1

INTRODUCCIN.

La tuberculosis es una de las principales enfermedades causales de muerte en el

mundo; se considera que actualmente la tercera parte de la poblacin mundial

esta infectada con tuberculosis, que cada ao ocurren entre 8 y 9 millones de

casos y que causa entre 2 y 3 millones de muertes anualmente (Collins, DM.

1996). En los ltimos aos se ha reportado un incremento del 0.3% en el nmero

de casos de tuberculosis y en la tasa de incidencia a nivel mundial, excepto en

Europa occidental y Norte Amrica (Bodmer et al. 2002). Mltiples factores como

la pobreza, condiciones socio-sanitarias y de salubridad, la aparicin de cepas

resistentes a una amplia gama de antibiticos y la carencia de una vacuna que

proteja en la edad adulta contra la enfermedad, contribuyen a que la enfermedad

persista en la poblacin (Collins, DM. 1996).

El microorganismo implicado en esta enfermedad es la bacteria Mycobacterium

tuberculosis, un bacilo Gram positivo que genera una infeccin asintomtica y

latente, en donde menos del 7% de la poblacin que enfrenta a la bacteria

desarrolla la enfermedad. Una caracterstica importante de la tuberculosis es que

puede presentarse de forma latente durante aos. En el estado de latencia, la

infeccin se hace progresiva al interior del husped sin sintomatologa alguna, y

en cualquier momento este estado puede revertir y reactivar la sintomatologa

caracterstica de la enfermedad (Burbano,C 2005).

Es poco el conocimiento respecto al estado fisiolgico de la bacteria en su estado

de latencia dentro del hospedero, al igual que los diferentes mecanismos y formas

por los cuales revierte del mismo. Investigaciones realizadas en las dos ltimas

dcadas han postulado que el bacilo enfrenta condiciones desfavorables como

privacin de oxgeno, descensos bruscos de pH, presencia de radicales txicos de

2

oxgeno y ausencia de nutrientes que afectan el crecimiento celular cuando est

al interior del hospedero, lo cual lleva al estado de latencia. (Yuan et al. 1996).

El estudio de protenas que le confieren resistencia al bacilo frente a las

condiciones desfavorables mencionadas, prometen ser una herramienta para la

identificacin y la deteccin rpida y directa de Mycobacterium tuberculosis,

permitiendo as desarrollar nuevas tcnicas de diagnstico.

3

JUSTIFICACIN

Diferentes estudios en Mycobacterium tuberculosis realizados por PCR en tiempo

real (RTq-PCR) y por microarreglos (Kendall et al. 2003, Rodrguez et al. 2006,)

han demostrado la transcripcin diferencial de mRNA del gen acr que codifica para

la protena alfa cristalina frente a condiciones de estrs. Este hecho sugiere la

hiptesis de que la protena alfa cristalina se sobre expresa cuando el bacilo se

encuentra en condiciones adversas de crecimiento como pH cido, hipoxia,

presencia de radicales txicos de oxgeno y diferentes concentraciones de etanol,

favoreciendo la adaptabilidad frente a estas condiciones durante el proceso de

infeccin.

Teniendo en cuenta lo anterior, se quiere estudiar si la protena alfa cristalina

16KDa se sobre expresa bajo condiciones de estrs en cantidades suficientes

para ser detectada e identificada mediante la tcnica de electroforesis en gel de

poliacrilamida y Western blot usando anticuerpos especficos.

Por esta razn, la sobre expresin y el reconocimiento de la protena Alfa

cristalina promete ser una herramienta muy valiosa para el desarrollo de tcnicas

de diagnstico confirmatorias de la tuberculosis.

4

HIPTESIS

La protena alfa cristalina (hspX), se sobre-expresa bajo diferentes condiciones de

estrs como hipoxia, descensos de pH, alcohol, presencia de agentes

generadores de radicales txicos de oxgeno y por lo tanto puede ser detectada

por sistemas inmunolgicos que usan anticuerpos.

.

5

OBJETIVOS

Objetivo general Evaluar la sobrexpresin de la protena alfa cristalina de Mycobacterium bovis

BCG mediante diferentes tipos estrs in vitro para detectarla mediante el uso de

anticuerpos. Objetivos especficos Establecer un protocolo de lisis celular de Mycobacterium bovis BCG para

observar el patrn de migracin electrofortico de las protenas de la bacteria e

identificar dentro del mismo la protena alfa cristalina.

Establecer un protocolo para inducir el estrs oxidativo, pH cido, etanol e

hipoxia.

Identificar de la protena alfa cristalina de Mycobacterium bovis BCG mediante la

tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Detectar la protena alfa cristalina de Mycobacterium bovis BCG mediante

ensayos de western blot, utilizando anticuerpos policlonales.

6

MARCO TERICO

Agente Etiolgico

Mycobacterium tuberculosis fue identificado como el agente causal de la

tuberculosis (TB) en 1882 por Robert Koch, quien logr aislarlo y cultivarlo a partir

de pacientes con tuberculosis (Fenton, MJ. et al.1996; Madigan, 2000). Es un

bacilo Gram positivo, aerobio facultativo, de carcter intracelular, posee un alto

contenido de lpidos y se puede identificar mediante tincin de Ziehl Neelsen

debido a que son cido alcohol resistentes (Ehlers, MRW., Daff, M. 1998;

Florczyk, MA. et al. 2001; Pieters, J. 2001; Salyers, A. et al. 2002). Es de

crecimiento lento, se multiplica en promedio cada 20 a 22 horas, por lo que se

requiere de 4 a 6 semanas para tener poblaciones densas (Cole, ST. et al. 1998;

Madigan, 2000). Crecen en medios especiales, a temperatura de 37C y en un

rango de pH de 7.0 a 7.2. Las micobacterias son hidrofbicas, tienden a crecer en

agregados, en filamentos o ramificaciones (Shinnick TM, King, CH. et al. 1995;

Madigan,2000).

Esta bacteria es un actinomiceto que se encuentra cercanamente relacionada con

bacterias saprofticas como Mycobacterium smegmatis (Russell, DG. 2001). Hace

parte del complejo M. tuberculosis junto con M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum

y M. microti (Collins, DM. 1996, Cole, ST. et al. 1998) con los cuales comparte un

99% de similitud a nivel de nucletidos, poseen secuencias casi idnticas de ARN

ribosomal (ARNr) 16S y difieren extensamente, en trminos de su tropismo,

fenotipos y patogenicidad (Brosch, R. et al. 2002).

La constitucin qumica de la pared bacteriana est compuesta por cidos

miclicos, ceras complejas y glicolpidos (Figura 1). Los cidos miclicos

contienen cadenas laterales que se unen a la molcula de cido murmico del

peptidoglicano a travs de enlaces fosfodisteres y a los arabino galactanos por

7

uniones de glicolpidos. Otro componente importante son los dimicolatos de

trehalosa y los sulfolpdos, los cuales son participes en el proceso de virulencia.

Otro constituyente nico es el lipo-arabino-manano (L.A.M.) que puede contribuir

al dao del hospedero (Valenzuela, M. 2000).

Figura 1. Estructura y composicin qumica de la pared celular de Mycobacterium

tuberculosis. Tomado de Valenzuela, M. 2000.

La cido alcohol resistencia est dada por la composicin qumica de la pared

celular de la bacteria, en especial por los cidos miclicos presentes, por lo tanto,

tienen una tincin especfica denominada Zielhl Neelsen en donde se utiliza

fuscina fenicada, alcohol cido y azul de metileno. El fenol tiene como funcin

permitir la penetracin de la fuscina dentro de los lpidos, el alcohol cido decolora

y finalmente el azul de metileno sirve como un colorante de contraste. Las

micobacterias se observan de color rojo y el resto de los microorganismos no

alcohol resistentes se observan azules (Figura 2) (Madigan et al. 2000).

8

Figura 2. Tincin de Zielhl Neelsen de Mycobacterium tuberculosis.

http://www.mf.uni-lj.si/imi/images/preparati/mikrobi/mycob01.jpg

El genoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (cepa de referencia) consiste en

4.4X106 pares de bases (pb) y contiene aproximadamente 4000 genes (Figura 3).

Cerca de 200 genes del genoma de M. tuberculosis codifican para protenas

enzimticas del metabolismo de cidos grasos, aproximadamente el 6% del total

del genoma (Tabla 1). 100 de ellos estn fuertemente implicados en la -oxidacin

de cidos grasos [Smith, I. 2003].

Tabla 1. Clasificacin general de los genes de Mycobacterium tuberculosis.

