THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS‐EST 

 

ECOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE Spécialité IMMUNOLOGIE 

   

Présentée par  

FANNY BRIZZI  

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE Paris‐Est 

   

 ÉTUDE DE L'EFFET DE L'EXPRESSION DE LA PROTEINE VIRALE NEF DU VIRUS DE L'IMMUNODEFICIENCE HUMAINE SUR LA 

LYMPHOPOÏESE T    

Soutenue le 27 Novembre 2009    Devant le jury constitué de :  

  Pr. Roger Le GrandDr. Rémi Cheynier Dr. Stéphane Basmaciogullari Pr. Yves Levy 

Examinateur & Président de JuryRapporteurRapporteur

Directeur de Thèse

Remerciements  

Je  tiens  tout  d’abord  à  remercier  le  docteur  Roger  Le Grand  pour m’avoir  fait  l’honneur d’être  président  et  examinateur  de mon  jury  de  thèse. Mes  remerciements  s’adressent également  aux  docteurs  Rémi  Cheynier  et  Stéphane  Basmaciogullari,  pour  avoir  accepté d’être rapporteurs de ma thèse et pour le temps qu’ils ont consacré à la correction de mon manuscrit.  

Mes remerciements s’adressent ensuite au professeur Yves Lévy pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire, de m’avoir encadrée et permis de mener à bien ce doctorat. 

Je remercie ensuite  le professeur  Jean‐Daniel Lelievre et  le docteur  Jérôme Estaquier pour leurs conseils et leur encadrement. 

Je remercie également Nathalie Solfoulon & Olivier Schwartz pour m’avoir fourni une grande partie du matériel qui m’a été nécessaire pour mener à bien cette étude. 

Je tenais ensuite à remercier : 

Mireille  pour  tes  conseils  autant  scientifiques  que  techniques  et  pour  m’avoir présenté Saint‐Antoine afin de m’aider à  retrouver certains anticorps ou objets qui s’étaient égarés… 

Aurélie  pour  nos  discussions  sur  les  séries  TV et  notre  passion  commune  pour  les aviateurs! 

Mathieu  (n°2) pour  tes  jolis pas de kapuera et  tes efforts  inaboutis de me  faire un croche pied… 

Shahul pour  ta présence et  ton aide  lors de  la  rédaction du manuscrit,  ton  soutien dans les manips et pour les parties de tennis qui m’ont permis de bien me défouler. 

Mehwish  pour  m’aider  à  continuer  de  pratiquer  l’anglais  et  pour  ne  jamais  me contredire (important ça Mehwish, continue!). 

Adeline pour  toute  l’aide que  tu m’as apportée en  triant pendant des heures mes cellules, pour ta gentillesse et ton écoute. 

Laure pour toujours décrocher quand je t’appelle.  

Ali pour tes conseils  lors de  la rédaction de ma thèse et ton naturel galant à toutes épreuves.  

Christine pour tes conseils, ta douceur, ta patience et ta capacité à travailler malgré le bruit!  

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Sylvie pour s’occuper sans faillir de la laverie et… de la carboglace. 

Hassen pour m’avoir nommée « bisounours » et pour tes conseils autant techniques que bibliographiques. 

Ahmad pour ta gentillesse et ta capacité à toujours aller plus loin. 

Lila pour ton fabuleux rire, ton entrain, ta gentillesse et ton fond de teint « Gucci© »! 

Guillaume, l’adorable copain du couloir d’en face. Présent depuis le début… toujours partant pour faire la fête avec toujours un petit mot gentil ou même un poème sous la main.  

Coralie pour ton superbe accent chantant et d’ailleurs pour tes chansons! 

Matthieu pour ta complicité tout au  long de ma thèse, tes conseils en photographie et ton petit côté poltron ;) 

Michelle pour  ton écoute  inébranlable,  ta  complicité et  ton  côté maternel qui m’a accompagnée  tout  au  long  de  ma  thèse.  Ainsi  que  pour  tes  longs  trajets  à  la maternité et tes superbes performances d’actrice dans le film « Vie ma vie de Clarisse en thèse »! 

Maymouna  pour  nos  capacités  télépathiques  ainsi  que  tout  ce  que  nous  avons partagé,  les  fous rires,  les pleurs,  les manips et  les sorties…  ta grande sensibilité et ton pragmatisme. Une grande amie… à qui je tiens énormément.  

La  petite  troupe  de  filles  du  début  qui  s’est  éparpillé  depuis:  Barbara,  Stéphanie, Vladimira, Maria, Cécile et Céline qui m’a permis de continuer le travail qu’elle avait commencé. Puis je remercie Clarisse, la petite Clarisse, avec moi depuis le début… qui m’a  soutenue qu’elle  soit dans  le même bureau ou a 5758  km de  là! Avec qui  j’ai développé une grande complicité et une amitié irremplaçable. Merci. 

Et  je  n’oublie  pas  Laure,  Houda,  Daniel,  Riccardo  et  Julie  que  je  n’aurai  pas  eu l’occasion  de  beaucoup  côtoyer mais  qui  sont    tous  adorables  et  prêts  à  rendre service. 

 

A  l’extérieur  de  ce  laboratoire,  j’aimerais  remercier  mes  amis  de  Fac,  toujours présents à mes côtés, avec qui nous avons partagés énormément de choses depuis le début de cette aventure ludique. Ceux qui suivirent la même voie que moi : les Docteurs Guillaume Castel,  Lisa  Cuckierman,  Sylvain  Riou,  Mathilde  Chaineaux,  Eloïse  Raoust,  Jean‐Batiste Bordes,  l’ont  clos  avant moi.  Et  je  n’oublie  pas  non  plus  la  présence  de  Raphaël  Boiron, Annes‐Sophie Bedin et Damien Coulomb. Je tenais à vous remercier pour vos conseils, votre aide et votre amitié. 

 

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Mes  remerciements  vont  ensuite  à  mon  meilleur  ami  depuis  le  lycée,  Aurélien, toujours  là quand  j’ai besoin de  lui et pour m’avoir présenté Yohan, Mickaël et Marietou. Merci  à  vous  quatre  pour  votre  soutien  infaillible  que  ce  soit  un  soutient moral  ou  tout simplement pour m’aider à déménager! Merci pour votre entrain à faire la fête et à prendre la vie du bon côté! Vive la Skypoker Team! 

 

Enfin, je tenais à remercier : 

Mes parents, Robert et Catherine et mon frère Paul pour m’avoir toujours poussé à faire ce qui m’intéressait et m’avoir toujours encouragé et soutenue.  

Ma grand‐mère Georgette pour m’avoir toujours écoutée et conseillée. 

René  pour  être mon  amour, mon  compagnon, mon  confident, mon meilleur  ami depuis presque 10 ans et pour être toujours à mes côtés quoi qu’il se passe… pour être toi. 

 

 

 

 

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Résumé La  destruction  du  compartiment  T  CD4  induite  par  le  VIH‐1  est  essentiellement 

périphérique. Cependant, l’atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent 

des arguments, est encore mal connue. L’objectif de ce travail a été d’explorer le rôle de la 

protéine  Nef,  hors  contexte  d’infection  virale,  dans  la  différenciation  lymphoïde.  Nef, 

produite  très  tôt  après  l’infection  par  le  VIH‐1,  possède  un  rôle‐clé  dans  la  pathogénie, 

comme en  témoigne  la  reproduction, chez  la souris  transgénique pour Nef, d’une maladie 

proche  de  la  maladie  humaine.  Dans  les  lymphocytes  matures  infectés,  Nef  module 

l’expression  du  récepteur  CD4,  des  molécules  du  CMH  de  classe  I  et  induit  un  état 

d’activation T. Nef  interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires  impliqués 

dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l’apoptose et de l’ontogénie T. Au 

cours de ce travail, nous avons montré que  l'expression de Nef en absence d'autres gènes 

viraux  bloquait  le  potentiel  T  et  NK  des  précurseurs  hématopoïétiques  humains  par  un 

mécanisme  apoptotique  indépendant des  caspases  et  lié  à une perturbation du potentiel 

mitochondrial.  

Grâce à  l’utilisation du  système de  culture OP9‐DL1 permettant  l’identification des 

premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que  la génération de 

cellules  T  à  partir  de  CD34+  est  affectée  à  un  stade  CD3+CD5+CD1a+  qui  a  initié  le 

réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en 

effet, une  réduction quantitative du nombre de CD4  ISP et de DP CD4+CD8+  TCRαβ  a été 

observée. Nef diminue aussi  la génération de cellules NK CD56+ alors que  la production de 

cellules  B  n’est  pas  affectée.  Des  analyses  par  dilution  limite  montrent  une  réduction 

significative de  la  fréquence des précurseurs T/NK parmi  les cellules CD34+ exprimant Nef. 

Nous  avons  par  ailleurs montré  une  augmentation  de  15  à  25%  de  cellules  apoptotiques 

dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n’est 

pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne  semble pas entrer non plus en  jeu. Nous 

avons par ailleurs pu déterminer que l’atteinte apoptotique des précurseurs passait par une 

déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6.   

L’ensemble  des  résultats  regroupés  dans  de  ce  travail  permet  d’approfondir  les 

connaissances  des  mécanismes  d’interférence  du  VIH  avec  l’hématopoïèse  et  plus 

précisément des actions de Nef sur l’hématopoïèse humaine.      

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6

 

  

  

  

  

  

  

TABLE DES MATIERES

  

  

   

TABLE DES MATIERES 

REMERCIEMENTS .............................................................................................................................. 2 

RESUME ................................................................................................................................................ 5 

TABLE DES MATIERES ..................................................................................................................... 6 

INTRODUCTION ................................................................................................................................. 9 

I.  GENERALITES DE L’INFECTION PAR LE VIH ...................................................................................................... 10 A.  Structure du VIH ..................................................................................................................................... 10 B.  Les récepteur et corécepteurs du VIH .................................................................................................... 12 C.  Les cellules cibles du VIH ........................................................................................................................ 14 

1.  Les lymphocytes TCD4+ ..................................................................................................................... 14 2.  Les monocytes/macrophages ............................................................................................................ 15 3.  Les cellules dendritiques .................................................................................................................... 17 

D.  Cycle viral ................................................................................................................................................ 18 

II.  ASPECTS CLINIQUES DE L’INFECTION PAR LE VIH .............................................................................................. 21 A.  La Phase Aigüe ou primo infection ......................................................................................................... 21 B.  La Phase Chronique ................................................................................................................................ 22 

III.  VIH ET LYMPHOPOÏESE ............................................................................................................................. 24 A.  Données récentes sur l’homéostasie des précurseurs T et NK ............................................................... 24 

1.  La thymopoïèse .................................................................................................................................. 24 i.  Les marqueurs phénotypiques ...................................................................................................... 25 ii.  Les différentes étapes de la lymphopoïèse T ................................................................................ 27 iii.  Le réarrangement du TCR ............................................................................................................. 29 

a.  Structure ................................................................................................................................... 29 b.  Organisation et réarrangement des gènes du TCR ................................................................... 30 

iv.  Rôle des cytokines et facteurs de transcription ............................................................................ 31 c.  L’IL‐7 ......................................................................................................................................... 31 d.  Notch ........................................................................................................................................ 35 

v.  Le développement des NK ............................................................................................................ 37 a.  Développement des cellules NK chez l’adulte .......................................................................... 37 b.  Les cytokines et facteurs de transcription impliqués dans le développement NK ................... 38 

B.  VIH et Thymopoïèse ................................................................................................................................ 39 

IV.  ROLE DE NEF DANS LA PHYSIOPATOLOGIE ...................................................................................................... 44 A.  Généralités .............................................................................................................................................. 44 B.  Nef et la physiopathologie SIDA ............................................................................................................. 44 

1.  Action positive de Nef sur la réplication virale et les capacités d’infection des virions .................... 44 2.  Action de Nef sur l’expression des molécules de surface .................................................................. 45 

i.  Diminution de l’expression du CD4 ............................................................................................... 45 ii.  Diminution de l’expression du CD28 ............................................................................................. 46 iii.  Diminution de l’expression du CMH de classe I ............................................................................ 47 iv.  Diminution de l’expression du CMH de classe II ........................................................................... 48 v.  Induction de DC‐SIGN .................................................................................................................... 49 

3.  Action de Nef sur la thymopoïèse ...................................................................................................... 49 C.  Nef et mort cellulaire .............................................................................................................................. 50 

1.  Données moléculaires sur l’apoptose ................................................................................................ 51 i.  Données morphologiques ............................................................................................................. 51 ii.  Les acteurs majeurs de l’apoptose ................................................................................................ 51 

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‐  Les Caspases ............................................................................................................................. 51 ‐  Les récepteurs de mort ............................................................................................................ 54 ‐  La famille BCL2.......................................................................................................................... 54 

iii.  Les grandes voies de signalisation ................................................................................................. 58 ‐  La voie extrinsèque ou des récepteurs de mort ....................................................................... 58 ‐  La voie intrinsèque ................................................................................................................... 59 

2.  Nef et apoptose ................................................................................................................................. 61 i.  Action anti‐apoptotique de Nef .................................................................................................... 61 ii.  Action pro‐apoptotique de Nef ..................................................................................................... 61 

3.  Les autres protéines virales du VIH et apoptose ................................................................................ 63 i.  Env ................................................................................................................................................. 63 ii.  Tat ................................................................................................................................................. 64 III.  Vpr ................................................................................................................................................. 64 

RESULTATS ...................................................................................................................................... 66 

I.  ARTICLE: “HIV‐1 NEF PROTEIN EXPRESSION IN HUMAN CD34+ PROGENITORS IMPAIRS THE DIFFERENTIATION OF AN EARLY 

T/NK CELL PRECURSOR” ..................................................................................................................................... 67 

II.  SUITE DE L’ÉTUDE .................................................................................................................................... 79 A.  Introduction ............................................................................................................................................ 79 B.  Matériel et Méthodes ............................................................................................................................. 80 C.  Résultats ................................................................................................................................................. 84 D.  Conclusion............................................................................................................................................... 97 

DISCUSSION & PERSPECTIVES ................................................................................................... 98 

BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................... 108  

 

 

 

 

 

 

 

     

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INTRODUCTION

  

  

 

I. GENERALITES DE L’INFECTION PAR LE VIH  

Découvert  en  1983  (Barre‐Sinoussi,  Chermann  et  al.  1983),  le  virus  de 

l’immunodéficience humaine  (VIH),  responsable du  syndrome d’immunodéficience acquise 

(SIDA) a engendré une pandémie qui depuis sa découverte peut être évaluée à plus de 60 

millions  de  personnes  infectées,  dont  plus  d’un  tiers  en  sont  déjà  décédées.  La 

caractéristique  principale  de  l’infection  par  le  VIH‐1  est  une  déplétion  progressive  des 

cellules T CD4+ entraînant une dégradation du système immunitaire et le développement de 

maladies opportunistes. 

A. Structure du VIH  

Le  virus  de  l’immunodéficience  humaine  (VIH)  fait  partie  de  la  famille  des 

Retroviridae.  Chaque  particule  virale  est  constituée  d'une  bicouche  lipidique  d'origine 

cellulaire dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines d’enveloppe virale transmembranaire 

(TM,  gp41)  liées  de  façon  non  covalente  aux  glycoprotéines  d'enveloppe  de  surface  (SU, 

gp120)  (Figure 1). L'intérieur de  la particule virale est  tapissé de molécules correspondant 

aux protéines de la matrice (MA) et contient également la protéase virale (PR). Au cœur de 

la particule virale se trouve un nucléoïde en forme de trapèze constitué par les protéines de 

la capside (CA). C'est à l'intérieur de la capside virale que sont présentes les protéines de la 

nucléocapside  (NC),  deux  des  trois  enzymes  virales  (la  transcriptase  inverse  (RT),  et 

l'intégrase  (IN)), ainsi que  le matériel génétique. C’est un  rétrovirus à ARN monocaténaire 

dont  le génome viral est composé de deux copies  identiques d’ARN  (Figure 1). Le génome 

viral du VIH comporte 1) des gènes classiques de structure Gag (précurseur de nombreuses 

protéines structurales de  l’intérieur du virus : matrice  (MA), capside  (CA) et nucléocapside 

(NC)),  Pol  (codant  pour  les  activités  enzymatiques  du  virus :  protéase  PR,  reverse 

transcriptase RT, RNase H  et  l’intégrase  IN)  et  Env  (codant pour  le précurseur  gp160 des 

protéines  virales  d’enveloppe :  gp41  et  gp120)  (Wilk, Gross  et  al.  2001),  2)  des  gènes  de 

régulation qui ont un rôle essentiel dans le pouvoir pathogène du virus : parmi ces derniers 

Tat et Rev. Enfin, il code aussi pour 3) quatre protéines accessoires nommées Nef, Vif, Vpr et 

Vpu.  Ces  protéines  accessoires  ne  sont  pas  indispensables  à  la  réplication  virale  mais 

remplissent  cependant des  rôles essentiels  au  cours du  cycle  viral  (Das  and  Jameel 2005) 

(Figure 2).  

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Figure 1.   Structure schématique du virus de l’immunodéficience humaine.      

 

 Figure 2.    Organisation du génome du VIH et résumé des fonctions des 9 gènes codant 

pour les 15 protéines virales. (Greene and Peterlin 2002) 

11

B. Les récepteur et corécepteurs du VIH 

Le  récepteur CD4  (cluster de différentiation 4) est une glycoprotéine exprimée à  la 

surface  des  lymphocytes  T  CD4+,  des  cellules  régulatrices  T,  des  monocytes,  des 

macrophages  et  de  certaines  cellules  dendritiques.  Une  très  forte  liaison  existe  entre  la 

gp120 du VIH et le récepteur CD4. Il en résulte que le VIH n’infecte que des cellules ayant ce 

récepteur  à  leur  surface.  Ces  cellules  sont  en  très  grande majorité  les  lymphocytes  CD4+ 

(McDougal, Nicholson et al. 1986).  

Les corécepteurs du VIH sont des récepteurs aux chimiokines appartenant à la famille 

des récepteurs à sept domaines transmembranaires avec un domaine intracellulaire couplé à 

une  protéine  G.  Plusieurs  corécepteurs  de  ce  type  ont  été  identifiés,  notamment  CCR5 

(Dragic, Litwin et al. 1996), CXCR4  (Feng, Broder et al. 1996), CCR2b, CCR3, CCR8  (Rucker, 

Edinger et al. 1997), CX3CR1 (Combadiere, Salzwedel et al. 1998), Bonzo (Pohlmann, Stolte 

et al. 1999), Bob  (Pohlmann, Stolte et al. 1999) et CCR9  (Choe, Farzan et al. 1998). Parmi 

ceux‐ci, les récepteurs CCR5 et CXCR4, les premiers décrits, sont les plus importants (Zhang, 

Rowe et  al. 2002).  L’utilisation  sélective des  corécepteurs CCR5 et/ou CXCR4 explique  les 

différents  tropismes des  isolats du VIH  (Berger, Doms et al. 1998)  (Figure 3).  La molécule 

CCR5 est le principal corécepteur des variants des VIH (isolats R5) transmis sexuellement et 

qui persistent chez  la majorité des personnes  infectées. L’existence de sites de  liaison de  la 

gp120 communs aux récepteurs CCR5 et CXCR4 est suggérée par  la capacité de  liaison aux 

deux  corécepteurs  des  isolats  R5/X4.  Des  résidus  négativement  chargés  et  des  tyrosines 

présentes  dans  le  domaine  extracellulaire  de  CXCR4  sont  impliqués  dans  la  fonction  de 

corécepteur  de  cette  molécule,  mais  chaque  isolat  interagit  avec  des  acides  aminés 

différents pour pénétrer dans la cellule cible (Amara, Gall et al. 1997; Brelot, Heveker et al. 

2000). 

L'utilisation  de  l'un  ou  l'autre  des  corécepteurs  par  le  VIH  est  déterminée  par  les 

séquences de la région V3 et de la région V1/V2 de la gp120 (Hoffman, Seillier‐Moiseiwitsch 

et  al.  2002;  Yamaguchi‐Kabata,  Yamashita  et  al.  2004).  Le  tropisme du VIH  varie  selon  le 

corécepteur utilisé par le VIH pour pénétrer dans la cellule cible. Les souches qui utilisent le 

CXCR4  comme  corécepteur  sont désignées « CXCR4‐tropique  »  (ou « X4 »),  tandis que  les 

souches qui utilisent CCR5 sont appelées « CCR5‐tropique » (ou « R5 ») (Berger, Doms et al. 

12

1998). Le CXCR4 étant le corécepteur utilisé par le VIH pour entrer dans les cellules cibles de 

lignées  lymphocytaires  adaptées,  les  virus  X4  sont  aussi  appelés  « T‐tropiques »  ou 

« lymphocytotropiques ».  Les  virus  R5  sont  dénommés  « M‐tropiques »  ou 

« monocytotropiques », puisque le corécepteur CCR5 permet principalement l'entrée du VIH 

dans les monocytes et les macrophages. Certains isolats capables d'utiliser les corécepteurs 

CXCR4 et CCR5 sont dénommés « CXCR4/CCR5‐tropiques » ou « à double  tropisme». 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 3.  Processus de fusion du VIH  à la membrane cellulaire. 

1) Fixation de la gp120 au récepteur CD4 ; 2) Fixation d'une boucle variable de la gp120 au co‐récepteur 

CCR5 ou CXCR4 et fixation de  la gp41 sur  la membrane cellulaire; 3) Pénétration de  la capside dans  le 

cytoplasme de la cellule. Source: national institute of allergy and infectious diseases  

   

13

C. Les cellules cibles du VIH  

1. Les lymphocytes TCD4+  

Les lymphocytes T CD4+ ont été pendant longtemps le centre d'intérêt des recherches 

sur  l'infection  par  le  VIH.  La  réplication  du  VIH  étant  rapide  et  très  efficace  dans  les 

lymphocytes T activés, ces cellules sont considérées comme  le principal site de production 

virale  qui  alimente  la  virémie  plasmatique.  In  vivo,  plusieurs  données  indiquent  que  les 

lymphocytes  T  CD4+  font  partie  des  premières  populations  cellulaires  majoritairement 

infectées par  le SIV (Virus de  l’Immunodéficience Simienne) et  le VIH (Zhang, Schuler et al. 

1999). 

Les cellules T CD4+ activées sont sensibles à l'infection par les isolats X4 et R5. L'état 

d'activation  de  ces  cellules  engendre  la  synthèse  de  nombreux  facteurs  cellulaires 

activateurs de la transcription virale. Dans ces conditions de réplication optimales, l'infection 

est  cytopathogénique  in  vitro.  Plusieurs  études  ont  montré  que  la majorité  des  virions 

présents dans  les plasmas d'individus  infectés provenait de ces cellules T CD4+ activées et 

que la durée de vie de ces cellules était limitée lorsque celles‐ci étaient infectées par le VIH 

(Ho, Neumann et al. 1995; Wei, Ghosh et al. 1995; Perelson 2002). Sous l'influence de l'IL‐2 

et  de  l'IFN‐γ,  les  cellules  Th1  (T  helper)  expriment  fortement  CCR5  et  sont  donc 

particulièrement  sensibles  à  l'infection  des  souches  R5.  En  revanche,  sous  l'influence  de 

cytokines de type Th2 (comme l'IL‐4), les cellules T produisent de l'IL‐10 qui a pour effet de 

réduire l'expression de CCR5, rendant les cellules de type Th2 plus sensibles à l'infection par 

les souches X4  (Suzuki, Koyanagi et al. 1999). Ainsi  l'environnement cytokinique  jouant un 

rôle critique dans la propagation différentielle des isolats viraux suggère que les cytokines de 

type Th2 (IL‐4 et IL‐10), fortement produites dans les stades tardifs de la maladie, pourraient 

jouer  un  rôle  important  dans  l'émergence  des  souches  X4  caractéristiques  de  ces  stades 

(Clerici and Shearer 1994; Torres, Medrano et al. 1998). 

L'infection des lymphocytes T CD4+ naïfs est généralement abortive. Cette inefficacité 

a été expliquée par un blocage de la réplication virale dans les cellules quiescentes. En effet, 

Zack & al. ont montrés que la progression de la cellule en phase G1b était nécessaire à une 

14

rétro‐transcription  complète  (Zack,  Haislip  et  al.  1992;  Korin  and  Zack  1998).  L’infection 

fonctionnelle des cellules cibles par HIV‐1 nécessite l’activation des cellules cibles. 

Les cellules mémoires au  repos peuvent être  infectées par  le VIH et constituent un 

réservoir viral latent particulièrement stable, ces cellules ayant une durée de vie prolongée. 

Toutefois,  ces  cellules  ne  répliquent  que  faiblement  le  VIH  (Finzi,  Blankson  et  al.  1999; 

Zhang, Schuler et al. 1999) (Figure 4). 

 

2. Les monocytes/macrophages  

 

Les monocytes  circulent dans  le  sang et  se différencient en macrophages  lorsqu’ils 

infiltrent  les  tissus. Les monocytes génèrent des populations hétérogènes de macrophages 

dans les différents tissus selon des signaux d’activation et le microenvironnement. 

Les monocytes fraîchement  isolés du sang périphérique peuvent être  infectés, mais  ils sont 

incapables  de  répliquer  le  VIH.  Leur  différenciation  en macrophage  induit  une  infection 

productive  (Rich,  Chen  et  al.  1992).  Cependant,  de  l’ARN  viral  a  été  détecté  dans  les 

monocytes  d’une  majorité  de  patients  séropositifs  (McElrath,  Steinman  et  al.  1991; 

Innocenti, Ottmann et al. 1992). Cette incapacité des monocytes à produire du virus semble 

être due  à un blocage du  cycle  viral  lors de  l’initiation de  la  transcription  inverse  (Sonza, 

Maerz et al. 1996).  

Les macrophages ont une longue durée de vie et constituent un réservoir important 

du VIH  in  vivo.  L’infection  des macrophages  s’effectue  principalement  par  le  corécepteur 

CCR5. De  ce  fait,  ils  sont  préférentiellement  infectés  par  des  souches  virales  R5‐tropique 

(Naif, Li et al. 1998). 

Les  macrophages  ont  la  capacité  de  phagocyter  et  d’apprêter  par  la  suite  des 

antigènes pour  les présenter aux  lymphocytes T  (Figure 4). Les macrophages sont des CPA 

(Cellules Présentatrices d’Antigènes). Le contact existant alors entre  les macrophages et  les 

lymphocytes  T  CD4+  lors  de  la  présentation  antigénique  pourrait  être  impliqué  dans  la 

transmission  du  VIH  (Carr,  Hocking  et  al.  1999).  Le  virus  peut  être  aussi  phagocyté  ou 

internalisé  par  l’intermédiaire  de  récepteurs  du  complément  CR1  et  CR3  (Thieblemont, 

Delibrias  et  al.  1993;  Bouhlal,  Galon  et  al.  2001)  et/ou  par  des  lectines  de  type  C.  Les 

dernières  étapes  du  cycle  viral  du  VIH  dans  le macrophage,  en  particulier  l’assemblage 

15

inhabituel des virions, pourraient contribuer au caractère de « réservoirs » de ces cellules. 

Comme pour  tous  les  rétrovirus de  type C,  l’assemblage des nouvelles particules virales a 

lieu classiquement au niveau de  la membrane cellulaire. Mais, dans  le cas du macrophage 

infecté par le VIH, une grande proportion des virions néoformés est assemblée au niveau des 

membranes des vésicules  cytoplasmiques.  Le VIH est ensuite  simplement exocyté, avec  le 

contenu de ces vésicules (Figure 4). 

 

 

Figure 4.  Motifs  de  réplication  virale  du  VIH  dans  les  différentes  cellules  hôtes. 

(Stevenson 2003) 

 

 

   

16

3. Les cellules dendritiques 

 

Les  cellules  dendritiques  immatures  (DCi)  sont  largement  distribuées  dans 

l'organisme et  jouent  le rôle de sentinelles dans certains tissus comme  les épithéliums. Les 

cellules  dendritiques  matures  migrent  vers  les  tissus  lymphoïdes  sous  l'influence  de 

molécules chimiotactiques afin de présenter l'antigène aux lymphocytes T. Plusieurs études 

ont montré que  les propriétés de migration et d'interaction des cellules dendritiques avec 

les lymphocytes pouvaient être exploitées par le VIH‐1 afin de faciliter l'infection par ce virus 

(Toniolo, Serra et al. 1995) (Figure 4). 

Les  DC  expriment  la  molécule  CD4  à  leur  surface  mais  également  les  deux  principaux 

corécepteurs  du  VIH.  L'expression  de  CCR5  et  de  CXCR4  est  fonction  de  leur  état  de 

maturation. Lorsqu’elles sont immatures, elles expriment principalement CCR5 et faiblement 

CXCR4, et seraient alors plus sensibles aux souches R5‐tropiques. Lorsqu’elles sont matures, 

l’expression de CCR5 diminue et celle de CXCR4 augmente, rendant les cellules plus sensibles 

à l'infection par les souches X4‐tropiques. Les DC matures répliqueraient beaucoup moins le 

virus,  probablement  à  cause  de  la  régulation  de  l'expression  des  corécepteurs  et  d’un 

blocage  précoce  du  cycle  viral  (Nelson,  Wiley  et  al.  1988;  Homsy,  Meyer  et  al.  1989; 

Giannetti, Zambruno et al. 1993). 

Dans  le  tractus génital,  les DC  immatures  sont  localisées au niveau de  l’épithélium 

(cellules  de  Langerhans)  et  de  la  région  sous‐épithéliale  (DC  dermiques).  Les  propriétés 

migratoires  des  DC  et  leur  capacité  à  recruter  les  lymphocytes  T  au  sein  des  tissus 

lymphoïdes suggèrent que ces cellules possèdent un rôle important dans la transmission du 

VIH. Cette hypothèse a été confortée par  la découverte du récepteur, DC‐SIGN, capable de 

capter,  entre  autres,  le  VIH  et  de  faciliter  l’infection  de  cellules  permissives  par  un 

mécanisme  indirect  (Geijtenbeek,  Kwon  et  al.  2000;  Geijtenbeek,  Torensma  et  al.  2000; 

Kwon, Gregorio et  al. 2002).  Les DC  agissent  comme un  cheval de  Troie pour  le  virus.  La 

molécule DC‐SIGN peut  interagir avec  l’enveloppe du VIH et  retenir ainsi  le virion dans un 

état  infectieux  pendant  plusieurs  jours  pour  le  transmettre  aux  lymphocytes  T  permissifs 

(Geijtenbeek, Kwon et al. 2000) (Figure 4). L’expression de la molécule DC‐SIGN semble être 

aussi  induite à  la surface des macrophages activés dans un environnement cytokinique de 

type Th1 (IFN‐γ) ou Th2 (IL‐4 ou IL‐13) (Chehimi, Luo et al. 2003). 

