Title マウスモデルを用いた炎症性腸疾患の新規予防/治療物質及び関連分子の探索( 本文(Fulltext) )

Author(s) 寒川, 祐見

Report No.(DoctoralDegree) 博士(獣医学) 乙第152号

Issue Date 2017-09-22

Type 博士論文

Version ETD

URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/73122

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

マウスモデルを用いた炎症性腸疾患の

新規予防/治療物質及び関連分子の探索

2017 年

岐阜大学大学院連合獣医学研究科

寒川祐見

マウスモデルを用いた炎症性腸疾患の

新規予防/治療物質及び関連分子の探索

寒川祐見

1

目次

序論 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 2

第 1章 マウス DSS 誘発大腸炎モデルを用いた候補物質の評価 ---------------------- 4

諸言 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 5

材料及び方法 ------------------------------------------------------------------------------------- 8

結果 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 14

考察 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 17

小括 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 21

第 2章 AOM/DSS誘発大腸癌モデルを用いた候補物質の評価及び 抗大腸炎/大腸

癌抑制作用の機序解析 --------------------------------------------------------------------------- 22

緒言 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 23

材料及び方法 ------------------------------------------------------------------------------------ 25

結果 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 33

考察 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 37

小括 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 42

第 3 章 マウス大腸炎/大腸癌モデルにおける AKAP13 及び ROCK の発現の検討

--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 44

緒言 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 45

材料及び方法 ------------------------------------------------------------------------------------ 47

結果 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 53

考察 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 56

小括 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 59

第 4章 DSS 誘発大腸炎における ROCK 阻害の影響に関する検討 ------------------ 60

諸言 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 61

材料及び方法 ------------------------------------------------------------------------------------ 62

結果 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 67

考察 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 71

小活 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 74

結論 --------------------------------------------------------------------------------------------------- 75

謝辞 --------------------------------------------------------------------------------------------------- 78

要旨 --------------------------------------------------------------------------------------------------- 79

Abstract ----------------------------------------------------------------------------------------------- 83

引用文献 --------------------------------------------------------------------------------------------- 87

略号一覧 ------------------------------------------------------------------------------------------- 112

図表 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 114

2

序論

炎症性腸疾患 (inflammatory bowel disease, IBD) は再燃と寛解を繰り返す，下痢，

血便及び腹痛等の臨床症状を伴う難治性慢性炎症性疾患であり，厚生労働省指定

難病である (1-2)。IBDの主な病型として潰瘍性大腸炎 (ulcerative colitis, UC) と

クローン病 (Crohn's disease, CD) があり，UC は結腸及び直腸のび漫性潰瘍，CD

は回腸～近位結腸の潰瘍や線維化を伴う肉芽腫性病変が特徴である (3-5)。日本

では特に UC 患者数が増加しており，平成 25年度厚生労働省保健・衛生行政業務

報告では患者数が 166,060 人と報告され，指定難病の中で最も患者数が多い疾患

となっている (6)。

近年の癌研究から，慢性炎症は潜在的な腫瘍誘発因子であることが示されてお

り，炎症が長期間持続する IBD は大腸癌の重大なリスクとして認識されている

(7)。そのため，IBD における炎症反応を抑えることが大腸癌への進展予防に効果

的であると考えられる。このような背景を踏まえて，IBD治療では，抗炎症剤に

よる臨床症状の緩和だけではなく，内視鏡的に粘膜に炎症が認められない「粘膜

治癒」を治療目標とする考え方が提唱され (8)，新たな治療法の開発が進められ

ている。これまでの UC 治療では，UC は原因不明で根本的な治療がないとの考

え方から，日本では基準薬として 5-アミノサリチル酸製剤，補助薬としてステロ

イドや azathioprine，6-mercaptopurine 等の免疫抑制剤が用いられ，併せて血球成

分除去療法等も行われている。さらに，これらの内科的治療が効かない場合には

外科的処置が行われる (6, 9)。近年では，UC を含む IBD が免疫制御機構の異常

による疾患と認識され，tumor necrosis factor-α (TNF-a) やインテグリンに対する

3

抗体医薬が治療に使用されるようになった (10-11)。IBD に対する抗 TNF-a 抗体

は治療効果が高く，世界的に使用が広がっている (6) ものの治療効果は完全では

なく，より有効な治療物質/治療法の開発が必要とされている (12-13)。

そこで，本研究ではマウス大腸炎及び大腸癌モデルを用いて新規 IBD 予防/治

療物質を探索するとともに，IBD治療につながり得る分子機序を明らかにするこ

とを目的とした。第 1章では新規 IBD予防/治療候補物質について，マウス dextran

sulfate sodium (DSS) 誘発大腸炎モデルを用いて候補物質の効果を検証した。また，

cDNA マイクロアレイ解析を行いマウスモデルにおける大腸炎関連分子を探索し

た。第 2章では第 1 章で有効性が認められた物質について，マウス azoxymethane

(AOM)/DSS 誘発大腸癌モデルを用いて大腸癌抑制作用を検証した。さらに，大腸

炎及び大腸癌抑制作用機序を検証するため，同物質の DSS 誘発大腸炎初期におけ

る変化及びヒト大腸癌細胞株の増殖活性への影響を評価した。第 3 章では，第 1

章においてマウス DSS 誘発大腸炎の炎症期において，発現変動が認められた分子

である A-kinase anchor protein 13 (AKAP13) について，マウスを用いた DSS 誘発

大腸炎及び AOM/DSS 誘発大腸癌モデルにおける病態への関与を検討した。加え

て第 4 章では，AKAP13 の下流で機能する Rho-associated coiled-coil containing

protein kinase (ROCK) の阻害が DSS 誘発大腸炎に与える影響を検討した。

4

第 1章

マウス DSS 誘発大腸炎モデルを用いた候補物質の評価

5

諸言

げっ歯類を用いた DSS 誘発大腸炎モデルは，IBDの急性炎症と粘膜損傷の病態

を反映したモデルとして治療薬の開発や病態の機序解析に広く使用されている

(14-16)。本モデルは 1～5%の DSS を飲水投与することでげっ歯類に大腸炎を誘

発するモデルであり (17-20)，5-FU誘発腸炎 (21)，トリニトロベンゼンスルホン

酸 (trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS) 誘発大腸炎 (22)，T細胞移入大腸炎モデル

(23) 等の他の大腸炎モデルと比較して簡便に大腸炎を誘発できることが特徴で

ある。さらに，DSS 誘発大腸炎モデルは急性炎症モデルとしてだけでなく IBDの

慢性炎症を反映したモデルとしても使用できる (24-25) ことや，DSS による大腸

粘膜バリアの破綻に続いて interleukin (IL) -1β (IL-1b)，IL-6及び TNF-a等の炎症

誘発性サイトカイン濃度が炎症局所及び血中において増加する点が IBD に類似

するとされている (26)。そこで，本章では DSS 誘発大腸炎モデルを使用して新

規 IBD予防/治療候補物質の効果を検討した。

これまでの IBD 患者の病態解析から，血小板が IBD の病態に関与することが

明らかになっている (27)。血小板は炎症誘導能を有し，組織損傷と修復の過程に

おいて contact-dependent シグナル (i.e. formation of circulating PLT-leukocyte

complex) によって白血球を誘導/活性化し，外来微生物に対する応答を引き起こ

す (28)。その結果，動員された白血球から放出されるサイトカインによってさら

なる組織傷害が引き起こされる。

これらの炎症の際には，炎症局所における活性酸素種 (reactive oxygen species,

ROS) の産生が亢進する (29-31) だけでなく，ROS からの保護機構であるスーパ

6

ーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase, SOD) 活性と総グルタチオン濃度

が減少することが示されている (29, 32-33)。そのため，ROS に対する機能性食品

の抗酸化作用が疾患予防や健康維持のために注目されている。IBD においても抗

酸化物質は炎症の軽減に有用であると考えられ (34)，他の薬剤と併用することで

より高い治療効果が期待される。例えば，ポリフェノールやフラボノイドのよう

な植物性化学物質の IBD治療への有効性は既に示されており (35)，大腸癌及び乳

癌を含むいくつかの一般的な癌における臨床データも示されている (36)。

これらの背景を踏まえて血小板凝集抑制剤である cilostazol (CZ) と抗酸化物質

である酵素処理イソクエルシトリン (enzymatically modified isoquercitrin, EMIQ)

及び α-リポ酸 (α-lipoic acid, ALA) を新規 IBD 予防/治療候補物質に選定した。CZ

(6［-4 (-1-Cyclohexyl-1H-tetrazol-5-yl) butyloxy］-3，4-dihydroquinolin-2 (1H) -one) は

2-oxo-quinoline誘導体であり，phosphodiesterase (PDE) 3A の阻害によって血小板

の活性化及び凝集を阻害する薬剤である (37-39)。環状ヌクレオチド PDE は，セ

カンドメッセンジャーとして，環状アデノシン一リン酸 (cyclic adenosine

monophosphate, cAMP) 及び環状グアノシン一リン酸の細胞内濃度を調節する酵

素であり，細胞の増殖及び分化等を調節するシグナル伝達カスケードにおいて中

心的役割を果たしている (40)。他の血小板凝集抑制剤は，血小板の機能に関連し

た自然免疫応答が関与する疾患への使用や応用研究が進められているが (28, 40)，

消化器疾患における使用例は少ない。EMIQ は，野菜や果物に含まれるルチンの

酵素的グリコシル化によってから産生される isoquercitrin に 1～複数の糖鎖が付

加されたグリコシル化配糖体である。EMIQ は水溶性であり，quercetin，

isoquercitrin 及び rutin (quercetin-3-O-rutinoside) より吸収性に優れた抗炎症及び抗

7

酸化物質であることが既に示されている (20, 41-43)。EMIQは抗炎症及び抗酸化

作用に加えて，肝臓 (44-47) 及び腎臓 (48-50) において，抗腫瘍効果を有するこ

とも示されていることから，IBD及び続発する大腸癌の予防にも有用であると推

察される。ALAは，5-(1,2-dithiolan-3-yl) pentanoicacid 又は thiocticacid として知ら

れる天然の代謝性抗酸化物質である (51)。細胞内グルタチオン濃度を増加させて

ビタミンC及びビタミンEのような他の生体内抗酸化物質を再生することが知ら

れ (52)，肝臓での抗腫瘍効果も示されている (53)。これまでに，EMIQ 及び ALA

が腫瘍形成抑制を有すること及び薬物処置によって誘発された毒性変化に対し

て酸化ストレスの軽減や抗炎症作用を示すことが肝臓及び腎臓で確認されてい

る (49-50, 54) ものの，これら 2物質の IBD又は IBDモデルである DSS 誘発大腸

炎における有効性は明らかにされていない。興味深いことに，quercetin と ALA

は CZ と同様に血小板の凝集を阻害することが知られている (55-56)。さらに，

quercetin は CZ と同様に PDE3 の活性を阻害することも知られている (57)。そこ

で，これらの多種な物質共通のシグナル伝達及びサイトカインを介して DSS 誘発

大腸炎を予防する可能性があると仮説を立て実験を行った。

8

材料及び方法

被験物質等の由来

EMIQ (純度: > 97%，0.1%の quercetin を含む) は三栄源エフ・エフ・アイ株式

会社 (大阪府豊中市) より供与された。CZ (純度: > 98.0%, 分子量: 369.47, CAS 番

号: 73963-72-1) 及びALA (純度: > 99.0%, 分子量: 206.32, CAS番号: 1077-28-7) を

東京化成工業株式会社 (東京都中央区 ) より購入した。DSS (分子量 :

36,000-50,000, CAS番号: 9011-18-1) をMP Biomedicals (Santa Ana, CA, USA) より

購入した。

供試動物

科研製薬株式会社 (静岡県藤枝市，HS 財団認定番号: 15-047) の動物実験ガイ

ドラインに従って倫理的に配慮して動物を飼育した。4週齢の BALB/cAnNCrlCrlj

系統の雌性マウスを日本チャールス・リバー株式会社 (厚木繁殖センター, 神奈

川県厚木市) から購入し，5日間実験環境に馴化させた。飼育室を温度 23 ± 3 ºC，

湿度 50 ± 20%に設定し，飼育室内の換気頻度を 1時間あたり 17回以上とした。

明暗サイクルを 12 時間とし，7:00～19:00 を明期とした。1ケージ (W 160 mm × D

300 mm × H 140 mm, 金網ケージ) 当たり 3 匹のマウスを収容した。馴化期間中，

基礎飼料 (オリエンタル酵母工業株式会社, 東京都板橋区) 及び上水 (静岡県藤

枝市) を自由摂取させた。馴化後，マウスを層別無作為化法にて，最新の体重に

基づいて各群に振り分け試験に使用した。剖検日にはマウスをイソフルラン麻酔

下で安楽殺した。

9

実験方法

群及び動物数を下表の通りとした。

群名称 被験物質 (用量) DSS 濃度 動物数 (匹)

DSS - 5% 12

CZ+DSS CZ (0.3%) 5% 12

EMIQ+DSS EMIQ (1.5%) 5% 12

ALA+DSS ALA (0.2%) 5% 12

Control - - 4

CZ，EMIQ及び ALA を 0.3，1.5及び 0.2%の用量にて混餌投与した。用量は既

報 (CZ:58-59 , EMIQ: 60-61, ALA: 62) を参考にして実施した予備試験結果から，

嗜好性に問題がなく，一般状態にも変化が認められない用量を選択した。

DSS を注射用水 (株式会社大塚製薬工場, 徳島県鳴門市) に 5 w/v%の用量にて

溶解させ給水ビンを用いて飲水投与した。DSS の用量は，予備試験において 3，4

又は 5%の DSS を 8 日間飲水投与した結果，体重及び体重増加率の減少及び軟便

が明瞭に認められた 5%に設定した。Control群には自由に上水 (静岡県藤枝市) を

飲水させた。

混餌投与開始日を DSS 飲水投与開始日の 5 日前とし，剖検日まで継続した。

DSS 飲水投与は 8日間 (day 1～day 8) とし，day 8 に剖検した。飼育期間中には

一般状態観察 (毎日)，体重測定 (day 1, 5, 7, 8)，糞便スコア観察 (day 5, 7) を実施

した。

剖検時 (day 8) に血液，大腸及び肝臓を採材した。遠心分離 (3000 rpm，15分)

により血液から血漿を分離した。大腸は大腸長 (回盲部～肛門) を測定の後，病

理組織学検査及び遺伝子解析用に処理した。病理組織学検査用のために，遠位大

10

腸及び肝臓を 10% 中性緩衝ホルマリンで固定した。残りの大腸の粘膜及び粘膜

下組織は cDNAマイクロアレイによる遺伝子解析のために切開及び生理食塩液に

よる洗浄を行った後にカミソリの刃を用いて粘膜を剥離し，RNAlater®

Stabilization Solution (Life Technologies, USA) 中に採取し，使用時まで-80℃にて保

管した。肝臓は固定後に重量を測定し，相対重量 (肝重量/体重) を算出した。

Disease activity index (DAI)

糞便スコアとして，下痢スコア及び出血スコアを求めた。便潜血の判定には，

便潜血検査試薬 (便潜血スライドシオノギ，塩野義製薬株式会社，大阪府大阪市)

を用いた。糞便スコアの基準は，下痢スコアを 0: normal stool，1: softer stool，2:

unformed stool，3: diarrhea，4: no stool，血便スコアを 0: no blood，1: weak

hemoccult-positive，2: moderate hemoccult-positive，3: strong hemoccult-positive，4:

visual blood とした (63)。さらに day 1 の体重を基準として，day 5 及び day 7 にお

ける体重変化率 (%) をスコア化した。スコアの基準は 0: ≧98.01%，1: 98.00～

95.01%，2: 95.00～90.01%，3: 90.00～85.01%，4: ≦85.00%とした。糞便スコア及

び体重減少スコアの和を DAIとした。

血漿中サイトカイン濃度測定

Bio-Plex Pro TM Mouse Cytokine 23-plexassay kit と Bio-Rad Bio-Plex Systems (バ

イオ・ラッドラボラトリーズ株式会社，Hercules，CA，USA) を用いて，以下の

項目を測定した: IL-1α (IL-1a)，IL-1β (IL-1b)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，

IL-10，IL-12 (p40)，IL-12 (p70)，IL-13，IL-17A，eotaxin，granulocyte-colony stimulating

11

factor (G-CSF)， granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)，

interferon-γ (INF-g)，keratinocyte derived cytokine (KC)，monocyte chemotactic protein

1 (MCP-1)，macrophage inflammatory protein (MIP) -1α (MIP-1a)，MIP-1β (MIP-1b)，

regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) 及び TNF-a。

病理組織学的検査

遠位大腸を輪切りに切り出し，常法に従ってパラフィン包埋，薄切及びヘマト

キシリン・エオジン (haematoxylin-eosin, H&E) 染色を行った。H&E 染色標本を

用いて粘膜下水腫，粘膜欠損及び炎症細胞浸潤の程度をスコア化した。粘膜下水

腫スコアの基準は 1: なし，2: 限局性，3: 多巣性，4: び漫性，粘膜欠損スコアの

基準は 1: なし，2: < 1/4，3: 1/4～1/2，4: 1/2～3/4，5: > 3/4，炎症細胞浸潤スコア

の基準は 1: なし，2: 軽度，3: 中等度，4: 重度とした。また，投与物の安全性の

確認を目的に，肝臓についても同様に H&E 染色標本を作製し，毒性所見の有無

を確認した。一部の個体については，常法に従って過ヨウ素酸シッフ (periodic

acid-Schiff stain, PAS) 染色を行った。

cDNAマイクロアレイ解析

RNeasy® MiniKit (QIAGEN, Hilden, Germany) を使用し，キットの取扱説明書に

従って大腸粘膜の total RNA を抽出した。得られた RNA溶液中の total RNA濃度

及び純度 (Abs260/Abs280, Abs260/Abs230) を，ナノドロップ (ND-1000, Thermo

Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA) を用いて測定した。また，total RNAの品

質 (RIN) を確認するため，バイオアナライザ (2100, Agilent Technologies Inc.,

12

Santa Clara，CA，USA) を用いて分析した。Control 群を除く各群から，濃度，純

度及び品質が良好な上位 4例を抽出して cDNA マイクロアレイ解析に用いた。

続いて，100 ngの total RNAから Low Imput Quick Amp Labeling Kit (One-Color,

Agilent Technologies Inc., Santa Clara，CA，USA) を用いてラベル化 cRNAを合成

した。さらに，RNeasy® MiniKit (QIAGEN, Hilden, Germany) を用いて，合成した

ラベル化 cRNAを精製した。得られたラベル化 cRNA溶液の Abs260 及び Abs550

を，ナノドロップ (ND-1000, Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA) を

用いて測定し，cRNA 収量及び Cy3 色素取込率を算出した。なお，cRNA 収量が

1.65 μg以上，Cy3 色素の取込率が 9 pmol/mg以上の基準を満たしたサンプルを使

用した。また，ラベル化 cRNAの品質を確認するため，バイオアナライザ (2100,

Agilent Technologies Inc., Santa Clara，CA，USA) を用いて分析した。ラベル化サ

ンプルのシグナルの大部分が，200から 2000 塩基長のサイズ範囲に位置している

ことを確認した。

その後，ハイブリダイゼーション及び洗浄として，ラベル化 cRNA 600 ng及び

Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies Inc., Santa Clara，CA，USA)

を用いてハイブリダイゼーションサンプルを調製し，マイクロアレイ (Sure Print

G3 Mouse GE 8×60K ) にハイブリダイゼーション (65℃，約 17時間) させた。ハ

イブリダイゼーション後，Gene Expression Wash Buffer を用いてアレイスライド

グラスを洗浄し，スキャニングに供した。スキャニング及び数値化には，マイク

ロアレイスキャナ (G2565BA，Agilent Technologies Inc., Santa Clara，CA，USA) を

用い，得られた画像から，Feature Extraction を用いてスポットの数値化データを

得た。得られた数値化データについて，Gene Spring GX 13.1 (Agilent Technologies

13

Inc., Santa Clara，CA，USA) を用いてデータ解析を実施し，DSS群と比較して CZ，

EMIQ又は ALA群で Fold change > 1.5の変動を示した遺伝子群を用いて，Venn

図を作成した (64)。

データの補正とフィルタリング条件は下記の通りとした。

(1) Normalization: Shiftto 75 percentile

(2) Base line Transformation: median of Control Samples

(3) Quality control: Filter Probesets by Expression

Lower cut-off: 20.0

Upper cut-off: 100.0

Entities where at least 100 percent of sample sinany 1 out of 2 condition shavevalues

