng lên nhanh chóng cùng với

sự phát hiện ngày càng nhiều các gen có thể đóng vai trò là các marker phân tử.

Vùng gen ở nhân và lục lạp được ưu tiên sử dụng. Do lục lạp có kích thước nhỏ và

các gen mục tiêu thường chỉ có một bản sao duy nhất nên việc nghiên cứu được

thực hiện dễ dàng hơn [63]. Theo mã vạch của hệ thống dữ liệu sự sống (The

Barcode of Life Data Systems) thì có đến 1 100 000 mã vạch ADN được sử dụng

cho 95 000 loài [47]. Cách đây khoảng 10 năm, theo số liệu tại GenBank thì có tới

180 000 trình tự mã vạch ADN dùng cho các loại thực vật [47]. Để chuẩn hóa việc

sử dụng các mã vạch ADN trên toàn thế giới, các nhà khoa học đã cố gắng tìm ra

các vùng ADN thích hợp để tạo mã vạch cho tất cả các loài. Sau khi đánh giá kĩ

lưỡng và đưa vào áp dụng, tiêu chuẩn của một mã vạch thích hợp được đưa ra với

các đặc điểm sau: thứ nhất, mã vạch phải có tính phổ biến giữa các loài thực vật;

thứ hai cho chất lượng trình tự cao và thứ ba là có khả năng nhận diện cao, cho phép

phân biệt được hầu hết các loài [47]. Vùng cytochrom c oxidase (CO1) ở ti thể, có

kích thước khoảng 650 bp, là một mã vạch chuẩn được sử dụng cho động vật. Tuy

nhiên, vùng này lại có sự đa hình thấp và hiệu quả nhận diện thấp ở thực vật. Cùng

với đó là sự tiến hóa nhanh về cấu trúc ti thể thực vật. Do đó, nó không được sử

dụng để làm mã vạch ở thực vật [47]. Nghiên cứu các mã vạch khác thay thế cho

thấy vùng phiên mã nội ở ADN ribosom nhân (ITS) và vùng trnH – psbA ở lục lạp

có sự sai khác lớn về trình tự ADN và có sự đa dạng giữa các loài. Bên cạnh đó,

vùng mã hóa tiểu đơn vị lớn của gen ribulose-bisphosphat carboxylase (rbcL ) và

gen maturase K (matK) cũng là các mã vạch thích hợp do phổ biến và có khả năng

nhận diện cao [47]. Do đó, rbcL, matK cùng với ITS và trnH – psbA được coi là các

mã vạch chuẩn cho nhận diện thực vật.

40

Cùng với các marker thu được từ phương pháp PCR, các mã vạch thu được

từ phương pháp giải trình tự cũng được sử dụng trong nhận diện thảo dược. Các

dược liệu giả mạo có thể có nguồn gốc từ các loài họ hàng thân thuộc của loài chính

thức được sử dụng làm thuốc hoặc từ một loài thuộc một họ khác. Do đó, dữ liệu

mã vạch ADN bao gồm các trình tự có thể phân biệt tại các cấp độ phân loại khác

nhau là cần thiết. Trong cây thuốc, có bốn mã vạch chuẩn chiếm hơn 50% số trình

tự, trong đó, vùng ITS là vùng được sử dụng thường xuyên nhất với 28%, tiếp đó là

psbA – trnH với 9%, rbcL chiếm 8% và matK chiếm 8% [47].

Ngoài các mã vạch chuẩn, một số vùng gen khác cũng được sử dụng để nhận

diện thảo dược như vùng trnL – trnF ở lục lạp và vùng nối giữa hai gen 5S của

ADN ribosom nhân [47].

2.2.1. Vùng phiên mã nội (ITS)

Vùng phiên mã nội (Internal trancribed spacer - ITS) là một vùng thuộc gen

rADN nhân. Gen rADN được tổ chức dưới dạng các đoạn lặp song song. Mỗi đơn

vị lặp lại chứa một vùng phiên mã gồm bao gồm các gen 18S, 5.8S và 26S cùng với

hai vùng ITS1 và ITS2. Các gen 18S, 5.8S và 26S rADN có độ bảo thủ cao trong

khi đó vùng ITS1 và ITS2 lại cho thấy sự biến đổi lớn, khác biệt giữa các chi, loài,

thậm chí là giữa các quần thể thuộc cùng một loài [73].

Vùng phiên mã nội (ITS) bao gồm vùng ITS1, gen 5.8S rADN và vùng ITS2,

với kích thước thay đổi từ 400 đến hơn 1000 bp [47]. Vùng ITS với tốc độ tiến hóa

nhanh và rất khác nhau giữa các loài. Cùng với đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS

dễ dàng được thực hiện do vùng này có kích thước nhỏ và sự sẵn có của các mồi

chung (universal primers) được thiết kế từ các trình tự bảo thủ cao bên cạnh vùng

ITS. Do những đặc điểm trên, vùng ITS trở thành một marker phổ biến nhất trong

nghiên cứu thực vật [9].

41

Hình 17. Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom [10]

Vùng ITS là vùng được sử dụng thường xuyên trong tạo mã vạch giúp nhận

diện thảo dược. Ví dụ như vùng ITS đã cung cấp những thông tin quý giá giúp phân

biệt các loài Dendrobium sử dụng làm thuốc và các loài giả mạo. Các thuốc này có

nguồn gốc từ rễ của các loài D. loddigesii, D. firmbriatum, D. chrysanthum, hoặc D.

nobile. Tuy nhiên, trên thị trường lại có đến 27 loài Dendrobium khác cũng được sử

dụng để giả mạo làm thuốc. Vùng ITS đã được khuếch đại, giải trình tự và đánh giá

sự đa dạng ở 18 loài Dendrobium được sử dụng làm thuốc trên thị trường. Kết quả

cho thấy sự đa hình trình tự giữa các loài Dendrobium tại vùng ITS1 là 3,2 – 37,9 %

và tại vùng ITS2 là 5,0 – 26,6 %. Hơn nữa, sự đa hình trình tự giữa các mẫu trong

cùng một loài là rất thấp và thay đổi từ 0 – 3,0% ở ITS1 và 0 – 4,0% ở vùng ITS2.

Kết quả trên cho thấy sự đa hình trình tự ở giữa các loài lớn hơn nhiều so với sự đa

hình trình tự ở bên trong một loài và mỗi loài Dendrobium đều có trình tự đặc trưng

ở vùng ITS1 và ITS2 và các loài trên có thể dễ dàng được phân biệt ở cấp độ ADN

[73].

Bên cạnh nhận diện các loài Dendrobium, vùng ITS còn được khai thác trong

nhận diện rất nhiều thảo dược khác. Vùng ITS đã giúp nhận diện hai loài sâm

Panax ginseng và Panax quinquefolius thông qua giải trình tự vùng ITS nhờ

phương pháp pyrosequencing [46]. Các peak thu được ở hai loài này là khác nhau

cho phép nhận diện hai loài này.

Ngoài ra, vùng ITS còn được áp dụng nhằm phân biệt Ruta graveolens với

loài giả mạo là Euphorbia dracunculoides. Kết quả giải trình tự vùng ITS cho thấy

42

E. dracunculoides không thể hiện bất kì sự tương đồng nào với R. graveolens [7].

Vùng ITS đem lại nhiều thông tin và có khả năng nhận diện cao loài Hedyosti dùng

làm thuốc và các loài khác trong chi Rutaceae ở sáu vị trí được nghiên cứu [34].

Vùng ITS tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong việc phân biệt 14 loài thuộc chi Hydyotis bao

gồm cả thảo dược H. diffusa và loài giả mạo H. corymbose. Sự biến dị thấp ở trong

loài (<0,5%) và cao giữa các loài với nhau cho phép nhận diện các loài này [48].

Vùng ITS được áp dụng trong phân biệt H. diffusa với các thuốc giả mạo từ các cây

thuộc họ khác như Sagina japonica, Stellaria alsine và Arenaria serpyllifolia với

tổng cộng 103 vị trí đa hình [47].

Trong vùng ITS, vùng ITS2 có mức độ đa hình cao nên cũng được dùng làm

mã vạch trong nhận diện thảo dược. Ưu điểm của vùng này là có cấp độ đa hình cao

giữa các loài và thấp ở trong một loài nên có thể nhận diện các loài có mối quan hệ

họ hàng. Theo thống kê của Chen S., năm 2009, tỉ lệ thành công trong phân biệt

hơn 4800 loài cây từ 753 chi nhờ giải trình tự vùng ITS2 lên đến 92.7% [14].