17

D. Cycle viral 

 

Le cycle viral commence par  l'attachement des particules virales sur  la cellule cible. 

L'attachement est dû à une interaction très forte entre la gp120 du côté viral et le récepteur 

cellulaire CD4 (Dalgleish, Beverley et al. 1984; Klatzmann, Champagne et al. 1984) ainsi que 

l’un des deux corécepteurs la molécule CCR5 (récepteur des chimiokines RANTES, MIP1‐α et 

MIP1‐β)  ou CXCR4  (récepteur de  la  chimiokine  SDF‐1)  (Alkhatib, Combadiere  et  al.  1996; 

Choe, Farzan et al. 1996; Deng, Liu et al. 1996; Dragic, Litwin et al. 1996; Feng, Broder et al. 

1996).  La  fixation  avec  le  récepteur  CD4  entraîne  le  changement  de  conformation  de  la 

gp120 qui peut alors se fixer à un des co‐récepteurs. Cette fixation  libère  la protéine gp41, 

qui  se  fixe  sur  la  membrane  cytoplasmique.  Par  repli  sur  elle‐même,  gp41  permet  un 

rapprochement de  l'enveloppe  virale  vers  la membrane  cytoplasmique, puis  la  fusion des 

membranes  cellulaire et  virale  a  lieu  grâce  à un peptide de  fusion présent dans  gp41.  La 

capside du VIH pénètre alors dans  le  cytoplasme de  la  cellule ; une  fois à  l'intérieur de  la 

cellule, elle est détruite par des protéases  cellulaires,  libérant  les deux brins d'ARN et  les 

enzymes  qu'elle  contenait  (phénomène  de  décapsidation)  (Figure  5).  Les  évènements 

précoces  qui  se  produisent  suite  à  la  libération  de  la  capside  dans  le  cytoplasme  sont  la 

formation  d’un  complexe  de  transcription  inverse  comprenant  le  génome  viral  ARN,  la 

reverse  transcriptase  (RT),  l’intégrase,  la nucléocapside,  la protéine virale R  (Vpr) et divers 

protéines de l’hôte (Karageorgos, Li et al. 1993). La transcription inverse peut alors avoir lieu 

et aboutit à la création d’un ADNc viral double brin (Figure 5). Cet ADNc double brin est alors 

transporté dans le noyau par des protéines appartenant au complexe de pré‐intégration du 

VIH. Ces protéines comme l’intégrase (Gallay, Hope et al. 1997) ou Vpr (Heinzinger, Bukinsky 

et  al.  1994)  ont  été montrées  comme  jouant  un  rôle  clef  dans  le  transport  nucléaire  de 

l’ADNc  viral.  Une  fois  dans  le  noyau,  le  génome  viral  peut  entrer  en  contact  avec  les 

chromosomes  de  la  cellule  hôte  et  s’intégrer  au  génome :  on  parle  alors  de  provirus.  Le 

provirus VIH peut  s’intégrer dans différents  sites d’intégration  au  sein des  chromosomes, 

ainsi beaucoup de cellules infectées intègrent plus d’un provirus. De cette intégration résulte 

des  formes provirales  transcriptionellement  latentes, par exemple  lors de  l’intégration du 

provirus dans des zones d’hétérochromatine réprimées, ou actives (Adams, Sharmeen et al. 

1994). Cependant, étant donné que de multiples provirus sont intégrés dans la cellule, il est 

18

probable  qu’au  moins  un  sera  actif  transcriptionellement.  L’équipe  de  Wain‐hobson  a 

d’ailleurs  montré  la  présence  de  quasi‐espèces  in  vivo  et  in  vitro  au  cours  du  temps 

(Meyerhans, Cheynier et al. 1989; Delassus, Cheynier et al. 1991). 

 

Après transcription du génome viral, plus d’une douzaine de transcrits sont générés. 

Certains sont rapidement  transportés dans  le cytoplasme  (Figure 5). Ces ARN viraux multi‐

épissés  codent pour  les protéines précoces : Nef,  Tat et Rev  (Cullen 1998).  Tat  interviens 

alors pour augmenter la transcription des protéines précoces. Rev agit comme un répresseur 

de la transcription afin de permettre une régulation du mécanisme. D’autres transcrits viraux 

sont  produits  et  codent  pour    les  protéines  accessoires  ainsi  que  le  génome  viral  (ARN) 

nécessaire  pour  l’assemblage  de  nouveaux  virions.  Leur  transport  dans  le  cytoplasme 

dépends de la production et de la quantité de Rev (Cullen 1998). Rev est une petite protéine 

navette qui se lie au complexe d’ARN, elle contient une séquence NLS (signal de localisation 

nucléaire) ainsi qu’une NES (séquence d’export nucléaire) riche en leucine.  

 

La dissémination du VIH se produit lorsqu’une balance entre l’épissage et le transport 

de  l’ARNm viral est mis en place. Si  l’épissage est trop efficace, seuls  les ARN viraux multi‐

épissés apparaissent dans le cytoplasme. Bien que nécessaire, ces protéines régulatrices sont 

insuffisantes  pour  permettre  une  réplication  virale  complète. Cependant,  si  l’épissage  est 

trop  diminué,  alors  la  quantité  idéale  de  Tat,  Rev  et  Nef  ne  sera  pas  atteinte.  Dans  de 

nombreuses cellules provenant de modèles non primates,  les  transcrits VIH subissent  trop 

d’épissage, ce qui bloque la production virale (Malim, Tiley et al. 1990). 

 

Tous  les composants des virions sont assemblés à  la membrane plasmique quand  le 

bourgeonnement se produit (Figure 5). Ce processus est largement dirigé par le couple Gag‐

Pol et  les polyprotéines Gag, mais aussi  influencé par Env et enfin  implique  le recrutement 

de deux copies du génome d’ARN viral et de Vpr (Freed 1998). La formation d’une capside 

immature requière approximativement 1500 polyprotéines Gag (Wilk, Gross et al. 2001). 

Une protéine humaine de liaison a l’ATP nommée HP68 joue un rôle de protéine chaperone 

dans  la  transformation  de  la  conformation  de Gag  (Zimmerman,  Klein  et  al.  2002).  Cette 

étape  est  nécessaire  à  l’assemblage  de  la  capside.  Grâce  aux  myristoylations  et  aux 

palmitoylations  de  la  polyprotéine Gag, Gag  s’associe  préférentiellement  avec  des micros 

19

domaines membranaires enrichis en cholestérol et en glycolipides (Gottlinger, Sodroski et al. 

1989; Ono and Freed 2001). Le bourgeonnement viral se déroule au niveau de ces régions de 

la  membrane  lipidique,  cédant  aux  virions  des  membranes  riches  en  cholesterol.  Cette 

composition  favorise  la sortie des virions ainsi que  la stabilité et  la  fusion avec  les cellules 

cibles (Campbell, Crowe et al. 2001). 

 

 

 

 

 

 

Figure 5.  Cycle de réplication du VIH (Peterlin and Trono 2003).  

 

20

II. ASPECTS CLINIQUES DE L’INFECTION PAR LE VIH 

 

L’infection par le VIH débute par une phase aigüe qui ne dure que quelques semaines 

et  qui  est  associée  à  une  forte  virémie,  une  chute  sévère  de  la  quantité  de  T  CD4+ 

périphériques  (Cooper, Gold  et  al.  1985; Ho,  Sarngadharan  et  al.  1985;  Clark,  Saag  et  al. 

1991; Daar, Moudgil et al. 1991; Henrard, Daar et al. 1995; Schacker, Hughes et al. 1998; 

Lyles, Munoz et al. 2000),  l’établissement d’un réservoir  latent de cellules T CD4+  infectées 

(Chun,  Carruth  et  al.  1997;  Finzi, Hermankova  et  al.  1997;  Chun,  Engel  et  al.  1998;  Finzi, 

Blankson  et  al.  1999)  et  le  développement  d’une  réponse  immune  spécifique  du  VIH 

(Borrow,  Lewicki  et  al.  1994;  Koup,  Safrit  et  al.  1994;  Rosenberg,  Billingsley  et  al.  1997; 

Pitcher, Quittner et al. 1999). Il en suit une forte chute de la charge virale, une augmentation 

partielle du nombre de T CD4+ puis  généralement une phase  asymptomatique d’infection 

chronique qui peut durer en moyenne 10 ans et qui est marquée par une chute  lente du 

nombre de T CD4+ périphériques et une  augmentation  constante de  la  virémie. Quand  la 

quantité de T CD4+ totale a été réduite de moitié (Haase 1999), les maladies opportunistes et 

les cancers se déclarent chez le patient. Ceci se produit de manière concomitante avec une 

hausse    rapide  de  la  virémie  et  un  effondrement  du  nombre  de  T  CD4+  périphériques 

(Pantaleo, Graziosi et al. 1993). 

 

A. La Phase Aigüe ou primo infection 

 

Les premiers évènements physiopathologiques lors de la phase aigüe d’infection sont 

peu connus chez  l’homme. Afin de  l’étudier, des modèles simiens d’infection par  le SIV ont 

étés mis en place. Après inoculation intraveineuse, intra‐rectale ou orale, du SIV, il apparaît 

que le foyer initial de réplication viral soit les T CD4+ dans la lamina propria des muqueuses 

plutôt que  les cellules non  lymphocytaires comme  les cellules dendritiques  (Smit‐McBride, 

Mattapallil et al. 1998; Veazey, DeMaria et al. 1998; Kewenig, Schneider et al. 1999; Stahl‐

Hennig,  Steinman  et  al.  1999;  Vajdy,  Veazey  et  al.  2000;  Veazey, Mansfield  et  al.  2000; 

Veazey,  Tham  et  al.  2000).  En  effet  il  a  été montré  que  les  cellules  intra  épithéliales  de 

Langerhans  peuvent  être  infectées  par  le  SIV  après  quoi  elles  maturent  et  migrent 

21

directement vers  les ganglions  les plus proches où  le virus  se propage aux cellules T CD4+ 

résidentes  (Hu,  Gardner  et  al.  2000).  Une  réponse  lymphocytaire  T  cytotoxique  (LTC) 

spécifique  du  virus,  dirigée  contre  les  gènes  de  structures  et  de  régulation  du  VIH  est 

rapidement mise  en  place.  Ces  T  CD8+  contrôlent  le VIH  par  au moins  deux mécanismes 

(Yang  and Walker 1997). Premièrement  les  LTC  lysent  les  cellules  infectées par  le VIH en 

reconnaissant à la surface de la cellule des peptides viraux présentés par le CMH de classe I. 

Deuxièmement  les  cellules  T  CD8+  inhibent  la  réplication  virale  par  la  sécrétion  de 

chimiokines comme MIP‐1a, MIP‐1b et RANTES qui se fixent aux corécepteurs du VIH‐1 à la 

surface des T CD4+ et bloquent ainsi l’entrée du virus. Ces chimiokines sont dans les mêmes 

granulent qui contiennent les protéines cytolytiques et sont larguées après rencontre du TCR 

avec son antigène spécifique (Wagner, Yang et al. 1998).  Les chimiokines agissent à leur tour 

comme stimulation de l’activité cytolytique des LTC  et potentialisent ainsi le contrôle du VIH 

(Borrow, Lewicki et al. 1994; Koup, Safrit et al. 1994). Ainsi, après environ deux semaines, on 

obtient une clairance de la virémie (Figure 6).  

Entre  6  semaines  et  3  mois  après  la  contamination,  les  personnes  infectées 

produisent des anticorps dirigés contre  les antigènes du VIH  (Borrow, Lewicki et al. 1994). 

Cette  période  est  désignée  sous  le  terme  de  séroconversion.  Cependant,  les  réponses 

immunitaires  anti‐virales,  bien  qu’importantes,  sont  insuffisantes  pour  conduire  à 

l’éradication virale au sein de l’organisme. 

 

B.  La Phase Chronique 

La  phase  chronique  de  l’infection  est marquée  par  une  augmentation  faible mais 

constante de la charge virale et inversement la chute progressive du nombre de lymphocytes 

T CD4+ dans  le  sang périphérique  sur une période d’environ 10 ans avant  l’apparition des 

symptômes  du  SIDA  (Kahn  and Walker  1998)  (Figure  6).  Pendant  cette  période, un  quasi 

équilibre  se  crée  entre  une  activation  chronique  des  T  CD4+  et  des  T  CD8+  (Ascher  and 

Sheppard 1988),  la mort cellulaire et  la production virale. Finalement, l’équilibre est rompu 

et le système immunitaire se dégrade progressivement, il en résulte une immunodéficience 

caractérisée par  le développement d’infections opportunistes qui  caractérisent  la maladie 

SIDA (Pantaleo, Graziosi et al. 1993).  

22

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

Figure 6.  Evolution de l’infection par le VIH, les trois phases cliniques. 

 

23

III. VIH ET LYMPHOPOÏESE 

 

L’infection par  le VIH est caractérisée par une perte progressive des  lymphocytes T 

CD4+  et  une  déficience  du  système  immunitaire  qui  entraîne  la  survenue  d’infections 

opportunistes puis la mort. Plusieurs voies entraînent la perte des lymphocytes TCD4+ : une 

diminution de  la production des cellules T par  le thymus, une  localisation du virus dans  les 

tissus  lymphoïdes  suivie  d’une  infiltration  des  centres  germinatifs  par  des  lymphocytes  T 

cytotoxiques  CD8+  spécifiques  du  VIH  (Gratton,  Cheynier  et  al.  2000),  une  altération  du 

processus homéostatique de prolifération des TCD4+ ainsi qu’une augmentation de  la mort 

cellulaire induite par le VIH.  

 

A. Données récentes sur l’homéostasie des précurseurs T et NK 

Les  cellules  du  sang  se  renouvellent  en  permanence  tout  au  long  de  la  vie.  Ce 

processus est assuré par une population de  cellules aux  caractéristiques particulières :  les 

Cellules Souches Hématopoïétiques  (CSH). Elles possèdent  les capacités uniques de s’auto‐

renouveler et de  se différencier en  l’ensemble des  cellules du  sang. Ces  cellules, peuvent 

être  classées en  trois  lignées :  lymphoïde  (regroupant  les  lymphocytes B et  T,  les Natural 

Killer  et  les  cellules  dendritiques),  myéloïde  (regroupant  les  macrophages,  les  cellules 

dendritiques, les monocytes et les granulocytes) et erythroïde‐mégacaryocytaire. 

1. La thymopoïèse 

La population lymphocytaire T représente environ 70% des lymphocytes du sang. Ces 

cellules  interviennent  non  seulement  dans  l’immunité  à médiation  cellulaire mais  aussi  à 

médiation humorale. Issus de progéniteurs provenant de la moelle osseuse, les précurseurs 

T migrent vers le thymus où ils vont finir leur maturation. Les lymphocytes T arborent à leur 

surface un TCR (T cell receptor) qui n’identifie l’antigène que sous forme clivée en un court 

peptide qui devra être associé aux molécules du CMH. 

 

24

i. Les marqueurs phénotypiques 

La progression de  la différenciation est  suivie grâce à  la présence de molécules de 

surface. Dans  le cas des  lymphocytes T, tout se passe dans  le thymus. Le développement T 

est suivi selon l’expression des marqueurs suivants : CD11, CD7, CD5, CD3, CD4 et CD8 sans 

oublier  l’expresssion du pré‐récepteur T  (pre‐Tα) et du récepteur T αβ. En réalité, c’est  les 

différentes  combinaisons  de  ces marqueurs  qui  permettent  l’identification  des  différents 

stades.  CD7  est  l’identifiant  le  plus  précoce  des  précurseurs  T  lorsqu’il  est  associé  à 

l’expression du CD3ε. Le CD5, une glycoprotéine membranaire impliquée dans l’adhésion et 

l’activation cellulaire, intervient dans la réponse proliférative de cellules T activées, ainsi que 

dans  la  fonction des cellules CD4+ helper.  Il est considéré comme un marqueur spécifique 

des  lymphocytes  T  bien  qu’il  existe  une  sous‐population  particulière  de  lymphocytes  B 

l’exprimant. Le CD2 est une molécule d’adhésion capable de lier le CD48 et CD58 (ou LFA‐3 

pour  lymphocyte Antigen‐3, présent  sur  les globules  rouges).  Il est  l’un des marqueurs  les 

plus précoces des  thymocytes et est maintenu sur  les cellules T matures. Le CD1a est une 

molécule dite CMH‐like pouvant présenter des molécules de lipides à la surface des cellules. 

Elle est présenté à  la  fois par  les  thymocytes,  les cellules dendritiques et  les macrophages 

activés.  Cependant,  associée  à  d’autres  marqueurs,  tel  que  le  CD5,  elle  caractérise  les 

thymocytes  mais  sa  fonction  n’est  pas  indispensable.  Le  complexe  CD3,  composé  chez 

l’homme de 4 chaînes polypeptidiques invariantes qui s’associent pour former trois dimères 

CD3γε, CD3δε ou CD3ξξ  est  souvent  associé  à  la différenciation  T mais peut‐être présent 

également sur les NK. 

Le  CD4  est  le  récepteur  permettant  d’interagir  avec  le  CMH  de  classe  II.  Il  est 

caractéristique des lymphocytes T dis « helpers », mais on le retrouve plus précocement au 

niveau des thymocytes SP CD4+ et des DP CD4+CD8+. Les monocytes, macrophages et autres 

cellules dendritiques peuvent aussi l’exprimer. 

Le CD8 est le récepteur permettant d’interagir avec le CMH de classe I, il est lui aussi 

exprimé par  les thymocytes et par près de 30% des  lymphocytes T du sang. Chez  l’homme, 

certaines  sous‐populations  de  NK  peuvent  aussi  le  présenter  mais  à  des  proportions 

moindres. Ainsi, les différentes populations T sont définies, non pas par l’expression unique 

d’un marqueur, mais par l’expression combinée des molécules précédemment citées (Figure 

7). 

25

 

Figure 7 :   Stades intermédiaires de développement des thymocytes. (Figure adaptée de 

(Blom and Spits 2006 et Res, 1999 #243)) 

 

   

26

ii. Les différentes étapes de la lymphopoïèse T 

Les CSH vont, à travers toute une série d’étapes, se différencier progressivement en 

précurseurs possédant un choix de différenciation de plus en plus restreint pour, finalement, 

engendrer  des  cellules  spécialisées.  Ces  cellules  apparaissent  en  premier  lors  du 

développement  embryonnaire  dans  les  vaisseaux  sanguins  intra  et  extra  embryonnaires. 

L’hématopoïèse se déroule alors au sein du placenta, du  foie  fœtal, de  la rate puis dans  la 

moelle osseuse.  La moelle osseuse  est  le  site majeur de  l’hématopoïèse  chez  l’adulte.  Le 

marqueur CD34 est connu pour caractériser les CSH au sein de la moelle osseuse et dans le 

sang de cordon (Civin, Strauss et al. 1984). 

Le thymus est le site majeur de développement et de la maturation des cellules T ou 

thymocytes. Les précurseurs des cellules T gagnent  le thymus par  la circulation sanguine et 

pénètrent le thymus au niveau de la jonction cortico‐médulaire (Porritt, Gordon et al. 2003). 

La  différenciation  des  thymocytes  peut  être  divisée  en  plusieurs  étapes,  en  fonction  de 

l’expression des marqueurs CD4 et CD8. Les cellules  immatures CD4‐CD8‐  (double positive, 

DP), puis évoluent vers les stades CD4+CD8+ ou CD4‐CD8+ (simple positive, SP) (Res and Spits 

1999). 

Une source continue de progéniteurs provenant de la moelle osseuse vient coloniser 

le  thymus,  permettant  ainsi  l’initiation  de  l’engagement  des  précurseurs  dans  la  voie  de 

différenciation T. Ces précurseurs sont nommés TSP pour « Thymus Seeding Progenitor ». 

Les  ETP  font  parties  de  la  population  CD34+CD1a‐.  A  l’apparition  du  CD1a 

(CD34+CD1a+) les cellules sont déjà engagées dans le lignage T. En effet, elles sont incapables 

de se différencier en une autre  lignée que  les T (Galy, Verma et al. 1993; Spits, Blom et al. 

1998; Dalloul, Patry et al. 1999; Res and Spits 1999). Cet ETP exprime  le marqueur CD34, 

mais ne présente pas de CD3, de CD4 ou de CD8. Il est dit TN (triple négatif). Au sein de ce 

stade  TN,  on  distingue  3  populations  identifiées  en  fonction  de  leur  expression  des 

marqueurs CD5 et CD1a chez l’homme (Figure 8). Au niveau du stade TN1 (CD34+CD1a‐CD5‐), 

la cellule est encore multipotente et a encore la capacité de se différencier en lymphocyte B, 

NK  ou  en  cellules  dendritiques.  Lors  de  l’acquisition  du  phénotype  TN2  (CD5+CD1a‐),  les 

cellules  initient  le  réarrangement  du  locus  δ  et  γ  des  gènes  du  TCR.  De  plus,  elles 

restreignent  leurs  potentiels  aux  seules  lignées  T  et  NK.  La  phase  TN3,  évaluée  par 

l’expression à  la membrane du CD1a, est spécifique de  la  lignée T, et marque  le début du 

27

réarrangement des gènes de  la chaîne β du TCR. Le réarrangement fonctionnel du TCRβ va 

permettre  l’expression  à  la membrane  du  pré‐TCR  composé  d’un  complexe  associant  la 

chaîne β et une chaîne pré‐T  (substitut de  la chaîne α),  le tout complexé aux chaînes CD3. 

Cette étape est un premier niveau de sélection appelé  la sélection β et est essentielle à  la 

maturation des thymocytes DN (Godfrey, Kennedy et al. 1993). De plus, le signal délivré par 

ce pré‐TCR permet la prolifération et la survie des DN (von Boehmer and Fehling 1997). Lors 

de l’étape suivante, les thymocytes deviennent des ISP (immature single positive), expriment 

le CD4 mais peu de CD3 (Hori, Cupp et al. 1991). Cette population peut être divisée en deux 

sous  populations :  une  CD4+CD1a+  (CD4  ISPlo)  et  une  CD4hiCD1a+  (CD4  ISPhi).  Elles 

commencent également à réarranger  les gènes α du TCR. Par  la suite ces cellules évoluent 

en DP (double positive) caractérisés par la co‐expression des molécules CD4 et CD8 puis par 

l’expression progressive du CD3 (Hori, Cupp et al. 1991; Galy, Verma et al. 1993). Enfin,  les 

dernières étapes de maturation aboutissent à  la sortie en périphérie de cellules matures et 

fonctionnelles simples positives CD4+CD3+ ou CD8+CD3+ (Figure 8). 

Jusqu’à  récemment,  l’étude  de  la  différenciation  T  in  vitro,  s’effectuait  par  des 

systèmes  délicats  de  FTOC  (feral  thymus  organ  culture). Ce  système  efficace mais  délicat 

soutient  la différenciation des précurseurs humains  jusqu’au stade DP mais ne permet pas 

de détailler  les stades  intermédiaires. Depuis quelques années, sont apparus des systèmes 

basés sur l’expression de ligand de Notch à la surface de cellules stromales médullaires (S17, 

MS‐5  ou  OP‐9)  (Schmitt  and  Zuniga‐Pflucker  2002;  De  Smedt,  Hoebeke  et  al.  2004). 

L’utilisation de ces stromas a considérablement amélioré les connaissances sur les étapes de 

la différenciation T humaine, en particulier grâce aux travaux de l’équipe de Zuniga‐Pflucker 

(Schmitt and Zuniga‐Pflucker 2002). 

 

Figure 8 :   Etapes de différenciation thymocytaire chez l’homme. 

28

iii. Le réarrangement du TCR 

a. Structure 

Le récepteur TCR est un hétérodimère constitué soit par l’association d’une chaîne α 

et d’une chaîne β (TCRαβ soit 85% des lymphocytes T circulants), soit par l’association d’une 

chaîne  δ  et  d’une  chaîne  γ  (TCRγδ).  Leur  structure  ressemble  étonnement  à  celle  des 

immunoglobulines,  les  TCR  sont  d’ailleurs  considérés  comme  de  la  superfamille  des  Ig. 

Quelques soient  les chaînes qui  le composent,  le TCR est toujours composé de 2 fragments 

unis par des ponts di‐sulfures. 

Chaque  chaîne  est  constituée  de  deux  domaines :  le  premier  situé  en N‐terminal, 

contient  le  site  de  reconnaissance  de  l’antigène  et  est  extrêmement  variable.  Il  est  aussi 

appelé segment variable. Le second domaine est lui, situé en C‐terminal et est relativement 

constant. Ce domaine se prolonge par une courte séquence hydrophobe qui assure l’ancrage 

à  la membrane, et par une petite queue  intra‐cytoplasmique. Le TCR ne possédant pas de 

séquence  de  signalisation  intra‐cytoplasmique  de  type  ITAM  (immuno‐receptor  Tyrosin 

based Activation Motive), il doit être associé au complexe multi‐moléculaire CD3 qui en est 

pourvu et pourra relayer le signal (Figure 9). 

 

 

Figure 9 :   Structure du récepteur des cellules T (TCR) 

 

29

b. Organisation et réarrangement des gènes du TCR 

Les  gènes des TCR  situés  sur différents  chromosomes :  les  locus  β et  γ  sont  situés 

respectivement aux positions 7q35 et 7p14. Le gène  δ est encastré au sein du  locus de  la 

chaîne α au niveau 14q11.q12. Chaque gène fonctionnel possède une partie variable et une 

partie  constante.  De  manière  similaire  aux  gènes  des  Ig,  la  partie  variable  est  en  fait 

constituée  de  l’assemblage  de  segments  génétiques :  V,  D  (uniquement  dans  le  cas  des 

chaînes  β  et  δ)  et  J  (jonction).  Le  réarrangement  des  gènes  des  TCR  se  produit  dans  le 

thymus  de manière  fortement  comparable  au mécanisme  responsable  du  réarrangement 

des Ig. Il existe une chronologie : les loci des chaînes γ et δ sont les premiers à se réarranger. 

En  général,  la  recombinaison  du  locus  δ  début  par  les  segments  DJ  puis  V‐DJ.  Si  les 

réarrangements des  gènes  δ et  γ peuvent engendrer un TCRγδ  fonctionnel,  le précurseur 

peut  alors  s’engager  vers  la  lignée  γδ.  De  même,  si  le  gène  du  TCRβ  démarre  son 

réarrangement de manière efficace,  la chaîne  β est synthétisée et peut alors s’associer au 

substitut  invariant  de  la  chaîne  α,  pré‐Tα.  Cette  association  va  entrainer  un  arret  du 

réarrangement  du  second  locus  de  la  chaîne  β  et  initier  le  réarrangement  du  gène  de  la 

chaîne α. Il en résulte  l’excision du gène δ et donc  l’impossibilité pour  la cellule d’exprimer 

un TCRγδ (Figure 10). 

 

 

Figure 10 :   Exemple de réarrangement des locus du TCR des chaînes α et β. 

30

iv. Rôle des cytokines et facteurs de transcription   

c.  L’IL­7 

L’IL‐7  joue  un  rôle  important  dans  le  développement  des  cellules  T.  En  effet, 

l’importance de l’IL‐7 au cours de la thymopoïèse a notamment été montrée chez des souris 

par  des  expériences  de  « silencing »  du  récepteur  de  l’IL‐7.  Le  phénotype  associé  à  cette 

déficience  se  traduit  par  une  réduction  de  la  cellularité  thymique  de  0.01%  à  10%  par 

rapport à la normale accompagnée d’un déficit des populations lymphoïdes T CD4+ et CD8+ 

avec un arrêt de la différenciation au stade précoce CD34+ (Peschon, Morrissey et al. 1994).  

Le récepteur de l’IL‐7 (IL7‐R) est constitué de 2 chaînes : l’IL‐7Rα (CD127) et la chaîne 

γ (CD132), commune aux récepteurs de l’IL‐2, IL‐4, IL‐9, IL‐15 et IL‐21. L’IL‐7Rα est exprimé 

sur les cellules hématopoïétiques et plus particulièrement les cellules de la lignée lymphoïde. 

La forme mature de  l’IL‐7Rα est une glycoprotéine membranaire de 49,5 kDa possédant un 

domaine  transmembranaire  de  25  acides  aminés.  La  partie  cytoplasmique  contient  de 

nombreuses régions : la région A riche en résidus acides, la région S riche en résidus sérine, 

la  région T qui  contient  trois  résidus  tyrosine  conservés  chez  l’Homme et  la  souris, et    le 

domaine Box1 qui est retrouvé dans tous les récepteurs cytokiniques de type 1. Ces régions 

servent de sites d’ancrage à des kinases telles que Jak1 et Jak3 (Janus kinase) ainsi qu’à des 

protéines adaptatrices, notamment STAT5a et STAT5b  (Jiang, Li et al. 2005). La  fixation de 

l’IL‐7  sur  la  chaîne  α  de  son  récepteur  permet  le  recrutement  de  la  chaîne  γc  et 

l’hétérodimérisation  des  deux  chaînes.  Durant  ce  rapprochement,  les  chaînes  α  et  γc 

apportent  les kinases  liées à  leur domaine  intracellulaire, respectivement  Jak1 et Jak3. Ces 

kinases  s’auto et  se  transphosphorylent afin d’augmenter  l’activation du  récepteur et  leur 

efficacité enzymatique. De plus  les protéines Jak phosphorylent    la tyrosine Y449,  localisée 

dans la région T de la chaîne α, afin de permettre le recrutement de Stat5, par son domaine 

SH2, et d’autres protéines adaptatrices. Les protéines Stat5  transloquent dans  le noyau et 

induisent l’expression de gènes cibles impliqués dans la survie cellulaire tels que Bcl‐2 (Jiang, 

Li et al. 2005).  

