tom 51, 2002 numer 3 (256) strony 319–330kosmos.icm.edu.pl/pdf/2002/319.pdf · plazmidy, czyli...

GRA¯YNA JAGURA-BURDZY

Zak³ad Biochemii Drobnoustrojów

Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

Pawiñskiego 5a, 02-106 Warszawa

[email protected]

ROLA REGULACJI EKSPRESJI GENÓW W STABILNOŒCI PLAZMIDÓW

Plazmidy, czyli niezale¿nie replikuj¹ce siêpozachromosomalne elementy genetyczneenetyczne wystêpuj¹ w Archea, Eubacteria iEukaryota. Najlepiej poznano biologiê plazmi-dów u bakterii i tej grupie poœwiêcone bêd¹ ni-niejsze rozwa¿ania. Plazmidy, zgodnie z przy-jêt¹ definicj¹, nie s¹ niezbêdne komórce gospo-darza do przetrwania ale czêsto zwiêkszaj¹jego zdolnoœci adaptacyjne do zmieniaj¹cychsiê warunków œrodowiska. Ekspresja informa-cji genetycznej, któr¹ nios¹ (stanowi¹ca niejed-nokrotnie kilkanaœcie % informacji komórki)mo¿e prowadziæ do obci¹¿enia metabolizmu wtakim stopniu, ¿e zmniejszy szansê gospodarzaw konkurencji z komórkami bezplazmidowy-mi. Regulacja ekspresji genów plazmidowychdecyduje wiêc o sukcesie w rozprzestrzenia-niu siê zarówno w linii pionowej (z pokoleniana pokolenie, ang. vertical inheritance), jak ihoryzontalnie (poprzez „infekcjê” nowych ko-mórek, ang. horizontal transfer).

Mówi¹c o plazmidach zwykle wymieniamycechy fenotypowe o jakie wzbogacaj¹ gospoda-rza: opornoœci na antybiotyki czy metale ciê-¿kie, zdolnoœæ rozk³adu zwi¹zków organicz-nych, wykorzystanie ró¿nych zwi¹zków wêgla,opornoœci na UV itp. Dla biologii plazmidównajistotniejsze s¹ jednak operony odpowiedzial-ne za replikacjê i mechanizmy stabilnego dzie-dziczenia stanowi¹ce tzw. szkielet genetyczny

(ang. backbone). Dla wiêkszych plazmidów jestto tak¿e zdolnoœæ zasiedlania nowych gospoda-rzy w wyniku transferu koniugacyjnego (pla-zmidy mobilizowalne czy koniugacyjne). Bada-nia nad transkryptomem plazmidów IncP-1(Thomas, dane nieopublikowane) wskazuj¹, ¿espoœród oko³o 60 genów plazmidu RK2 wysokipoziom ekspresji charakteryzuje jedynie opero-ny opornoœci na antybiotyki. Byæ mo¿e jest toregu³a dla genów warunkuj¹cych wymierne ko-rzyœci adaptacyjne, a byæ mo¿e jest oznak¹ nie-dawnego w³¹czenia tych genów do wyciszone-go na drodze ewolucji t³a genetycznego, jakimjest szkielet plazmidowego genomu.

Promotory operonów odpowiedzialnychza replikacjê, stabilne utrzymywanie w komór-kach czy transfer horyzontalny w przewa-¿aj¹cej czêœci nale¿¹ do bardzo silnych sy-gna³ów transkrypcyjnych, z których ekspresjarzadko zachodzi konstytutywnie. Podlegaj¹one regulacji negatywnej, zapewniaj¹c w tensposób potencjaln¹ mo¿liwoœæ wysokiego po-ziomu ekspresji genom plazmidowym. Mo¿li-woœæ, która przez wiêkszoœæ cyklu ¿yciowegoplazmidu jest jednak niewykorzystana. Induk-cja ekspresji operonów jest rzadko u¿ywanymmechanizmem regulacji transkrypcji, najlepiejpoznane przyk³ady dotycz¹ indukcji systemówtransferu koniugacyjnego i jeden z przyk³adówbêdzie omówiony szczegó³owo.

REGULACJA PROCESU REPLIKACJI

Celem kontroli procesu replikacji plazmi-du jest utrzymywanie œcis³ej liczby kopii, opty-

malnej dla okreœlonej wielkoœci plazmidu tak,aby z jednej strony nie obni¿yæ zdolnoœci prze-

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 319–330

¿ycia gospodarza (ang. fitness) a z drugiej stro-ny zabezpieczyæ przekazanie w czasie podzia³ubakterii chocia¿ jednej kopii plazmidu ka¿dejkomórce potomnej (DEL SOLAR i wspó³aut.1998)

Plazmidy wykorzystuj¹ do powielania siê„fabryki replikacyjne” gospodarza. Sygna³ roz-poczêcia replikacji w oriV (ang. origin — punktstartu) plazmidu jest jednak zale¿ny od specy-ficznego Inicjatora kodowanego przez sam pla-zmid: mo¿e to byæ bia³ko (zwane najczêœciejRep) lub inicjatorowe RNA (np. RNA II w pla-zmidach typu ColE1). Generalnie kontrola ilo-œci kopii plazmidu przebiega na etapie inicjacjireplikacji poprzez obni¿anie ekspresji genurep (ESPINOZA i wspó³aut. 2000). Najprostszynegatywny mechanizm regulacyjny to auto-genna represja. Wyjœciowo wysoki poziom eks-presji ( po podziale komórki i spadku iloœci ko-pii plazmidu czy przejœciu genomu plazmido-wego do biorcy w czasie koniugacji) jest repry-mowany w miarê przybywania produktu, czylibia³ka Rep. Dla wielu plazmidów wykazano, ¿ebia³ko Rep przyjmuje dwie formy: w postacimonomeru wi¹¿e siê do powtórzonych se-kwencji w oriV zwanych iteronami, aktywujeoriV powoduj¹c „topnienie” dwuniciowejstruktury DNA i inicjuje replikacjê, natomiastw postaci dimeru wi¹¿e siê do operatora w re-gionie w³asnego promotora i blokuje tran-skrypcjê (Ryc. 1) (CHATTORAJ 2000). W niektó-

rych plazmidach lokalizacja iteronów oriV wregionie promotora rep umo¿liwia pe³nienieró¿nych funkcji przez tê sam¹ formê bia³ka Repw zale¿noœci od stê¿enia Rep. Co wiêcej, samproces replikacji mo¿e indukowaæ produkcjêbia³ka Rep i nowe wydarzenia inicjacyjne po-przez usuwanie represora Rep z miejsc opera-torowych (profag P1) (MUKHOPADHYAY iCHATTORAJ 2000).