Nghiên cứu trình tự ITS2 ở các loài thuộc họ Đậu (Fabaceae) cho thấy sự biến dị

giữa các mẫu cùng loài là 1,7% (từ 0 – 14,4%) và giữa các loài là 8,6% ( từ 0% -

68%). Trong nghiên cứu này, 22 loài ghi trong dược điển Trung Quốc cùng với 66

loài khác bao gồm các loài giả mạo với chúng đã được nhận diện thành công nhờ

các trình tự ITS2 [21].

2.2.2. Vùng trnH – psbA

Vùng trnH – psbA là một vùng không mã hóa nằm ở lục lạp. Vùng này có

kích thước khoảng 340 – 660 bp và nằm giữa gen mã hóa cho protein D1 của hệ

thống quang hóa II (photosystem II) và gen mã hóa cho ARN vận chuyển của

histidin [47]. Vùng trnH – psbA có các tiêu chuẩn cần có của một mã vạch ADN

như có chiều dài ngắn để dễ dàng khuếch đại và giải trình tự, có sự đa dạng cần

thiết để nhận diện và có vùng bảo thủ để phát triển mồi chung [32]. Vùng trnH –

psbA là một trong các trình tự biến đổi nhanh nhất trong lục lạp do tốc độ tiến hóa

nhanh. Hơn nữa, ở hai đầu của vùng này đều có vùng có tính bảo thủ cao nên có thể

43

dễ dàng khuếch đại sử dụng các mồi chung. Và một ưu điểm khác nữa là có trình tự

đủ ngắn để khuếch đại các mẫu ADN có thể đã thoái biến do quá trình xử lý và bảo

quản mẫu. Do các đặc điểm này nên vùng trnH – psbA là một vùng hữu ích trong

nhận diện các cây thuốc từ loài giả mạo với nó. Ví dụ như vùng trnH – psbA đã

được thành công trong nhận diện Illicium verum từ loài Illicium khác giả mạo cho

nó. Nghiên cứu giải trình tự vùng trnH – psbA với loài Illicium verum và loài

Illicium khác cho thấy tỉ lệ khuếch đại thành công tại vùng này là 100% và tỉ lệ

nhận diện thành công là 100% [50]. Hơn nữa, vùng trnH – psbA còn rất hiệu quả

trong phân biệt các loài Dendrobium khác nhau với sự biến dị giữa các loài là 0,3 –

2,3% và tỉ lệ biến dị trong phạm vi loài là 0 – 0,1% [76]. Hiệu quả của trnH – psbA

còn được chứng minh bằng sự nhận diện thành công thảo dược Paris polyphylla

var. chinensis và Paris polyphylla var. yunnanensis được sử dụng trong y học cổ

truyền với các loài giả mạo chế biến từ Valeriana jatamansi [75].

Mặc dù vùng trnH – psbA rất hữu ích trong nhận diện các loài thảo dược,

nhưng nó cũng không thể nhận diện Citrus chachiensis từ Citrus grandis và một vài

loài Citrus khác. Một nhược điểm của vùng trnH – psbA là không tạo ra các trình tự

ngược chiều rõ ràng. Cùng với đó, sự có mặt của cấu trúc polyA/T trong vùng này

làm giảm tỉ lệ giải trình tự thành công. Thêm nữa, sự chèn vào hoặc mất đi một

nucleotid ở vùng này thường xuyên xảy ra, do đó việc so sánh giữa các trình tự trnH

– psbA gặp nhiều khó khăn [47].

2.2.3. Maturase K (matK)

Vùng matK là một vùng mã hóa nằm tại lục lạp. MatK là một trong những

vùng tiến hóa nhanh nhất ở lục lạp cho thấy cấp độ cao trong nhận diện thực vật

[47]. Vùng matK đã được ứng dụng trong nghiên cứu họ Đậu. Từ 1079 loài thuộc

409 chi của họ này, giải trình tự matK giúp nhận diện thành công 80% ở cấp độ loài

và 96% ở cấp độ chi với tần số sai khác ở trong loài trung bình là 1,4% và giữa các

loài trung bình là 9,1%. MatK cho thấy có sự đa hình giữa các loài cao hơn đối với

các mẫu thuộc cùng một loài [20]. Do có cấp độ đa hình cao, matK còn có thể nhận

44

diện được các dược liệu từ các nguồn gốc khác nhau. Vùng matK có thể nhận diện

Fallopia multiflora từ các vùng địa lý khác nhau [47]. Hơn nữa, matK còn có thể

phân biệt được nguồn gốc của vị thuốc “Chuanxiong” ở Trung Quốc (Ligusticum

chuanxiong) và ở Nhật Bản (Cnidium officinale) [47].

Do phản ánh mức độ đa hình cao nên matK được đề nghị làm một mã vạch

chuẩn. Tuy nhiên, sử dụng matK gặp phải một vấn đề là thiếu mồi chung (universal

primer) do đó cần sử dụng nhiều mồi khác nhau để khuếch đại các mẫu từ các bậc

phân loại khác nhau. Kress và Erickson chỉ đạt được độ khuếch đại là 39,3% cho

96 loài thuộc 48 chi mặc dù sử dụng đến 10 cặp mồi [65]. Do đó, matK nên được

kết hợp với một mã vạch chuẩn khác. Sự kết hợp giữa matK và rbcL đã được đề

xuất bởi nhóm nghiên cứu thực vật CBOL nhằm tạo mã vạch trọng tâm trong nhận

diện thảo dược [12].

2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)

Vùng rbcL là một vùng gen mã hóa nằm ở lục lạp. Vùng này cho tỉ lệ khuếch

đại thành công và chất lượng trình tự cao [47]. Tuy nhiên, sự đa dạng ở vùng này lại

thấp. Trường hợp nghiên cứu trên các loài Epimedium là một ví dụ. Trên tổng số 10

loài Epimedium được nghiên cứu thì kết quả cho thấy các đặc điểm sai khác đặc

trưng tại vùng rbcL chỉ là 4/706. Trong khi đó, các đặc điểm sai khác được xác định

ở vùng ITS là 18/678 và vùng trnH – psbA là 35/533 [32]. Bên cạnh đó, trong

nghiên cứu của Kress WJ, rbcL cũng cho thấy sự đa dạng thấp nhất (0,83%) giữa 11

mã vạch khác cùng được nghiên cứu để phân biệt hai loài khác nhau trong họ Cà

(Solanaceae) là Atropa belladonna và Nicotiana tabacum [43]. Sự đa hình thấp của

vùng rbcL là một trở ngại lớn trong nhận diện các mẫu thu được từ các loài có quan

hệ gần gũi với nhau. Tuy nhiên, khi sử dụng vùng này kết hợp với các vùng khác sẽ

cho kết quả nhận diện cao hơn. Trong nghiên cứu ở các loài Dioscorea cho thấy,

nếu chỉ sử dụng một vùng riêng lẻ thì tỉ lệ nhận diện thành công của matK là

23,26%, của rbcL là 9,30%, của trnH – psbA là 11,63% nhưng khi có sự kết hợp

của hai vùng thì hiệu quả nhận diện tăng lên rõ rệt. Nếu kết hợp matK+rbcL thì tỉ lệ

45

nhận diện thành công tăng lên 46,51% còn nếu kết hợp rbcL+trnH- psbA thì tỉ lệ đạt

được là 37,21% [65]. Như vậy việc kết hợp giữa vùng rbcL với vùng trnH – psbA

hay matK sẽ cho hiệu quả nhận diện cao nhất giữa các loài và đem lại một công cụ

quan trọng để nhận diện thảo dược.

2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược

Bên cạnh các mã vạch chuẩn, có nhiều trình tự ADN khác cũng có thể được

sử dụng trong nhận diện thảo dược.