 

31

D’autres protéines sont également activées par cette voie de signalisation telles que 

les kinases de  la  famille Src et  la PI3K. Les PI3K constituent une  famille  très conservée qui 

joue  un  rôle  central  dans  la  survie  et  la  croissance  de  nombreux  types  cellulaires  (Datta, 

Brunet et al. 1999). Elle est ainsi recrutée par  la tyrosine Y449 phosphorylée et activée par 

phosphorylation de sa sous unité p85. La PI3K va pouvoir activer des protéines cibles comme 

AKT ou PKB. AKT est une kinase dont la phosphorylation inhibe la protéine pro‐apoptotique 

Bad  (Khaled,  Li  et  al.  2002;  Li,  Jiang  et  al.  2004)  et  active  la protéine mTOR  (mammalian 

target  of  rapamycin).  Cette  dernière  est  impliquée  dans  le  contrôle  de  la  traduction  de 

certains ARNm  comme  la  cyclin D1, NFAT  ou  encore NFκB. AKT  est  aussi  responsable  de 

l’inactivation  par  phosphorylation  du  facteur  de  transcription  Foxo3a,  facteur  de 

transcription de la protéine pro‐apoptotique Bim (Jiang, Li et al. 2005). L’absence de signaux 

de croissance comme  l’IL‐7 ou  l’IL‐3,  les  lymphocytes arrêtent  leur cycle cellulaire en phase 

Go/G1  (Komschlies, Gregorio et al. 1994; Khaled, Bulavin et al. 2005; Kittipatarin,  Li et al. 

2006). Afin de sortir de cette phase, les cellules doivent, activer des cyclines spécifiques de la 

phase  G1  qui  sont  nécessaire  ou  retour  en  cycle,  ou  réguler  négativement  l’expression 

d’inhibiteurs  comme  p27kip1.  La  Pi3K  à  travers  l’activation  d’AKT  permet  d’augmenter  la 

sensibilité des protéines c‐myc et cyclin D du cycle cellulaire à travers l’inactivation de GSK3β 

(Vivanco and Sawyers 2002). 

La  famille des Src kinases  (SFKs) comprends neuf membres :  src, Lck, Hck, Fyn, Blk, 

Lyn, Fgr, Yes et Yrk. Ces kinases, une fois activées, vont enclencher la voie des MAPK. Lck et 

Fyn sont  les SFKs qui sont  le plus abondamment exprimées dans  les  thymocytes  (Mustelin 

1994; Wange and Samelson 1996).  Les modèles murins déficients pour  Lck présentent un 

blocage de la différenciation T au stade DN (Molina, Kishihara et al. 1992). Ainsi l’ensemble 

de    la  voie  de  signalisation  induite  par  l’IL‐7  induit  la  survie  et  la  prolifération  cellulaire 

(Figure 11).  

Des études effectuées à l’aide de récepteurs chimériques ont mis en évidence que les 

chaînes γc et alpha, du  récepteur à l’IL‐7 étaient nécessaires à la transduction du signal. De 

plus  la perte de  l’une des deux chaînes  induit un phénotype  identique caractérisé par une 

diminution du nombre de  lymphocytes T et un développement  lymphocytaire altéré. Chez 

l’Homme, un défaut  génétique dans  les  gènes  codant pour  la  γc  (Noguchi, Yi et  al. 1993; 

Russell, Keegan et al. 1993),  l’IL‐7Rα  (Puel, Ziegler et al. 1998; Giliani, Mori et al. 2005) ou 

32

Jak3 (Macchi, Villa et al. 1995; Russell, Tayebi et al. 1995) est responsable de la majorité des 

syndrômes  SCID  (Severe  Combined  Immune  Deficiencies)  qui  sont  caractérisées  par  un 

nombre très réduit de  lymphocytes T. La forme  la plus fréquente de SCID est causée par  la 

mutation dans le gène codant pour la γc (Fischer, Le Deist et al. 2005). Chez ces patients, les 

cellules  T  et  NK  sont  absentes,  alors  que  le  développement  B  est  normal.  Les  patients 

déficients en IL7‐Rα ont également un nombre très réduit de cellules T alors que la quantité 

de  cellules B est normale  (Noguchi, Yi et al. 1993; Russell, Keegan et al. 1993; Fischer,  Le 

Deist et al. 2005). Contrairement aux patients déficients en γc, les patients déficients en IL7‐

Rα ont une fréquence normale de cellules NK à la périphérie (Puel, Ziegler et al. 1998; Giliani, 

Mori et al. 2005). 

 Les  signaux  transmis par  l’IL‐7  sont  cruciaux dans  le développement des  cellules T 

humaines.  En  effet  l’inhibition  de  ces  signaux  par  l’intermédiaire  d’anticorps  anti‐IL‐7  ou 

anti‐IL‐7R  empêche  l’expansion  et  la  différenciation  des  cellules  T  dans  les  FTOC  (Fœtal 

thymic organ culture) (Plum, De Smedt et al. 1996; Pallard, Stegmann et al. 1999) ainsi que la 

différenciation  de  précurseurs  CD34+  qui  se  trouve  presque  entièrement  bloquée  à  la 

transition CD34+CD1a+/CD4 ISP (Plum, De Smedt et al. 1996). L’équipe de N. Taylor a de plus 

montré une importance de la dose et de la durée du signal IL‐7. En effet, une concentration 

de 0.1ng/mL d’IL‐7 augmente  la viabilité des RTE  (Recent Thymic Emigrants), alors qu’une 

dose  supérieure  à  1ng/mL  permet  leur  prolifération.  De  plus  un  signal  d’une  heure 

seulement d’IL‐7 à 10ng/mL permet leur survie à long terme. Le signal continu est cependant 

nécessaire à l’entrée en cycle (Swainson, Kinet et al. 2007). Enfin, une étude menée chez le 

macaque par N.  Israel et R. Cheynier   a montré que chez  les singes  infectés par  le SIV, un 

traitement  par  l’IL‐7  permettait  sans  modification  de  la  charge  virale,  d’augmenter  le 

nombre de cellules TCD4+ et T CD8+ mémoires circulantes. Ce traitement permet également 

une  augmentation  du  nombre  de  cellules  T  naïves  par  prolifération  périphérique  ainsi 

qu’une augmentation de la production thymique (Beq, Nugeyre et al. 2006). 

 

 

 

33

 

 

Figure 11.  Schéma des grandes voies de signalisation de l’IL‐7 

   

34

d. Notch 

Un autre  facteur  indispensable à  l’engagement dans  la voie de différenciation T est  la 

voie  de  signalisation  Notch.  Les  récepteur  Notch  contrôlent  la  différenciation  et  la 

prolifération  des  cellules  en  réponse  à  la  liaison  avec  leur  ligand  présent  sur  les  cellules 

voisines (Artavanis‐Tsakonas, Rand et al. 1999). L’interaction des récepteurs Notch (Notch1, 

2, 3, 4) avec leurs ligands (DL1, 2, 4 et Jagged‐1,‐2)  provoque le clivage protéolytique de la 

partie  cytoplasmique  du  récepteur : Notch‐ic  (NIC).  Celle‐ci migre  ensuite  jusque  dans  le 

noyau et interagit  avec des facteurs de transcription : CBF‐1 (C promoter binding factor‐1) et 

RBP‐J  (Recombination  signal‐binding  protein),  induisant  ainsi  la  transcription  des  gènes 

cibles.  En  absence  de NIC,  RBP‐J  réprime  la  transcription  en  interagissant  avec  différents 

corépresseurs. Quand NIC  se  lie à RBP‐J,  le  co‐activateur MAML‐1  (Mastermind‐like‐1) est 

recruté. Il se  lie à NIC créant  le complexe NIC‐CSL‐ADN, transformant ainsi  le complexe CSL 

(CBF‐1/suppressor of Hairless/Lag1) en un activateur transcriptionel (Figure 12).  

Ainsi,  il a été montré que  la délétion conditionnelle de Notch1 entraîne un profond 

changement dans le développement lymphoïde. En effet, dans le thymus, le développement 

T est  inhibé au profit d’un développement B  (Radtke, Wilson et al. 1999). Des modèles de 

différenciation  T  ont  été  développés  à  partir  de  ces  informations.  Jaleco  et  al.  ont  ainsi 

montré  que  la  co‐culture  de  cellules  CD34+  de  sang  de  cordon  humain  avec  la  lignée 

cellulaire murine S17 exprimant le ligand de Notch DL1 permettait la génération de cellules 

CD7+ avec un fort potentiel NK, inhibant ainsi la différenciation B (Jaleco, Neves et al. 2001). 

De même,  l’équipe de  Zuniga‐Pflucker et  ses  collaborateurs  (La Motte‐Mohs, Herer et  al. 

2005) ont obtenus après culture de cellules CD34+ de moelle ou de sang de cordon sur  la 

lignée  stromale OP9‐DL1  (lignée exprimant  le  ligand DL1), une différenciation   T complète 

(De  Smedt,  Hoebeke  et  al.  2004;  La Motte‐Mohs,  Herer  et  al.  2005).  La  présence  d’un 

environnement  capable  d’induire  la  signalisation  Notch  est  donc  indispensable  à 

l’engagement  vers  la  voie de différenciation T. Mais  cette nécessité ne  se  limite pas qu’à 

l’engagement  des  cellules  hématopoïétiques  les  plus  précoces  vers  la  voie  T  puisque  les 

cellules pénétrant dans le thymus ont encore la capacité de s’engager dans d’autres voies de 

différenciation telles que la voie B et la voie NK, en l’absence du signal Notch (Garcia‐Peydro, 

de  Yebenes  et  al.  2006).  La  signalisation  induite  par  Notch  est  également  nécessaire  au 

maintien de  l’expression du potentiel T au cours des  stades précoces de  la différenciation 

35

thymique. De plus, de nombreuses études indiquent que la voie Notch est impliquée dans la 

régulation  des  réarrangements  du  TCRβ,  de  la  dichotomie  αβ/γδ  et  CD4/CD8  (De  Smedt, 

Reynvoet et al. 2002; Garcia‐Peydro, de Yebenes et al. 2003).   

 

 

 

 

Figure 12.  Voie de signalisation de Notch 

   

36

v. Le développement des NK 

 

Il  semblerait  que  la  moelle  osseuse  soit  le  site  principal  de  développement  des 

cellules NK  (Galy,  Travis  et  al.  1995).  Cependant,  les  cellules  NK  semblent  pouvoir  se 

développer dans de nombreux sites, en effet des précurseurs NK (NKP) ont été trouvés dans 

le  foie  (Jaleco,  Blom  et  al.  1997),  le  thymus  (Sanchez,  Spits  et  al.  1993),  les  ganglions 

lymphatiques et la rate (Gunther, Holloway et al. 2005).   

 

a. Développement des cellules NK chez l’adulte 

Le  développement  phénotypique  et  fonctionnel  complet  des  cellules  NK  a 

majoritairement  lieu dans  la moelle osseuse. Dans  la moelle osseuse,  les  cellules NK  sont 

issues des précurseurs CLP.  Les précurseurs  restreints aux  cellules NK ont par  la  suite été 

identifiés  dans  la moelle  osseuse  de  souris  adulte  (Rosmaraki,  Douagi  et  al.  2001).  Ces 

précurseurs, appelées pro‐NK ou NKP (NK cell progenitor), se distinguent par l’expression de 

la chaîne β commune aux récepteurs de l’IL‐2 et de l’IL‐15 (CD122) et ont comme phénotype 

Lin‐ CD122+ NK1.1‐ DX5‐ (intégrine α2). Ces cellules, également observées dans le thymus, la 

rate et  les ganglions  lymphatiques de souris adultes se différencient en cellules NK  in vitro 

sur des cellules  stromales OP9 et dans des  systèmes de culture de  type FTOC  (Rosmaraki, 

Douagi et al. 2001). L’acquisition de CD122 permet aux cellules NKP de répondre à  l’IL‐15, 

une  cytokine  sécrétée par  les  cellules  stromales de  la moelle osseuse et  indispensable au 

développement des cellules NK. Les cellules NKP vont ensuite acquérir de façon séquentielle 

les différents récepteurs présents sur les cellules matures et fonctionnelles.  

Au  cours  de  leur  développement,  les  cellules  NK  vont  subir  un  phénomène 

d’éducation  qui  les  rend  tolérantes  au  soi  et  qui  leur  permet  de  reconnaître  des 

modifications quantitatives de l’expression des molécules du CMH de classe I sur des cellules 

cibles.  Sur  le  plan  phénotypique,  les  cellules  NK  matures  sont  CD3‐  CD122+  (chaîne  β 

commune aux récepteurs de l’IL‐2 et IL‐15) et NK1.1+ CD161+ CD56hi CD16‐ (Ryan, Turck et al. 

1992; Carlyle, Martin et al. 1999; Kung, Su et al. 1999) (Figure 13).  

 

37

 

Figure 13.  Modèle de développement des cellules NK (adapaté de (Blom and Spits 2006)) 

 

b. Les cytokines et facteurs de transcription impliqués dans le développement NK  

Parmis  les  signaux  délivrés  par  l’environnement  de  la moelle  osseuse,  un  certain 

nombre de cytokines ont été identifiées comme supportant le développement des CD34+ en 

cellules  NK  in  vitro,  notamment :  le  SCF,  le  FLT3‐L,  l’IL‐7,  l’IL‐2  et  l’IL‐15.  Une  étude  a 

notamment  montré  que  des  cultures  de  CSH  humaines  avec  du  FLT3‐L  permettent 

d’engendrer des cellules NK qui expriment du CD122 et qui répondent à l’IL‐15 (Yu, Fehniger 

et al. 1998).  

L’IL‐15 est considéré comme un facteur critique du développement NK, en effet,  il a 

été montré que le nombre de NK est fortement diminué chez les souris déficientes en IL‐15 

ou mutées dans une des chaînes du récepteur : IL‐15α,β ou γc (Lodolce, Boone et al. 1998; 

Kennedy, Glaccum et al. 2000). Les patients ayant un syndrome SCID dont  la cause est une 

déficience de  la  chaîne  γc, présentent une absence de  cellules NK  (Fischer,  Le Deist et al. 

2005).  

Des  facteurs  de  transcription  sont  également  impliqués  dans  l’engagement  des 

cellules CLP, ELP et NKP vers la lignée NK. L’engagement du récepteur Notch‐1 par son ligand 

DL‐1 entraîne  les cellules CD34+ de sang de cordon dans  la voie T/NK  (Jaleco, Neves et al. 

2001;  Benne,  Lelievre  et  al.  2009), mais  l’inhibition  de  la  signalisation  de Notch  dans  un 

38

système FTOC qui permet le développement T et NK entraine l’inhibition du développement 

T  et  stimule  le  développement  des  cellules  NK  (De  Smedt,  Hoebeke  et  al.  2005).  La 

signalisation Notch est peut‐être nécessaire dans  les premières étapes du développement 

des cellules souches hématopoïétiques en cellules NK, mais n’est peut‐être pas nécessaire à 

des stades plus tardifs. 

 

B. VIH et Thymopoïèse 

L’évidence de l’infection du thymus par le VIH est montrée par un certain nombre de 

changements morphologiques qui ont étés décrits dans des  thymus d’adultes  (Davis 1984; 

Seemayer, Laroche et al. 1984; Grody, Fligiel et al. 1985; Savino, Dardenne et al. 1986; Linder 

1987; Schuurman, Krone et al. 1989) ou d’enfants  (Joshi and Oleske 1985; Prevot, Audouin 

et al. 1992; Burke, Anderson et al. 1995) infectés. En effet ceux‐ci peuvent être résumés par 

une  déplétion  des  thymocytes,  une  involution  thymique,  une  perte  de  la  démarcation 

cortico‐médulaire  ou  une  perte  de  l’épithélium  thymique.  En  effet  puisque  le  CD4  est 

présent sur plus de 90% des thymocytes et des macrophages intra‐thymiques, cet organe est 

une  cible  privilégiée  pour  l’infection  virale.  Il  a  d’ailleurs  été montré  que  les  thymocytes 

étaient inféctés in vitro (De Rossi, Calabro et al. 1990; Tremblay, Numazaki et al. 1990; Hays, 

Uittenbogaart et al. 1992).  Des études sur les macaques infectés par le SIV ont montré une 

réplication virale dans  les  thymocytes et dans  les macrophages  thymiques, ceci seulement 

deux  semaines  après  l’inoculation.  De  plus  huit  semaines  après  inoculation,  des  signes 

d’involution  thymique  sont  observés  chez  ces  singes  (Baskin, Murphey‐Corb  et  al.  1991). 

D’autre  part  des  études  menées  par  J.  McCune  afin  de  déterminer  les  stades  de  la 

différenciation  T  susceptibles  à  l’infection  par  le  VIH  ont  montrées  que  le  CXCR4  était 

exprimé  faiblement  dans  les  précurseurs  hématopoïétiques  et  fortement  dans  les 

précurseurs  T  immatures  (CD4+CD3‐CD8‐)  dans  le  thymus.  Cette  expression  serai  ensuite 

fortement  diminuée  durant  la  différenciation  T  puis  ré‐exprimé  lors  de  la  sortie  en 

périphérie.  Quand  au  CCR5,  il  est  indétectable  dans  la  plupart  des  précurseurs 

hématopoïétiques  et  thymiques.  Son  expression  est  cependant  augmentée  lors  de  la  co‐

expression  du  CD4  et  du  CD8.  Tout  ceci  laissant  supposer  que  la  différenciation  T  est 

particulièrement susceptible aux souches X4‐tropiques  (Berkowitz, Beckerman et al. 1998). 

39

Des  résultats  similaires  ont  étés  publiés  par  l’équipe  de  F.  Barré‐Sinoussi  et N.  Israël  en 

montrant  que  l’environnement  thymique,  c'est‐à‐dire  la  production  d’IL‐7  par  les  cellules 

épithéliales  thymiques,  favorisait  la  réplication  des  souches  X4‐tropiques  en  augmentant 

l’expression  de  CXCR4  sur  les  thymocytes  CD4+CD8‐CD3+  (Schmitt,  Chene  et  al.  2003). 

L’équipe de S. Fauci a montré une  infection des  cellules DP  (CD4+CD8+) et des  cellules SP 

(CD4+ ou CD8+). Dans  la même étude  ils ont également montré que  les cellules épithéliales 

thymiques,  qui  constituent  le microenvironnement  thymique,  contiennent  également  des 

copies  de  l’ARN  viral  dans  leur  cytoplasme.  Cependant  l’infection  productive  n’a  pas  été 

trouvée.  Ils  observent  par  ailleurs  une  dégénérescence  de  ce microenvironnement  sans 

forcément trouver de virus à l’intérieur des cellules (Stanley, McCune et al. 1993). L’infection 

d’une cellule n’implique donc pas que l’infection sera productive. En effet, les travaux de N. 

Israël    et  de  F.  Barré‐Sinoussi  ont  montrés  que  le  TNF  et  l’IL‐7  étaient  des  facteurs 

indispensables à  la  réplication virale. Elles ont montrées que  l’interaction avec  les cellules 

épithéliales  thymiques  induisait un  fort  taux de  réplication virale   des souches T‐tropiques 

primaires  exclusivement  dans  les  thymocytes  matures  CD4+CD8‐CD3+.  Le  TNF  et  l’IL‐7 

sécrétés au cours de cette interaction ont un rôle critique pour la réplication virale à travers 

l’activation de NFκB. En effet,  le TNF est un  inducteur majeur de NFκB et  l’IL‐7 permet un 

maintien de l’expression du récepteur au TNF. Les cellules CD4+CD8‐CD3‐ sont incapables de 

répliquer  le  virus,  ceci  étant  associé  à  un  défaut  de  production  de  TNF  durant  leur 

interaction  avec  les  cellules  épithéliales  thymiques  et  corrèle  avec  l’absence  d’activité 

nucléaire de NFκB. L’autre population majeure exprimant le récepteur CD4 est la population 

des  DP  (CD4+CD8+CD3‐).  Malgré  une  entrée  du  virus,  aucune  production  virale  n’est 

détectée  dans  ces  cellules.  Ceci  est  probablement  du  au  fait  qu’elles  ne  peuvent  pas 

répondre aux signaux TNF ou IL‐7. Ces travaux concluent donc qu’in vivo malgré une entrée 

efficace  du  virus  dans  les  populations  CD4+,  une  charge  virale  importante  n’est  générée 

quand dans les thymocytes CD4+CD8‐CD3+ (Chene, Nugeyre et al. 1999). 

 

La lymphopénie observée dans les TCD4+ peut être lié à une interférence du VIH avec 

le renouvellement T que ce soit au niveau des progéniteurs ou de la différenciation dans le 

thymus.  

Ainsi  le  remplacement  des  cellules  T matures  n’est  plus  assuré.  En  effet  de  nombreuses 

études  ont  étés menées  sur  la  susceptibilité  des  CD34+  à  l’infection  par  le  VIH  ou  tout 

40

simplement de l’effet de l’infection sur les capacités hématopoïétiques des cellules souches. 

Il a été montrés que  la mobilisation des  cellules CD34+ de patients VIH par  le G‐CSF était 

réduite par rapport à des individus sains (Schooley, Mladenovic et al. 2000). De plus, il a été 

montré que  les précurseurs CD34+ des  individus progressant dans  la maladie SIDA ont une 

perte de la capacité de développement des cellules T (Clark, Repping et al. 2000).  Plusieurs 

études ont par ailleurs montrées que  le VIH bloquait  l’hématopoïèse avec une diminution 

drastique  du  nombre  thymocytes  générés  due  à  une  perte  des  précurseurs 

hématopoïétiques  que  ce  soit  par modification  de  l’environnement  thymique  ou  par  le 

déclenchement de l’interaction gp120 avec le récepteur CD4 présent en faible quantité dans 

certaines sous‐populations CD34+ (Zauli, Vitale et al. 1994; Jenkins, Hanley et al. 1998). Ces 

études s’accordent sur le fait qu’elles ne trouvent pas ou peu de génome viral dans les CD34+ 

(Marandin,  Katz  et  al.  1996;  Jenkins,  Hanley  et  al.  1998).  Ces  précurseurs  seraient  donc 

bloqués  ou  déplétés  en  absence  d’infection  directe.  L’hypothèse  selon  laquelle  les CD34+ 

seraient susceptibles à  l’infection par  le VIH est soutenue par  le  fait qu’elles expriment  les 

corécepteurs CXCR4 et CCR5 (Deichmann, Kronenwett et al. 1997; Ruiz, Cicala et al. 1998). 

Les précurseurs seraient d’ailleurs plus susceptibles aux souches X4‐tropiques car CXCR4 est 

présent  sur  les  CD34+  à  84%  pour  uniquement  24%  dans  le  cas  de  CCR5  (Deichmann, 

Kronenwett  et  al.  1997). Des  études  ont montrés  qu’un  faible  pourcentage  (1  à  2%)  des 

cellules souches CD34+ étaient également p24+ 48 heures après incubation avec les souches 

virales  (Knutsen, Roodman et al. 1999). La présence d’ADN proviral a été étudié dans une 

autre étude menée sur 10 patients VIH et a montré que deux des patients étaient positifs 

pour les gènes gag et pol du VIH‐1 cependant le nombre de copies d’ADN proviral dans ces 

échantillons ne dépassait pas 2 à 5 copies pour 250 000 cellules (Neal, Holland et al. 1995). 

Les auteurs ont conclus que  le compartiment CD34+ n’était pas  infecté dans  la majorité de 

patients VIH‐1. En effet,  l’impact physiologique d’une  infection si  faible est‐elle réellement 

visible sur  la globalité de  la pathologie SIDA? Quoi qu’il en soit,  l’infection par  le VIH peut 

empêcher la maturation des CD34+ par un certain nombre de mécanismes indépendamment 

de l’infection directe que nous avons cités ci‐dessus. 

La contribution de la production thymique au renouvellement T peut être évaluée grâce à la 

quantification des cellules T naïves venant d’émigrer du thymus par  la technique du TRECs 

(T‐cell receptor excision circles), qui sont formés au cours du réarrangement du TCR (T‐cell 

receptor) dans le thymus (Geenen, Poulin et al. 2003). Le nombre de TRECs permet d’évaluer 

41

ainsi  la  fonction  thymique  (Spits  2002).  La  variation  de  la  fréquence  des  sjTREC  seule  ne 

reflète pas de manière exacte  les perturbations de  la  fonction  thymique  chez  les patients 

infectés par  le VIH. En effet,  les changements dans  la  fréquence des sjTREC peut‐être une 

conséquence soit d’une réduction de  la production  thymique et d’une augmentation de  la 

prolifération  périphérique,  conséquence  d’une  activation  immune  généralisée  (Douek, 

McFarland et  al. 1998; Hazenberg, Otto et  al. 2000; Douek, Betts et  al. 2001; Hazenberg, 

Otto  et  al.  2003).  Cependant,  le  ratio  sj/βTREC  dépend  exclusivement  de  la  prolifération 

intra‐thymique des précurseurs T, et n’est pas affectées par les changements de la fréquence 

des  cellules  T  en  cycle  ou  sur  leur  survie  ou  leur mortalité  (Dion,  Bordi  et  al.  2007).  La 

quantité de TRECs dans le sang est réduite en seulement quelques mois après l’infection par 

le  VIH  (Douek, McFarland  et  al.  1998).  Cette mesure  donne  une  idée  sur  le  pronostique 

d’évolution de  la maladie, ainsi  les  individus avec un faible taux de TRECs progressent plus 

rapidement vers la pathologie SIDA (Hatzakis, Touloumi et al. 2000).  

Les  mécanismes  impliqués  dans  la  mort  des  cellules  T  induite  par  le  VIH  sont 

nombreux,  on  peut  citer en  premier  le  système  immunitaire  jouant  son  rôle :  les  cellules 

infectées  sont  tuées  par  les  lymphocytes  T  cytotoxiques  (LTC)  spécifiques  du  VIH  (Ho, 

Neumann  et  al.  1995;  McCune  2001).  Ensuite,  la  destruction  des  cellules  effectrices 

spécifiques du VIH après leur recrutement dans les tissus lymphoïdes, une expression altérée 

des  molécules  cellulaires  régulatrices  de  l’apoptose  par  les  lymphocytes  et  les  cellules 

présentatrices  de  l’antigène  (CPA)  (Xu,  Laffert  et  al.  1999).  Un  état  général  d’activation 

immunitaire est observé durant  la phase asymptomatique de  l’infection par  le VIH dans  les 

tissus  lymphoïdes et dans  le sang périphérique et persiste tout au  long du déroulement de 

l’infection.  Même  si  la  réplication  virale  est  grandement  diminuée  sous  l’influence  des 

réponses immunes spécifiques, le VIH n’est jamais complètement éliminé et sa persistance, 

associée avec une expression constante des antigènes viraux est sans doute responsable de 

l’activation chronique. De plus, des facteurs exogènes stimulent  la production de cytokines 

pro‐inflammatoires  comme  le  TNFα,  l’IL‐1β  ou  l’IL‐6  qui  entraine  l’activation  cellulaire  et 

donc  la  réplication  virale  (Blanchard,  Montagnier  et  al.  1997).  Ce  déséquilibre  dans 

l’activation  immune est sans doute une mécanisme  important  responsable de  la mort des 

cellules dans le SIDA. 

 

42

L’impact  de  l’infection  par  le  VIH  doit  également  être  dépendant  de  l’âge  car  le 

thymus  s’atrophie  avec  l’âge.  En  effet  la  production  thymique  a  été  montrée  comme 

décroissante  avec  l’âge :  les  capacités  prolifératives  d’une  souris  âgée  de  24  mois 

correspondent à approximativement 20% de son potentiel thymique à 3 mois. Et le nombre 

de  thymocytes produit correspond à 2% de ce qui est produit  très  tôt après  la naissance. 

Ainsi  l’infection  du  thymus  in  utero  ou  lors  de  la  petite  enfance  a  un  impact  sur  le 

déroulement de  la maladie SIDA  (McCune 1991). Les cas pédiatriques peuvent être classés 

en deux catégories de  types de progression :  la première qui correspond à 20 ou 30% des 

patients est un déroulement fulgurant de  la pathologie avec une mort après 2 ou 3 ans. La 

seconde se comparerait à  la vitesse de  la plupart des cas adultes, c'est‐à‐dire entre 5 à 10 

ans (Auger, Thomas et al. 1988). Ces enfants ont un phénotype immunologique similaire aux 

enfants  nés  avec  le  syndrome  de  Di  Georges,  c'est‐à‐dire  un  très  faible  nombre  de 

lymphocytes T CD4 ou T CD8 circulants.  

 

43

IV. ROLE DE NEF DANS LA PHYSIOPATOLOGIE 

A. Généralités 

Le gène Nef est très conservé et code pour la protéine Nef qui est un facteur critique 

du  développement  de  la  maladie  SIDA.  Nef  est  une  protéine  de  27Kda  produite  en 

abondance  rapidement après  infection par  le virus et qui  s’accroche à  la membrane de  la 

cellule par sa partie N‐terminal myristoylée (Fackler and Baur 2002; Das and Jameel 2005). In 

vivo, Nef est un facteur essentiel pour  l’efficacité de réplication virale et  le développement 

de  la  pathologie ;  In  vitro, Nef  facilite  également  la  réplication  virale  et  augmente  le 

potentiel infectieux des virions. Nef est déterminante dans la pathologie SIDA. En effet, une 

cohorte de patients infectés par une souche VIH deleté de Nef sont des  « non progresseurs 

à  long  terme » qui ne manifestent aucun  signe clinique du SIDA  (Dyer, Geczy et al. 1997). 

Ceci est un exemple du potentiel pathogène de Nef. 

Nef  agit  de manière  très  diverse  dans  la  cellule :  en  intervenant  au  niveau  de  la 

membrane  plasmique  où  il module  l’expression  de  nombreuses  protéines  associées  à  la 

membrane et dans  le cytoplasme. Ou suivant sa  localisation  intracellulaire,  il  interfère avec 

les signaux de transduction cellulaire.  