within cut-off

統計処理

体重，大腸長及び血漿中サイトカイン濃度は，被験物質間の比較を行うことを

目的に Tukey’s multiple comparison test を実施した。DAI及び病理組織学的検査ス

コアについてはWilcoxon signed-rank test を実施した。いずれの解析においても有

意水準を両側 5%とした。統計解析には SAS (SAS InstituteInc., Cary, NC) 及び

EXSUS (株式会社 CAC クロア, 東京都中央区) を使用した。

14

結果

体重，DAI及び肝重量

DSS 飲水期間に DSS処置動物の体重は徐々に減少した (Table 1)。Control 群で

は体重の減少は認められなかった。CZ，EMIQ 及び ALA の体重減少抑制効果は

明らかでなかった。

同様に DSS 処置動物では，DSS 飲水投与期間が長くなるにつれて DAI スコア

が増加した (Figure 1A)。Control 群では DAIスコアの増加は認められなかった。

CZ，EMIQ 及び ALA 処置群では day 7 において，DSS 群と比較してこれら DAI

スコアの指標のうち，下痢スコアが有意に減少した。肝重量 (平均絶対重量及び

平均相対重量) に群間の明らかな差は認められなかった。

大腸長

DSS群では control群と比較して，有意な大腸長の短縮が認められた (Figure 1B)。

CZ+DSS 群では，DSS 群と比較して有意に大腸長の短縮が抑制された。EMIQ 及

び ALA処置群では大腸長短縮抑制効果は明らかでなかった。

血漿中サイトカイン濃度

DSS 群では control 群と比較して，血漿中の IL-1a，IL-6，IL-17，TNF-a，G-CSF

及び KC の濃度増加が認められた (Figure 2)。CZ，EMIQ 及び ALA 処置群では

DSS 群と比較して血漿中 IL-6 及び TNF-a 濃度の有意な減少が認められた。さら

に CZ+DSS 群では IL-17 及び KC，EMIQ+DSS 群では KC，ALA+DSS 群では KC

15

の血漿中濃度が DSS 群と比較して有意に減少した。有意差が認められなかったも

のの，CZ，EMIQ及び ALA群のいずれかにおいて，IL-1b，IL-2，IL-4，IL-5，IL-13，

IFN-g，MCP-1及び MIP-1aの濃度減少する傾向が認められた。全群における血漿

中 IL-9濃度及び CZ+DSS 群における血漿中 IL-10 濃度は検出限界以下であった。

病理組織学的検査

遠位大腸において control 群に異常は認められなかった (Figure 3)。DSS 処置動

物では，粘膜下組織の水腫，粘膜欠損及び粘膜固有層～粘膜下組織における炎症

細胞浸潤が認められた。DSS 群では水腫の程度に個体差が認められたものの，粘

膜欠損は観察部位の半分以上に高度な炎症細胞浸潤を伴って認められた。これら

の変化は CZ，EMIQ 及び ALA 処置によって軽減された。まず，CZ+DSS 群では

粘膜欠損及び炎症細胞浸潤，EMIQ+DSS 群では水腫及び粘膜欠損，ALA+DSS 群

では水腫及び炎症細胞浸潤スコアがそれぞれ DSS 群と比較して有意に減少した。

また，CZ，EMIQ 及び ALA 処置によって陰窩拡張が認められた。粘液の産生は

CZ，EMIQ及び ALA 処置によって DSS 群より亢進した (Figure 4)。

肝臓において CZ，EMIQ 及び ALA処置による重量変化及び毒性所見は認めら

れなかった (Table 1)。

cDNAマイクロアレイ解析

遺伝子発現解析において，DSS 群と比較して CZ，EMIQ及び ALA 処置群で共

通して発現増加した遺伝子プローブ数は，発現減少した遺伝子プローブ数より多

かった (Figure 5, Table 2)。Pathway解析では，CZ，EMIQ及び ALA 処置群におい

16

て，それぞれ，6，9及び 13の Pathway変動が抽出された (Table 3)。抽出された

Pathwayのうち，Type II interferon signalingが EMIQ+DSS 群及び ALA+DSS 群に，

ESC Pluripotency PathwaysがEMIQ+DSS群及びCZ+DSS群に，Id Signaling Pathway

が ALA+DSS 群及び CZ+DSS 群に共通であった。

17

考察

DSS による大腸炎誘発機序は明らかでないものの，DSS が大腸粘膜バリアを破

壊して，IL-1，IL-6 及び TNF-aを含む炎症誘発性サイトカインの血漿中濃度増加

を伴う炎症反応を誘導すると考えられている (26)。マウス DSS 誘発大腸炎にお

けるサイトカインプロファイルは，組織学的変化を反映することが示されている

(15, 65)。本章では，血小板凝集抑制作用を介した抗炎症作用が期待される CZと，

抗酸化作用を介した抗炎症作用が期待される EMIQ及びALAを解析対象とした。

その結果，これら 3 物質の全てがいずれかの評価項目において，DSS 誘発大腸炎

における大腸炎抑制作用を示した。特に 23 種の血漿中サイトカイン濃度測定で

は CZ，EMIQ 及び ALA 処置によって，IBD の病態において主要な炎症誘発性サ

イトカインである IL-6及び TNF-aの血漿中濃度が有意に減少したことから，3物

質が抗炎症作用を有すると判断した。PAS 染色によって示される粘膜上皮のムチ

ン産生は，CZ，EMIQ 及び ALA 処置によって亢進した。陰窩拡張は粘液産生が

亢進し貯留して生じたものと推察された。この結果より，血漿中サイトカイン濃

度測定結果に一致して，CZ，EMIQ 及び ALA がムチン産生によって粘膜上皮に

対する傷害を軽減したことが示唆された。こられの抗炎症及び粘膜保護作用は

H&E 染色標本を用いた病理組織学的検査においても確認され，DSS 群において

観察された粘膜下組織における水腫，粘膜欠損及び粘膜固有層～粘膜下組織への

炎症細胞浸潤のスコアは 3物質の処置により軽減し，組織傷害の抑制によって糞

便スコア及び体重減少スコアから算出した DAIスコアが低下したと考えられた。

CZ は下痢，大腸長短縮，血漿サイトカイン濃度上昇及び大腸組織傷害に対し

18

て顕著な抑制作用を示した。CZ は高親油性であり (39)，大腸粘膜上皮には CZ

の標的である PDE3Aが特異的に発現するため (40)，CZが大腸組織に分布して粘

膜保護効果を発揮した可能性が考えられる。さらに，CZ と同様に大腸炎抑制作

用を示した EMIQ は，ラット肝臓において β-naphthoflavone により誘発した酸化

ストレス及び TNF-aシグナルを介した毒性変化に対して抑制的に作用し，炎症を

抑制することが示されている (49)。本章において実施した血漿中サイトカイン濃

度測定においても，既報に一致して血漿中 TNF-a濃度の減少が認められた。また，

cDNA マイクロアレイ解析結果からも EMIQ は II 型 IFN シグナル及び p38

mitogen-activated protein kinase (MAPK) シグナル伝達を介して大腸炎を抑制する

可能性が示唆された。

ALA はヒドロキシラジカルや一重項酸素等の活性酸素種を除去することが知

られる抗酸化物質である (66, 67)。既報において，ALAの強制経口投与によって

2サイクルの 3% DSS飲水投与により誘発された大腸炎が，複数のサイトカイン

とその制御因子である nuclear factor-kappa B (NF-κB)，signal transducer and activator

of transcription (STAT) 3及び cyclo-oxygenase-2を介して軽減されたことが示され

ている (16)。本研究でも ALA 処置により，大腸組織傷害と血漿中 IL-1b，IL-2，

IL-6 及び TNF-a 濃度増加が抑制された。cDNA マイクロアレイ解析結果からは，

ALA は既報と同様の炎症性シグナル伝達に加えて，アポトーシス，DNA の複製

及びWnt シグナル伝達を調整する可能性が考えられた。

近年の抗 TNF-a抗体を用いた IBD治療では，IBDの病態の主となる炎症及び免

疫反応を軽減して粘膜治癒を誘導することを目的としている (13, 68)。本研究に

用いた 3物質は，血漿中の TNF-aを有意に減少させたことから，IBD においても

19

TNF-a産生抑制作用が期待される。さらに，IBD患者では炎症局所において Th17

細胞が産生する IL-6 等の炎症誘発性サイトカインがさらなる炎症反応の引き金

となり，IBDの病態を憎悪させることが知られている (69)。本研究の血漿中サイ

トカイン濃度測定により CZ が血漿中 IL-17 濃度を減少させた。また，CZ+DSS

群において単球及びマクロファージの浸潤に関与する KC (70-71) の血漿中濃度

の減少も認められた。以上より，PDE3 阻害剤である CZ は，IBD の予防/治療へ

の有効性が期待される。

cDNA マイクロアレイ解析において抽出された A-kinase anchoring protein

(AKAP) 13は Rho の GTPaseを活性化させる Rho GTPase guanine-nucleaotide 交換

因子ドメインを含む AKAP ファミリーの 1 つである (72-74)。AKAP13 は，心肥

大において cAMP依存性 protein kinase A (PKA) signalingを統合する重要な役割を

果たすことが示されている (75)。今回，DSS 処置による Akap13及び IL-6の高発

現は CZ，EMIQ及び ALA投与によって減少することが明らかとなった。これは，

AKAP-LBC/IKKb活性化複合体がNF-kB及び IL-6の転写を活性化するとの報告と

一致している (76)。さらに興味深いことに，Rho キナーゼは，消化管粘膜上皮バ

リアの調節に重要な役割を果たしている。大腸粘膜上皮における AKAP13 の高発

現が，粘膜治癒に関与する可能性がある。逆に，AKAP13 の過剰発現は乳癌 (77)，

甲状腺癌 (78) 及び大腸癌 (79-80) 等で報告されており，Rho の活性化が腫瘍の

増殖や転移に関与することが示唆されている。しかしながら，消化管粘膜上皮に

おける腫瘍形成に対する AKAP13 の役割は，さらにマウスの大腸炎関連癌モデル

において検討する必要があると考えられた。

本研究によって，異なる作用機序を有する CZ，EMIQ 及び ALA の 3物質が，

20

共通して血漿中炎症誘発性サイトカイン濃度を減少させ，粘膜傷害を軽減するこ

とが示された。IBD 患者は，持続的な炎症反応によって大腸炎関連大腸癌

(colitis-associated cancer) の高いリスクを有することから (4)，大腸炎関連大腸癌

の適切な動物モデルを用いて，これらの物質の大腸炎に続発する大腸癌に対する

有効性の検証が必要である。

21

小括

IBDは日本において増加傾向にある難治性慢性炎症性疾患である。IBDによる

慢性炎症は大腸癌のリスクとなることから，IBDを粘膜治癒に導く有効な治療物

質/治療法の開発が求められている。IBD の病態に血小板の活性化と ROS による

組織傷害が関与すると考えられため，第 1 章ではこれらの病態機序に拮抗的に働

いて大腸炎抑制作用を示す可能性が考えられる物質として，血小板凝集抑制剤の

CZと，抗酸化物質である EMIQ及び ALA の計 3物質を取り上げ，その効果を検

証した。検証には IBD の病態モデルとして広く使用されているマウス DSS 誘発

大腸炎モデルを使用した。BALB/cマウスに 0.3% CZ (CZ+DSS 群)，1.5% EMIQ

(EMIQ+DSS群) 又は 0.2% ALA (ALA+DSS群) を混餌投与するとともに，5% DSS

を 8日間飲水投与して大腸炎を誘発した。DSS 飲水投与期間中には体重測定及び

糞便観察を行い，剖検後には，大腸長測定，血漿中サイトカイン濃度測定，遠位

大腸における病理組織学的検査及び大腸粘膜の cDNAマイクロアレイ解析を実施

した。その結果，いずれの群においても DSS 飲水投与開始 7日目における糞便の

下痢スコアが DSS 群と比較して有意に減少した。さらに CZ+DSS 群では，大腸

長の短縮が DSS 群と比較して有意に抑制された。また，いずれの群においても大

腸組織傷害スコア及び血漿中 IL-6/TNF-a 濃度が DSS 群と比較して有意に減少し

た。これらの結果から，CZ，EMIQ及び ALA はいずれも大腸炎抑制作用を有し，

IBD の治療に有用である可能性が考えられた。また，cDNA マイクロアレイ解析

において 3 物質に共通して発現が減少した AKAP13 を見出し，本分子と IBD の

関連について検討を進めることした。

22

第 2章

AOM/DSS 誘発大腸癌モデルを用いた候補物質の評価及び

抗大腸炎/大腸癌抑制作用の機序解析

23

緒言

近年の発癌研究から，様々な臓器において慢性炎症が発癌のリスクになること

が明らかとなっており (7, 81)，疫学調査では全ての癌のうちの 25%が慢性炎症と

関連することが示されている (82)。慢性炎症から発癌に至る機序には，炎症細胞

によって産生される活性酸素種 (reactive oxygen species, ROS) の関与がある (83)。

炎症細胞によって炎症局所で産生される ROS は，DNA を傷害又は不安定化し，

細胞増殖制御から外れた異常な細胞増殖を引き起こす (84-85)。慢性炎症が持続

する IBDは大腸癌の重大なリスクであり，IBDに続発する大腸癌は大腸炎関連大

腸癌と呼ばれる。大腸炎関連大腸癌において，ROS はイニシエーション及びプロ

モーションを進行させ (82, 85-86)， “inflammation-dysplasia-carcinoma” と呼ばれ

る一連の病理学的変化の誘導に関与している (87)。

第 1章において IBDの発症機序解析や治療法の研究に広く使用されているマウ

ス DSS 誘発大腸炎モデルにおいて，血小板凝集抑制剤である CZ及び抗酸化物質

であるEMIQとALAがDSSによる大腸粘膜傷害を軽減し，血漿中TNF-a及び IL-6

濃度を減少させる効果を有することを示した。しかしながら，これら物質の大腸

炎関連大腸癌への有効性はこれまで明らかにされていない。そこで第 2 章では，

AOM/DSS 誘発大腸癌モデルを用いて CZ，EMIQ 及び ALA の大腸癌抑制作用に

ついて検証した。

AOM/DSS 誘発大腸癌モデルは，大腸炎関連大腸癌の病態を反映するモデルで

あり，本モデルを用いて天然物質及び合成化合物の化学的予防効果に関する多く

の研究が実施されている (88-89)。本章では CZ，EMIQ 及び ALA の AOM/DSS

24

誘発大腸癌モデルに対する有効性を，DSS 飲水投与を 1サイクルのみ行う短期評

価と，2 サイクル行う長期評価にて検証した。さらに，本試験には比較対照とし

て大腸癌を含む腫瘍性病変において抑制効果を有することが示されているアン

トシアニン (anthocyanin, AC) 投与群を設定した (90-94)。加えて，DSS 誘発大腸

炎及び AOM/DSS誘発大腸癌モデルにおけるさらなる抑制作用機序を明らかにす

るため，短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験及びヒト大腸癌細胞を用いた in vitro 細胞

増殖抑制試験を実施した。

25

材料及び方法

試験物質

EMIQ (純度: > 97%，0.1%の quercetin を含む) 及び AC (extract of the purple sweet

potato) は三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 (大阪府豊中市) より供与された。CZ

(純度: > 98.0%, 分子量: 369.47, CAS 番号: 73963-72-1)，ALA (純度: > 99.0%, 分子

量: 206.32, CAS 番号: 1077-28-7) 及び 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU, 純度: > 98%,

CAS 番号: 59-14-3) を東京化成工業株式会社 (東京都中央区) より購入した。DSS

(分子量: 36,000-50,000, CAS 番号: 9011-18-1) をMP Biomedicals (Santa Ana, CA,

USA) より購入した。AOM (純度: > 98%, CAS 番号: 25843-45-2) をシグマアルド

リッチ (St. Louis, MO, USA) より購入した。

供試動物

科研製薬株式会社 (静岡県藤枝市, HS 財団認定番号: 15-047) の動物実験ガイ

ドラインに従って倫理的に配慮して動物を飼育した。4週齢の BALB/cAnNCrlCrlj

系統の雌性マウスを日本チャールス・リバー株式会社 (厚木繁殖センター, 神奈

川県厚木市) から購入し，7日間以上実験環境に馴化させた。飼育室を温度 23 ± 3

ºC，湿度 50 ± 20%に設定し，飼育室内の換気頻度を 1時間あたり 17回以上とし

た。明暗サイクルを 12時間とし，7:00～19:00 を明期とした。1ケージ (W 160 mm

× D 300 mm × H 140 mm, 床敷きケージ) 当たり 3～5匹のマウスを収容した。馴

化期間中，基礎飼料 (オリエンタル酵母工業株式会社, 東京都板橋区) 及び上水

(静岡県藤枝市) を自由摂取させた。馴化後，マウスを層別無作為化法にて，最新

26

の体重に基づいて各群に振り分け試験に使用した。剖検日にはマウスをイソフル

ラン麻酔下で安楽殺した。

実験方法 1 (in vivo試験)

群及び動物数を下表の通りとした。

①AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験

群名称 被験物質

(用量) AOM 用量 DSS 濃度

動物数 (匹)

短期 長期

AOM+DSS - 10 mg/kg 3% 8 8

AOM+DSS+CZ CZ (0.3%) 10 mg/kg 3% 8 8

AOM+DSS+EMIQ EMIQ (1.5%) 10 mg/kg 3% 8 8

AOM+DSS+ALA ALA (0.2%) 10 mg/kg 3% 8 8

AOM+DSS+AC AC (5%) 10 mg/kg 3% 8 8

AOM - 10 mg/kg - 8 8

②短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験

群名称 被験物質 (用量) DSS 濃度 動物数 (匹)

Day 2 Day 4 Day 6

DSS - 4% 4 4 4

DSS+CZ CZ (0.3%) 4% 4 4 4

DSS+EMIQ EMIQ (1.5%) 4% 4 4 4

DSS+ALA ALA (0.2%) 4% 4 4 4

Control - - 4 4 4

CZ，EMIQ，ALA 及び AC を 0.3，1.5，0.2 及び 5.0%の用量で混餌投与した。

ACの用量は既報に準じて決定した (95-96)。AOMの用量は既報に準じて10 mg/kg

とし単回腹腔内投与した (97)。DSS を注射用水 (株式会社大塚製薬工場, 徳島県

鳴門市) に 3 又は 4 w/v%の用量にて溶解させ給水ビンを用いて飲水投与した。

AOM 群又は control 群には自由に上水 (静岡県藤枝市) を飲水させた。

AOM/DSS誘発大腸癌抑制試験では，混餌投与開始日を AOM腹腔内投与 (week

27

0) の 1 週間前とし，剖検日まで継続した。AOM 腹腔内投与 (week 0) の 1 週間

後に 3% DSS を飲水投与した。DSS 飲水投与は 1サイクルの飲水期間を 1週間と

し，1 サイクル (短期評価) 又は 2 サイクル (長期評価) の飲水投与を行った。1

回目と 2回目の DSS 飲水投与間には 2週間の休薬期間を設けた。休薬期間中は自

由に上水 (静岡県藤枝市) を飲水させた。短期評価群では，DSS 飲水投与終了後

3週間 (week 5)，長期評価群では最終 DSS 飲水投与終了後 4週間 (week 9) に剖

検した。

短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験では，混餌投与開始日を DSS 飲水投与開始日

(day 1) の 7日前とし，剖検日まで継続した。4% DSS を飲水投与した。DSS 飲水

投与は 8日間 (day 1～day 8) として day 2, 4, 6 に剖検した。BrdU は各剖検日の

前々日及び前日に 100 mg/kgの用量にて腹腔内投与した。

いずれの試験においても飼育期間中には一般状態観察 (毎日) 及び体重測定

(1 週間に 2 回以上) を実施した。AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験では，さらに，

大腸重量，1個体あたりの腫瘤数及び腫瘍容積，ムチン枯渇巣(mucin depleted foci,

MDF) 数及び変異陰窩巣 (aberrant crypt foci, ACF) 数を測定した。AOM/DSS 誘発

大腸癌抑制試験では実験期間中に短期評価AOM+DSS+CZ群の 1例が死亡したが，

その他に死亡は認められなかった。なお，大腸長の測定では，大腸摘出操作によ

り損傷を生じた個体については，大腸長測定の対象外とした。その結果，大腸長

測定の対象個体は，AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験では，短期評価における

AOM+DSS+CZ群を N = 6，短期評価における AOM+DSS+AC 群，長期評価にお

ける AOM+DSS+CZ群，長期評価における AOM+DSS+AC 群及び長期評価におけ

る AOM 群を N = 7 とした。残りの群では全例 (N = 8) を大腸長の解析対象とし

28

た。短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験では，DSS+ALA 群の day 4，DSS+CZ群の day

4及び day 6 では N = 3 とし，残りの群では全例 (N = 4) を大腸長の解析対象とし

た。

剖検時に血液及び大腸を採材した。遠心分離 (3000 rpm，15分) により血液か

ら血漿を分離した。大腸は大腸長 (回盲部～肛門) を測定の後，病理組織学検査

及び免疫組織化学染色のために 10% 中性緩衝ホルマリン (N = 4/group) 又は 4%

パラホルムアルデヒド (N = 4/group) で固定した。

血液生化学検査

AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験の長期評価において血液生化学検査を実施した

(N = 8)。検査には LABOSPECT006 (株式会社日立ハイテクノロジーズ, 東京都港

区 ) を使用し，以下の項目を検査した : total protein (T.Protein)，albumin，

albumin/globulin ratio (A/G ratio) ， total bilirubin (T.Bilirubin) ， aspartate

aminotransferase (AST)，alanine aminotransferase (ALT)，alkaline phosphatase (ALP)，

cholesterol，triglyceride，phospholipid，glucose，blood urea nitrogen (BUN)，creatinine。

大腸腫瘤数及び容積の測定

AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験で大腸に肉眼的に認められた腫瘤について縦，

横，高さの 3 辺をデジタルノギスで測定し，次の式により容積 (mm3) を算出し

た: length (mm) × width (mm) × height (mm) × 0.526 (98)。腫瘤容積の和を total mass

volumeとして個体毎に算出した。その後，H&E染色用 (N = 4) 及び免疫組織化

学染色用 (N = 4) に処理した。

29

MDF及び ACF の検出

AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験の短期評価では MDF 及び ACF を検出するため

に，それぞれ 1% アルシアンブルー (pH 2.5) で 30分間及び 0.2% メチレンブル

ーで 5分間染色した。既報に従って MDFと ACFの数を実体顕微鏡下で計数した

(99)。MDFは既報 (100-101) に従い「ムチンの減少又は枯渇が認められる 2つ以

上の陰窩の集合であり，陰窩の歪み及び周辺正常組織より隆起した病変」と定義

した。ACFは既報 (102) に従い「正常の陰窩と比較して大型で，周辺正常組織よ

り隆起し，陰窩周辺がメチレンブルーに濃染する病変」と定義した。

病理組織学的検査

常法に従って大腸のパラフィン包埋，薄切及び H&E染色を行った。AOM/DSS

誘発大腸癌抑制試験において，短期評価の全例 (N = 7-8/group) 及び長期評価の半

数例 (N = 4/group) について，大腸全長 (大腸～肛門) の長軸組織切片について，

腫瘍性病変の総数 (multiplicity) をカウントした。なお，短期評価 AOM+DSS+ALA

群の１例では観察に適した標本が得られなかったため解析対象から除外し，解析

対象を N = 7 とした。大腸の腫瘍性病変を，既報に従って low-grade 異形成，

high-grade 異形成，腺腫及び腺癌に分類した (89)。さらに，炎症の評価として既

報 (103) に従い，炎症スコアを 0: 異常は認められない，1: 正常と比較して陰窩

が 1/3 まで短縮する又は粘膜に軽度の炎症細胞浸潤及び水腫が認められる，2: 正

常と比較して陰窩が 2/3 まで短縮する又は粘膜に中等度の炎症細胞浸潤が認めら

れる，3: 正常陰窩が認められないが粘膜上皮は残存する又は粘膜に高度な炎症細

30

胞浸潤が認められる，4: 粘膜上皮が欠損する又は高度な炎症細胞浸潤が粘膜，粘

膜下組織及び粘膜固有層に認められる，とした。遠位大腸～肛門を解析対象とし

た。短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験では，遠位大腸の短軸切片を作製し，炎症細胞

浸潤，水腫及び粘膜傷害の有無を観察した。

短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験では遠位大腸を輪切りに切り出し，常法に従って

パラフィン包埋，薄切及び H&E 染色を行い，組織傷害を観察した。一部の個体

については，常法に従って PAS 染色を行った。

免疫組織化学染色方法及び評価方法

AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験の長期評価の半数例 (N = 4/group) について免

疫組織化学染色を行った。病理組織学的検査では，より多くの腫瘍性病変を観察

するために，約 5 mmの間隔で大腸全長 (遠位大腸～肛門) を短軸に切り出した。

免疫組織化学染色を p53，β-catenin，Ki-67，Iba1，Nox1 及び Cyclin D1 について

実施した (Table 4)。

免疫組織化学染色を以下の手順で実施した。脱パラフィンした標本を必要に応

じてオートクレーブを用いて 121°C，15分の抗原賦活を行った。その後，3% H2O2

メタノール液で内因性ペルオキシダーゼを除去し，一次抗体と反応させた。一次

抗体反応の条件を室温下で 1～3 時間又は 4°C 下で一晩とした。抗原抗体反応の

可視化には Envision Dual Link System-HRP (Dako, Glostrup, Denmark) 及び Liquid

DAB+Substrate Chromogen System (Dako, Glostrup, Denmark) を用い，取扱い手順に

従い実施した。次いで，標本をヘマトキシリンで対比染色し，顕微鏡検査のため

にカバーガラスで封入した。

31

免疫組織化学染色標本は，既報 (104-105) に準じた半定量的評価を行った。解

析対象は，β-catenin，Ki-67，Iba1，Nox1 及び Cyclin D1の免疫組織化学染色標本

とした。半定量的評価法では，各視野の陽性細胞の割合及び染色強度の和を求め

た。陽性細胞の割合のスコアを 0: 0%，1: 1～25%，2: 26～50%，3: 51～75%，4: 76

～100%，染色強度のスコアを 0: negative，1: mild，2: moderate，3: strongとした。

陽性細胞の割合及び染色強度の和を合計スコアとし，合計スコアを 0～7とした。

スコアはマウス 1匹あたり 9～10個の腺癌について，100倍の倍率で観察した。

短期DSS誘発大腸炎抑制試験では，BrdU (1:80，M0744，Dako，Glostrup，Denmark)

に対する免疫組織化学染色を以下の手順で実施した。脱パラフィンした標本を pH

6 条件下にてオートクレーブを用いて 121°C，15 分の抗原賦活を行い，3% H2O2

メタノール液で内因性ペルオキシダーゼを除去した。一次抗体反応は室温で 0.5

時間とした。抗原抗体反応の可視化には Envision Dual Link System-HRP (Dako,

Glostrup, Denmark) 及び Liquid DAB+Substrate Chromogen System (Dako, Glostrup,

Denmark) を用い，取扱い手順に従い実施した。次いで，標本をヘマトキシリン

で対比染色し，顕微鏡検査のためにカバーガラスで封入した。遠位大腸の短軸切

片における 1陰窩当たりの BrdU陽性上皮細胞を 400倍にてカウントした。なお，

DSS 群の day 2 及び day 4，control 群の day 2，DSS+ALA群の day 4 では評価に適

した標本を得られなかったため，解析対象を N = 3とした。

In vitro 腫瘍増殖抑制試験

ヒト大腸癌細胞株として American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)

より入手した HT-29，LS174T，DLD-1及び COLO205を用いた。ヒト大腸癌細胞

32

株における細胞増殖活性は，ELISA BrdU assay kit (Roche, Basel, Switzerland) を用

いて測定した。測定方法は取扱説明書に準じた。ヒト大腸癌細胞株には HT-29，

LS174T，DLD-1及び COLO205を用いて，細胞播種濃度をそれぞれ 5×103，1×10

4，

1×103～5×10

3及び 1×104 cells/mLとした。96 ウェルプレートに 100 µLのヒト大腸

癌細胞株を播種し，CZ (0.03及び 0.08 mM)，EMIQ (83 及び 250 mM)，ALA (0.17

及び 0.50 mM) 及び AC (83及び 250 mM) を処理して 5% CO2インキュベーター

で 3日間培養した。続いて，BrdUを添加して 4時間後に細胞を固定し，90分間，

抗 BrdU抗体と反応させた。BrdUの取り込みは，基質としてテトラメチルベンジ

ジンを用いて細胞をインキュベートすることによって検出し，マイクロプレート

リーダーを用いて 370 nmの吸光度を測定することによりBrdU取り込み量を測定

した。本操作はトリプリケイトで 3回繰り返し実施した。

統計処理

全ての結果を平均±標準偏差として表した。測定及び計算によって得られた結

果を統計的に Dunnett’s multiple comparison 又は Tukey’s multiple comparison test を

用いて解析した。病理組織学的検査及び免疫組織化学染色スコアを Wilcoxon

signed-rank test を用いて解析した。いずれの解析においても有意水準を両側 5%と

した。統計解析には SAS (SAS InstituteInc., Cary, NC) 及び EXSUS (株式会社 CAC

クロア, 東京都中央区) を使用した。

33

結果

体重 (AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験)

Week 2～5にかけて DSS 処置動物では体重減少が認められたが，AOM 群では

体重減少は認められず，実験期間中を通じて体重が増加した (Figure 6)。

AOM+DSS 群では，AOM 群と比較して week 2～3, 5,9において有意に体重が減少

した。体重推移においてAOM+DSS+CZ群，AOM+DSS+EMIQ群，AOM+DSS+ALA

群及び AOM+DSS+AC 群では AOM+DSS 群との有意差は認められなかったが，

AOM+DSS+ALA群で減少する傾向が認められた。

血液生化学検査 (AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験)

各測定項目において，AOM+DSS+CZ群，AOM+DSS+EMIQ 群，AOM+DSS+ALA

群では AOM+DSS 群と比較して，毒性学的意義のある変動は認められなかった

(Table 5)。

大腸長及び大腸重量 (AOM/DSS誘発大腸癌抑制試験)

短期評価では DSS を処置した全ての群において AOM 群と比較して，大腸長が

短縮したが，長期評価では明らかな変化は認められなかった (Table 6)。大腸重量

は，短期評価ではいずれの群においても同程度であり AOM+DSS 群と AOM 群間

に有意な差は認められなかったが，長期評価では AOM+DSS 群と AOM 群間に有

意な増加が認められた。 AOM+DSS+CZ 群， AOM+DSS+EMIQ 群及び

AOM+DSS+AC 群の大腸重量は AOM+DSS 群と比較して有意に減少した。個体ご

34

とに大腸重量を大腸長で除して求めた大腸重量 /大腸長比は，短期評価では

AOM+DSS 群は AOM 群と比較して増加したが，AOM+DSS 群と CZ，EMIQ，ALA

及び AC 処置群間に有意な変化は認められなかった (Figure 7)。一方，長期評価

では，大腸重量と同様に，AOM+DSS+CZ 群，AOM+DSS+EMIQ 群及び

AOM+DSS+AC 群において AOM+DSS 群と比較して有意な大腸重量/大腸長比の

減少が認められた。

腫瘤数及び容積 (AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験)

腫瘤容積及び腫瘤数は，DSS 処置群において AOM 群と比較して有意に増加し

た (Table 6，Figure 7)。腫瘤容積は各被験物質で AOM+DSS 群と比較して有意な

減少は認められなかったものの，AOM+DSS+CZ群及び AOM+DSS+EMIQ 群では

比較対照群である AOM+DSS+AC 群と比較して低値であった。腫瘤数も各被験物

質で AOM+DSS 群と比較して有意な減少は認められなかったものの，

AOM+DSS+EMIQ群では AOM+DSS+AC 群と比較して低値であった。

MDF及び ACF (AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験)

MDF及び ACFは大腸の中間部～遠位に観察された (Figure 8)。MDF及び ACF

数は DSS 処置群において AOM 群と比較して有意に増加した (Table 6)。MDF数

は AOM+DSS+EMIQ 群，AOM+DSS+ALA 群及び AOM+DSS+AC 群で AOM+DSS

群と比較して有意に減少した。ACF 数は AOM+DSS+EMIQ 群で AOM+DSS 群と

比較して有意に減少した。

35

病理組織学的検査 (AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験)

AOM 及び DSS の投与により，短期及び長期評価において全ての個体で大腸腫

瘍を誘発した (Table 7, Figure 9)。一方，AOM のみを処置した AOM 群では腫瘍

性病変は認められなかった。腫瘍性病変の総数は，短期及び長期評価において，

AOM+DSS 群は AOM 群と比較して有意に増加した。また，AOM+DSS 群におけ

る腫瘍病変総数は短期及び長期評価で同程度であった。短期評価において，腫瘍

病変総数は CZ，EMIQ，ALA及び AC 処置群では，AOM+DSS 群と比較して有意

に減少した。長期評価における腫瘍病変総数は，AOM+DSS+AC 群で AOM+DSS

群と比較して有意に減少した。

炎症スコアは短期及び長期評価において，AOM+DSS 群は AOM 群と比較して

有意に増加した (Table 7)。長期評価では，炎症スコアが AOM+DSS+EMIQ 群及

び AOM+DSS+AC 群で AOM+DSS 群と比較して有意に減少したものの，短期評

価では CZ，EMIQ，ALA及び AC 処置による有意な変化は認められなかった。

免疫組織化学染色 (AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験)