Tomado de Smith, I 2003

Funcin No. De Genes

% del Total % de

capaidad codificante

Metabolismo de lpidos 225 5.7 9.3

Vas de seales 207 5.2 6.1

Procesos celulares y pared celular 517 13.0 15.5

Estabilidad de RNAs 50 1.3 0.2

Elementos IS y bacterifagos 137 3.4 2.5

9

Protenas PE* y PPE** 167 4.2 7.1

Metabolismo intermediario y Resp. 877 22.0 24.6

Protenas reguladoras 188 4.7 4.0

Virulencia, detoxificacin y virulencia 91 2.3 2.4

Funciones hipotticamente

conservadas 911 22.9 18.4

Protenas de funcin desconocida 607 15.3 9.9

*, ** Protenas cidas ricas en glicina

Tiene un alto contenido de guanina-citocina (G-C), el cual es constante a lo largo

de todo su genoma [Smith, I. 2003].

Figura 3. Mapa circular del cromosoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv .

Tomado de Cole, ST. 1998.

10

PROCESO DE INFECCIN La infeccin causada por M. tuberculosis depende de dos parmetros

fundamentales: la virulencia de la bacteria y la resistencia del hospedero frente a

la misma (Madigan 2000; Pieters, J. 2001). Hay dos clases de infecciones:

primaria y post-primaria (reinfeccin) (Madigan 2000). Tanto el bacilo como el

hospedero participan en una compleja red de interacciones que pueden llevar a la

eliminacin del patgeno (no infeccin), permanencia a largo plazo del bacilo

(infeccin latente) o una enfermedad activa (tuberculosis primaria o reactivacin)

(Wayne, L. 1994; Deretic, V., Fratti, RA. 1999).

El proceso de infeccin consta de los siguientes pasos: i) transmisin, adherencia

e ingestin por los macrfagos, ii) prevencin de la acidificacin del fagosoma, iii)

inhibicin de la fusin normal al lisosoma, iv) formacin del granuloma, v)

diseminacin de la infeccin dentro del hospedero, vi) modulacin del sistema

inmune del hospedero, y vii) dormancia o latencia y viii) reactivacin (Shinnick TM,

King, CH. et al. 1995; Collins, DM. 1996).

Transmisin, adherencia e ingestin por los macrfagos. La enfermedad se disemina persona a persona en forma de aerosol, la

transmisin ocurre cuando hay un contacto prolongado entre un portador de la

bacteria y otra persona susceptible (Salyers, A. et al. 2002, Clark-Curtiis, JE. et al.

2003). Aproximadamente el 30% de las personas expuestas llegan a ser

infectadas; el 60-90% de estas personas tendrn una respuesta inmune efectiva,

permitiendo la contencin de la enfermedad (Manabe, YC., Bishai, WR. 2000).

Una vez inhaladas, menos del 10% de las bacterias llegan a los bronquiolos y

alvolos (rganos diana); la gran mayora se quedan en el epitelio respiratorio

superior en donde son expulsadas por el aparato mucociliar (Fenton, MJ. et al.

1996). El aerosol que contiene las micobacterias llega hasta los alvolos del tracto

respiratorio del individuo, all la bacteria penetra los macrfago alveolares donde la

11

tiene la habilidad de sobrevivir y multiplicarse. (Salyers, A. et al. 2002; Zhart, TC.

2003 ; Clark-Curtiis, JE. et al. 2003; Tyagi, JS., Sharma, D. 2004).

Los bacilos entran a los macrfagos por medio de uniones especficas a distintas

molculas de superficie celular (Britton, WJ. et al. 1994; Fenton, MJ. et al. 1996;

Ehlers, MRW., Daff, M. 1998). Las micobacterias poseen partculas llamadas

(opsoninas) que recubren la superficie celular y son de alta afinidad para

receptores celulares de los macrfagos. Las micobacterias se pueden unir

directamente va receptores de complemento (CR1, CR3 y CR4), por medio del

receptor de manosa de macrfagos (MMRc) y el receptor de protena surfactante

A (SPA) (Fenton, MJ. et al. 1996; Ehlers, MRW., Daff, M. 1998; Zhart, TC. 2003).

Estas tambin pueden unirse a los macrfagos a travs de los receptores de

fibronectina y vitronectina (Britton, WJ. et al. 1994). M. tuberculosis entra a los

macrfagos predominantemente va CR3 (Pieters, J. 2001), este receptor parece

ser la va predilecta para diversos patgenos filogenticamente no relacionados, lo

cual hace pensar que constituye una va segura para la entrada (Ehlers, MRW.,

Daff, M. 1998).

Una vez ocurre la infeccin de los macrfagos alveolares, la bacteria prolifera

intracelularmente dentro de ellos e induce citoquinas que inician la respuesta

inflamatoria de los pulmones (Parrish et al, 1998; Flynn et al, 2001; Russell, DG.

2001). Durante la infeccin, el macrfago juega un papel contradictorio ya que es

la unidad primaria celular de defensa y adems, el sitio primario de la replicacin

de la bacteria. Este evento permite inferir que el macrfago alveolar es la primera

clula del hospedero que responde a la invasin de la micobacteria y por lo mismo

ayuda en su subsiguiente diseminacin. (Cosma, et al. 2003).

Prevencin de la acidificacin del fagosoma Los macrfagos alveolares atizan los bacilos y los encierran en fagosomas. Si los

macrfagos se activan, los fagosomas se fusionan con los lisosomas y la bacteria

12

es eliminada (Clark-Curtiis, JE. Et al. 2003); si no estn activos, los bacilos

sobreviven y crecen en los fagosomas alterando la maduracin a fagolisosomas

(Parrish et al, 1998; Clark-Curtiis, JE et al. 2003).

El crecimiento intracelular de las bacterias depende de su habilidad para evitar la

destruccin por parte de las enzimas lisosomales, los intermediarios de oxgeno

reactivos (ROIs) y los intermediarios de nitrgeno reactivos (RNIs) (Fenton, MJ. et

al. 1996); adems, ellas deben someterse a un ambiente con un pH cido (Smith,

I. 2003).

Estudios han revelado que las membranas vacuolares que rodean los bacilos no

poseen la ATPasa de protones responsable de la acidificacin fagosomal (Sturgill-

Koszycki, S. et al. 1994; Fenton, MJ. et al. 1996, Ehlers, MRW., Daff, M. 1998).

Sin embargo, se ha mostrado una heterogeneidad considerable de pH entre las

diferentes vesculas, con una disminucin inicial de pH, seguida por una

recuperacin y equilibrio de pH entre 6.3 y 6.5 (Deretic, V., Fratti, RA. 1999; Hner

zu Bentrup, K., Russell, DG. 2001). El mantenimiento del pH fagolisosomal

alrededor de 6.5 restringe la actividad de la hidrolasa lisosomal, permitiendo la

capacidad de supervivencia intracelular del bacilo (Sturgill-Koszycki, S. et al.

1994).

Inhibicin de la fusin normal con el lisosoma. Varios patgenos intracelulares han desarrollado y evolucionado mecanismos

para evadir el microambiente vacuolar. Listeria y Shigella, por ejemplo,

fsicamente escapan del fagosoma y se replican en el citoplasma, mientras que M.

tuberculosis, al igual que Legionela, inhibe la fusin fagosoma-lisosoma (Smith, I.

2003).

Es posible que la micobacteria tenga por lo menos dos tipos de mecanismos

adaptativos: a) tener una restriccin temprana de la fusin fagolisosomal en la

13

infeccin; b) tener una adaptacin a la fusin fagolisosomal dentro de los

macrfagos activos de los granulomas tardo en la infeccin (Cosma, et al. 2003).

Formacin del granuloma Cuando la bacteria ya se encuentra en el tejido profundo de los macrfagos y tal

vez otras clulas que han sido fagocticas, macrfagos adicionales y linfocitos

migran hacia el sitio de infeccin y forman un granuloma (Flynn et al, 2001;

Cosma, et al. 2003). Se puede decir que un granuloma es una coleccin

organizada de macrfagos diferenciados con una morfologa particular, que

contiene bacilos fagocitados rodeados por linfocitos (Manabe, YC., Bishai, WR.

2000, Pieters, J. 2001; Cosma, et al. 2003; Zahrt, TC. 2003; Flynn, JL., Chan, J.

2005).

Generalmente la formacin del granuloma sirve para contener a los patgenos,

previniendo su crecimiento continuo y su diseminacin al resto del tejido alveolar,

del pulmn y otros rganos. Adicional a esto, concentra la respuesta inmune

directamente en el sitio de infeccin (Fenton, MJ. et al. 1996; Hner zu Bentrup,

K., Russell, DG. 2001; Tyagi, JS., Sharma, D. 2004). El granuloma se mantiene en

el hospedero persistentemente infectado, debido a la estimulacin crnica de las

clulas inmunes y forma la base de la lesin de la tuberculosis (Flynn et al, 2001).

