The Gs –Linked Receptor GPR3 The Gs –Linked Receptor GPR3 Maintains Meiotic Arrest in Maintains Meiotic Arrest in

Mammalian OocytesMammalian Oocytes

在哺乳動物卵母細胞內維持在哺乳動物卵母細胞內維持減數分裂初期停止的減數分裂初期停止的 Gs –Gs –

Linked Receptor GPR3 Linked Receptor GPR3

卵的成長卵的成長

第一次減數分裂第一次減數分裂

第二次減數分裂第二次減數分裂

Prophase ArrestProphase Arrest

初級卵母細胞在進行排卵作用時卵會停止初級卵母細胞在進行排卵作用時卵會停止在在第一次減數分裂的第一次減數分裂的 Prophase Prophase 的階段的階段 而本 而本次的實驗就是探討如何在此階段停止 並懷次的實驗就是探討如何在此階段停止 並懷疑其停止的原因是由於卵母細胞 細胞膜上疑其停止的原因是由於卵母細胞 細胞膜上擁有某種受器擁有某種受器 (Receptor)(Receptor) 可以接受 周圍細可以接受 周圍細胞所釋放出來的化學物質 來對卵母細胞進胞所釋放出來的化學物質 來對卵母細胞進行停止的調控行停止的調控

為何懷疑在卵母細胞膜上為何懷疑在卵母細胞膜上有受器有受器

把位於成熟濾泡內的卵母細胞把位於成熟濾泡內的卵母細胞 (( 已已prophase arrest)prophase arrest) 移出 發現卵母細胞會回移出 發現卵母細胞會回

復減數分裂復減數分裂 (resume meiosis (resume meiosis spontaneously)spontaneously)

Prophase Prophase 和 和 Metaphase Metaphase 在顯微鏡在顯微鏡下觀察的不同下觀察的不同

Prophase Prophase 核膜沒有破裂核膜沒有破裂 核仁是完整的核仁是完整的

Metaphase Metaphase 有染色體濃縮的現象有染色體濃縮的現象 有紡垂絲的形成有紡垂絲的形成

MetaphaseMetaphaseІІ and Metaphase and Metaphase ІІІІ

MetaphaseMetaphaseІІ 有紡垂絲 有紡垂絲 (spindle) (spindle) 沒有極體 沒有極體(polar body)(polar body)

MetaphaseMetaphaseІІІІ 有紡垂絲 也有極體 有紡垂絲 也有極體

MetaphaseMetaphaseІІІІ

Metaphase Metaphase ІІІІ((放大放大 ))

要使卵母細胞的減數分裂要使卵母細胞的減數分裂 prophase arrest prophase arrest 必必須活化在卵母細胞內的訊息分子須活化在卵母細胞內的訊息分子

而其中又以而其中又以 Gs proteinGs protein 最為重要 最為重要

Gs proteinGs protein

Gs protein Gs protein 是一種 是一種 G G 蛋白 蛋白

所謂的 所謂的 GG 蛋白就是可藉由一連串的蛋白活蛋白就是可藉由一連串的蛋白活化的過程 達成活化具有特殊功能的蛋白質化的過程 達成活化具有特殊功能的蛋白質來進行某種機制的運作 來進行某種機制的運作

以下是一般的 以下是一般的 G protein G protein 活化的過活化的過程程

Prophase ArrestProphase Arrest 的機制的機制

Gs protein Gs protein 具有使卵母細胞進行 具有使卵母細胞進行 Prophase Prophase Arrest Arrest 的功能 的功能

然而 然而 Gs protein Gs protein 必須接受其他的蛋白活化必須接受其他的蛋白活化(Receptor)(Receptor)

由以上兩點可推測 在卵母細胞膜上應該有由以上兩點可推測 在卵母細胞膜上應該有某種受器可以接受外界的刺激 並活化某種受器可以接受外界的刺激 並活化 Gs Gs proteinprotein

為了辨認出此種為了辨認出此種 receptor receptor 我們查詢我們查詢由 由 cDNA library cDNA library 所組成的所組成的 EST EST

EST ( expression sequence tag database)EST ( expression sequence tag database) 一種一種資料庫可以找尋某物種某時期某種細胞資料庫可以找尋某物種某時期某種細胞有有表現表現的的的的 DNADNA 序列序列