B. Nef et la physiopathologie SIDA 

1. Action  positive  de  Nef  sur  la  réplication  virale  et  les 

capacités d’infection des virions 

Nef est exprimée en abondance  juste après  l’infection, en même  temps que Tat et 

Rev. La quantité d’ARNm de Nef à ce moment est estimée à 75% des ARNm viraux produits 

(Guy, Kieny et al. 1987; Klotman, Kim et al. 1991).  Il a été montré que l’augmentation de la 

réplication virale et des capacités  infectieuses du virus sont associées à  l’expression de Nef 

dans  les  PBMC  (peripheral  blood mononuclear  cells)  in  vitro  (Jamieson,  Aldrovandi  et  al. 

1994; Spina, Kwoh et al. 1994). Les capacités de réplication des souches VIH‐1 Nef+ et Nef‐

délétées dans  les PBL (Primary Blood Lymphocytes) montrent que Nef facilite  la réplication 

virale en augmentant les capacités infectieuses des virions (Chowers, Spina et al. 1994). Ainsi 

les virus mutés au niveau de Nef sont 4 à 40 fois moins infectieux qu’une souche sauvage. 

44

2. Action de Nef sur l’expression des molécules de  surface 

i. Diminution de l’expression du CD4 

Le  CD4  est  une  glycoprotéine  de  55  kDa  localisée  à  la  surface  cellulaire.  Cette 

protéine  sert  de  co‐récepteur  au  TCR.  En  effet,  le  CD4  reconnaît  la  partie  constante  des 

molécules  du  CMH  II.  Le  TCR  lui,  reconnaît  les  parties  constantes  et  hypervariables, 

l'antigène étant fixé sur cette dernière. Le CD4 se situe à  la surface des cellules restreintes 

par  le CMH de classe  II comme  les cellules T helper, ou à  la surface des monocytes et des 

macrophages.  Elle  sert  aussi  de  récepteur  principal  à  l’entrée  du  VIH  et  du  SIV  dans  les 

cellules (Lama 2003).  

Nef a  la capacité de réduire de manière drastique  la quantité de récepteur CD4 à  la 

surface  cellulaire  (Aiken,  Konner  et  al.  1994;  Piguet,  Schwartz  et  al.  1999;  Greenway, 

Holloway  et  al.  2003).  La  diminution  de  l’expression  du  CD4  par  Nef  permet  ainsi  une 

meilleure propagation du  virus en prévenant  la  séquestration de  l’enveloppe  virale par  le 

récepteur CD4 lors de son bourgeonnement ou lors de l’entrée des particules virales (Lama 

2003). (Figure 14). 

Les protéines Env et Vpu du VIH‐1 diminuent également  l’expression du  récepteur 

CD4 à la surface de la cellule (Piguet, Schwartz et al. 1999). Cependant, contrairement à ces 

deux protéines qui agissent au niveau  intracellulaire, Nef agit au niveau des molécules de 

CD4 se trouvant déjà au niveau de la surface cellulaire. La diminution du CD4 induite par Nef 

passe par  l’internalisation de  la molécule de surface CD4 de manière clathrine dépendante 

suivi par sa dégradation via le système endosomal/lysosomal (Aiken, Konner et al. 1994). 

La protéine CD4 possède quatre acides aminés hydrophobes dont deux  leucines au 

niveau de sa queue cytoplasmique qui sont nécessaires pour son endocytose (Aiken, Konner 

et al. 1994; Salghetti, Mariani et al. 1995). Ce site est normalement masqué par l’accrochage 

de la p56Lck (protéine de la famille des Src kinase) qui prévient l’internalisation du CD4 par 

l’accrochage  aux  protéines  adaptatrices  (AP)  dans  le  complexe  de  clathrine.  Nef  semble 

contourner les voies normales de régulation de l’expression du CD4 en se liant par son motif 

dileucine à la queue cytoplasmique de CD4 (Mangasarian, Foti et al. 1997). Le motif dileucine 

permet également  le recrutement du complexe de clathrine via  les molécules adaptatrices 

AP‐2  (Greenberg,  Bronson  et  al.  1997).  Nef  agit  comme  un  pont  entre  le  CD4  et  les 

molécules adaptatrices en déplaçant p56Lck. 

45

ii. Diminution de l’expression du CD28 

La  présence  ou  l’absence  de  signaux  de  co‐stimulation  délivrés  par  des molécules 

accessoires comme  le CD28  (Arora, Fredericksen et al. 2002)  lors de  l’engagement du TCR 

entraîne une activation ou une anergie de la cellule. La liaison du TCR ou du CD28 seul induit 

des  niveaux  minimes  d’activation  qui  conduit  la  cellule  à  entrer  en  anergie  (Arora, 

Fredericksen et al. 2002). De même que pour  le CD4, Nef permet aussi  l’accélération de  la 

diminution de  l’expression du CD28 à  la surface cellulaire. Le CD28 est nécessaire pour une 

activation maximale des cellules T (Figure 14). Le bénéfice que retire  le virus à diminuer  la 

quantité  de  CD28  à  la  surface  des  cellules  peut  être  que,  au  cours  de  la  présentation 

antigénique,  les cellules T adhèrent avec  les cellules présentatrices de  l’antigène. En effet, 

l’interaction  entre  le  CD28  et  les molécules  B7  d’un  coté  et  le  TCR/CD4  et  le  CMH‐II  de 

l’autre sont connues pour permettre une interaction forte et stable (Grakoui, Bromley et al. 

1999; Hwang, Huang et al. 2000) et permettent le maintient du contact entre les CPA et les 

cellules  T.  La  régulation  négative  du CD28  et  du CD4  limite  probablement  l’adhésion  des 

cellules T exprimant Nef aux CPA et promeut le désengagement de la cellule T activée de la 

cellule présentatrice de  l’antigène. La cellule  infectée peut alors repartir dans  la circulation 

ou se fixer a d’autres CPA favorisant ainsi la dissémination virale.  

Une  autre  conséquence  possible  de  la  régulation  négative  du  CD4  et  du  CD28  est  la 

compromission de  la durée et de  la force du signal au sein de  la cellule T  infectée. D’autre 

part, Nef active certaines voies de signalisation qui influent sur l’activation T. Des études ont 

montrées que Nef  augmentait  l’activation des  cellules T  thymiques et périphériques dans 

des  souris  transgéniques.  De  plus  Nef  est  capable  de  diminuer  le  seuil  nécessaire  à  la 

stimulation antigène‐spécifique des clones T (Skowronski, Parks et al. 1993; Hanna, Kay et al. 

1998; Schrager and Marsh 1999). Ceci montre que Nef active des voies de signalisation qui 

pourraient remplacer les cascades de signalisation normales de l’activation T.  

En diminuant l’expression de surface du CD28 et du CD4 et en contournant les voies 

normales d’activation, Nef permet de déclencher  le processus d’activation nécessaire à  la 

réplication virale  tout en  restreignant  les  interactions cellules T/CPA, permettant ainsi une 

meilleure dissémination virale.  

 

46

iii. Diminution de l’expression du CMH de classe I 

 

La réponse  immune adaptative nécessite  la reconnaissance des cellules  infectées en 

amont de  leur élimination par  les  lymphocytes T cytotoxiques  (CTL). Cette  reconnaissance 

nécessite  une  présentation  des  peptides  viraux  à  la  surface  des  cellules  infectées  par  les 

molécules du  complexe majeur d’histocompatibilité de  type  I  (Pamer and Cresswell 1998; 

Rock and Goldberg 1999; Yewdell and Hill 2002). Afin de contrer cette stratégie de défense 

de l’organisme, un certain nombre de virus comme le virus de l’herpes, les retrovirus et les 

poxvirus  ont  développé  des  stratégies  qui  ciblent  l’assemblage  et  l’acheminement  des 

molécules de CMH‐I dans les cellules infectées (Yewdell and Hill 2002). Ceci permet d’altérer 

la présentation des peptides viraux et augmente les chances du virus d’échapper au système 

immunitaire (Pamer and Cresswell 1998). La protéine Nef est responsable de cette fonction 

(Figure 14). En effet,  rapidement après  l’infection, Nef diminue  l’expression des molécules 

de CMH‐I de surface. Nef permet ainsi de réduire la reconnaissance des cellules infectées par 

le VIH par  les  lymphocytes T cytotoxiques (Schwartz, Marechal et al. 1996; Collins, Chen et 

al. 1998). Nef diminue sélectivement l’expression du HLA‐A et HLA‐B connus pour présenter 

les antigènes aux CTL mais ne diminue pas l’expression du HLA‐C et E connus pour protéger 

les cellules de  la  lyse par  les cellules NK (Garcia and Foster 1996; Schwartz, Marechal et al. 

1996; Ploegh 1998; Cohen, Gandhi et al. 1999; Swigut, Iafrate et al. 2000).  La diminution du 

MHC‐I est clathrine indépendante et fait suite à la séquestration dans le trans‐Golgi (Piguet, 

Wan et al. 2000). En effet,  les molécules de  classe  I  sont des heterodimères  résultant de 

l’association  non  covalente  d’une  chaîne  lourde  α  et  d’une  chaîne  légère :  la  β2‐

microglobuline,  chargée d’un peptide de 8 à 11 acides aminés.  L’assemblage de  ces deux 

chaînes ainsi que  le chargement du peptide produit par  le protéasome, se déroule dans  le 

réticulum endoplasmique (RE). De nombreux virus  interviennent au niveau de  l’assemblage 

de ces deux chaînes dans  le RE. La protéine Nef n’affecte pas ce processus mais augmente 

l’internalisation  des  molécules  de  CMH‐I  de  surface  (Schwartz,  Marechal  et  al.  1996; 

Greenberg, Iafrate et al. 1998; Le Gall, Erdtmann et al. 1998).  Les molécules de CMH‐I sont 

ainsi  rapidement  internalisées  depuis  la  surface  cellulaire  dans  des  endosomes,  puis 

transportées  dans  le  trans‐golgi  où  elles  s’accumulent  (Bell,  Schaefer  et  al.  2001;  Swigut, 

Shohdy  et  al.  2001).    Ce  mécanisme  permet  donc  au  virus  d’échapper  au  système 

immunitaire en empêchant la lyse des cellules infectées par les lymphocytes T cytotoxiques. 

47

iv. Diminution de l’expression du CMH de classe II 

Les molécules HLA de classe II sont des dimères constitués d’une chaîne lourde α de 

35 kDa et d’une  chaîne  légère  β de 29 kDa.  Les molécules de CMH‐II  sont exprimées à  la 

surface  des  cellules  présentatrices  d’antigène  et  présentent  aux  lymphocytes  T  CD4+  des 

peptides antigéniques  (Hegde, Chevalier et al. 2003).  Il a été montré que  les macrophages 

accumulent  des  particules  virales  dans  les  compartiments  de  transport  des molécules  de 

CMH‐II (Raposo, Moore et al. 2002), certaines molécules peuvent ainsi être incorporées dans 

la membrane des virions  lors du bourgeonnement  (Tremblay, Fortin et al. 1998). Dans  les 

monocytes chroniquement  infectés,  la présentation des molécules de classe  II est entravée 

(Polyak,  Chen  et  al.  1997)  par Nef  qui  a  été  rapporté  comme  étant  capable  d’affecter  la 

localisation de surface des molécules de CMH‐II réduisant ainsi la présentation des peptides 

exogènes aux T CD4+  (Stumptner‐Cuvelette, Morchoisne et al. 2001; Schindler, Wurfl et al. 

2003;  Stumptner‐Cuvelette,  Jouve  et  al.  2003)  (Figure  14).  La  présentation  des  peptides 

antigéniques par le CMH‐II joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative dans 

laquelle  les peptides générés à partir des  sources exogènes  sont présentés aux cellules T‐

helper. La réponse T helper CD4+  joue un rôle central dans  le contrôle de  l’infection par  le 

VIH. Nef affecte donc  le développement d’une réponse efficace dirigée à  l’encontre du VIH 

et permet l’évasion du virus du système immunitaire. 

 

 

 

Figure 14.  Modulation de l’expression des protéines associées à la membrane par Nef au 

sein d’une cellule infectée. 

 

48

v. Induction de DC‐SIGN 

 

Nef permet également une meilleure dissémination virale en  induisant  l'expression 

de DC‐SIGN (Dendritic Cell‐Specific Intercellular adhesion molecule‐3‐Grabbing Non‐integrin) 

(Sol‐Foulon, Moris et al. 2002) à  la surface des cellules dendritiques  immatures,  favorisant 

ainsi  leur  interaction avec  les  lymphocytes T CD4 et  l’accrochage du virus. Celui‐ci peut en 

effet  se  lier  à DC‐SIGN  grâce  à  la  gp120. On  aura  alors  internalisation  du  virus  dans  des 

compartiments à  faibles pH dans  lesquels  le virus échappe à  la dégradation  lysosomale et 

reste  infectieux  jusqu’à  être  transmis  aux  cellules  T  (Jameson,  Baribaud  et  al.  2002).  (Cf. 

I.C.3. Les cellules cibles du VIH ; les cellules dendritiques) 

 

3. Action de Nef sur la thymopoïèse 

Au  cours de  l’infection par  le VIH,  la  capacité du  thymus à  reconstituer  le pool de 

cellules  T  naïves  est  fortement  diminuée.  Chez  les  patients  infectés,  sous  traitement 

antirétroviral, la quantité de cellules T CD4+ naïves provenant du thymus augmente (Douek, 

McFarland  et  al.  1998;  Dion,  Bordi  et  al.  2007).  Chez  les  enfants  séropositifs  le 

développement T est perturbé (Gaulton, Scobie et al. 1997). Cet effet est également observé 

chez les souris SCID‐humanisées (Su, Kaneshima et al. 1995; Jamieson and Zack 1998).  Dans 

ce modèle Nef a été caractérisé comme acteur nécessaire pour une réplication virale efficace 

et  une  déplétion  des  thymocytes  (Jamieson,  Aldrovandi  et  al.  1994;  Aldrovandi  and  Zack 

1996;  Aldrovandi, Gao  et  al.  1998). De  plus,  l’expression  de Nef  dans  les  thymocytes  de 

souris transgéniques (Tg) induit une diminution du nombre de thymocytes CD4+, du nombre 

de  cellules  T  ainsi  qu’une  altération  des  capacités  d’activation  de  ces  cellules  (Brady, 

Pennington  et  al.  1993;  Skowronski,  Parks  et  al.  1993;  Lindemann, Wilhelm  et  al.  1994). 

Enfin, l’expression de Nef dans les cellules normalement infectées par le VIH (cellules T CD4+, 

cellules dendritiques et macrophages et  les précurseurs  thymiques CD4+ CD8+, CD4+ CD8‐) 

entraîne chez des souris Tg des symptômes proches de la pathologie SIDA, à savoir : perte de 

poids, diarrhées, atrophie thymique, mort des cellules T CD4+. La gravité de la maladie étant 

corrélée au niveau d’expression du transgène (Hanna, Kay et al. 1998).  

49

D’autre part,  la diminution de  l’expression du CD4 et du CD8β a été observée après 

transduction  de  la  protéine  Nef  par  un  vecteur  rétroviral  dans  des  thymocytes  humains 

immatures.  Dans  cette même  expérience,  la  génération  de  thymocytes  doubles  positifs 

(CD4+ CD8+) est fortement diminuée en présence de Nef. La production thymique se  limite 

alors  à  une  faible  quantité  de  cellules  CD3+  CD4‐.  L’expression  de  Nef  par  transduction 

rétrovirale  dans  des  précurseurs  T    affecte  donc  la  génération  de  nouvelles  cellules  T 

(Verhasselt, Naessens et al. 1999; Stove, Naessens et al. 2003). 

C. Nef et mort cellulaire 

 

 L’apoptose est un processus physiologique qui a pour  finalité  la mort des  cellules. 

C’est un processus critique pour un développement normal et dans  le  fonctionnement des 

organismes multicellulaires. Des anomalies dans  le contrôle de  la mort cellulaire entrainent 

de nombreux  types de pathologies, comme  le cancer, des maladies auto‐immunes ou des 

désordres  dégénératifs.  La  signalisation  apoptotique  intervient  par  l’intermédiaire  de 

plusieurs  voies  qui  sont  initiées  par  le  déclenchement  d’évènements  intracellulaires  ou 

extracellulaire, par exemple lors de la fixation à un récepteur de mort. 

Les  virus  ont  développé  de  nombreux  mécanismes  afin  d’échapper  au  système 

immunitaire de  leur hôte. Une des stratégies développée par  le VIH consiste en  l’activation 

des  programmes  apoptotiques  qui  permettront  la  destruction  des  cellules  effectrices  du 

système immunitaire. Le génome du VIH code ainsi pour des protéines pro‐apoptotiques qui 

permettent la destruction des lymphocytes qu’ils soient infectés ou non à travers l’activation 

des  tumor‐necrosis  factor  (TNF)  ou  par  l’intermédiaire  de  la  voie mitochondriale.  Le  VIH 

engendre aussi un état d’activation chronique du système immunitaire qui sera responsable 

de l’exacerbation du mécanisme physiologique de  délétion clonale. 

   

50

1. Données moléculaires sur l’apoptose 

i. Données morphologiques 

Les cellules entrant en apoptose vont  tout d’abord  subir une condensation de  leur 

cytoplasme et une diminution du volume cellulaire. Certains organites vont également subir 

des  modifications  majeures,  particulièrement  la  mitochondrie  où  l’on  observe  une 

diminution  du  potentiel  membranaire  et  une  modification  de  l’intégrité  membranaire 

entraînant le relargage de molécules pro‐apoptotiques de l’espace intermembranaire dans le 

cytoplasme  (cytochrome  c…).  La  chromatine  se  condense,  l’ADN  est  dégradé  par  des 

endonucléases en fragments réguliers multiples de 180 paires de base (pb) ‐ caractéristiques 

de  coupures  entre  les  nucléosomes.  Les  cellules  perdre  alors  le  contact  avec  les  cellules 

voisines. 

Finalement,  la  membrane  plasmique  va  bourgeonner  ce  qui  va  conduire  à  la 

formation des corps apoptotiques rapidement éliminés par phagocytose évitant ainsi toute 

libération  du  contenu  cellulaire.  Au  cours  du  processus  apoptotique,  les  cellules  vont 

également  perdre  l’asymétrie  de  leur membrane  plasmique:  les  phosphatidylsérines  sont 

exposées de  la  face interne à  la  face externe de  la bicouche  lipidique. Ces molécules sont 

alors reconnues par  les macrophages (Williams 1991) qui vont ainsi permettre  l’élimination 

des corps apoptotiques.

ii. Les acteurs majeurs de l’apoptose  

‐ Les Caspases 

Les  caspases  (cystein aspartate  specific proteases)  sont une  famille de protéases à 

cystéine essentielles dans la mort cellulaire programmée (Kumar and Lavin 1996; Nicholson 

and Thornberry 1997). Elles possèdent  toutes un motif catalytique  très conservé composé 

d’un  résidu  cystéine  inclus  dans  une  séquence  peptidique  de  type  QAXCXG,  ce  qui  leur 

confère une spécificité de reconnaissance et de clivage au niveau de résidus aspartate. Les 

caspases  sont  généralement  présentes  dans  toutes  les  cellules  sous  forme  de  précurseur 

51

enzymatique  inactif  (zymogène)  avec  une  activité  protéase  inexistante  (Nicholson  and 

Thornberry 1997; Stennicke, Jurgensmeier et al. 1998; Nicholson 1999).  

On peut classer les caspases humaines en deux groupes selon leur degré d’homologie 

avec  la  caspase‐1 :  le premier groupe  contient  les  caspases  ‐1,  ‐4,  ‐5, qui  sont  impliquées 

dans le processus d’inflammation ; le deuxième groupe contient les caspases ‐2, ‐3, ‐6, ‐7, ‐8, 

‐9 et ‐10 qui jouent un rôle central dans le processus d’apoptose (Figure 15). 

Les caspases sont  constituées d’un pro‐domaine N‐terminal, d’une grande sous unité 

(20kDa)  contenant  le  site  catalytique,  et  d’une  petite  sous  unité  (10kDa).  Elles  sont 

synthétisées sous forme de pro‐enzymes et sont activées par clivage protéolytique au niveau 

des résidus aspartate conservés. Cette activation se fait, en réalité, en deux étapes : dans un 

premier temps, la petite sous unité est libérée puis la grande, permettant ainsi la formation 

d’un  tétramère  (constitué de deux hétérodimères)  catalytiquement actif puis  les  caspases 

vont ensuite cliver spécifiquement leurs substrats au niveau d’un résidu aspartate (Nicholson 

and  Thornberry  1997).  Elles  peuvent  donc  s’auto‐activer  et/ou  s’activer  mutuellement, 

entraînant  ainsi  une  activation  protéolytique  en  cascade  (Stennicke,  Jurgensmeier  et  al. 

1998). 

  En plus de leurs sous unités actives, les caspases possèdent un pro‐domaine à 

l’extrémité N‐terminale. On peut diviser les caspases en deux sous‐groupes selon la longueur 

de  ce  domaine :  les  caspases  initiatrices  (caspases  ‐2,  ‐8,  ‐9  et  ‐10)  présentant  un  pro‐

domaine long, et les caspases exécutrices (caspases ‐3, ‐6 et ‐7) présentant un pro‐domaine 

court (Figure 15). 

Les  caspases  initiatrices  présentent  des  séquences  spécifiques  d’interaction  avec 

d’autres  protéines  dans  leur  pro‐domaine :  on  retrouve  ainsi  un  domaine  DED  (Death 

Effector Domain) dans  les caspases  ‐8 et  ‐10 ou une séquence CARD (Caspase Recruitment 

Domain) dans les caspases ‐2 et ‐9. Ces domaines permettent aux caspases initiatrices d’être 

recrutées par des protéines adaptatrices au niveau des complexes d’initiation de l’apoptose, 

par exemple le DISC (Death‐Inducing Signalling Complex) pour la caspase‐8 ou l’apoptosome 

(un large complexe protéique qui comprends le cytochrome c et APAF‐1 (apoptotic protease‐

activating factor‐1) pour la caspase‐9. Au sein de ces complexes, les caspases initiatrices sont 

ainsi  clivées,  et  vont  aller  activer  à  leur  tour  leurs  substrats,  notamment  les  caspases 

effectrices. 

 

52

 

 

Figure 15.   Les Caspases (Taylor, Cullen et al. 2008). 

 

 

Ces dernières vont alors, elles mêmes, cliver  leurs substrats spécifiques aboutissant 

aux changements morphologiques, biochimiques et structuraux observés lors de l’apoptose. 

En  effet,  les  substrats  des  caspases  regroupent  un  large  panel  de  protéines  cellulaires : 

protéines de structure cytoplasmiques (actine, β‐caténine…) ou nucléaires (lamines A et B) ; 

protéines impliquées dans le métabolisme et la réparation de l’ADN (PARP : Poly ADP‐Ribose 

Polymérase, ATM : Ataxia telangiectasia mutated, DNA‐PK : DNA‐dependent Protein Kinase) ; 

protéines  impliquées  dans  le  cycle  cellulaire  (p27,  pRB,  MDM2…) ;  protéines  pro‐

apoptotiques (caspases, protéines de la famille Bcl‐2…). 

53

Au vu de l’importance du rôle des caspases dans la cellule, cette famille de protéines 

nécessite d’être finement régulée tant au niveau de sa synthèse que de son fonctionnement. 

En  plus  de  la  régulation  transcriptionnelle  et  des  modifications  post‐traductionnelles 

auxquelles  les  caspases  sont  sujettes  (Earnshaw, Martins  et  al.  1999),  il  existe  un  autre 

niveau de régulation constitué par  la famille des  IAP (Inhibitor of Apoptosis). Ces protéines 

peuvent,  en  effet,  inhiber  l’activité  enzymatique  des  caspases  et même  conduire  à  leur 

dégradation via la voie ubiquitine/protéasome (Salvesen and Duckett 2002).  

 

‐ Les récepteurs de mort 

Les membres  de  la  famille  des  TNF‐R  (Tumor  Necrosis  Factor  Receptor)  ont  une 

action pléiotrope qui dépend du type cellulaire et d’autres signaux reçus par  la cellule. Ces 

récepteurs peuvent ainsi déclencher  la prolifération,  la survie,  la différenciation ou  la mort. 

Les récepteurs de mort font partie de la super famille des TNF‐R  comprenant, entre autres, 

CD95/Apo‐1/Fas,  TNF‐R1  (TNF  Receptor  1),  DR3  (Death  Receptor  3),  DR4/TRAIL‐R1  (TNF‐

Related Apoptosis‐Inducing Ligand R‐1) et  DR5/TRAIL‐R2…etc. Ils possèdent dans leur région 

intracellulaire,  un  domaine  de mort DD  (Death Domain)  (Tartaglia, Ayres  et  al.  1993).  Ce 

dernier est un motif protéique de 80 acides aminés, indispensable à la transmission du signal 

de  mort  puisqu’il  permet  le  recrutement  de  protéines  présentant  des  domaines 

homologues. 

 

‐ La famille BCL2  

Chez  les mammifères,  il existe  au moins 12 protéines principales  appartenant  à  la 

famille BCL‐2.   Ces protéines présentent un grand nombre d’activités biologiques allant de 

l’inhibition de l’apoptose à son induction.  

L’alignement des séquences protéiques des différents membres de la famille a permis 

la mise  en  évidence  de  quatre  domaines  hautement  conservés  chez  les mammifères,  les 

domaines BH (BCL‐2 Homology) 1 à 4. Cette découverte a permis le classement des membres 

de  la  famille  BCL‐2  en  trois  classes  (Tsujimoto  and  Shimizu  2000; Adams  and  Cory  2007) 

(Figure 16) : 

54

- Le groupe des facteurs de survie « BCL‐2‐like » qui rassemble  les membres de  la 

famille présentant  les 4 domaines BH. Tous  les membres de ce groupe ont des 

propriétés anti‐apoptotiques. C’est à  ce groupe qu’appartiennent, entre autres, 

BCL‐2, BCL‐XL, MCL‐1… 

- Le  deuxième  groupe  réunit  une  partie  des  membres  pro‐apoptotiques  de  la 

famille  sous  le  nom  de  facteurs  de  mort  « BAX‐like »  et  se  caractérise  par 

l’absence du domaine BH4 (sauf dans  le cas de Bcl‐xS). On y trouve  les protéines 

BAX et BAK notamment. BAX et BAK jouent un rôle crucial dans  l’induction de  la 

pérméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie et ainsi permettent 

le relarguage de molécules apoptotiques comme  le cytochrome c. On aura alors 

activation des caspases. Les protéines anti‐apoptotiques comme BCL‐2 et BCL‐XL 

inhibent BAX et BAK. 

- Le  troisième  groupe  peut  se  lier  et  réguler  les  protéines  anti‐apoptotiques 

promouvant  ainsi  l’apoptose.  Ses membres ne présentent que  le domaine BH3 

d’où  son  nom :  « BH3‐only ».  BAD,  BID,  BIM,  PUMA, NOXA,  par  exemple,  font 

partie de  ce groupe.  L’expression des protéines BH3‐only peut être  induite par 

des  facteurs de transcription. Par exemple, NOXA et PUMA sont  induits par p53 

en réponse à des cassures de l’ADN (Oda, Ohki et al. 2000; Nakano and Vousden 

2001;  Yu,  Zhang  et  al.  2001)  et  BIM  est  induit  par  FOXO3A  (forkhead  box 

transcription  factor‐3A)  en  réponse  à  la  déprivation  en  facteur  de  croissance 

(Dijkers, Medema et al. 2000).  

 

Les membres de  la  famille Bcl‐2 peuvent  former des homo‐ ou des hétérodimères 

avec  des  partenaires  spécifiques  de  fonction  opposée  (Sedlak,  Oltvai  et  al.  1995).  Les 

domaines  BH1,  2  et  3  des  membres  anti‐apoptotiques  ainsi  que  le  domaine  BH3  des 

membres pro‐apoptotiques  seraient  impliqués dans cette  interaction. En effet, des études 

structurales  sur  BCL‐XL  d’abord  puis  sur  les  autres membres  de  la  famille  ont  permis  de 

mettre en évidence que  la proximité spatiale des domaines BH1, 2 et 3 des membres anti‐

apoptotiques  permettait  la  formation  d’une  poche  hydrophobe  permettant  l’interaction 

avec  les membres pro‐apoptotique  (Muchmore, Sattler et al. 1996)  (Figure 16).  Il y aurait 

ainsi une neutralisation  compétitive entre  les membres aux  fonctions opposées,  le niveau 

d’expression  relatif  de  chaque  protéine  déterminant  ainsi  la  sensibilité  de  la  cellule  à  un 

55

signal de mort (Yang and Korsmeyer 1996). Ainsi, la régulation des niveaux d’expression des 

protéines anti‐apoptotiques de  la  famille BCL‐2 est un moyen pour  les  cellules de  réguler 

l’apoptose.  Par  exemple  la  transcription  de  BCL‐XL  peut  être  induite  par  des  facteurs  de 

croissances  ou  cytokines  par  l’intermédiaire  de  la  voie  JAK‐STAT  (Janus  kinase‐signal 

transducer and activator of transcription) afin de promouvoir la survie cellulaire (Grad, Zeng 

et al. 2000). 

Les  différents  membres  de  la  famille  présentent  des  localisations  sub‐cellulaires 

variées. Dans une cellule normale, la plupart des membres anti‐apoptotiques s’ancrent dans 

les membranes via  le domaine  transmembranaire  (TM)   présent au niveau de  la partie C‐

terminal. C’est  le cas de Bcl‐2 qui est majoritairement  localisé à  la membrane du réticulum 

endoplasmique  (une  petite  partie  étant  cependant  localisée  à  la  membrane  externe 

mitochondriale)  (Lithgow,  van Driel et al. 1994). BCL‐XL est, en  revanche, majoritairement 

localisée dans le cytosol. En ce qui concerne le groupe « BAX‐like », on retrouve BAK dans la 

membrane  externe  mitochondriale  (Cheng,  Sheiko  et  al.  2003),  BAX  étant  plutôt 

cytoplasmique. Enfin les protéines ne présentant que le domaine BH3 sont, pour la plupart, 

cytoplasmiques. Après un stimulus apoptotique, la localisation de certaines de ces protéines 

va  changer. Ainsi,  en  réponse  à  un  signal  de mort, BAX  changerait  de  conformation.  Son 

domaine TM, normalement replié dans la poche hydrophobe, deviendrait alors accessible et 

permettrait l’ancrage de  la protéine dans  la membrane externe de  la mitochondrie (Suzuki, 

Youle  et  al.  2000).  Un  mécanisme  similaire  a  été  mis  en  évidence  pour  BCL‐XL  (Hinds, 

Lackmann et al. 2003). Le changement de localisation peut donc être dû à un changement de 

conformation mais aussi à des modifications post‐traductionnelles. C’est  le cas de BID qui, 

une  fois clivée par  la caspase‐8 en  t‐BID, est myristoylée  (au niveau d’un résidu glycine N‐

terminal) puis relocalisée du cytoplasme vers la mitochondrie (Zha, Weiler et al. 2000). C’est 

également  le  cas  de  la  protéine  BCL‐2  dont  les  fonctions  anti‐apoptotiques  peuvent  être 

modulées  par  phosphorylation  ou  clivage  protéolytique  (Blagosklonny  2001).  La 

phosphorylation de Bcl‐2 a lieu au niveau de résidus Ser et Thr localisés entre les domaines 

BH3  et  BH4  (Srivastava, Mi  et  al.  1999).  Différentes  kinases  ont  été  impliquées  dans  le 

processus, notamment la p38 MAP kinase. 