Các vùng atpF – atpH và psbK – psbI là hai vùng không mã hóa nằm ở lục

lạp, đã được đề xuất là các mã vạch để nhận diện thực vật. Hai marker này không

được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu hệ thống và nguồn gốc phát sinh loài nên có

rất ít dữ liệu về chúng. Trong nghiên cứu của nhóm CBOL, psbK – psbI cho hiệu

quả nhận diện cao nhưng có nhược điểm là không phổ biến và chất lượng trình tự

đạt được thấp. Trái lại, vùng atpF – atpH cho hiệu quả nhận diện tương tự nhưng

phổ biến hơn và chất lượng trình tự đạt được ở mức trung bình. Một vài nghiên cứu

đã được thực hiện với hai vùng này và cho thấy khả năng áp dụng trong nghiên cứu

hệ thực vật ở Hàn Quốc [27].

Vùng intron trnL và vùng trnL – trnF đã được sử dụng rất lâu để nghiên cứu

nguồn gốc phát sinh loài ở thực vật. Việc giải trình tự cả hai vùng này đều được

thực hiện dễ dàng. Một trong các ưu điểm khi sử dụng intron trnL là vùng ở giữa

intron có thể được sử dụng làm vị trí gắn mồi và vị trí này tiếp giáp ngay với một vị

trí có sự đa dạng cao [27]. Sử dụng intron trong nhận diện 40 mẫu bao gồm tám loài

Lonicera và một thứ (var) cho thấy tỉ lệ nhận diện thành công là 50% [66]. Vùng

trnL – trnF có chiều dài hợp lý, tỉ lệ khuếch đại thành công cao, tuy nhiên sự đa

dạng trong trình tự lại kém vùng trnH – psbA tới 3 lần [12]. Trong các nghiên cứu

trên cây thuốc, vùng trnL – trnF đã thành công trong nhận diện Cardiocrinum

giganteum với loài họ hàng thân thuộc là C. cordatum. Mức độ nhận diện của vùng

này chỉ ở mức vừa phải trong một số trường hợp. Trường hợp nhận diện vị thuốc

“Cangzu” có nguồn gốc từ Atractylodes chinensis và A. lancea với các loài

46

Atractylodes là một ví dụ. Nó có thể phân biệt A. chinensis với A. koreana và A.

macrocephala nhưng không thể phân biệt A. lanceae từ A. japonica [47].

Ngoài các vùng trên, vùng nối giữa hai gen 5S ở ADN ribosom nhân cũng là

một trong những vùng được sử dụng trong nhận diện thảo dược. Đây là một trong

những vùng thường xuyên được sử dụng (chiếm 5%) do có sự biến đổi lớn, đồng

thời hiệu quả nhận diện cao [47]. Vùng này đã được sử dụng trong nghiên cứu

Swertia mussotii và các loài Swertia giả mạo, cho thấy sự đa dạng giữa các loài thay

đổi từ 31% đến 65% [47]. Vùng nối giữa hai gen 5S cũng đã được sử dụng nhận

diện loài Epimedium có tác dụng chữa bệnh [47]. Mặc dù có sự đa dạng lớn và hiệu

quả nhận diện cao, nhưng sử dụng vùng này trong nhận diện thảo dược sẽ phải đối

mặt với một số vấn đề như có quá nhiều bản sao cùng với đó là sự biến đổi nhiều về

trình tự giữa các loài và trong một loài sẽ làm cho việc so sánh trở nên khó khăn.

Do đó, vùng nối giữa hai gen 5S không được sử dụng như là một mã vạch chuẩn

[47].

Tóm lại, bên cạnh các marker thu được bằng khuếch đại PCR, các marker

dựa trên phương pháp giải trình tự ADN cũng được sử dụng để nhận diện thảo

dược. Đây là một công cụ có độ chính xác cao, tin cậy và hiệu quả. Với một thảo

dược, có rất nhiều phương pháp được nghiên cứu với mục đích nhận diện. Ví dụ

như loài Ruta graveolens với loài giả mạo là Euphorbia dracunculoides trước đây

đã được phân biệt bằng RAPD thì nay cũng có thể phân biệt nhờ so sánh trình tự

vùng ITS. Các loài Panax đã được nhận diện bằng marker RAPD, AFLP, SCAR,

MARMS… thì nay lại có thể nhận biết nhờ giải trình tự vùng ITS. Các loài

Dendrobium, bên cạnh nhận diện bằng ARMS còn có thể nhận diện nhờ trnH –

psbA… Nhìn chung so với phương pháp marker dựa trên phản ứng khuếch đại PCR,

phương pháp dựa vào giải trình tự có ưu điểm hơn là cho phép nghiên cứu trên số

lượng lớn các mẫu, đồng thời lượng thông tin thu được cũng nhiều hơn. So với một

số phương pháp như RAPD, ISSR hay DALP thì kết quả thu được của phương pháp

dựa trên giải trình tự ADN là chính xác hơn. Tuy nhiên, sử dụng các marker dựa

47

trên giải trình cũng tồn tại nhược điểm là quá trình nghiên cứu khá phức tạp và đòi

hỏi những kiến thức trước về trình tự cần nghiên cứu để thiết kế mồi cho trình tự

này.

2.3. Phương pháp ADN micrroarray

Microarray là một phương pháp dựa trên sự lai phân tử [2]. Nguyên tắc của

lai phân tử là một quá trình trong đó hai sợi ADN ở dạng sợi đơn có trình tự

nucleotid bổ sung cho nhau sẽ bắt cặp với nhau tạo thành ADN mạch kép thông qua

cầu nối là các liên kết hydro [78]. Trong microarray, các mẫu dò được cố định trên

giá thể rắn còn các trình tự mục tiêu được đánh dấu phục vụ cho quá trình lai [2].

Trong phương pháp ADN microarray, hai kĩ thuật thường được sử dụng trong

nhận diện thảo dược là kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid và

kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen. Hai kĩ thuật này đều phụ thuộc vào

thông tin có sẵn về trình tự của loài nghiên cứu. Các trình tự trong bộ gen của các

loài được đem ra so sánh để từ đó xác định các trình tự đặc trưng cho một loài cụ

thể. Hàng trăm hoặc hàng nghìn trình tự đặc trưng được gắn lên một microarray duy

nhất để nhận diện thảo dược trong một hỗn hợp phức tạp nhiều thành phần [53].

2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid

Trong kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò oligonucleotid, các mẫu dò đặc

trưng cho loài có chiều dài từ 25 – 60 nucleotid được gắn lên một giá thể rắn. Mẫu

dò có thể có nguồn gốc từ vùng mã hóa hoặc vùng không mã hóa. Mỗi microarray

được gắn mẫu dò từ hàng trăm loài khác nhau. Các mẫu ADN được chiết tách từ

loài mục tiêu, với trình tự tương ứng với mẫu dò được khuếch đại, được đánh dấu

huỳnh quang và lai trên array oligonucleotid dưới điều kiện thực hiện chính xác,

nghiêm ngặt [53].

48

Hình 18. Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là oligonucleotid hoặc

gen để nhận diện thảo dược [53]

Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid đã thành công

trong nhận diện tám loài Panax khác nhau dựa vào gen 18S rADN. Quá trình

nghiên cứu đã thu được các tín hiệu đặc trưng tại mỗi điểm từ đó giúp xác định

được tám loài này. Trong quá trình nghiên cứu có một vài điểm chú ý là quá trình

lai được thử nghiệm ở 4 mức nhiệt độ là 55, 60, 65 và 680C với các đoạn ADN đặc

trưng của tám loài sâm này. Kết quả cho thấy mức độ nghiêm ngặt càng cao thì

phản ứng lai càng đặc hiệu. Nhiệt độ 680C được lựa chọn vì cho phép quan sát mô

hình các điểm huỳnh quang đặc trưng cho mỗi loài. Trong kĩ thuật microarray thì

việc phải có các mẫu dò chứng âm và chứng dương là cần thiết. Trong nghiên cứu

trên, các mẫu dò chứng âm và chứng dương đều được sử dụng nhằm kiểm soát sai

49

số, đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Mẫu dò chứng dương được sử dụng trong

nghiên cứu trên là mẫu dò có chiều dài 27 bp bổ sung với vị trí từ 227 – 253 theo

đầu từ 5’ – 3’ với trình tự gen 18 rADN, là vùng có sự khác biệt lớn giữa các loài và

có sự tương đồng cao ở trong một loài sâm. Các mẫu dò chứng dương được sắp xếp

theo sơ đồ nhất định trên mỗi array. Các mẫu dò chứng âm dài 25 bp với trình tự

nucleotid được lựa chọn ngẫu nhiên mà đã được xác nhận là không tương đồng với

trình tự mục tiêu [83].

