Réalisé par:BEN ALLA SafaBOUTASKNIT AbderrahimTILIRINE Khalid Mr. K. OUFDOU

Les effets des extraits des Cyanobactéries contenant les microcystines sur la croissance, le processus de la

nodulation et l’assimilation de l’azote chez la fève Vicia faba L., Fabacées

Université Caddi Ayad Faculté des Sciences Semlalia de marrakech Master BES 2015

Plan du travail

IntroductionI/ Matériel et méthodes II/ RésultatsIII/ DiscussionConclusion

INTRODUCTION

Les changements climatiques mènent à une augmentation de

l’eutrophisation des écosystèmes aquatiques surtout les réservoirs et les

rivières ainsi que les cyanobactéries sont de plus en plus fréquentes.

L’utilisation des eaux contaminées par ces toxines dans l’irrigation peut

contribuer à plusieurs effets négatifs sur le rendement agricole surtout chez

les légumineuses , ainsi cette étude vise à déceler l’influence de ces toxines

sur la croissance , la nodulation et l’assimilation de l’azote.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

MILIEU D’ÉTUDE Barrage de « Lalla Takerkoust »:

Situé à environ 35 Km au Sud Ouest de Marrakech, II est construit sur

l'oued N'fis qui prend sa source dans la chaîne du haut Atlas.

C’est un réservoir aquatique qui représente un écosystème avec une

prolifération massif des cyanobactéries toxiques durant l’été et l’automne.

ECHANTILLONNAGE

Les cyanobactéries toxiques sont collectées en mois de

Septembre 2005 à partir de réservoir de Takerkoust.

Les échantillons sont collectés suit aux techniques

d’échantillonnage.

CYANOBACTÉRIES TOXIQUES

Généralement ces proliférations ne durent que quelques jours car les pluies, les

vents violents ou la chute de la température  sont des facteurs qui stoppent cette

croissance anarchique.

Microcystis aeruginosa

Cette bactérie appartient à la famille des Microcystis, prolifèrent dans les

écosystèmes d'eau douce tempérés.

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS

Les échantillons sont séchés et congelés

Le matériel lyophilisés (échantillons) est conservé à 20°C pour l’extraction

des MC et l’analyse par la chromatographie HPLC.

La méthode d’extraction et la quantification des toxines par HPLC est déjà

décrite par EL Khalloufi et al.

Chromatographie HPLC

Les effets toxique des MC sur les souches rhizobiales

Protocole expérimental:

Trois souches rhizobiales sont isolées( dans le milieu YEM medium agar

avec congo-red) à partir des racines nodulés de v.faba collecté de la

région de Marrakech.

NB: les nodules sont prédésinfecté avec l’hypochlorite (4°) et lavées avec

l’eau physiologique stérile.

Milieu d’isolement des souche rhizobial

Milieu YEM medium

Confrontation des souches rhizobiales et les MC

Dans trois rangées des flacons contenants100ml de l’extrait de levure

mannitol inoculé avec les trois souches rhizobiales

(RhoF4.RhoF6.RhoF21) en parallèle avec les concentrations (0, 10, 50 et

100 µg/l) de MC.

Incubation à 28°C dans l’obscurité avec l’agitation continue (250 rpm).

L’estimation de la croissance des souches rhizobiales étudiées est évalué

par le comptage des UFC dans le milieu de culture.

Effets d’extrait du MC sur la germination des graines de la fève

Protocole expérimental:• Stérilisation et rinçage des graines. • Préparer trois boite de pétri pour la germination des

grains(pour chaque boite 10 graines ).• L’exposition des graines à des concentratrions de ( 0; 10; 50;

100 µg MC /l). • Incubation des boites de germination à 25°C dans l’obscurité

et dans un milieu stérile.• Ainsi la détermination de taux de la germination.

L’exposition des plantes de la fève à l’extrait de MC

Protocole expérimental:

Prégermination des graines de v.faba dans des pots de 15 cm de sable stérile ( 3

graines/pots), sous les conditions naturelles ( Avril-Mai 2010).

Trois groupes de traitement sont réalisée avec 3 différent souches

(RohF4.RohF6.RohF21), 2 ml de suspension bactérienne par group de graines

Après 15 jours de germination on rajoute les différents gammes de concentrations

(0, 10, 50 et 100µg/l de MC), avec la solution de l’azote pendant 6 semaines.

Evaluation d’effets

Récolte des plantes puis récupération des nodules de chaque

lots de plantes.

Compter de nombre de nodules pour chaque gammes de

concentration.

le nombre de nodules selon la concentration de MC utilisée

nous permet de vérifier s’il y a de différence significative les

résultats ou non.