Los granulomas recin formados estn compuestos por fagocitos mononucleares

inmaduros rodeados de clulas efectoras linfocticas como las clulas T CD4+ y

CD8+. Durante el proceso de maduracin a granulomas productivos, los fagocitos

mononucleares se diferencian en macrfagos y llegan a ser activados,

agregndose en clulas gigantes multinucleares y clulas epiteloidales (Zahrt,

TC. 2003) (Figuras 4 y 4B).

14

Figura 4A. Formacin del Granuloma. Modificado de www.nyas.org/images/mt.

New York Academic of Science.

Figura 4B. Composicin de un Granuloma maduro. Modificado de Burbano, 2005).

Dentro del granuloma se cree que la micobacteria se adapta a un ambiente hostil y

bastante dinmico: la mayora del tejido alrededor se encuentra calcificado o

necrtico; el interior del granuloma se piensa que est desprovisto o contiene

15

bajos niveles de oxgeno, posee un pH cido, contienen altas concentraciones de

CO2, posee altos niveles de cidos orgnicos alifticos y enzimas hidrolticas.

Adems, alrededor del Granuloma existe un gran nmero de compuestos

antimicrobiales liberados por clulas inmunes que rodean el granuloma como el

interfern y el factor de necrosis tumoral (TNF-) (Wayne, LG. 1994; Yuan, Y.

et al. 1996; Cunningham, AE., Spreadbury, CL. 1998; Florczyk, MA. et al. 2001;

Smith, I. 2003; Zahrt, TC. 2003). Se ha sugerido que el TNF juega un papel crucial

en la formacin y el mantenimiento del granuloma tanto en ratones como en

humanos. Paradjicamente, el TNF tambin contribuye significativamente al

desarrollo de la inmunopatologa (Flynn, JL., Chan, J. 2005). Se puede decir que

el granuloma se puede ver como un nicho al cual la micobacteria se adapta y

sobrevive por los diferentes mecanismos que posee para evadir la respuesta

inmune (Flynn, JL., Chan, J. 2005).

Modulacin del sistema inmune del Hospedero A pesar de la fuerte respuesta inmune que involucra clulas T CD4+ y CD8+, al

igual que anticuerpos especficos contra los antgenos micobacterianos, sta

puede controlar ms no eliminar la infeccin, lo cual indica que M. tuberculosis ha

evolucionado en diferentes mecanismos para modular o evadir los efectos por

parte del hospedero (macrfagos que hacen parte del granuloma) (Flynn, JL.,

Chan, J. 2003).

En resumen, se puede decir que las micobacterias manipulan la respuesta del

sistema inmune de la siguiente forma: resistencia a los RNIs; detencin de la

maduracin de los fagosomas a fagolisosomas, lo cual hace que se evadan los

efectos antimicrobianos de los lisosomas; inhibicin de la presentacin de

antgenos micobacterianos a las clulas T, entre otros. Todos estos mecanismos

de evasin probablemente y en gran parte promueven la persistencia del patgeno

por aos dentro del hospedero. De gran importancia son todas las molculas que

16

median todas estas estrategias, ya que pueden ser blancos potenciales para

agentes teraputicos contra la micobacteria (Flynn, JL., Chan, J. 2003).

Latencia o Dormancia. En un estado de dormancia, la actividad metablica desciende casi hasta niveles

basales, all, las clulas pueden permanecer por largos periodos de tiempo sin

dividirse. Sin embargo, este estado puede revertir a crecimiento activo si se

encuentran condiciones favorables: pH 6.8 7.0, temperatura de 36C, presin de

oxgeno atmosfrico 20% (Kaprelyants, AS. et al. 1993; Yuan, Y. et al. 1998).

La latencia tambin se ha descrito como persistencia no replicativa (NRP), que

puede explicarse por la ausencia de replicacin o porque el nmero bajo y

constante de bacterias resulta de la dinmica del equilibrio entre la replicacin

bacterial y la eliminacin de ellas por parte del hospedero (Cosma, et al. 2003). La

tuberculosis latente es un sndrome clnico que ocurre luego de que un individuo

ha sido expuesto a la bacteria, se ha establecido la infeccin y se ha generado

una respuesta inmune para controlar el patgeno que lo lleva a un estado

quiescente. Las personas con tuberculosis latente no son contagiosas (Parrish,

NM. et al. 1998). Se cree que algunos factores que contribuyen al inicio de este

estado son la disminucin de nutrientes, la disminucin en pH, la generacin de

productos que limitan el crecimiento y el agotamiento de oxgeno (Yuan, Y. et al.

1998; Wayne et al. 2001; OToole, R. et al. 2003).

Se han identificado diferentes genes que se inducen durante la latencia, como el

gen acr que codifica para la protena alfa cristalina, y el gen icl que codifica para la

enzima isocitrato liasa que hace parte del ciclo del glioxilato (Parrish et al. 1998).

Se puede decir entonces que existen dos hiptesis para explicar el proceso de

regulacin gnica que lleva al desarrollo de la latencia. La primera es, que existe

un cambio en expresin gnica semejante a lo que ocurre cuando las clulas

entran en la fase estacionaria, como resultado de la deprivacin de nutrientes y/o

17

la hipoxia dentro del ambiente granulomatoso. En la segunda hiptesis, se dice

que la micobacteria tiene un programa de desarrollo que conduce a la generacin

de una especie de espora especficamente adaptada para la persistencia y

resistencia frente a condiciones desfavorables de crecimiento (Young, D. et al.

2002).

PRINCIPALES TIPOS DE ESTRS QUE ENFRENTA Mycobacterium tuberculosis EN EL MOMENTO DE INFECCIN La destreza de microorganismos patgenos para soportar el estrs ambiental

tanto fuera como dentro del hospedero, juega un papel crtico para determinar su

xito como patgeno (Bodmer, T. et al. 2000). A continuacin se presentan los

principales tipos de estrs que la micobacteria enfrenta durante la infeccin.

Exposicin a agentes oxidantes El primer estrs al que se ve enfrentada la bacteria es la exposicin a agentes

oxidantes. Los macrfagos activos producen intermediarios de nitrgeno (RNI) y

de oxgeno reactivos (ROI) (Manganelli, et al. 2004). El trmino RNI se refiere a

los estados oxidados y a los productos de nitrgeno de la sintasa de xido ntrico,

que incluyen desde el xido ntrico (NO) a nitrato (NO3) y que se encuentran en

ambientes fisiolgicos. Estos intermediarios incluyen NO-, NO2, NO2- , N2O3, N2O4,

s-nitrosotioles, peroxinitrito (OONO), y complejos de hierro-dinitrosil. Los ROI son

los productos intermediarios de la reduccin del O2 hasta llegar al agua, como son

el superxido (O2), perxido de hidrgeno (H2O2), radicales hidroxilo (OH-) y

productos reactivos de stos con haluros y aminas (Nathan, C., Silo, MU. 2000).

Resistir los efectos del estrs oxidativo y nitrosativo es un proceso crtico para el

establecimiento y mantenimiento de la infeccin por parte de patgenos como M.

tuberculosis.

18

Los ROIs y NOIs pueden daar las bases del ADN, lpidos y varios motivos

qumicos, tales como los clusters de Fe-S, grupos heme, metales de transicin,

entre otros (Zahrt, TC., Deretic, V. 2002, Nathan, C., Silo, MU. 2000). El dao

provocado por los ROIs y RNIs conlleva a una inhibicin general del metabolismo

celular, alterando los procesos asociados con el transporte activo dependiente de

protones, utilizacin de oxgeno y de la fosforilacin oxidativa (Zahrt, TC., Derectic,

V. 2002).

Exposicin a pH cidos El segundo tipo de estrs es la exposicin a pH cido. El bloqueo que la

micobacteria hace a la acidificacin del fagosoma no es completo y stos

empiezan a acidificarse rpidamente despus de la fagocitosis; por lo tanto, se

presenta un descenso en el pH (Manganelli, et al. 2004). Si los bacilos estn

viables, el pH desciende por debajo de 6, aunque luego puede aumentar a 6.5

despus de varias horas. Esta acidificacin se puede ver como una seal que usa

la micobacteria para inducir la expresin de genes que se necesitan para alterar la

maduracin del fagosoma (Fisher, MA. et al. 2002). Sin embargo, un ambiente

cido es una de las condiciones ms estresantes que encuentran las clulas

vivientes, ya que para que funcionen normalmente sus protenas y enzimas, la

bacteria debe mantener un pH interno cercano a 7 (Piddington, DL. et al. 2000).

Los genes que se expresan bajo condiciones cidas juegan un papel en la

patognesis de la tuberculosis permitiendo su adaptacin y supervivencia dentro

de fagosomas y en la parte interior de las lesiones granulomatosas, que tambin

pueden tener un pH cido (Saviola, B. et al. 2003).