Inny mechanizm regulacji ekspresji genurep równie czêsto wykorzystywany przez pla-zmidy oparty jest na powstawaniu antysensow-nego RNA, które poprzez oddzia³ywanie zmRNArep obni¿a jego trwa³oœæ, powoduje ate-nuacjê, maskuje sygna³y translacyjne lub zwiêk-sza powinowactwo dodatkowych elementówregulacyjnych np. bia³ek represorowych(WAGNER i SIMONS 1994, FRANCH i GERDES2000). Regulatorowe, antysensowne RNA jestwysoce labilne, jego stê¿enie jest wiêc œciœleproporcjonalne do iloœci kopii plazmidu. Spa-dek iloœci kopii plazmidu, a tym samym regula-torowego RNA, prowadzi do wzmo¿onej synte-zy inicjatora. Najlepiej poznany system replika-cji plazmidów typu ColE1, w których inicjacjareplikacji regulowana jest przez antysensowneRNA (RNA I) nie zale¿y od bia³ka inicjatorowe-go Rep: inicjatorem replikacji jest tu transkrypttzw. RNA II. Jego prawid³owe zwiniêcie siê i od-dzia³ywanie z DNA w regionie oriV jest sy-gna³em do wkroczenia RNazyH i PolI DNA orazrozpoczêcia replikacji plazmidu. Tworzeniedwuniciowych struktur miêdzy RNA II i kom-plementarnym do niego RNA I uniemo¿liwiatworzenie hybrydu RNAII-DNA i blokuje repli-kacjê.

Negatywna kontrola oparta na dzia³aniu re-presorów, produktów niezale¿nych operonówwydaje siê najrzadziej stosowanym sposobemregulacji ekspresji genu rep. W takich przypad-

kach sensorem iloœci kopii plazmidu staje siêelement niezale¿ny od samego procesu repli-kacji. Interesuj¹cym przyk³adem s¹ tu plazmidyIncP-1, w których ekspresja genu trfA (czylirep) jest regulowana przez przynajmniej trzyglobalne represory KorA, IncC i KorB, produk-ty tzw centralnego operonu kontroli korAincC-

korB (PANSEGRAU i wspó³aut. 1994).

320 GRA¯YNA JAGURA-BURDZY

Ryc. 1. Autogenna regulacja genu rep.

Bia³ko Rep w postaci monomeru wi¹¿e siê z iteronami (powtórzone miejsca wi¹zania Rep) w regionie oriV i ini-

cjuje replikacjê. W postaci dimeru rozpoznaje operator w regionie w³asnego promotora i blokuje transkrypcjê.

Rozwój badañ nad replikacj¹ plazmidówwyraŸnie wskazuje, ¿e proste mechanizmykontroli, chocia¿ skuteczne, ustêpuj¹ miejscakombinacji ró¿nych mechanizmów: autogen-

nej regulacji i regulacji przy udziale antysen-sownego RNA czy antysensownego RNA i do-datkowych bia³ek represorowych (DEL SOLAR iESPINOZA 2000).

REGULACJA EKSPRESJI OPERONÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA STABILNE DZIEDZICZENIEPLAZMIDÓW

Plazmidy rozprzestrzeniaj¹ siê czynnie wpopulacji gospodarza dwoma sposobami: prze-kazywane s¹ do potomstwa w czasie podzia³ukomórki albo na drodze koniugacji/mobilizacji„infekuj¹” bezplazmidowego dotychczas bior-cê. Replikacja zapewnia w³aœciw¹ iloœæ kopiiplazmidu na komórkê zwiêkszaj¹c szansê prze-trwania, a kodowane przez plazmidy systemymrs (ang. multimer resolution systems) maksy-malizuj¹ iloœæ kopii separuj¹c powstaj¹ce dime-ry/multimery. Podczas gdy ma³e plazmidy o du-¿ej iloœci kopii bazuj¹ na losowej segregacjicz¹steczek do komórek potomnych, du¿e pla-zmidy o niskiej liczbie kopii (1–2 na komórkê)aktywnie pomagaj¹ losowi stosuj¹c powszech-nie dwa mechanizmy: aktywnego rozdzia³u(ang. active aprtitioning) i niszczenia w popula-cji tych bakterii, które przypadkowo straci³yplazmid (ang. postsegregational killing, psk)(GERDES i wspó³aut. 2000a). Genomika plazmi-dów dostarcza dowodów na „mobilnoœæ” tychmechanizmów miêdzy ró¿nymi plazmidami.Jest to mo¿liwe m.in. dziêki temu, ¿e s¹ kodowa-ne przez zamkniête, samoregulowalne jednost-ki transkrypcyjne, nazywane czêsto „kasetami”.

Systemy aktywnego rozdzia³u to operonysk³adaj¹ce siê najczêœciej z dwóch genów parA iparB i z miejsca centromero-podobnego parS

(przez analogiê do systemów eukariotycznych)(GERDES i wspó³aut. 2000b). W uproszczeniuaktywny rozdzia³ przebiega nastêpuj¹co: bia³kotypu B rozpoznaje i wi¹¿e parS, tworzy pary pla-zmidów, które nastêpnie s¹ aktywnie separowa-ne przy udziale aktywnoœci ATPazowej bia³kaParA i cz¹steczki plazmidów kierowane s¹ doprzeciwnych biegunów komórki w czasie jejpodzia³u. Istniej¹ dwa g³ówne typy systemówaktywnego rozdzia³u oparte na budowie bia³ko-wych sk³adników, lokalizacji centromeru i regu-lacji ekspresji. W przypadku pierwszym iloœæbia³ka typu ParA (ATPaza z motywami Walkera)jest limitowana (tak samo jak bia³ka ParB).Bia³ko ParA jest autogennym represorem ope-ronu parAparB i w tej funkcji jest wspomaganeprzez ParB lub bia³ko ParB jest autorepresoremwi¹¿¹c siê do centromeru w rejonie promotorai w tej funkcji wspomagane jest przez ParA (Ryc.2A, B). Zaburzenia relatywnych iloœci obu sk³ad-ników prowadz¹ do gwa³townej utraty (destabi-lizacji) plazmidu. W przypadku plazmidu R1

Rola regulacji ekspresji genów w stabilnoœci plazmidów 321

Ryc. 2. Autoregulacja operonów aktywnego rozdzia³u.

Dwa modele autoregulacji s¹ przedstawione schematycznie: (A) g³ównym represorem jest ParA a ParB stabilizu-je kompleksy ParA-DNA, centromer (miejsce oddzia³ywania ParB z DNA) wystêpuje bezpoœrednio za operonemlub w odleg³ych miejscach; (B) lokalizacja centromeru pokrywa siê z promotorem operonu parAB i dziêki temuParB pe³ni równoczeœnie dwie funkcje — autorepresora i bia³ka podzia³owego.

(typ II) funkcjê autorepresora pe³ni bia³ko ParR(homolog ParB), którego iloœæ w komórce wy-nosi oko³o 1000 cz¹steczek. Nie jest to skutecz-na autorepresja poniewa¿ poziom pierwszegoproduktu operonu ParM (aktynopodobnej AT-Pazy) wynosi oko³o 15000 monomerów(MOLLER-JENSEN i wspó³aut. 2002). Ró¿nice wekspresji obydwu genów wynikaj¹ z inhibicjitranslacji parB z policistronowego mRNA (ang.translation coupling). ParM oddzia³ywuje zkompleksem parS-ParR i polimeryzuj¹c tworzydynamicznie aktywne d³ugie struktury sepa-ruj¹ce przestrzennie cz¹steczki plazmidu dobiegunów- jest to pierwszy przyk³ad analogawrzeciona podzia³owego u bakterii. Z punktuwidzenia regulacyjnego jest to te¿ wyj¹tek odklasycznej regu³y „wyciszania” ekspresji genówplazmidowych.