Effets des MC sur la matière sèche

Protocole expérimental:

Dessiccation des tiges, racines et nodules à 70°C pendant 72h.

Pondéré la matière sèche obtenu.

Dosage de l’azote contenu dans les racines et les bourgeon

par la méthode de Kjeldahl.

Analyse statistique

Les résultats ainsi obtenu pour chaque protocole

expérimental sont analysée par des tests statistique

convenable.

L’analyse de la variance ( Anova) nous permet de

vérifier s’il y a une différence significatif entre les

résultats obtenu.

RESULTATSLes résultats de la chromatographie obtenue de l’extrait des blooms du

M.aeroginosa, révèle qu’il ya cinq variétés : MDC-LCR (4.20 %) ; MC-(H4)-YR (4.32 %) ; MCLY (8.32 %); C-FR (9.25 %) et MC-LR (73.71 %). La concentration des microcystines contenant dans l’extrait de blooms est de

22.24 µg/ml. MC-LR est la microcystine la plus dominante dans l’extrait (74%).

Tableau1: Effet des cyanotoxines sur la croissance des souches rhizobiums (RhOF4, RhOF6 et RhOF21) dans YEM medium (abondances bactériennes en UFC/ml)

Confrontation des souches rhizobiums et les cyanotoxines

Tableau 2: l’effet de la concentration des microcystines sur l’abondance des souches bactériens après 5 jours d’exposition

  100 µg/l  témoin RhOF4

(UFC/ml) 122*1011  227 * 1011

RhOF6 (UFC/ml)  100*108   127 * 108 

RhOF21 (UFC/ml)61*1010  261 *  1010

La croissance des souches du rhizobium RhOF4, RhOF6 et RhOF21 dépend de la nature de la souche et de la concentration des cyanotoxines.

Les toxines des Microcystines ont des effets négatifs sur la croissance des

rhizobiums.

Décroissance significative des UFC/ml des rhizobiums dans les tests

d’exposition avec les MC en comparaison avec le témoin.

L’effet négatif des microcystines apparait spécialement pour les hautes

concentrations (50 et 100 µg/l).

Concentration MC (µg/l) 10 50 100Taux de germination (%) 100 75 68,75

Tableau 3: Effet de la concentration de microcyctine (10, 50 et 100 µg/l) sur le taux de la germination des graines

Effet des microcystines sur le taux de la germination des graines de la fève

Les microcystines ont des effets significativement négative sur le taux de germination des graines de la fève.

Rendement de la matière sèche des pousses et les racines

Figure 1: Effet des microcystines sur l’accumulation de la matière sèche dans les poussés (A) et les racines (B) chez la fève inoculé avec les souches rhizobiums (RhOF4, RhOF6 et RhOF21)

le rendement de la matière sèche des pousses et les racines décroit significativement

dans des concentrations les plus élevés de cyanotoxine (100 µg MC/l).

Les plantes de la fève inoculées avec RhOF6 ont montré une décroissance significative

de la matière sèche dans les concentrations de 50 µg MC/l en comparaison avec le

témoin.

les plantes inoculé avec RhOF21 ne montre pas une différence significative de point de

vue de poids sec entre les racines et les pousses.

Il y a une corrélation significativement négative entre la concentration des cyanotoxines

et la matière sèche de plante de la fève inoculé avec RhOF4, RhOF6 et RhOF21.

Figure 2: Effet des microcystines sur la matière sèche des nodules et le nombre des nodules

Effet des microcystines sur la nodulation

L’effet des microcystines est fort contre la nodulation.

Les microcystines inhibent la croissance des nodules et aussi le processus

de la nodulation.

Cyanotoxines induisent des effets négatifs sur le développement des

nodules de la fève inoculés avec les souches RhOF4, RhOF6 et RhOF21.

Effet des microcystines sur la nodulation

Effet des microcystines sur la teneur d’azote contenu dans les racines et les bourgeons de la fève inoculée avec les souches

rhizobiums

Tableau 5: effet des microcystines sur la teneur d’azote contenu dans les racines et les bourgeons de la fève inoculée avec les souches rhizobiums

Dans les plantes nodulés par RhOF6 ou par RhOF21, les MC fait diminuer

significativement la teneur de l’azote totale dans les bourgeons et les

racines de la fève

l'effet des cyanotoxines est plus important dans les concentrations de

toxines plus élevées(50, 100µg MC/ml). Par contre les MC n'ont pas induit

une modification significative sur l'azote contenu dans les pousse et les

tiges des plantes inoculées  par RHOF4 ===> RHOF4 est plus résistante

aux MC.

l'assimilation de l'azote sous l'effet des cyanotoxines est différente selon la

concentration des MC et la nature de la souche

DISCUSSION

L’extrait brute des cyanotoxines utilisé dans cette étude a un effet négatif sur la croissance des

souches du rhizobium testé qui nodulent les fèves.