Las bacterias Gram positivas pueden presentar varios mecanismos de resistencia

a pH cido. Una combinacin de estrategias constitutivas e inducibles que resultan

en la remocin de protones (H+), alcalinizacin del ambiente externo, cambios en

la composicin de la pared celular, produccin de protenas de choque general y

chaperonas, expresin de reguladores transcripcionales, y respuestas a cambios

19

en la densidad celular, pueden contribuir a la superviviencia (Cotter, PD., Hill, C.

2003).

Alteracin en las estructuras de la superficie celular

El tercer tipo de estrs enfrentado es el dao en estructuras de superficie debido a

la accin de mltiples respuestas por parte del hospedero (Manganelli, et al.

2004). Los macrfagos y las NK, por ejemplo, secretan pptidos txicos y

protenas que actan en la superficie de la micobacteria hidrolizando enlaces de

molculas que permiten la estabilidad de la pared y membrana celular.

Los macrfagos tambin pueden secretar cidos grasos libres (AGL) txicos para

la bacteria dentro del fagosoma y al exterior del mismo (Manganelli, et al. 2004).

Los AGL cumplen un papel sinergco con los RNIs en donde los FFA insertan sus

motivos no polares en la bicapa lipdica de la membrana celular, causando

cambios en la permeabilidad e inactivacin de enzimas respiratorias. Los AGL

median cambios en las funciones de la membrana, lo cual lleva a una

amplificacin de la actividad de los RNIs que causan la inactivacin de las metalo-

enzimas bacterianas e inhiben la sntesis de ADN (Akaki, T. et al. 2000).

Surfactantes alveolares pueden tener un papel de detergentes con actividad

antibacterial (Manganelli, et al. 2004). Los linfocitos T V9/V2 pueden destruir

eficientemente a las micobacterias intra y extracelularmente por medio de

molculas citotxicas como la granulisina y las perforinas (Dieli, F. et al. 2001).

Hipoxia

El cuarto estrs que experimenta la bacteria dentro del granuloma y fagosoma es

la hipoxia. In vivo, la cantidad de bacilos en una lesin generalmente se

correlaciona con el grado de oxgeno presente; esto sugiere que la disponibilidad

de oxgeno puede limitar el crecimiento de la micobacteria durante la infeccin

(Park, HD. et al. 2003). La disminucin de oxgeno es una condicin que se cree

20

puede ser el mejor candidato para la induccin de genes que se expresan en la

persistencia de la micobacteria (Manganelli, et al. 2004).

La adaptacin de la micobacteria frente a la hipoxia dentro del hospedero es un

hecho. Dicha adaptacin parece ser un paso clave en la persistencia del

microorganismo e involucra la accin de varios genes concomitantemente (Mayuri.

et al. 2002). Esta adaptacin es una actividad coordinada a muchos niveles y una

rpida alteracin puede llevar a la muerte celular.

Bajo condiciones de microaerofilia e hipoxia, la micobacteria sufre cambios a nivel

molecular, metablico, estructural y fisiolgico. Uno de ellos es la prdida de la

caracterstica de ser alcohol resistente. Adicionalmente, se produce un

engrosamiento de la pared celular, posiblemente este engrosamiento ayude a la

micobacteria a sobrevivir bajo condiciones de hipoxia in vivo; puede servir como

escudo que ofrece proteccin contra el ambiente hostil y las condiciones txicas

encontradas en el granuloma (Cunningham AF., Spreadbury, CL. 1998). Las

condiciones de hipoxia tambin alteran la resistencia a medicamentos

antituberculosas convencionales y la sensibilidad a metronidazol.

Ausencia de nutrientes

El quinto estrs es la inanicin de elementos esenciales (Manganelli, et al. 2004).

Este se presenta en forma de deplecin de aminocidos, carbohidratos y

micronutrientes; Este episodio coincide con la formacin de los granulomas

(Primm, TP. et al. 2000).

Algunas especulaciones han centrado el papel del metabolismo de lpidos en

mantener la viabilidad de la micobacteria en la ausencia de un crecimiento robusto

por la falta de substrato. Bajo esta aproximacin, conocida sta como la hiptesis

lipoltica, se cree que el ambiente caseoso intragranular es rico en lpidos y la

micobacteria presenta un conjunto de enzimas para utilizar los lpidos como la

fuente primaria de carbono (Cole, ST. et al. 1998; Primm, TP. Et al. 2000).

21

Para que la micobacteria se pueda adaptar a la disminucin de nutrientes, esta

debe utilizar una variedad de mecanismos de control transcripcional. En algunos

casos, la expresin de genes especficos es controlada por factores sigma

alternativos como sigF o sigB. Adicional a esto, algunos microorganismos, entre

ellos M. tuberculosis, traducen la inanicin de nutrientes en la acumulacin de

nucletidos hiperfosforilados de guanina (p) ppGpp- (Primm, TP. et al. 2000). Esto

conduce a alteraciones en la expresin de genes que suprimen la sntesis de

especies de ARN estables (ARNr, ARNt), induce vas degradativas, activa ciertos

genes de fase estacionaria, y modula genes que regulan la replicacin del ADN y

la tasa de crecimiento (Primm, TP. et al. 2000).

GENES INVOLUCRADOS EN EL PROCESO DE LATENCIA Sistema de dos Componentes DosRs

El flujo de seales la comunicacin entre molculas intracelulares en las

bacterias se lleva a cabo principalmente por la transferencia de un grupo fosforil

(fosforilacin) entre dominios conservados de protenas reguladoras de dos

componentes: una donadora y la otra receptora (Saini, DK, et al. 2004B). En el

primer paso, un sensor, que usualmente es una protein-histidin-kinasa se

autofosforila en un residuo histidina conservado, en respuesta a cambios

ambientales extracelulares como tensin de O2, temperatura, pH, iones, solventes

orgnicos, radicales de O2 etc. En el segundo paso, este grupo fosforil es

transferido a un residuo conservado de cido asprtico en el dominio N-terminal

del regulador de respuesta. La regulacin de este sistema ocurre por modulacin

ya sea de la actividad kinasa o fosfatasa de estas protenas (Stock, AM. et al.

1995).

Los sistemas moleculares de dos componentes se encuentran ntimamente

relacionados en la regulacin de la expresin gnica de la bacteria, desde la toma

22

de azcares hasta la virulencia bajo una variedad de cambios de condiciones

ambientales (Dasgupta, N. et al. 2000). M. tuberculosis posee 11 sistemas de dos

componentes completos, los cuales se cree que modulan la expresin de mltiples

genes que facilitan la adaptacin de los bacilos a los cambios ambientales

adversos (Saini, DK. et al. 2004B), (Rodrguez et al 2007)

Entre estos sistemas se encuentra el reguln DosRS. DosR activa la transcripcin

de 47 genes que promueven la supervivencia de Mycobacterium tuberculosis en el

estado no replicativo (Wisedchaisri,G. et al 2005). Los genes dosR-dosS codifican

un regulador de respuesta (RR, 217 aa) y una protena histidinkinasa (HPK, 578

aa) respectivamente. Los marcos abiertos de lectura (ORFs) asignados, al igual

que la descripcin de los genes concuerda con dos de los genes denominados

Rv3133c y Rv3132c respectivamente en el genoma anotado de M. tuberculosis

H37RV (Dasgupta, N. et al. 2000). El locus dosR-dosS se encuentra precedido del

gen Rv3134c que es potencialmente transcrito en la misma direccin del sistema

de dos componentes y se predice que codifica una protena rica en Ala-Val de 28

kDa, de funcin desconocida (Figura 5.) (Dasgupta, N. Et al. 2000; Boon, C., Dick,

T. 2002). Cuando se observa la posicin de los genes, los ORFs que codifican

DosR y DosS se sobreponen en un nucletido, y 27 pb separan Rv3134c de dosR.

Puede ser probable que estos dos genes tengan comportamiento polisistrnico.

Junto con Rv3134c estos tres genes pueden estar formando un opern de

transcripcin continua (Dasgupta, N. et al. 2000).

Figura 5. Organizacin genmica del locus Rv3134c-dosR-dosS. Tomado de

(Mayuri et al. 2002).

23

El Sistema regulatorio de dos componentes dosR-dosS se expresa bajo

condiciones de hipoxia u xido ntrico (NO) al interior de los monocitos, ste

evento no se puede interrumpir, lo cual hace pensar que cumple una funcin

esencial en la fisiologa del organismo (Dasgupta, N. et al. 2000). Sherman et al.

propone que dosR-dosS estn involucrados en la adaptacin del bacilo frente a

tenciones severas de oxigeno al interior del hospedero. Rv3133c parece ser que

controla genes que tambin se expresan bajo esta condicin como el acr, Rv2623

y Rv2626c (Boon, C., Dick, T. 2002). DosR se une a una caja especial (dosR box)

en la regin promotora del acr (Tambien llamado hspX) que codifica para una

protena chaperona alfa cristalina de 16KDa (Wisedchaisri,G. et al 2005). Parece

ser que DosR se une a un motivo particular de la secuencia corriente arriba de los

genes que se expresan bajo condiciones de hipoxia, sin embargo, la unin es

necesaria pero no suficiente para la induccin del gen.