Systemy posegregacyjnego zabijania psk,mimo swojej ró¿norodnoœci i wyspecjalizowa-

nia w dzia³aniu na ró¿ne „cele” w komórce, ba-zuj¹ na ró¿nicach w stabilnoœci toksyny i od-trutki (GERDES i wspó³aut. 2000a). W opero-nach psk, które koduj¹ dwa bia³kowe sk³adnikialbo sama odtrutka albo w kompleksie z tru-cizn¹ odpowiada za autoregulacjê. W niektó-rych plazmidach jak np. pSM19035 z grupyinc18 w operonie trucizny (�) i odtrutki (�) po-jawia siê niezale¿ny regulator omega, sk³adniktego samego operonu (�-�-�), który pe³ni funk-cjê autorepresora (Ryc. 3) (DE LA HOZ iwspó³aut. 2000). W systemach gdzie odtrutk¹jest antysensowne niestabilne RNA (np.hok/sok w plazmidzie R1) transkrypcja zacho-dzi konstytutywnie, a regulacja ekspresji jestposttranskrypcyjna. Mechanizm hok/sok by³pierwszym szczegó³owo poznanym mechani-zmem potranskrypcyjnej regulacji ekspresjigenów przy zastosowaniu antysensownegoRNA (THISTED i wspó³aut. 1995).

REGULACJA EKSPRESJI OPERONÓW TRANSFERU KONIUGACYJNEGO

Transfer koniugacyjny plazmidów jest jed-nym z najistotniejszych procesów w horyzon-talnym rozprzestrzenianiu siê genów w biosfe-rze (ZECHNER i wspólaut. 2000). Generalnieproces koniugacji sk³ada siê z dwóch etapów:

(i) przygotowania DNA plazmidu do trans-feru tzw funkcje Dtr (ang. DNA transfer and re-plication);

(ii) zbudowania mostu koniugacyjnegomiêdzy biorc¹ i dawc¹ (agregaty koniugacyjneu bakterii Gram dodatnich czy kontakt przyudziale pilusa u bakterii Gram-ujemnych) czylifunkcje Mpf (ang. mating pair formation).

Kompleksy bia³kowe bior¹ce udzia³ w tychdwóch etapach s¹ kodowane w du¿ych jed-nostkach transkrypcyjnych, przestrzennie roz-dzielonych. Podczas gdy funkcje Dtr s¹ plazmi-dowo-specyficzne (kompleks relaksazy rozpo-znaje i nacina jedn¹ niæ tylko w oriT w³asnegoplazmidu), funkcje Mpf plazmidów z bakteriiGram-ujemnych czêsto wykorzystywane s¹ dotransportu przez inne plazmidy obecne w ko-mórce bakterii (plazmidy mobilizowalne).Funkcje Dtr razem z Mpf zajmuj¹ od 20–40kb,stanowi¹ oko³o 50% informacji genetycznejplazmidów koniugacyjnych, nic wiêc dziwne-go, ¿e ich ekspresja musi byæ œciœle kontrolo-wana.

Wœród plazmidów koniugacyjnych rozró¿-niamy takie, które czekaj¹ na sygna³ do koniu-gacji utrzymuj¹c funkcje Dtr/Mpf w stanie

„utajnionym” i takie, które s¹ w ci¹g³ej gotowo-œci do transferu chocia¿ jest to gotowoœæ na mi-nimalnym poziomie (ZATYKA i THOMAS 1998).Najlepiej poznanym (i najwczeœniej odkrytym)jest system koniugacyjny plazmidu F (i plazmi-dów pochodnych R1 czy R100) zakodowany woko³o 40 genach regionu tra. Oko³o po³owabia³ek Tra uczestniczy w syntezie piliny i budo-wie F-pilusa. Region tra znajduje siê za oriT isk³ada siê z trzech jednostek transkrypcyjnych,dwóch mono traM, traJ i jednego multicistro-nowego operonu traY. TraJ jest aktywatorempromotora traY. Ekspresja traJp jest z kolei mo-dulowana przez mRNAfinP (antysensowneRNA, negatywny efektor translacji TraJ) ibia³ko FinO, produkt ostatniego genu operonutraY (stabilizator dupleksu mRNAfinP-m-RNAtraJ). Dzia³anie FinOP (ang. fertility inhi-bition) skutecznie wy³¹cza gen traJ i tym sa-mym operon traY, jedynie oko³o 0.1% komó-rek w populacji gospodarza R1 czy R100 jestzdolna do transferu. Dziêki mutacji insercyjnejIS3 w genie finO prowadz¹cej do czêœciowejderepresji traJp populacja gospodarza plazmi-du F jest w 100% zdolna do transferu i to sprzy-ja³o odkryciu zjawiska koniugacji u bakterii iskorelowania go z wystêpowaniem plazmidu F(LEDERBERG i TATUM 1946).

Plazmidy IncP-1 s¹ plazmidami o bardzoszerokim spektrum gospodarzy — mog¹ siê re-plikowaæ i stabilnie utrzymywaæ we wszyst-


kich badanych bakteriach Gram-ujemnych(PANSEGRAU i wspó³aut. 1994). Ich system ko-niugacyjny ma jeszcze szerszy zasiêg: plazmidyIncP-1 mog¹ byæ przenoszone koniugacyjniedo bakterii Gram-dodatnich i komórek euka-riotycznych (HEINEMANN i SPRAGUE 1989).Funkcje Dtr zakodowane s¹ w regionie tra

(Tra1) w dwóch jednostkach transkrypcyjnychtraJIHGFEDCBA i traKLM, których przeciwnie

skierowane promotory obejmuj¹ oriT (miejsceinicjacji transferu koniugacyjnego). Kompleksrelaksazy TraJ/TraI/TraK wi¹¿¹c siê do oriT iwprowadzaj¹c jednoniciowe naciêcie jedno-czeœnie pe³ni funkcjê autoregulatora obydwupromotorów. Drugi multicistronowy operontrb (Tra2) koduje funkcje Mpf. Produktempierwszego genu tego operonu — trbA jestbia³ko represorowe, które jest g³ównym regula-


Ryc. 4. Regulacja ekspresji operonów transferu koniugacyjnego w plazmidzie pTiC58 z A. tumefa-

ciens.

OccR i TraR s¹ aktywatorami transkrypcji, do swojej funkcji wymagaj¹ niskocz¹steczkowych kofaktorów — spe-cyficznych opin, produktu uszkodzonych komórek roœlinnych (OccR) i pochodnej laktonu homoseryny AAI(TraR). Ekspresja traR jest zale¿na od kompleksu OccR-opiny. Autoinduktor AAI jest produktem syntazy TraI. Ni-ski poziom podstawowy AAI jest niewystarczaj¹cy do aktywacji TraR ale wzrasta wraz ze wzrostem liczby komó-rek-dawców (gêstoœci¹ populacji). Przekroczenie poziomu progowego indukuje kaskadê wydarzeñ transkrypcyj-nych poprzez autoindukcjê traI i traR. Wi¹zanie TraR-AAI w regionie promotora traItrb indukuje transkrypcjêrównie¿ z przeciwnie skierowanego promotora operonu repABC odpowiedzialnego za replikacjê wegetatywn¹ iaktywny rozdzia³ plazmidów.

Ryc. 3. Regulon Omega w plazmidzie pSM19035 (inc18).