找尋可以成為找尋可以成為 G protein –coupled receptors G protein –coupled receptors (GPCRs)(GPCRs) 其特徵是 其特徵是 7-transmembrane 7-transmembrane structurestructure 可以使可以使 G protein G protein 活化活化

G protein –coupled receptorsG protein –coupled receptors

查詢結果查詢結果 10001000 多個哺乳動物基因會產生多個哺乳動物基因會產生

7-transmembrane protein7-transmembrane protein 其中有其中有 1515 個被發個被發現在卵母細胞的現在卵母細胞的 ESTEST 資料庫資料庫

1515 個之中有一個叫個之中有一個叫 Gpr3 receptor Gpr3 receptor 這就是這就是的主題了 的主題了 辨認它辨認它 (Gpr3)(Gpr3) 和 和 Prophase Arrest Prophase Arrest 有無直接的關係有無直接的關係

The The Gs –Linked Receptor GPR3Gs –Linked Receptor GPR3 Maintains Maintains Meiotic ArrestMeiotic Arrest in in

Mammalian OocytesMammalian Oocytes

在哺乳動物卵母細胞內維持在哺乳動物卵母細胞內維持減數分裂初期停止減數分裂初期停止

Gs –Linked Receptor GPR3Gs –Linked Receptor GPR3

接下來 就是要證明接下來 就是要證明 Gpr3 Gpr3 receptor receptor 確實與卵母細胞確實與卵母細胞的的 Prophase Arrest Prophase Arrest 有關有關

實驗一 實驗一 Gpr3 RNA Gpr3 RNA 的 的

1: In situ hybridization 1: In situ hybridization

2: RT-PCR2: RT-PCR In situ hybridization In situ hybridization 的對象 的對象 : : 老鼠的卵巢老鼠的卵巢

發現 發現 Gpr3 RNA Gpr3 RNA 主要出現在卵母細胞內主要出現在卵母細胞內

In situ hybridizationIn situ hybridization

為了進一步比較 為了進一步比較 Gpr3 RNA Gpr3 RNA 的濃度的濃度使用了使用了 RT-PCR RT-PCR 的技術的技術

RT-PCR (Reverse transcription polymerase RT-PCR (Reverse transcription polymerase

chain reaction) chain reaction) 可利用 可利用 RNA RNA 反轉錄成 反轉錄成 cDNAcDNA

越多的 越多的 RNA RNA 反轉錄生成的 反轉錄生成的 cDNA cDNA 越多 再越多 再利利

用特別設計的探針則可比較出不同細胞 用特別設計的探針則可比較出不同細胞 RNA RNA 含量的多寡含量的多寡

發現在卵母細胞內的發現在卵母細胞內的 Gpr3 RNA Gpr3 RNA 的濃度遠的濃度遠高於周圍的體細胞高於周圍的體細胞

由本實驗可以知道 由本實驗可以知道 Gpr3Gpr3 與與卵母細胞卵母細胞有密有密切的關係切的關係

實驗一 結果實驗一 結果

在接下來的實驗會用到基因缺失鼠在接下來的實驗會用到基因缺失鼠 基因缺失鼠基因缺失鼠 (gene knockout mice)(gene knockout mice)

利用生物技術的方式 製造具有某一利用生物技術的方式 製造具有某一特定基特定基因因缺陷缺陷 (( 失去功能失去功能 )) 的老鼠 藉由和正常老鼠的老鼠 藉由和正常老鼠的比較來了解此的比較來了解此特定基因特定基因的功能的功能

實驗二 實驗二 Gpr3 gene knockout miceGpr3 gene knockout mice 1.1. 由單一個卵母細胞比較由單一個卵母細胞比較

Gpr3-/- :Gpr3 Gpr3-/- :Gpr3 基因缺失基因缺失

Gpr3+/+ : Gpr3 Gpr3+/+ : Gpr3 正常正常

觀察的細胞 觀察的細胞 :: 老鼠的 老鼠的 antral follicle antral follicle 內的卵母細胞內的卵母細胞

辨別卵母細胞是否 有辨別卵母細胞是否 有 Prophase Arrest Prophase Arrest 的情況的情況

Gpr3+/+Gpr3+/+

Gpr3+/+ Gpr3+/+ 的卵母細胞內的的卵母細胞內的核膜核膜與與核仁核仁均都相當的完整 由此作均都相當的完整 由此作者推論此一卵母細胞應該還者推論此一卵母細胞應該還停停留在 留在 ProphaseProphase 的狀態並沒有繼的狀態並沒有繼續進行減數分裂續進行減數分裂