Quelques études ont montré que les MC affectent la perméabilité de la paroi cellulaire même

aux faibles concentrations (Dixon et al. 2004).

Il est indiqué aussi que les cyanobactéries peuvent produire des différents types des

métabolites secondaires ayant une activité fongicide et/ou antibactérienne.

Les extraits des cyanobactérie et des MC pures ont un effet inhibiteur sur la croissance et

l’ultrastructure des microalgues (effet inhibiteur plus persistant)et les bactéries. perte de

propriétés métaboliques au bout de 8jrs d’exposition

Selon Vassilakaki et Pflugmacher,L’exposition aux extraits bruts des bactéries et

aux MC pures induit une réponse oxydative de Senechosystis sp. au stress et aussi

un effet négatif sur la croissance des microalgues et bactéries.

La germination des graines est très essentielle, elle constitue le stade précoce de la

croissance des semis (peut affecter la productivité des récoltes).

l’inhibition de la germination est observée chez les légumineuses

ToxinesCyanobactér

iques+

Extraits bruts des

cyanobactéries

Alfalfa(Madia sativa)

(Pflugmacher et al.2006; El khaloufi

et al. 2011)

Graines de Pea sativum

(Saqrane et al.2008)

Exposition Exposition

Constations de cette étude:

Aucun effet n’est apparent pour la concentration 10µg de MC-LR/l par rapport au

témoin.

Cette étude confirme donc les constatations de l’étude précédente.

En plus de cela on 'a une réduction de la matière sèche (des tiges et des racines)

dans la gamme des plantes comme le pois cultivé(Pea sativum) et d’autre plantes

terrestres telles les lentilles cultivées(L.esculenta), le maïs(Z. mays), le blé dur

(T. durum) le trèfle, le colza et aussi l’ivraie (Rye grass) . diminution à la plus

forte concentration(100µg MC/l).

La nodulation mesurée et le nombre de nodule sont un indice d’infection réussie

des légumineuses par les MC.

Effet des pratiques d’irrigation par aspersion avec une eau contaminée??

• Cet effet possible est évoqué par El khaloufi et al.

Irrigation en eau contenant les MC

Réduction de nombre des nodules durant la symbiose MC-M.Sativa ( dépend de la concentration des MC)

les cyanotoxines ont réduit le nombre de nodules par plante de fèves et

encore leur poids sec.

La réduction du poids est due à la réduction de la translocation des

carbohydrates envers les nodules suivant l’inhibition de la croissance des

bourgeons et la diminution de la capacité photosynthétique

intrinsèque(Velagaleti et Marsh 1989).

Assimilation de l’azote

La symbiose Rhizobium-Légumineuses permet la fixation de l’azote

atmosphérique.

La souche RhOF4 apparaît être la plus efficace pour l’assimilation de l’azote.

Dans cette expérience , pas de modification de l’azote contenu dans les bourgeons

et les racines des plantes infectées par RhOF4 par contre l’azote totale décroit

pour les fèves inoculées par RhOF6 et RhOF21 et exposées aux MC.

Le déclin de l’azote assimilé par les plantes de la fève sous autres stress

environnementaux est rapporté par plusieurs auteurs, Sadiki et Rabih 2001

Abdellay et al. 2005 Krouma 2009… .

La dégradation de leghemoglobine (hémoprotéine fixatrice d’ O2 chez

les fabacées)

La diminution de l’activité

enzymatique

des

tissus protecteurs

Inhibition des

voies d’assimilation de l’ammonium

Réduction de l’activité

nitrogènase et la li

mitation de diffusion d’O2

Diminution ou déclin

de l’assimilati

on de l’azote

CONCLUSION

Cette étude a évalué l’impact des cyanotoxines sur la croissance, la

nodulation et l’assimilation de l’azote chez la fève.

L’utilisation des eaux contaminées aux cyanotoxines dans l’irrigation

engendre des effets négatifs sur le rendement et la qualité des cultures ce

qui conduit aux pertes économiques significatives.

La tolérance de la symbiose rhizobium-légumineuses peut constituer une

nouvelle voie pour augmenter la fertilisation et la du sol et aussi une

méthode biotechnologique pour remédier la contamination des cultures par

les cyanotoxines.

Références

Abddelly C. Krouma A. Drevon JJ (2005). Nitrogen fixation and yield of chickpea in salin Mediterranean zones, Grain legumes 42: 16-17

Asada K (1992) Ascorbate peroxydase: a hydrogen peroxide scavenging enzyme in plants. Physiol Plant 85: 235-241

Merci pour votre

attention