Represor Omega (�) rozpoznaje krótkie sekwencje nukleotydów wystepuj¹ce jako bezpoœrednie lub odwróco-ne powtórzenia w promotorach copS (determinuj¹cego iloœæ kopii plazmidu), �, koduj¹cego homolog ParA i�-�-� koduj¹cego system stabilizacyjny typu psk.

torem promotorów tra i trb (ZATYKA iwspó³aut.1994). Ekspresja operonu trb jest re-gulowana tak¿e przez globalny regulator KorB(nastêpny rozdzia³) dziêki temu ekspresja ope-ronów transferu koniugacyjnego jest sprzê-¿ona z ekspresj¹ pozosta³ych operonów pla-zmidu. Gospodarze plazmidów IncP-1 s¹ wci¹g³ej gotowoœci do transferu koniugacyjne-go. Synteza piliny i zbudowanie pilusa zacho-dzi natychmiast po zasiedleniu nowego gospo-darza. Jedna z nici DNA w obrêbie oriT plazmi-du jest naciêta i tylko oddzia³ywanie relaksazy zoriT zapobiega relaksacji cz¹steczki DNA. Kon-takt z potencjalnym biorc¹ jest wiêc natych-miast uwieñczony rozpoczêciem replikacji ko-niugacyjnej i transferem jednej nici do biorcy.

Inny bardzo ciekawy system koniugacyjny,o którym nale¿a³oby wspomnieæ jest reprezen-towany przez plazmidy Ti z Agrobacterium tu-

mefaciens (ZECHNER i wspó³aut. 2000). Plazmi-dy Ti koduj¹ dwa systemy koniugacyjne: pierw-szy, sk³adaj¹cy siê z kilku multicistronowychoperonów vir umo¿liwiaj¹cy transfer oko³o20kb T-DNA do komórek roœlinnych i drugi,czterooperonowy tra/trb odpowiedzialny zakoniugacjê miêdzy komórkami bakterii. Do in-dukcji ekspresji operonów virA,virB,virD ivirG potrzebne s¹ sygna³y z uszkodzonych ko-mórek roœlinnych. Aktywacja ekspresji regulo-nu vir zale¿y od VirA i VirG, bia³ek nale¿¹cychdo dwu sk³adnikowego systemu regulacyjne-go. Do ekspresji genów tra/trb wymagana jestkombinacja sygna³ów z komórek roœlinnych i

informacji o gêstoœci populacji dawcy (ang. qu-orum sensing). Pierwszym genem dwunasto-genowego operonu trb jest traI koduj¹cy syn-tazê autoinduktora AAI (ang. N-3-oxo-o-canoyl-L-homoserine lactone) (Ryc. 4). Autoin-duktor AAI jest kofaktorem bia³ka TraR, akty-watora transkrypcji operonów traAFB, tra-

CDG, traM, trb i occ. Indukcja ekspresji tra/trb

przebiega dwu etapowo: specyficzne opinyprodukowane przez uszkodzone komórki ro-œlinne w po³¹czeniu z bia³kami regulatorowy-mi (np. OccR w pTiR10) aktywuj¹ transkrypcjêoperonu occ i produkcjê TraR (traR ostatni genoperonu occ). Niski podstawowy poziom syn-tezy induktora AAI przez TraI jest jednak nie-wystarczaj¹cy do aktywacji TraR, dopierowzrost gêstoœci populacji dawcy i addytywnyefekt induktora AAI jest w stanie zmieniæ kon-formacjê bia³ka TraR na aktywator transkryp-cyjny m.in. dla w³asnego operonu a tak¿e ope-ronu trb i tym samym traI.

System koniugacyjny indukowany nie gê-stoœci¹ populacji dawcy, ale obecnoœci¹ w od-powiednim stê¿eniu potencjalnych biorcówreprezentuj¹ plazmidy z bakterii Enterococcus

faecalis np. pAD1 czy pCF10. Bakterie wydzie-laj¹ niskocz¹steczkowe feromony specyficznew stosunku do okreœlonego dawcy (gospoda-rza plazmidu), które osi¹gaj¹c progowe stê¿e-nie indukuj¹ syntezê substancji agregacyjnej udawcy i ekspresjê operonów koniugacyjnychtego plazmidu. Bez obecnoœci feromonu ope-rony te podlegaj¹ œcis³ej negatywnej kontroli.

GLOBALNA REGULACJA — SYSTEMY KOORDYNUJ¥CE WSZYSTKIE PROCESY ¯YCIOWEPLAZMIDU

W cyklu ¿yciowym plazmidu poszczególneprocesy wymagaj¹ sekwencji wydarzeñ tran-skrypcyjno-translacyjnych czyli derepresji ko-lejnych operonów. Najwa¿niejszym jednakaspektem regulacyjnym wydaje siê byæ skoor-dynowana represja wszystkich funkcji plazmi-dowych tak, aby gospodarz nie przegra³ walki oprze¿ycie i umo¿liwi³ plazmidom dalsze roz-przestrzenianie siê w populacji. Koordynacjaró¿nych funkcji plazmidu mo¿e byæ wynikiemorganizacji genów w operony np. w plazmi-dach typu RepABC autoregulowane operonyrepABC, które koduj¹ bia³ko RepC (niezbêdnedo inicjacji replikacjji) koduj¹ równie¿ dwabia³ka odpowiedzialne za aktywny rozdzia³ ko-pii plazmidu do komórek potomnych: RepAB(RAMIREZ-ROMERO i wspólaut. 2000). Innym

przyk³adem organizacji przestrzenneju³atwiaj¹cej koordynacjê ekspresji jest wystê-powanie regionów promotorowych ini-cjuj¹cych transkrypcjê w przeciwnych kierun-kach (ang. divergent promoters) ze wspólnymimiejscami wi¹zania dla efektorów. Takie pro-motory najczêœciej wystêpuj¹ miêdzy operona-mi uczestnicz¹cymi w tym samym procesie(operony Dtr w plazmidach IncP-1 czy IncN)(ZECHNER i wspó³aut. 2000), ale równie¿ miê-dzy operonami np replikacji wegetatywnej ioperonami transferu koniugacyjnego (pTi58,IncP-1 czy IncP-9) (LI i FARRAND 2000,JAGURA-BURDZY i THOMAS 1994, GREATED iwspó³aut. 2000). Tutaj ciekawym przyk³ademmo¿e byæ wspomniany ju¿ plazmid pTiC58(Ryc. 4), w którym indukcja za pomoc¹ sy-


gna³ów z uszkodzonych komórek roœlinnych,w po³¹czeniu z sygna³em gêstoœci populacji ko-mórek z plazmidem, indukuje system transferukoniugacyjnego (LI i FARRAND 2000). Kom-pleks TraR-AAI wi¹¿¹c siê w regionie przeciw-nie skierowanych promotorów trb i repABC in-dukuje równie¿ operon aktywnego rozdzia³u ireplikacji wegetatywnej plazmidu.