Ngoài sử dụng để nhận diện các loài sâm, kĩ thuật này cho thấy hiệu quả

trong nhận diện nhiều loài thảo dược có độc tính cao như Aconitum carmichaeli, A.

kusnezoffi, Alocasia macrorrhiza, Croton tiglium, Datura inoxia, Datura metel,

Datura tatula, Dysosma pleiantha, Dysosma versipellis, Euphorbia kansui,

Hyoscyamus niger, Pinellia cordata, Pinellia pedatisecta, Pinellia ternata,

Rhododendron molle, Strychnox nux-vomica, Typhonium divaricatum, Typhonium

giganteum bằng sử dụng các mẫu dò là các oligonucleotid dựa vào trình tự của gen

5S rADN [11]. Cùng với đó, kĩ thuật này đã được áp dụng để phân biệt loài

Dendrobium officinale với 7 loài Dendrobium khác dựa vào trình tự tại vùng nối

giữa hai gen 5S [67].

2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen

Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen về cơ bản là giống với kĩ thuật

microarray oligonucleotid ngoại trừ việc sử dụng các mẫu dò là các trình tự đặc

trưng từ các vùng mã hóa. Mẫu dò có kích thước mở rộng toàn bộ gen, nằm trong

khoảng 0.5 – 1.5 kb. Các bước chiết tách ADN, quá trình lai và thăm dò tương tự

như kĩ thuật trên. Tuy nhiên, so với kĩ thuật microarray, các đoạn gen đặc trưng

được sử dụng làm mẫu dò thay vì vài oligonucleotid từ một trình tự gen [53]. Một

nghiên cứu sử dụng kĩ thuật này đã được thực hiện với 5 loài Dendrobium là

Dendrobium oficinale, D. loddigesii, D. fimbriatum, D. chrysanthum, D. nobile.

Mẫu dò để nhận các loài Dendrobium được xây dựng dựa trên trình tự ITS. Trình tự

ITS được gắn lên giá thể, trong đó các trình tự ITS2 được đánh dấu huỳnh quang

50

cho các tín hiệu đặc trưng của mỗi loài. Từ kết quả thu được cho thấy phương pháp

đủ nhạy để thăm dò sự có mặt của Dendrobium nobile trong một hỗn hợp thảo dược

chứa chín thành phần khác nhau [79]. So với kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò

oligonucleotid, kĩ thuật này đặc hiệu hơn do sử dụng trình tự mẫu dò dài hơn. Tuy

nhiên, nhược điểm chung của cả hai phương pháp này là không thích hợp trong

nghiên cứu các loài khi chưa có đủ thông tin về bộ gen do những thông tin về bộ

gen là cần thiết để thiết kế mẫu dò oligonucleotid hoặc thiết kế mồi.

Như vậy, bên cạnh các phương pháp marker dựa vào PCR và marker dựa vào giải

trình tự, các marker thu được dựa vào phương pháp microarray cũng được sử dụng

với mục đích nhận diện thảo dược. Phương pháp microarray đem lại một công cụ

hiệu quả trong nhận diện thảo dược. Nếu như phương pháp marker dựa vào khuếch

đại PCR có nhược điểm là việc thăm dò đa dạng được thực hiện trên gel do đó rất

tốn thời gian công sức và làm giới hạn số mẫu được thăm dò thì phương pháp

microarray lại tỏ ra có ưu điểm vượt trội vì cho phép một số lượng lớn các mẫu dò

ADN lai với các đoạn ADN mục tiêu, do đó chúng rất chính xác và giúp tiết kiệm

được công sức. Kĩ thuật microarray cho phép thăm dò nhiều loài khác nhau. Việc

thăm dò sự có mặt của một thành phần trong một hỗn hợp các thành phần hay các

sản phẩm đã qua chế biến, xử lý bằng nhiệt cũng đã được thực hiện. Tuy nhiên

phương pháp này cũng có nhược điểm là cần một số lượng mẫu lớn và quá trình

thực hiện tốn thời gian do quá trình lai kéo dài thường đòi hỏi là ủ qua đêm. Trong

khi đó, các phương pháp khác lại tỏ ra là tiết kiệm thời gian hơn ví dụ như trong

trường hợp nhận diện Panax giseng và Panax quinquefolius là một ví dụ. Phân biệt

Panax ginseng và Panax quinquefolius dựa vào giải trình tự vùng ITS sử dụng

phương pháp pyrosequencing cho phép việc nghiên cứu đồng thời các mẫu chỉ

trong vòng 15 phút [46]. Một nhược điểm nữa của các phương pháp microarray là

nếu điều kiện không được thực hiện nghiêm ngặt thì sự lai chéo giữa các trình tự

tương tự nhau sẽ xảy ra dẫn đến những dương tính giả.

51

Chương 3. Bàn luận

3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh

học phân tử

Nhận diện thảo dược đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả

điều trị, an toàn cho người sử dụng, giảm sự thiếu công bằng trong thương mại và

đem lại lòng tin cho người tiêu dùng. Đồng thời, nhận diện chính xác thảo dược

cũng góp phần trong việc chuẩn hóa và công nghiệp hóa các thuốc có nguồn gốc

thảo dược. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các kĩ thuật

sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các kĩ

thuật này bước đầu đã được ứng dụng có hiệu quả để nhận diện thảo dược. Sử dụng

sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược có thể khắc phục được một số các

nhược điểm của các phương pháp nhận diện hiện có như phương pháp nhận diện

dựa vào hình thái, phương pháp vi học và phương pháp phân tích thành phần hóa

học. Nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử có thể thực hiện với

nhiều dạng khác nhau của của thảo dược từ mẫu tươi, mẫu khô đến mẫu đã sơ chế

và kết quả không chịu ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của thực vật, điều kiện

môi trường, điều kiện thu hái... Do đó, phương pháp nhận diện dựa trên chỉ thị

ADN là một công cụ tiên tiến, hiệu quả cho mục đích nhận diện thảo dược.

Tuy nhiên không có một phương pháp nào là hoàn hảo tuyệt đối. Bên cạnh

những ưu điểm vượt trội, việc sử dụng phương pháp nhận diện thảo dược dựa trên

ADN cũng phải đối mặt với một số khó khăn, thách thức.

Vấn đề đầu tiên là sự thoái biến của ADN. Ở thảo dược, sự thoái biến của

ADN thường xuyên xảy do chúng thường được xử lý bằng nhiệt (phơi hoặc sấy

khô), xay, nghiền hoặc được xử lý với nhiều chất hóa học khác nhau [78]. Vấn đề

này có thể được giải quyết nhờ việc lựa chọn các kĩ thuật có thể áp dụng các ADN

thoái biến. Một số kĩ thuật trong đó sử dụng các gen có nhiều bản sao (như gen

ribosom), từ đó, cơ hội để thu được trình tự của toàn bộ gen là cao hơn. Một giải

52

pháp khác là sử dụng các kĩ thuật trong đó việc khuếch đại được thực hiện tại các

vùng ADN có kích thước nhỏ, ví dụ như kĩ thuật nghiên cứu SSR với các trình tự

mục tiêu thường có chiều dài khoảng vài chục bp do đó nguy cơ xảy ra đứt gãy ở

bên trong đoạn trình tự mục tiêu này sẽ thấp hơn. Sử dụng kĩ thuật lai ADN

microarray cũng rất hữu ích trong việc nhận diện các ADN đã bị thoái biến [78]. Ví

dụ như kĩ thuật ADN microarray đã được áp dụng với hai loài Panax ginseng và

Panax quinquefolius ở dạng rễ đã chế biến và đã thành công trong việc nhận diện

hai loài này [54].

Sự có mặt của các chất ức chế chuỗi phản ứng PCR cũng là một vấn đề cần

quan tâm [78]. Thảo dược thường chứa các hợp chất phenolic, các polysaccharid và

các sắc tố. Các chất này có thể đóng vai trò là những yếu tố ức chế phản ứng PCR.