Gpr3-/- Gpr3-/-

Gpr3-/- Gpr3-/- 放大圖放大圖

因為已經可以看到 因為已經可以看到 極體極體 (polar (polar body) body) 以及以及濃縮的染色體濃縮的染色體 所以 所以作者判斷它作者判斷它 (( 卵母細胞卵母細胞 )) 已經由已經由prophase prophase 轉變成轉變成 metaphase(metaphase(ІІІІ) ) Prophase Arrest Prophase Arrest 停止減速分裂 停止減速分裂繼續進行繼續進行

結論結論 -- 由單一細胞比較由單一細胞比較 Gpr3+/+ Gpr3+/+ 持續持續 Prophase arrestProphase arrest Gpr3-/- Gpr3-/- 恢復減數分裂恢復減數分裂

代表說 代表說 Gpr3 Gpr3 基因的表現與否確實對卵母基因的表現與否確實對卵母細胞能否維持 細胞能否維持 Prophase Arrest Prophase Arrest 有直接的關有直接的關係係

2-22-2 由卵巢內的卵母細胞作比較由卵巢內的卵母細胞作比較

使用進入青春期前的老鼠使用進入青春期前的老鼠

觀察老鼠的卵巢內各個時期濾泡內的觀察老鼠的卵巢內各個時期濾泡內的卵母細胞卵母細胞

何為濾泡 何為濾泡 ??

就是在卵巢內 就是在卵巢內 圍著圍著卵母細卵母細胞胞的細胞群的細胞群

濾泡成熟過程的各個時期濾泡成熟過程的各個時期

Pre-antral follicle Pre-antral follicle 直徑直徑 <140µm<140µm

Early antral follicle 140µm<Early antral follicle 140µm< 直徑直徑 <250µm<250µm

Antral follicle Antral follicle 直徑直徑 >250µm>250µm

卵巢內各時期濾泡卵母細胞回復減卵巢內各時期濾泡卵母細胞回復減數分裂比例數分裂比例

Gpr3+/+Gpr3+/+ Gpr3-/-Gpr3-/-

卵巢內卵巢內Antral follicleAntral follicle

的卵母細胞的卵母細胞回覆回覆減數分裂減數分裂的比例的比例

0%0% 82%82%

而在而在 Gpr3-/-Gpr3-/- 的的 82%82% 中中

有有 42%42% 已經在已經在 Metaphase Metaphase ІІІІ

MetaphaseMetaphaseІІ and Metaphase and Metaphase ІІІІ

MetaphaseMetaphaseІІ 有紡垂絲 有紡垂絲 (spindle) (spindle) 沒有極體 沒有極體(polar body)(polar body)

MetaphaseMetaphaseІІІІ 有紡垂絲 也有極體 有紡垂絲 也有極體

無論是無論是 Gpr3-/-Gpr3-/- 或或 Gpr3+/+Gpr3+/+在在 Pre-antralPre-antral 濾泡濾泡內的卵內的卵母細胞都不會回復減數分母細胞都不會回復減數分裂裂 (( 都是都是 0%)0%)

Early antral follicleEarly antral follicle

從 從 Pre-antral follicle Pre-antral follicle 到 到 Antral follicle Antral follicle 中間有一過程稱中間有一過程稱作 作 Early antralEarly antral

Early Antral Early Antral 是是濾泡腔開使充滿液體濾泡腔開使充滿液體的時期的時期

Gpr3-/-Gpr3-/- 內有內有 37%37% 的卵母細胞 開始回復減數分裂的卵母細胞 開始回復減數分裂(Metaphase (Metaphase ІІ))