Plazmidy IncP-1 przez wiele lat reprezen-towa³y jedyny w swoim rodzaju majstersztykregulacyjny (PANSEGRAU i wspó³aut. 1994,THORSTED i wspó³aut. 1998). Ich system regu-lacyjny charakteryzuje siê ogromn¹ z³o¿ono-œci¹. Niew¹tpliwie najbardziej uderzaj¹c¹cech¹ tego systemu jest istnienie centralnegooperonu kontroli korAB(FG)incC (ang.cco-central control operon) koduj¹cego trzyglobalne bia³ka regulatorowe: KorA, KorB iIncC (spoœród piêciu do tej pory dok³adniescharakteryzowanych w plazmidach IncP-1)(Ryc. 5). Bia³ka te determinuj¹ istnienie tzwregulonów — grup operonów kontrolowa-nych przez ten sam globalny regulator. Dodat-kowo wiele operonów na plazmidzie podlegaautogennej represji. Istnienie regulonównak³adaj¹cych siê na siebie i na lokalne obwo-dy autoregulacyjne sprawia, ¿e ka¿dy promo-tor jest reprymowany przez przynajmniej dwarepresory a niektóre z nich jak trfAp czy kfrAp

przez piêæ czy szeœæ (Ryc. 6). Zachodz¹ce nasiebie sytemy regulacyjne (ang. multivalentregulatory network) zapewniaj¹ bardzo œcis³¹kontrolê promotorów, które zwykle maj¹ se-kwencje zbli¿one do consensus i bardzo wyso-ki poziom ekspresji. Istnienie takichnak³adaj¹cych siê obwodów regulacyjnych toz pewnoœci¹ doskona³y mechanizm bufo-ruj¹cy — uszkodzenie jednego z nich nie pro-wadzi do „ucieczki” promotora spod kontroli.Wreszcie wiele spoœród regulatorów wydajesiê dzia³aæ kooperacyjnie: niezale¿niedzia³aj¹c obni¿aj¹ poziom ekspresji promoto-ra kilka razy a dzia³aj¹c wspólnie nawet kilka-set razy. Przez wiele lat uwa¿ano, ¿e posiada-nie przez IncP-1 tak silnych promotorów (nie-klonowalnych w nieobecnoœci represorów)jest niezbêdnym warunkiem ekspresji opero-nów w ró¿nych gospodarzach — jak wspo-mniano plazmidy IncP-1 mog¹ siê replikowaæwe wszystkich bakteriach Gram-ujemnych.Byæ mo¿e jest to prawd¹, ale badania ekspresjigenów plazmidowych w rozmaitych gospoda-rzach nie wykaza³y a¿ tak wielkich ró¿nic wpowinowactwie RNA polimeraz do sekwencjitych promotorów.

W przypadku najlepiej zbadanego systemuregulacyjnego plazmidu RK2 (IncP-1�) global-ny regulator KorC (85 aminokwasów, aa) kon-troluje ekspresjê trzech operonów uczest-nicz¹cych w stabilizacji plazmidu poprzez re-presjê promotorów: klcA, kleA i kleC (Ryc. 5).Sekwencja palindromowa rozpoznawanaprzez KorC (OC) 5’TAGGGCATAATGCCCTA3’pokrywa siê z sekwencj¹ –10 promotorów iKorC jest dla tych promotorów nadrzêdnymrepresorem.

KorA (101aa) reguluje siedem operonówm.in. trzy regulowane przez KorC a tak¿e inneodpowiedzialne za stabilne dziedziczenie kla-

ABC, kfrAupf54.8upf54.4, korABincCkorFG iwegetatywn¹ replikacjê (ssbtrfA). KorA rozpo-znaje palindrom (OA) 5’TTTAGCTAAA3’, któryalbo zachodzi na sekwencjê –10 promotorów(klaAp, korAp i trfAp) albo poprzedza sekwen-cjê –35 (klcAp, kleAp, kleCp, kfrAp). W pierw-szej grupie promotorów „bezb³êdny” palin-drom jest 12 nukleotydowy, powiêkszony oskrajne 5’G i 3’C. W przypadku OA wystê-puj¹cych w pobli¿u –35 tylko w kfrAp jest 12nukleotydowy palindrom ale z wewnêtrznymb³êdem (ang. mismatch). Badania hierarchiiwi¹zania KorA do operatorów wykaza³y 10-kr-otne wiêksze powinowactwo bia³ka do 12 per-fekcyjnego palindromu ni¿ do 10 nukleotydo-wego lub 12 z „b³êdem” (JAGURA-BURDZY iTHOMAS 1995). Badania te wykaza³y równie¿,¿e dodatkowe sekwencje poprzedzaj¹ce palin-drom moduluj¹ powinowactwo represora. Po-dzielono wiêc miejsca OA na dwie klasy w zale-¿noœci od si³y wi¹zania KorA. Odzia³ywuj¹c zklas¹ pierwsz¹ OA (wi¹zanie w obrêbie consen-sus –10) KorA jest g³ównym represorem dla da-nego promotora, oddzia³ywania z klas¹ drug¹s¹ s³absze i dla takich promotorów KorA jestdrugorzêdnym represorem. Poniewa¿ stê¿enieKorA w komórkach podlega fluktuacjom takahierarchia wi¹zania zapewnia hierarchiê re-presji/derepresji poszczególnych operonów.Unikalna i interesuj¹ca jest funkcja KorA w re-gionie pomiêdzy operonami ssbtrfA (wegeta-tywna replikacja) a trb (transfer koniugacyjny— funkcje Mpf) (JAGURA-BURDZY i THOMAS1994). Wi¹¿¹c siê do pojedynczego operatoraOA pomiêdzy przeciwnie skierowanymi za-chodz¹cymi na siebie promotorami trfAp itrbAp (ang. face to face divergent promoters)KorA hamuje wegetatywn¹ replikacjê i jedno-czeœnie podnosi poziom ekspresji trbA ko-duj¹cego represor wszystkich operonów ko-niugacyjnych. Nie dzia³a jednak jako bezpo-


œredni aktywator transkrypcji trbAp tylko po-œrednio uniemo¿liwiaj¹c RNAP tworzenieotwartych kompleksów (izomeryzacjê) w se-kwencji –10 trfAp u³atwia cz¹steczkom RNAPpod¹¿aj¹cym po przeciwnej nici od trbAp elon-gacjê w kierunku genu struktury trbA.

TrbA jak wspomniano jest podstawowymrepresorem operonów transferu koniugacyj-nego (ZATYKA i wspó³aut.1994). Bia³ko jest sto-sunkowo ma³e (121 aa) z tego 35 C-koñcowych

aminokwasów jest œciœle zakonserwowanemiêdzy KorA i TrbA. TrbA jako jedyny spoœródglobalnych regulatorów plazmidów IncP-1przez d³ugi czas nie mia³ zidentyfikowanegomiejsca wi¹zania poniewa¿ jego operator OT wprzeciwieñstwie do OA, OC czy OB w ¿adnej zlokalizacji nie jest perfekcyjnym palindromem.Badania w grupie C. M.THOMAS (dane nieopu-blikowane) wykaza³y, ¿e zast¹pienie w plazmi-dzie RK2 palindromu OT z b³êdem przez palin-


Ryc. 5. Centralny operon kontroli plazmidu RK2 (IncP-1�).

KorA jest zakodowane w 5’ koñcu genu incC w innej ramce odczytu. Gen incC koduje dwie ró¿nej d³ugoœci for-my IncC, z których d³u¿sza ma w³aœciwoœci regulatorowe a krótsza jest wystarczaj¹ca do uczestnictwa w aktyw-nym rozdziale kopii plazmidu. korF i korG nie s¹ zakonserwowane w podgrupie IncP-1�, ich rola jako global-nych regulatorów wymaga potwierdzenia. OA i OB reprezentuj¹ miejsca wi¹zania dla KorA i KorB w promotorze.