 

Les  membres  de  la  famille  Bcl‐2  sont  donc  essentiels  pour  la  signalisation 

apoptotique  grâce,  en  grande  partie,  à  leur  capacité  à  réguler  la  perméabilité 

56

mitochondriale,  mais  également,  à  moduler,  par  l’intermédiaire  d’interactions  protéine‐

protéine, l’activité de molécules régulatrices de l’apoptose.  

 

 

 

 

 

 

 

Figure 16.  Protéines de la famille BCL‐2 (Youle and Strasser 2008). 

57

iii. Les grandes voies de signalisation  

‐ La voie extrinsèque ou des récepteurs de mort  

La voie extrinsèque est déclenchée par  l’engagement des  récepteurs TNF‐R comme 

FAS ou  TNFR1  (TNF  receptor‐1) qui  contiennent un domaine  intracellulaire de mort  (DD). 

Celui‐ci  peut  recruter  et  activer  la  caspase‐8  grâce  à  la  protéine  adaptatrice  FADD  (Fas‐

associated  death  domain).  Ce  recrutement  induit  l’activation  des  caspases,  comme  la 

caspase‐3,  ‐6  ou  ‐7  sans  participation  de  la  famille  BCL‐2.  L’interaction  de  FADD  et  des 

caspases permet la formation d’un complexe appelé DISC (Kischkel, Hellbardt et al. 1995). 

Une  fois  les  caspases  initiatrices  activées,  on  peut  distinguer  deux  types  de 

phénomènes  selon  la quantité de protéases activées. Dans un premier cas,  la quantité de 

caspases actives est suffisante pour initier l’apoptose directement. L’activation des caspases 

initiatrices 8 et 10 au niveau du DISC est alors rapidement suivie de l’activation des caspases 

exécutrices qui vont permettre  l’activation directe de  la caspase‐3 qui, à son tour, va cliver 

ses  différents  substrats  et  permettre  le  déroulement  du  processus  apoptotique  (Kischkel, 

Hellbardt et al. 1995).  

En revanche dans le second cas, la quantité de caspases initiatrices actives étant trop 

faible, la mitochondrie va être nécessaire pour amplifier le signal de mort (Scaffidi, Fulda et 

al. 1998). Ainsi malgré la faible quantité de caspase‐8 qui n’est pas suffisante pour un clivage 

direct de la caspase‐3, on aura un clivage de Bid, membre pro‐apoptotique « BH3‐only » de 

la  famille  Bcl‐2.  La  protéine  tronquée  t‐Bid,  après myristoylation,  va  être  relocalisée  à  la 

mitochondrie,  permettant  ainsi,  via  l’interaction  avec  Bax,  la  formation  de  pores  dans  la 

membrane mitochondriale. Ceci va aboutir à une chute du potentiel mitochondrial (Δψm) et 

au  relargage des molécules depuis  l’espace  intermembranaire de  la mitochondrie,  vers  le 

cytoplasme  (Jurgensmeier,  Xie  et  al.  1998;  Reed,  Jurgensmeier  et  al.  1998).  Plusieurs 

molécules  vont  être  relarguées,  parmi  elles,  l’AIF  (Apoptosis  Inducing  Factor)  et  le 

cytochrome c. Dans le cytosol, le cytochrome c forme l’apoptosome, un complexe composé 

du cytochrome c, de APAF‐1, d’ATP et de la pro‐caspase 9. Au sein de l’apoptosome, la pro‐

caspase  9  est  activée  et  peut  alors,  activer  les  caspases  effectrices  ‐3,  ‐6  et  ‐7  en  aval 

(Rathmell and Thompson 1999; Slee, Harte et al. 1999) (Figure 17). 

 

58

‐ La voie intrinsèque 

 

La voie  intrinsèque est activée en réponse à des stimuli  intracellulaires comme, par 

exemple,  des  dommages  causés  à  l’ADN  par  les  radiations  ionisantes  ou  des  agents 

chimiothérapeutiques,  des  dommages  causés  à  la  mitochondrie  ou  encore  l’activation 

d’oncogènes.  Elle  met  en  jeu  uniquement  la  mitochondrie:  on  observe  une  chute  du 

potentiel mitochondrial Δψm et  le  relargage des molécules de  l’espace  intermembranaire 

dans  le  cytoplasme.  Suite  à  cela,  interviennent  les mêmes  évenements  que  pour  la  voie 

axtrinsèque,  c'est‐à‐dire  activation  des  caspase  effectrices  ‐9  et  ‐3.  S’ensuit  alors  la 

dégradation  de  l’ADN,  le  bourgeonnement  de  la  membrane  et  la  formation  de  corps 

apoptotiques. En amont, en revanche, les événements moléculaires menant à l’activation de 

la mitochondrie  ne mettent  pas  en  jeu  les  caspases  initiatrices mais  les membres  de  la 

famille Bcl‐2 (Figure 17). 

   

59

 

 

 

 

Figure 17.  Voies  extrinsèque  et  intrinsèque  d’induction  de  l’apoptose  (Blondel  B, 

Virologie 2006) 

60

2. Nef et apoptose 

i. Action anti‐apoptotique de Nef 

Il a été montré que Nef protège les cellules infectées contre les signaux provenant du 

récepteur de mort CD95 (Fas) et de la mort médiée par le TNF‐R via l’inhibition de la kinase 

ASK‐1 (apoptosis signal regulating kinase) (Geleziunas, Xu et al. 2001) (Figure 14). Nef peut 

également inhiber la voie Fas par le blocage de l’activation des caspases ‐3 et ‐8 (Yoon, Jeong 

et al. 2001) (Figure 14).  

L’infection par le VIH‐1 induit l’induction de la protéine pro‐apoptotique Bad. Nef sert 

alors de balance aux effets apoptotiques du VIH en activant la PI3‐K (phosphatidylinositol‐3‐

kinase) et PAK2 (p21‐activated kinase 2) résultant en la phosphorylation et donc inactivation 

de Bad (Wolf, Witte et al. 2001) (Figure 14).  

Nef joue également sur la demi‐vie de la p53 (tumor suppressor protein p53) qui joue 

un rôle critique dans la régulation de l’apoptose (Greenway, McPhee et al. 2002).  

 

ii. Action pro‐apoptotique de Nef 

 

La  protéine  Nef  possède  également  des  effets  pro‐apoptotique ;  en  effet  il  a  été 

montré qu’elle intervenait dans l’apoptose induite par la voie Fas/Fas‐L : 1) Nef exogène est 

capable de se  lier à  la chaîne  ζ du  récepteur T et d’induire ainsi  l’expression de Fas‐L à  la 

surface des cellules en contournant ainsi la nécessité d’un antigène pour activer les cellules T 

(Xu, Laffert et al. 1999) (Figure 14). 2) D’autre part, il a été montré que Nef endogène était 

capable d’augmenter Fas et Fas‐L (Zauli, Gibellini et al. 1999) (Figure 14).  

Nef  peut  également  déclencher  la  voie  intrinsèque  de  l’apoptose  en  diminuant 

l’expression de BCL‐2 et de BCL‐XL ou en augmentant  les effets observés en général dans 

l’apoptose : dépolarisation mitochondriale et activation des caspases ‐3 et ‐8 (Bossy‐Wetzel 

and Green 1999; Rasola, Gramaglia et al. 2001) (Figure 14). 

   

61

 

 

Figure 14.  Les différentes relations avec l’apoptose connues de Nef au sein d’une cellule 

infectée. 

62

Enfin, la liaison de Nef avec le CXCR4 sur les cellules T CD4+ a également été montrée 

comme suffisante pour induire l’apoptose (James, Huang et al. 2004). 

 

Comme c’est  le cas de plusieurs protéines du VIH, Nef peut donc à  la  fois  jouer un 

rôle  pro‐apoptotique  et  anti‐apoptotique,  suivant  la  situation  environnementale  dans 

laquelle elle se trouve (Cossarizza 2008).  

 

L’induction  de  l’apoptose  dans  les  cellules  infectées  n’est  pas  forcément  un mécanisme 

favorisant  la dissémination ou  la  réplication virale. Cependant  l’homme n’étant pas  l’hôte 

naturel du VIH, il se peut que ces phénomènes soient le résultat d’une mauvaise adaptation 

du  virus  à  notre  environnement.  Ceci  entrainant  jouant  sur  le  déclenchement  de  la 

pathologie SIDA. 

 

3. Les autres protéines virales du VIH et apoptose 

i. Env  

La protéine Env du VIH est présente à la surface des cellules infectées et consiste en 

un hétérodimère de glycoprotéine (gp) 120 et de gp41 (Chan, Fass et al. 1997). L’apoptose 

est  induite par  gp120  Env  sur  les  T CD4  à  travers  l’activation de  la  voie  Fas  (CD95)/Fas‐L 

(Zagury, Cantalloube et al. 1993; Wang, Dudhane et al. 1994; Katsikis, Garcia‐Ojeda et al. 

1996; Orlikowsky, Wang  et  al.  1997),  la  voie  extrinsèque  qui  conduit  à  la  diminution  de 

l’expression  de Bcl‐2  (Hashimoto, Oyaizu  et  al.  1997)  et  l’activation  des  caspases  8  et  10 

comme décris précédemment. La gp120 soluble peut également induire l’apoptose par voie 

extrinsèque de cellules T helper non infectées à travers la fixation sur le CD4 (Banda, Bernier 

et al. 1992). Cette fixation induit une partie de la voie d’activation  des cellules T. Cependant, 

en absence d’activation spécifique du TCR,  le signal transmis  induit  l’apoptose (Marschner, 

Hunig et al. 2002). 

Il a également été décrit une activation de  la voie  intrinsèque, en  corrélation avec 

l’activation de  la  caspase  3  (Ohnimus, Heinkelein et  al.  1997; Kaul  and  Lipton  1999), une 

perte rapide du potentiel mitochondrial (Δψm) (Berndt, Mopps et al. 1998), une diminution 

63

de l’expression de Bcl‐2 (Hashimoto, Oyaizu et al. 1997) et une augmentation de l’expression 

de Bax (Ferri, Jacotot et al. 2000). 

ii. Tat  

La  protéine  Tat  est  permet  l’augmentation  de  la  transcription  virale  grace  à  son 

interaction avec  la région d’activation Tat (TAR)  localisée à  l’extrémité 5’ de tous  les ARNm 

viraux. Tat augmente également  l’activité transcriptionelle d’un certain nombre de facteurs 

de transcription comme NFκB  (Conant, Ma et al. 1996; Demarchi, d'Adda di Fagagna et al. 

1996), NFAT (Kinoshita, Su et al. 1997; Macian and Rao 1999; Li, Multon et al. 2000) et AP‐1 

(Kumar, Manna  et  al.  1998).  La  protéine  Tat  peut  être  sécrétée  par  les  cellules  inféctées 

(Chang, Samaniego et al. 1997) puis être endocytée par les cellules voisines (Ensoli, Barillari 

et al. 1990; Mann and Frankel 1991; Zagury, Sill et al. 1998). Tat peut induire l’augmentation 

de  la mort à travers  la voie Fas (CD95)/Fas‐L (Li‐Weber, Laur et al. 2000), et quand elle est 

sécrétée  (Ensoli,  Barillari  et  al.  1990),  peut  augmenter  la  susceptibilité  des  cellules  non 

infectées à la mort par Fas (Westendorp, Frank et al. 1995; McCloskey, Ott et al. 1997). Des 

mécanismes  indépendants de  la voie Fas ont également été décrits avec Tat : Tat diminue 

Bcl‐2  et augmente l’expression de Bax (Sastry, Marin et al. 1996). Tat augmente également 

l’expression des caspases 8  (Bartz and Emerman 1999) et 10  (Gibellini, Re et al. 2005). Tat 

entraîne également la translocation de Bim depuis les microtubules jusqu’à la mitochondrie 

où il induit la perméabilisation de la membrane mitochondriale (Chen, Wang et al. 2002).  

 

iii. Vpr  

Vpr  est une protéine du VIH de 14 kDa nécessaire dans la réplication du VIH.  

Après  l’infection,  Vpr  semble  avoir  de  nombreuses  activités  comme :  l’interaction 

avec  le complexe de pré‐intégration du VIH et  la translocation de celui‐ci dans  le noyau ;  la 

suppression du système immunitaire et l’augmentation de l’expression des gènes viraux. Vpr 

est également nécessaire afin d’avoir une  infection productive dans des cellules qui ne  se 

divisent pas  comme  les macrophages  (Connor, Chen et  al. 1995;  Eckstein,  Sherman et  al. 

2001). 

64

L’activation de la voie indépendante des caspases par Vpr a également été observée, 

à  travers  un  effet  direct  de  Vpr  sur  la  perméabilisation  de  la membrane mitochondriale 

(Jacotot, Ravagnan et al. 2000; Jacotot, Ferri et al. 2001; Roumier, Vieira et al. 2002). Enfin il 

a  été montré  que  Vpr  interagit  avec  NF‐κB  et  augmente  ainsi  les  signaux  apoptotiques 

diminuant l’expression des protéines BCL‐2 et BCL‐XL (Muthumani, Hwang et al. 2002).  

 

 

 

 

 

 

 

   

65

66

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

   

RESULTATS

I. ARTICLE:  “HIV‐1 NEF  PROTEIN  EXPRESSION  IN HUMAN CD34+  PROGENITORS 

IMPAIRS THE DIFFERENTIATION OF AN EARLY T/NK CELL PRECURSOR” 

 

Céline  Dorival1,  Fanny  Brizzi1,  Jean‐Daniel  Lelièvre,  Nathalie  Sol‐Foulon,  Emmanuelle  Six,  Adeline 

Henry, Isabelle André‐Schmutz, Marina Cavazzana‐Calvo, Laure Coulombel, Jérôme Estaquier, Olivier 

Schwartz, Yves Lévy 

Virology 377 (2008) 207–215 

1 These authors contributed equally to this work. 

 

L’infection  par  le  VIH‐1  est  caractérisée  par  une  perte  progressive  des  cellules  T  CD4, 

entrainant  ainsi  une  immunodéficience  sévère. Une  des  causes  de  cette  perte  progressive  est  le 

manque de renouvellement des cellules T. En effet,  il semblerait que  le VIH‐1 affecte  la production 

des  cellules T à  travers des mécanismes qui ne  sont pas encore  tous  connus.  Il a été notamment 

montré que  la production  thymique  est  affectée  chez  les patients  infectés par  le VIH‐1  (Hatzakis, 

Touloumi et al. 2000; Richardson, Sverstiuk et al. 2000; Douek, Betts et al. 2001; Dion, Poulin et al. 

2004). Dans cet article, nous nous sommes intéressés à l’effet de l’expression de la protéine Nef du 

VIH‐1  sur  le  potentiel  des  précurseurs  hématopoïétiques  humains  CD34+.  Nef  est  une  protéine 

produite à un stade précoce du cycle viral du VIH et possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme 

en  témoigne  la  reproduction,  chez  la  souris  transgénique  pour  Nef,  d’une maladie  proche  de  la 

maladie  humaine  avec  atrophie  thymique  (Hanna,  Kay  et  al.  1998).  Nef  interfère  avec  les  voies 

d'endocytose  et  de  trafic  intracellulaire  induisant  une  diminution  de  l’expression  de  CD4,  des 

molécules  de HLA  classe  I  et  du  CD8,  et  avec  plusieurs  voies  de  signalisation  impliquées  dans  la 

survie/apoptose ou dans l’ontogénie T (LAT, Lck, MAP kinases…) (Hanna, Kay et al. 1998; Hanna, Kay 

et al. 1998). Nous avons privilégié et mis au point une approche de surexpression de Nef, en dehors 

du  contexte  de  l’infection  par  le  VIH,  par  l’utilisation  de  lentivirus  exprimant  Nef  dans  des 

précurseurs  hématopoïétiques  CD34+.  Ces  cellules  sont  transduites  puis  cultivées  sur  les  cellules 

stromales OP9‐DL1 qui permettent  la différenciation de précurseurs hématopoïétiques humains en 

cellules T.  

Nous avons ainsi montré que la protéine Nef affecte la génération des cellules T à un stade précoce 

CD3ε  +  CD5+  CD1a+.  Ces  cellules  ayant  commencé  le  réarrangement D‐J  du  TCRβ.  Les  stades  plus 

tardifs du développement T sont aussi affectés car une réduction significative du nombre de cellules 

67

ISP CD4+ CD3ε+ intra (Immature single positive), de doubles positives (DP) CD4+ CD8+ TCRαβ et de NK 

CD56+ a été observé. La production de cellules B, observée dans un système de culture similaire mais 

avec  des  cellules  MS5,  n’est  pas  affectée.  De  plus  une  étude  par  dilution  limite  a  permis  de 

démontrer une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ 

exprimant Nef.  

Ces  résultats  nous  ont  permis  de  conclure  que  la  protéine  Nef  du  VIH‐1  interférait  dans  la 

différenciation des cellules hématopoïétiques au niveau d’un précurseur ayant le potentiel T/NK. 

Des  études  ont  déjà  été  menées  par  d’autres  groupes  sur  le  sujet  en  utilisant  également  des 

précurseurs CD34+ transduits par un retrovirus exprimant Nef. Les précurseurs thymiques ou de sang 

de  cordon étaient  injectés dans un  système  FTOC ou  in  vivo dans des  souris  SCID‐hu  (Verhasselt, 

Naessens et al. 1999; Stove, Van de Walle et al. 2005). Ces études ont montrés que Nef réduisait le 

rendement thymique des cellules CD4 et CD8. Cet effet est associé avec une modulation significative 

de  l’expression  de  surface  des molécules  CD4  et  CD8  à  la  surface  des  cellules  T.  Ces  résultats 

suggèrent que Nef peut bloquer la différenciation T au stade de sélection positive puisque la perte de 

ces récepteurs entrave la sélection positive de la lignée T (Rahemtulla, Fung‐Leung et al. 1991; Itano, 

Cado et al. 1994). A  l’aide d’un panel de mutants de Nef dont certains mutés dans  leur capacité à 

diminuer  l’expression  des  molécules  CD4  et  CD8,  Stove  a  montré  que  la  modulation  des  ces 

récepteurs  n’était  pas  indispensable,  voir  même  avait  un  impact  mineur  sur  l’interférence  du 

développement T  induit par Nef (Stove, Naessens et al. 2003). Nos résultats semblent montrer que 

Nef bloquerait le développement T, avant la sélection du TCRβ. De plus, la réduction quantitative que 

nous observons dans  la  fréquence des cellules CD3εintra CD5+ CD1a+ CD4‐ CD8‐ et des précurseurs 

NK, alors que la génération des cellules B n’est pas affectée, suggère que Nef interfère a un stade très 

précoce du développement lymphoïde, avant l’engagement entre les lignées T et NK. 

Les mécanismes moléculaires  par  lesquels  Nef  altère  le  développement  des  stades  précoces  du 

développement  lymphoïde  ne  sont  pas  tous  connus.  La  protéine  Nef  est  modifiée  par 

phosphorylation  et myristoylation,  ce  qui  permet  le  ciblage  de  la  protéine  à  la membrane. Nous 

avons montré que la mutation de ce site abolie l’effet de Nef sur la réduction du potentiel T/NK des 

cellules hématopoïétiques CD34+. Cependant, l’inhibition du ciblage de Nef à  la membrane abolie la 

modulation  des molécules  de  CD4  et  de HLA  classe  I mais  aussi  de  nombreuses  autres  fonctions 

cellulaires de Nef. 

Plusieurs groupes ont mis en évidence que  le VIH pouvait  infecter  le thymus, et que cette  infection 

entraine une réduction de la production thymique, ce qui contribue à l’absence de la restauration du 

pool de cellules T périphériques  (Bonyhadi, Rabin et al. 1993; Jamieson, Aldrovandi et al. 1994; Su, 

68

Kaneshima et  al. 1995; Douek, Betts et  al. 2001).  Les mécanismes par  lesquels  le VIH perturbe  la 

thymopoïèse peuvent être dû à l’infection directe des thymocytes avant leur sortie du thymus,  à une 

infection des épithéliums  thymiques, à  l’infection des cellules CD34+ ou  juste à  l’altération de  leur 

potentiel.  Bien  que  certaines  équipes  aient  rapporté  avoir  détecté  des  cellules  CD34+  de moelle 

osseuse infectées, la majorité de ces précurseurs semblent ne pas être susceptibles à l’infection par 

le  VIH  (von  Laer,  Hufert  et  al.  1990;  Stanley,  Kessler  et  al.  1992;  Zauli,  Furlini  et  al.  1994; Neal, 

Holland et al. 1995; Weichold, Zella et al. 1998; Baillou, Simon et al. 2003). Cependant,  l’hypothèse 

selon laquelle les précurseurs peuvent être susceptibles à l’infection par le VIH est supportée par le 

fait que les CD34+ et les thymocytes expriment les corécepteurs du VIH (berkowitz 1998 ; deichmann 

1997 ; ruiz 1998 ; zaitseva 1998).  Nos résultats montrent que l’expression de Nef est suffisante pour 

réduire de manière significative la capacité des précurseurs à former des cellules T.  

 

 

 

 

   

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HIV-1 Nef protein expression in human CD34+ progenitors impairs the differentiationof an early T/NK cell precursor

Céline Dorival a,1, Fanny Brizzi a,1, Jean-Daniel Lelièvre a,b, Nathalie Sol-Foulon c, Emmanuelle Six d,Adeline Henry a, Isabelle André-Schmutz d, Marina Cavazzana-Calvo d, Laure Coulombel e, Jérôme Estaquier a,Olivier Schwartz c, Yves Lévy a,b,⁎a INSERM U 841, Faculté de Médecine, Créteil, Franceb Service d'Immunologie, Hôpital Henri Mondor, Créteil, Francec Groupe Virus et Immunite, Institut Pasteur, CNRS URA1930, Franced Departement de Biotherapie, Hopital Necker-Enfants-Malades, INSERM U768, 149, rue de Sevres, 75015 Paris, Francee INSERM U602, Hopital Paul-Brousse, 12, avenue Paul Vaillant Couturier, 94800 Villejuif, France

A B S T R A C TA R T I C L E I N F O

Article history:Received 5 March 2008Returned to author for revision25 March 2008Accepted 14 April 2008

Keywords:HIV-1NefOP9-DL1T-cell differentiationNK cellsCD34+ cells

HIV-1 impairs the production of T cells, throughmechanisms that are still unknown. Here, we investigated theeffect of the expression of HIV-1 Nef on the T-cell potential of human hematopoietic CD34+ precursors. Thoseprogenitorswere transduced by using lentiviral vectors expressing Nef and cultured on OP9-DL1 cells allowingthe differentiation of T cell from human hematopoietic precursors. We demonstrate that Nef impairs thegeneration of a CD3ɛ+CD5+ CD1a+ precursor stage that has initiated a D-J rearrangement of the TCRβ locus.Onward stages of T-cell development were also affected with a quantitative reduction of CD4+ intraCD3ɛ+

Immature single positive cells (ISP), Double Positive (DP) CD4+CD8+ TCRαβ Tcells and CD56+ NK cells. But B cellproductionwas not affected. Limiting dilution analyses demonstrated a significant reduction in the frequencyof T/NK progenitors among Nef-expressing CD34+ cells. Altogether, these data demonstrate that Nef interfereswith the differentiation of a primitive lymphoid human precursor with a T/NK potential.

© 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

HIV-1 infection is characterized by a progressive loss of CD4 T cellleading to a severe immune deficiency. More than 20 years after theidentification of HIV, the exact mechanisms by which HIV leads tothe depletion of CD4 T cells are not completely understood andremain a matter of controversy. The current view suggests that aperipheral activation of the immune system leads to a depletion ofCD4 T cells by activation-induced cell death resulting in anexhaustion of the pool of naïve T cells (Moanna et al., 2005). Themaintenance of this pool is critically dependent on the input fromthe thymus where the differentiation of early hematopoieticprogenitors into mature T cells takes place. Several lines of evidenceare in favor of an impairment of thymic function in HIV-infectedpatients (Dion et al., 2004; Douek et al., 2001; Hatzakis et al., 2000;

Richardson et al., 2000). Arguments emerged from the estimationof thymic output by quantification of TCR rearrangement excisioncircles (TREC). Although, the precise mechanisms leading to thisreduced thymic proliferation are unknown, it is clearly related to thepresence of replicating virus as intra thymic proliferation normalizeswith antiviral therapy.

The HIV-1 Nef gene is essential for AIDS pathogenesis. HIV-1 Nefprotein is a 27-kDa protein that is expressed early during cellinfection (Guatelli et al., 1990; Robert-Guroff et al., 1990). Nefincreases viral replication in vivo and enhances viral infectivity(Fackler and Baur, 2002). Nef interferes with the expression of crucialmolecules at the surface of lymphocytes such as CD4 (Garcia andMiller, 1991), the major histocompatibility complex (MHC) class I(Schwartz et al., 1996) and II (Stumptner-Cuvelette et al., 2001), CD28(Swigut et al., 2001), DC-SIGN (Sol-Foulon et al., 2002), CD8 αβ(Stove et al., 2005), and chemokine receptors (Janardhan et al., 2004;Michel et al., 2005). Nef also alters T-cell signaling pathways andimmunological synapse formation (Tolstrup et al., 2004). The role ofNef in AIDS pathogenesis can be deduced by the observation ofcohort long term non-progressor Australian patients infected aftertransfusions of blood containing a Nef-defective virus (Deacon et al.,1995). In the same way, Nef from SIVmac strain is essential for the

Virology 377 (2008) 207–215

⁎ Corresponding author. INSERM U 841, Faculté de médecine, 8 rue du général Sarrail,Créteil 94010 Cedex and Service d'Immunologie Clinique, Hôpital Henri Mondor, 51,Avenue du Maréchal de Lattre de Tassigny, 94010 Créteil, France. Fax: +33 1 49 81 24 69.

E-mail address: yves.levy@hmn.aphp.fr (Y. Lévy).1 These authors contributed equally to this work.

0042-6822/$ – see front matter © 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.virol.2008.04.009

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maintenance of high viral load and disease progression (Kestler et al.,1991). Transgenic mice expressing Nef in T cells under the control ofeither TCRβ, CD2, CD3δ, or CD4 regulatory elements exhibit a loss ofCD4 T cell and in vitro alteration of T cell activation. Nef expressionalone is sufficient to induce an AIDS-like disease in mice (Hanna etal., 1998). Many of these models are characterized by a thymicatrophy and a decreased cellularity of the thymus (Hanna et al.,1998). Moreover, Nef is required for pathogenicity and depletion ofthymocytes in SCID-Hu mice infected with HIV (Duus et al., 2001). Allthese observations point out to a role of HIV-1 directly affecting T-cell differentiation.

In vitro models designed to study human T cell developmentconstitute an interesting way to investigate the pathogenic effects ofHIV or its distinct genes on thymopoiesis. Using human-CD34+ seededin human or murine foetal thymic organ culture (FTOC), it has beendemonstrated that Nef induces a defect in the maturation ofthymocytes (Duus et al., 2001; Verhasselt et al., 1999). However,these systems do not allow to dissect precisely the impact of Nefexpression on the kinetics of differentiation of earliest stages of T celldevelopment. Until recently, such studies were limited by the lack of arobust system capable to assess the kinetics of the maturation of thoseearliest steps of T cell maturation. The recent demonstration thatmurineOP9 stromal cells engineered to express theNotch liganddelta-like 1 (OP9-DL1 system) are capable to induce the differentiation ofhematopoietic progenitors to DP CD4+CD8+ cells (Schmitt and Zuniga-Pflucker, 2002) led us to examine the effects of Nef expression onT-celldevelopment.

For this, Nef was expressed in hematopoietic CD34+ precursorsusing lentiviral vectors. Then, the T-cell potential of transduced cellswas assessed using the OP9-DL1 system. In parallel, the B and NKpotential of transduced progenitors was evaluated using adequateculture systems. Also, we estimated the impact of Nef on the frequencyof T, B and NK precursors.

Results

Lentiviral-mediated expression of Nef

Purified cord blood (CB) CD34+ cellswere transducedwith lentiviralvectors expressing wild type-Nef (Nef-WT) or an inactive myristoyla-tion-defective mutant (Nef-G2A), which no longer associates withcellular membranes (Sol-Foulon et al., 2004). About 18–24% of trans-duced cells expressedNef (mean: 18%+/−2.7 and22%+/−3.7, inNef-WTand Nef-G2A experiments, respectively; n=13), as judged by cyto-metric analysis (Fig. 1A). Nef-WT-transduced cells expressed a 27-kDaprotein as assessed by western blot (not shown). As compared to Nef-G2A-transduced cells, a 40% down-modulation of the mean fluores-cence intensities (MFI) of HLA class I staining was noted in Nef-WT-transduced cells (mean MFI: 268+/−42 versus 495+/−104) (P=0.006;n=13) resulting in an increase of gated HLAlow cells (Fig. 1B). Nef-WTHLAlow-transduced cells were sorted and analyzed for the content ofNef protein by intra-cytoplasmic staining. Fig.1C shows that these cellsexpressed a higher content of Nef than cells which did not modulateHLA class I molecules (Nef-WT HLAhigh). This indicates that lentiviral-transduced CD34+ cells express a biological active form of Nef.