La va de transduccin de la seal es mediada por Rv3132c y tal vez tambin por

su homloga Rv2027c (dosT) (Park, HD. et al. 2003) (una protena de 573

aminocidos que posee un 62.5% de identidad con DosS) (Dasgupta, N. et al.

2000). DosR-DosS media la adaptacin de la bacteria frente a condiciones

adversas a travs de la transcripcin de mltiples genes que conllevan a la

sntesis de mltiples protenas por una cascada de fosforilacin y puede ser un

paso clave regulatorio que une la limitacin de oxgeno y la iniciacin de dosS

dosR y/o mantenimiento de la respuesta adaptativa a la hipoxia (Malhorta, V. et al.

2004).

Adems de la induccin del dosR-DosS por hipoxia, a travs de microarreglos y

RTq-PCR se a demostrado que ste reguln tambin se induce bajo otros tipos de

estrs como exposicin la S-nitrosoglutatione (GSNO), el cual es un donador de

NO, rangos de concentracin de etanol entre el 5 y 10% v/v, perxido de

hidrgeno H2O2 y bajo reposo absoluto standing (Kendall, SL. et al. 2004).

24

Protena Alfa cristalina

La protena alfa cristalina (-crystallin), (Hsp 16.3), codificada por el gen acr

conocido tambin como hspX o Rv2031c, pertenece a la familia de protenas

pequeas de choque trmico (sHSPs), acta como una chaperona ATP

independiente y forma agregados en trmeros de alto peso molecular in vivo

(Yuan, Y. et al. 1996). Sin embargo, esta protena parece no inducirse por choque

trmico (Verbon, A. et al. 1992). Homlogos bacterianos de esta protena se han

encontrado en Bacillus subtilis y estn involucrados en la formacin de esporas y

como respuesta a varios tipos de estrs enfrentados en otros microorganismos

(Yuan, Y. et al. 1998).

El gen acr se induce en la fase estacionaria de la curva de crecimiento y en

cultivos incubados en quietud. Bajo estas condiciones hay cierta disminucin de

oxgeno en el sedimento bacteriano, lo cual puede explicar su induccin (Yuan, Y.

et al. 1996; Florczyk, MA. et al. 2001).

La protena se localiza en la membrana celular, en la infraestructura de la pared

celular y con menos frecuencia en las regiones perifricas de los bacilos, lo cual

sugiere que puede estar asociada con el mantenimiento de la integridad fsica de

la clula; adems, se la encuentra formando complejos agregados activos dentro y

fuera de la clula (Cunningham AF., Spreadbury, CL. 1998). Al asociar la alfa

cristalina con un engrosamiento en la pared celular y su importancia para la

sobrevivencia del patgeno en macrfagos y granulomas, se puede decir que esta

protena facilita el re-arreglo de la pared celular de la micobacteria cuando se

enfrenta a condiciones adversas (OToole, R. et al. 2003). Esta protena le otorga

un alto grado de resistencia a la clula permitiendo una estabilidad en las

protenas que se requieren para reactivar a las micobacterias cuando estn en

presencia de ambientes hostiles. La tensin de oxgeno puede servir como una

seal para expresar protenas como la -cristalina, requerida para la sobrevivencia

a largo plazo y la persistencia no replicativa de la bacteria (Yuan, Y. et al. 1996).

25

La induccin del acr en estados de hipoxia, su funcin como chaperona, su

ubicacin en la pared celular, el efecto negativo de su sobreexpresin en la tasa

de crecimiento, y la correlacin de su concentracin celular con la tolerancia del

bacilo a un choque abrupto anaerbico, sugieren un papel crtico de este producto

en la habilidad de la micobacteria para persistir sin replicarse en las regiones

hostiles del tejido del hospedero (Garbe, TR. et al. 1999; Desjardin, LE. et al.

2001; Sherman, DR. et al. 2001; Mayuri et al. 2002).

Tcnicas de Diagnstico de Mycobacterium tuberculosis. El examen microscpico del extendido de esputos teidos con Ziehl-Nielsen para

bacterias cido-alcohol resistentes, es el mtodo estndar utilizado en el

diagnstico de la tuberculosis. Las ventajas de ste mtodo son, sin duda alguna,

los bajos costos variables y su especificidad en reas de alta prevalencia; sin

embargo, dicha tcnica tiene serias limitantes que obstaculizan la extensin y la

calidad de su aplicacin, afectando en ltimas, su impacto en el control de TB. Los

equipos requeridos son difciles de mantener en campo; los resultados son muy

sensibles a la disposicin y el entrenamiento del personal tcnico, que se suma a

la creciente incidencia de "baciloscopas negativas" en los pases donde la

infeccin por VIH es prevalente. Sumado a lo anterior, el tiempo entre la

recoleccin de la muestra y el diagnstico es muy largo debido a que el

procesamiento de la muestra incluye la descontaminacin y concentracin, el

extendido, secado, tincin y observacin, adems de la necesidad de efectuar los

ensayos por duplicado o triplicado. El resultado es un diagnstico que tarda

mucho, con frecuencia inexacto, y finalmente mina la confianza del paciente en los

servicios del laboratorio y el sistema de salud en general (Kubica GP. 2001).

Las tcnicas que actualmente disponemos para el diagnstico de las

micobacterias son muy numerosas y las podemos englobar en los siguientes

apartados:

26

a. Observacin microscpica de las micobacterias tras tinciones realizadas de

extensiones de las muestras clnicas

b. Diagnstico de las micobacterias mediante diferentes tcnicas de amplificacin

gentica de cidos nucleicos

c. Aislamiento de las micobacterias mediante el cultivo diferenciales en medio

slido o lquido

Diversos grupos en el mundo han tratado de utilizar las tcnicas inmunolgicas

para el desarrollo de diagnsticos en TB. Una prueba basada en la reaccin

antgeno-anticuerpo tal como aglutinacin que no requieren alta tecnologa seran

ideales para el diagnostico de la bacteria en todos los campos de diagnostico de

enfermedades infeccionsas. La mayora de estas pruebas serolgicas utilizan

antgenos purificados o mezclas de antgenos de Mycobacterium tuberculosis que

son luego identificados por anticuerpos presentes en el suero de pacientes

tuberculosos. Desafortunadamente, y a pesar de una investigacin permanente en

este campo, las pruebas desarrolladas no han dado los resultados de

especificidad ni sensibilidad que ameriten el reemplazo de la baciloscopia.

Los grandes avances en el conocimiento de Biologa molecular en cuanto a

tcnicas de diagnostico para enfermedades infecciosas, han permitido conocer

las secuencias especificas de DNA o RNA para cada especie de micobacterias,

siendo as, la mejor alternativa para lograr una rpida y correcta identificacin.

Entre estas tcnicas se incluyen las sondas de cidos nucleicos marcadas con

istopos radiactivos, la amplificacin de segmentos especficos, la secuenciacin

del 16S rRNA, el anlisis de la restriccin de fragmentos polimrficos (RFLP).

Actualmente y gracias a la secuencia del genoma de Mycobacterium tuberculosis

(Cole et al., 1998; Fleishman et al., 2002) y a los avances en los estudios de

27

protemica y expresin de protenas, se abre una nueva posibilidad para el

desarrollo de este tipo de diagnsticos basados en el reconocimiento especfico de

cada uno de las protenas expresadas

ANLISIS DE LA EXPRESIN DE PROTENAS BAJO LAS DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRS. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE La electroforesis es un mtodo analtico semipreparativo, en el que se separan

biomolculas, en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la accin de

un campo elctrico, fue empleado por primera vez por Tiselius en el ao 1937

(Garcia, H. 2000). Esta tcnica se basa en la migracin de solutos inicos bajo la

influencia de un campo elctrico; estos solutos migran hacia el ctodo o nodo

segn su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Sirve como mtodo de

separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras

biomolculas donde aportan un grado de pureza considerado (Garcia, H. 2000).

Es una tcnica til adems para determinar el peso molecular y el nmero de

cadenas polipeptidicas de una protena.

Western blot. Es un mtodo de transferencia cuantitativa de protenas ribosomales entre

muchas ms, las cuales son separadas en primer lugar por electroforesis en geles

de poliacrilamida y posteriormente son transferidas a una membrana de

nitrocelulosa mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular

(electrobloting) (Towbin et al 1979). Posterior a este proceso, se realiza un

enfrentamiento entre un anticuerpo que reconocer la protena de inters dentro

de todas las protenas que fueron fijadas a la membrana; seguido de un paso de

rebelado como indicador del complejo protena-anticuerpo.