Ryc. 6. Genom RK2 (IncP-1�) z zaznaczonymi miejscami oddzia³ywañ piêciu globalnych regulatorów:KorA, KorB, IncC, KorC i TrbA.

Na mapie zaznaczono: funkcje replikacji wegetatywnej jako oriV i trfA, determinanty opornoœci na tetracyklinê(TcR), penicylinê (PnR) i kanamycynê (KnR), region par/mrs koduj¹cy system psk i mrs, region par/cco czyli cen-tralny operon kontroli bior¹cy udzia³ w aktywnym rozdziale kopii plazmidu oraz dodatkowe funkcje stabilizacyj-ne — kla, klc i kle.

drom perfekcyjny powoduje kilkusetkrotneobni¿enie zdolnoœci takiego wariantu RK2 dotransferu koniugacyjnego. B³êdy nagromadzo-ne wiêc zosta³y prawdopodobnie celowo nadrodze ewolucji aby utrzymaæ ekspresjê repry-mowanych przez TrbA operonów na stosunko-wo wysokim poziomie. Jednak TrbA nie jest re-presorem daj¹cym odpowiedŸ wszystko albonic, wspó³czynnik represji przy nadprodukcjiTrbA waha siê od 3 do10 razy trudno wiêc by³ozrozumieæ koniecznoœæ obni¿ania i tak s³abejrepresji poprzez nagromadzanie mutacji wmiejscu wi¹zania. Dopiero badania nad ostat-nim na liœcie globalnym regulatorem KorBzdaj¹ siê wyjaœniaæ ten paradoks.

KorB jest najwiêkszym bia³kiem spoœród re-presorów IncP-1, sk³ada siê z 358 aminokwa-sów. Tworzy dimery, tetramery i kompleksywy¿szego rzêdu (WILLIAMS i wspó³aut. 1993).W formie dimerycznej rozpoznaje 13 nukleoty-dowy palindrom OB 5’TTTAGC(G/C)GCTAAA3’,który w niektórych przypadkach zawiera do-datkow¹ parê 5’G-3’C odpowiedzialn¹ za zwiê-kszone powinowactwo KorB (KOSTELIDOU iTHOMAS 2000). OB wystêpuje 12 razy w geno-mie RK2 ale tylko dla 6 miejsc wykazano rolêregulacyjn¹ KorB jako represora transkrypcji.W zale¿noœci od lokalizacji wzglêdem sekwen-cji promotorowych podzielono OB na trzy kla-sy. Klasa pierwsza to miejsca znajduj¹ce siê wpobli¿u sekwencji –35 (trfAp, korAp i klaAp).Promotory te powsta³y prawdopodobniewskutek duplikacji poniewa¿ nie tylko œciœlezakonserwowane s¹ ich istotne czêœci (se-kwencje –35, –10), ale równie¿ lokalizacjamiejsc wi¹zania OA i OB wzglêdem promotora iwzglêdem siebie (33 nukleotydów miêdzy cen-trami symetrii palindromów). Represja tychtrzech promotorów przez KorB okreœlana jako„proksymalna” zachodzi poprzez bezpoœred-nie oddzia³ywanie z RNAP zwi¹zan¹ z promo-torem i jej „uwiêzienie” (ang. RNAP arrest) i niewymaga dimeryzacji KorB ani obecnoœci C-ter-minalnych 100aa. Klasa druga OB to miejscawystêpuj¹ce w pewnym oddaleniu od promo-tora od 100nt poni¿ej miejsca startu transkryp-cji (trbAp) do oko³o 200nt powy¿ej tego miej-sca (kfrAp, kleAp, trbBp). Represja tych promo-torów okreœlana jest mianem „represji na dy-stans” i wymaga obecnoœci domeny dimeryza-cyjnej/tetrameryzacyjnej w KorB (JAGURA-BURDZY i wspó³aut. 1999a). Wreszcie trzeciaklasa to miejsca OB oddalone oko³o 1kb od zna-nego promotora; dotychczas nie wykazano dlanich funkcji regulacyjnej. Spoœród szeœciu

miejsc tej klasy cztery s¹ równomiernie roz-mieszczone w operonach tra i trb, jedno w re-gionie stabilizacyjnym par/mrs i jedno (o suge-rowanej funkcji centromeru, WILLIAMS iwspó³aut. 1998) miêdzy genami o nieznanejfunkcji (upf54.4-upf54.8). Hierarchia wi¹zaniaKorB do operatorów wskazuje najwiêksze po-winowactwo do trfAp, najs³absze do OB z klasytrzeciej. KorB jest znacznie s³abszym represo-rem ni¿ KorA ale ma wiêksze spektrumdzia³ania: reprymuje operony uczestnicz¹ce wwegetatywnej replikacji, transferze koniuga-cyjnym i stabilnym dziedziczeniu. Koordynujewiêc wszystkie procesy ¿yciowe plazmidu. Wa-¿nym aspektem, który nale¿y podkreœliæ jestkooperatywne oddzia³ywanie KorB z innymiglobalnymi regulatorami: KorA i TrbA. Od-dzia³ywania te zale¿¹ od N-koñca KorB i zakon-serwowanego (85% homologii) C-koñca KorA iTrbA (KOSTELIDOU i wspó³aut. 1999, ZATYKA iwspó³aut. 2001). I w³aœnie te oddzia³ywania ko-operacyjne mog¹ odgrywaæ tak istotn¹ rolê wregulacji ekspresji genów: nieznaczne fluktu-acje w poziomie jednego z kooperantów, nie-wielkie zmiany w jego strukturze i w powino-wactwie do operatora s¹ potêgowane w sygna-le koñcowym, kooperacyjnym.

Wi¹zanie KorB do OB jest stabilizowaneobecnoœci¹ innego globalnego regulatora, pro-duktu centralnego operonu kontroli cco:IncC-1, chocia¿ IncC nie wi¹¿e siê do DNA bez-poœrednio (JAGURA-BURDZY i wspó³aut.1999b). IncC i KorB nale¿¹ odpowiednio dorodzin bia³ek ParA i ParB i pe³ni¹ istotn¹ funk-cjê w stabilnym dziedziczeniu plazmidówIncP-1 stanowi¹c ich system aktywnego roz-dzia³u kopii plazmidów do komórek potom-nych (MOTALLEBI- VESHAREH i wspó³aut. 1990).Fakt, ¿e obydwa bia³ka pe³ni¹ jednoczeœnierolê globalnych regulatorów przez wiele lat by³unikalnym wœród plazmidów przyk³adem kon-centracji funkcji (sugerowano równie¿ rolêKorB w przestrzennym upakowaniu DNA).

Ostatnio wykazano, ¿e bia³ko Omega zpSM19035 (bakterie Gram-dodatnie) jest glo-balnym regulatorem funkcji replikacyjnych/ ilo-œci kopii plazmidu (copS), funkcji stabilizacyj-nych (operon posegregacyjnego zabijania:epsi-lon/zeta) i operonu delta i byæ mo¿e jest rów-nie¿ sk³adnikiem aparatu aktywnego rozdzia³u(DE LA HOZ i wspó³aut. 2000) (Ryc. 3). PlazmidyIncP-1 ze swoim z³o¿onym systemem regulacyj-nym nie s¹ wiêc mo¿e wcale unikalne, a koordy-nacja ró¿nych funkcji plazmidu jest zjawiskiembardziej uniwersalnym ni¿ myœlano.