正常卵母細胞開始依賴正常卵母細胞開始依賴體細胞體細胞和和 cAMPcAMP 來維持來維持prophase Arrest prophase Arrest

可知 在可知 在 Early antral follicle Early antral follicle 時期的卵母細時期的卵母細胞開始依賴 胞開始依賴 Gpr3 receptorGpr3 receptor 來維持來維持 Prophase Prophase ArrestArrest

由此可知 在這由此可知 在這 Early antral follicleEarly antral follicle 時期 時期 Gpr3Gpr3 receptorreceptor 和 和 周圍體細胞周圍體細胞 存在者某種關 存在者某種關係來調控係來調控 Prophase ArrestProphase Arrest

卵巢內各時期濾泡卵母細胞回復減數分裂比例卵巢內各時期濾泡卵母細胞回復減數分裂比例

結論結論 -- 由卵巢內的卵母細胞作比由卵巢內的卵母細胞作比較較

卵母細胞上的 卵母細胞上的 Gpr3 receptorGpr3 receptor 與 與 卵卵周圍體細胞周圍體細胞間存在某種關係間存在某種關係來調控卵的來調控卵的 Prophase ArrestProphase Arrest

本次實驗的特殊現象本次實驗的特殊現象 發生於將發生於將卵母細胞移出卵母細胞移出以確認 以確認

Gpr3-/- Gpr3-/- AntralAntral 以及以及 Early antralEarly antral

型態濾泡內的卵母細胞是否有型態濾泡內的卵母細胞是否有回復減數分裂回復減數分裂

將卵母細胞移出以決定在 將卵母細胞移出以決定在 antral antral 以及以及 early antral early antral 內的哪一個卵母細胞並沒有回復減數分裂內的哪一個卵母細胞並沒有回復減數分裂

針對這種現象 作者解釋為 可能是針對這種現象 作者解釋為 可能是即使在即使在 Gpr3-/-Gpr3-/- 內 也還存在著某些內 也還存在著某些特殊種類特殊種類 (subgroup)(subgroup) 即使 即使 Gpr3 -Gpr3 -receptor receptor 失去功能 也依然可維持一失去功能 也依然可維持一段時間的段時間的 Prophase ArrestProphase Arrest

下一個實驗會使用到下一個實驗會使用到 LH(LH( 促黃促黃體成熟激素體成熟激素 )) 因此在這裡先介因此在這裡先介紹紹 LH LH 以及以及 LHLH 對濾泡和卵母對濾泡和卵母細胞的影響細胞的影響

LHLH 受到受到 GnRHGnRH 的調控的調控

LHLH 會促進排卵作用會促進排卵作用

如何會使如何會使 Prophase Arrest Prophase Arrest 的卵母細胞的卵母細胞(( 正常狀態下正常狀態下 )) 由由 prophaseprophase 變成變成

MetaphaseMetaphase 此一機制是由腦下垂體所分泌的 此一機制是由腦下垂體所分泌的 luteinizing luteinizing

hormone hormone 所調控所調控 LH LH 刺激卵母細胞以及週遭的體細胞刺激卵母細胞以及週遭的體細胞

(granulosa cells)(granulosa cells) 卵母細胞上有 卵母細胞上有 LH Receptor LH Receptor 受到 受到 LH LH 刺激刺激後後會激起一連串的活化反應 而使得減數分裂會激起一連串的活化反應 而使得減數分裂回復進行回復進行

LHLH 對濾泡的影響對濾泡的影響 使得濾泡內的細胞開始膨大使得濾泡內的細胞開始膨大 (( 形成黃體形成黃體 ))

使正常的卵母細胞的使正常的卵母細胞的 Prophase Arrest Prophase Arrest 停止停止減數分裂開始進行減數分裂開始進行 (( 濃度到達一定程度濃度到達一定程度 ))

因為 因為 LH LH 也會使得 也會使得 Prophase Prophase Arrest Arrest 停止 減數分裂繼續進行 停止 減數分裂繼續進行 所以懷疑所以懷疑 LHLH 與 與 Gpr3-/-Gpr3-/- 的的Prophase Arrest Prophase Arrest 停止有關停止有關

LH dependant geneLH dependant gene

要偵測 要偵測 LH LH 是否作用到卵母細胞上 就要對 是否作用到卵母細胞上 就要對 卵母細胞內的 卵母細胞內的 LH dependant gene LH dependant gene 進行偵測進行偵測