28

Formas de abordar el estudio. Modelos in vivo e in vitro

Como el proceso de la latencia y persistencia no replicativa en M. tuberculosis

puede tomar varios aos en manifestarse en el hospedero, se han desarrollado

varios modelos in vitro e in vivo para similar las caractersticas y ambientes de

una infeccin latente. Aunque estos modelos son limitados en su capacidad de

recapitular completamente las caractersticas de la bacteria y el humano, proveen

una plataforma til para poder iniciar estudios que asignan aspectos especficos

en el proceso de infeccin (Zahrt, TC. 2003).

A travs de los modelos in vitro, se puede estudiar la expresin de diferentes

genes que codifican para protenas que le otorgan grados de resistencia frente a

condiciones adversas que sufre la bacteria en el hospedero al momento de la

infeccin (Wayne, LG; Sohaskey, CD. 2001).

.

29

MATERIALES Y MTODOS Cepas bacterianas y medios de cultivo. En este proyecto se utiliz la cepa de Mycobacterium bovis BCG donada por la

Universidad autnoma de Madrid a la Corporacin CorpoGen. Por su alto grado de

homologa a nivel gentico y molecular, M. bovis BCG se puede manipular como

una cepa avirulenta de M. tuberculosis (Sherman, DR. et al. 2001).

El medio de cultivo para el crecimiento de las micobacterias fue medio lquido

Middlebrook 7H9 cuya composicin se describe en la Tabla 2.

Tabla 2. Composicin del Middlebrook 7H9 (Difco laboratories).

Compuesto Cantidad % (p/v)

Sulfato de amonio 0.05

cido glutmico 0.05

Citrato de sodio 0.01

Clorhidrato de piridoxina 1*10-4

Biotina 5*10-5

Fosfato dibsico de sodio 0.27

Citrato de hierro (III) y amonio 4*10-3

Fosfato monobsico de potasio 0.1

Sulfato de magnesio 5*10-4

Sulfato de zinc 1*10-4

Cloruro de calcio 5*10-5

Sulfato de cobre 1*10-4

Este medio fue suplementado con Tween 80 al 0.05% (v/v) (J.T. Baker), glicerol al

0.2%(v/v) (MolLabs), y ADC (complejo dextrosa albumina) al 10% (v/v) que

30

contiene albmina bovina (Sigma), glucosa (Mallincknodt) y cloruro de sodio

(MolLabs). Se us igualmente este mismo medio en forma slida conteniendo agar

(Difco laboratories) suplementado con Tween 80 al 0.05% (v/v) (J.T. Baker),

glicerol al 0.2% (v/v) (MolLabs), y ADC al 10% (v/v).

Condiciones de crecimiento.

La cepa de M. bovis BCG se cultiv por duplicado en frascos Schott tapa rosca de

250 ml con un volumen particular (segn la necesidad de cada experimento) de

medio lquido Middlebrook 7H9 (Difco laboratories). Los cultivos se mantuvieron a

37C en agitacin a 150 rpm en un agitador orbital durante un periodo de 7 das.

Al cuarto da de crecimiento (fase exponencial) se realizaron pases a medio de

cultivo nuevo y fresco con el fin de trabajar con clulas en fase exponencial en

cada experimento.

Estandarizacin del lisado de Mycobacterium bovis BCG.

Para la lisis de la micobacteria se parti de un volumen de 1.5 ml del cultivo lquido

en fase exponencial, se recuperaron las bacterias por centrifugacin y se lavaron

dos a tres veces con tampn Tris-EDTA 10mM (TE) con el fin de retirar los

residuos de medio. Sobre el pellet de bacterias lavadas se probaron tres

siguientes protocolos:

Protocolo No. 1: Lisis enzimtica.

Para la ruptura de la pared celular, se us lisozima a una concentracin de 2.5

mg/ml durante 30 minutos a 37C, seguido de un paso de lisis bacteriana usando

el detergente inico dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1% (p/v) y 85C de

temperatura por 3 minutos.

31

Protocolo No. 2: Lisis mecnica. En este caso se us rompimiento mecnico. Para ello el pellet lavado se

resuspendi en tampn de lisis TEDP (TrisHCl 10mM pH 7.4, SDS 1% (p/v),

EDTA 1mM, PMSF 0.2mM) y se resuspendi en un volumen equivalente de perlas

de vidrio de 0.5 mm de dimetro previamente tratadas con cido clorhdrico 8.4M.

La ruptura mecnica se llev a cabo en un Mini Bead Beater Bio-Spec a mxima

velocidad en un solo ciclo de 5 minutos a temperatura ambiente.

Protocolo No. 3 Lisis por ebullicin.

En este mtodo, el pellet de clulas lavadas se coloc directamente en tampn

de carga de electroforesis (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8, SDS 2% (p/v), DDT 0.1 M

(p/v), 0.01% (p/v) Azul bromofenol, Glicerol 10% (v/v) y se llev a ebullicin por

tres minutos.

Estandarizacin de las diferentes condiciones de estrs in vitro de Mycobacterium bovis BCG.

Para cada uno de los mtodos de estrs diseados se establecieron controles

negativos que tenan el mismo procedimiento de las muestras estresadas pero sin

el agente causal del estrs.

Estrs por pH cido. Este tipo de estrs se realiz segn los autores mencionados a continuacin con

algunas modificaciones acordes a las condiciones de trabajo. Se evaluaron

diferentes valores de pH (4.5; 5.5; y 6.0) y diferentes tiempos de exposicin a los

mismos como se describe a continuacin:

32

Para el pH 4.5 los tiempos evaluados fueron 30 y 60 minutos segn Yuan et al.

1996.

Para el pH 5.5 los tiempos evaluados fueron 30 y 60 minutos segn Hu et al.

2005.

Para el pH 6.0 los tiempos evaluados fueron 30 y 60 minutos segn Fisher et al.

2002 y Burbano et al 2005.

A partir de un cultivo lquido de M Bovis BCG en fase exponencial, se tomaron

alcuotas de 5 ml en tubos de 50 ml, se retir el medio de cultivo por centrifugacin

a 13000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente y las bacterias fueron re-

suspendidas en medio lquido Middlebrook 7H9 (descrito anteriormente) cuyo pH

fue ajustado a los valores 4.5, 5.5 y 6.0 por medio de solucin amortiguadora de

acetato de sodio a una concentracin final de 50 mM. Estos se llevaron a

incubacin a 37C y 150 rpm durante los tiempos ya mencionados. Transcurrido el

tiempo de estrs en pH cido, el medio acidificado fue retirado por centrifugacin

y las clulas se lisaron por el mtodo escogido (mtodo mecnico). El perfil

proteico se analiz mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

33

Figura 6. Procedimiento estrs por pH.

Estrs por alcohol (etanol). Este tipo de estrs se realiz segn Kendall et al. 2003 y Hu et al. 2005 con

algunas modificaciones. A partir de un cultivo lquido de M Bovis BCG en fase

34

exponencial, se tomaron alcuotas de 5 ml en tubos de 50 ml, se retir el medio de

cultivo por centrifugacin a 13000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente y las

bacterias fueron resuspendidas en medio lquido Middlebrook 7H9 suplementado

con etanol a una concentracin final de 5, 10 y 15% (v/v) y llevadas a incubacin a

37C y 150rpm. Para cada concentracin se evaluaron los tiempos 15, 30 y 60

minutos. Transcurridos los cuales, el medio con etanol fue retirado por

centrifugacin y las clulas se lisaron por el mtodo escogido. El perfil proteico fue

analizado por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

35

Figura 7. Procedimiento estrs por etanol.

36

Estrs oxidativo (H2O2). Este tipo de estrs se realiz segn lo reportado por Hu et al. 2005 y Kendall et al.

2003 con algunas modificaciones. A partir de un cultivo lquido de M Bovis BCG en

fase exponencial, se tomaron alcuotas de 5 ml en tubos de 50 ml, se retir el

medio de cultivo por centrifugacin a 13000 rpm por 5 minutos a temperatura

ambiente y las bacterias fueron re-suspendidas en medio lquido Middlebrook 7H9

suplementado con perxido de hidrgeno (H2O2) como agente oxidante a una concentracin final 10, 15 y 20 mM. Los tiempos de exposicin evaluados fueron

30, 60 y 90 minutos y 150 rpm para cada una de las concentraciones.

Transcurridos los tiempos de estrs, el medio con perxido se retir por

centrifugacin y las clulas fueron lisadas por el mtodo escogido, luego se

evidenci el patrn de migracin de las protenas expresadas mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

37

Figura 8. Procedimiento ests oxidativo.