腫瘍性病変部の核内における β-catenin，Ki-67及び Cyclin D1の陽性像が，周囲

の正常粘膜上皮に比べて顕著に増加した (Table 8, Figure 10)。β-catenin スコアは

AOM+DSS+CZ群及びAOM+DSS+AC群ではAOM+DSS群と比較して有意に減少

したが，AOM+DSS+EMIQ群では有意に増加した。Ki-67スコアは AOM+DSS+CZ，

AOM+DSS+ALA群及び AOM+DSS+AC群で AOM+DSS群と比較して有意に減少

した。Cyclin D1 スコアは AOM+DSS 群と比較して，全ての被験物質群及び AOM

群で減少した。腫瘍細胞の Nox1 の染色強度に群間の差は認められなかった。ま

36

た，腫瘍性病変部における p53 陽性像はほとんど認められなかった (Data not

shown)。

Iba1陽性像は腫瘍性病変部間質に認められた。Iba1スコアはAOM+DSS+CZ群，

AOM+DSS+EMIQ群及び AOM+DSS+ALA 群では，AOM+DSS 群と比較して有意

に減少した。

In vitro 腫瘍増殖抑制試験

CZ，ALA 及 AC 処理によって HT-29，LS174T，DLD-1 及び COLO205 細胞株

で BrdU 取り込みが有意に抑制されたが，EMIQ 処理ではいずれの細胞株でも

BrdU取り込みに変化は認められなかった (Figure 11)。

短期 DSS誘発大腸炎抑制試験

Day 4 及び day 6 において，DSS 群では control 群と比較して有意な大腸長の短

縮が認められた (Figure 12)。しかし，CZ，EMIQ及び AC 処置による大腸長短縮

抑制効果は明らかではなかった。

BrdU 陽性上皮細胞数を指標とした粘膜上皮の増殖活性は，DSS 群では経時的

に減少した。Control 群では BrdU陽性上皮細胞数に経時的変化は認められなかっ

た。DSS+CZ群及び DSS+EMIQ 群では day 4 及び day 6 において，DSS+ALA群

ではではday 4において，DSS群と比較して有意な増殖活性の回復が認められた。

病理組織学的検査では，day 6 から DSS 処置により炎症細胞浸潤を伴う粘膜欠

損が認められ，その程度は DSS 群> DSS+ALA 群> DSS+CZ群> DSS+EMIQ 群の

順に強かった。

37

考察

マウス AOM/DSS 誘発大腸癌モデルにおける MDF は，DSS で誘発される炎症

によって促進される前癌病変であり，発癌初期の抗腫瘍作用の指標にされている

(106)。AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験における短期評価では，CZ，EMIQ 及び

ALA処置によりMDF 数が減少した。この結果は，病理組織学的検査による腫瘍

性病変数の評価結果と一致しており，第 1章で示した DSS 誘発大腸炎抑制作用を

介して，CZ，EMIQ 及び ALA は前癌病変を抑制すると考えられた。なお，本試

験では既報と異なり ACF より MDF が多く観察された (100)。本試験に使用した

BALB/cマウスはAOM/DSSに高感受性であることが知られていることから，ACF

と MDF の発現頻度の差は種及び系統による違いを反映している可能性が考えら

れる (103)。

AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験における長期評価では，大腸長，大腸重量，肉

眼的な腫瘤容積及び数，病理組織学的検査による腫瘍性病変数及び炎症の程度並

びに免疫組織化学染色性を評価した。その結果，特に AOM+DSS+CZ 群及び

AOM+DSS+EMIQ群では大腸重量及び腫瘤容積の減少が認められたことから，CZ

及び EMIQは大腸癌抑制作用を有すると考えられた。同様の結果は，比較対照と

して使用した AC (90, 92, 107-110) においても確認されている。

AOM/DSS 誘発大腸癌モデルにおいて，粘膜上皮の持続した細胞増殖は腫瘍形

成に重要な役割を有する。長期評価における大腸腺癌での Ki-67 免疫組織化学染

色評価によって，CZ 及び AC 処置群では無処置群と比較して有意な細胞増殖の

抑制が認められた。これまでの in vitro 研究では，CZ (111)，ALA (112-113) 及び

38

AC (33, 110) が，ヒト大腸癌細胞株に対する増殖抑制作用を有することが報告さ

れている。本章にて実施したヒト大腸癌細胞株を用いた細胞増殖への影響評価に

おいても，CZ，ALA 及び AC 処置によって全てのヒト大腸癌細胞株で BrdU取り

込みが減少した。その機序として，CZ の PDE3 阻害作用を介したヒト大腸癌細

胞株の成長阻害が考えられる (111)。CZは細胞内 cAMP を増加させ (114)，増加

した cAMPが細胞死ではなくG1及びM期における細胞周期の停止をもたらすこ

とが示されている (115)。一方，ALA は，p53 非依存的にミトコンドリア障害を

介してアポトーシスを引き起こすことが知られている (116-117)。また，AC は

Aktの抑制と p38 MAPK の活性化によってアポトーシス及び細胞周期停止を誘導

するとされている (118-120)。従って，本章における大腸癌細胞の細胞増殖でも

同様の機序が関与していることが示唆された。

AOM は β-catenin のコドン 33 と 41 に変異を引き起こし，β-catenin の核内移行

を増加させることで，標的遺伝子である C-myc 及び Cyclin D1 転写を活性化して

細胞増殖を引き起こす (80, 121)。長期評価では，CZ 及び AC 処置によって大腸

腺癌組織における β-catenin と Cyclin D1の発現抑制が認められた。In vivo試験で

得られたこれらの結果は，CZ の大腸炎関連大腸癌治療への有効性を示唆してお

り，in vitro 試験における本物質の結果を補足するものと考えられる。なお，

AOM+DSS+EMIQ群では β-catenin核内移行の増加が認められたが，EMIQの抗酸

化作用によってβ-catenin核内移行とTcf複合体とDNAの結合が抑制されてCyclin

D1の発現が減少したとの報告があることから (122)，意義のない偶発的変化であ

ると考えられる。

EMIQ は AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験において大腸癌抑制作用が確認されて

39

いるものの，ヒト大腸癌細胞株を用いた in vitro 試験では腫瘍細胞に対する直接

的な作用は認められなかった。EMIQ は摂取後，吸収されるまでにほとんどが脱

グリコシル化され，ヒト血中では quercetin，quercetin-glucuronide又はその両方と

して存在する (123)。今回，代謝産物の血中濃度測定は行わなかったものの，EMIQ

を単回投与したラット血漿中では quercetin 及び quercetin-glucuronide 濃度が上昇

することが示されている (124)。Isoquercitrin 及び quercitrin は，ヒト大腸癌細胞

の Akt-mammalian target of rapamycin (125-126) 及び NF-κB (127) を介して ROSの

産生を抑制し腫瘍増殖を阻害する。一方で，抗酸化作用を有するこれらの物質が

AMPK シグナルを介してミトコンドリア膜電位を減少させて ROS の産生を亢進

し，アポトーシスを誘導するとの報告がある (128-129)。さらに，EMIQ は

isoquercitrin と比べて水に溶けやすく吸収性に優れており (123)，ラットを用いた

長期投与試験において毒性変化は認められていない (61, 124)。本試験においても，

血液生化学検査結果に毒性所見は認められなかった。そのため，EMIQ は吸収性

及び安全性の面から isoquercitrinより優れた治療物質となり得ると考えられるが，

in vitro 試験においてはさらなる暴露条件等の確認が必要である。

AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験では，DSS+AOM+CZ 群及び DSS+AOM+EMIQ

群では腫瘍間質におけるマクロファージの浸潤が DSS+AOM 群と比較して減少

することが明らかとなった。同様に DSS+AOM+EMIQ 群及び DSS+AOM+AC 群

は組織の炎症スコアが減少した。マクロファージは IBD患者において主要な ROS

産生源の一つであるため (32, 36)，これらの結果は CZ 及び EMIQ の直接的な大

腸癌抑制作用だけでなく抗炎症作用を反映したものと考えられる。この結果は，

急性 DSS 誘発大腸炎抑制試験においても確認された。

40

第 1 章では，CZ 及び EMIQ 処置が大腸組織の炎症を軽減させることが明らか

になった。本章における短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験では，DSS が BrdU陽性上

皮細胞数を減少させることを見出し，CZ 及び EMIQ 処置によって，DSS による

BrdU陽性上皮細胞数の減少が抑制され，細胞増殖が維持されることを見出した。

既報では，DSS による BrdU 陽性上皮細胞数の減少は，アポトーシスの増加及び

細胞周期停止によって引き起こされる可能性があると報告されている (130)。持

続的に粘膜の恒常性を維持することは，IBD を予防するための重要な戦略である

ため，短期 DSS 誘発大腸炎抑制試験によって明らかとなった CZと EMIQの DSS

誘発大腸炎に対する粘膜保護作用は，AOM/DSS 誘発大腸癌モデルにおける抗炎

症性及び二次的な大腸癌抑制作用裏付けるものであった。

一方，AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験における ALAの大腸癌抑制作用は限定的

であった。既報の in vitro 試験では，本章の結果と同様に ALAがヒト大腸癌細胞

株の増殖を抑制することが示されている (113, 131)。その機序として，ALAが p53

依存性のミトコンドリアを介した内因性アポトーシス経路による細胞死の引き

金となる (116, 117)。ラットを用いた実験では ALAを 80 mg/kgの用量で強制経

口投与することで，nuclear erythroid 2-related factor 2 を介して DSS 誘発大腸炎に

おける炎症を明確に抑制すること (16) 及び TNBS 誘発性大腸炎を抑制すること

(14) が示されている。これらの結果の違いは試験条件の違いによると考えられる

が，in vivo 試験による ALA の大腸炎及び大腸癌の抑制効果に関する報告は限定

的であるため，さらなる有効性の確認が必要である。

第 2 章において，CZ 及び EMIQ のマウス AOM/DSS 誘発大腸癌モデルに対す

る大腸癌抑制作用を示した。その作用機序として in vivo試験における抗炎症効果

41

(CZ及び EMIQ) に加え，in vitro 試験における直接的な増殖抑制作用 (CZ) が認

められた。さらに，AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験にて確認された β-cateninの核

内移行及びCyclin D1発現の抑制により大腸癌抑制作用が示されたと考えられる。

これらの結果より，取り上げた 3物質のうち特に CZ及び EMIQ が新規 IBD予

防/治療物質として有効であると考えられた。CZ及び EMIQ は国内外の公的機関

において，既にその安全性が検証されている。CZ は PDE3 阻害作用を介した血

小板凝集抑制作用及び血管拡張作用を有することから，閉塞性動脈硬化症 (132)

や脳梗塞 (133) 等の治療に使用されている。IBD患者では静脈血栓塞栓症のリス

クが高まるとの報告 (134) からも，抗炎症及び抗血栓作用を有する CZの有用性

が期待される。EMIQ は，Expert Panel of the Flavour and Extract Manufactures

Association (FEMA, FEMA No.4225) 及び U.S. Food and Extract and Drug

Administration (US FDA) によって一般に安全と認められる物質 (generally

recognized as safe, GRAS, GRAS No.00220) として認可され，既に食品添加物とし

て使用されている。そのため，さらなる有効性の検証によって，IBD 治療への活

用が期待される。

42

小括

第 1章において CZ，EMIQ 及び ALAが DSS 誘発大腸炎を軽減することを確認

した。そこで，これら物質について IBD の予防/治療におけるさらなる有効性の

検証のため，マウス AOM/DSS 誘発大腸癌モデルを用いて大腸癌抑制作用を検証

した。BALB/cマウスに 10 mg/kgの用量にて AOM を単回腹腔内投与し，その後，

3% DSS の 1 週間飲水投与を 1 サイクル (短期評価) 又は 2 サイクル (長期評価)

行い，大腸癌を誘発した。検証にあたり，CZ，EMIQ 及び ALA に加えて抗腫瘍

作用がよく知られる植物由来色素であるAC処置 (5%, AOM+DSS+AC) 群を設け，

比較対象とした。さらに，大腸炎/大腸癌抑制作用の機序を検証することを目的に，

DSS 誘発大腸炎の初期変化の観察及びヒト大腸癌細胞株を用いた in vitro 増殖抑

制試験を行った。

その結果，AOM/DSS 誘発大腸癌モデルを用いた大腸癌抑制試験では，短期評

価において AOM+DSS+EMIQ 群，AOM+DSS+ALA 群及び AOM+DSS+AC 群で

AOM+DSS 群と比較して有意に MDF 数が減少した。さらに，長期評価では

AOM+DSS+CZ 群及び AOM+DSS+EMIQ 群において大腸重量及び腫瘤容積が

AOM+DSS+AC 群より減少し，AC と同程度以上の大腸癌抑制作用を示した。本

効果は，DSS 誘発大腸炎初期において，DSS による大腸粘膜上皮の増殖抑制を

CZ 及び EMIQ が抑制して大腸炎を軽減させたことによるものと考えられた。さ

らに，免疫染色の結果より CZの発がん抑制には大腸癌細胞における β-catenin及

び Cyclin D1の発現抑制作用が関連することが明らかとなった。さらに in vitro 増

殖抑制試験ではCZ及びALAがヒト大腸癌細胞株の増殖活性を直接低下させるこ

43

とが明らかとなった。

以上の結果より，CZ 及び EMIQ は大腸炎関連大腸癌を反映した動物モデルに

おいて大腸癌抑制作用を示し，新規 IBD 予防/治療物質として有用である可能性

が示された。

44

第 3章

マウス大腸炎/大腸癌モデルにおける AKAP13 及び ROCKの発現の検討

45

緒言

AKAP13は第 1章にて実施したマウスDSS誘発大腸炎モデルの炎症期における

cDNA マイクロアレイ解析で抽出された分子の１つである。AKAP ファミリー蛋

白質は，シグナル伝達のプラットフォームとして細胞内の複数の酵素を正確に機

能させ，シグナル伝達を調節する足場蛋白質である (135)。AKAP13 は AKAP-Lbc

としても知られ，protein kinase A 及び protein kinase C 等の複数の protein kinaseの

足場となる。また，AKAP13 は Rho-GTPase guanine nucleotide exchange region ドメ

インを有しており，RhoAの活性化を介して下流の ROCK1及び ROCK2 をエフェ

クターとして機能させる (136)。RhoA-ROCK シグナルは，アクチン・ミオシン

複合体であるアクトミオシンによるアメーバ様の細胞遊走に関与することが報

告されている。AKAP13/ROCKシグナルが関与する病態としては，心肥大が知ら

れているが (137)，消化管の病態における役割は十分に検討されていない。

AKAP13 は，肝細胞癌 (138)，乳癌 (139)，甲状腺癌 (78)，前立腺癌 (140) 及

び大腸癌 (80) 等の複数のヒトの腫瘍に発現し，腫瘍の薬剤耐性にも関与する

(141)。リンパ球性白血病では，AKAP13 のスプライシング変異体は lymphoid blast

crisis oncogeneとして知られ，腫瘍細胞の形質転換に関与している (142)。AKAP13

をトランスフェクトした腫瘍細胞は，細胞外シグナル制御リン酸化酵素

(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 及び Cyclin D1 の活性化を伴う高い細胞

増殖活性を示し，これらは全て Rho 阻害剤によって抑制される (138)。これらの

ことから，腫瘍細胞の増殖には AKAP13/ROCK シグナルが関与する可能性が考え

られる。

46

そこで本章では，AKAP13 の消化管粘膜上皮の病態時の役割を明らかにするこ

とを目的に，マウス AOM/DSS 誘発大腸癌モデル及び DSS 誘発大腸炎モデルの炎

症期及び回復期における AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 の発現を解析した。

47

材料及び方法

試験物質

DSS (分子量: 36,000-50,000, CAS番号: 9011-18-1) をMP Biomedicals (Santa Ana,

CA, USA) より購入した。

供試動物

科研製薬株式会社 (静岡県藤枝市, HS 財団認定番号: 15-047) の動物実験ガイ

ドラインに従って倫理的に配慮して動物を飼育した。4週齢の BALB/cAnNCrlCrlj

系統の雌性マウスを日本チャールス・リバー株式会社 (厚木繁殖センター, 神奈

川県厚木市) から購入し，7日間以上実験環境に馴化させた。飼育室を温度 23 ± 3

ºC，湿度 50 ± 20%に設定し，飼育室内の換気頻度を 1時間あたり 17回以上とし

た。明暗サイクルを 12時間とし，7:00～19:00 を明期とした。1ケージ (W 160 mm

× D 300 mm × H 140 mm, 床敷きケージ) 当たり 3～4匹のマウスを収容した。馴

化期間中，基礎飼料 (オリエンタル酵母工業株式会社, 東京都板橋区) 及び上水

(静岡県藤枝市) を自由摂取させた。馴化後，マウスを層別無作為化法にて，最新

の体重に基づいて各群に振り分け試験に使用した。剖検日にはマウスをイソフル

ラン麻酔下で安楽殺した。

実験方法

腫瘍組織における AKAP13 発現解析には，第 2章の AOM/DSS 誘発大腸癌抑制

試験の AOM 群 (対照群) 及び AOM+DSS 群の大腸組織を用いた。

48

大腸炎組織における AKAP13 発現解析では，群及び動物数を下表の通りとした。

群名称 被験物質 DSS 濃度 動物数 (匹)

Week 1 Week 2 Week 3

DSS - 4% 9 9 9

Control - - 6 0 6

大腸炎組織における AKAP13 発現解析では，DSS を注射用水 (株式会社大塚製

薬工場, 徳島県鳴門市) に 4 w/v%の用量にて溶解させ，給水ビンを用いて飲水投

与した。Control 群には自由に上水 (静岡県藤枝市) を飲水させた。DSS 飲水投与

は 1 週間 (week 0～week 1) として，その後，1 又は 2 週間の休薬期間を設けた

(week 2～week 3)。休薬期間中は自由に上水 (静岡県藤枝市) を飲水させた。Week

1，week 2及び week 3 に剖検した。飼育期間中には一般状態観察 (毎日)，体重測

定 (1週間に 1回以上)，糞便のスコア観察 (week 1, week 2, week 3) 及び糞便採取

(week 1, week 2, week 3) を実施した。

剖検時に大腸を採取し大腸長 (回盲部～肛門) を測定の後，病理組織学検査及

び免疫組織化学染色用に遠位大腸を 10% 中性緩衝ホルマリンで固定した。

Real-time RT-PCR による遺伝子解析のために，残りの大腸を切開し，生理食塩液

による洗浄を行った後にカミソリの刃を用いて粘膜を剥離し，RNAlater®

Stabilization Solution (Life Technologies, USA) 中に採取し，使用時まで-80℃にて保

管した。

糞便スコア

糞便スコアとして，下痢スコア及び出血スコアを求めた。便潜血の判定には，

尿潜血検査試薬 (ウリエース CK, テルモ株式会社, 東京都渋谷区) を使用した。

49

糞便スコアの基準は，下痢スコアを 0: normal stool，1: softer stool，2: unformed stool，

3: diarrhea，4: no stool，出血スコアを 0: no blood，1: weak hemoccult-positive，2:

moderate hemoccult-positive，3: strong hemoccult-positive，4: visual bloodとした (63)。

糞便中カルプロテクチン濃度測定

大腸炎の指標として糞便中カルプロテクチン濃度を測定した (143-144)。測定

には ELISA kit (S100A8/S100A9 ELISA kit, Catalog No.K6936, Immundiagnostik AG,

Bensheim, Germany) を用いた。

糞便 20 mgにつき 1 mLのExtraction Buffer (キットの一部) を加えて溶液を調製

した。測定時のサンプル希釈倍率は 50倍とし，主波長 450 nm及び対照波長 620 nm

における吸光度を duplicate にて測定した。その他の操作は測定キットの説明書に

従い実施した。測定結果を Softmax pro (Molecular Devices, ver.6) を用いて解析し

た。DSS 飲水投与動物では，各時点に採取した糞便のうち 30 mg以上の糞便が回

収されたサンプル各 6例分を測定対象とした。Control 群では day 7 においてラン

ダムに選んだ 4例分を測定対象とした。

病理組織学的検査

固定した遠位大腸の全長を長軸に切り出し，常法に従ってパラフィン包埋，薄

切及び H&E 染色を行い，病理学的変化を解析した。一部の個体については，常

法に従って PAS 及びトルイジンブルー染色を行った。

50

免疫組織化学染色

腫瘍組織における AKAP13 発現解析では，第 2 章の長期評価 AOM 群及び

AOMD+DSS 群のうち，4% パラホルムアルデヒドによる固定を行った各群 4 匹

の組織を使用し，β-catenin，AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 の免疫組織化学染色

を実施した。大腸炎組織における AKAP13 発現解析では，AKAP13，ROCK1，

ROCK2，PCNA，Ki-67，IL-6，cytokeratin，vimentin 及び Iba1 について免疫組織

化学染色を実施した (Table 9)。免疫組織化学染色をいずれも以下の手順で実施し

た。脱パラフィンした標本を必要に応じてオートクレーブを用いて 121°C，15分

の抗原賦活を行い，3% H2O2メタノール液で内因性ペルオキシダーゼを除去した。

一次抗体反応は室温又は 4°C の条件下で行った。抗原抗体反応の可視化には

Envision Dual Link System-HRP (Dako, Glostrup, Denmark) 及 び Liquid

DAB+Substrate Chromogen System (Dako, Glostrup, Denmark) を用い，取扱い手順に

従い実施した。次いで，標本をヘマトキシリンで対比染色し，顕微鏡検査のため

にカバーガラスで封入した。

免疫組織化学的蛍光染色

免疫組織化学的蛍光染色によって，IL-6 及び cytokeratin の共局在を確認した。

10% 中性緩衝ホルマリンで固定し，常法に従ってパラフィン包埋及び薄切した大

腸組織を使用した。免疫組織化学的蛍光染色を以下の手順で実施した。まず，脱

パラフィンした組織を pH 9.0の条件下で 121°C，15分のオートクレーブ処理によ

り内因性ペルオキシダーゼを除去した。その後，1 次抗体を室温で 2 時間反応さ

せ，2次抗体として Alexa Fluor-conjugated antibodies (1:200; Alexa Fluor488/Alexa

51

Fluor568, ab150113/ab175471, Abcam，Cambridge, UK) を用い室温で 2時間反応さ

せ，4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Life Technologies) による核染色を実施し

た。蛍光顕微鏡システム (VS120 Fluorescence BX53, Olympus) を用いて観察を行

い IV100 software (オリンパス株式会社, 東京都新宿区) で解析を実施した (145)。

Real-time RT-PCR

RNeasy® MiniKit (QIAGEN, Hilden, Germany) を使用し，キットの取扱説明書に

従って大腸粘膜の total RNA を抽出した。cDNA 合成には，QuantiTect reverse

transcription kit (QIAGEN, Hilden, Germany) を使用し，1サンプルあたり 1 µgの

total RNA を用いて，キットの取扱説明書に従い実施した。Real-time RT-PCR は

QuantiFast SYBRGreen PCR kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 及び AriaMx Real-Time

PCR System (Agilent Technologies Inc., Santa Clara，CA，USA) を使用した。PCR

primersは Akap13，Rock1，Rock2，proliferating cell nuclear antigen (Pcna)，Il-6及

び glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) はタカラバイオ株式会社 (滋

賀県草津市) 又は QIAGEN (Hilden, Germany) からの購入品を使用した。NADPH

oxidase 1 (Nox1) の PCR primers は F: ATGGATTTTCTAAACTACCGTCTCTT，R:

CAAAGTTTAATGCTGCATGACC (5’-3’) を使用した。測定値は Gapdh で補正し

2-ΔΔCT

method で解析した (146)。

統計解析

大腸炎組織における AKAP13 発現解析では，体重，糞便中カルプロテクチン濃

度及び大腸長は Student’s t-test によって解析した。糞便スコアを Wilcoxon

52

signed-rank test にて解析した。Real-time RT-PCR による遺伝子解析データは外れ

値検定を行った後，Dunnett’s multiple comparison にて解析した。いずれの解析に

おいても有意水準を両側 5%とした。統計解析には SAS (SAS InstituteInc., Cary,

NC) 及び EXSUS (株式会社 CAC クロア, 東京都中央区) を使用した。

53

結果

腫瘍組織における免疫組織化学染色

AOM 群において腫瘍性病変は認められなかった。AOM 群の正常組織において

AKAP13 及び ROCK1 陽性像は粘膜管腔側上皮の細胞質内に軽度に認められ，

ROCK2 の染色性は低かった (Figure 13)。第 2 章の AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試

験では，腫瘍性病変を low-grade異形成，high-grade異形成，腺腫及び腺癌の 4種

に細分類した。AOM+DSS 群における腫瘍性病変部では，AKAP13 及び ROCK1

が粘膜上皮の細胞質内で弱陽性を示し，正常組織と比較して染色強度が増加した。

さらにその染色強度は，low-grade異形成から腺癌までの悪性度に応じて増加した。

腺管状増殖パターンを示す領域では AKAP13 及び ROCK1 の染色強度が増した。

一部の腫瘍細胞では，ROCK1 が細胞質だけではなく核内にも陽性を示した。一

方，腫瘍細胞における ROCK2の染色強度は弱く，ROCK1と比較して弱いながら

も，管腔側領域や腺管状増殖領域では染色強度が増した。

体重，臨床検査及び大腸長 (大腸炎組織における AKAP13発現解析)

DSS 群の体重は，week 2 及び week 3 において，control 群と比較して有意に減

少した (Table 10)。DSS 群の体重減少は，week 2 で最も顕著であり，week 3にか

けて回復傾向を示した。DSS 群の糞便スコアは week 2において最も高く，week 2

以降で回復傾向を示した。糞便中カルプロテクチン濃度も糞便スコアと一致して

week 2 において有意に増加し week 3 にかけて回復傾向を示した。大腸長は DSS

群において control 群と比較して，全ての時点で短縮が認められた。DSS 群の大

54

腸長は week 2において最も低値を示し，week 3 にかけて回復傾向を示した。

Real-time RT-PCR (大腸炎組織における AKAP13 発現解析)

DSS 群において有意差は認められないものの week 1に Akap13 が高発現し，そ

の後，減少した (Figure 14)。実験期間を通じて Rock1及び Rock2の発現に明らか

な変化は認められなかった。DSS 群における Pcnaの mRNA発現量は week 1にお

いて有意に減少し，その後，week 2 から week 3 にかけて回復した。Nox1 の mRNA

発現量は week 1 において減少し，week 3 では control 群と比較して有意に増加し

た。Il-6の mRNA発現量は week 2 で最も高値を示したが control 群と比較して，

有意差は認められなかった。

病理組織学的検査 (大腸炎組織における AKAP13 発現解析)

Control 群では，実験期間を通じて正常な陰窩の形態と粘膜上皮の配列が認めら

れた (Figure 15)。陰窩は杯細胞を含む円柱上皮で覆われ，深く規則的に整列して

いた。DSS 群では week 1 において，陰窩が浅くなるために粘膜が菲薄化し，こ

のような陰窩には，扁平化した上皮や細胞質に粘液を多量に含んだ上皮が観察さ

れた。Week 2 においては粘膜欠損が認められた一方で，単層の好塩基性上皮が粘

膜表面を覆う再生初期像が散見された。粘膜固有層には好中球を主体とする高度

な炎症細胞浸潤が認められた。Week 3では粘膜欠損部は減少して未成熟陰窩の形

成が認められ，炎症細胞浸潤は軽減した。未成熟陰窩は好塩基性の細胞質を示し，

杯細胞に乏しく不規則に分岐する形態であった。Week 2 から week 3 にかけて，

粘膜固有層では好酸性細胞質を有する上皮様の細胞塊が認められた (Table 10,

55

Figure 16)。細胞塊は数個の細胞からなり，一部で管腔状構造を示した。トルイジ

ンブルー染色及び PAS 染色には陰性を示した。なお，肥満細胞及び杯細胞がそれ

ぞれトルイジンブルー染色及び PAS 染色にそれぞれ陽性反応を示すことを確認

している。細胞塊の数は week 2 において最も増加し，week 3 には減少した。な

お，細胞塊は AOM/DSS誘発大腸癌抑制試験においても粘膜固有層に散見された。

免疫組織化学染色及び蛍光染色 (大腸炎組織における AKAP13発現解析)

Control 群では AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 が腫瘍組織における免疫組織化