Lựa chọn một phương pháp chiết tách thích hợp có thể loại trừ được các yếu tố ảnh

hưởng đến nói trên. Một giải pháp nữa là pha loãng ADN mẫu và thêm vào đó chất

làm tăng cường phản ứng PCR [78]. Ví dụ như trong quá trình nghiên cứu ba loài

Tribulus terrestris, Tribulus lanuginosus và Tribulus subramanyamii, sau khi thử

nhiều quy trình hướng dẫn chiết tách ADN khác nhau, phương pháp chiết tách ADN

được mô tả bởi Milligan với một số cải tiến đã được lựa chọn. Dung dịch chiết tách

được bổ sung LiCl có tách dụng loại bỏ các hợp chất polyphenol và polysaccharid.

Hỗn hợp chloroform và isoamyl alcol được sử dụng để loại tạp, chủ yếu là protein

do protein biến tính chuyển vào trong pha dầu còn ADN nằm ở pha nước. RNase

cũng được sử dụng để loại bỏ ARN lẫn với ADN. Sử dụng phương pháp này thu

được ADN có chất lượng tốt, tỉ lệ A260/A280 đạt 1,6 – 1,8 [9].

Vấn đề ngoại nhiễm bởi các ADN không thuộc loài mục tiêu cũng cần được

xem xét [78]. Các ADN này có thể bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn hoặc các côn trùng

nhiễm vào trong thảo dược do quá trình bảo quản không đúng hoặc do các ADN từ

các thực vật khác bị lẫn trong công thức phối hợp. Các ADN này sẽ được khuếch

đại cùng với các ADN mục tiêu gây ảnh hưởng đến kết quả thu được. Vấn đề này có

thể được giải quyết bằng một quy trình xử lý mẫu, dụng cụ thao tác nghiêm ngặt

53

hoặc sử dụng các kĩ thuật đặc trưng cho các ADN mục tiêu như kĩ thuật ARMS

hoặc SCAR [78]. Ví dụ như trong nghiên cứu ở ba loài Phyllanthus amarus,

Phyllanthus urinaria và Phyllanthus debilis sử dụng kĩ thuật SCAR. Trong một hỗn

hợp đồng lượng của ba loài trên, mồi SCAR đặc hiệu được thiết kế cho loài

Phyllanthus amarus chỉ khuếch đại các băng đặc trưng cho loài này mà không tạo ra

băng ADN với các ADN nhiễu từ hai loài còn lại. Trường hợp tương tự khi sử dụng

mồi đặc hiệu cho loài P. urinaria hoặc P. debilis. Mồi này chỉ khuếch đại ADN từ

loài mục tiêu và không khuếch đại đoạn ADN ngoại nhiễm [68]. Bên cạnh sử dụng

hai kĩ thuật SCAR và ARMS, nếu vùng nghiên cứu đặc trưng cho loài và quy trình

xử lý và bảo quản mẫu nghiêm ngặt thì có thể sử dụng nghiên cứu microarray để

nghiên cứu hỗn hợp ADN [78].

Mặc dù còn tồn tại những điểm hạn chế, các công cụ sinh học phân tử vẫn là

một phương pháp hiệu quả trong nhận diện thảo dược và những điểm hạn chế còn

tồn tại hoàn toàn có thể khắc phục được. Hiện nay đã có nhiều loại vân tay hoặc mã

vạch đã được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới như dấu vân tay SCAR, ISSR hay

mã vạch ITS.

Trong sinh học phân tử, có rất nhiều kĩ thuật có thể được sử dụng để nhận

diện thảo dược. Căn cứ để nhận diện thảo dược là các marker ADN có thể thu được

nhờ các phương pháp khuếch đại PCR với nhiều loại mồi khác nhau, phương pháp

giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray. Trong mỗi phương pháp này

lại có rất nhiều kĩ thuật khác nhau. Một khó khăn cho những nhà nghiên cứu là việc

phải lựa chọn một hoặc một số marker phù hợp cho các nghiên cứu của mình. Một

marker phù hợp là một marker có sự đa hình cao, xuất hiện trong bộ gen với tần

suất lớn, quy trình thực nghiệm đơn giản, nhanh, chi phí thấp, hiệu suất cao, độ tin

cậy cao và có khả năng trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên,

không một kĩ thuật nào có thể đạt được tất cả các tiêu chuẩn này. Do đó, việc lựa

chọn marker cho một nghiên cứu phải xem xét đến các yếu tố sau:

- Sự sẵn có của hệ thống marker.

54

- Mức độ đơn giản của kĩ thuật và thời gian cần để thực hiện.

- Khả năng phản ánh mức độ đa hình của marker.

- Chất lượng và số lượng mẫu ADN hiện có.

- Khả năng trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí nghiệm.

- Kích thước, số lượng mẫu nghiên cứu.

- Thiết bị và các kĩ năng cần thiết.

- Chi phí thực hiện.

Bảng sau đây sẽ cho thấy một vài so sánh giữa các kĩ thuật làm căn cứ để lựa chọn.

55

Bảng 2. So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học phân tử để nhận diện thảo dược [78]

Các đặc điểm SCAR ARMS SSR CAPS RP-PCR ISSR AFLP Giải

trình Lai

Chi phí phát triển Trung

bình

Trung

bình Cao

Trung

bình Thấp Thấp Thấp

Trung

bình

Trung

bình

Chi phí vận hành Thấp Thấp Trung bình Trung

bình Thấp Thấp

Trung

bình

Trung

bình

Trung

bình

Số vị trí khuếch đại Một vị trí Một vị trí Một vị trí Một vị trí Nhiều vị

trí

Nhiều vị

trí

Nhiều vị

trí Một vị trí Một vị trí

Yêu cầu về tính nguyên vẹn của

ADN mẫu

Trung

bình

Trung

bình Thấp

Trung

bình Cao Cao Cao

Trung

bình

Trung

bình

Yêu cầu về độ tinh sạch của

ADN mẫu Cao Cao Trung bình Cao Cao Cao Cao Cao Cao

Kiến thức cần biết trước về bộ

gen Có Có Có Không Không Không Không Có Có

Hiệu suất Thấp Thấp Cao Thấp Cao Cao Cao Thấp Cao

Kĩ năng yêu cầu Thấp Thấp Trung bình-

thấp Thấp Thấp Thấp

Trung

bình

Trung

bình

Trung

bình

Khả năng tự động hóa Có Có Có Khó Có Có Có Có Khó

Độ tin cậy Cao Cao Cao Cao Thấp Trung

bình Cao Cao

Trung

bình

56

Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng nên tùy vào mục đích và

điều kiện sẵn có để lựa chọn một phương pháp thích hợp nhất. Từ góc độ mục đích

của nghiên cứu, nếu muốn thực hiện nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn thì nên sử

dụng các phương pháp cho phép nghiên cứu với số lượng mẫu lớn như phương

pháp giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray. Phương pháp ADN

microarray thích hợp cho nhận diện loài trong hỗn hợp các loài nghi ngờ. Phương

pháp giải trình tự ADN thích hợp cho việc xác định các mẫu chưa biết rõ loài. Với

số lượng mẫu nhỏ có thể sử dụng các marker thu được dựa vào phản ứng khuếch đại

PCR. Với các marker này, căn cứ vào độ tin cậy mong muốn đạt được có thể lựa

chọn phương pháp. Kĩ thuật nhận diện chính xác được đề xuất là kĩ thuật SCAR

hoặc ARMS. Kĩ thuật có độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm thấp, độ tin cậy thấp như

kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) chỉ thích

hợp trong việc phân nhóm các thảo dược hoặc để phân biệt các mẫu với nhau vì với

cùng một mẫu mỗi lần thử nghiệm chạy PCR sẽ có thể cho một mô hình băng ADN

khác nhau.

3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam

Theo nghiên cứu về thực trạng sử dụng thảo dược ở Việt Nam cho thấy thảo

dược hoang dại hoặc sản xuất trong nước cũng như các thảo dược nhập khẩu từ

nước ngoài đang lưu hành trong nước không được kiểm soát về chất lượng và độ

an toàn [1]. Thảo dược trong nước chủ yếu được thu hái từ nguồn cây mọc hoang,

lấy số lượng làm mục tiêu chính. Tình trạng thu hái không đúng mùa vụ, sơ chế,

bảo quản không theo quy trình nghiêm ngặt dẫn đến những sự nhầm lẫn thường

xuyên xảy ra. Những nguyên nhân chính dẫn đến nhầm lẫn là:

- Do hình dạng của các thảo dược rất giống nhau.

- Do chế biến làm thay đổi hình dạng thảo dược.

- Do sự thay thế tùy tiện các thảo dược.