Nef impairs the development of T-cell precursors

We asked whether Nef expression on early precursors could affectvarious stages of T-cell development. We have studied the differentia-tion of Nef-transduced CD34+ cells in an in vitro system allowing theanalysis of the kinetics of development of different precursor popula-tions. For this, Nef-G2A-transduced CD34+cells and HLAlow Nef-expres-singCD34+ cellswere sorted and cultured for 35 days onOP9-DL1 feedercells in the presence of IL-7 and FLT3L (La Motte-Mohs et al., 2005;Schmitt and Zuniga-Pflucker, 2002). Non-transduced (NT) CD34+ cellscultured in the same conditionswereusedas controls. Fig. 2A shows that

Fig. 1. Expression of Nef protein downregulates the expression of HLA class I molecules. Purified CB CD34+ cells were transduced or not (NT) with lentiviral vectors expressingwild type-Nef (Nef-WT) or an inactive myristoylation-defective mutant (Nef-G2A). Four days later expressions of: (A) intra-cytoplasmic Nef protein and (B) surface expression ofHLA class I molecules were assessed by flow cytometry (Nef-WT in black line, Nef-G2A in grey and isotype control in dashed line) (C) Nef expression was also assessed byimmunofluorescence staining in NT, Nef-G2A-transduced cells, and in HLAlow and HLAhigh sorted Nef-WT-transduced cells. One representative experiment out of 13 with similarresults is shown.

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purifiedNTCD34+ cells cultured in thepresenceof OP9-DL1 systemgaverise to CD5+CD1a+ precursor T cells at days 14. The majority of theselatter cells expressed intracellularly CD3ɛ antigen (not shown). Analysisof TCRβ rearrangement of sorted CD5+intraCD3ɛ+CD1a+ showed thatthese cells exhibited a polyclonal D-Jβ rearrangement similar to con-trol thymocytes, demonstrating that these cells represent an early stepof T-cell differentiation (Fig. 2B). A small percentage of CD4+CD8− cellsexpressing intraCD3ɛ+molecule (CD4 ISP)was detectable at day 14 (b5%of cells) and increased significantly up to 15% at day 21 (not shown).Thereafter, the proportion of CD4 ISP decreased (around 10% at day 28)while the generation of double positive CD4+CD8+ precursor T cellsincreases (20%–45% at days 28–35) (Fig. 2A).

Day 14 analysis of the generation of CD5+intraCD3e+CD1a+precursor T cells from Nef-WT-transduced CD34+ cells showed a 50%reduction as compared to Nef-G2A-transduced cells (mean: 8+/−3.4%compared with 15+/−3.2% and 17+/−8% for Nef-G2A- and NT-trans-duced CD34+ cells, respectively; P=0.02 for comparison between Nef-WT- and Nef-G2A-transduced cells; n=3) (Fig. 3). At day 28, thefrequency of CD4 ISP and DP CD4+CD8+ generated from Nef-WT CD34+

cells averaged 6+/−3.1% and 4+/−1.4%, respectively. These percentages

were on average 60% lower to those observed with Nef-G2A-trans-duced CD34+ cells which gave rise to 16.5+/−6% of CD4 ISP (P=0.01)and 15+/−5.4% of DP CD4+CD8+ cells (n=3) (P=0.001). In the sameculture conditions, NT CD34+ cells generated 15.3+/−4.3% and 13+/−3%of CD4 ISP and DP CD4+CD8+ cells, respectively (n=3) (Fig. 3B). Ac-cordingly, an average two-fold reduction in the proliferation of Nef-WT-transduced cells was noted as compared to NT CD34+ cells at day28 period (Fig. 3A).

These results indicate that Nef expression impairs the develop-ment of various stages of T cell precursors.

Nef expression impairs the differentiation of NK, but not B lymphocytes

In order to investigatewhether Nef expression could impact on non-T cell potential of hematopoietic progenitors, transduced cells werecocultured with murine MS5 stromal cells in the presence of IL-2, IL-15and SCF that allows the differentiation of NK and B lymphocyte pre-cursors (Lefort et al., 2006) (Fig. 4A). Fig. 4B shows that the rate of cellproliferation of transduced and NT control cells did not differsignificantly and averaged 10–12-fold increase at week 3 of the culture

Fig. 2. T-cell differentiation of ex vivo purified CD34+ progenitors cultured on OP9-DL1 stromal cells. Purified CB CD34+ cells were cultured on OP9-DL1 for 35 days. T celldifferentiation assessed by phenotypic analyses performed at days 14, 21, 28 and 35 is shown. One representative experiment out of 4 is shown. PCR analysis of the TCRβrearrangement of sorted CD5−intraCD3ɛ−CD1a− (lane 1) and CD5+intraCD3e+CD1a+ (lane 2) generated at day 14 from ex vivo purified NT CD34+ cells cultured on OP9-DL1 cellscompared to thymocyte controls (lane 3). CD5+intraCD3ɛ+CD1a+ cells exhibited a polyclonal D-Jβ rearrangement similar to control thymocytes, demonstrating that these cellsrepresent an early step of T-cell differentiation. Integrity of DNA was assessed by PCR of the Bcl6 gene.

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(n=3). Nef-WT-transduced cells gave rise to 4.6+/−2.1% of CD19 B cells,which was not significantly different from those derived from NT- orNef-G2A-transduced cells (3.5+/−1.5% and 4.5+/−2%, respectively; n=4)(Fig. 4C). In contrast, the generation of CD56+NKcellswasdiminishedby50% in cultures initiated with Nef-WT-expressing cells (13.15+/−5.5%)compared with Nef-G2A (28+/−8%) and NT cells (27.1+/−9.4%) (P=0.01;n=4).). In some experiments, Nef-WT-transduced CD34+ cells werecultured on OP9-DL1 without sorting of HLAlow Nef-expressing CD34+

cells. In these conditions, the generation of NK CD56+ cells was anaverage 35% lower than those observed with Nef-G2A-transduced cells(not shown).

These results indicate that Nef impairs the differentiation of NKprecursors while B cell differentiation is not affected.

Nef expression in CD34+ progenitors diminishes the frequency of T/NKearly precursors

The above results suggested that Nef interferes with the differentia-tion of an early precursor with a T and/or NK potential. To determinequantitatively the effect of Nef on these precursor frequencies, weperformed limiting dilution analyses of the T and NK cell potential oftransduced and NT CD34+ cells cultured either on OP9-DL1 or MS5stromal cells. First, we found a dramatic reduction in the number ofwellswithvisible growthwhenOP9-DL1wellswere seededwithNef-WTHLAlow-expressing cells indicating a global reduction in the frequencyof progenitors with T potential (Fig. 5A). This result was confirmed byphenotypic analysis showing that Nef-WT HLAlow-transduced cellsdisplayed a lower frequency of early CD5+intraCD3ɛ+CD1a+ precursorT cells (1/120) compared with non-transduced (1/75) and Nef G2A-transduced CD34+ cells (1/50) (Fig. 5B). Similarly, the frequency of NKprecursors was significantly decreased in Nef-WT HLAlow CD34+ cells (1/100) as compared to Nef-G2A (1/25) and NT CD34+ cells (1/65) (Fig. 5C).These results indicate that Nef hampers the earliest stages of thedifferentiation of CD34+ cells affecting a lymphoid precursor orientedtowards the T and/or NK differentiation.

Discussion

In this study, we demonstrate that HIV-1 Nef expression in theabsence of other viral genes hampers the T and NK cell potential ofhuman hematopoietic progenitors. Using adequate culture systemsallowing the identification of earliest stages of Tcell differentiation, weshow that the generation of T cells from CD34+ progenitors is affectedat a CD3ɛ+CD5+CD1a+ precursor stage that has initiated a D-J rear-rangement of the TCRβ locus. Subsequent stages of T cell develop-ment were also affected with a quantitative reduction of CD4 ISPand DP CD4+CD8+ TCRαβ T cells. Nef also decreased the generation ofCD56+NK cells whereas B cell production was not affected. Limitingdilution analyses demonstrated a significant reduction in thefrequency of T/NK progenitors among Nef-expressing CD34+ cells.Collectively, these data indicate that Nef interferes with the differ-entiation of a primitive lymphoid precursor with a T/NK potential.

Other groups have addressed the question of the role of Nef in T celldevelopment using retrovirally transduced CD34+ precursors from thy-mus or cord blood grafted in vitro in murine thymic lobes or in vivo inhuman thymus of SCID-hu mice (Stove et al., 2005; Verhasselt et al.,1999). These studies provided important results showing that Nef-WTreduced the output of CD4 and CD8 Tcells. These effectswere associatedwith a significant down-modulation of T-cell precursor surface expres-sion of CD4 and CD8 molecules. These results suggested that Nef mayblock Tcell differentiation at the stage of positive selection since the lossof these receptors may hamper positive selection of the T cell lineages(Itano et al., 1994; Rahemtulla et al., 1991). Using a panel of Nef mutantsimpaired in their capacity to down-modulate CD4 and CD8 molecules,Stove et al. showed that down-modulation of these receptors wasdispensable, or have aminor impact, on T-cell development (Stove et al.,

Fig. 3. Progression of precursor T cell differentiation of Nef-WT HLAlow or Nef-G2A-transduced CB CD34+ cells cultured on the OP9-DL1 stromal cells. (A) Rate growthof CD34+ cells transduced with lentivirus Nef-WT or Nef-G2A or not cultured onOP9-DL1 for 28 days (n=4). (B) Mean percentages of CD5+intraCD3ɛ+CD1a+ (D14),CD4+intraCD3ɛ+CD8− (CD4 ISP) (D28) and CD4+CD8+ DP cells (D28) generated fromNef-WT HLAlow and Nef-G2A-transduced and NT CD34+ cells (n=3). ⁎ Pb0.05 forcomparison either with control NT or Nef-G2A-transduced cells.

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2003). However, these results were discordant with those reportedby others showing that some Nef mutants defective in CD4 down-modulation do not induce thymic depletion in the SCID-hu model(Stoddart et al., 2003). Nef transgenic models gave also conflictingresults (Brady et al., 1993; Hanna et al., 2001; Skowronski et al., 1993).Some groups reported a correlation between the down-modulationeffect of CD4 expression and Nef pathogenicity (Brady et al., 1993;Skowronski et al.,1993). In contrast, Hanna et al. reported that AIDS-likedisease was abolished by mutating the prolin rich domain within Nefwhereas thismutant still down-modulates CD4 expression (Hanna et al.,2001). Therefore, these models did not allow determining preciselyat what stage Nef could interfere with T-cell development. Our re-sults provide arguments that Nef blocks T-cell development at an earlystage of development, before the positive selection or the TCRβ-selection. Moreover, the quantitative reduction in both the frequency ofintraCD3ɛ+CD5+CD1a+CD4−CD8− and NK precursors, while B cell gen-eration was unaffected, suggested that Nef interferes with an earlieststage of lymphoid development beyond the commitment towards TandNK lineages. Further experiments conducted at the clonal levelwould behelpful to determinewhether Nef blocks the differentiation of T and NKprecursors or a bipotential T/NK progenitor.

Themolecularmechanisms bywhichNef alters the development ofearly stages of lymphoid differentiation are not fully understood. Sincewe have studied the T/NK potential of CD34+ cells which have down-modulatedHLA class Imoleculeswe cannot rule out that this biologicaleffect impacted on the potential of CD34+ cells. Nevertheless,we foundthat non-sorted Nef-transduced cells have a decrease potential thatwas intermediate (30% reduction) between purified class I HLA lowcells and Nef-G2A-transduced cells (not shown).

Nef protein is posttranslationally modified by phosphorylation andmyristoylation, which targets Nef to the cell membrane. We foundthat mutation of this site abolished the effect of Nef on the reduction

of the T/NK potential of CD34+ hematopoietic cells. However,inhibition of Nef targeting to the cell membrane abolishes not onlyCD4 and HLA class I expression but also all other cellular functions ofNef. Our results suggest that Nef expression led to the depletion ofearliest precursors (CD5+CD1a+intraCD3+) at a stage before expres-sion of surface CD4 molecules. Alternatively, we cannot rule out thatmore mature precursors (CD4ISP) were depleted concomitantly to thedown-modulation of CD4 molecules. However, in long term cultures,we did not detect a down-modulation of CD4 expression on DP cellsgenerated from Nef-WT-transduced CD34+ cells (see Fig. 3) despite apersistent, but low, expression of Nef four weeks after initiation of cellcultures (not shown).

Several studies have reported an interaction between Nef andcellular signal transduction pathways. A highly conserved prolin richmotif within the core domain of Nef is able to associate in vitro withthe SH3 domains of Src-kinases lck, Fyn, Lyn, and Hck resulting in amodulation of their catalytic activities. In FTOC experiments, retro-viral transduction of CD34+ thymic progenitors with various mutantsin SH3 binding domain attenuated the blockade of T-cell develop-ment but did not give a completely normal thymopoiesis (Stove et al.,2003). Similarly, Nef transgenic mice model showed that mutation ofthe SH3-binding domain of Nef abolished its pathogenic effects.These results indicated that many of the pathogenic effects of Nef arerelated to an increase of T cell activation through a TCR-dependentmechanism (Schrager and Marsh, 1999; Simmons et al., 2001). Ourresults showed that Nef might also interact with signaling pathwaysindependent of the TCR at a stage characterized by the absence of aTCR CD3 complex expression.

We found that Nef expression impaired the differentiation of T cellprogenitors but not the proliferation of CD34+ cells cultured eitherin the presence of IL-7 on OP9-DL1 stromal cells or in conditionsadequate for B and NK differentiation in the presence of IL-2, IL-15 and

Fig. 4. Evaluation of B and NK lymphoid potential of Nef-WT HLAlow or Nef-G2A-transduced CB CD34+ cells cultured onMS5 stromal cells. (A) Differentiation of CD19+ B and CD56+ NKcells from NT CD34+ cells cultured on MS5 stromal cells for 21 days in the presence of IL-2, IL-15 and SCF. (B) Growth rate of NT, Nef-WT HLA low and Nef-G2A-transduced CD34+ cellscultured on MS5 stromal cells in the presence of IL-2, IL-15 and SCF at day 21 (n=3). (C) Mean percentages of CD19+ B and CD56+ NK cells generated from Nef-WT HLA low Nef-G2A-transduced or NT CD34+ cells cultured on MS5 stromal cells at day 21 (n=4). ⁎ Pb0.05 compared with controls NT and Nef-G2A.

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SCF onMS5 stromal cells. Therefore, reduced differentiation of NK andT cell was probably not caused by a toxic effect of Nef expression butby a specific function in CD34+ progenitors.

Several studies have shown that Nef modulates the apoptoticmachinery although the exact role of Nef in apoptosis remains underdiscussion (Geleziunas et al., 2001; Xu et al., 1999). Nef expressionupregulates Fas and Fas ligand expression at the surface of T cell linesinducing the death of uninfected cells by a bystander mechanism (Xuet al., 1999; Zauli et al., 1999). On the other hand, Nef may suppressFas-mediated apoptosis of infected cells by interacting with ASK1, aserine/threonine kinase involved in apoptotic signaling by deathreceptors (Geleziunas et al., 2001). We did not detect any increase ofFas expression at the surface of Nef-expressing CD34+ cells (notshown). However, the effects of Nef on T cell survival could be largelydependent on the stages of cell differentiation and activation.

What could be the relevance of our observations for the physiopathol-ogyofHIV infection?ThemechanismsbywhichHIV impairs thymopoiesiscould occur as a result of direct HIV infection of thymocytes before re-lease from the thymus, thymic epithelia and/or HIV infection of CD34+cells and/oralteredCD34+ thymocytepotential. Although therehavebeen,reports of detection of HIV in bone marrow CD34+ cells, several studieshave indicated that these precursors appeared largely uninfected or at alower levels (Baillou et al., 2003; Neal et al., 1995; Stanley et al., 1992; vonLaer et al., 1990; Weichold et al., 1998; Zauli et al., 1994). However thehypothesis that primitive precursorsmight be susceptible toHIV infectionis supported by the observation that both CD34+ cells and thymocytesexpress HIV co-receptors (Berkowitz et al., 1998; Deichmann et al., 1997;Ruiz et al., 1998; Zaitseva et al., 1998). Thymocytes at various develop-mental stages are susceptible to HIV-1 infection (Bonyhadi et al., 1993;Schnittman et al., 1990; Su et al., 1995; Valentin et al., 1994). In vitro,infection of CD34+ cells inhibits thymopoiesis in FTOC system and theprecortical and cortical stages of maturation (Knutsen et al., 1999). In thissystem, HIV infection of cord blood CD34+ cells not only depleted CD4+thymocytes but also earliest stages of thymocyte maturation at the triplenegatif stage.

Several groups provided evidence that HIV can infect the thymuswhich results in a reduced thymic output contributing possibly to thedecline or absence of restoration of the peripheral T-cell pool (Bonyhadiet al., 1993; Douek et al., 2001; Jamieson et al., 1994; Su et al., 1995). Wefound that T-cell stages generated from CB CD34+ progenitors are highlycomparable to ex vivo purified thymic precursors (JD Lelievre et al.,submitted) suggesting that the system we used may recapitulate thedifferentiation of physiologic steps of T-cell development. Our resultsshow that Nef expression by itself significantly reduces the capacityof T-cell production from earliest progenitors. It is interesting to notethat the differentiation of those precursors in the OP9-DL1 system, asseen in vivo, is highly dependent on IL-7 in the absence of which therate of death of Nef-expressing precursors seemedmore pronounced(not shown). Whether Nef interferes with the signaling of a survivalfactor such as IL-7 is under investigation.

Potent antiviral drugs are capable to control the emerged part ofthe iceberg of virus replication. The demonstration that residualexpression of crucial HIV proteins such as Nef may continuously affectthe capacity of restoration of the immune system is not withoutconsequences. This observation reinforces the rationale for the use ofimmune intervention acting at the earliest stages of T-cell develop-ment. Likely, the recent advent of IL-7 as a potential therapeutic tool inHIV-infected patients is a good promise (Levy, 2006).

Materials and methods

Cell preparation

Human cord blood (CB) samples were collected with the informedconsent of themothers according to approved institutional guidelines.CD34+ cells were purified by immunomagnetic selection (Stemcelltechnologies Inc, Vancouver, BC, Canada;Miltenyi Biotec, Paris, France)as described by the manufacturer. Purity of CD34+ cells exceeded 90%

Fig. 5. Evaluation of the frequency of T and NK cell precursors in Nef-WT HLAlow or Nef-G2A-transduced CB CD34+ cells. (A) Plating efficiency of NT, Nef-WT HLAlow and Nef-G2A-transduced CD34+ cells cultured on OP9-DL1 feeder cells. (B) Limiting dilutionanalysis of the frequency of CD5+CD3i+ early precursor T cells. Cultured on OP9-DL1with IL7 and FLT3L. Ten, fifty or one hundred NT, Nef-WT HLAlow or Nef-G2A-transdu-ced cells were directly sorted onto OP9-DL1 cells and analyzed by FACS at day 14.(C) Limiting dilution analysis of CD56+ NK cells cultured onMS-5 stromal cells with IL-2,IL-15, andSCF.Ten,fiftyoronehundredNT,Nef-WTHLAloworNef-G2A-transducedcellsweredirectly sortedontoMS-5cells andanalyzedbyFACSatday14of theculture. CD5+intraCD3ɛ+and NK frequencies were calculated as the reciprocal of the concentration of cells thatresulted in N63% positive wells (dotted lines) using Poisson method. One representative oftwo experiments with similar results.

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and isolated cells were frozen in 90% fetal calf serum (FCS, Hyclone,Perbio, France) 10% DMSO (Sigma, St Quentin Fallavier, France).

Murine stromalMS-5 cells wereweekly passaged in α-MEM (GibcoBRL, Cergy Pontoise, France) supplemented with 10% FCS (Hyclone,Perbio). OP9 cells co-expressing eGFP (OP9-gfp) and the human Delta-1 (referred to as OP9-DL1) (kindly provided by E. Six) weremaintainedin α-MEM supplemented with 20% FCS (Hyclone, Perbio) andpassaged twice a week. All cell lines were incubated at 37 °C, in airatmosphere saturated with humidity and with 5% CO2.

Lentiviral vector preparation

pHR'Nef and pHR'Nef-G2A lentiviral vector encoding the HIV LAI(also termed R7) Nef wild type gene or a non-myristoylated Nef genemutant (under the control of the elongation factor-1α promoter) wereprepared and used as described (Sol-Foulon et al., 2004). p24concentrations of lentiviral vectors were between 2 and 6 µg/mL.

Transduction protocol

Human CD34+ populations were preincubated into 12-wells at5×105 cells/mL for 24 h in α-MEMwith 20% FCS (Hyclone, Perbio) in thepresence of four recombinant (r) human (hu) cytokines: stem cell factor(SCF, 100 ng/mL), Flt3-ligand (FL, 100 ng/mL), interleukine-3 (IL-3,60 ng/mL) and thrombopoietin (TPO, 10 ng/mL) (all purchased fromAbcys s.a., Paris, France) (Sirven et al., 2001). Cells (3 to 5×105 cells/mL in300 μL into 48-wells) were then exposed, in the same medium, with50 ng/well viral p24 of concentrated lentiviral vector particles andcentrifuged for 90min at 1500 rpm. 20% FCSwas added 24 h after. Non-transduced cells were kept under the same culture conditions. Cellswere then collected and washed four days later. Nef expression wasanalyzed by flow cytometry (FACScalibur, Becton-Dickinson, Pont deClaix, France) and the Nef functionality was verified by analysis of theMHC-I expression. HLAlow-expressing cells were sorted by a cell sorterEPICS ELITE (Beckman Coulter, Roissy DCG, France).

Immunofluorescence staining

Cells were coated on glass coverslips in 24-well plates precoated bypoly-L-lysine (Sigma). Cells were then fixed 15 min in 4% paraformal-dehyde-phosphate-buffered saline (PBS) (PFA) and permeabilized15 min by in 0.05% saponin–0.2% bovine serum albumin in PBS(PBSap). After permeabilization, cells were incubated for 30 min atroom temperature with Anti-Nef mAb MATG 020 (Sol-Foulon et al.,2004) (1/1000) in PBSap and after washing, incubated for 30 minwithsecondary antibody. Confocal microscopy was performed on a LeicaTCS4D instrument.

Assessment of the T cell potential of CD34+ cells

Five to ten×104 sorted human hematopoietic stem cells (CD34+)were added per individual well of a 6-well plate confluent with OP9-DL1 cells in α-MEM (Gibco BRL) with 20% FCS (Hyclone, Perbio), rhu-IL-7 (2 ng/mL) and rhu-FL (5 ng/mL). Cocultures were disaggregatedby vigorous pipetting and passaged through a 70-μm filter to reducestromal cell line aggregates and eliminate contaminating OP9 cellsand human hematopoietic stem cells were deposed on a new wellplate confluent with OP9-DL1 in the same medium twice a week asdescribed (La Motte-Mohs et al., 2005). At different times cells wereremoved to analyze T-cell differentiation by flow cytometry.

For cultures at limiting dilutions, one day before the culture, 96-wellplates were coated with gelatin 0.1% (Sigma) during 1 h, and platedwith OP9-DL1 cells. When cells were confluent, they were treated with10 µg/mLmitomycin C (Sigma) during2 hwhich avoid repeated transfersonto new feeder. Cells were next washed twice. Then, 10, 50 and 100transduced CD34+ cells were deposited on OP9-DL1 cells using the

automatic device of the cell sorter. Cells were cultured in α-MEM with20% FCS plus rhu-IL-7 (2 ng/mL) and rhu-FL (5 ng/mL) and every weekhalf medium was changed. After 4 weeks, wells containing more than200cellswerephenotyped for thepresenceof precursorCD5+CD1a+CD3ɛintracellular+ T cells by flow cytometry.

Assessment of the NK and B cell potential of CD34+ cells

Five to ten×103 sorted CD34+were added per individual well in 48-well plates with confluent MS-5 stromal cells in RPMI 1640 (GibcoBRL), supplemented with 10% human AB serum, 5% FCS (Stemcelltechnologies Inc, Vancouver, BC, Canada), rhu-IL-2 (10 ng/mL), rhu-IL-15 (1 ng/mL), and rhu-SCF (50 ng/mL) as previously described(Reynaud et al., 2003). Every week, half medium was changed. Cellswere collected after 2 and 3 weeks in culture and their expression ofNK and B cell specific antigens was analyzed by flow cytometry.

For cultures at limiting dilutions, 10, 25 and 50 transduced cellswere deposited using the automatic device of the cell sorter in 96-wellplates precoated with confluent MS-5 cells in and cultures maintainedas described above. After 3 weeks, wells that contained visible growthwere scored positive for NK (CD56+) cells by flow cytometry.

Cell phenotyping by flow cytometry

The following murine anti-human mAbs directly conjugatedwith fluoresceine isothyocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) or PE-cyanin5 (PE-Cy5) were used: CD1a-PE, CD3e-FITC, CD4-PE, CD5-PE-Cy5, CD8-PE-Cy5, CD19-PE, and CD56-PE-Cy5 from Immunotech-Beckman-Coulter and HLA-ABC-PE from Dako. Briefly, cells wereincubated with the appropriate mAbs at 4 °C for 20 min, washed inPBS/0.5% BSA and then fixed in PBS containing 1% PFA (Sigma). Forthe intracellular expression of CD3ε, cells were fixed in PBS con-taining 1% PFA during 10 min at 4 °C. After washing, cells wereincubated with the mAb CD3ε at 4 °C in 0.1% saponin in PBS andwashed again. For the intracellular staining of Nef, cells were fixed15 min in 1% PFA, permeabilized and stained 30 min with anti-NefmAb MATG 020 in PBSap at room temperature and then with goatanti-mouse Ig AlexaFluor-647 (Molecular Probes, Cergy Pontoise,France). Analysis was performed on a FACScalibur (Becton-Dick-inson) using Cellquest software.

Molecular analysis of TCR gene rearrangements

Genomic DNA was extracted using DNA easy tissues kit (Qiagen).PCR were performed in a volume of 50 μL containing 200 mol/Ldeoxynucleotide priphosphates (dNTPs), 2 mM MgCl2 and 0.5 U DNApolymerase (Invitrogen, Life Technologies Carlsbad, California, USA).Primers for Dβ-Jβ amplifications were Dβ1.1 and TBR1 as previouslyreported (Lefort et al., 2006). PCR conditions were performed underthe following conditions: 5 min at 94 °C; 35 cycles of 60 s at 94 °C, 60 sat 63 °C; and 7 min at 72 °C. The amplified fragments were separatedon 1.8% agarose gels and visualized by ethidium bromide staining.

Statistic analysis

Statistical analyses were performed by using the paired Student's ttest. The data were expressed as means±standard error (SE) of themean. p values of N0.05 were considered to be not significant. T cellfrequencieswe calculated as the reciprocal of the concentration of cellsthat resulted in ≥63% positive wells using Poisson statistics and theweighted mean method.

Acknowledgments

This work is supported by grants from ANRS (Agence Nationale deRecherche sur le SIDA et les hépatites). CD was funded by a fellowship

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from the ANRS and SIDACTION. FB was funded by a fellowship fromthe ANRS. JDL was funded by a fellowship from SIDACTION.

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215C. Dorival et al. / Virology 377 (2008) 207–215

II. SUITE DE L’ÉTUDE 

 

A. Introduction 

 

L’infection du thymus dans la pathologie SIDA entraine une incapacité de l’organisme à renouveler le 

pool de cellules T naïves. Sous thérapie antirétrovirale, le nombre de cellules T naïves provenant du 

thymus est augmenté (Douek, McFarland et al. 1998; Dion, Bordi et al. 2007). L’infection par  le VIH 

perturbe  fortement  le  développement  T  comme  il  a  été  montré  chez  des  enfants  séropositifs 

(Gaulton, Scobie et al. 1997) ou dans chez les souris SCID‐hu infectées par le VIH (Su, Kaneshima et al. 

1995;  Jamieson, Uittenbogaart et al. 1997). Dans  ce dernier modèle, nef a été montré  comme un 

facteur  important dans  la  réplication virale. Le VIH agit  sur  l’hématopoïèse, en effet,  la culture de 

moelle  osseuse  provenant  de  patients  infectés  par  le  VIH  témoignent  d’une  faible  capacité  de 

prolifération et de différenciation des précurseurs CD34+ (Marandin, Katz et al. 1996; Sloand, Young 

et  al.  1997),  l’hématopoïèse  est  donc  affectée.  On  a  alors  un  défaut  de  production  et  de 

renouvèlement  des  cellules  T  ce  qui  contribue  de manière  très  active  au  développement  de  la 

pathologie SIDA.  

Nous  avons montrés  que  l’expression  de  la  protéine Nef  dans  des  précurseurs  hématopoïétiques 

CD34+  de  sang  de  cordon  affecte  la  génération  des  cellules  T  à  un  stade  précoce  alors  que  la 

production de cellules B n’est pas affectée. Nef semble réduire de manière significative la fréquence 

des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ (Dorival, Brizzi et al. 2008).  

Le système mis au point pour étudier la différenciation T précoce des précurseurs hématopoïétiques 

CD34+ est dépendant des signaux délivrés par les couples Notch/Notch ligand et IL7/IL7R. Dans cette 

seconde partie du  travail nous avons émis  l’hypothèse que  la diminution du nombre de  cellules T 

pourrait être due à un phénomène apoptotique. Afin de décrypter les mécanismes intervenant dans 

cette  altération  du  potentiel  T  des  précurseurs  hématopoïétiques  exprimant Nef,  nous  avons  fait 

exprimer  la protéine Nef dans  les précurseurs hématopoïétiques CD34+ de sang de cordon à  l’aide 

des vecteurs  lentiviraux  codant pour  la protéine Nef  sauvage ou  le mutant Nef‐G2a  (mutant non‐

myristoylé, le rendant incapable de se fixer à la membrane plasmique). 

Nous  avons  également  étudié  l’effet  de  l’IL7/IL7R  et  les  voies  de  transduction  de  l’IL7R  sur  les 

mécanismes de mort cellulaire induite par Nef. 