学染色の AOM 群の正常組織と同様の染色性を示すことを確認した。DSS 群では

AKAP13が week 1の変性粘膜上皮及び week 2及び week 3の再生粘膜上皮に強染

した (Figure 17)。Week 2 及び week 3 では，AKAP13 の染色強度は，再生陰窩よ

り潰瘍部を覆う単層粘膜上皮において強かった。DSS 群では，ROCK1 が変性粘

膜上皮で強陽性を示した。一方，ROCK2陽性は変性粘膜上皮の 8割程度であり，

ROCK2と比較して，ROCK1が強い染色強度を示した。同様に再生粘膜上皮での

ROCK1 の染色強度は，ROCK2 と比較して強かった。粘膜固有層の細胞塊は

AKAP13，ROCK1及び ROCK2に加えて，IL-6及び cytokeratinに陽性を示したが，

Ki-67，vimentin 及び Iba1 には陰性を示した。蛍光免疫組織化学染色において，

粘膜固有層の細胞塊において IL-6及び cytokeratinの共局在を確認した (Figure 18)。

56

考察

AKAP13は，ヒト大腸腫瘍において発現することが知られる足場蛋白質である。

Hu らはヒト大腸腫瘍の免疫組織化学染色において腺癌の 52.3%が AKAP13 に陽

性を示し，腺腫 (9.1%) と正常組織 (34.7%) に比べて高発現することを報告して

いる (80)。彼らの研究では，AKAP13 の mRNA 及び蛋白質の両方が腫瘍の悪性

度と相関して発現増加することが示されている。しかし，大腸腫瘍において

AKAP13 と ROCKの両方について発現解析した報告はない。本章では，AOM/DSS

誘発大腸癌モデルの腫瘍性病変において，AKAP13 に加え，下流のエフェクター

分子である ROCK1 及び ROCK2 の発現を免疫組織化学的に解析した。解析の結

果，マウス AKAP13 はヒトと同様に，腫瘍性病変部の粘膜上皮において陽性を示

し，異形成から腺癌まで大腸腫瘍の悪性化に伴って染色強度が増加した。また，

ROCK1 は AKAP13 と同様に腫瘍の悪性化に伴って発現が増加したが，ROCK2

の発現増加は明らかではなかった。本解析により明らかとなった ROCK1 と

ROCK2の染色強度の違いは，正常マウスの大腸及び小腸では ROCK1 が主であり，

ROCK2 の免疫組織化学的は無視できる程度にわずかであったとの既報と一致し

ている (147)。また，Rho シグナルが細胞骨格の調節だけでなく p21 の発現抑制

や Cyclin D1の発現促進を介して細胞周期進行の制御に関与し (148)，AKAP13 が

Rho を介して腫瘍を形成する (149-150) との報告があることから，AKAP13 は

ROCK1を介して大腸における腫瘍形成を促進する可能性が考えられる。

消化管の粘膜損傷や粘膜治癒など病的状態における AKAP13 の役割は，これま

でに検討されていない。そこで，マウス DSS 誘発大腸炎モデルを用いて Akap13

57

の mRNA及び蛋白質の発現を解析した。Real-time RT-PCR では，Akap13 の mRNA

発現量が week 1 に一時的に増加したが，免疫組織化学的染色では，week 1 から

week 3 まで継続して AKAP13 の強陽性像が認められた。この mRNAと蛋白質の

発現時期の違いは，転写と翻訳との間の時間差及び AKAP13 の安定性 (151) によ

るものと推察される。AKAP13 が足場を提供する反応分子には，ERK (76, 152)，

MAPK (153) 及び NF-κB (154) 等の大腸炎の発現において重要な役割を果たす炎

症及び細胞増殖に関与するシグナル伝達分子が含まれる。本章では，ROCK1 及

び ROCK2 のうち，特に ROCK1 が AKAP13 とともに，粘膜表面及び陰窩の上部

領域上の好塩基性細胞において高発現することを示した。これらの細胞は傷害断

端から遊走する restituted cell及び細胞増殖を伴う再生粘膜上皮であると考えられ

る。粘膜の修復反応を real-time RT-PCR にて確認したところ，細胞増殖マーカー

である Pcna及び酸化ストレス発生源である NADPX oxidaseの構成分子であり，

粘膜保護にも関連する Nox1 (21) の mRNA発現レベルは week 1 に減少し，その

後，week 2～week 3 において増加した。そのため，DSS 誘発大腸炎モデルの回復

期において AKAP13/ROCK シグナルが細胞増殖の亢進に関与し，粘膜修復を促進

している可能性が考えられる。

AKAP13は心臓においてRhoAとROCKを介して inhibitor κB kinase β (IKKβ) の

活性化を調節し，この過程で形成される AKAP13/IKKb 活性化複合体は IL-6の転

写を介して (76)，α1-アドレナリン誘発性心肥大及び細胞増殖を引き起こす (138)。

IL-6は消化管粘膜においても，粘膜損傷時に粘膜バリア機能を維持するために重

要であり (155)，さらに IBDにおける慢性腸炎の促進にも重要な役割を担う (156)。

そこで，DSS 誘発大腸炎の粘膜損傷時及び修復期の IL-6発現を免疫組織化学的蛍

58

光染色によって解析した。その結果，IL-6 はマクロファージやリンパ球等の炎症

細胞だけではなく，粘膜固有層の細胞塊で発現していた。本細胞塊は cytokeratin

に陽性を示すことから上皮由来であると考えられるが，その正確な由来及び機能

は本検討では明らかでなく，このような細胞塊の報告はこれまでなされていない。

既報において，IL-6 は IBD 患者及びその動物モデルにおいて，マクロファージ，

樹状細胞，リンパ球及び粘膜上皮に局在し (157-158)，多機能性炎症誘発性サイ

トカインとして DSS 誘発性大腸炎の際に粘膜上皮をアポトーシスから保護する

ことが示されている (158-159)。粘膜固有層の上皮細胞塊における IL-6，AKAP13，

ROCK1及び ROCK2 の共局在は，AKAP13 が ROCK1及び ROCK2 を介して IL-6

の発現に関与している可能性を示唆し，大腸炎モデルにおいて粘膜治癒を調節す

る因子である可能性が考えられる。

結論として，本章ではマウスを用いた AOM/DSS 誘発大腸癌モデル及び DSS 誘

発大腸炎モデルの様々な病的状態において，AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 が粘

膜上皮に発現することを示した。大腸炎では，AKAP13 及び ROCK1 が粘膜損傷

から修復までの過程に関与する可能性があり，IBD患者にとって重要な治療標的

となり得ると考えられる。したがって，粘膜上皮に特異的な ROCK シグナル伝達

の増加は，急性大腸炎モデルにおける粘膜治癒を促進する可能性がある。さらに，

粘膜修復期において，AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 を発現する上皮細胞塊を初

めて見出した。上皮細胞塊は AKAP13，ROCK1 及び ROCK2に加えて，消化管粘

膜の維持に重要な役割を有する IL-6 を発現することから，ROCK1 及び ROCK2

を介した IL-6産生が粘膜治癒に間接的に関与する可能性が示唆されたが，上皮細

胞塊が粘膜治癒に与える影響についてはさらなる検証が必要である。

59

小括

第 3章では，第 1章で実施した cDNAマイクロアレイ解析で抽出された分子

の中から大腸炎又は大腸癌に関連すると考えられた AKAP13 を抽出し，解析を行

った。解析には，第 2章で得た AOM/DSS 誘発大腸癌抑制試験におけるマウス大

腸腫瘍組織と 1週間の 4% DSS飲水投与と 1又は 2週間の DSS休薬によって得た

DSS 誘発大腸炎における炎症期及び回復期の組織を用いた。解析対象は，AKAP13

とそのエフェクター分子である ROCK1及び ROCK2 とし，real-time RT-PCR によ

る mRNA発現解析及び免疫組織化学染色による蛋白質発現解析を実施した。

その結果，AKAP13，ROCK1及び ROCK2 は正常な粘膜上皮では弱陽性を示す

のみであったが，マウス大腸腫瘍組織では，腫瘍性病変の悪性度に伴って染色強

度が増加した。大腸炎では，炎症期の変性上皮と回復期に認められる再生上皮で

AKAP13 と ROCK1 が強染した。ROCK2 の染色強度は，大腸腫瘍組織及び大腸炎

組織において AKAP13 及び ROCK1と比較して同等以下であった。以上の結果よ

り，消化管の病態時には AKAP13 と ROCK1 が関連して機能すると考えられた。

また，AKAP13/ROCKシグナルは大腸炎及び大腸癌の過程で細胞増殖に関与する

可能性が示唆された。

さらに，粘膜治癒過程の粘膜固有層において AKAP13，ROCK1 及び ROCK2

を発現する上皮細胞塊が認められた。これらの細胞が AKAP13，ROCK1 及び

ROCK2 に加えて，多機能性炎症誘発サイトカインである IL-6 を発現することか

ら，粘膜修復への関与が示唆された。

60

第 4章

DSS 誘発大腸炎における ROCK 阻害の影響に関する検討

61

諸言

消化管粘膜上皮は，消化管腔内の有害物質に対する重要なバリアとして機能し

(160) ，粘膜バリアの異常は IBD を含む様々な消化器疾患で認められる (161)。

消化管粘膜が傷害された場合，初期の治癒過程において傷害部断端の粘膜上皮が

細胞増殖を伴うことなく傷害部に遊走し，粘膜バリア欠損部を覆う即時応答が知

られている (162)。粘膜治癒過程におけるこのプロセスは “restitution” と呼ばれ，

様々なサイトカイン及び成長因子や，細胞外マトリックスとインテグリン依存性

の相互作用によっても調節されている (163)。傷害部位に遊走する粘膜上皮，す

なわち restituted cell の細胞内制御機構は複雑であり，細胞膜上に存在するインテ

グリンと連動するアクチンフィラメントの動的リモデリングが最も重要な要素

となる (164)。Restitution の後，傷害部周囲に残存した粘膜上皮が増殖・分化し，

粘膜バリアが再構築されることで粘膜の恒常性が回復する (162, 165, 166-168)。

第 3章において，AKAP13 及び ROCK1が DSS 誘発大腸炎の炎症期及び回復期

において発現することを示した。AKAP13とそのエフェクター分子であるROCK1

及び ROCK2 (169) は，粘膜上皮の極性と遊走に関与することが示されている

(170)。ROCK1 及び ROCK2 が活性化することでミオシン軽鎖のリン酸化を引き

起こし restitution の際の細胞遊走に必要な著明なアクチンフィラメントの動的リ

モデリングを制御している (171)。しかし，大腸炎モデルにおいて AKAP13 と

ROCK を介した restitution の関連性はこれまで検討されていない。そこで第 4 章

では急性期及び亜急性期の DSS 大腸炎モデルに ROCK 阻害剤を適用し，

AKAP13/ROCK シグナルの restitution に対する関与を検討した。

62

材料及び方法

試験物質

DSS (分子量: 36,000-50,000, CAS番号: 9011-18-1) をMP Biomedicals (Santa Ana,

CA, USA) より購入した。5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU, 純度: > 98%, CAS 番号:

59-14-3) を東京化成工業株式会社 (東京都中央区) より購入した。ROCK のリン

酸化阻害剤である fasudil hydrochloride hydrate (FH, 製品名: エリル点滴静注液 30

mg) を旭化成ファーマ株式会社 (東京都千代田区) より購入した。

供試動物

科研製薬株式会社 (静岡県藤枝市, HS 財団認定番号: 15-047) の動物実験ガイ

ドラインに従って倫理的に配慮して動物を飼育した。4週齢の BALB/cAnNCrlCrlj

系統の雌性マウスを日本チャールス・リバー株式会社 (厚木繁殖センター, 神奈

川県厚木市) から購入し，7日間以上実験環境に馴化させた。飼育室を温度 23 ± 3

ºC，湿度 50 ± 20%に設定し，飼育室内の換気頻度を 1時間あたり 17回以上とし

た。明暗サイクルを 12時間とし，7:00～19:00 を明期とした。1ケージ (W 160 mm

× D 300 mm × H 140 mm, 床敷きケージ) 当たり 3～5匹のマウスを収容した。馴

化期間中，基礎飼料 (オリエンタル酵母工業株式会社, 東京都板橋区) 及び上水

(静岡県藤枝市) を自由摂取させた。馴化後，マウスを層別無作為化法にて，最新

の体重に基づいて各群に振り分け試験に使用した。剖検日にはマウスをイソフル

ラン麻酔下で安楽殺した。

63

実験方法

群及び動物数を下表の通りとした。

①急性期 DSS 誘発大腸炎

群名称 被験物質 (用量) DSS 濃度 動物数 (匹)

Day 4 Day 6 Day 8

DSS - 4% 9 9 9

DSS+FH FH (10 mg/kg1)

) 4% 9 9 9

Control - - - - 6

FH FH (10 mg/kg1)

) - - - 4

1) 1日 2 回，皮下投与した。

②亜急性期 DSS 誘発大腸炎

群名称 被験物質 (用量) DSS 濃度 動物数 (匹)

Day 16

DSS - 2% 5

DSS+FH FH (10 mg/kg1)

) 2% 5

1) 1日 2 回，皮下投与した。

2) DSS 群及び DSS+FH 群に 100 mg/kg の BrdUを day 15に腹腔内投与した。

DSS を注射用水 (株式会社大塚製薬工場, 徳島県鳴門市) に 2又は 4 w/v%の用

量で溶解させ給水ビンを用いて飲水投与した。Control 群には自由に上水 (静岡県

藤枝市) を飲水させた。FHを 10 mg/kgの用量で 1日 2回，反復皮下投与した。

Control 群には生理食塩液 (株式会社大塚製薬工場, 徳島県鳴門市) を同様に皮下

投与した。

急性期DSS誘発大腸炎におけるROCK阻害試験では，4% DSSを飲水投与した。

DSS 飲水投与と同時に FHの皮下投与を開始した。DSS 飲水投与は 8日間 (day 1

～day 8) として day 4, 6, 8 に剖検した。亜急性期 DSS 誘発大腸炎における ROCK

阻害試験では，軽度の大腸炎を誘発し，その回復反応を観察するため急性期 DSS

64

誘発大腸炎よりも用量の低い 2% DSSを飲水投与した。DSS飲水投与と同時に FH

の皮下投与を開始した。DSS 飲水投与は 16 日間 (day 1～day 16) として day 16

に剖検した。100 mg/kgの BrdUを剖検日の前日に腹腔内投与した。いずれの試験

においても飼育期間中には一般状態観察 (毎日) 及び体重測定 (1 週間に 1 回以

上) を実施した。

剖検時には大腸を摘出し，大腸長測定，病理学的検査，免疫組織化学染色及び

遺伝子解析を実施し，ROCK阻害剤の影響を確認した。また，day 6 及び day 8 で

は剖検時に血漿を採取し，血漿中 serum amyloid A (SAA) 濃度を測定した。遠心

分離 (3000 rpm，15 分) により血液から血漿を分離した。大腸については大腸長

(回盲部～肛門) を測定の後，病理組織学検査，免疫組織化学染色及び遺伝子解析

用 (急性期 DSS 誘発大腸炎における ROCK 阻害試験のみ) に処理した。病理組織

学検査及び免疫組織化学染色のために，遠位大腸を 4% パラホルムアルデヒドで

固定した。Real-time RT-PCR による遺伝子解析のために，残りの大腸を切開し，

生理食塩液による洗浄を行った後にカミソリの刃を用いて粘膜を剥離し，

RNAlater® Stabilization Solution (Life Technologies, USA) 中に採取し，使用時まで

-80℃にて保管した。

血漿中 SAA濃度測定

全身性の炎症の指標として血漿中 SAA濃度を測定した (172)。測定には ELISA

Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA) を用い，取り扱い説明書に従

って測定した。

65

病理組織学的検査及び免疫組織化学染色

遠位大腸の横断組織又は長軸断組織について，常法に従ってパラフィン包埋，

薄切及び H&E染色を行った。

急性期 DSS 誘発大腸炎における ROCK 阻害試験では，遠位大腸の横断組織を

用いた。H&E染色標本を用いて粘膜下水腫，粘膜欠損及び炎症細胞浸潤の程度を

スコア化した。粘膜下水腫スコアを 1: なし，2: 限局性，3: 多巣性，4: び漫性，

粘膜欠損スコアを 1: なし，2: < 1/4，3: 1/4～1/2，4: 1/2～3/4，5: > 3/4，炎症細胞

浸潤スコアを 1: なし，2: 軽度，3: 中等度，4: 重度とした。亜急性期 DSS 誘発

大腸炎における ROCK 阻害試験では，遠位大腸の長軸断組織を用いた。H&E 標

本を用いて観察した全長に対する粘膜欠損の割合 (粘膜欠損率，%) を算出した。

免疫組織化学染色

免疫組織化学染色を AKAP13，ROCK1，ROCK2，cytokeratin，BrdU 及び PCNA

について実施した (Table 11)。免疫組織化学染色を以下の手順で実施した。脱パ

ラフィンした標本を必要に応じてオートクレーブを用いて 121°C，15分の抗原賦

活を行い，3% H2O2メタノール液で内因性ペルオキシダーゼを除去した。一次抗

体反応は室温又は 4°C の条件下で行った。抗原抗体反応の可視化には Envision

Dual Link System-HRP (Dako, Glostrup, Denmark) 及び Liquid DAB+Substrate

Chromogen System (Dako, Glostrup, Denmark) を用い，取扱い手順に従い実施した。

次いで，標本をヘマトキシリンで対比染色し，顕微鏡検査のためにカバーガラス

で封入した。亜急性期 DSS 誘発大腸炎における ROCK 阻害試験では，PCNA 免

疫組織化学染色標本を用いて restitution 率 (%) を算出した。restitution 率は潰瘍部

66

(正常な陰窩間) に対する PCNA陰性単層上皮の割合とした。

Real-time RT-PCR

RNeasy® MiniKit (QIAGEN, Hilden, Germany) を使用し，キットの取扱説明書に

従って大腸粘膜の total RNA を抽出した。cDNA 合成には，QuantiTect reverse

transcription kit (QIAGEN, Hilden, Germany) を使用し，1サンプルあたり 1 µgの

total RNA を用いて，キットの取扱説明書に従い実施した。Real-time RT-PCR は

QuantiFast SYBRGreen PCR kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 及び AriaMx Real-Time

PCR System (Agilent Technologies Inc., Santa Clara，Agilent Technologies Inc., Santa

Clara，CA，USA) を使用した。PCR primers は Akap13，Rock1，Rock2，Pcna 及

び Gapdh はタカラバイオ株式会社 (滋賀県草津市 ) 又は QIAGEN (Hilden,

Germany) からの購入品を使用した。測定値は Gapdhで補正し 2-ΔΔCT

methodで解

析した (146)。

統計解析

粘膜欠損スコアを各時点の DSS 群と DSS+FH 群をWilcoxon signed-rank test に

て解析した。体重，大腸長，血漿中 SAA濃度，粘膜欠損率，restitution率及び real-time

RT-PCR データを検査時点ごとに Student’s t-test にて解析した。Real-time RT-PCR

データから検定前に外れ値を除外した。いずれの解析においても有意水準を両側

5%とした。統計解析には SAS (SAS InstituteInc., Cary, NC) 及び EXSUS (株式会社

CAC クロア, 東京都中央区) を使用した。

67

結果

体重，臨床検査及び大腸長 (急性期)

FH群及び DSS+FH 群では，FHの薬理作用である血管拡張により投与後数時間

にわたって耳，鼻，尾，四肢端の紅潮が認められた (後述する亜急性期 DSS 誘発

大腸炎における ROCK 阻害試験でも同様であった)。体重は day 4 及び day 6 にお

いて，DSS 群と DSS+FH 群の間に有意な変化は認められなかった (Table 12)。Day

8 では DSS 処置により DSS 群では control 群及び FH 群と比較して体重が減少し

た。さらに DSS+FH 群の体重は，DSS 群と比較して低値であった。Control 群及

び FH群では体重推移の差は認められなかった。大腸長は DSS+FH 群の day 4 及

び day 8 において DSS 群と比較して短かった。DSS 群の大腸長は，実験期間を通

して control 群及び FH 群と比較して短かった。

血漿中 SAA濃度 (急性期)

DSS 群の血漿中 SAA濃度は control 群及び FH群と比較して高値であった。Day

6では DSS+FH群の血漿中 SAA濃度が DSS 群と比較して有意に増加し，day 8 で

は各群で同程度であった (Figure 19A)。

病理組織学的検査 (急性期)

遠位大腸組織において，control 群及び FH群に異常は認められなかった (Table

12)。DSS 群では，粘膜下水腫，粘膜固有層～粘膜下組織における炎症細胞浸潤

及び粘膜欠損が day 6 及び day 8 に認められた。Day 8 では，DSS+FH 群の炎症細

68

胞浸潤スコア及び合計スコア (水腫，炎症細胞浸潤及び粘膜欠損) が DSS 群と比

較して有意に増加した。DSS+FH群の粘膜欠損スコアは，DSS 群と比較して増加

傾向を示した (Figure 19B)。第 3章で観察された好酸性細胞質と円型核を有する

上皮細胞塊がday 8において粘膜固有層に散見された。その数はDSS+FH群でDSS

群と比較してわずかながら増加傾向を示した。

Real-time RT-PCR (急性期)

Akap13 の mRNA 発現は，DSS+FH 群では DSS 群と比較して有意に減少した

(Table 12)。Rock1 及び Rock2の mRNA発現は，day 4 及び day 6 において，DSS+FH

群が DSS 群と比較して増加傾向を示した。Rock2の mRNA発現は，day 4 におい

て DSS+FH群では DSS 群と比較して有意に増加した。Day 6 及び day 8 において

も Rock2のmRNA発現は，DSS+FH群が DSS群と比較して依然として高かった。

FH 群の Akap13，Rock1 及び Rock2 の発現は，control 群と同程度であった。Pcna

の mRNA発現は，DSS 群及び DSS+FH群では day 4 及び day 6 において，control

群と比較して減少傾向を示した。Day 8 では DSS 群では control 群と比較して減少

傾向を示したものの，DSS+FH 群では増加の傾向は認められず day 6 と同程度で

あった。

免疫組織化学染色 (急性期)

Control 群では，第 3 章と同様に，管腔側粘膜上皮の細胞質において AKAP13

及び ROCK1の弱陽性像が観察されたが，ROCK2 の染色性は低かった (Figure 20)。

FH群の AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 の染色強度は，各時点の control 群と同程

69

度であった。DSS 処置により，day 4 から上皮細胞質内に AKAP13 と ROCK1 の

中程度の染色強度が認められ，day 6 及び day 8 にかけて徐々に染色強度及び陽性

領域が増加し，陰窩から上皮の内腔表面で観察された。ROCK2 陽性像は，DSS

群では day 8 において control 群と比較してわずかに増加した。各時点の DSS+FH

群で AKAP13，ROCK1 及び ROCK2の染色強度は，DSS 群と同程度であった (data

not shown)。

体重及び大腸長 (亜急性期)

体重はDSS群及びDSS+FH群ともに，day 8からday 12にかけて徐々に減少し，

day 13 以降に回復する傾向が認められた (Figure 21A)。DSS+FH群では day 10 以

降に体重減少が顕著であったが，DSS 群との有意差は認められなかった。大腸長

は，DSS+FH群では DSS 群より短くなる傾向が認められた。

病理組織学的検査 (亜急性期)

DSS群及びDSS+FH群において粘膜上皮の変性及び再生と粘膜固有層～粘膜下

層における炎症細胞浸潤が観察された(Figure 21B)。粘膜欠損率は，DSS+FH群で

は DSS 群と比較して増加傾向がみられた (Figure 21C)。上皮細胞塊が粘膜固有層

において観察された。上皮細胞塊の数は，DSS 群と比較して DSS+FH 群において

わずかに増加したものの明らかな差は認められなかった (Figure 22C)。

免疫組織化学染色 (亜急性期)