Estrs por hipoxia. Este tipo de estrs se realiz segn Cunningham et al. 1997 con algunas

modificaciones. A partir de un cultivo lquido de M Bovis BCG en fase exponencial,

38

se tomaron alcuotas de 5 ml en tubos tapa rosca, se retir el medio de cultivo por

centrifugacin a 13000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente y las bacterias

fueron resuspendidas en medio lquido Middlebrook 7H9 fresco. A cada tubo se le

adicion parafina lquida para generar un ambiente anaerbico. Los tiempos de

evaluacin en este ambiente de hipoxia fueron 2, 4 y 7 horas. Transcurrido el

tiempo de estrs, se retir la parafina y el medio de cultivo y las clulas fueron

lisadas por el mtodo escogido. El perfil proteico fue analizado mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

39

Figura 9. Procedimiento estrs por hipoxia.

40

ANLISIS DE LA EXPRESIN DE LA PROTENA ALFA CRISTALINA BAJO DIFERENTES CONDICONES DE ESTRS Cuantificacin de protenas totales a partir de lisados de Mycobacterium bovis BCG. Sobre cada uno de los lisados celulares se determin la concentracin de protena

total por el mtodo de Bradford M.M 1976 adaptado a microplaca con el fin de

determinar las diferencias de este parmetro en los diferentes tratamientos de

estrs teniendo como referencia los controles utilizados. Igualmente se us para

colocar cantidades de protena equivalentes en cada electroforesis. Para cada

cuantificacin se elabor una curva de calibracin utilizando un patrn de

gamaglobulina G entre 80 y 5 g/ml Electroforesis denaturante en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). La separacin de las protenas se realiz mediante electroforesis denaturante en

gel de poliacrilamida (17%T, 3%C) siguiendo el mtodo descrito por Laemmli en

1970, usando una cmara Mini-Protean II miniGel BioRad, bajo las indicaciones

del fabricante. El corrido electrofortico se realiz a voltaje constante (100 V los

primeros 15 minutos, 150 V por 2 horas. Los geles fueron teidos con Azul

brillante de Coomassie R-250 y desteidos en una mezcla metanol 40%(v/v),

acido actico 10%(v/v)..

Para llevar a cabo el anlisis de los perfiles proteicos, se corrieron

simultneamente patrones de peso molecular (10-250 KDa Invitrogen) que

permitieron evidenciar la posicin de la protena alfa cristalina.

41

RESULTADOS

Condiciones de crecimiento

La cepa de Mycobacterium bovis BCG fue cultivada en medio lquido Middlebrook

7H9 (Difco laboratorios) por duplicado a 37C en agitacin a 150 rpm durante 8

das. Las muestras de los cultivos fueron tomadas al quinto da de crecimiento,

(fase exponencial). La densidad ptica (D.O.520nm) de los cultivos correspondiente

al da de muestreo oscil entre 0.532 y 0.588nm y se tuvo un recuento de

unidades formadoras de colonias entre 6,6x105 y 8.4x105 ufc/ml.

Cuantificacin de protenas totales a partir de lisados de Mycobacterium bovis BCG sometidos a deferentes mtodos de estrs.

Se realiz la cuantificacin de protenas totales por el mtodo de Bradford

adaptado a microplaca a partir de lisados celulares sometidos a los diferentes

mtodos de estrs. Para cada cuantificacin se elabor una curva de calibracin

utilizando un patrn de gamaglobulina G entre 80 y 5 g/ml. El coeficiente de correlacin de las diferentes curvas de calibracin siempre fue mayor de 0.99.

Los datos de protena total de cada tipo de estrs aparecen ms adelante junto a

cada una de las electroforesis respectivas.

Estandarizacin de lisado de Mycobacterium bovis BCG.

Se probaron tres protocolos para la lisis de la bacteria: lisis enzimtica, lisis

mecnica y lisis por ebullicin, cada uno por triplicado. El patrn de migracin

electrofortico de las protenas por SDS-PAGE fue similar entre los tres protocolos

(Figura 10). Este experimento no tuvo determinacin de protena total.

42

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mtodo

delisis.

Eb.

Eb.

Eb.

Mec.

Mec.

Mec.

M.T

Enz.

Enz.

Enz.

Figura 10. Electroforesis en gel de poliacrilamida a partir de lisados celulares de

Mycobacterium bovis BCG por diferentes mtodos: Eb: ebullicin; Mec: mecnico;

Enz: enzimtico; M.T: marcador de talla molecular.

Anlisis de la expresin de la protena Alfa cristalina bajo diferentes condiciones de estrs.

Cultivos de Mycobacterium bovis BCG fueron sometidos a diferentes tipos de

estrs (pH, Hipoxia, etanol, H2O2) probados independientemente y en algunas

combinaciones de los mismos para observar bajo cual de todos ellos se sobre-

expresaba la protena Alfa cristalina de 16 KDa. Cada tipo de estrs tuvo dos

replicas y su correspondiente control negativo (condiciones normales de

crecimiento). Una vez estresadas las bacterias se procedi a lisarlas por el mtodo

mecnico. Todos los resultados de los diferentes tipos de estrs fueron analizados

por SDS-PAGE.

43

Estrs por pH

Con el fin de simular las condiciones adversas de crecimiento que enfrenta el

bacilo tuberculoso dentro del hospedero, se llev a cabo un choque cido in-vitro a

diferentes pHs. Los cultivos de Mycobacterium bovis BCG en fase logartmica

fueron estresados a pH 4.5; 5.5 y 6.0 en medio lquido Middlebrook 7H9 (Difco

laboratorios) por 1 da. El patrn de migracin electrofortico mostr una mayor

intensidad en la banda a nivel de 16 KDa (segn marcador de talla molecular para

protenas) a pH 5.5 y 6.0 respectivamente, mientras que a pH 4.5 la intensidad de

la banda a la altura de 16KDa fue menos intensa (figura 11 siguiente hoja).

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH.

Tiempodeestrs(minutos)

C.N

5.5

30

5.5

60

4.5

30

4.5

30

6.0

30

M.T

6.0

60

6.0

60

Vacio

44

Figura 11. Electroforesis en gel de poliacrilamida a partir de lisados celulares de

Mycobacterium bovis BCG sometidos a estrs por pH. M.T: marcador de talla

molecular; C.N: Control negativo

Tabla No 3. Cuantificacin de protenas a partir del estrs por pH.

Estrs Promedio [g/l]

pH C.N 4.5 5.5 6.0

6,893 6,923 7,448 7,567

% de expresin 100 100 108 110

C.N: control negativo

Estrs por hipoxia

Con el mismo fin del estrs de pH cido se realiz el estrs por hipoxia de

Mycobacterium bovis BCG. Los cultivos se dividieron en alcuotas de 5ml, se

agreg azul de metileno como indicador del consumo de oxgeno y parafina lquida

para generar el ambiente anaerbico. Los cultivos fueron evaluados diariamente

(cada 24 horas) por un periodo de cuatro das. A partir del primer da de hipoxia

(carriles 2 y 3 figura 12 siguiente hoja) se observ una mayor intensidad de la

banda a la altura de 16 KDa, que con el transcurso del tiempo (a partir del carril 4)

la banda se hace ms notoria y constante (carriles 6 al 10). El mayor incremento

en la cantidad de protena total se observ en el transcurso entre el da 1y da dos

de estrs (Tabla 4).

45

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dasde

Hipoxia

C.N

1

1

2

M.T

2

3

3

4

4

Figura 12. Electroforesis en gel de poliacrilamida a partir de lisados celulares de

Mycobacterium bovis BCG sometidos a estrs por hipoxia. M.T: marcador de talla

molecular: C.N: Control negativo.

Tabla No 4. Cuantificacin de protenas a partir del estrs por hipoxia.

Estrs Promedio [g/l]

Hipoxia C.N Da 1 Da 2 Da 3 Da 4

7,012 7,221 8,332 8,124 8,193

% de expresin 100 103 119 117 117

C.N: control negativo

46

Estrs por alcohol (etanol).

Cultivos de Mycobacterium bovis BCG se dividieron en alcuotas de 5ml y fueron

resuspendidos en medio lquido Middlebrook 7H9 (Difco laboratorios) modificado

con etanol llegando a una concentracin final de 5, 10 y 15% (v/v). Las muestras

fueron evaluadas por un periodo de dos das tomando muestras cada da. En el

patrn de migracin electrofortico no se observaron diferencias en la expresin

de la banda a la altura de 16KDa entre las diferentes concentraciones de etanol

evaluadas (figura13).

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Estrs,

tiempo(das)

y

concentracin

%(p/v)

C.N

Et

1

5

Et

2

5

Et

1

10

Et

2

10

Et

3

10

M.T Et

1

15

Et

2

15

Vacio

Figura 13. Electroforesis en gel de poliacrilamida a partir de lisados celulares de

Mycobacterium bovis BCG sometidos a estrs por etanol al 5, 10 y 15% (p/v).

M.T: marcador de talla molecular; C.N: Control negativo; Et: etanol.

47

Tabla No 5. Cuantificacin de protenas a partir del estrs por etanol al 5, 10 y

15% (v/v).