 

79

B. Matériel et Méthodes 

 

Préparation des cellules 

Des prélèvements de sang de cordon ont étés récupérés après consentement des mères en accord 

avec  les  directives  administratives.  Les  cellules  CD34+  sont  purifiées  par  sélection  magnétique 

(Stemcell technologies Inc, Vancouvert, BC, Canada) suivant le protocole du fabriquant. La pureté des 

cellules CD34+ est toujours supérieure à 95%. Les cellules sont ensuite congelées dans 90% de sérum 

de veau fœtal (FCS, Hyclone, Perbio, France) et 10% de DMSO (Sigma, St Quentin Fallavier, France) 

avant d’être utilisées. 

Les cellules OP9 exprimant  le  ligand de Notch Delta‐1 (OP9‐DL1) (Provenant du  laboratoire d’E. Six) 

sont cultivées dans du α‐MEM avec 20% de FCS (Hyclone, Perbio). Les cellules sont passées deux fois 

par semaine et incubées à 37°C avec 5% de CO2 dans l’air. 

Les PBL (peripheral blood  lymphocyte) sont récupérés après Ficoll et adhérence des échantillons de 

sang provenant de l’EFS (Etablissement Français de dont du sang). Les cellules sont ensuite purifiées 

pour le CD4 par sélection magnétique (CD4+ T Cell Isolation Kit II, Miltenyi Biotec SAS, Paris, France) 

suivant le protocole du fabriquant. 

 

Vecteurs lentiviraux 

Les  vecteurs  lentiviraux pHR’Nef et pHR’Nef‐G2A  codant pour  le  gène Nef  sauvage du VIH  LAI ou 

pour  le gène mutant non‐myristoylé de Nef nous ont été gracieusement donné par O. Schwartz et 

sont préparés comme décrit dans  l’article  (Sol‐Foulon, Esnault et al. 2004). Les deux  lentivirus sont 

sous le contrôle du promoteur de l’EF1‐α (Elongation fator‐1α). 

80

Protocole de transduction 

Les cellules CD34+ sont incubées dans des plaques 12 puits à une concentration de 5 x 105 cellules/mL 

pendant 24h dans du α‐MEM avec 20% de FCS  (Hyclone, Perbio) en présence de quatre cytokines 

humaines :  stem  cell  factor  (SCF,  100ng/mL),  Flt3‐Ligand  (FL,  100ng/mL),  interleukine‐3  (IL‐3, 

60ng/mL) et de la thrombopoïétine (TPO, 10ng/mL) (toutes provenant de Abcys s.a., Paris, France)*. 

Les cellules  (3 à 5 x 105cellules/mL dans des plaques p48) sont ensuite mises en présence de 50ng 

p24/puit  de  vecteur  lentiviral.  Les  cellules  sont  centrifugées  pendant  90min  à  1500  rpm  dans  le 

même milieu mais  sans  sérum. 24h plus  tard, 20%  FCS est  ajouté dans  les puits.  Les  cellules non 

transduites (NT) sont cultivées dans les mêmes conditions de culture. Les cellules sont récupérées et 

lavées  4  jours  plus  tard.  L’expression  de  la  protéine  Nef  est  observée  par  cytométrie  de  flux 

(FACScalibur, Becton‐Dickinson, Pont de claix, France) : les cellules sont fixées 10 min en PFA 2% puis 

incubées  30 min  dans  une  solution  de  saponine  0.1%  à  4°c    avec  l’anticorps  anti‐Nef : mouseAb 

MATG 020 au 1/1000 (Sol‐Foulon, Esnault et al. 2004). Après lavage, les cellules sont incubées dans la 

même solution avec l’anticorps secondaire anti‐mouse‐A647 (Dako) au 1/100 pendant 30 min à 4°C.   

La fonctionnalité de la protéine Nef déterminée par l’expression du CMH‐I. Un marquage est réalisé 

avec  l’anticorps  anti‐HLA‐ABC‐PE  (Dako).  Les  cellules  exprimant  faiblement  le  CMH‐I,  nommées 

HLALow  sont  triées  sur un  trieur MoFlo  (Beckman‐Coulter,  Fullerton, Californie).  Les autres  cellules 

passent également dans le trieur. 

 

Analyse de l’Apoptose 

150 x 103 cellules CD34+ par puits sont misent en culture dans des plaques p96 avec ou sans OP9‐DL1. 

Les  cellules  sont  cultivées dans un milieu  α‐MEM  reconstitué dans de  l’eau milliQ en présence de 

20% de SVF avec de  l’IL7 humaine  (2ng/mL) et du FLT3‐L humain  (5ng/mL)  (Swainson, Kinet et al. 

2007).  L’inhibiteur  des  caspases  z‐VAD.fmk  ou  l’antagoniste  de  l’interaction  Fas/Fas‐L  (ZB4)  sont 

ajoutés en début de culture. Après 16 heures de culture, les cellules sont lavées avec du PBS 1x puis 

marquées avec  le CD45‐PE pendant 30min afin de discriminer  les cellules CD34+ des cellules OP9‐

DL1.  Les  cellules  sont  ensuite  marquées  par  de  l’AnnexineV‐Fitc  ou  –PE  pendant  15  min  à 

température  ambiante  dans  le  noir  ou  par  du  Dioc6  pendant  15  min  à  37°C  dans  le  noir.  Un 

FACScalibur est utilisé pour analyser les cellules. 

 

81

PCR quantitative / Real time PCR 

La totalité de l’ARN cellulaire est extrait en Trizol (Invitrogen). L’ARN est traité avec de la RNase‐free 

DNase I (Qiagen) et la reverse transcription est réalisée selon le protocole AffinityScript QPCR cDNA 

synthetisis  Kit  (Stratagene)  suivant  le  protocole  du  fabriquant.  Les  cDNA  sont  dilués  au  1/10  afin 

d’être utilisés comme échantillons pour  la PCR en temps réelle. La PCR en temps réelle est réalisée 

selon le protocole Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene). Les conditions de PCR sont 

d’un cycle d’activation de la Taq 10min à 95°C puis de 40 cylces (15 sec à 95°C, 30 sec à 60°C et 15sec 

à  72°C)  puis  1  cycle  de  dissociation  (1min  à  95°C,  30sec  à  60°C  et  30sec  à  95°C).  La    séquence 

spécifique  des  primers  pour  BimEL  est :  Sens,  5’‐ATCCCCGCTTTTCATCTTTA‐3’  et  Anti‐sens,  5’‐

AGGACTTGGGGTTTGTGTTG‐3’ ;  pour  BCL2 :  Sens,  5’‐GAGGATTGTGGCCTTCTTTG‐3’  et Anti‐sens,  5’‐ 

ACAGTTCCACAAAGGCATCC‐3’ et pour BCL‐XL : Sens, 5’‐ CATGGCAGCAGTAAAGCAAG‐3’ et Anti‐sens, 

5’‐ TGCTGCATTGTTCCCATAGA‐3’. 

L’expression  de BCL2, BCL‐XL  et Bim  est  normalisée  pour  chaque  échantillon  à  partir  du  gène  de 

ménage S14 (Sens, 5’‐GGCAGACCGAGATGAATCCTCA‐3’ et Anti‐sens, 5’‐CAGGTCCAGGGGTCTTGGTCC‐

3’).  La méthode  des    Ct  (quantification  relative  normalisée  par  un  calibrateur)  est  utilisée  pour 

normaliser tous les échantillons. Les échantillons sont normalisés avec le S14 et l’expression relative 

est calculée par rapport au calibrateur (les cellules non transduites) par la méthode [Delta][Delta]Ct. 

Le  ratio normalisé de  chaque échantillon par  rapport au  calibrateur a été  calculé  comme  suit : 2–

[delta][delta]Ct , la formule se détaillant en  [delta][delta]Ct = [delta]Ct,échantillon ‐ [delta]Ct,reference (NT). 

 

Transfection des cellules par AMAXA et plasmides 

La  transfection  des  cellules  a  été  réalisée  avec  l’appareil  Amaxa  Nucleofector  II  (Amaxa).  La 

transfection  a  été  réalisée  en  suivant  le  protocole  Amaxa.  Les  réactifs  pour  les  cellules  T  (T  cell 

nucleofector kit) a été utilisé et le programme de transfection U14 a été utilisé pour les cellules non 

activées. Des cellules  fraiches uniquement ont été utilisées. Les plasmides Nef‐WT et Nef‐AS  (anti‐

sens) proviennent   d’isolat VIH‐1 LAI. Le plasmide anti‐sens  rend complètement  inactif  la protéine 

résultante. Ces deux  plasmides,  sous  le  contrôle du promoteur du  cytomegalovirus, nous ont  été 

fournis par O. Schwartz. Le plasmide GFP (green fluorescent protein) pmaxGFP est fourni dans le kit 

AMAXA.  2µg  de  plasmide/5  x  106  cellules  ont  été  utilisés.  Les  cellules  sont  ensuite  remisent  en 

culture  que  ce  soit  dans  du milieu  complet  sans  cytokines  (RPMI,  10%  de  SVF)  ou  avec  de  l’IL7 

humaine [10ng/mL] (Swainson, Kinet et al. 2007). 

 

82

Marquages des cellules pour la cytométrie en Flux 

Les cellules sont récupérées et fixées dans du PBS contenant 2% de PFA pendant 10 min à 37%C. Le 

marquage  intracellulaire  anti‐Bcl2  est  réalisé  à  l’aide  de  l’anticorps  Anti‐human  bcl2 

oncoprotein/Fitc, clone 124 (Dako France S.A.S., Trappes, France). Après un  lavage,  les cellules sont 

perméabilisées dans une solution de PBS/saponine 0.1% pendant 20 min a  température ambiante. 

Les cellules sont ensuite mises en présence de l’anticorps au 1/50ème pendant 30 min à température 

ambiante. Le marquage intracellulaire de stat5 est réalisé avec l’anticorps anti‐Phospho‐Stat5 (Y694) 

Alexa fluor 488 (BD Biosciences), les cellules sont perméabilisées en méthanol 100% froid pendant 30 

min dans  la  glace.  Les  cellules  sont  ensuite  lavées  et  incubées  avec  l’anticorps pendant  60 min  à 

température  ambiante.  Les  cellules  sont  lavées  et  analysées  à  l’aide  d’un  cytomètre  en  flux 

FACScalibur (Becton‐Dickinson) ainsi que du logiciel Cellquest. 

 

Analyses statistiques 

Les analyses statistiques sont réalisées en utilisant le test Wilcoxon. Les valeurs sont exprimées avec 

la moyenne  ±  l’écart  type  de  la moyenne.  Les  valeurs  de  p>0.05  sont  considérées  comme  non 

significatives.  

 

 

 

 

 

 

83

C. Résultats 

 

Expression de Nef dans les cellules CD34+ transduites 

Les  cellules  CD34+  purifiées  (Dorival,  Brizzi  et  al.  2008)  sont  transduites  par  un  vecteur  lentiviral 

exprimant  la protéine Nef‐WT ou une  forme  inactive défectueuse dans son site de myristoylation : 

Nef‐G2A. Cette forme mutante de la protéine Nef est incapable de se fixer à la membrane plasmique 

(Sol‐Foulon,  Esnault  et  al.  2004).  Après  transduction,  entre  18  à  24%  des  cellules  transduites 

expriment Nef‐WT ou Nef‐G2A  (Figure 1A). De plus 40% de diminution de  l’intensité moyenne de 

fluorescence des molécules de CMH de classe  I est observée dans  les cellules transduites avec Nef‐

WT (Figure 1B). 

 

 

25

Nef-WT

35

Nef-G2A NT

Nef

B

HLA-ABC

Nef-G2AMFI : 270Nef-WTMFI : 240

Figure 1.   L’expression de Nef dans les précurseurs CD34+. 

Les précurseurs sont  transduits ou non  (NT) avec des vecteurs  lenti‐viraux exprimant  les protéines virales Nef‐WT  ou  un mutant  de Nef : Nef‐G2A. Quatre  jours  après  transduction,  (A)  l’expression intracellulaire de Nef  et (B) l’expression de surface des molécules HLA de classe I sont analysée par cytométrie en flux. 

 

 

84

Nef induit la mort des précurseurs hématopoïétiques par apoptose 

Nous avons ainsi évalué la fréquence de cellules AnnexineV+ dans les précurseurs hématopoïétiques 

ainsi que  l’effet du stroma sur  la survie cellulaire, 12 à 16h après que  les cellules CD34+ exprimant 

Nef‐WT aient été mises en culture sur les cellules OP9‐DL1 ou non. Dans les conditions de culture en 

présence  d’OP9‐DL1,  le  pourcentage  (Moyenne,  Ecart  type)  des  cellules  en  apoptose  est 

significativement  supérieur  dans  les  cellules  exprimant Nef‐WT  (37  ±  14)  par  rapport  aux  cellules 

exprimant Nef‐G2a (26 ± 11) ou les cellules CD34+ non transduites (NT) (27 ± 11) (p < 0.05) (Figure 1 A 

& B). De même dans  les conditions d’étude sans  feeder, on obtient une  fréquence des cellules en 

apoptose significativement supérieure dans les cellules exprimant Nef‐WT (37 ± 16) par rapport aux 

cellules exprimant Nef‐G2a (18 ± 8) (P < 0.01), aux cellules CD34+ NT (17.5 ± 8) (P < 0.01), aux cellules 

GFP‐  (10 ± 7)  (P < 0.05), GFP+  (17 ± 9)  (p < 0.05) ou aux cellules Nef‐WT HLAHigh  (9 ± 3)  (p < 0.05) 

(Figure 1C). Aucune différence n’est observée entre les deux conditions de culture.  

 

Figure 1.   L’expression de Nef engendre l’apoptose des précurseurs CD34+. 

Les cellules CD34+ NT, Nef‐WT, Nef‐G2A ou GFP, transduites et purifiées sont marquées (AnnexineV+) après 12 à 16 heures de culture. (A) Les résultats d’une expérience sur 6 donnant les mêmes résultats est présentée, après culture sur OP9‐DL1.  Le pourcentage des cellules positives pour l’AnnexineV+ en présence d’OP9‐ DL1  (B)  (n=6) ou sans  feeder  (C)  (n=4). La significativité est annotée par rapport à Nef‐WT HLALow.   * P<0,05 ; ** P<0,01 

85

L’apoptose des précurseurs CD34+  induite par l’expression de Nef dans est indépendante de la voie 

des caspases et de l’interaction Fas/Fas‐L 

  Il a été montré que Nef pouvait  induire  la mort des cellules via  les  interactions Fas/Fas‐L (Xu, 

Laffert et al. 1999; Zauli, Gibellini et al. 1999). Afin de déterminer l’implication de cette voie dans la 

mort cellulaire observée, les cellules transduites par Nef‐WT et Nef‐G2a, en culture pendant 12 à 16h 

sur les cellules OP9‐DL1 ou sans feeder, ont été incubées avec z‐VAD.fmk, un inhibiteur des caspases 

(Figure 2A) ou avec ZB4 un antagoniste de  l’interaction Fas/Fas‐L  (Figure 2B). La mort des cellules 

Nef‐WT n’est pas diminuée en   présence de   z‐VAD.fmk ou de ZB4. Ces résultats montrent   que  la 

mort des cellules ne passe pas par  la voie Fas/Fas‐L et que  l’expression de Nef dans  les précurseurs 

hématopoïétiques CD34+ induit une forte mortalité qui est indépendante de la voie des caspases. 

 

Figure 2.   L’apoptose induite par l’expression de Nef dans les précurseurs CD34+  est indépendante 

de la voie des caspases et de l’intéraction Fas/Fas‐L. 

    Les cellules CD34+ NT, Nef‐WT ou Nef‐G2A transduites et purifiées sont mises en culture en présence d’OP9‐ DL1 ou sans feeder et incubées soit avec  (A) l’inhibiteur des caspases z‐VAD.fmk ou (B) l’antagoniste de la liaison Fas/Fas‐L ZB4, au début de la culture puis marquées en AnnexineV+ après 12 à 16 heures de culture (n=3).  

86

Atteinte du Potentiel mitochondrial dans les précurseurs CD34+  exprimant Nef‐WT 

  Enfin nous avons voulu déterminer si l’atteinte des précurseurs passait par une déstabilisation 

mitochondriale indépendamment de la voie des caspases. Nous avons pour cela marqué les cellules 

dans  les mêmes  conditions  que  précédemment  avec  le marqueur  DIOC6  qui  s’incorpore  selon  le 

potentiel  transmembranaire mitochondrial.  Dans  ces  conditions,  le  pourcentage  (Moyenne,  Ecart 

type) des cellules ayant subit une déstabilisation mitochondriale est significativement supérieur dans 

les  cellules exprimant Nef‐WT HLALow  (41 ± 20) par  rapport aux  cellules Nef‐G2a  (19 ± 6), Nef‐WT 

HLAHigh (14 ± 5),  GFP‐ (17 ± 6) ou aux cellules CD34+ non transduites (22 ± 8) (P<0,05) (Figure 3). 

 

 

 

Figure 3.   Atteinte du Potentiel mitochondrial dans les précurseurs CD34+  exprimant Nef‐WT. 

(A) Les résultats d’une expérience sur 4 donnant les mêmes résultats est présentée.  Le pourcentage de cellules Dioc‐ est indiqué dans chaque échantillon. 

(B) Pourcentage des cellules CD34+ NT, Nef‐WT HLAlow, Nef‐WT HLAHigh, Nef‐G2A ou GFP‐ négatives pour le DIOC6 après 12 à 16h de culture sans feeder (n=4). La significativité est annotée par rapport à Nef‐WT HLALow. * P<0,05 

   

87

Une  des  limites  du  travail  sur  les  précurseurs  hématopoïétiques  est  le  faible  nombre  de 

cellules disponibles qui  limite un certain nombre d’analyses notamment biochimiques. Nous avons 

donc décidé d’étudier en parallèle un autre modèle qui soit moins  restrictif. Nous avons  reproduit 

des expériences d’expression de Nef par des lymphocytes ou PBL primaires périphériques, ainsi que 

dans des lignées T immortalisées représentant des stades précoces de la différenciation lymphoïde T. 

Plusieurs lignées cellulaires T ont été testées : Jurkat, CEM ou SupT1. Les cellules ont étés transduites 

ou transféctées et  l’apoptose observée après 4  jours de culture sous différentes conditions, que ce 

soit de sensibilisation à  la mort par déprivation de  sérum ou en conditions de culture normale. La 

mortalité qui était observée dans  le modèle de précurseurs CD34+ n’a pas été  retrouvée dans  les 

lignées. Nous montrons donc  les résultats obtenus avec  les  lymphocytes T ou PBL primaires qui ont 

donnés des résultats similaires aux précurseurs hématopoïétiques. 

88

Nef‐WT induit la mort des PBL par déstabilisation mitochondriale 

Nous avons alors décidé de tester  l’effet de Nef dans  les PBL (peripheral blood  lymphocyte) afin de 

voir si  l’on   retrouvait cette mortalité. La protéine Nef a donc été surexprimée dans ce modèle par 

transfection Amaxa et nous avons évalué la fréquence de cellules Dioc‐ dans ces cellules 8h après la 

transfection des cellules. Un contrôle de  l’efficacité de transfection a été réalisé en transfectant  les 

cellules en parallèle avec la GFP. A 8h, l’expression de la GFP est de 50 à 70%. Dans ces conditions, la 

fréquence  des  cellules  entrées  en  apoptose  est  significativement  supérieure  dans  les  cellules 

exprimant Nef‐WT  (P=0.02) par  rapport aux cellules non  transféctées mais  justes choquées  (Mock) 

ou par rapport aux cellules exprimant Nef‐AS (P=0.005) (Figure 4). 

 

 

Figure 4.   Atteinte du Potentiel mitochondrial des PBL  exprimant Nef‐WT. 

(A) Les résultats d’une expérience sur 3 donnant les mêmes résultats est présentée. Le pourcentage de cellules Dioc‐ est indiqué dans chaque échantillon.  

(B) Pourcentage des cellules Mock, Nef‐AS ou Nef‐WT négatives pour  le Dioc6 8h après transfection (n=3). La significativité est annotée par rapport à Nef‐WT HLALow. * p<0,05 

   

89

90

  L’IL‐7 est une des cytokines essentielle au cours du développement  lymphoïde et de  la survie 

cellulaire.  En  effet  la  fixation  de  l’IL‐7  sur  son  récepteur  déclenche  des  voies  de  survie  et  de 

prolifération, qui passent notamment par les voies Jak/Stat. Nous avons donc voulu étudier l’effet de 

l’IL‐7 sur la survie des cellules exprimant Nef‐WT. Nous n’avons pas pu étudier ce phénomène sur les 

précurseurs hématopoïétiques car  la survie des CD34+ est dépendante de  la présence d’IL‐7 dans  le 

milieu de culture (Magri, Yatim et al. 2009). Nous avons donc observé  l’effet de  l’expression de Nef 

dans les PBL. 

 

L’IL‐7 ne permet pas de protéger de la mort les PBL exprimant Nef‐WT 

  Nous n’avons pas observé d’amélioration de la survie cellulaire en présence de 10ng/mL d’IL‐7 

dans  notre  modèle.  Le  pourcentage  (Moyenne,    Ecart  type)  de  cellules  en  apoptose  dans  les 

conditions  controles  (Mock)  sans  IL7  (32  ±  14)  ont  peu  de  variation  avec  les  cellules Mock  en 

présence d’IL7 (38 ± 2), de même que pour  les cellules Nef‐AS sans  IL7  (36 ± 18) comparativement 

aux cellules Nef‐As en présence d’IL7 (45 ± 4) ou enfin les cellules Nef‐WT (49 ± 16) par rapport aux 

cellules en présence d’IL7  (57 ± 5). Les variations ne sont pas significatives mais on observe même 

une  légère tendance à  l’augmentation de  la mort cellulaire en présence d’IL7. Quoi qu’il en soit,  la 

mortalité est  toujours  significativement plus  forte dans  les  cellules exprimant Nef‐WT par  rapport 

aux Mock (P = 0.02) avec ou sans IL7 ou en comparaison avec les cellules Nef‐AS (P = 0.005) (Figure 

5).  

 

Figure 5.   L’IL‐7 ne diminue pas la mort dans les PBL  exprimant Nef‐WT. 

Pourcentage  des  cellules NT, Nef‐AS  ou Nef‐WT  négatives  pour  le Dioc6  8h  après  transfection  en présence ou non d’IL7 [10ng/mL] (n=3). 

Les voies qui induisent la survie cellulaire passent entre autre par la transcription des protéines de la 

famille  BCL2  comme  BCL2  lui‐même  et  BCL‐XL.    Nous  avons  recherché  si  la  transcription  de  ces 

facteurs était modifiée par Nef‐WT. 

 

La transcription des molécules anti‐apoptotiques BCL2 et BCL‐XL n’est pas modifiée par Nef‐WT 

dans les précurseurs hématopoïétiques. 

Nous  avons  recherché  si  la  transcription  de  ces  facteurs  était  modifiée  par  Nef‐WT  par  PCR 

quantitative (Figure 6). Une légère diminution de l’expression de BCL‐XL est observée dans les cellules 

exprimant  fortement  Nef‐WT  comparativement  aux  cellules  non  transduites  (P=0.08)  tandis 

qu’aucune  différence  n’est  observée  avec  les  cellules  exprimant Nef‐G2a  (P=0.47)  ou  les  cellules 

exprimant  faiblement  Nef, Nef  HLAHigh  (P=0.5).  En  ce  qui  concerne  BCL2,  la  transduction  en  elle‐

même semble augmenter  la  transcription de BCL2. Cependant aucune différence significative n’est 

observée entre  les différentes conditions. Nef‐WT ne semble donc pas  induire une diminution de  la 

transcription des acteurs anti‐apoptotiques BCL2 ou BCL‐XL. 

 

 

Figure 6.   Expression relatives de BCL2 et BCL‐XL. 

Les cellules CD34+ NT, Nef‐WT, Nef‐G2A, transduites et purifiées sont prélevées après 12 à 16 heures de culture  (n=3). L’ARN est extrait puis  rétrotranscrit et  l’expression   des gènes BCL2 et BCL‐XL est analysé par RT PCR quantitative.   

91

Nef n’influence pas l’expression du facteur anti‐apoptotique BCL2 dans les PBL 

  De même, dans ce modèle nous avons voulu voir si Nef intervenait dans les voies qui induisent 

la survie cellulaire. Pour cela nous avons observé l’intensité moyenne de fluorescence de la protéine 

BCL2 dans  les PBL, 8h après transfection  (Figure 7A). Aucune différence d’expression de BCL2 n’est 

observée dans les PBL après transfection (Figure 7B). 

 

Figure 7.   Intensité moyenne de fluorescence de la protéine anti‐apoptotique BCL2 dans les PBL. 

(A)  Les  résultats d’une expérience  sur 3 donnant  les mêmes  résultats est présentée.  La  valeur de l’intensité  moyenne  de  fluorescence  est  annotée  dans  chaque  échantillon.  La  ligne  pointillée représente l’anticorps contrôle et la bleu le marquage BCL2. 

(B)  Intensité moyenne de  fluorescence de BCL2 dans  les cellules Mock, Nef‐WT et Nef‐AS 8h après transfection (n=3). 

 

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Aucune différence n’est observée sur l’expression du facteur anti‐apoptotique BCL2 en présence d’IL‐7 dans les PBL 

  Nous avons également voulu déterminer  si  la voie de  l’IL‐7 était modifiée par Nef‐WT, nous 

avons étudié  l’expression de BCL2 après stimulation des cellules avec ou sans IL‐7. Aucune différence 

d’expression n’est observée avec Nef‐WT par rapport aux autres conditions (Figure 8). On n’observe 

d’ailleurs  que  très  peu  de  variation  de  l’expression  de  BCL2  après  ajout  d’IL‐7.  Elle  est  en  fait 

légèrement augmentée dans chaque expérimentation, mais cela n’apparait pas dans l’histogramme à 

cause des variations de la MFI de BCL2 inter‐expérimentation.  

 

Figure 8.   MFI de la protéine BCL2 dans les PBL après transfection avec ou sans présence d’IL‐7. 

(A)  Les  résultats d’une expérience  sur 3 donnant  les mêmes  résultats est présentée.  La  valeur de l’intensité  moyenne  de  fluorescence  est  annotée  dans  chaque  échantillon.  La  ligne  pointillée représente l’anticorps contrôle et la pleine le marquage BCL2. 

(B)  Intensité moyenne de fluorescence de BCL2 dans  les cellules Mock, Nef‐WT et   Nef‐AS 8h après transfection avec ou sans IL‐7 [10ng/mL] (n=3). 

93

Nef n’augmente pas la transcription de la protéine pro‐apoptotique BIM dans les précurseurs 

CD34+ 

  Une des voies d’induction de  l’apoptose est contrôlée par  le facteur de transcription Foxo3a. 

Ainsi dans des conditions de survie cellulaire  (signalisation par des cytokines comme  l’IL‐7),  la PI3K 

phosphoryle ses protéines cibles telles que AKT qui ensuite inactive par phosphorylation la protéine 

Foxo3a, facteur de transcription de  la protéine pro‐apoptotique Bim (Dijkers, Medema et al. 2000). 

Nous  avons  donc  voulu  étudier  l’état  de  phosphorylation  de  la  protéine  Foxo3a,  en  posant 

l’hypothèse  que  Nef  serait  impliquée  dans  l’activation  de  ce  facteur  de  transcription  pro‐

apoptotique. Nous nous sommes heurtés a de nombreux problèmes techniques concernant  la mise 

au point d’un western Blot anti‐phospho‐Foxo3a. Nous avons alors choisi une approche indirecte par 

PCR quantitative de la protéine cible de ce facteur de transcription : BIM. Nous avons donc étudié si 

la transcription de BIM était modifiée par Nef‐WT (Figure 9). En prenant les cellules non transduites 

comme contrôle, aucune variation de la transcription n’est observée dans nos conditions de culture.  

 

 

Figure 9.   Expression relative de la protéine pro‐apoptotiques BIM. 

Les cellules CD34+ NT, Nef‐WT, Nef‐G2A, GFP‐ et GFP+ transduites et purifiées sont prélevées après 12 à 16 heures de culture (n=3) et une qPCR est réalisée pour le gène BIM.   

 

 

 

  

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Nef‐WT ne préviens pas l’activation du facteur de transcription Stat5 dans les précurseurs CD34+ 

Les  voies  qui  pourraient  permettre  la  survie  cellulaire  et  qui  passent  par  la  transcription  des 

protéines de  la famille BCL2 qui peuvent être  induites par des facteurs de croissances ou cytokines 

par  l’intermédiaire  de  la  voie  JAK‐STAT  (Grad,  Zeng  et  al.  2000).  Une  fois  activées  par 

phosphorylation,  les protéines Stat5  transloquent dans  le noyau et  induisent  l’expression de gènes 

cibles. Or, il a récemment été montré que Nef perturbait de manière très importante l’expression du 

facteur  anti‐apoptotique  Stat5  (Prost,  Le  Dantec  et  al.  2008)  entraînant  une  perte  du  potentiel 

multipotent des progéniteurs hématopoïétiques. 

Nous  avons  donc  étudié  l’expression  de  Stat5‐P  par  les  précurseurs  hématopoïétiques  exprimant 

Nef‐WT  (Figure 10 A  et B).  Les  résultats préliminaires  semblent montrer que dans nos  conditions 

d’expérimentation, l’expression de Nef ne diminue pas l’expression de Stat5‐P. 

 

Figure 10.   Phosphorylation de la protéine anti‐apoptotique Stat5 dans les précurseurs CD34+. 

(A)  Les  résultats d’une expérience  sur 2 donnant  les mêmes  résultats est présentée.  La  valeur de l’intensité  moyenne  de  fluorescence  est  annotée  dans  chaque  échantillon.  La  ligne  pointillée représente l’anticorps contrôle et la bleu le marquage STAT5‐P. 

(B)  Intensité moyenne de  fluorescence  (MFI) de  l’expression de  Stat5‐P par  les  cellules CD34+ NT, Nef‐WT HLAlow, Nef‐WT HLAHigh et  Nef‐G2A après 12 à 16h de culture en l’absence de feeder (n=2). 