粘膜欠損部を覆う単層の好塩基性上皮 (潰瘍被覆上皮) が AKAP13 に対する免

70

疫組織化学染色に陽性を示した (Figure 23)。AKAP13 陽性の単層上皮は抗 BrdU

免疫組織化学染色及び抗 PCNA 免疫組織化学染色に対して陰性を示した(Figure

22A)。Restitution 率は，DSS+FH 群において，DSS 群と比較して有意に減少した

(Figure 22B)。

71

考察

ROCK は粘膜バリアの維持に重要な役割を有しており (173)，粘膜傷害時の傷

害部断端からの残存粘膜上皮の遊走である restitution にも関与している (174)。第

4章では，マウスDSS誘発大腸炎の粘膜欠損及び回復時におけるAKAP13，ROCK1

及び ROCK2の役割について検討するために，ROCK 阻害剤を用いて DSS 誘発大

腸炎での粘膜応答に及ぼす影響を調べた。

まず，急性期DSS誘発大腸炎のサンプルを用いて，大腸炎初期におけるAkap13，

Rock1 及び Rock2 の遺伝子発現を継時的に解析した。第 2 章において，DSS は大

腸粘膜において細胞増殖の阻害により大腸炎を誘発することを示したが，本章に

おいても，DSS 誘発大腸炎による粘膜欠損が認められる以前の day 4 より Pcna

の発現減少が認められ，同時に，Akap13の発現増加が確認された。免疫組織化学

染色による AKAP13 蛋白質の発現解析において，day 4において細胞質における

染色強度が増加することを確認した。AKAP13 陽性細胞は，粘膜の内腔表面側か

ら陰窩底部に向かって分布し，かつ，DSS 飲水投与期間の延長に従い分布領域が

拡大した。AKAP13 と ROCK1 及び ROCK2 との発現を比較したところ，ROCK1

の陽性細胞の継時的変化は AKAP13 と同様であったが，ROCK2 の陽性細胞の変

化はごくわずかであった。RhoA は消化管粘膜の恒常性及び粘膜バリア機能を維

持するための細胞センサーとして傷害初期に機能する可能性が考えられている

(175)。AKAP13 も RhoA と同様に，ROCK1 及び ROCK2のうち特に ROCK1と協

調して粘膜バリアの維持に関与しているものと推察された。

次に，亜急性期 DSS 誘発大腸炎のサンプルを用いて，大腸炎の修復段階の

72

AKAP13 発現と細胞増殖活性の関連性について解析した。その結果，AKAP13 は

BrdU 及び PCNA に陰性の潰瘍被覆上皮において発現することを確認した。傷害

後の初期応答として，損傷を受けた粘膜上皮の脱落と増殖を伴わない粘膜上皮の

遊走によって粘膜バリアが再確立される。この過程は restitution と呼ばれ，細胞

増殖を伴わない (176-178)。したがって，増殖活性を示さない AKAP13 陽性細胞

は，粘膜傷害初期応答として遊走した restituted cell であると考えられた。

さらに，ROCK1及びROCK2のリン酸化阻害剤であるFHによるAKAP13/ROCK

シグナルの阻害が，マウス DSS 誘発大腸炎モデルの急性期及び亜急性期に与える

影響を検討した。両試験において，FH の皮下投与後数時間には，耳，鼻，尾及

び四肢端等に紅潮を生じることを確認した。この FH 投与後の変化は，血管平滑

筋細胞における ROCK1 及び ROCK2 のリン酸化阻害を介した末梢血の血管拡張

によると考えられる (179, 180)。FH の併用処置は，急性及び亜急性 ROCK 阻害

試験において，体重減少及び全身炎症の憎悪と大腸における粘膜欠損及び炎症を

もたらした。本結果は，restitution 率の減少で示されるように，FH が ROCKシグ

ナルを阻害して上皮の restitution を抑制したことによる修復遅延に起因すると推

察された。しかし，他の ROCK阻害剤を用いた試験では本結果と異なる知見が得

られている。ROCK 阻害剤として Y-27632 を使用した場合，マウス又はラットに

おける放射線誘発性腸炎及び粘膜バリア機能障害 (181) や，虚血‐再灌流時の腸

炎及び酸化ストレス産生 (182-183) が低減することが報告されている。これらの

効果は，白血球及び血小板の ROCK抑制によるケモカイン産生抑制のためである

と考察されている。消化管における ROCK 阻害の影響は，使用された疾患モデル

及び試験条件，また，粘膜上皮とその他の血球に対する ROCK 阻害剤の感受性の

73

違いに依存するものであり，本章と既報との結果の違いについてさらなる検証が

必要である。

炎症期粘膜固有層における上皮細胞塊は，第 3章において AKA13 及び ROCK1

及び ROCK2 を発現したことから，ROCK 阻害剤の影響を受ける可能性が考えら

れた。しかし，亜急性期試験において DSS 群と DSS+FH 群間の上皮細胞塊の数

に差は認められなかった。本試験系においては上皮細胞塊の機能は不明であり，

また，ROCK阻害剤の上皮細胞塊の機能への影響の評価には至っていない。しか

しながら，上皮細胞塊は AKAP13，ROCK1 及び ROCK2に加えて，多機能性サイ

トカインである IL-6 を発現していることから粘膜修復に関与する可能性が示唆

され，さらなる研究が必要と考えられた。

本章ではDSS誘発大腸炎における ROCK阻害剤の影響を検討した。その結果，

AKAP13 は restituted cell において発現するとともに，ROCK 阻害剤によって

restitution が抑制され大腸炎が増悪した。粘膜バリアの反復的な障害は，IBDを含

む様々な消化器疾患で認められる変化であり，障害された粘膜バリアはその都度

修復される必要がある (161)。近年の IBD 治療では，治療目標を粘膜の再生を誘

導して寛解に導く“粘膜治癒”としており (10)，本結果は AKAP13/ROCK シグ

ナルを介して粘膜治癒を促進する IBD に対する新規治療物質の開発の可能性を

示唆するものである。

74

小活

第 3章においてAKAP13/ROCKシグナルがマウスの大腸炎及び大腸癌における

細胞増殖に関与する可能性が示された。そこで第 4 章では，消化管粘膜での

AKAP13/ROCK の役割を明らかにするため AKAP13，ROCK1及び ROCK2の大腸

炎初期における発現を解析するとともに，ROCK 阻害が DSS 誘発大腸炎に与える

影響について解析した。BALB/cマウスに，4% DSS を 8日間 (急性期試験) 又は

2% DSS を 16 日間 (亜急性期試験) 飲水投与した。飲水投与期間中には，ROCK

のリン酸化阻害剤である fasudil hydrochloride hydrate (FH, 10 mg/kg) を 1日 2回，

皮下投与した。剖検後，大腸組織の遺伝子発現，組織病理学的変化及び免疫組織

化学染色による蛋白質発現を解析した。その結果，AKAP13 は正常上皮では管腔

側粘膜上皮の細胞質に弱発現するのみであったが，急性期試験では DSS 誘発大腸

炎の粘膜傷害に先行して染色強度が増すとともに，DSS 飲水投与期間の延長に伴

って発現細胞の分布が陰窩まで拡大した。亜急性期試験では，粘膜傷害初期応答

として潰瘍部を被う PCNA陰性の粘膜上皮 restituted cell に AKAP13 が発現した。

両試験において，FH 投与により，遠位大腸における粘膜欠損，全身性炎症マー

カーである血漿中 serum amyloid A濃度及び病理組織学検査的スコアが FH非投与

群と比較して増加の傾向を示した。また，亜急性期試験においては，FH 投与に

よって PCNA陰性上皮を指標とした restitution 率の抑制が認められた。

これらの結果から，消化管における AKAP13 の機能として restitution の制御が

考えられた。また，AKAP13/ROCK シグナルが DSS 誘発大腸炎において傷害初期

に作用し，粘膜修復及び大腸粘膜の恒常性維持に関与する可能性が示唆された。

75

結論

日本では近年 IBD 患者数が増加傾向にあり，新規治療物質・治療法の開発及び

分子機序の解明が必要とされている。IBDは難治性炎症性疾患であり，IBDによ

る慢性炎症は潜在的な発癌リスクであることから，新規治療物質・治療法では粘

膜治癒を誘導し炎症を軽減させることが求められている。そこで本研究では，IBD

及び IBD に続発する大腸炎関連大腸癌の予防又は治療に効果的な物質の探索と

病態に関連する分子機序の探索を目的とした。

第 1章では，IBD 及び大腸炎関連大腸癌には血小板の活性化と炎症反応によっ

て生じる ROS が関与しているとの既知情報から，PDE3阻害作用を介した血小板

凝集抑制剤である CZ と抗酸化物質である EMIQ 及び ALA を新規予防/治療物質

の候補に選定した。マウス DSS 誘発大腸炎モデルを用いて，これら 3物質の大腸

炎抑制作用を検証した結果，3物質ともに大腸炎の病態の指標とした糞便スコア，

大腸長短縮，血漿中サイトカイン濃度の増加及び組織傷害が改善した。これらの

ことから，CZ，EMIQ 及び ALAは大腸炎抑制作用を有すると考えられた。

第 2 章では CZ，EMIQ 及び ALA の有効性のさらなる検証として，マウス

AOM/DSS 誘発大腸癌モデルを用いて，大腸癌抑制作用を検証した。その結果，

初期病変の検出を目的とした短期評価では 3 物質に共通して前癌病変である

MDF 数が減少した。腫瘍形成の程度の比較を目的とした長期評価においては，

CZ 及び EMIQ 処置群で大腸重量及び腫瘤容積が減少した。加えて第 2 章では，

大腸炎及び大腸癌抑制作用の機序を，ヒト大腸癌細胞を用いた in vitro 試験及び

短期 DSS誘発大腸炎抑制試験にて検証したところ，in vitro試験では CZ及び ALA

76

がヒト大腸癌細胞株の増殖抑制作用を示した。また，短期 DSS 誘発大腸炎抑制試

験では，DSS 誘発大腸炎の初期において DSS が大腸粘膜上皮の増殖活性を減少

させることが明らかとなり，CZ及び EMIQ はこの DSS 毒性を軽減した。

これらのことから第 1章及び第 2章で認められた大腸炎及び大腸癌抑制作用の

機序として，直接的な抗炎症作用 (CZ, EMIQ, ALA) 及び DSS 毒性の軽減による

二次的な抗炎症作用 (CZ, EMIQ) 並びに腫瘍細胞に対する直接的な増殖抑制作

用 (CZ, ALA) が大腸炎及び大腸癌抑制作用に関与することが示唆された。これ

らの結果を総合して，CZ 及び EMIQ の 2 物質が AOM/DSS 誘発大腸癌モデルに

おいて大腸癌抑制作用を示すと結論付けた。今後のさらなる有効性の検証によっ

て，CZ及び EMIQ の IBD及び大腸炎関連大腸癌の治療への応用が期待される。

第 3 章及び第 4 章では，大腸炎関連分子の探索を目的に，第 1 章で実施した

cDNA マイクロアレイ解析によって抽出した AKAP13 に着目して検討を行った。

まず，第 3章では，AKAP13 に加えて AKAP13 のエフェクター分子である ROCK1

及び ROCK2の発現をマウス AOM/DSS誘発大腸癌モデル及び DSS誘発大腸炎モ

デルを用いて検証した。また，第 4章では，ROCK1 及び ROCK2のリン酸化阻害

剤を用いて ROCK1 及び ROCK2の阻害が DSS 誘発大腸炎の病態に与える影響を

検討した。第 3章の結果から，AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 はマウス大腸癌に

おいて発現し，その発現はヒトと同様に大腸腫瘍の悪性度に伴って亢進すること

が明らかとなった。DSS 誘発大腸炎モデルにおいては，炎症期の変性上皮及び再

生上皮に発現することを示した。また，第 4 章では大腸炎の炎症に先行して

AKAP13 と ROCK1 が粘膜上皮に発現することを示した。さらに粘膜傷害初期応

答として潰瘍部に遊走した restituted cell に AKAP13 が発現し，ROCK1 及び

77

ROCK2阻害によって粘膜上皮の restitutionが抑制されて大腸炎が増悪することが

示された。

以上より，第 3章及び第 4章を通じて，AKAP13 は DSS 誘発大腸炎の炎症初期

にはROCK1を介して傷害に対する粘膜上皮の初期応答である restitutionを制御し，

DSS 誘発大腸炎の回復期及び腫瘍性病変では ROCK1 及び ROCK2 を介して細胞

増殖に関与する可能性が示唆された。さらに，大腸炎修復期の粘膜固有層におい

て出現する上皮細胞塊を見出した。上皮細胞塊は AKAP13，ROCK1 及び ROCK2

に加えて，粘膜の恒常性維持及び増殖に関与する多機能性サイトカインである

IL-6を発現していることから粘膜修復に関与する可能性が示唆され，さらなる研

究が必要と考えられた。

現在のところ，IBD の治療目標とされている粘膜治癒については，有効な治療

法の確立には至っておらず，有効物質の探索及び分子機序の解明が求められてい

る。本研究結果を通じて CZ 及び EMIQ が治療物質として有効である可能性が示

された。さらに，大腸炎の炎症期及び回復期における ROCKシグナル伝達の増強

は，粘膜治癒を促進する可能性があり，本研究結果は粘膜治癒を誘導する治療法

の開発の一助となることが期待される。

78

謝辞

本稿を終えるにあたり，本研究に関して長年に渡る御指導，御鞭撻，御協力を

賜りました東京農工大学大学院農学研究院動物生命科学部門病態獣医学研究分

野獣医病理学研究室 吉田敏則准教授に深甚なる謝意を表します。

実験期間中，貴重な御指導，御助言を賜りました東京農工大学大学院農学研究

院動物生命科学部門病態獣医学研究分野獣医病理学研究室 渋谷淳教授に厚く御

礼申し上げます。

本稿作成に際し，懇篤な御指導を賜りました，帯広畜産大学基礎獣医学研究部

門病態予防学分野病態病理学研究室 古岡秀文教授，岩手大学農学部共同獣医学

科比較薬理毒性学研究室 佐藤洋教授，岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科病

態獣医学 酒井洋樹准教授，東京農工大学大学院農学研究院動物生命科学部門農

学部獣医学科獣医薬理学研究室 佐々木一昭准教授に，感謝申し上げます。

本研究の全般にわたる親身な御指導と研究環境の提供に御配慮を頂きました

科研製薬株式会社新薬創生センター薬物動態・安全性部 箕輪賢治部長に拝謝致

します。被験物質を御提供頂きました，三栄源エフ・エフ・アイ株式会社安全性

科学部 林新茂先生，各種解析に御指導，御協力を賜りました，国立がん研究セ

ンター研究所基盤的臨床開発研究コアセンター動物実験部門 落合雅子先生，千

葉県がんセンター研究所発がん制御研究部 筆宝義隆先生に深謝致します。

最後に，科研製薬株式会社及び東京農工大学獣医病理学研究室の皆様の御協力

がなければ成し得ませんでした。ここに心より感謝申し上げます。

79

要旨

炎症性腸疾患 (inflammatory bowel disease, IBD) は，近年，日本において増加傾

向にある難治性疾患である。本研究では IBD の新規予防・治療物質及び関連分子

の探索を目的として，マウスモデルを用いた実験を行った。IBDの病態には，血

小板の活性化と活性酸素種による組織傷害が関与することが知られているため，

血小板凝集抑制剤の cilostazol (CZ) と，抗酸化物質である酵素処理イソクエルシ

トリン (enzymatically modified isoquercitrin, EMIQ) 及び α-リポ酸 (α-lipoic acid,

ALA) を候補物質として取り上げ，第 1章では dextran sulfate sodium (DSS) 誘発

大腸炎モデル，第 2 章では azoxymethane (AOM)/DSS 誘発大腸癌モデルを用いて

効果を検証した。また，第 1章にて cDNAマイクロアレイ解析を行い大腸炎関連

分子の探索を行い，抽出された A-kinase anchor protein 13 (AKAP13) について第 3

章及び第 4章にて大腸炎及び大腸癌への関与を検証した。

第 1章では 0.3% CZ，1.5% EMIQ又は 0.2% ALA を混餌投与するとともに，5%

DSS を 8日間飲水投与して大腸炎を誘発した。体重，糞便スコア，大腸長，血漿

中サイトカイン濃度，病理組織学的スコアを指標として大腸炎抑制作用を検証し

た。その結果，CZ，EMIQ及び ALAが糞便スコア，血漿中 interleukin (IL)-6及び

tumor necrosis factor α 濃度及び病理組織学的スコアを低下させた。これらの結果

より，これら 3 物質は大腸炎抑制作用を有すると考えられた。また，cDNA マイ

クロアレイ解析において 3物質に共通して Akap13の発現減少が認められた。

第2章では，AOM/DSS誘発大腸癌モデルを用いて大腸癌抑制作用を検証した。

CZ，EMIQ及び ALA の用量は第 1章と同様とし，AOM (10 mg/kg, i.p.) 単回投与

80

及び 3% DSS の飲水投与により大腸癌を誘発した。大腸長，大腸重量，腫瘤数，

腫瘤容積，ムチン枯渇巣 (mucin depleted foci, MDF) 数，変異陰窩巣数を指標とし

て大腸癌抑制作用を検証した。その結果，EMIQ及び ALAがMDF数を有意に減

少させた。さらに，CZ 及び EMIQ は大腸重量及び腫瘤容積を減少させた。これ

らの結果より，CZ及び EMIQが大腸癌抑制作用を有すると考えられた。

さらに第 2章では，大腸炎及び大腸癌抑制作用の機序を検証することを目的に，

DSS 誘発大腸炎の初期変化及びヒト大腸癌細胞株の細胞増殖への影響を評価し

た。その結果，DSS 誘発大腸炎の初期において DSS は大腸粘膜上皮の増殖を抑

制し，CZ及び EMIQ は DSS から大腸粘膜を保護することにより大腸炎を軽減さ

せることが明らかとなった。さらに in vitro 試験では，CZ 及び ALA がヒト大腸

癌の増殖活性を低下させることが明らかとなった。

第 3章では，第 1章で抽出された AKAP13 分子に加えて，その下流のエフェ

クター分子である Rho-associated coiled-coil containing protein kinase (ROCK) 1及び

ROCK2 の大腸炎及び大腸癌における発現を real-time RT-PCR 又は免疫組織化学

染色にて解析した。解析対象は，4% DSS を 1週間飲水投与した炎症期組織と，

その後 1 又は 2 週間 DSS を休薬した回復期組織及び第 2 章で作製した大腸腫瘍

組織とした。その結果，AKAP13，ROCK1 及び ROCK2は正常組織と比べて，大

腸炎では炎症期の変性上皮と回復期に認められる再生上皮で強染し，大腸腫瘍組

織では腫瘍性病変の悪性度に伴って染色強度が増加した。ROCK2 の染色強度は

AKAP13 及び ROCK1 と比較して弱かったことから，AKAP13 は ROCK1 と関連

して機能すると考えられ，その染色態度より AKAP13/ROCK シグナルは大腸炎及

び大腸癌の過程で細胞増殖に関与する可能性が示唆された。さらに，第 3章の検

81

討を通じて粘膜治癒過程の粘膜固有層において AKAP13，ROCK1 及び ROCK2

を発現する上皮細胞塊を見出し，これらの細胞が多機能性サイトカインである

IL-6を発現することから，上皮細胞塊が粘膜治癒に与える影響が示唆された。

第 4章では，消化管粘膜における AKAP13/ROCK シグナルの役割を明らかにす

るため AKAP13，ROCK1 及び ROCK2 の大腸炎初期の発現解析を行うとともに，

ROCK 阻害が大腸炎に与える影響を確認した。4% DSS を 8 日間 (急性期) 又は

2% DSSを 16日間 (亜急性期) 飲水投与するとともにROCK1及びROCK2のリン

酸化阻害剤を投与した。AKAP13，ROCK1及び ROCK2の発現を real-time RT-PCR

又は免疫組織化学染色にて解析し，さらに，体重，血漿中 serum amyloid A (SAA)

濃度，大腸長，病理組織学的スコア及び粘膜傷害の初期応答指標である restitution

率を用いて DSS 誘発大腸炎における ROCK 阻害の影響を検証した。その結果，

DSS誘発大腸炎急性期においてAKAP13及び ROCK1は粘膜傷害に先行して発現

することを確認した。また，亜急性期には潰瘍部を覆う増殖活性を伴わない遊走

粘膜上皮である restituted cellにAKAP13が発現することが明らかとなった。また，

ROCK 阻害により血漿中 SAA 濃度及び病理組織学的スコアが増加し，大腸炎が

増悪された。ROCK 阻害による大腸炎増悪の原因と推察される restitution 率の抑

制が認められた。以上より，AKAP13 は ROCK1 を介した粘膜傷害の初期応答

restitution の制御に関与する可能性が考えられた。なお，粘膜固有層において

AKAP13，ROCK1及び ROCK2を発現する上皮細胞塊の発現数に ROCK 阻害剤の

影響がなかったことから，現時点でその意義は不明であるが，粘膜修復への関与

についてさらなる研究が必要である。

現在のところ，有効な IBD治療法は確立されておらず，さらなる有効物質の探

82

索及び分子機序の解明が求められている。第 1章及び第 2章で得られた結果より，

CZ及びEMIQが新規 IBD予防/治療物質として有用である可能性が示された。IBD

の予防/治療への応用のためには，さらなる効果の検証に加えて，安全性の検証が

必要であると考えられる。さらに，第 3章及び第 4章で得られた結果より，AKAP13

は大腸における粘膜傷害に応答し，ROCK シグナルを介して粘膜修復及び粘膜恒

常性の維持に関与すると考えられ，粘膜治癒を誘導する治療法への応用の可能性

が示唆された。CZ及び EMIQ の大腸炎抑制機序と AKAP13/ROCK シグナルに関

するさらなる検討が，今後，IBDの新規予防・治療薬の分子標的の探索の一助と

なることが期待される。

83

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is an intractable disease whose incidence has been

increasing in Japan in recent years. The aim of this study was to search for new

prophylactic/therapeutic substances and related molecular mechanisms for IBD using

mouse models. It is known that the pathology of IBD involves platelet activation and

tissue injury by reactive oxygen species (ROS). Therefore, we selected cilostazol (CZ),

an antiplatelet aggregation agent, and the antioxidants enzymatically modified

isoquercitrin (EMIQ) and α-lipoic acid (ALA), as candidate prophylactic/therapeutic

substances for IBD. The effects of CZ, EMIQ, and ALA were examined using a dextran

sulphate sodium (DSS)-induced colitis model in chapter 1, and an azoxymethane

(AOM)/DSS-induced colon cancer model in chapter 2. In chapter 1, cDNA microarray

analysis was performed to search for colitis-related molecules, and A-kinase anchor

protein 13 (AKAP13) was detected. In chapter 3 and 4, involvement of AKAP13 in

colitis and colon cancer in murine models was verified.

In the first chapter, mice were given a diet with 0.3% CZ, 1.5% EMIQ, or 0.2% ALA

and challenged with 5% DSS in drinking water for 8 days to induce colitis. The effects

against DSS-induced colitis were evaluated by analysing the body weight change, faecal

score, colon length, plasma cytokine levels, and histopathological scores. CZ, EMIQ, and

ALA supplementation reduced the faecal score, plasma interleukin (IL)-6/tumor necrosis

factor α concentration, and histopathological scores. Therefore, it was considered that

these three agents have anti-colitis effects. In addition, through cDNA microarray

analysis, expression of AKAP13 was found to be decreased because of diet

supplementation with all three drugs as compared to the expression in the no-treatment

group.

84

In chapter 2, the inhibitory effect of CZ, EMIQ, or ALA on colon cancer was

examined using the AOM/DSS-induced colon cancer model. Mice were given CZ, EMIQ,

or ALA at the same dose as that described in Chapter 1, and were administrated a AOM

single injection (10 mg/kg, i.p.) and drinking water with 3% DSS to induce colon cancer.

The effects against AOM/DSS-induced colon cancer were evaluated by analysing the

colon length, colon weight, mass number, mass volume, mucin-depleted foci (MDF)

number, and aberrant crypt foci number. The number of MDF was significantly

decreased because of diet supplementation with EMIQ and ALA. In addition, CZ and

EMIQ reduced the colon weight and tumor volume. Hence, CZ and EMIQ were thought

to have suppressive effects on colon cancer.

In addition, in chapter 2, we evaluated the initial change in DSS-induced colitis and

the effect on cell proliferation in a human colon cancer cell line with the aim of revealing

the anti-colitis/colon cancer mechanism of DSS. We found that DSS suppressed the

epithelial proliferation in the colon mucosa during the early stage of DSS-induced colitis,

and CZ and EMIQ alleviated colitis by blocking the action of DSS on the epithelia.

Furthermore, in vitro studies revealed that CZ and ALA reduced the proliferation of

human colon cancer cell lines.

In chapter 3, the expression of AKAP13, a molecule selected via cDNA microarray

analysis in chapter 1, and Rho-associated coiled-coil containing protein kinase (ROCK)

1/2, which are downstream effectors of AKAP13, were analysed by real-time RT-PCR

and immunohistochemical staining in tissues from colitis and colon cancer models. To

analyse these expressions during the inflammatory stage and recovery stage of colitis,

mice were challenged with 4% DSS for a week and then, DSS was withdrawn for 1 or 2

weeks. The colon neoplastic tissues were obtained from the experiments described in

85

chapter 2. Via immunohistochemical staining, AKAP13, ROCK1, and ROCK2 were

found to be strongly expressed in the degenerative epithelial cells in the inflammatory

phase and in the regenerating epithelial cells in the recovery phase in colitis tissues

compared to the expression in normal tissues. In the colon neoplastic tissue, the

expression levels of AKAP13, ROCK1, and ROCK2 were associated with the

malignancy of the neoplastic lesion. Since the staining of ROCK 2 was weaker than that

of AKAP13 and ROCK1, AKAP13 was considered to co-operate with ROCK1, and be

involved in cell proliferation. Furthermore, through examination in chapter 3, we found

epithelial cell clumps in the mucosal lamina propria expressing AKAP13, ROCK1, and

ROCK2 during the mucosal healing process. Since the clumps also express

multifunctional cytokine IL-6, it was thought that it would be worthwhile to further

investigate the involvement of these clumps in mucosal healing.

In chapter 4, in order to clarify the role of AKAP13/ROCK signaling in

gastrointestinal mucosa, we carried out expression analysis of AKAP13, ROCK1, and

ROCK2 in the early colitis stage, and performed a ROCK inhibition study. Mice were

given drinking water with 4% DSS for up to 8 days (acute phase) or 2% DSS for 16 days

(subacute phase) and were injected (s.c.) with a ROCK1/2 phosphorylation inhibitor. The

expressions of AKAP13, ROCK1, and ROCK2 were analysed by real-time RT-PCR or

immunohistochemical staining. The effects of ROCK inhibition were evaluated by

analysing the body weight change, plasma serum amyloid A (SAA) level, colon length,

histopathological score, and restitution rate, an index of early healing response following

mucosal injury. It was confirmed that AKAP13 and ROCK1 were expressed prior to

mucosal injury in the acute phase of DSS-induced colitis. Moreover, it was revealed that

AKAP13 was expressed in restituted cells, which are proliferating cell nuclear

86

antigen-negative monolayer epithelial cells covering the ulcer in the subacute phase. In

addition, the ROCK inhibiter administration exacerbated colitis, resulting in an increase

in plasma SAA levels and histopathological scores. ROCK inhibition was also found to

suppress the restitution rate, and this was presumed to be the cause of the colitis

exacerbation. From these results, it was suggested that AKAP13 might control the

restitution during the early phase of mucosal injury through ROCK1.

Currently, effective IBD therapy has not been established, and it is necessary to further

search for effective substances and elucidate the molecular mechanisms. The results

obtained in chapter 1 and 2 showed that CZ and EMIQ may be useful as new therapeutic

substances for IBD. Before application of CZ and EMIQ in IBD therapy, additional

verification of the efficacy and safety is considered necessary. Furthermore, the results

obtained in chapter 3 and 4 suggested that AKAP13 might respond to mucosal injury and

participate in the mucosal repair or maintenance of mucosal homeostasis via ROCK1

signaling, might be applycated to the therapy for mucosal healing. Further studies on the

anti-colitis mechanism of CZ and EMIQ, and AKAP13/ROCK signaling are expected to

be helpful for developing therapeutic methods to induce mucosal healing.

87

引用文献

1 Fakhoury M, Negrulj R, Mooranian A, Al-Salami H. (2014). Inflammatory bowel

disease: clinical aspects and treatments. J Inflamm Res. 7, 113-120.

2 Kaser A, Zeissig S, Blumberg RS. (2010). Inflammatory bowel disease. Annu Rev

Immunol. 28, 573-621.

3 小林拓, 日比紀文. (2009). 炎症性腸疾患: 診断と治療の進歩 I．炎症性腸疾

患の概念・定義と疫学. 日内会誌. 98, 5-11.

4 Aguilera M, Darby T, Melgar S. (2014). The complex role of inflammasomes in

the pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases–Lessons learned from

experimental models. Cytokine Growth Factor Rev. 25, 715-730.

5 Fakhoury M, Negrulj R, Mooranian A, Al-Salami H. (2014). Inflammatory bowel

disease: clinical aspects and treatments. J Inflamm Res. 7, 113-120.

6 渡辺守. (2015). 教育講演 潰瘍性大腸炎の治療の進歩 第 112 回日本内科

学会講演会 イノベーションで拓く内科学 . 日本内科学会雑誌 . 104,

1980-1985.

7 Wu Y, Antony S, Meitzler JL, Doroshow JH. (2014). Molecular mechanisms

underlying chronic inflammation-associated cancers. Cancer Lett. 345, 164-173.

8 藤谷幹浩, 高後裕. (2013). 潰瘍性大腸炎と粘膜治癒. 日本消化機病學會雜

誌. 乙. 110, 1900-1908.

9 D'Haens G, Sandborn WJ, Feagan BG, Geboes K, Hanauer SB, Irvine EJ,

Lemann M, Marteau P, Rutgeerts P, Scholmerich J, Sutherland LR. (2007). A

review of activity indices and efficacy end points for clinical trials of medical

therapy in adults with ulcerative colitis. Gastroenterology. 132, 763-786.

88

10 Neurath MF. (2014). New targets for mucosal healing and therapy in

inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7, 6-19.

11 Olszewski AJ, Ali S. (2014). Comparative outcomes of rituximab-based systemic

therapy and splenectomy in splenic marginal zone lymphoma. Ann Hematol. 93,

449-458.

12 Meier J, Sturm A. (2011). Current treatment of ulcerative colitis. World J

Gastroenterol. 17, 3204-3212.

13 Sales-Campos H, Basso P, Alves V, Fonseca M, Bonfá G, Nardini V, Cardoso C.

(2015). Classical and recent advances in the treatment of inflammatory bowel

diseases. Braz J Med Biol Res. 48, 96-107.