在 在 LH LH 到達一定程度時 到達一定程度時 LH dependant gene LH dependant gene 就會被活化 而轉譯出 蛋白質 就會被活化 而轉譯出 蛋白質 CSP2CSP2

(Chondroitin sulfate proteoglycan 2) (Chondroitin sulfate proteoglycan 2) 因此只因此只要 檢驗 要 檢驗 CSP2 RNA CSP2 RNA 的含量就可以知道 的含量就可以知道 LHLH是否有作用於卵母細胞 是否有作用於卵母細胞

實驗三 實驗三 LH LH 對卵母細胞的影響對卵母細胞的影響

利用利用 RT-PCRRT-PCR 技術偵測卵母細胞內的 技術偵測卵母細胞內的 CSP2CSP2

RNA RNA 以確定 以確定 LH LH 是否對卵母細胞有影響是否對卵母細胞有影響

CSP2 RT-PCRCSP2 RT-PCR

也有可能是 也有可能是 Gpr3-/- Gpr3-/- 失去形成黃體的機能失去形成黃體的機能

使用 使用 LH receptor agonist LH receptor agonist 來刺激 來刺激 receptor receptor 即可檢驗出 即可檢驗出 Gpr3-/- Gpr3-/- 是否失去了形成黃體是否失去了形成黃體的機能的機能

在這裡使用的在這裡使用的 agonistagonist 是 是 human chorionic human chorionic gonadotropin gonadotropin 簡稱 簡稱 hCGhCG

hCG hCG 可以偵測卵母細胞是否失去形成黃體的可以偵測卵母細胞是否失去形成黃體的機能機能

對對 Gpr3-/- Gpr3-/- 卵母細胞使用卵母細胞使用 hCGhCG

結論結論 由實驗三我們可以知道由實驗三我們可以知道 LHLH 並不會影響並不會影響Gpr3-/-Gpr3-/- 的的回復減數分裂回復減數分裂

也就是說 也就是說 Gpr3-/- Gpr3-/- 之所以會回復減數分裂 之所以會回復減數分裂 完全是由於 完全是由於 Gpr3 Gpr3 這個這個基因失去作用基因失去作用 卵母 卵母細胞上沒有這細胞上沒有這 Gpr3 receptorGpr3 receptor

實驗四 實驗四 Gpr3-/-Gpr3-/- 卵母細胞的表型反轉卵母細胞的表型反轉

將 將 Prophase Arrest Prophase Arrest 的 的 Gpr3-/- Gpr3-/- 卵母細胞注射卵母細胞注射Gpr3 RNA Gpr3 RNA 將之放入將之放入 Pre-antral Pre-antral 的濾泡中培養的濾泡中培養

觀察濾泡成長到 觀察濾泡成長到 Antral Antral 時期後是否會有回復時期後是否會有回復減數分裂的狀況發生減數分裂的狀況發生

若若沒有回復沒有回復則代表 則代表 Gpr3 receptorGpr3 receptor 確實可以阻確實可以阻止減數分裂的回復止減數分裂的回復 ((Prophase ArrestProphase Arrest))

加入加入 Gpr3 RNA Gpr3 RNA 明顯減少回復減數明顯減少回復減數分裂分裂

結論結論 原本會回復減數分裂的原本會回復減數分裂的 Gpr3-/-Gpr3-/- 的卵母細胞 的卵母細胞

在注射入 在注射入 Gpr3 RNA Gpr3 RNA 後 變成不在會復減數後 變成不在會復減數分裂分裂

由此可知 由此可知 Gpr3 receptor Gpr3 receptor 確實可以維持減數確實可以維持減數分裂的 分裂的 Prophase ArrestProphase Arrest

ConclusionConclusion

由這四個實驗的結果可以知道 由這四個實驗的結果可以知道 Gpr3 Gpr3 receptorreceptor

是存在於是存在於卵母細胞膜卵母細胞膜上的蛋白 可以接受體上的蛋白 可以接受體細胞產生的訊息傳遞物質 活化細胞產生的訊息傳遞物質 活化 Gs ProteinGs Protein再引起一連串的活化反應 最後使得再引起一連串的活化反應 最後使得減數分減數分裂停止裂停止