- Do trùng tên gọi.

- Do chưa xác định được tên khoa học của thảo dược.

57

- Do cố ý giả mạo.

Trong các lý do trên, việc nhầm lẫn do sự giống nhau của các thảo dược hoặc

do trùng tên gọi là nguyên nhân quan trọng có thể gây nguy hiểm đến tính mạng của

người bệnh và đã có trường hợp tử vong [1]. Cùng với đó, sự cố ý giả mạo có xu

hướng ngày càng gia tăng bởi sự giao lưu buôn bán chưa được kiểm soát chặt chẽ.

Trên thị trường, thảo dược được mua bán theo cảm quan, nhu cầu và chưa được sự

quản lý chặt chẽ từ phía các cơ quan nhà nước. Theo thống kê từ năm 1980 đã phát

hiện 70 cây thuốc và vị thuốc có cùng tên gọi với các cây thuốc và vị thuốc khác; có

khoảng 50 dược liệu dễ bị nhầm lẫn và nhiều dược liệu bị giả mạo do người sản

xuất, buôn bán cố ý. Trên thị trường Việt Nam đã phát hiện có sự giả mạo tam thất

bằng nga truật, hoài sơn bằng củ cọc, địa cốt bì bằng hương gia bì [1]. Những bất

cập này cho thấy việc nhận diện thảo dược tại Việt Nam đang là một nhu cầu cấp

thiết để đảm bảo hiệu quả điều trị và nhằm ngăn chặn những hậu quả đáng tiếc cho

người sử dụng.

Cho đến nay, tại Việt Nam đã có các phương pháp để nhận diện thảo dược

chủ yếu còn ở mức độ đơn giản. Các tiêu chuẩn để nhận diện một thảo dược

thường là dựa vào phương pháp hình thái, phương pháp vi học và phương pháp

phân tích hóa học được lựa chọn là sắc kí lớp mỏng. Những phương pháp này cho

thấy độ chính xác không cao, tuy nhiên do đơn giản, dễ thực hiện nên được sử

dụng khá phổ biến. Trái lại, việc áp dụng các kĩ thuật tiên tiến và có độ chính xác

cao hơn như các kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược còn khá mới

mẻ. Ở Việt Nam, có rất ít nghiên cứu trên thảo dược áp dụng các phương pháp này.

Qua khảo sát thực tế tại Viện Dược liệu, các nhà khoa học mới áp dụng kĩ thuật

RAPD để nghiên cứu phân biệt sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) với sâm vũ

diệp (Panax bipinnatifidus) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus) [3], nghiên

cứu phân biệt ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus) với ngũ gia bì gai

(Acanthopanax trifoliatus) [4]. Kết quả thu được từ các nghiên cứu cho thấy sử

dụng RAPD có thể phân biệt được các loài này. Tuy nhiên RAPD không phải là

58

một kĩ thuật được đề xuất cho việc nhận diện thảo dược do có độ tin cậy thấp. Bộ

môn Thực vật – trường Đại học Dược Hà Nội mới bắt đầu quá trình triển khai áp

dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu thảo dược. Một báo cáo hiếm

hoi sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược là của Nguyễn

Thanh Thuận và cộng sự tại Đại học Y Dược Tp.HCM trong đó kĩ thuật RFLP-

PCR sử dụng mồi là trình tự vùng ITS và 18S được áp dụng để nhận diện các loài

sâm khác nhau [5]. Trong nông nghiệp, việc áp dụng công cụ sinh học phân tử

được chú nhiều ý hơn. Tuy nhiên, mặc dù các công cụ sinh học phân tử, di truyền

học đã được áp dụng rộng rãi trong một thời gian dài trong lĩnh vực nông nghiệp

nhưng chủ yếu chỉ giới hạn trong nghiên cứu các loại cây lương thực trọng điểm.

Như vậy, việc sử dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu cây thuốc và

vị thuốc nói chung và trong việc nhận diện thảo dược nói riêng vẫn đang là một

hướng đi khá mới mẻ tại Việt Nam. Cơ sở vật chất và nguồn nhân lực ở nước ta có

thể đáp ứng một phần đáng kể cho việc triển khai các nghiên cứu và ứng dụng

công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược. Tuy nhiên, điều quan trọng là

các nhà quản lý, các nhà khoa học và nhà sản xuất cần có nhận thức đầy đủ về ý

nghĩa của việc nhận diện thảo dược và những lợi thế của công cụ sinh học phân tử

để quan tâm đẩy mạnh hơn nữa sự phát triển của lĩnh vực này. Trước mắt, để phù

hợp với điều kiện thực tế của Việt Nam, có thể lựa chọn triển khai một số kĩ thuật

đơn giản, độ tin cậy tương đối cao như kĩ thuật giải trình tự ADN một số vùng

chọn lọc, kĩ thuật ISSR hoặc SSR…

59

KẾT LUẬN

Đề tài hoàn thành đã đạt được các mục tiêu sau:

- Đã tìm hiểu những nguyên tắc cơ bản của các kĩ thuật sinh học phân tử được

ứng dụng trong nhận diện thảo dược. Có ba phương pháp được sử dụng là

phương pháp marker dựa trên phản ứng khuếch đại PCR, phương pháp giải trình

tự ADN và phương pháp ADN microarray. Từ mỗi phương pháp, có nhiều kĩ

thuật khác nhau được xây dựng và triển khai.

- Đã đưa ra những đánh giá bước đầu về ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của

mỗi kĩ thuật. Mỗi kĩ thuật đều có ưu nhược điểm riêng nên cần xem xét đầy đủ

các yếu tố liên quan để chọn được kĩ thuật phù hợp nhất.

ĐỀ XUẤT

Đẩy mạnh triển khai các nghiên cứu áp dụng công cụ sinh học phân tử trong

nhận diện thảo dược như một biện pháp hướng đến tiêu chuẩn hóa dược liệu tại Việt

Nam nhằm đạt mục tiêu sử dụng thuốc an toàn, hợp lý và hiệu quả.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bùi Thị Bằng (2003), “Thực trạng chất lượng và an toàn dược liệu lưu hành trên

thị trường”, Tài liệu hội nghị Dược liệu toàn quốc lần thứ nhất “Phát triển dược

liệu bền vững trong thế kỉ mới”, tr.174-175.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hồ Chí Minh.

3. Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Tập, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phương, Đinh Đoàn

Long (2009), “Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu đa hình di truyền

góp phần phân biệt và bảo tồn ba loài cây thuốc sâm Việt Nam (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.), sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) và tam thất hoang

(P. stipuleanatus Tsai et Feng) ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 14(2), tr. 74-81.

4. Đinh Đoàn Long, Nguyễn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức

Phương (2009), “Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu đa hình di truyền

nhằm góp phần giá trị bảo tồn hai loài cây thuốc ngũ gia bì hương

(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) và ngũ gia bì gai (Acanthopanax

trifoliatus (L.) Merr.)”, Tạp chí Dược liệu, 14(1), tr. 10-16.

5. Nguyễn Thanh Thuận, Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông

(2010), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định một số loài sâm thuộc

chi Panax”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 14(1), tr. 129-133.

Tiếng Anh

6. Agarwal M., Shrivastava N., Padh H. (2008), “Advances in molecular marker

techniques and their applications in plant sciences”, Plant Cell Rep, 27:617–631.

7. Al-Qurainy F., Khan S., Ali M.A., Al-Hemaid F.M., Tarroum M., Ashraf M.

(2011), “ Authentication of Ruta graveolens and its adulterant using internal

transcribed spacer (ITS) sequences of nuclear ribosomal DNA”, Pak. J. Bot.,

43(3): 1613-1620.

8. Arif I.A., Bakir M.A., Khan H.A., Al Farhan A.H., Al Homaidan A.A.,

Bahkali A.H., Al Sadoon M., Shobrak M. A. (2010), “Brief review of

molecular techniques to assess plant diversity”, .Int. J. Mol. Sci., 11, pp. 2079-

2096.

9. Balasubramani S.P., Murugan R., Ravikumar K., Venkatasubramanian P.

(2010), “Development of ITS sequence based molecular marker to distinguish,

Tribulus terrestris L. (Zygophyllaceae) from its adulterants”, Fitoterapia 81, pp.

503–508.