14 Sun J, Zhang H, Guan L, Zhou H, Sun M. (2015). Alpha-lipoic acid attenuates

trinitrobenzene sulfonic acid-induced ulcerative colitis in mice. Int J Clin Exp

Med. 8, 358.

15 Singh K, Coburn LA, Barry DP, Asim M, Scull BP, Allaman MM, Lewis ND,

Washington MK, Rosen MJ, Williams CS. (2013). Deletion of cationic amino

acid transporter 2 exacerbates dextran sulfate sodium colitis and leads to an

IL-17-predominant T cell response. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305,

G225-G240.

16 Trivedi PP, Jena GB. (2013). Role of alpha-lipoic acid in dextran sulfate

sodium-induced ulcerative colitis in mice: studies on inflammation, oxidative

stress, DNA damage and fibrosis. Food Chem Toxicol. 59, 339-355.

17 Nighot P, Al-Sadi R, Rawat M, Guo S, Watterson DM, Ma T. (2015). Matrix

metalloproteinase 9-induced increase in intestinal epithelial tight junction

permeability contributes to the severity of experimental DSS colitis. Am J Physiol

89

Gastrointest Liver Physiol. 309, G988-997.

18 Zucker SD, Vogel ME, Kindel TL, Smith DL, Idelman G, Avissar U,

Kakarlapudi G, Masnovi ME. (2015). Bilirubin prevents acute DSS-induced

colitis by inhibiting leukocyte infiltration and suppressing upregulation of

inducible nitric oxide synthase. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 309,

G841-854.

19 Achiwa K, Ishigami M, Ishizu Y, Kuzuya T, Honda T, Hayashi K, Hirooka Y,

Katano Y, Goto H. (2016). DSS colitis promotes tumorigenesis and fibrogenesis

in a choline-deficient high-fat diet-induced NASH mouse model. Biochem

Biophys Res Commun. 470, 15-21.

20 Liu S, Li Y, Deng B, Xu Z. (2016). Recombinant Lactococcus lactis expressing

porcine insulin-like growth factor I ameliorates DSS-induced colitis in mice.

BMC biotechnology. 16, 1: 25.

21 加藤伸一. (2016). 消化管炎症の病態における NADPH オキシダーゼ 1

(NOX1) の役割. 日本薬理学雑誌. 147, 18-22.

22 南木康作, 水野慎大, 長沼誠, 金井隆典. (2015). 炎症性腸疾患と腸内細菌.

日本消化機病學會雜誌. 乙. 112, 1947-1955.

23 新井万里, 松岡克善, 金井隆典. (2015). I. IBD 及び IBS における腸内細菌

の関与. 日本内科学会雑誌. 104, 35-41.

24 Chinnadurai R, Ng S, Velu V, Galipeau J. (2015). Challenges in animal

modelling of mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory bowel disease.

World J Gastroenterol. April 28, 4779-4787.

25 Melgar S, Karlsson L, Rehnstrom E, Karlsson A, Utkovic H, Jansson L,

Michaelsson E. (2008). Validation of murine dextran sulfate sodium-induced

90

colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int

Immunopharmacol. 8, 836-844.

26 Perse M, Cerar A. (2012). Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps

and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617.

27 Voudoukis E, Karmiris K, Koutroubakis IE. (2014). Multipotent role of platelets

in inflammatory bowel diseases: a clinical approach. World J Gastroenterol. 20,

3180-3190.

28 Pitchford S. (2007). Novel uses for anti‐platelet agents as anti‐inflammatory

drugs. British journal of pharmacology. 152, 987-1002.

29 Balmus IM, Ciobica A, Trifan A, Stanciu C. (2016). The implications of

oxidative stress and antioxidant therapies in Inflammatory Bowel Disease:

Clinical aspects and animal models. Saudi J Gastroenterol. 22, 3-17.

30 Zhu H, Li YR. (2012). Oxidative stress and redox signaling mechanisms of

inflammatory bowel disease: updated experimental and clinical evidence. Exp

Biol Med. 237, 474-480.

31 Mouzaoui S, Djerdjouri B, Makhezer N, Kroviarski Y, El-Benna J, Dang PM.

(2014). Tumor necrosis factor-alpha-induced colitis increases NADPH oxidase 1

expression, oxidative stress, and neutrophil recruitment in the colon: preventive

effect of apocynin. Mediators Inflamm. 2014, 312484.

32 Lih-Brody L, Powell SR, Collier KP, Reddy GM, Cerchia R, Kahn E, Weissman

GS, Katz S, Floyd RA, McKinley MJ. (1996). Increased oxidative stress and

decreased antioxidant defenses in mucosa of inflammatory bowel disease. Dig

Dis Sci. 41, 2078-2086.

33 Buffinton GD, Doe WF. (1995). Depleted mucosal antioxidant defences in

91

inflammatory bowel disease. Free Radic Biol Med. 19, 911-918.

34 Oz HS, Chen TS, McClain CJ, de Villiers WJ. (2005). Antioxidants as novel

therapy in a murine model of colitis. J Nutr Biochem. 16, 297-304.

35 Hur SJ, Kang SH, Jung HS, Kim SC, Jeon HS, Kim IH, Lee JD. (2012). Review

of natural products actions on cytokines in inflammatory bowel disease. Nutr Res.

32, 801-816.

36 Crawford S. (2014). Anti-inflammatory/antioxidant use in long-term maintenance

cancer therapy: a new therapeutic approach to disease progression and recurrence.

Ther Adv Med Oncol. 6, 52-68.

37 Gresele P, Momi S, Falcinelli E. (2011). Anti-platelet therapy: phosphodiesterase

inhibitors. Br J Clin Pharmacol. 72, 634-646.

38 Ari H, Emlek N, Ari S, Coşar S, Doğanay K, Aydin C, Tenekecioğlu E, Tütüncü

A, Yontar O, Gürdoğan M. (2015). The Effect of High Dose Cilostazol and

Rosuvastatin on Periprocedural Myocardial Injury in Patients with Elective

Percutaneous Coronary Intervention. Acta Cardiologica Sinica. 31, 292.

39 Schrör K. (2002). The pharmacology of cilostazol. Diabetes Obes Metab. 4,

S14-S19.

40 Azevedo MF, Faucz FR, Bimpaki E, Horvath A, Levy I, de Alexandre RB,

Ahmad F, Manganiello V, Stratakis CA. (2014). Clinical and molecular genetics

of the phosphodiesterases (PDEs). Endocrine reviews. 35, 195-233.

41 Akiyama T, Washino T, Yamada T, Koda T, Maitani T. (2000). Constituents of

enzymatically modified isoquercitrin and enzymatically modified rutin (extract).

Shokuhin Eiseigaku Zasshi (Journal of the Food Hygienic Society of Japan). 41,

54-60.

92

42 Nishimura J, Saegusa Y, Dewa Y, Jin M, Kawai M, Kemmochi S, Harada T,

Hayashi SM, Shibutani M, Mitsumori K. (2010). Antioxidant enzymatically

modified isoquercitrin or melatonin supplementation reduces oxidative

stress-mediated hepatocellular tumor promotion of oxfendazole in rats. Arch

Toxicol. 84, 143-153.

43 Yokohira M, Yamakawa K, Saoo K, Matsuda Y, Hosokawa K, Hashimoto N,

Kuno T, Imaida K. (2008). Antioxidant Effects of Flavonoids Used as Food

Additives (Purple Corn Color, Enzymatically Modified Isoquercitrin, and

Isoquercitrin) on Liver Carcinogenesis in a Rat Medium-Term Bioassay. J Food

Sci. 73, C561-C568.

44 Fujii Y, Kimura M, Ishii Y, Yamamoto R, Morita R, Hayashi S-m, Suzuki K,

Shibutani M. (2013). Effect of enzymatically modified isoquercitrin on

preneoplastic liver cell lesions induced by thioacetamide promotion in a

two-stage hepatocarcinogenesis model using rats. Toxicology. 305, 30-40.

45 Hara, S., Morita, R., Ogawa, T., Segawa, R., Takimoto, N., Suzuki, K., ... &

Shibusawa, S. (2014). Tumor suppression effects of bilberry extracts and

enzymatically modified isoquercitrin in early preneoplastic liver cell lesions

induced by piperonyl butoxide promotion in a two-stage rat hepatocarcinogenesis

model. Exp Toxicol Pathol, 66, 225-234.

46 Kimura, M., Fujii, Y., Yamamoto, R., Yafune, A., Hayashi, S. M., Suzuki, K., &

Shibutani, M. (2013). Involvement of multiple cell cycle aberrations in early

preneoplastic liver cell lesions by tumor promotion with thioacetamide in a

two-stage rat hepatocarcinogenesis model. Exp Toxicol Pathol, 65, 979-988.

47 Morita R, Shimamoto K, Ishii Y, Kuwata K, Ogawa B, Imaoka M, Hayashi SM,

93

Suzuki K, Shibutani M, Mitsumori K. (2011). Suppressive effect of enzymatically

modified isoquercitrin on phenobarbital-induced liver tumor promotion in rats.

Arch Toxicol. 85, 1475-1484.

48 Packer L, Witt EH, Tritschler HJ. (1995). alpha-Lipoic acid as a biological

antioxidant. Free Radic Biol Med. 19, 227-250.

49 Kuwata K, Shibutani M, Hayashi H, Shimamoto K, Hayashi S-M, Suzuki K,

Mitsumori K. (2011). Concomitant apoptosis and regeneration of liver cells as a

mechanism of liver-tumor promotion by β-naphthoflavone involving

TNFα-signaling due to oxidative cellular stress in rats. Toxicology. 283, 8-17.

50 Taniai E, Yafune A, Nakajima M, Hayashi SM, Nakane F, Itahashi M, Shibutani

M. (2014). Ochratoxin A induces karyomegaly and cell cycle aberrations in renal

tubular cells without relation to induction of oxidative stress responses in rats.

Toxicol Lett. 224, 64-72.

51 Gruzman A, Hidmi A, Katzhendler J, Haj-Yehie A, Sasson S. (2004). Synthesis

and characterization of new and potent alpha-lipoic acid derivatives. Bioorg Med

Chem. 12, 1183-1190.

52 Jia Z, Hallur S, Zhu H, Li Y, Misra HP. (2008). Potent upregulation of

glutathione and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 by alpha-lipoic acid in

human neuroblastoma SH-SY5Y cells: protection against neurotoxicant-elicited

cytotoxicity. Neurochem Res. 33, 790-800.

53 Fujii Y, Segawa R, Kimura M, Wang L, Ishii Y, Yamamoto R, Morita R,

Mitsumori K, Shibutani M. (2013). Inhibitory effect of a-lipoic acid on

thioacetamide-induced tumor promotion through suppression of inflammatory

cell responses in a two-stage hepatocarcinogenesis model in rats. Chem Biol

94

Interact. 205, 108-118.

54 Shimada Y, Dewa Y, Ichimura R, Suzuki T, Mizukami S, Hayashi S-m, Shibutani

M, Mitsumori K. (2010). Antioxidant enzymatically modified isoquercitrin

suppresses the development of liver preneoplastic lesions in rats induced by

β-naphthoflavone. Toxicology. 268, 213-218.

55 Hubbard G, Stevens J, Cicmil M, Sage T, Jordan P, Williams C, Lovegrove J,

Gibbins J. (2003). Quercetin inhibits collagen‐stimulated platelet activation

through inhibition of multiple components of the glycoprotein VI signaling

pathway. J Thromb Haemost. 1, 1079-1088.

56 Lai Y-S, Shih C-Y, Huang Y-F, Chou T-C. (2010). Antiplatelet activity of

α-lipoic acid. J Agric Food Chem. 58, 8596-8603.

57 Ko W-C, Shih C-M, Lai Y-H, Chen J-H, Huang H-L. (2004). Inhibitory effects of

flavonoids on phosphodiesterase isozymes from guinea pig and their structure–

activity relationships. Biochem Pharmacol. 68, 2087-2094.

58 Lee JH, Oh GT, Park SY, Choi J-H, Park J-G, Kim CD, Lee WS, Rhim BY, Shin

YW, Hong KW. (2005). Cilostazol reduces atherosclerosis by inhibition of

superoxide and tumor necrosis factor-α formation in low-density lipoprotein

receptor-null mice fed high cholesterol. J Pharmacol Exp Ther. 313, 502-509.

59 Hase Y, Okamoto Y, Fujita Y, Kitamura A, Nakabayashi H, Ito H, Maki T,

Washida K, Takahashi R, Ihara M. (2012). Cilostazol, a phosphodiesterase

inhibitor, prevents no-reflow and hemorrhage in mice with focal cerebral

ischemia. Exp Neurol. 233, 523-533.

60 Yokohira M, Yamakawa K, Saoo K, Matsuda Y, Hosokawa K, Hashimoto N,

Kuno T, Imaida K. (2008). Antioxidant Effects of Flavonoids Used as Food

95

Additives (Purple Corn Color, Enzymatically Modified Isoquercitrin, and

Isoquercitrin) on Liver Carcinogenesis in a Rat Medium‐Term Bioassay. J Food

Sci. 73, C561-C568.

61 Salim EI, Kaneko M, Wanibuchi H, Morimura K, Fukushima S. (2004). Lack of

carcinogenicity of enzymatically modified isoquercitrin in F344/DuCrj rats. Food

Chem Toxicol. 42, 1949-1969.

62 Quinn JF, Bussiere JR, Hammond RS, Montine TJ, Henson E, Jones RE,

Stackman RW. (2007). Chronic dietary α-lipoic acid reduces deficits in

hippocampal memory of aged Tg2576 mice. Neurobiology of aging. 28, 213-225.

63 Sann H, Erichsen J, Hessmann M, Pahl A, Hoffmeyer A. (2013). Efficacy of

drugs used in the treatment of IBD and combinations thereof in acute

DSS-induced colitis in mice. Life Sci. 92, 708-718.

64 Huang TY, Chu HC, Lin YL, Lin CK, Hsieh TY, Chang WK, Chao YC, Liao CL.

(2009). Minocycline attenuates experimental colitis in mice by blocking

expression of inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinases.

Toxicol Appl Pharmacol. 237, 69-82.

65 Alex P, Zachos NC, Nguyen T, Gonzales L, Chen TE, Conklin LS, Centola M, Li

X. (2009). Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine

DSS and TNBS‐induced colitis. Inflamm Bowel Dis. 15, 341-352.

66 Gorąca A, Huk-Kolega H, Piechota A, Kleniewska P, Ciejka E, Skibska B.

(2011). Lipoic acid–biological activity and therapeutic potential.

Pharmacological Reports. 63, 849-858.

67 Skibska B, Goraca A. (2015). The protective effect of lipoic acid on selected

cardiovascular diseases caused by age-related oxidative stress. Oxid Med Cell

96

Longev. 2015.

68 Galvez-Peralta M, Wang Z, Bao S, Knoell DL, Nebert DW. (2014).

Tissue-Specific Induction of Mouse ZIP8 and ZIP14 Divalent Cation/Bicarbonate

Symporters by, and Cytokine Response to, Inflammatory Signals. Int J Toxicol.

33, 246-258.

69 Gálvez J. (2014). Role of Th17 Cells in the Pathogenesis of Human IBD. ISRN

inflammation. 2014.

70 Takada Y, Hisamatsu T, Kamada N, Kitazume MT, Honda H, Oshima Y, Saito R,

Takayama T, Kobayashi T, Chinen H. (2010). Monocyte chemoattractant

protein-1 contributes to gut homeostasis and intestinal inflammation by

composition of IL-10–producing regulatory macrophage subset. J Immunol. 184,

2671-2676.

71 Ranganathan P, Jayakumar C, Manicassamy S, Ramesh G. (2013). CXCR2

knockout mice are protected against DSS-colitis-induced acute kidney injury and

inflammation. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1422-1427.

72 Diviani D, Soderling J, Scott JD. (2001). AKAP-Lbc anchors protein kinase A

and nucleates Galpha 12-selective Rho-mediated stress fiber formation. J Biol

Chem. 276, 44247-44257.

73 Klussmann E, Edemir B, Pepperle B, Tamma G, Henn V, Klauschenz E,

Hundsrucker C, Maric K, Rosenthal W. (2001). Ht31: the first protein kinase A

anchoring protein to integrate protein kinase A and Rho signaling. FEBS Lett. 507,

264-268.

74 Klussmann E, Rosenthal W. (2001). Role and identification of protein kinase A

anchoring proteins in vasopressin-mediated aquaporin-2 translocation. Kidney Int.

97

60, 446-449.

75 Diviani D, Dodge-Kafka KL, Li J, Kapiloff MS. (2011). A-kinase anchoring

proteins: scaffolding proteins in the heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301,

H1742-1753.

76 del Vescovo CD, Cotecchia S, Diviani D. (2013). A-kinase-anchoring

protein-Lbc anchors IkappaB kinase beta to support interleukin-6-mediated

cardiomyocyte hypertrophy. Mol Cell Biol. 33, 14-27.

77 Neumeister VM, Anagnostou V, Siddiqui S, England AM, Zarrella ER,

Vassilakopoulou M, Parisi F, Kluger Y, Hicks DG, Rimm DL. (2012).

Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein

expression in breast cancer tissues. J Natl Cancer Inst. 104, 1815-1824.

78 Feher LZ, Pocsay G, Krenacs L, Zvara A, Bagdi E, Pocsay R, Lukacs G, Gyory F,

Gazdag A, Tarko E, Puskas LG. (2012). Amplification of thymosin beta 10 and

AKAP13 genes in metastatic and aggressive papillary thyroid carcinomas. Pathol

Oncol Res. 18, 449-458.

79 Nome T, Thomassen GOS, Bruun J, Ahlquist T, Bakken AC, Hoff AM, Rognum

T, Nesbakken A, Lorenz S, Sun J, Barros-Silva JD, Lind GE, Myklebost O,

Teixeira MR, Meza-Zepeda LA, Lothe RA, Skotheim RI. (2013). Common

Fusion Transcripts Identified in Colorectal Cancer Cell Lines by

High-Throughput RNA Sequencing. Transl Oncol. 6, 546-IN545.

80 Hu JK, Wang L, Li Y, Yang K, Zhang P, Chen XZ, Wang R, Zhou ZG. (2010).

The mRNA and protein expression of A-kinase anchor proteins 13 in human

colorectal cancer. Clin Exp Med. 10, 41-49.

81 大島浩子. (2014). 『慢性炎症と胃がん発生』 炎症性微小環境と TNF-α に

98

よる胃がん発生促進機序. 日本薬理学雑誌. 143, 279-282.

82 Hussain SP, Harris CC. (2007). Inflammation and cancer: an ancient link with

novel potentials. Int J Cancer. 121, 2373-2380.

83 Sabharwal SS, Schumacker PT. (2014). Mitochondrial ROS in cancer: initiators,

amplifiers or an Achilles' heel? Nat Rev Cancer. 14, 709-721.

84 Fernandes JV, Cobucci RN, Jatoba CA, Fernandes TA, de Azevedo JW, de

Araujo JM. (2015). The role of the mediators of inflammation in cancer

development. Pathol Oncol Res. 21, 527-534.

85 Wang Z, Li S, Cao Y, Tian X, Zeng R, Liao DF, Cao D. (2016). Oxidative Stress

and Carbonyl Lesions in Ulcerative Colitis and Associated Colorectal Cancer.

Oxid Med Cell Longev. 2016, 9875298.

86 Meier J, Sturm A. (2011). Current treatment of ulcerative colitis. World J

Gastroenterol. 17, 3204-3212.

87 Itzkowitz SH, Yio X. (2004). Inflammation and cancer IV. Colorectal cancer in

inflammatory bowel disease: the role of inflammation. Am J Physiol Gastrointest

Liver Physiol. 287, G7-17.

88 Tanaka T. (2009). Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental

animal studies. J Carcinog. 8, 1: 5.

89 Tanaka T. (2012). Development of an inflammation-associated colorectal cancer

model and its application for research on carcinogenesis and chemoprevention.

Int J Inflam. 2012, 658786.

90 Lim S, Xu J, Kim J, Chen TY, Su X, Standard J, Carey E, Griffin J, Herndon B,

Katz B, Tomich J, Wang W. (2013). Role of anthocyanin-enriched purple-fleshed

sweet potato p40 in colorectal cancer prevention. Mol Nutr Food Res. 57,

99

1908-1917.

91 Nimptsch K, Zhang X, Cassidy A, Song M, O'Reilly EJ, Lin JH, Pischon T,

Rimm EB, Willett WC, Fuchs CS, Ogino S, Chan AT, Giovannucci EL, Wu K.

(2016). Habitual intake of flavonoid subclasses and risk of colorectal cancer in 2

large prospective cohorts. Am J Clin Nutr. 103, 184-191.

92 Sehitoglu MH, Farooqi AA, Qureshi MZ, Butt G, Aras A. (2014). Anthocyanins:

Targeting of Signaling Networks in Cancer Cells. Asian Pacific J Cancer Prev.

15, 2379-2381.

93 Shi N, Clinton SK, Liu Z, Wang Y, Riedl KM, Schwartz SJ, Zhang X, Pan Z,

Chen T. (2015). Strawberry phytochemicals inhibit azoxymethane/dextran

sodium sulfate-induced colorectal carcinogenesis in Crj: CD-1 mice. Nutrients. 7,

1696-1715.

94 Thomasset S, Berry DP, Cai H, West K, Marczylo TH, Marsden D, Brown K,

Dennison A, Garcea G, Miller A, Hemingway D, Steward WP, Gescher AJ.

(2009). Pilot study of oral anthocyanins for colorectal cancer chemoprevention.

Cancer Prev Res. 2, 625-633.

95 Aqil F, Vadhanam MV, Jeyabalan J, Cai J, Singh IP, Gupta RC. (2014).

Detection of anthocyanins/anthocyanidins in animal tissues. J Agric Food Chem.

62, 3912-3918.

96 Tanaka T, Kohno H, Suzuki R, Yamada Y, Sugie S, Mori H. (2003). A novel

inflammation ‐ related mouse colon carcinogenesis model induced by

azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer science. 94, 965-973.

97 MacFarlane AJ, McEntee MF, Stover PJ. (2014). Azoxymethane-induced colon

carcinogenesis in mice occurs independently of de novo thymidylate synthesis

100

capacity. J Nutr. 144, 419-424.

98 Murray NR, Weems J, Braun U, Leitges M, Fields AP. (2009). Protein kinase C

βII and PKCι/λ: collaborating partners in colon cancer promotion and progression.

Cancer research. 69, 656-662.

99 Alrawi SJ, Schiff M, Carroll RE, Dayton M, Gibbs JF, Kulavlat M, Tan D,

Berman K, Stoler DL, Anderson GR. (2006). Aberrant crypt foci. Anticancer Res.

26, 107-119.

100 Caderni G, Femia AP, Giannini A, Favuzza A, Luceri C, Salvadori M, Dolara P.

(2003). Identification of Mucin-depleted Foci in the Unsectioned Colon of

Azoxymethane-treated Rats Correlation with Carcinogenesis. Cancer Research.

63, 2388-2392.

101 Pierre F, Freeman A, Taché S, Van der Meer R, Corpet DE. (2004). Beef meat

and blood sausage promote the formation of azoxymethane-induced

mucin-depleted foci and aberrant crypt foci in rat colons. J Nutr. 134, 2711-2716.

102 Santarelli RL, Vendeuvre J-L, Naud N, Taché S, Guéraud F, Viau M, Genot C,

Corpet DE, Pierre FH. (2010). Meat processing and colon carcinogenesis: cooked,

nitrite-treated, and oxidized high-heme cured meat promotes mucin-depleted foci

in rats. Cancer Prev Res. 3, 852-864.

103 Suzuki R, Kohno H, Sugie S, Nakagama H, Tanaka T. (2006). Strain differences

in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon

carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27, 162-169.

104 Kohno H, Suzuki R, Sugie S, Tanaka T. (2005). Suppression of colitis-related

mouse colon carcinogenesis by a COX-2 inhibitor and PPAR ligands. BMC

Cancer. 5, 1: 46.

101

105 Tan BL, Norhaizan ME, Pandurangan AK, Hazilawati H, Roselina K. (2016).

Brewers' rice attenuated aberrant crypt foci developing in colon of

azoxymethane-treated rats. Pak J Pharm Sci. 29, 205-212.

106 Femia AP, Dolara P, Luceri C, Salvadori M, Caderni G. (2009). Mucin-depleted

foci show strong activation of inflammatory markers in

1,2-dimethylhydrazine-induced carcinogenesis and are promoted by the

inflammatory agent sodium dextran sulfate. Int J Cancer. 125, 541-547.

107 Kang S-Y, Seeram NP, Nair MG, Bourquin LD. (2003). Tart cherry anthocyanins

inhibit tumor development in ApcMin mice and reduce proliferation of human

colon cancer cells. Cancer Letters. 194, 13-19.

108 Li L, Wang L, Wu Z, Yao L, Wu Y, Huang L, Liu K, Zhou X, Gou D. (2014).

Anthocyanin-rich fractions from red raspberries attenuate inflammation in both

RAW264.7 macrophages and a mouse model of colitis. Sci Rep. 4, 6234.

109 Wang LS, Stoner GD. (2008). Anthocyanins and their role in cancer prevention.

Cancer Lett. 269, 281-290.

110 Xiao-yan Z, Zhen-ya Z, Xiao-wen Z, Masahiro Y, Ying-nan Y, Ji L. (2010).

Anthocyanins extracted from Chinese blueberry (Vaccinium uliginosum L.) and

its anticancer effects on DLD-1 and COLO205 cells. Chin Med J. 123,

2714-2719.

111 Murata K, Kameyama M, Fukui F, Ohigashi H, Hiratsuka M, Sasaki Y, Kabuto T,

Mukai M, Mammoto T, Akedo H, Ishikawa O, Imaoka S. (1999).

Phosphodiesterase type III inhibitor, cilostazol, inhibits colon cancer cell motility.

Clin Exp Metastasis. 17, 525-530.

112 Casciari J, Riordan N, Schmidt T, Meng X, Jackson J, Riordan H. (2001).

102

Cytotoxicity of ascorbate, lipoic acid, and other antioxidants in hollow fibre in

vitro tumours. Br J Cancer. 84, 1544–1550.

113 Yoo TH, Lee JH, Chun HS, Chi SG. (2013). alpha-Lipoic acid prevents p53

degradation in colon cancer cells by blocking NF-kappaB induction of RPS6KA4.

Anticancer Drugs. 24, 555-565.

114 Tsukahara T, Matsuda Y, Haniu H. (2013). Cyclic phosphatidic acid stimulates

cAMP production and inhibits growth in human colon cancer cells. PLoS One. 8,

e81139.

115 Liu X, Yang JM, Zhang SS, Liu XY, Liu DX. (2010). Induction of cell cycle

arrest at G1 and S phases and cAMP-dependent differentiation in C6 glioma by

low concentration of cycloheximide. BMC Cancer. 10, 1: 684.

116 Dorsam B, Fahrer J. (2016). The disulfide compound alpha-lipoic acid and its

derivatives: A novel class of anticancer agents targeting mitochondria. Cancer

Lett. 371, 12-19.

117 Wenzel U, Nickel A, Daniel H. (2005). alpha-Lipoic acid induces apoptosis in

human colon cancer cells by increasing mitochondrial respiration with a

concomitant O2-*-generation. Apoptosis. 10, 359-368.

118 Lazze MC, Savio M, Pizzala R, Cazzalini O, Perucca P, Scovassi AI, Stivala LA,

Bianchi L. (2004). Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in

different human cell lines. Carcinogenesis. 25, 1427-1433.