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Nef‐WT semble prévenir partiellement l’activation du facteur de transcription Stat5 dans les PBL 

Enfin, de même que pour  les cellules CD34+, nous avons voulu déterminer  si  le blocage de  la voie 

Stat5  était  impliqué dans  la mort des PBL  (Figure 11 A  et B). Après  transfection,  les  cellules  sont 

mises  ou  non  en  présence  d’IL‐7  et  la  phosphorylation  de  Stat5  est  observée.  Une  nette 

augmentation  de  la  phosphorylation  en  présence  d’IL7  est  observée  dans  toutes  les  conditions. 

Cependant, l’activation de Stat5  (MFI: Mean Fluorescence Intensity) est plus faible dans les cellules 

exprimant Nef‐WT (5 ± 2) en comparaison avec les cellules Mock (10 ± 3) et Nef‐AS (9 ± 5).  

 

 

Figure 11.   Phosphorylation de la protéine anti‐apoptotique Stat5 dans les PBL. 

(A)  Les  résultats d’une expérience  sur 3 donnant  les mêmes  résultats est présentée.  La  valeur de l’intensité moyenne  de  fluorescence  est  annotée  dans  chaque  échantillon.  La  ligne  en  pointillés représente l’anticorps contrôle et la noire le marquage STAT5‐P.  

(B) MFI de  la protéine STAT5‐P dans  les cellules Mock, Nef‐WT et   Nef‐AS 8h après transfection en présence d’IL‐7 [10ng/mL] ou non (n=3) 

   

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D. Conclusion 

 

  Au cours de ces expériences, nous avons montré que  l’expression Nef  induit  l’apoptose dans 

les précurseurs CD34+ et dans  les PBL. Cette apoptose est  indépendante de  la voie des caspases et 

des  récepteurs de mort. De plus  il  semblerait qu’elle passe par une déstabilisation mitochondriale 

dans  les deux modèles. L’analyse des facteurs de survie n’a pas permis de montrer un effet de Nef 

sur l’expression de BCL2 ou de BCL‐XL et l’IL7 ne permet pas de limiter la mort des CD34+ ou des PBL 

exprimant Nef. Cependant ces résultats semblent montrer une diminution de l’expression de STAT5 

par  les PBL exprimant Nef. Ceci n’a pas été mis en évidence dans  les expériences réalisées avec  les 

cellules  CD34+.  Cependant,  nous  n’avons  pas  pu  réaliser  une  étude  complète  de  l’expression  de 

STAT5‐P par ces cellules en raison du faible nombre de cellules disponibles. 

  La voie  IL7/IL7‐R est une voie de survie qui par  la phosphorylation du facteur Foxo3a permet 

une  inactivation de ce  facteur et une diminution de  la  transcription de BIM. Malheureusement,  la 

mise au point du western Blot anti‐Foxo3a‐P(T32) a été très difficile en raison du faible nombre de 

cellules  CD34+  et    de  faible  expression  de  Foxo3a  dans  les  PBL. Une manière  indirecte  d’étudier 

l’influence de cette voie a été l’analyse par RT‐PCR de l’expression de BIM. Nous n’avons pas mis en 

évidence  une  variation  d’expression  de  BIM  par  les  cellules  exprimant  Nef,  cependant  les 

expériences sont à compléter.  

En conclusion,  l’analyse de ces résultats orientent clairement vers un effet pro‐apoptotique de Nef 

tant au niveau des précurseurs hématopoïétiques que des lymphocytes T primaires. Cette apoptose 

impliquant une déstabilisation mitochondriale. Ces résultats sont compatibles avec d’autres résultats 

du  laboratoire (Laforge, Petit et al. 2007) et nous ouvre  la voie sur  l’exploration des  interactions de 

Nef avec les voies mitochondriales dans la physiopathologie du VIH. 

 

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98

  

  

  

  

  

 

 

  

DISCUSSION & PERSPECTIVES

  

Au  cours  de  cette  thèse,  nous  avons montré  que  l'expression  de Nef  en  absence 

d'autres  gènes  viraux  bloquait  le  potentiel  T  et  NK  des  précurseurs  hématopoïétiques 

humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation 

du potentiel mitochondrial. 

  Grâce à  l’utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant  la différenciation des 

cellules T jusqu’au stade double positif, nous avons montré que la génération de cellules T à 

partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du 

TCRβ.  Les  stades  suivant du développement T  sont aussi affectés, en effet, une  réduction 

quantitative du nombre de CD4  ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue 

aussi  la  génération  de  cellules NK  CD56+  alors  que  la  production  de  cellules  B  n’est  pas 

affectée dans un  système de  culture MS5. Des  analyses par dilution  limite montrent une 

réduction  significative  de  la  fréquence  des  précurseurs  T/NK  parmi  les  cellules  CD34+ 

exprimant  Nef.  De  manière  générale  ces  résultats  montrent  que  Nef  interfère  avec  la 

différenciation des précurseurs lymphoïdes ayant un potentiel T/NK.  

Les  patients  infectés  par  le  virus  de  l’immunodéficience  humaine manifestent,  en 

dehors de  lymphopénies, de multiples déficiences hématologiques associées au  syndrome 

d’immunodéficience    acquise.  Ces  déficiences  montrent  un  dysfonctionnement  de 

l’hématopoïèse  probablement  dû  à  l’altération  des  cellules  souches  hématopoïétiques 

(Verhasselt,  Naessens  et  al.  1999).  La  controverse  selon  laquelle  les  cellules  souches 

hématopoïétiques sont susceptibles ou non d’être  infectées   existe (Steinberg, Crumpacker 

et al. 1991; Zauli, Re et al. 1992; Zauli, Re et al. 1992; Zauli, Re et al. 1992; Zauli, Furlini et al. 

1994; Zauli and Capitani 1996; Kearns, Bahner et al. 1997; Weichold, Zella et al. 1998). En 

effet,  il  a  été  montré  par  certaines  équipes  que  la  pré‐incubation  des  CD34+  avec  des 

souches  de  VIH  M  ou  T  tropiques  entrainait  dans  un  système  de  culture  épithéliale 

thymique, une détérioration en deux semaines de la production thymique. Dans cette même 

expérience, les auteurs ont montrés qu’un faible pourcentage (1 à 2%) des cellules souches 

CD34+ étaient également p24+ 48 heures après incubation avec les souches virales (Knutsen, 

Roodman et al. 1999). L’hypothèse selon laquelle les CD34+ seraient susceptibles à l’infection 

par le VIH est soutenue par le fait qu’elles expriment les corécepteurs CXCR4 et CCR5 (Ruiz, 

Cicala et al. 1998; Knutsen, Roodman et al. 1999). Plusieurs rapports ont également montré 

de faible taux de cellules CD34+ VIH+ dans la moelle osseuse. On peut se demander toutefois 

99

si  l’impact physiologique d’une  infection si  faible est‐elle réellement visible sur  la globalité 

de la pathologie SIDA. Quoi qu’il en soit, l’infection par le VIH peut empêcher la maturation 

des CD34+ par un certain nombre de mécanismes  indépendamment de  l’infection directe : 

inhibition par des cytokines comme  le TNFα ou  induction de  l’apoptose (Stanley, Kessler et 

al. 1992; Banda, Tomczak et al. 1997). L’importance ici, est d’observer l’impact de la protéine 

Nef du VIH en dehors du contexte de  l’infection par  le VIH.  Il a été montré que  la protéine 

Nef pouvait pénétrer dans des cellules B primaires non infectées (Qiao, He et al. 2006) aussi 

bien que dans différentes lignées hématopoïétiques ou non‐hématopoïétiques (Alessandrini, 

Santarcangelo et al. 2000; Olivetta, Percario et al. 2003; Varin, Manna et al. 2003; Mangino, 

Percario et al. 2007) en présence de cellules voisines infectées ou par l’ajout de Nef dans le 

milieu  de  culture  (Michael,  Herman  et  al.  1999; Mangino,  Percario  et  al.  2007).    Nef  a 

récemment  été  décrit  comme  étant  capable  de  pénétrer  dans  les  cellules  lymphoïdes 

primaires après son ajout dans  le milieu de culture  (Qiao, He et al. 2006). Prost et al. ont 

montrés  que  10ng/mL  de  la  protéine  recombinante  Nef  est  suffisant  pour  affecter  la 

fonctionnalité  des  cellules  CD34+  (Prost,  Le  Dantec  et  al.  2008).  Il  est  donc  possible  que 

l’action du VIH  sur  les précurseurs hématopoïétiques passe par Nef et  cela  sans  infection 

directe.  Des  études  ont  été menées  sur  le  sujet  en  utilisant  également  des  précurseurs 

CD34+ transduits par un retrovirus exprimant Nef. En effet, Verhasselt et al. ont utilisés des 

précurseurs thymiques ou de sang de cordon, injectés dans un système FTOC ou in vivo dans 

des souris SCID‐hu et ainsi montré un défaut du renouvellement du pool de cellules T naïves 

périphériques.  Ils  ont  montré  une  altération  du  développement  des  cellules  T  dans  le 

thymus,  c'est‐à‐dire  une  diminution  du  nombre  de  cellules  ainsi  qu’une  diminution  de 

l’expression  du  CD4  et  du  CD8  dans  les  cellules  exprimant  Nef.  Ils  n’ont  pas  noté 

d’augmentation de  l’apoptose dans  les thymocytes exprimant Nef (Verhasselt, Naessens et 

al. 1999; Stove, Van de Walle et al. 2005 ).   Une autre équipe a par ailleurs développé des 

souris  transgéniques  pour  le  gène Nef  sous  le  contrôle  du  promoteur  du CD4,  ces  souris 

présentent  tous  les  syndromes  d’immunodéficience  incluant  une  perte  de  poids,  une 

atrophie  thymique et une mort prématurée  (Simard, Chrobak et al. 2002).  Ils ont observé 

une réduction du nombre de CD8+ et CD4+ périphériques, ce qui reflète un défaut thymique. 

Ces études ont donc montrées que Nef affectait le fonctionnement thymique en réduisant le 

rendement thymique des cellules CD4 et CD8.  

100

Cet effet est associé avec une diminution significative de l’expression de surface des 

molécules  CD4  et  CD8  à  la  surface  des  cellules  T.  Ces  résultats  suggèrent  que  Nef  peut 

bloquer la différenciation T au stade de sélection positive puisque la perte de ces récepteurs 

entrave la sélection positive de la lignée T (Rahemtulla, Fung‐Leung et al. 1991; Itano, Cado 

et al. 1994). A l’aide d’un panel de mutants de Nef dont certains mutés dans leur capacité à 

réguler  négativement  les  molécules  CD4  et  CD8,  Stove  a  montré  que  la  diminution  de 

l’expression des ces récepteurs n’était pas indispensable, voir même avait un impact mineur 

sur  l’interférence  du  développement  T  induit  par Nef  (Stove, Naessens  et  al.  2003). Nos 

résultats semblent montrer que Nef bloquerait  le développement T à un stade précoce de 

développement  avant  la  sélection  du  TCRβ.  De  plus,  la  réduction  quantitative  que  nous 

observons dans  la fréquence des cellules CD3εintra CD5+ CD1a+ CD4‐ CD8‐ et des précurseurs 

NK, alors que la génération des cellules B n’est pas affectée, suggère que Nef interfère a un 

stade très précoce du développement lymphoïde, avant l’engagement entre les lignées T et 

NK. 

Les mécanismes moléculaires par  lesquels Nef altère  le développement des  stades 

précoces du développement lymphoïde ne sont pas tous connus. Puisqu’un des effets de Nef 

est la régulation négative du CMH‐I nous ne pouvons pas exclure l’impact de ce phénomène 

biologique sur  l’effet observé sur  les CD34+ dans  le développement  lymphoïde. La protéine 

Nef  est modifiée  par  phosphorylation  et myristoylation,  ce  qui  permet  le  ciblage  de  la 

protéine à la membrane. Nous avons montré que la mutation de ce site abolie l’effet de Nef 

sur  la  réduction  du  potentiel  T/NK  des  cellules  hématopoïétiques  CD34+.  Cependant, 

l’inhibition du ciblage de Nef à la membrane abolie  les régulations négatives des molécules 

de CD4 et de HLA classe I mais aussi de nombreuses autres fonctions cellulaires de Nef. Nos 

résultats suggèrent que  l’expression de Nef amène à  la déplétion des précurseurs précoces 

(CD5+ CD1a+ intraCD3+) a un stade avant l’expression du CD4 à la surface. Nous ne pouvons 

cependant pas exclure que des précurseurs plus matures comme au stade CD4 ISP aient pu 

être déplétés à cause de la diminution d’expression du CD4+. 

  Nous avons posé  l’hypothèse d’une apoptose des cellules CD34+ exprimant Nef à un 

stade  précoce  du  développement  T.    Nous  avons  montré  qu’il  y  a  effectivement  une 

augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par 

rapport aux autres conditions. Cette apoptose n’est pas caspase dépendante puisque l’ajout 

101

de z‐VAD.fmk, un puissant inhibiteur des caspases ne diminue en aucun cas (sur OP9‐DL1 ou 

non)  la mort  des  cellules  exprimant Nef‐WT.   Nef  est  également  connu  pour  augmenter 

l’expression de Fas et Fas‐L à  la surface des  lignées cellulaires T,  induisant ainsi  la mort des 

cellules non infectées par un effet indirect (Xu, Laffert et al. 1999; Zauli, Gibellini et al. 1999). 

Cependant, ici, La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer en jeu puisque l’ajout d’un inhibiteur 

de cette voie : ZB4 n’entraîne aucune diminution de l’apoptose des précurseurs exprimant la 

protéine  Nef.    Nous  avons  par  ailleurs  pu  déterminer  que  l’atteinte  apoptotique  des 

précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6.   

  Puisque la voie intrinsèque de l’apoptose semble être déclenchée ici, nous avons voulu 

étudier si l’expression des facteurs anti‐apoptotiques BCL2 et BCL‐XL et pro‐apoptotique Bim 

étaient  modifiés.  Nous  n’avons  pas  observé  de  modification  de  la  transcription  de  ces 

facteurs,  de  plus  nous  nous  sommes  intéressés  aux  facteurs  de  transcriptions  de  ces 

protéines, notamment  la protéine Stat5   une  fois activée par phosphorylation,  transloque 

dans le noyau afin de déclencher la transcription des facteurs anti‐apoptotiques BCL2 et BCL‐

XL. Cependant nous n’avons pas pu observer de variations dans l’activation de ce facteur. En 

ce qui concerne  le facteur de transcription de Bim : FOXO3a, nous avons étés confrontés a 

plusieurs  problèmes  techniques :  une  quantité  insuffisante  de  cellules  pour  réaliser  un 

western  blot  ainsi  que  des  difficultés  à  reproduire  les  résultats  décrits  par  le  groupe  de 

Sekaly (van Grevenynghe, Procopio et al. 2008) pour la mise au point de l’anticorps Foxo3a‐

PT32. Nous avons donc décidé d’essayer de trouver un modèle d’étude similaire qui ne serait 

pas limitant en nombre de cellules. 

    Après avoir  testé un  certain nombre de  lignées  cellulaires T, nous n’avons pas 

réussi à retrouver une mortalité augmentée par la présence de Nef. Nous avons donc décidé 

de tester  l’effet de Nef dans  les PBL (peripheral blood  lymphocyte). La protéine Nef a donc 

été  surexprimée  dans  ce modèle.  Une  apoptose  significativement  plus  forte  a  été  ainsi 

observée dans les cellules transféctées par la protéine Nef‐WT comparativement aux cellules 

transféctées  par  la  protéine  Nef‐AS  ou  justes  choquées  (Mock).  Cette  apoptose  passe 

également par une atteinte du potentiel mitochondrial des PBL. Comme pour les CD34+, Nef 

ne  joue pas sur  l’expression du facteur anti‐apoptotique BCL2. Ces résultats ne concordent 

pas  avec  ceux  obtenus  par  Rasola  et  al.  qui montraient  que  Nef  augmente  la mort  des 

lignées T CD4+ après stimulation par des agents apoptotiques en réduisant  l’expression des 

102

protéines BCL2 et BCL‐XL et en augmentant  la dépolarisation mitochondriale. L’ajout de  z‐

VAD.fmk  dans  leurs  expériences  permettait  de  réduire  mais  pas  d’abolir  l’apoptose, 

impliquant également une voie caspase indépendant (Rasola, Gramaglia et al. 2001). 

  De nombreux facteurs sont essentiels au cours du développement lymphoïde. Une des 

cytokines majeures du développement T est  l’IL‐7. Le taux d’expression de  l’IL‐7Rα est très 

régulé  au  cours  du  développement  lymphoïde  afin  qu’à  chaque  stade  de maturation  les 

cellules  reçoivent  un  signal  adapté.  L’importance  de  l’IL‐7  au  cours  de  la  thymopoïèse  a 

notamment été montrée chez des souris par des expériences d’inactivation du récepteur de 

l’IL‐7. Le phénotype associé à cette déficience se traduit par une réduction de  la cellularité 

thymique  de  0,01%  à  10%  par  rapport  à  la  normale  accompagnée  d’un  déficit  des 

populations lymphoïdes T CD4+ et CD8+ avec un arrêt de la différenciation au stade précoce 

CD34+ (Peschon, Morrissey et al. 1994). Des résultats similaires ont étés obtenus par l’équipe 

de  Plum  et  Verhasselt  quand  ils  ont,  après  avoir  introduit  des  CD34+  humains  dans  un 

système FTOC, bloqués  le signal  IL7 par des anticorps neutralisants  (Plum, De Smedt et al. 

1996). L’IL‐7 est donc indispensable au développement T.  

  Au  cours  de  leur  différenciation  les  CD34+  que  nous  utilisons  sont  cultivées  en 

présence d’IL‐7 sur des cellules stromales OP9‐DL1. Elles reçoivent donc en plus du signal IL‐

7  indispensable  a  la  différenciation  T,  un  signal  Notch.  La  voie  de  signalisation  Notch 

participe à la différenciation et la prolifération des cellules en réponse à la liaison avec leur 

ligand présent sur  les cellules voisines  (Artavanis‐Tsakonas, Rand et al. 1999). En effet des 

résultats publiés dans  l’équipe montrent que  l’IL‐7 seule est suffisante pour  la survie et  la 

prolifération des cellules CD34+, des  ISP  (CD3‐CD4+CD8‐) et des DP  (CD3‐CD4+CD8+). L’ajout 

d’un  signal Notch  permet  de  potentialiser  l’effet  de  l’IL‐7  en  particulier  sur  les  CD34+  en 

maintenant  l’expression de  la chaîne α de  l’IL‐7 à  la surface des thymocytes au cours de  la 

différenciation (Magri, Yatim et al. 2009). 

    La fixation de l’IL‐7 sur la chaîne α de son récepteur permet le recrutement de la 

chaîne γc et l’hétérodimérisation des deux chaînes. Durant ce rapprochement, les chaînes α 

et γc apportent les kinases liées à leur domaine intracellulaire, respectivement Jak1 et Jak3. 

Ces  kinases  s’auto et  se  transphosphorylent afin d’augmenter  l’activation du  récepteur et 

leur  efficacité  enzymatique.  De  plus  les  protéines  Jak  phosphorylent    la  tyrosine  Y449, 

103

localisée dans la région T de la chaîne α, afin de permettre le recrutement de Stat5, par son 

domaine SH2, et d’autres protéines adaptatrices. Les protéines Stat5  transloquent dans  le 

noyau et  induisent  l’expression de gènes cibles  impliqués dans  la survie cellulaire  tels que 

Bcl‐2  (Jiang,  Li et  al.  2005). D’autres protéines  sont  également  activées par  cette  voie de 

signalisation telles que les kinases de la famille Src et la PI3K. Cette dernière étant elle aussi 

recrutée par la tyrosine Y449 phosphorylée et activée par phosphorylation de sa sous unité 

p85. La PI3K va pouvoir activer ses protéines cibles telles que AKT qui notamment  inactive 

par  phosphorylation  la  protéine  Foxo3a,  facteur  de  transcription  de  la  protéine  pro‐

apoptotique Bim  (Jiang, Li et al. 2005). Ainsi  l’ensemble de    la voie de signalisation  induite 

par l’IL‐7 induit la survie et la prolifération cellulaire. 

Nous avons donc voulu voir si dans ces conditions, Nef influait à un endroit de la voie 

de  transduction du  signal de  survie  IL7. Dans nos conditions,  l’expression du  récepteur de 

l’IL‐7 (chaîne α) n’est pas modifiée par Nef (data not shown) dans les PBL. Cependant, l’ajout 

d’IL‐7  ne  permet  pas  de  diminuer  la mort  des  PBL  et  dans  ce modèle,  Nef‐WT  semble 

prévenir  l’activation  de  Stat5.  En  effet,  Stat5  est  moins  phosphorylé  dans  les  cellules 

exprimant  la  protéine  Nef‐WT  par  rapport  aux  deux  autres  conditions.  Ce  qui  semble 

suggérer que Nef agirait sur  la phosphorylation de  la protéine Stat5,  inhibant ainsi  le signal 

de  survie  cellulaire.  En  effet,  pendant  la  réalisation  de mon  travail  de  thèse,  une  autre 

équipe  a montré  une  interférence  dans  la  signalisation  de  stat5  par Nef.  Stat5  est  donc 

apparu comme un candidat  idéal afin d’expliquer  le phénomène de mort cellulaire observé 

dans les CD34+ de sang de cordon exprimant Nef, le système de culture étant dépendant, au 

niveau de la survie cellulaire, de la présence d’IL‐7. Prost et al. ont ainsi montré que lors de 

l’infection par le VIH, les précurseurs perdaient leur potentiel hématopoïétique multipotent 

et que cela était corrélé avec la diminution de l’expression des protéines Stat5‐A et Stat5‐B. 

De plus,  ils ont montré que Nef était essentielle dans  la  régulation négative des protéines 

Stat5  et  à  l’origine  de  l’altération  du  potentiel  multipotent  des  précurseurs 

hématopoïétiques CD34+ (Prost, Le Dantec et al. 2008). Les précurseurs utilisés par l’équipe 

de Prost et al. proviennent de moelles osseuses de macaques. Après infection par le SIV de 

ces macaques, le potentiel multipotent des précurseurs hématopoïétiques recueillis dans la 

moelle  osseuse  est  étudié.  Ils  observent  alors  une  réduction  très  forte  du  potentiel 

hématopoïétique des CD34+. Cette observation est corrélée avec une très forte réduction de 

104

quantité  d’ARNm  de    STAT5‐A  et  STAT5‐B  et  un  niveau  protéique  indétectables  dans  les 

CD34+ provenant des macaques infectés. Cependant aucun génome viral n’est détecté dans 

ces  cellules.  Ils  supposent  alors  qu’un  facteur  soluble  est  responsable  du  défaut 

hématopoïétique  induit  par  le  SIV. Nef  est  en  effet  connu  pour  être  produit  en  grandes 

quantités rapidement après  l’infection et est présent dans  les particules virales, et dans  le 

sérum à des concentrations allant jusqu’à 10ng/mL (Fujii, Otake et al. 1996). La déplétion par 

ajout dans le plasma infecté d’anticorps anti‐Nef ou l’ajout de protéines Nef recombinantes 

au contact de précurseurs hématopoïétiques entraine des résultats  identiques à  l’infection 

par  le  SIV,  c'est‐à‐dire une  réduction  du  potentiel  hématopoïétique  des CD34+  de moelle 

osseuse ainsi qu’une diminution de  l’ARNm de STAT5‐A et ‐B. Nous n’avons pas observé de 

diminution  de  la  phosphorylation  de  la  protéine  STAT5‐A  dans  notre  système  de 

surexpression de Nef dans  les CD34+. Cependant  les précurseurs utilisés dans notre équipe 

proviennent  de  sang  de  cordon  humain  et  non  de  moelle  osseuse  simienne.  Le  mode 

d’expression  de  Nef  n’est  pas  non  plus  similaire,  nous  avons  utilisé  des  techniques  de 

surexpression  de  la  protéine Nef  dans  les  précurseurs  par  transduction  lentivirale  et  par 

transfection Amaxa dans les  PBL alors que la protéine Nef est utilisé comme facteur soluble 

ou bloquée par des anticorps anti‐Nef dans les expériences de Prost et al.   Enfin la cinétique 

d’étude n’est pas du tout  la même. D’autres équipes ont également montré que des souris 

transgéniques  pour  Stat5 :  STAT5ABΔn/Δn  ont  une  lymphopoïèse  fortement  anormale  avec 

peu de T CD8+ et de faibles réponses à l’IL‐2 par rapport aux animaux sauvages (Yao, Cui et 

al.  2006)  et  que  le  VIH‐1  entrainait  la  diminution  sélective  de  Stat5  dans  les  cellules  T 

purifiées de patients infectés (Pericle, Pinto et al. 1998). Dans notre modèle de CD34+, nous 

n’avons donc pas observé de variation de la phosphorylation de Stat5. Une analyse cinétique 

de l’expression de la protéine Stat5 par RT‐PCR et par western blot permettrait sûrement de 

conclure sur l’effet de Nef sur Stat5 dans ce modèle. 

Nous n’avons pas réussi à caractériser  le détail des mécanismes entrant en jeu dans 

l’apoptose  des  précurseurs  hématopoïétiques  après  expression  de  la  protéine  Nef. 

Contrairement  à nos  résultats, d’autres équipes n’ont pas  trouvé que  l’expression de Nef 

augmentait l’apoptose dans les thymocytes après plusieurs semaines de culture (Verhasselt, 

Naessens et al. 1999; Stove, Naessens et al. 2003; Stove, Van de Walle et al. 2005). Nous 

avons cependant montré que la voie déclenchée est indépendante des caspase et que nous 

105

observions  une  déstabilisation mitochondriale.  La  protéine  Nef  est  capable  d’inhiber  les 

signaux  apoptotiques  régulés  par  Bcl‐2,  à  travers  la  phosphorylation  de  la  protéine  Bad 

inhibant ainsi  son activité  (Wolf, Witte et al. 2001). D’un autre côté, d’autres équipes ont 

montrés que Nef pouvait  induire  l’apoptose en réduisant  l’expression de Bcl‐2 et de Bcl‐XL 

(Genini, Sheeter et al. 2001; Rasola, Gramaglia et al. 2001 ) ce qui provoque l’augmentation 

de  toutes  les  voies  d’apotose :  dépolarisation  mitochondriale,  activation  de  la  caspase 

3...etc.  Dans  notre  modèle,  nous  n’observons  pas  d’effet  de  Nef  sur  l’expression  des 

protéines Bcl‐2 ou Bcl‐XL. Plusieurs hypothèses restent encore à étudier afin d’élucider  les 

mécanismes d’apoptose mis en jeux par Nef dans notre modèle. Par exemple, Muthumani et 

al. ont montré que Nef pouvait  induire  l’augmentation de PD‐1  (Programmed death 1)  le 

récepteur  de  PDL‐1  induisant  ainsi  la mort  des  cellules  par  activation  de  la  p38 MAPK 

(Muthumani,  Choo  et  al.  2008).  Une  autre  équipe  a  montré  que Nef  interagissait 

directement  avec  la  protéine  p53  induisant  ainsi  l’apoptose  dans  des  lignées  T  CD4+ 

(Greenway, McPhee et al. 2002).  En effet, la protéine p53 est le facteur de transcription de 

Bax,  qui  en  se  dimérisant,  perfore  la membrane mitochondriale  et  permet  la  sortie  du 

cytochrome  C.  p53  peut  également  s’accumuler  dans  le  cytosol  pendant  l’apoptose  et 

fonctionner comme une protéine « BH3‐only » et donc se lier à Bax et l’activer (Chipuk and 

Green  2006).  Dans  la même  perspective,  Laforge  et  al.  ont montré  dans  un modèle  de 

lymphocytes TCD4+ purifiés que l’expression de la protéine Nef induisait la mort des cellules 

T CD4+ par pérméabilisation des lysosomes et relarguage de la cathepsine D (Laforge, Petit et 

al.  2007). On  a  alors  activation  de  la  protéine  Bax  et  déstabilisation mitochondirale.  Ces 

résultats sont d’ailleurs en accord avec ceux obtenus par Genini et al. à partir de cellules T 

CD4+  stimulées  par  la  PHA  et  l’IL‐2  qui  indiquent  que  la  réplication  du  VIH  aboutit  à  la 

phosphorylation de p53 permettant  l’augmentation de  l’expression de Bax qui est associée 

au relargage du cytochrome c et de l’AIF (Genini, Sheeter et al. 2001). L’étude de la p53, de 

BAX, de  l’AIF  et de  la  cathepsine D  semblent donc des pistes  intéressantes  et pourraient 

permettre d’expliquer le phénomène que nous avons observé. 

Les  individus  infectés  par  le  VIH  développent  un  syndrome  d’immunodéficience 

acquise qui est le résultat de la perte progressive des lymphocytes T CD4+, de la fonction des 

T  helper  et  d’une  mauvaise  présentation  par  les  cellules  présentatrices  de  l’antigène. 

L’incapacité de l’organisme à reconstituer un pool de cellules T naïves chez les patients SIDA 

106

est  en  parti  dû  à  une  inhibition  de  la  thymopoïèse  et  à  une  altération  du  potentiel  des 

précurseurs hématopoïétiques. En effet,  l’infection par  le VIH perturbe  le développement 

des  cellules  T  humaines  comme  il  a  été montré  chez  des  enfants  séropositifs  (Gaulton, 

Scobie et al. 1997) ou dans le thymus de souris SCID‐hu infectées par le VIH (Su, Kaneshima 

et al. 1995;  Jamieson and Zack 1998). Dans ce dernier modèle, Nef est nécessaire pour  la 

réplication  virale  et  la  déplétion  des  thymocytes  (Jamieson,  Aldrovandi  et  al.  1994; 

Aldrovandi  and  Zack  1996;  Aldrovandi,  Gao  et  al.  1998).  L’observation  de  souris 

transgéniques ont permit d’emmètre l’hypothèse que la protéine Nef, indépendamment de 

la présence de virus ou d’autres gènes du VIH, est responsable de la déplétion thymocytaire 

et possiblement de la progression de la pathologie en SIDA (Hanna, Kay et al. 1998; Hanna, 

Kay et al. 1998). L’ensemble des résultats réalisés lors de ce travail permettent d’approfondir 

les  connaissances  des  mécanismes  d’interférence  du  VIH  avec  l’hématopoïèse  et  plus 

précisément des actions de Nef sur l’hématopoïèse humaine. 

  

 

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