10. Baldwin B.G. (1992), “Phylogenetic utility of the internal transcribed spacer of

nuclear ribosomal DNA in plans: An example from Compositae”, Mol

Phylogenet Evol., 1(1): 3-16.

11. Carles M., Cheung M.K.L., Moganti S., Dong T.T.X., Tsim K.W., Ip N.Y.,

Sucher N.J. (2005), “A DNA microarray for the authentication of toxic

traditional Chinese medicinal plants”, Planta Med, 71(6): 580-584.

12. CBOL Plant Working Group (2009), “A DNA barcode for land plants”, PNAS,

106(31), pp. 12794 –12797.

13. Chen R., Dong J., Cui X., Wang W., Yasmeen A., Deng Y., Zeng X., Tang Z.

(2012), “DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent

medicines”, Sci. Rep., 2:958.

14. Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang

X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y., Leon C. (2010), “Validation of the ITS2

region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLoS

ONE 5(1): e8613.

15. Cheng KT., Su B., Chen CT., Lin CC. (2000), “RAPD analysis oi Astragalus

medicines marketed in Taiwan”, Am J Chin Med., 28(2):273-8.

16. Choudhary N., Sekhon B.S. (2011), “An overview of advances in the

standardization of herbal drugs”, J Pharm Educ Res, 2(2), pp. 55-70.

17. Dhanya K., Syamkumar S., Siju S., Sasikumar B. (2011), “Sequence

characterized amplified region markers: A reliable for adulterant detection in

turmeric powder”, Food Research International, 44(9), pp. 2889–2895.

18. Franca L.T., Carrilho E., Kist T.B. (2002), “A review of DNA sequencing

techniques”, Quarterly Reviews of Biophysics, 35 (2), pp. 169-200.

19. Ganie S.H., Srivastava P.S., Narula A., Ali Z., Sharma M.P. (2012),

“Authentication of shankhpushpi by RAPD markers”, Eurasia J Biosci 6, pp.

39-46.

20. Gao T., Sun Z., Yao H., Song J., Zhu Y., Ma X., Chen S. (2011), “Identification

of Fabaceae plants using the DNA barcode matK”, Planta Med., 77(1):92-94.

21. Gao T., Yao H., Song J., Liu C., Zhu Y., Ma X., Pang X., Xu H., Chen S.

(2010), “Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a

potential DNA barcode ITS2”, J Ethnopharmacol., 130(1):116-121.

22. Ghosh S., Majumder P.B., Sen Mandi S.S. (2011), “Species-specific AFLP

markers for identification of Zingiber officinale, Z. montanum and Z. zerumbet

(Zingiberaceae)”, Genetics and Molecular Research, 10(1): 218-229.

23. Guo JL., Ren Y., Chen L., Pei J., Wan DG. (2010), “Authentication of Caulis

clematidis armandii (Chuanmutong) and differentiation of its common

adulterants using RAPD and SCAR markers”, Journal of Medicinal Plants

Research, 4(8), pp. 697-701.

24. Ha W.Y., Shaw P.C., Liu J., Yau C.F., Wang J. (2002), “Authentication of

Panax ginseng and Panax quinquefolius using amplified fragment length

polymorphism (AFLP) and directed amplification of minisattlite region DNA

(DAMD)”, J. Agric. Food Chem., 50, pp. 1871 −1875.

25. Ha WY., Yau F.C., But P.P., Wang J, Shaw PC. (2001), “Direct amplification of

length polymorphism analysis differentiates Panax ginseng from P.

quinquefolius”, Planta Med 67, pp. 587-589.

26. Heubl G. (2010), “New aspects of DNA-based authentication of Chinese

medicinal plants by molecular biological techniques”, Planta Med, 76: 1963-

1974.

27. Hollingsworth P.M., Graham S.W., Little D.P. (2011), “Choosing and using a

plant DNA barcode”, PLoS ONE 6(5): e19254.

28. Hon CC, Chow YC, Zeng FY, Leung FC. (2003), “Genetic authentication of

ginseng and other traditional Chinese medicine”, Acta Pharmacol Sin., 24(9):

841-6.

29. Hussain M.A., Bedi Y.S. (2012), “Authentication of Picrorhiza kurrooa Royle

ex Benth. using DNA fingerprint”, International Journal of AgriScience, 2(6):

511-521.

30. Ince A. G., Karaca M. (2011), “Species-specific touch-down DAMD-PCR

markers for Salvia species”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(9), pp.

1590-1595.

31. Jiang Y., David B., Tua P., Barbin Y. (2010), “Recent analytical approaches in

quality control of traditional Chinese medicines—A review”, Analytica Chimica

Acta 657, pp. 9–18.

32. Jiang Y., Ding C., Zhang L., Yang R., Zhou Y., Tang L. (2011), “Identification

of the genus Epimedium with DNA barcodes”, Journal of Medicinal Plants

Research, 5(28), pp. 6413-6417.

33. Joshi M., Deshpande J.D. (2010), “Polymerase chain reaction: methods,

principles and application”, International Journal of Biomedical Research 1, pp.

81-97.

34. Kårehed J., Groeninckx I., Dessein S., Motley T.J., Bremer B. (2008), “The

phylogenetic utility of chloroplast and nuclear DNA markers and the phylogeny

of the Rubiaceae tribe Spermacoceae”, Mol Phylogenet Evol., 49(3):843-866.

35. Khan S., Mirza K.J., Abdin M.Z. (2010), “Development of RAPD markers for

authentication of medicinal plant Cuscuta reflexa”, EurAsia J BioSci 4, pp. 1-7.

36. Khan S., Mirza K.J., Abdin M.Z. (2010), “DNA fingerprinting for the

authentication of Ruta graveolens”, African Journal of Biotechnology, 10(44),

pp. 8709-8715.

37. Khan S., Mirza K.J., Al-Qurainy F., Abdin M.Z. (2011), “Authentication of the

medicinal plant Senna angustifolia by RAPD profiling”, Saudi Journal of

Biological Sciences 18, pp. 287–292.

38. Khan S., Mirza K.J., Md Tayaab Md, Abdin M.Z. (2009), “RAPD profile for

authentication of medicinal plant Glycyrrhiza glabra Linn.”, Internet Journal of

Food Safety, 11, pp. 24-28.

39. Khan S., Qureshi M.I., Kamaluddin, Alam T., Abdin M. Z. (2006), “Protocol for

isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of medicinal plants suitable

for RAPD and restriction digestion”, African Journal of Biotechnology, 6(3), pp.

175-178.

40. Kim J, Jo BH, Lee KL, Yoon ES, Ryu GH, Chung KW. (2007), “Identification

of new microsatellite markers in Panax ginseng”, Mol Cells., 24(1): 60-8.

41. Ko R.J. (2004), “A U.S. perspective on the adverse reactions from traditional

Chinese medicines”, J Chin Med Assoc, 67:109-116.

42. Kreader C.A. (1996), “Relief of amplification inhibition in PCR with Bovine

Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein”, Applied and environmental

microbilogy, pp. 1102–1106.

43. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005), “Use of

DNA barcodes to identify flowering plants”, PNAS, 102(23), pp. 8369 – 8374.

44. Kunle, Folashade O., Egharevba, Omoregie H., Ahmadu, Ochogu P. (2012),

“Standardization of herbal medicines - A review”, International Journal of

Biodiversity and Conservation , 4(3), pp. 101-112

45. Kwon HK., Ahn Ch., Choi YE. (2009), “Molecular authentication of Panax

notoginseng by specific AFLP-derived SCAR marker”, Journal of Medicinal

Plants Research, 3(11), pp. 957-966.

46. Leem K., Kim S.C., Yang C.H., Seo J. (2005), “Genetic identification of Panax

ginseng and Panax quinquefolius by pyrosequencing methods”, Biosci

Biotechnol Biochem., 69(9):1771-1773.

47. Li M., Cao H., But P.P., Shaw PC. (2011), “Identification of herbal medicinal

materials using DNA barcodes”, Journal of Systematics and Evolution, 49(3):

271–283.

48. Li M., Jiang RW., Hon PM., Cheng L., Li LL., Zhou JR., Shaw PC., But P.P.

(2010), “Authentication of the anti-tumor herb Baihuasheshecao with bioactive

marker compounds and molecular sequences”, Food Chemistry, 119(3), pp.

1239–1245.