119 Shin DY, Lee WS, Lu JN, Kang MH, Ryu CH, Kim GY, Kang HS, Shin SC,

Choi YH. (2009). Induction of apoptosis in human colon cancer HCT-116 cells

by anthocyanins through suppression of Akt and activation of p38-MAPK. Int J

Oncol. 35, 1499-1504.

103

120 Yun J-M, Afaq F, Khan N, Mukhtar H. (2009). Delphinidin, an anthocyanidin in

pigmented fruits and vegetables, induces apoptosis and cell cycle arrest in human

colon cancer HCT116 cells. Mol Carcinog. 48, 260-270.

121 de Sousa EM, Vermeulen L, Richel D, Medema JP. (2011). Targeting Wnt

signaling in colon cancer stem cells. Clin Cancer Res. 17, 647-653.

122 Amado NG, Predes D, Fonseca BF, Cerqueira DM, Reis AH, Dudenhoeffer AC,

Borges HL, Mendes FA, Abreu JG. (2014). Isoquercitrin suppresses colon cancer

cell growth in vitro by targeting the Wnt/beta-catenin signaling pathway. J Biol

Chem. 289, 35456-35467.

123 Makino T, Shimizu R, Kanemaru M, Suzuki Y, Moriwaki M, Mizukami H.

(2009). Enzymatically modified isoquercitrin, alpha-oligoglucosyl quercetin

3-O-glucoside, is absorbed more easily than other quercetin glycosides or

aglycone after oral administration in rats. Biol Pharm Bull. 32, 2034-2040.

124 Nyska A, Hayashi S-m, Koyanagi M, Davis JP, Jokinen MP, Ramot Y, Maronpot

RR. (2016). Ninety-day toxicity and single-dose toxicokinetics study of

alpha-glycosyl isoquercitrin in Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 97,

354-366.

125 Kim WK, Bang MH, Kim ES, Kang NE, Jung KC, Cho HJ, Park JH. (2005).

Quercetin decreases the expression of ErbB2 and ErbB3 proteins in HT-29

human colon cancer cells. J Nutr Biochem. 16, 155-162.

126 Refolo MG, D'Alessandro R, Malerba N, Laezza C, Bifulco M, Messa C, Caruso

MG, Notarnicola M, Tutino V. (2015). Anti Proliferative and Pro Apoptotic

Effects of Flavonoid Quercetin Are Mediated by CB1 Receptor in Human Colon

Cancer Cell Lines. J Cell Physiol. 230, 2973-2980.

104

127 Zhang XA, Zhang S, Yin Q, Zhang J. (2015). Quercetin induces human colon

cancer cells apoptosis by inhibiting the nuclear factor-kappa B Pathway.

Pharmacogn Mag. 11, 404-409.

128 Kim GT, Lee SH, Kim YM. (2013). Quercetin Regulates Sestrin

2-AMPK-mTOR Signaling Pathway and Induces Apoptosis via Increased

Intracellular ROS in HCT116 Colon Cancer Cells. J Cancer Prev. 18, 264-270.

129 Kim GT, Lee SH, Kim JI, Kim YM. (2014). Quercetin regulates the sestrin

2-AMPK-p38 MAPK signaling pathway and induces apoptosis by increasing the

generation of intracellular ROS in a p53-independent manner. Int J Mol Med. 33,

863-869.

130 Araki Y, Mukaisyo K, Sugihara H, Fujiyama Y, Hattori T. (2010). Increased

apoptosis and decreased proliferation of colonic epithelium in dextran sulfate

sodium-induced colitis in mice. Oncol Rep. 24, 869-874.

131 Casciari JJ, Riordan NH, Schmidt TL, Meng XL, Jackson JA, Riordan HD.

(2001). Cytotoxicity of ascorbate, lipoic acid, and other antioxidants in hollow

fibre in vitro tumours. Br J Cancer. 84, 1544-1550.

132 Kodama-Takahashi K, Kurata A, Ohshima K, Yamamoto K, Uemura S,

Watanabe S, Iwata T. (2003). Effect of cilostazol on the ventricular escape rate

and neurohumoral factors in patients with third-degree atrioventricular block.

Chest. 123, 1161-1169.

133 髙木俊範, 原英彰. (2016). 脳卒中病態におけるシロスタゾールの可能性―

基礎研究からのアプローチ― 脳循環代謝. 日本脳循環代謝学会機関誌. 27,

277-280.

134 藤谷幹浩. (2017). 特集: 炎症性腸疾患 IV. 炎症性腸疾患と合併症との関

105

わり 静脈血栓塞栓症. 日本臨牀. 75, 455-460.

135 Diviani D, Reggi E, Arambasic M, Caso S, Maric D. (2016). Emerging roles of

A-kinase anchoring proteins in cardiovascular pathophysiology. Biochim Biophys

Acta. 1863, 1926-1936.

136 Vega FM, Ridley AJ. (2008). Rho GTPases in cancer cell biology. FEBS Lett.

582, 2093-2101.

137 Calejo AI, Tasken K. (2015). Targeting protein-protein interactions in complexes

organized by A kinase anchoring proteins. Front Pharmacol. 6, 192.

138 Sterpetti P, Marucci L, Candelaresi C, Toksoz D, Alpini G, Ugili L, Baroni GS,

Macarri G, Benedetti A. (2006). Cell proliferation and drug resistance in

hepatocellular carcinoma are modulated by Rho GTPase signals. Am J Physiol

Gastrointest Liver Physiol. 290, G624-632.

139 Wirtenberger M, Tchatchou S, Hemminki K, Klaes R, Schmutzler RK, Bermejo

JL, Chen B, Wappenschmidt B, Meindl A, Bartram CR, Burwinkel B. (2006).

Association of genetic variants in the Rho guanine nucleotide exchange factor

AKAP13 with familial breast cancer. Carcinogenesis. 27, 593-598.

140 Lewis TE, Milam TD, Klingler DW, Rao PS, Jaggi M, Smith DJ, Hemstreet GP,

Balaji KC. (2005). Tissue transglutaminase interacts with protein kinase A anchor

protein 13 in prostate cancer. Urol Oncol. 23, 407-412.

141 Raponi M, Harousseau JL, Lancet JE, Lowenberg B, Stone R, Zhang Y, Rackoff

W, Wang Y, Atkins D. (2007). Identification of molecular predictors of response

in a study of tipifarnib treatment in relapsed and refractory acute myelogenous

leukemia. Clin Cancer Res. 13, 2254-2260.

142 Sterpetti P, Hack AA, Bashar MP, Park B, Cheng SD, Knoll JH, Urano T, Feig

106

LA, Toksoz D. (1999). Activation of the Lbc Rho exchange factor

proto-oncogene by truncation of an extended C terminus that regulates

transformation and targeting. Mol Cell Biol. 19, 1334-1345.

143 Burri E, Beglinger C, von Felten S, Lehmann FS. (2015). Fecal calprotectin and

the clinical activity index are both useful to monitor medical treatment in patients

with ulcerative colitis. Dig Dis Sci. 60, 485-491.

144 Lasson A, Stotzer PO, Ohman L, Isaksson S, Sapnara M, Strid H. (2015). The

intra-individual variability of faecal calprotectin: a prospective study in patients

with active ulcerative colitis. J Crohns Colitis. 9, 26-32.

145 Onda N, Kemmochi S, Morita R, Ishihara Y, Shibutani M. (2013). In vivo

imaging of tissue-remodeling activity involving infiltration of macrophages by a

systemically administered protease-activatable probe in colon cancer tissues.

Transl Oncol. 6, 628-637.

146 Livak KJ, Schmittgen TD. (2001). Analysis of relative gene expression data using

real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25,

402-408.

147 Iizuka M, Kimura K, Wang S, Kato K, Amano M, Kaibuchi K, Mizoguchi A.

(2012). Distinct distribution and localization of Rho-kinase in mouse epithelial:

muscle and neural tissues. Cell Struct Funct. 37, 155–175.

148 Etienne-Manneville S, Hall A. (2002). Rho GTPases in cell biology. Nature. 420,

629-635.

149 Carnegie GK, Means CK, Scott JD. (2009). A-kinase anchoring proteins: from

protein complexes to physiology and disease. IUBMB Life. 61, 394-406.

150 Molee P, Adisakwattana P, Reamtong O, Petmitr S, Sricharunrat T,

107

Suwandittakul N, Chaisri U. (2015). Up-regulation of AKAP13 and MAGT1 on

cytoplasmic membrane in progressive hepatocellular carcinoma: a novel target for

prognosis. Int J Clin Exp Pathol. 8, 9796-9811.

151 Baisamy L, Cavin S, Jurisch N, Diviani D. (2009). The Ubiquitin-like Protein

LC3 Regulates the Rho-GEF Activity of AKAP-Lbc. J. Biol. Chem. 284,

28232-28242.

152 Smith FD, Langeberg LK, Cellurale C, Pawson T, Morrison DK, Davis RJ, Scott

JD. (2010). AKAP-Lbc enhances cyclic AMP control of the ERK1/2 cascade. Nat

Cell Biol. 12, 1242–1249.

153 Cariolato L, Cavin S, Diviani D. (2011). A-kinase anchoring protein (AKAP)-Lbc

anchors a PKN-based signaling complex involved in alpha1-adrenergic

receptor-induced p38 activation. J Biol Chem. 286, 7925-7937.

154 Shibolet O, Giallourakis C, Rosenberg I, Mueller T, Xavier RJ, Podolsky DK.

(2007). AKAP13, a RhoA GTPase-specific guanine exchange factor, is a novel

regulator of TLR2 signaling. J Biol Chem. 282, 35308-35317.

155 Taniguchi K, Wu LW, Grivennikov SI, de Jong PR, Lian I, Yu FX, Wang K, Ho

SB, Boland BS, Chang JT, Sandborn WJ, Hardiman G, Raz E, Maehara Y,

Yoshimura A, Zucman-Rossi J, Guan KL, Karin M. (2015). A gp130-Src-YAP

module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519, 57-62.

156 Waldner MJ, Neurath MF. (2014). Master regulator of intestinal disease: IL-6 in

chronic inflammation and cancer development. Semin Immunol. 26, 75-79.

157 Kusugami K, Fukatsu A, Tanimoto M, Shinoda M, Haruta J, Kuroiwa A, Ina K,

Kanayama K, Ando T, Matsuura T, et al. (1995). Elevation of interleukin-6 in

inflammatory bowel disease is macrophage- and epithelial cell-dependent. Dig

108

Dis Sci. 40, 949-959.

158 Grivennikov S, Karin E, Terzic J, Mucida D, Yu GY, Vallabhapurapu S, Scheller

J, Rose-John S, Cheroutre H, Eckmann L, Karin M. (2009). IL-6 and Stat3 are

required for survival of intestinal epithelial cells and development of

colitis-associated cancer. Cancer Cell. 15, 103-113.

159 Bollrath J, Phesse TJ, von Burstin VA, Putoczki T, Bennecke M, Bateman T,

Nebelsiek T, Lundgren-May T, Canli O, Schwitalla S, Matthews V, Schmid RM,

Kirchner T, Arkan MC, Ernst M, Greten FR. (2009). gp130-mediated Stat3

activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during

colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102.

160 Dignass AU, Baumgart DC, Sturm A. (2004). Review article: the

aetiopathogenesis of inflammatory bowel disease-immunology and repair

mechanisms. Aliment Pharmacol Ther. 20 Suppl 4, 9-17.

161 Dignass AU. (2001). Mechanisms and modulation of intestinal epithelial repair.

Inflamm Bowel Dis. 7, 68-77.

162 Frey, M. R., & Polk, D. B. (2006). Mucosal repair and restitution. In Physiology

of the Gastrointestinal Tract (pp. 459-475). Elsevier Academic Press, Amsterdam.

163 Zbar AP, Simopoulos C, Karayiannakis AJ. (2004). Cadherins: an integral role in

inflammatory bowel disease and mucosal restitution. J Gastroenterol. 39,

413-421.

164 Mammen JM, Matthews JB. (2003). Mucosal repair in the gastrointestinal tract.

Crit Care Med. 31, S532-537.

165 Pignatelli M. (1996). Modulation of cell adhesion during epithelial restitution in

the gastrointestinal tract. Yale J Biol Med. 69, 2: 131.

109

166 McKaig BC, Makh SS, Hawkey CJ, Podolsky DK, Mahida YR. (1999). Normal

human colonic subepithelial myofibroblasts enhance epithelial migration

(restitution) via TGF-β3. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 276,

G1087-G1093.

167 Cetin S, Ford HR, Sysko LR, Agarwal C, Wang J, Neal MD, Baty C, Apodaca G,

Hackam DJ. (2004). Endotoxin inhibits intestinal epithelial restitution through

activation of Rho-GTPase and increased focal adhesions. J Biol Chem. 279,

24592-24600.

168 Leoni G, Neumann P-A, Kamaly N, Quiros M, Nishio H, Jones HR, Sumagin R,

Hilgarth RS, Alam A, Fredman G. (2015). Annexin A1-containing extracellular

vesicles and polymeric nanoparticles promote epithelial wound repair. J Clin

Invest. 125, 1215-1227.

169 Mack NA, Georgiou M. (2014). The interdependence of the Rho GTPases and

apicobasal cell polarity. Small GTPases. 5, 2: e973768.

170 Mack NA, Georgiou M. (2014). The interdependence of the Rho GTPases and

apicobasal cell polarity. Small GTPases. 5, e973768.

171 Thumkeo D, Watanabe S, Narumiya S. (2013). Physiological roles of Rho and

Rho effectors in mammals. Eur J Cell Biol. 92, 303-315.

172 Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, Grillo RL, Rebuzzi AG, Pepys MB,

Maseri A. (1994). The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid

a protein in severe unstable angina. N Engl J Med. 331, 417-424.

173 Popoff MR, Geny B. (2009). Multifaceted role of Rho, Rac, Cdc42 and Ras in

intercellular junctions, lessons from toxins. Biochim Biophys Acta. 1788,

797-812.

110

174 Rao JN, Guo X, Liu L, Zou T, Murthy KS, Yuan JX-J, Wang J-Y. (2003).

Polyamines regulate Rho-kinase and myosin phosphorylation during intestinal

epithelial restitution. Am J Physiol Cell Physiol. 284, C848-C859.

175 Segain J-P, de la Blétière DR, Sauzeau V, Bourreille A, Hilaret G,

Cario-Toumaniantz C, Pacaud P, Galmiche J-P, Loirand G. (2003). Rho kinase

blockade prevents inflammation via nuclear factor κB inhibition: evidence in

Crohn’s disease and experimental colitis. Gastroenterology. 124, 1180-1187.

176 Santos MF, McCormack SA, Guo Z, Okolicany J, Zheng Y, Johnson LR, Tigyi

aG. (1997). Rho Proteins Play a Critical Role in Cell Migration during the Early

Phase of Mucosal Restitution. J. Clin. Invest. 100, 216-225.

177 WM W, RJ P, NA W. (2000). Peptide gene expression in gastrointestinal mucosal

ulceration: ordered sequence or redundancy? Gut. 46, 286–292.

178 Takagi T, Naito Y, Uchiyama K, Okuda T, Mizushima K, Suzuki T, Handa O,

Ishikawa T, Yagi N, Kokura S, Ichikawa H, Yoshikawa T. (2011). Rebamipide

promotes healing of colonic ulceration through enhanced epithelial restitution.

World J Gastroenterol. 17, 3802-3809.

179 Ito K, Shimomura E, Iwanaga T, Shiraishi M, Shindo K, Nakamura J, Nagumo H,

Seto M, Sasaki Y, Takuwa Y. (2003). Essential role of rho kinase in the

ca2+Sensitization of Prostaglandin F2α-Induced Contraction of Rabbit Aortae. J

Physiol. 546, 823-836.

180 Nagumo H, Sasaki Y, Ono Y, Okamoto H, Seto M, Takuwa Y. (2000). Rho

kinase inhibitor HA-1077 prevents Rho-mediated myosin phosphatase inhibition

in smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 278, C57-65.

181 Mihaescu A, Santen S, Jeppsson B, Thorlacius H. (2011). Rho kinase signalling

111

mediates radiation-induced inflammation and intestinal barrier dysfunction. Br J

Surg. 98, 124-131.

182 Santen S, Wang Y, Laschke MW, Menger MD, Jeppsson B, Thorlacius H. (2010).

Rho-kinase signalling regulates CXC chemokine formation and leukocyte

recruitment in colonic ischemia-reperfusion. Int J Colorectal Dis. 25, 1063-1070.

183 Huang Y, Xiao S, Jiang Q. (2015). Role of Rho kinase signal pathway in

inflammatory bowel disease. Int J Clin Exp Med.. 8, 3089-3097.

112

略号一覧

AC: anthocyanin

ACF: aberrant crypt foci

AKAP13: A-kinase anchor protein 13

ALA: α-lipoic acid

AOM: azoxymethane

BrdU: 5-Bromo-2'-deoxyuridine

cAMP: cyclic adenosine monophosphate

CD: Crohn's disease

CZ: cilostazol

DAI: disease activity index

DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole

DSS: dextran sodium sulphate

EMIQ: enzymatically modified isoquercitrin

ERK: extracellular signal-regulated kinase,

FH: fasudil hydrochloride hydrate

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor

GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor

H&E: haematoxylin-eosin

Iba1: ionized calcium-binding adapter molecule 1

IFN: interferon

IL: interleukin

KC: keratinocyte derived cytokine

MAPK: mitogen-activated protein kinase

MCP: monocyte chemotactic protein

MDF: mucin depleted foci

MIP: macrophage inflammatory protein

NF-κB: nuclear factor-kappa B

NOX1: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase 1

PCNA: proliferating cell nuclear antigen

PAS: periodic acid-Schiff reaction

113

PDE: phosphodiesterase

RANTES: regulated on activation normal T cell expressed and secreted

ROCK: Rho-associated coiled-coil containing protein kinase

ROS: reactive oxygen species

SAA: serum amyloid A

STAT signal transducer and activator of transcription

TNBS: trinitrobenzenesulfonic acid

TNF: tumor necrosis factor

UC: ulcerative colitis

114

図表

115

Figure 1. Disease activity index (DAI) and colon length in DSS-induced colitis

inhibition study (chapter 1)

(A) DAI indicates the total scores of faecal blood, diarrhoea, and body weight loss on

day 5 and 7 during DSS administration.

(B) Colon length indicates the length from the ileocecum to the anus.

Data represent the mean and standard deviation of the score of each parameter; (A) ***:

p < 0.001 compared with DSS group (Wilcoxon signed-rank test) or (B) bars with

different alphabets indicate p < 0.05 (Tukey’s multiple comparison).

116

Figure 2. Plasma cytokine/chemokine levels in DSS-induced colitis inhibition

study (chapter 1)

Interleukin (IL) -1α (IL-1a), IL-1β (IL-1b), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12

(p40; p70), IL-13, IL-17, tumor necrosis factor-α (TNF-a), interferon-γ (INF-g), eotaxin,

granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage (GM)-CSF,

keratinocyte-derive cytokine (KC), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), and

regulated on activation, normal T cell expressed and excreted (RANTES) were

measured using Bio-Plex ProTM mouse cytokine 23-plex assay kit. Data represent

mean and standard deviation; bars with different alphabets differ significantly at p <

0.05 (Tukey’s multiple comparison).

117

Figure 3. Representative H&E staining images of histological findings in the

distal colon in DSS-induced colitis inhibition study (chapter 1)

(A) Representative images of tissue injury in the DSS (a), control (b), EMIQ+DSS (c),

ALA+DSS (d), and CZ+DSS (e) groups. No abnormalities were detected in the control

group. Oedema, mucosal loss, and inflammatory cell infiltration were evident in the

DSS group, while parts of mucosal epithelial cells were preserved with dilated crypts,

and weak to moderate oedema and inflammatory cell infiltration were seen in the

EMIQ+DSS, ALA+DSS, and CZ+DSS group. H&E staining, scale bar indicates 100

µm.

(B) Distribution of histopathological scores in submucosal oedema, mucosal loss, and

inflammatory cell infiltration. Significantly different from the DSS group: *: p < 0.05;

**: p < 0.01, and ***: p < 0.001 (Wilcoxon signed-rank test).

118

Figure 4. Representative PAS images of histological findings in the distal colon in

DSS-induced colitis inhibition study (chapter 1)

Representative images of tissue injury in the DSS (a), control (b), EMIQ+DSS (c),

ALA+DSS (d), and CZ+DSS (e) groups. No abnormalities were detected in the control

group. PAS staining, scale bar indicates 100 µm.

119

Figure 5. Summary of microarray gene expression analysis in DSS-induced

colitis inhibition study (chapter 1)

Venn diagram represents shared expression genes that were up- or down-regulated

compared with DSS group on three sets, i.e. EMIQ+DSS (EMIQ), ALA+DSS (ALA),

and CZ+DSS (CZ) groups. Fold change > 1.5 and p < 0.05 were considered statistically

significant.

120

Figure 6. Body weight changes in AOM/DSS-induced cancer inhibition study

(chapter 2)

Mice received a single intraperitoneal injection of AOM (10 mg/kg) at the beginning of

the experiment (week 0, arrow). One week after AOM injections, mice received one

cycle of 1-week 3% DSS administration in drinking water for colitis induction. The

short-term group was necropsied (arrowhead) 3 weeks after the end of the DSS

administration (week 5). The long-term group received a second 1-week cycle of 3%

DSS administration and was necropsied 4 weeks after the end of second DSS

administration (week 9). Data are presented as mean ± standard deviation.

121

Figure 7. Representative macroscopic findings in colorectum and colorectal

weight to length ratio in mice in AOM/DSS-induced cancer inhibition study

(chapter 2)

The short-term group was necropsied 3 weeks after the end of 3% DSS administration

(week 5). The long-term group received a second 3% DSS administration and was

necropsied 4 weeks after the end of second DSS administration (week 9). (A) One (left)

and two (right) cycles of DSS treatment combined with AOM induced colonic

neoplasms, most frequently observed in the middle and distal colon. The sizes of masses

were clearly increased in the long-term group compared with those in the short-term

group. Treatment with CZ, EMIQ, ALA, and AC appeared to reduce the size of masses.

In the AOM group, masses were rarely observed. Scale bar indicates 10 mm. (B) Ratio

of colorectal weight to length was calculated as colon weight (mg)/colon length (mm).

Data are mean and standard deviation. *: p < 0.05, **: p < 0.01, and ***: p < 0.001

versus AOM+DSS group (Dunnett's multiple comparison).

122

A

B

↑ ↑

↑↑ ↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑ ↑

↑↑ ↑

↑

↑

↑

↑

↑

Figure 8. Representative images of mucin-depleted foci (MDF) and aberrant

crypt foci (ACF) and in AOM/DSS-induced cancer inhibition study (chapter 2)

In the short-term evaluation in the AOM/DSS cancer study, colorectal tissues were

evaluated for MDF (A) and ACF (B). Lesions were identified as MDF by determining

the absence or very slight production of mucins and presence of at least two crypts

(arrows). Lesions were identified as ACF by larger than normal crypts that were

microscopically elevated and thick epithelial lining that stained darker than normal

crypts did.

123

Figure 9. Representative images of proliferative lesions in the long-term

treatment group of AOM/DSS-induced cancer inhibition study (chapter 2)

Proliferative lesions were histopathologically classified as low- or high-grade dysplasia,

adenoma, and adenocarcinoma and the multiplicity of each lesion was calculated. H&E

staining, scale bar indicates 100 µm.

(A) Dysplasia, low-grade: no abnormalities in the form of crypts.

(B) Dysplasia, high-grade: irregular form of crypts.

(C) Adenoma: compression of surrounding tissues.

(D) Adenocarcinoma: increased mitotic index.

124

Figure 10. Representative images of immune reaction in adenocarcinoma for

β-catenin, Ki-67, and Iba1 in AOM/DSS-induced cancer inhibition study (chapter

2)

Immunohistochemistry was performed for β-catenin, Ki-67, and Iba1. Immune reactions

of AOM+DSS+CZ group were decreased compared with AOM+DSS group.

Haematoxylin counterstain.

125

Figure 11. In vitro cell proliferation assay of human colon cancer cell lines

(chapter 2)

BrdU uptake rate of CZ (A), EMIQ (B), ALA (C), and AC (D) relative to dimethyl

sulphoxide-treated controls (average absorbance ratio of three assays) is shown. In vitro

experiments were carried out in triplicate per assay in at least three independent

experiments. Data are mean and standard deviation. *: p < 0.05, **: p < 0.01, and ***: p

< 0.001 versus control.

126

Figure 12. Comparison of proliferative activity of mucosal epithelial cells in acute

DSS-induced colitis inhibition study (chapter 2)

Mice were administered 4% DSS in drinking water for up to 6 days (day 1-6). Colon

length (A) and number of BrdU-positive cells per crypt on day 2, 4, or 6 of DSS

administration (B). Data are mean ± standard deviation; *: p < 0.05, **: p < 0.01, and

***: p < 0.001 versus AOM+DSS group (Dunnett's multiple comparison). (C)

Representative images of BrdU immunostaining in the distal colon of (a) control and (b)

DSS-treated groups on day 6.

127

Figure 13. Representative images of immunoreactions for β-catenin, AKAP13,

ROCK1, ROCK2, and BrdU of AOM/DSS induced proliferative lesions in mice

(chapter 3)

Samples from AOM+DSS group in AOM/DSS-induced cancer inhibition study (chapter

2) were immunohistochemistry stained for β-catenin, AKAP13, ROCK1, ROCK2, and

BrdU. Proliferative lesions were subdivided into low- and high-grade dysplasia,

adenoma, and adenocarcinoma. Scale bar indicates 50 μm.

128

Figure 14. Comparison of relative mRNA expression levels in AKAP13

expression analysis DSS-induced colitis study (chapter 3)

Relative mRNA expression levels of Akap13, Rock1, Rock2, Pcna, Nox1, and Il-6 in

control and DSS-challenged mice. Values are mean and standard deviation. ##: p<0.01,

Dunnett’s test.

129

Figure 15. Representative images of histological findings in the distal colon in

AKAP13 expression analysis DSS-induced colitis study (chapter 3)

Representative images of histological findings via H&E staining in control group at

week 1 (A), DSS group at week 1(B), DSS group at week 2 (C), DSS group at week 3

(D). Control group showed no abnormal changes during the experiment. The DSS group

showed mucosal degeneration at week 1, restitution (arrowhead) at week 2, and

incomplete regeneration at week 3. In weeks 2 and 3, there was infiltration of

inflammatory cells and clumps of cells (arrow) in the lamina propria. Scale bar indicates

100 μm.

130

Figure 16. Representative images of clumps in AKAP13 expression analysis

DSS-induced colitis study (chapter 3)

The clumps observed in AKAP13 expression analysis DSS-induced colitis study (A)

and in AOM/DSS-induced cancer inhibition study (B). Scale bar indicates 50 µm.

(A) The clumps have eosinophilic cytoplasm as shown via hematoxylin and eosin

staining (a), and were also negative for periodic acid-schiff (b) and toluidine blue (c).

Furthermore, no immunostaining was observed for vimentin (d), PCNA (e) and Iba1 (f).

(B) Inset: Higher-magnification image of clump in lamina propria.

131

Figure 17. Representative images of immune reaction in AKAP13 expression

analysis DSS-induced colitis study (chapter 3)

Immunoreactions for AKAP13, ROCK1, ROCK2, and BrdU in degenerated, restituted,

and regenerated mucosa. Arrowheads show clumps of cells. Scale bar indicates 100 μm.