PODSUMOWANIE

Organizacja przestrzenna w du¿e jednost-ki transkrypcyjne zapewnia mo¿liwoœæ koor-dynacji ekspresji genów uczestnicz¹cych wtym samym procesie. U³o¿enie tych jednostektranskrypcyjnych wzglêdem siebie np. z pro-motorami w tym samym regionie ale skiero-wanymi przeciwnie pozwala na zastosowanietego samego elementu regulacyjnego do sko-ordynowanej ekspresji operonów uczest-nicz¹cych w podobnych lub zupe³nie innychprocesach. Autogenna represja zachodz¹ca wmiarê syntezy produktów i utrzymanie eks-presji na niskim, podstawowym poziomie za-pewnia najbardziej ekonomiczne rozwi¹zaniabez potrzeby zewnêtrznych sensorów. Auto-regulacja, chocia¿ wydaje siê najprostsz¹ stra-tegi¹, nie zawsze mo¿e jednak zaspokoiæ wy-magania regulacyjne. W wiêkszoœci plazmi-dów koniugacyjnych (IncP-1, IncQ, IncI1)kompleks relaksazy jest zazwyczaj autoregula-torem operonów Dtr dziêki lokalizacji oriT wregionie promotorowym. Trudniej wyobraziæsobie zachodzenie autoregulacji poprzez ko-ñcowy produkt operonu Mpf (kompleksbia³ek tworz¹cych pilus). Uzasadnione jest tupojawienie siê bia³ek o funkcji regulatorowejkodowanych przez operon mpf (IncP-1, IncF,IncN). Plazmidy IncP-1 id¹ jakby o krok dalejskupiaj¹c geny regulatorowe w jednym opero-nie (autoregulowanym), co wiêcej niektóre zbia³ek represorowych maj¹ do spe³nienia do-datkowe funkcje w biologii plazmidów IncP-1(aktywny rozdzia³ kopii plazmidów do komó-rek potomnych).

Z punktu widzenia ewolucji istnienie re-gulatorowego RNA jest idealnym rozwi¹za-niem: umo¿liwia zachodzenie zmian równo-czeœnie w sekwencji „regulatora” i celu, naktóry ten regulator dzia³a. Szczególnie cennemo¿e to byæ przy zjawisku niezgodnoœci pla-zmidów (kontrola replikacji). Mutacja w anty-

sensownym RNAI w plazmidach typu ColEI torównoczeœnie mutacja w inicjatorowymRNAII tej kopii plazmidu, si³a oddzia³ywañmiêdzy komplementarnymi cz¹steczkamiRNA nie ulegnie zmianie ale zmieni siê si³a od-dzia³ywañ regulatorowego RNAI z pozo-sta³ymi kopiami plazmidu co mo¿e pozwoliæró¿nym wariantom na wspó³istnienie w tej sa-mej komórce gospodarza. Regulacja przyudziale antysensownego RNA ma jeszcze innezalety: jest bardziej czu³a i podlega szybszymzmianom ni¿ regulacja przy udziale bia³ek.Niew¹tpliwie mo¿e byæ mniej dyskrymi-nuj¹ca w wyborze w³aœciwego celu i pewniedlatego wiêkszoœæ systemów opartych na re-gulacji antysensownym RNA zawiera równie¿bia³kowe sk³adniki.

Intryguj¹c¹ cech¹ regulacji ekspresji ge-nów plazmidowych jest osi¹gniêcie wywa-¿onej równowagi (ang. fine tuning) miêdzytym co niezbêdne do przetrwania w gospoda-rzu i tym co mo¿e obni¿yæ zdolnoœæ prze¿yciagospodarza. Plazmidy IncP-1 zdolne do replika-cji i stabilnego dziedziczenia w wielu odmien-nych gatunkach bakterii s¹ tutaj niezast¹pio-nym przyk³adem do perfekcji opanowanejtechniki regulacji ekspresji genów. Istnieniez³o¿onej sieci regulacyjnej, nak³adaj¹cych siêna siebie regulonów koordynuj¹cych wszyst-kie procesy ¿yciowe czy kooperacyjnedzia³anie regulatorów buforuje niespodziewa-ne zmiany œrodowiska.

Wspomniane przyk³ady sprzê¿enia syste-mów koniugacyjnych plazmidów Ti czy pla-zmidów feromono-zale¿nych z obecnoœci¹ po-tencjalnych dawców/biorców czy czynnikamize œrodowiska sygnalizuj¹ istotn¹ now¹ dzie-dzinê badañ nad plazmidami: relacje plazmid aœrodowisko z mo¿liwoœciami manipulacji wprzysz³oœci odpowiedziami plazmidów.

THE ROLE OF REGULATION OF GENE EXPRESSION IN PLASMID STABILITY

S u m m a r y

Plasmid survival relies heavily on the regulation ofgene expression assuring the balance between the ne-cessity of a certain level of plasmid genetic informationbeing expressed and minimalization of the metabolicburden imposed on the host. The most commonly usedregulatory mechanisms are autogenous repression andantisense RNA-mRNA interactions which provide thesystems with economy, simplicity, sensitivity and possi-

bility of rapid response to internal and external changes.IncP-1 plasmids are described in more detail as the

paradigm of a multivalent regulatory network, responsi-ble for tight repression, coordination and fine-tuning ofalmost all plasmid functions and providing simulta-neously a high level of security to plasmid genome.

Appropriate recognition and use of environmen-tal stimuli as very important factors in plasmid biol-


ogy is nicely exhibited by Ti plasmids of Agro- bacterium tumefaciens and pheromone-responsiveplasmids of Enterococcus faecalis.

LITERATURA

CHATTORAJ D. K., 2000. Control of plasmid DNA repli-

cation by iterons: no longer paradoxical. Mol.Microbiol. 37, 467–476.

DE LA HOZ A. B., AYORA S., SITKIEWICZ I., FERNANDEZ S.,PANKIEWICZ R., ALONSO J. C., CEG£OWSKI P., 2000,Plasmid copy-number control and better-than-

random segregation genes of pSM19035 share a

common regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,728–733.

DEL SOLAR G., ESPINOZA M., 2000. Plasmid copy number

control: an ever-growing story. Mol. Microbiol. 37,492–500.

DEL SOLAR G., GIRALDO R., RUIZ-ECHEVARRIA M. J.,ESPINOZA M., DIAZ-OREJAZ R., 1998. Replication and

control of circular bacterial plasmids. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 62, 434–464.

ESPINOZA M., COHEN S., COUTURIER M., DEL SOLAR G.,DIAZ-OREJAZ R., GIRALDO R., JANNIERE L., MILLER, C.,OSBORN M., THOMAS C. M., 2000. Plasmid replica-

tion and copy number control. [W:] The Horizon-

tal Gene Pool. THOMAS C. M. (red.) Amsterdam,Harwood Academic Publishers 1–47.