49. Liu T., Ji Y. (2011), “Molecular authentication of the medicinal plant Paris

polyphylla Smith var. yunnanensis (Melanthiaceae) and its related species by

polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism (PCR-

RFLP)”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(7), pp. 1181-1186.

50. Meizi L., Hui Y., Kun L., Pei M., Wenbin Z., Ping L. (2012), “Authentication of

Illicium verum using a DNA barcode psbA-trnH”, Journal of Medicinal Plants

Research, 6(16), pp. 3156-3161.

51. Misra A., Shasany A.K., Shukla A.K., Darokar M.P., Singh S.C., Sundaresan V.,

Singh J., Bagchi G.D., Jain S.P., Saikia D., Khanuja S.P.S. (2010), “AFLP

markers for identification of Swertia species (Gentianaceae)”, Genetics and

Molecular Research, 9 (3): 1535-1544.

52. Nikam P. H., Kareparamban J., Jadhav A., Kadam V. (2012), “Future trends in

standardization of herbal drugs”, Journal of Applied Pharmaceutical Science 02

(06); pp. 38-44.

53. Niu L., Mantri N., Li C.G., Xue C., Pang E. (2011), “Array-based techniques for

fingerprinting medicinal herbs”, Chinese Medicine, 6:18

54. Niu L., Mantri N., Li C.G., Xue C., Wohlmuth H., Pang E.CK (2011),

“Detection of Panax quinquefolius in Panax ginseng using ‘subtracted diversity

array’”, J Sci Food Agric, 91: 1310 – 1315.

55. Saini A., Reddy S.K, Jawali N. (2004), “Evaluation of long primers for AP-PCR

analysis of mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]: Genetic relationships and

fingerprinting of some genotypes”, Indian journal of Biotechnology 3, pp 511-

518.

56. Schlötterer C. (2000), “Evolutionary dynamics of microsatellite DNA”,

Chromosoma, 109(6): 365-71.

57. Scott M.C., Caetano-Anollés G., Trigiano R.N. (1996), “DNA amplification

fingerprinting identifies closely related Chrysanthemum Cultivars”, J. A MER.

SOC. H ORT. SCI., 121(6):1043–1048.

58. Sehgal D., Bhat V., Raina S.N. (2008), “Advent of diverse DNA markers to

decipher genome sequence polymorphism”, Handbook of new technologies

genetic improvement of legumes, CRC Press Taylor and Francis Group, Boca

Raton.

59. Selkoe K.A., Toonen R.J. (2006), “Microsatellites for ecologists: a practical

guide to using and evaluating microsatellite markers”, Ecol Lett., 9(5): 615-29.

60. Semagn K., Bjørnstad Å., Ndjiondjop M. N. (2006), “An overview of molecular

marker methods for plants”, African Journal of Biotechnology, 5(25), pp. 2540-

2568.

61. Shaw PC., Wong KL., Chan A.W., Wong WC., But P.P. (2009), “Patent

applications for using DNA technologies to authenticate medicinal herbal

material”, Chin Med., 4: 21.

62. Shi H.M., Wang J., Wang M.Y., Tu P.F., Li X.B. (2009), “Identification of

Cistanche Species by chemical and inter-simple sequence repeat fingerprinting”,

Biol. Pharm. Bull., 32(1), pp. 142-146.

63. Smillie TJ and Khan IA (2010), “A comprehensive approach to identifying and

authenticating botanical products”, Clinical pharmacology and theurepeutics,

87(2), pp. 175-186.

64. Sun X., Guo J., Ge Y., Xia B., Hang Y. (2012), “Study of specific random

amplification of polymorphic DNA- sequence characterized amplified region

(RAPD-SCAR) marker for the endangered Chinese endemic herb Atractylodes

lancea”, Journal of Medicinal Plants Research, 6(21), pp. 3774-3780.

65. Sun XQ., Zhu YJ., Guo JL., Peng B., Bai MM., Hang YY. (2012), “DNA

barcoding the Dioscorea in China, a vital group in the evolution of

monocotyledon: Use of matK gene for species discrimination”, PLoS ONE 7(2):

e32057.

66. Sun Z., Gao T., Yao H., Shi L., Zhu Y., Chen S. (2011), “Identification of

Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method”,

Planta Med, 77: 301 – 306.

67. Sze S.C., Zhang K.Y., Shaw PC., But P.P., Ng TB., Tong Y. (2005), “A DNA

microarray for differentiation of the Chinese medicinal herb Dendrobium

officinale (Fengdou Shihu) by its 5 S ribosomal DNA intergenic spacer region”,

Biotechnol Appl Biochem., 49(2):149-154.

68. Theerakulpisut P., Kanawapee N., Maensiri D., Bunnag S., Chantaranothai P.

(2008), “ Development of species- specific SCAR markers for identification of

three medicinal species of Phyllanthus”, Journal of Systematics and Evolution,

46 (4): 614-621.

69. Wagner H. Bauer R., Melchart D., Xiao P., Staudinger A. (2011),

“Chromatography fingerprint Analysis of Herbal Medicines”, Springer, New

York.

70. Wang H., Kim MK., Kim YJ., Lee HN., Jin H., Chen J., Yang DC. (2012),

“Molecular authentication of the Oriental medicines Pericarpium Citri

Reticulatae and Citri Unshius Pericarpium using SNP markers”, Gene., 494(1),

pp. 92-95.

71. Wang J., Tanret I., Mangelings D., Fan G., Wu Y., Heyden Y.V. (2010),

“Fingerprint development for Ginkgo biloba extracts by pressurized capillary

electrochromatography: Comparison of column types”, Journal of

Chromatographic Science, 48, pp. 428-435.

72. Wang X. (2011), “Inter-simple sequence repeats (ISSR) molecular

fingerprinting markers for authenticating the genuine species of rhubarb”,

Journal of Medicinal Plants Research, 5(5), pp. 758-764.

73. Xu H, Wang Z, Ding X, Zhou K, Xu L (2005), “Differentiation of Dendrobium

species used as "Huangcao Shihu" by rDNA ITS sequence analysis, Planta

Med., 71: 1-3.

74. Yadav A., Ahmad J., Chaudhary A.A., Ahmad A. (2012), “Development of

sequence characterized amplified region (SCAR) Marker for the authentication

of Bacopa monnieri (L.) Wettst)”, European Journal of Medicinal Plants, 2(3):

186-198.

75. Yang Y., Zhai Y., Liu T., Zhang F., Ji Y. (2011), “Detection of Valeriana

jatamansi as an adulterant of medicinal Paris by length variation of chloroplast

psbA-trnH region”, Planta Med., 77(1):87-91.

76. Yao H., Song JY., Ma XY., Liu C., Li Y., Xu HX., Han JP., Duan LS., Chen SL.

(2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode

sequence: The chloroplast psbA-trnH intergenic region”, Planta Med.,

75(6):667-669.

77. Ye Q, Qiu YX, Quo YQ, Chen JX, Yang SZ, Zhao MS, Fu CX. (2006),

“Species-specific SCAR markers for authentication of Sinocalycanthus

chinensis”, J Zhejiang Univ Sci B., 7(11):868-872.

78. Yip P.Y., Chau C.F., Mak C.Y., Kwan H.S. (2007), “DNA methods for

identification of Chinese medicinal materials”, Chinese Medicine, 2:9.

79. Zhang YB., Wang J., Wang ZT., But P.P., Shaw PC. (2003), “DNA Microarray

for identification of the herb of Dendrobium species from Chinese medicinal

formulations”, Planta Med., 69(12):1172-1174.

80. Zhao YP., Qiu YX., Gong W., Li JH., Fu CX. (2007), “Authentication of

Actinidia macrosperma using PCR-RFLP based on trnK sequences”, Botanical

Studies, 48: 239-242.

81. Zhao Z., Hu Y., Liang Z., Yuen J.P., Jiang Z., Leung K.S. (2006),

“Authetication is fundamental for standardization of Chinese medicines”, Planta

Med, 72: 865-874.

82. Zhu S., Fushimi H., Cai S., Komatsu K. (2003), “Species identification from

Ginseng drugs by multiplex amplification refractory mutation system

(MARMS)”, Planta Med, 70: 189-192.

83. Zhu S., Fushimi H., Komatsu K. (2008), “Development of a DNA microarray

for authentication of Ginseng drugs based on 18S rRNA gene sequence”, J.

Agric. Food Chem., 56, pp. 3953–3959.