132

Figure 18. Representative immunofluorescent image of the clumps of cells in the

regenerative phase mucosa in AKAP13 expression analysis DSS-induced colitis

study (chapter 3)

The clumps of cells in the lamina propria in the regenerative phase co-expressed IL-6

and cytokeratin in the cytoplasm. Scale bar indicates 20 µm.

(A) Immunofluorescence staining for IL-6. Positive cells were observed in the lamina

propria.

(B) Immunofluorescence staining for cytokeratin. Positive cells were observed in the

luminal surface and lamina propria.

(C) Counterstained with 4',6-diamidino-2-phenylindole.

(D) Clumps of cells were observed under differential interference contrast microscopy.

(E) Merged images of A, B, and D.

(F) Merged images of A, B, and C.

133

Figure 19. Serum amyloid A (SAA) levels and representative image of

histopathological lesions in the distal colon in the acute ROCK inhibition study

(chapter 4)

Mice were challenged with 4% DSS in their drinking water for up to 8 days. During this

period, mice received subcutaneous injections of FH (10 mg/kg) twice per day.

(A) SAA levels were measured using an ELISA kit on days 6 and 8. Values are mean

and standard deviation, *: P< 0.05 and **: P< 0.01, Student’s T-test.

(B) H&E staining of the lesions in the distal colon on day 8. Scale bar indicates 100 µm.

DSS group (a) and DSS+FH group (b). Mucosal injuries with prominent inflammation

appear to be more severe in the DSS+FH group than in the DSS group.

134

Figure 20. Representative images of immune reaction in the distal colon in the

acute ROCK inhibition study (chapter 4)

Immunoreactions for AKAP13, ROCK1, and ROCK2 in the DSS group at days 4, 6,

and 8, as well as the control group at day 8. Scale bar indicates 50 µm.

135

Figure 21. Body-weight changes, colon length, and mucosal loss rate in the acute

ROCK inhibition study (chapter 4)

Mice were challenged with 2% DSS in their drinking water for 16 days. During this

period, mice received subcutaneous injections of FH (10 mg/kg) twice per day.

(A) Body-weight (g) changes through the experiment period. Data are mean and

standard deviation. No significant differences were observed between the DSS and

DSS+FH groups.

(B) Individual colon length (round) and mean colon length (bar) at day 16. No

significant differences were observed between the DSS and DSS+FH groups.

(C) Individual mucosal loss rate (round) and mean mucosal loss rate (bar) at day 16.

Mucosal loss rates were calculated using the H&E stained sections. No significant

differences were observed between DSS and DSS+FH groups.

136

Figure 22. Representative images of clumps in the acute ROCK inhibition study

(chapter 4)

The clumps observed in both the acute ROCK inhibition study and subacute ROCK

inhibition study.

(A) The clumps have an eosinophilic cytoplasm as shown via H&E staining. Shown are

the clumps from the DSS group during the subacute ROCK inhibition study. Scale bar

indicates 100 µm. Inset: Higher-magnification image of two clumps. (B) These clumps

were positive for AKAP13 (a) and cytokeratin (b). Scale bar indicates 50 µm. (C) There

were no significant changes in the number of clumps between the DSS and the DSS+FH

groups.

137

Figure 23. Representative images of mucosal restitution in the acute ROCK

inhibition study (chapter 4)

(A) Histopathology via H&E staining (a, d) and immunoreactions for AKAP13 (b, e)

and BrdU (c, f) in the DSS (a-c) and DSS+FH groups (d-f). Scale bar indicates 100 µm.

(B) Quantitative analysis of restitution rate (%) in the colorectum of the DSS and

DSS+FH groups. Circles indicate individual value and bar indicates mean of each

group.

Table 1. Body weight, body weight change, and liver weight in DSS-induced colitis inhibition study (chapter 1)

Parameters DSS

EMIQ+DSS

ALA+DSS

CZ+DSS

Control

Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD

N 12 12 12 12 4

Body weight

Day 1 (g) 19.93 ± 0.91 a

20.38 ± 0.88 a

20.06 ± 0.76 a

20.53 ± 0.98 a

20.48 ± 1.06 a

Day 8 (g) 18.08 ± 1.23 a

18.19 ± 1.50 a

17.76 ± 1.12 a

18.34 ± 1.31 a

21.65 ± 0.91 b

Body weight change

Day 8 (%) 90.72 ± 3.57 a

89.25 ± 5.80 a

88.58 ± 5.33 a

89.45 ± 6.74 a

105.78 ± 1.15 b

Liver weight

Absolute (g) 1.30 ± 0.13 a

1.32 ± 0.21 a

1.30 ± 0.17 a

1.35 ± 0.15 a

1.82 ± 0.14 b

Relative (%) 7.20 ± 0.41 a

7.24 ± 0.75 a

7.32 ± 0.57 a

7.33 ± 0.45 a

8.41 ± 0.37 b

Individual body weights were measured on day 1 of DSS administration and necropsy day (day 8). Individual body weight change (%) was calculated by dividing

body weight on day 8 by the weight on day 1. Individual relative liver weight was calculated by dividing absolute liver weight by body weight on day 8. Different

alphabets differ significantly at p< 0.05 (Tukey’s multiple comparison). The data represent mean value ± standard deviation in each group.

Table 2. The genes up- or down-regulated compared with the DSS group in

DSS-induced colitis inhibition study (chapter 1)

Regulation Gene Symbol Description

Down Akap13 A-kinase anchor protein 13

Heatr5b HEAT repeat containing 5B

Hspa12a heat shock protein 12A

Parp14 poly (ADP-ribose) polymerase family, member 14

Phxr1 Mouse period repetitive

Plxnb2 plexin B2

Prorsd1 prolyl-tRNA synthetase domain containing 1

Up Afap1 actin filament associated protein 1

Chd6 chromodomain helicase DNA binding protein 6

Dok7 docking protein 7

Fut10 fucosyltransferase 10

Kdm2b lysine (K)-specific demethylase 2B, transcript variant 1

Ldb2 LIM domain binding 2, transcript variant 2

Lrrn4cl LRRN4 C-terminal like

Nrn1 neuritin 1

Olfr419 olfactory receptor 419

Olfr693 olfactory receptor 693

Pcp4l1 Purkinje cell protein 4-like 1

Pfas phosphoribosylformylglycinamidine synthase (FGAR amidotransferase)

Plk2 polo-like kinase 2

Prkg1 protein kinase, cGMP-dependent, type I

Rfx7 regulatory factor X, 7

Rhbdl3 rhomboid, veinlet-like 3

Scrt1 scratch homolog 1, zinc finger protein

Slc15a2 16 days embryo lung cDNA, RIKEN full-length enriched library

Slc16a12 solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 12

Tcp11l1 t-complex 11 like 1

Tmem45a transmembrane protein 45a

Vav3 vav 3 oncogene, transcript variant 1

Vmn1r41 vomeronasal 1 receptor 41

Vmn2r81 vomeronasal 2, receptor 81

Zfp667 zinc finger protein 667

The genes up- or down-regulated by EMIQ, ALA, and CZ treatments compared with DSS group, are

listed. The probes lacking the gene symbol and overlapping gene symbol were excluded. Fold change >

1.5 and p< 0.05 (T Test unpaired) considered statistically significant.

Table 3. Pathway analysis in microarray gene expression analysis in DSS-induced

colitis inhibition study (chapter 1)

Substance Pathway p value

EMIQ Embryonic stem cell (ESC) Pluripotency Pathways 0.0433

Focal Adhesion 0.0080

Kit Receptor Signaling Pathway 0.0166

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) Cascade 0.0259

p38 MAPK Signaling Pathway 0.0391

Proteasome Degradation 0.0086

Transforming growth factor (TGF) β Signaling Pathway 0.0054

Type II interferon signaling 0.0362

Wnt Signaling Pathway 0.0106

ALA Apoptosis 0.0003

Chemokine signaling pathway 0.0031

Deoxyribonucleic acid (DNA) Replication 0.0007

Focal Adhesion 0.0418

G1 to S cell cycle control 0.0018

Id Signaling Pathway 0.0001

Interleukin (IL) -3 Signaling Pathway 0.0124

IL-5 Signaling Pathway 0.0408

Integrin-mediated Cell Adhesion 0.0011

MAPK signaling pathway 0.0148

Toll Like Receptor signaling 0.0332

Type II interferon signaling 0.0012

Wnt Signaling Pathway Net Path 0.0008

CZ ESC Pluripotency Pathways 0.0343

Id Signaling Pathway 0.0451

Leptin Insulin Overlap 0.0195

Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) signaling pathway 0.0071

Regulation of Actin Cytoskeleton 0.0305

Retinol metabolism 0.0212

The genes that were significantly altered by EMIQ, ALA, or CZ treatments compared

with DSS treatment alone are shown.

Table 4. Reagent list of immunohistochemistry in chapter 2

Symbol Antibody

product code

Activation of

antigen Dilution Reaction time Manufacturer

p53 NCL-p53-CM5p pH 6, 121°C, 15 min 500 4°C, over night Leica Biosystems (Newcastle, United Kingdom)

β-catenin 610154 pH 6, 121°C, 15 min 1000 Room temperature, 1-3 h Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA)

Ki-67 M3060 pH 6, 121°C, 15 min 200 4°C, over night Spring Bioscience (Pleasanton, CA, USA)

Iba1 019-19741 - 500 Room temperature, 1-3 h Wako (Tokyo, Japan)

Nox1 NBP1-31546 pH 9, 121°C, 15 min 2000 4°C, over night Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)

CyclinD1 ab16663 pH 6, 121°C, 15 min 2000 Room temperature, 1-3 h Abcam (Cambridge, UK)

Table 5. Blood biochemistry in AOM/DSS cancer study (Long-term) in AOM/DSS-induced colorectal cancer inhibition study

(chapter 2)

Group AOM+DSS AOM+DSS+CZ AOM+DSS+EMIQ AOM+DSS+ALA AOM+DSS+AC AOM

N 8 8 8 8 8 8

T.Protein 4.35 ± 0.09 b 4.35 ± 0.21 b 4.34 ± 0.21 b 4.41 ± 0.12 b 4.51 ± 0.12 b 4.79 ± 0.19 a

Albumin 2.59 ± 0.12 c 2.66 ± 0.18 bc 2.60 ± 0.20 c 2.65 ± 0.15 bc 2.84 ± 0.12 b 3.13 ± 0.10 a

A/G ratio 1.48 ± 0.16 b 1.58 ± 0.14 b 1.51 ± 0.19 b 1.52 ± 0.18 b 1.70 ± 0.16 a 1.89 ± 0.12 a

T.Bilirubin 0.01 ± 0.01 NS 0.00 ± 0.01 NS 0.01 ± 0.02 NS 0.02 ± 0.01 NS 0.01 ± 0.01 NS 0.01 ± 0.01 NS

AST 91.25 ± 21.72 bc 129.88 ± 35.41 abc 160.63 ± 62.01 a 80.75 ± 22.04 c 101.75 ± 36.01 bc 145.63 ± 42.38 ab

ALT 37.88 ± 16.97 ab 42.00 ± 6.93 ab 40.13 ± 11.05 ab 28.13 ± 12.31 b 50.25 ± 13.85 a 46.63 ± 7.65 a

ALP 193.63 ± 26.32 b 220.38 ± 31.38 b 203.00 ± 30.75 b 218.38 ± 23.84 b 231.63 ± 18.55 b 298.38 ± 19.89 a

Cholesterol 93.63 ± 7.74 ab 92.75 ± 6.20 ab 97.25 ± 6.48 a 85.38 ± 5.34 b 94.63 ± 5.32 ab 97.13 ± 9.06 a

Triglyceride 60.00 ± 30.88 NS 82.25 ± 34.67 NS 73.75 ± 26.95 NS 74.75 ± 19.67 NS 49.25 ± 15.49 NS 54.00 ± 11.60 NS

Phospholipid 173.63 ± 10.77 NS 170.63 ± 13.15 NS 178.00 ± 11.60 NS 169.13 ± 6.81 NS 175.00 ± 6.70 NS 178.25 ± 14.99 NS

BUN 19.21 ± 2.15 NS 18.39 ± 2.08 NS 18.51 ± 2.91 NS 19.04 ± 1.48 NS 17.95 ± 1.40 NS 16.65 ± 1.26 NS

Creatinine 0.13 ± 0.01 NS 0.13 ± 0.01 NS 0.14 ± 0.01 NS 0.13 ± 0.01 NS 0.13 ± 0.01 NS 0.13 ± 0.01 NS

Blood biochemistrical markers for liver and kidney were analyzed in AOM/DSS cancer study (Long-term). There were no toxic change on liver and kidney in all

groups. Different letters differ significantly (P< 0.05, Tukey’s multiple comparison). NS indicates no significant difference. The data represent mean value ±

standard deviation in each group.

Table 6. Colorectal tumorigenesis in AOM/DSS-induced colorectal cancer inhibition study (chapter 2)

Study AOM+DSS AOM+DSS+ CZ AOM+DSS+ EMIQ AOM+DSS+ ALA AOM+DSS+ AC AOM

Short-term N 8 6-7 8 8 7-8 8

Colorectal weight 0.40 ± 0.04 0.42 ± 0.06 0.41 ± 0.05 0.40 ± 0.03 0.41 ± 0.03 0.35 ± 0.04

Colorectal length 93.25 ± 7.57 98.83 ± 6.15 94.63 ± 8.80 95.50 ± 10.52 94.71 ± 4.72 113.75 ± 11.03 ***

MDF 72.13 ± 9.05 60.57 ± 7.23 56.00 ± 13.77 ** 56.00 ± 11.16 ** 54.50 ± 10.46 ** 7.13 ± 4.91 ***

ACF 49.13 ± 18.80 34.14 ± 9.89 29.00 ± 15.10 * 31.50 ± 14.42 32.88 ± 15.47 1.13 ± 2.47 ***

Long-term N 8 7-8 8 8 7-8 7-8

Colorectal weight 0.86 ± 0.23 0.65 ± 0.07 * 0.61 ± 0.15 ** 0.76 ± 0.12 0.59 ± 0.12 ** 0.32 ± 0.06 ***

Colorectal length 94.63 ± 5.29 98.71 ± 4.23 94.38 ± 2.39 95.88 ± 4.85 94.57 ± 6.08 97.57 ± 5.68

Total mass volume 182.08 ± 86.89 121.89 ± 26.55 110.11 ± 62.82 152.11 ± 58.95 122.81 ± 72.06 0.17 ± 0.47 ***

Total mass number 18.25 ± 6.94 18.63 ± 3.81 14.50 ± 5.53 17.00 ± 5.21 14.88 ± 4.76 0.25 ± 0.71 ***

Mice received a single intraperitoneal injection of AOM (10 mg/kg) at the beginning of experiment (week 0). One week after AOM injections, mice received one

cycle of 7-day 3% DSS administration in drinking water for colitis induction. The short-term group was necropsied 2 weeks after the end of the DSS administration

(week 4). The long-term group received a second 7-day cycle of 3% DSS administration and was necropsied 4 weeks after the end of second DSS administration

(week 9). One mouse in the AOM+DSS+CZ group died during the experimental protocol because of colitis. At necropsy, colorectal weight (g) and colorectal length

(mm) were measured. All the masses were counted throughout the large intestine, and then total mass numbers per mouse were obtained. Each mass volume (mm3)

was measured using a digital calliper and calculated as (length × width ×height × 0.526). Total mass volume per mouse was obtained by adding each mass volume.

The data represent mean value ± standard deviation in each group. *: p< 0.05, **: p< 0.01, and *: p< 0.001 versus AOM+DSS group (Dunnett’s multiple

comparison).

Table 7. Histopathological analysis in AOM/DSS-induced colorectal cancer inhibition study (chapter 2)

Study AOM+DSS AOM+DSS+CZ AOM+DSS+EMIQ AOM+DSS+ALA AOM+DSS+AC AOM

Short-term N / incidence 8 / 100% 7 / 100% 8 / 100% 7 / 100% 8 / 100% 8 / 0%

Dysplasia, low-grade 1.50 ± 1.51 0.00 ± 0.00 *** 0.13 ± 0.35 *** 0.00 ± 0.00 *** 0.00 ± 0.00 *** 0.00 ± 0.00 ***

Dysplasia, high-grade 2.00 ± 1.07 2.43 ± 1.13 1.38 ± 1.19 0.57 ± 1.13 * 0.88 ± 0.99 0.00 ± 0.00 **

Adenoma 1.50 ± 1.07 1.00 ± 2.24 0.75 ± 0.71 0.29 ± 0.49 0.25 ± 0.71 0.00 ± 0.00 *

Adenocarcinoma 11.88 ± 2.47 8.14 ± 2.73 * 7.88 ± 4.29 * 6.43 ± 2.51 ** 9.38 ± 2.13 0.00 ± 0.00 ***

Total 16.88 ± 3.48 11.57 ± 4.28 * 10.13 ± 5.08 ** 7.29 ± 1.80 *** 10.50 ± 2.39 ** 0.00 ± 0.00 ***

Inflammatory index 2.13 ± 0.35 2.00 ± 0.82 2.00 ± 0.76 1.75 ± 0.46 1.88 ± 0.35 0.00 ± 0.00 ##

Long-term N / incidence 4 / 100% 4 / 100% 4 / 100% 4 / 100% 4 / 100% 4 / 0%

Dysplasia, low-grade 1.50 ± 3.00 0.25 ± 0.50 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

Dysplasia, high-grade 2.50 ± 2.65 0.00 ± 0.00 1.25 ± 1.89 0.00 ± 0.00 0.50 ± 0.58 0.00 ± 0.00

Adenoma 3.00 ± 3.56 1.00 ± 0.00 0.75 ± 1.50 1.00 ± 1.41 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

Adenocarcinoma 10.50 ± 2.08 11.50 ± 2.52 10.75 ± 3.86 10.25 ± 2.63 8.75 ± 2.22 0.00 ± 0.00 ***

Total 17.50 ± 5.92 12.75 ± 2.22 12.75 ± 3.30 11.25 ± 1.89 9.25 ± 2.75 ** 0.00 ± 0.00 ***

Inflammatory index 2.50 ± 0.58 2.00 ± 0.82 1.25 ± 0.50 # 2.00 ± 0.82 1.25 ± 0.50 # 0.00 ± 0.00 #

One mouse in the AOM+DSS+CZ group died during the experiment period because of colitis. One sample from AOM+DSS+ALA group was excluded owing to

the lack of suitability for histological analysis. The data represent mean value ± standard deviation in each group. *: p< 0.05, **: p< 0.01, and *: p< 0.001 versus

AOM+DSS group (Dunnett’s multiple comparison). #: p< 0.05, ##: p< 0.01 versus AOM+DSS group (Wilcoxon signed-rank test).

Table 8. Immunohistochemistry in AOM/DSS-induced colorectal cancer inhibition study (chapter 2)

Antigen AOM+DSS AOM+DSS+CZ AOM+DSS+EMIQ AOM+DSS+ALA AOM+DSS+AC

β-catenin 6.10 ± 0.81 5.53 ± 1.24 #

6.60 ± 0.50 ##

5.95 ± 1.08 4.63 ± 0.93 ##

Ki-67 5.33 ± 1.05 4.38 ± 0.93 ##

4.80 ± 1.09 4.78 ± 0.92

# 4.38 ± 0.74

##

Iba1 5.28 ± 1.54 4.30 ± 1.07 ##

4.25 ± 1.01 ##

4.73 ± 1.34 #

5.13 ± 1.42

Nox1 3.78 ± 0.83 3.68 ± 0.66 4.08 ± 0.89

4.05 ± 0.78 3.70 ± 1.07

Cyclin D1 4.70 ± 0.69 4.08 ± 0.57 ##

4.33 ± 0.47 #

4.32 ± 0.47 #

4.18 ± 0.55 ##

The immunostaining was scored using a semi-quantitative system in the long-term evaluation. Scores were calculated as the sum of the extent and intensity of the

staining (score = extent + intensity) of in nine to 10 fields per mouse (n = 4/group). The data represent mean value ± standard deviation in each group. #: p< 0.05

and ##

: p< 0.01 versus AOM+DSS group (Wilcoxon signed-rank test).

Table 9. Reagent list of immunohistochemistry in chapter 3

Symbol Antibody product code Activation of antigen Dilution Reaction time Manufacturer

AKAP13 HPA019773 pH 9, 121°C, 15 min 3000-5000 room temperature, 30min Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)

Cytokeratin ab27988 pH 9, 121°C, 15 min 500 4°C, over night Abcam (Cambridge, UK),

Iba1 019-19741 - 500 4°C, over night Wako (Tokyo, Japan)

IL-6 sc-1265 pH 9, 121°C, 15 min 500 4°C, over night Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Texas, USA)

Ki-67 M3060 pH 6, 121°C, 15 min 200 room temperature, 1hr Spring bioscience (Pleasanton, California, USA)

PCNA M0879 DW, 90°C, 5 min 600 room temperature, 2hr Dako (Glostrup, Denmark)

ROCK1 HPA007567 pH 6, 121°C, 15 min 400 room temperature, 1hr Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)

ROCK2 HPA007459 pH 6, 121°C, 15 min 100 room temperature, 1hr Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)

Vimentin sc-7557 pH 6, 90°C, 10 min 200 4°C, over night Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Texas, USA)

Table 10. Clinical parameter of AKAP13 expression analysis in chapter 3

Item Week 1 Week 2 Week 3

Control DSS Control DSS Control DSS

Clinical Body weight g 20.2 ± 0.4 20.5 ± 0.7 NS

21.6 ± 0.3 15.5 ± 2.7 ***

22.1 ± 0.2 20.0 ± 0.8 ***

Diarrhea score

0.0 ± 0.0 0.4 ± 0.7

NS 0.0 ± 0.0 0.9 ± 0.3

### 0.0 ± 0.0 0.9 ± 0.6

##

Faecal blood score

0.0 ± 0.0 2.0 ± 1.5

## 0.0 ± 0.0 2.4 ± 1.9

## 0.0 ± 0.0 0.9 ± 1.1

#

Faecal calprotectin ng/g 19.5 ± 1.6 32.0 ± 9.9

* NE 42.4 ± 21.0 * NE 26.4 ± 11.3

NS

Colon length

mm 93.8 ± 3.1 75.1 ± 4.5 ***

NE 73.4 ± 4.3 - 107.7 ± 4.4 86.9 ± 8.6

***

Histopathology Mucosal loss rate % 0.0 ± 0.0 27.0 ± 25.1 * NE 49.3 ± 23.8

- 0.0 ± 0.0 8.7 ± 11.1

NS

Number of clumps 0.0 ± 0.0 1.0 ± 2.0 NS

NE 18.7 ± 9.3 - 0.0 ± 0.0 12.2 ± 7.2

***

Mice were administered 4% DSS in their drinking water for one week. After inducing colitis, mice were given tap water for up to 2 weeks. Control mice were given

tap water throughout the experiment. The data represent mean value ± standard deviation in each group. **: P< 0.01, ***: P< 0.001, Student’s t-test at each

necropsy day for body weight (control, n = 6-16; DSS, n = 9-27), concentrations of faecal calprotectin (control, n = 4; DSS, n = 6), colorectum length (control, n =

6; DSS, n = 9), mucosal loss rate and the number of clumps (control, n = 6; DSS, n = 9) versus control group per time point or control group at week 1. ##: P< 0.01,

###: P< 0.001, Wilcoxon signed-rank test for faecal blood and diarrhea score (control, n = 6; DSS, n = 9) versus control group per time point. NS, No significant

difference; -, No statistical analysis.

Table 11. Reagent list for immunohistochemistry in chapter 4

Symbol Antibody product code Activation of antigen Dilution Reaction time Manufacturer

AKAP13 HPA019773 pH 9, 121°C, 15 min 500-5000 4°C, over night Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)

BrdU M0744 pH 6, 121°C, 15 min 80 room temperature, 1hr Dako (Glostrup, Denmark)

Cytokeratin ab27988 pH 9, 121°C, 15 min 500 4°C, over night Abcam (Cambridge, UK)

PCNA M0879 DW, 90°C, 10 min 1000 4°C, over night Dako (Glostrup, Denmark)

ROCK1 HPA007567 pH 6, 121°C, 15 min 400 room temperature, 1hr Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)

ROCK2 HPA007459 pH 6, 121°C, 15 min 100 room temperature, 1hr Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)

Table 12. Time course of the acute ROCK inhibition study (chapter 4)

Item Day 4

Day 6

Day 8

DSS DSS+FH DSS DSS+FH DSS DSS+FH Control FH

N 9 9 9 9 9 9 6 4

Body weight (g) 20.4 ± 0.8 20.3 ± 0.8 NS 19.9 ± 1.0 19.6 ± 0.9 NS 16.7 ± 1.6 15.7 ± 0.9 NS 21.2 ± 0.7 20.0 ± 1.0

Colon length (mm) 97.3 ± 4.9 94.6 ± 5.3 NS 72.6 ± 7.4 75.9 ± 7.8 NS 66.9 ± 5.6 62.8 ± 3.8 NS 113.3 ± 8.6 111.4 ± 6.5

Histopathological score

Oedema 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 NS 2.2 ± 1.0 2.8 ± 1.0 NS 3.7 ± 0.5 3.4 ± 0.5 NS 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0

Mucosal loss 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 NS 1.8 ± 1.1 1.7 ± 1.1 NS 3.4 ± 1.5 4.7 ± 0.7 NS 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0

Inflammatory cell 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 NS 2.2 ± 0.7 2.3 ± 0.5 NS 2.1 ± 0.3 2.7 ± 0.5 # 1.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0

Total 3.0 ± 0.0 3.0 ± 0.0 NS 6.2 ± 2.2 6.7 ± 1.0 NS 9.2 ± 1.8 10.8 ± 1.0 # 3.0 ± 0.0 3.0 ± 0.0

Number of clumps 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 NS 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 NS 0.7 ± 1.1 1.4 ± 3.4 NS 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

mRNA level Akap13 4.57 ± 1.62 0.89 ± 0.24 *** 2.04 ± 0.57 0.81 ± 0.55 * 2.13 ± 0.80 0.68 ± 0.16 ** 1.00 ± 0.29 0.75 ± 0.36

Rock1 1.52 ± 0.40 2.54 ± 0.93 NS 1.68 ± 1.16 2.07 ± 0.76 NS 2.14 ± 0.85 1.93 ± 0.21 NS 1.00 ± 0.23 1.10 ± 0.44

Rock2 1.26 ± 0.39 2.91 ± 1.24 * 1.53 ± 1.15 2.08 ± 0.50 NS 3.23 ±1.03 4.51 ± 4.29 NS 1.11 ± 0.13 1.09 ± 0.23

Pcna 0.42 ± 0.04 0.58 ± 0.19 NS 0.88 ± 0.32 0.72 ± 0.45 NS 1.44 ± 1.11 0.75 ± 0.30 NS 1.00 ± 0.42 1.22 ± 0.22

Mice were administered 4% DSS in their drinking water for up to 8 days. During the study, mice received subcutaneously injections of FH (10 mg/kg) twice a day.

Colorectal length indicates length from the ileocecum to the anus in the mice. The data represent mean value ± standard deviation in each group. *: p< 0.05, **: P<

0.01, ***: P< 0.001, Student’s t-test versus the DSS group per time point. #: p< 0.05, Wilcoxon rank test versus the DSS group per time point. Relative mRNA

expression levels were normalized by the mRNA level of Gapdh. ND, Not detected; NS, No significant difference; -, No statistical analysis.