FRANCH T., GERDES K., 2000. U-turns and regulatory

RNAs. Curr. Opin. Microbiol. 3, 159–164.GERDES K., AYORA S., CANOSA I., CEG£OWSKI P.,

DIAZ-OREJAZ R., FRANCH T., GULTYAEV A. P., BUGGE

JENSEN R., KOBAYASHI I., MACPHERSON C., SUMMERS D.,THOMAS C. M., ZIELENKIEWICZ U., 2000a. Plasmid

maintenance systems. The Horizontal Gene Pool.THOMAS C. M. (red.) Amsterdam, Harwood Acade-mic Publishers, 49–85.

GERDES K., MOLLER-JENSEN J., JENSEN R. B., 2000b. Pla-

smid and chromosome partitioning: surprises

from phylogeny. Mol. Microbiol. 37, 455–466.GREATED A., TITOK M., KRASOWIAK R., FAIRCLOUGH R.,

THOMAS C. M., 2000. The replication and stable in-

heritance functions of IncP-9 plasmid pM3. Micro-biol. 146, 2249–2258.

HEINEMANN J. A., SPRAGUE G. F. Jr., 1989. Bacterial

conjugative plasmids mobilize DNA transfer be-

tween bacteria and yeast. Nature 340, 205–209.JAGURA-BURDZY G., THOMAS C. M., 1994. KorA protein of

promiscuous plasmid RK2 controls a transcriptio-

nal switch between divergent operons for plasmid

replication and conjugative transfer. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91, 10597–10575.

JAGURA-BURDZY G., THOMAS C. M., 1995. Purification of

KorA protein from broad host range plasmid RK2:

definition of a hierarchy of KorA operators. J. Mol.Biol 253, 39–50.

JAGURA-BURDZY G., MACARTNEY D. P., ZATYKA M.,CUNLIFFE L., COOKE D., HUGGINS C., WESTBLADE L.,FARHAT K., THOMAS C. M., 1999a. Repression at a di-

stance by the global regulator KorB of the promi-

scuous IncP plasmids. Mol. Microbiol. 32,519–532.

JAGURA-BURDZY G., KOSTELIDOU K., POLE J., KHARE D.,JONES A., WILLIAMS D. R., THOMAS C. M., 1999b. IncC

of broad-host-range plasmid RK2 modulates KorB

transcriptional repressor activity in vivo and ope-

rator binding in vitro. J. Bacteriol. 181,2807–2815.

KOSTELIDOU K., THOMAS C. M., 2000. The hierarchy of

KorB binding at its twelve binding sites on the

broad host range plasmid RK2 and modulation of

this binding by IncC1 protein. J. Mol. Biol. 295,411–422.

KOSTELIDOU K., JONES A.C., THOMAS C. M., 1999. Conse-

rved C-terminal region of the global regulator

KorA of promiscuous plasmid RK2 is required for

co-operativity between KorA and a second RK2

global regulator, KorB. J. Mol. Biol. 289, 211–221.LEDERBERG J., TATUM E.I., 1946 Gene recombination in

Escherichia coli. Nature 158, 558.LI P.L., FARRAND S.K. 2000. The replicator of the nopali-

ne-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the rep-

ABC family and is influenced by the TraR-depen-

dent quorum-sensing regulatory system. J. Bacte-riol. 182, 179–188.

MOLLER-JENSEN J., BUGGE JENSEN R., LOWE J., GERDES K.2002. Prokaryotic DNA segregation by an actin-

like filament. The EMBO J. 21, 3139–3127.MOTALLEBI-VESHAREH M., ROUCH D. A., THOMAS C. M.,

1990. A family of ATPases involved in active parti-

tioning of diverse bacterial plasmids. Mol. Micro-biol. 4, 1455–1463.

MUKHOPADHYAY S., CHATTORAJ D. K. 2000. Replicatio-

n-induced transcription of an autorepressed gene:

the replication initiator gene of plasmid P1. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97, 7142–7147.

PANSEGRAU W., LANKA E., BARTH P., FIGURSKI D. H.,GUINEY D.G., HAAS D., HELINSKI R. R., SCHWAB H.,STANISICH V. A., THOMAS C. M., 1994. Complete nuc-

leotide sequence of Birmingham IncP� plasmids:

compilation and comparative analysis. J. Mol.Biol. 239, 623–663.

RAMIREZ-ROMERO M. A., SOBERON N., PEREZ-OSEGUERA A.,TELLEZ-SOSA J., CEVALLOS M. A., 2000. Structural ele-

ments required for replication and incompatibili-

ty of the Rhizobium etli symbiotic plasmid. J. Bac-teriol. 182, 3117–3124.

THISTED T., SORENSEN N. S., GERDES K., 1995. Mechanism

of post-segregational killing: secondary structure

analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1

suggests a fold back structure that prevents trans-

lation and antisense RNA binding. J. Mol. Biol.247, 859–873.

THORSTED P. B., MACARTNEY D. P, AKHTAR P., HAINES A. S.,ALI N., DAVIDSON P., STAFFORD T., POCKLINGTON M. J.,PANSEGRAU W., WILKINS B. M., LANKA E., THOMAS C.M., 1998. Complete sequence of the IncP� plasmid

R751: implications for the evolution and organi-


sation of the IncP backbone. J. Mol. Biol. 282,969–990.

WAGNER E. G. H., SIMONS R. W., 1994. Antisense RNA

control in bacteria, phages and plasmids. Annu.Rev. Microbiol. 48, 713–742.

WILLIAMS D. R., MOTALLEBI-VESHAREH M., THOMAS C. M.,1993. Multifunctional repressor KorB can block

transcription by preventing isomerization of RNA

polymerase-promoter complexes. Nucl. Acids Res.21, 1141–1148.

WILLIAMS D. R., MACARTNEY D. P., THOMAS C. M., 1998.The partitioning activity of the RK2 central con-

trol region requires only IncC, KorB and

KorB-binding site OB3 but other KorB-binding si-

tes form destabilizing complexes in the absence of

OB3. Microbiol. 144, 3369–3378.ZATYKA M., JAGURA-BURDZY G.,THOMAS C. M., 1994. Regu-

lation of transfer genes of promiscuous IncP� pla-

smid RK2: repression of Tra1 region transcription

both by relaxosome proteins and by the Tra2 regu-

lator TrbA. Microbiol. 140, 2981–2990.ZATYKA M., THOMAS C. M., 1998.Control of genes for

conjugative transfer of plasmids and other mobi-

le elements. FEMS Microbiol. Rev. 21, 291–319.ZATYKA M., BINGLE L., JONES A. C., THOMAS C. M., 2001.

Cooperativity between KorB and TrbA repressors

of broad-host-range plasmid RK2. J. Bacteriol. 183,1022–1031.

ZECHNER E. L., DE LA CRUZ F., EISENBRANDT R., GRAHN A.M., KORAIMANN G., LANKA E., MUTH G., PANSEGRAU

W., THOMAS C. M., WILKINS B. M., ZATYKA M., 2000.Conjugative- DNA transfer processes. [W:] The Ho-

rizontal Gene Pool. THOMAS C. M. (red.) Amster-dam, Harwood Academic Publishers, 87–174.


tom 51, 2002 numer 3 (256) strony 319–330kosmos.icm.edu.pl/pdf/2002/319.pdf · plazmidy, czyli...

Documents