Estrs Promedio [g/l]

Etanol C.N 5% 10% 15%

5,243 5,256 5,245 5,112

% de expresin 100 100 100 98

C.N: control negativo

Estrs oxidativo H2O2

Los cultivos de Mycobacterium bovis BCG fueron divididos en alcuotas de 1.5 ml

y se resuspendieron en medio lquido Middlebrook 7H9 modificado con perxido

de hidrgeno H2O2 a una concentracin final de 10, 15 y 20 mM. El estrs se

evalu a los 30, 60 y 90 minutos de estrs. En el patrn de migracin

electrofortico se observ que la expresin de la protena alfa cristalina 16 KDa es

mnima comparada con el control negativo (figura 14 siguiente hoja). No se

observaron diferencias entre las concentraciones a los tiempos evaluados.

48

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[mM]de

H2O2

Tiempo

(minnutos)

10

15

10

30

10

60

15

15

15

30

C.N

20

15

20

30

20

60

M.T

Figura 14. Electroforesis en gel de poliacrilamida a partir de lisados celulares de

Mycobacterium bovis BCG sometidos a estrs oxidativo por H2O2 10,15 y 20 mM.

M.T: marcador de talla molecular; C.N: Control negativo

Tabla No 6. Cuantificacin de protenas a partir del estrs por peroxido de

hidregeno 10,15 y 20mM.

Estrs Promedio [g/l]

Peroxido de hidrogeno

C.N 10mM 15mM 20mM

6,003 6,022 6,100 6,083

% de expresin 100 100 102 101

C.N: control negativo

49

Estrs por pH e hipoxia.

A partir del resultado de estrs por pH y por hipoxia, se estableci el pH 5.8 como

punto intermedi para estresar las bacterias por tiempos ms prolongados (4 das)

en estrs por hipoxia. La combinacin de los dos mtodos de estrs se evalu

tomando muestras cada da. En el patrn de migracin electrofortico se observa

una mayor intensidad de color de la banda a nivel de 16KDa en todos los das de

estrs (1,2, 3 y 4 de la figura 15). La intensidad de la banda fue constante durante

los das evaluados

Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dasen

Hipoxia

apH

5.8

C.N

1

1

2

2

3

M.T

3

4

4

Figura 15. Electroforesis en gel de poliacrilamida a partir de lisados celulares de

Mycobacterium bovis BCG sometidos a estrs por pH 5.8 en hipoxia por 4 das.

M.T: marcador de talla molecular; C.N: control negativo.

50

Tabla No 7. Cuantificacin de protenas a partir del estrs por hipoxia a pH 5.5.

Estrs Promedio [g/l]

Hipoxia a pH 5.5 C.N Da 1 Da 2 Da 3 Da 4

7,129 8,334 8,357 8,391 8,398

% de expresin 100 117 117 118 118

C.N: control negativo

51

DISCUSIN DE RESULTADOS

Mycobacterium tuberculosis enfrenta un ambiente dinmico de estmulos hostiles

al interior del hospedero, todo ellos son adversos para su permanencia,

crecimiento y desarrollo (Bacon et al 2007). Dentro de esos estmulos se

encuentra el descenso de pH, hipoxia, inanicin, presencia de compuestos txicos

como el oxido ntrico y perxido de hidrogeno, siendo todos un conjunto de

seales censadas que generan una respuesta transcripcional de muchos genes,

otorgndole al bacilo resistencia para la adaptacin, sobrevivencia y posterior

replicacin dentro del hospedero (Madigan et al. 2000). Los resultados de los

diferentes tipos de estrs evaluados en este trabajo evidenciaron la expresin de

la protena alfa cristalina como respuesta frente al estrs por pH, hipoxia, y

combinaciones entre ambos respectivamente. No se evidenci incremento en la

expresin de la protena en etanol al 5 y 10%(p/v) ni en perxido de hidrogeno 10,

15 y 20 mM.

En el estrs por pH, la protena de inters Alfa cristalina y el resto de protenas

caractersticas del lisado de Mycobacterium bovis BCG tuvieron una mejor

resolucin a pH 4.5, a diferencia de los otros dos pH evaluados 5,5 y 6,0 donde

se observ la protena de 16KDa y un bandeo caracterstico de Mycobacterium

bovis BCG. Estudios realizados en quimiostato demostraron que Mycobacterium

bovis BCG puede crecer en un rango de pH entre 5.0 y 6.0, a valores inferiores de

pH el bacilo no puede crecer (Bacon et al 2007). El choque cido a pH 4.5 al que

fue sometido la bacteria en este experimento fue brusco comparado al que hubiera

tenido en un fagosoma infectado (valor mximo de 5.1). A pH 4.5 quizs se

denaturaron protenas de la superficie celular, impidiendo as la homeostasis

necesaria para el equilibrio de protones del medio extracelular respecto al

intracelular, generando as lisis de la bacteria. Las protenas del metabolismo

celular y la replicacin de cidos nucleicos pueden ser afectadas por los efectos

52

del pH cido (denaturacin) impidiendo el crecimiento de la bacteria. Lo anterior se

puede correlacionar con los resultados obtenidos por (Bacon et al 2007) donde

evalu el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en quimiostato a diferentes

pH, encontrando que el bacilo tuberculoso puede crecer en un rango de pH entre

5.1 y 6.0; valores inferiores a 5.1 el bacilo no present crecimiento.

Shinnik et al. en el 2002 y Kendall et al. en el 2004 examinaron la respuesta de

Mycobacterium tuberculosis en medio cido a travs de micro-arreglos

encontrando 8 genes involucrados en la biosntesis de lpidos (mayor componente

de la pared celular) y protenas trans-membranales como la kdpA, kdpB y kdpC

que realizan procesos de transferencia de hidrogeno (H+) y potasio (K+)

(www.tuberculist.com). Siendo la Alfa cristalina una protena de la pared celular,

la sntesis de la misma puede estar influenciada por los efectos del pH cido

mencionado anteriormente. En el pH 5.5 y 6.0 a los 30 y 60 minutos de estmulo la

expresin de la protena Alfa cristalina fue levemente notoria. La cuantificacin de

protenas totales en este estrs respaldan esta hipotesis debido a que la expresin

de protenas increment en un 8% a pH 5.5 y 10% a pH 6.0 (Tabla No 3) respecto

al control negativo despus del tratamiento. Estos resultados concuerdan con el

trabajo realizado por Rodrguez et al 2005 en donde observaron a travs de PCR

en tiempo real un incremento en el hspX-mRNA y en el mRNA-DosR de 70 veces

bajo el estrs por pH durante 30 y 60 minutos (datos por publicar). Segn los

resultados de Rodrguez et al 2005 accepted Tuberculosis, en este experimento se

hubiera esperado un mayor incremento en la cantidad de protena y en la

intensidad de la banda correspondiente a la protena Alfa cristalina de la que se

obtuvo (figura 11). Hu et al 1998, a travs de Northern blot report que el hspX-

mRNA es una molcula muy inestable debido a su corto tiempo de vida media (2

minutos), por ende se podra sugerir que en el transcurso de la sntesis de hspX-

mRNA a la traduccin a protena Alfa Cristalina podran ocurrir un conjunto de

eventos que no dejan que todo los hspX-mRNA se traduzcan a protena.

intensidad respecto a los diferentes tipos de estrs probados individualmente (pH,

H2O2 y etanol). Desde el primer da de hipoxia la protena fue expresada (figura

53

12, carriles 2 y 3), la intensidad se increment gradualmente a partir del segundo

da de estrs (con excepcin del carril 3 como consecuencia de una mayor carga

de protena de la muestra 4 respecto a la 3) y se mantuvo constante durante el

tiempo experimental, evidenciando as que la alfa cristalina es una protena

estable una vez expresada. Los resultados de la cuantificacin de protenas

totales concuerdan con lo anterior ya que se observ un incremento del 3, 19 y

17% en la expresin despus del tratamiento hipoxico (Tabla 5) respecto al control

negativo.

La estabilidad de esta protena est relacionada con la funcin que esta cumple

dentro de clula, ya que Lim et al 1999, Desjardin et al 2001 y Sherman et al 2003

reportaron a la alfa cristalina como una protena que ayuda a conservar la

integridad de la clula bajo condiciones hostiles de crecimiento, factor que

favorece el estado de latencia del bacilo dentro del hospedero (Bacon et al 2007).

Los resultados obtenidos en este experimento coinciden con los reportes

realizados por Lim et al 1999, Desjardin et al 2001, donde expresaron la protena

bajo estrs por hipoxia en un transcurso de 8 a 40 das. En este experimento la

expresin de la alfa cristal se logr evidenciar a las primeras 48 horas de estrs; la

diferencia en cuanto a tiempos de expresin se debe quizs a la relacin de

volumen del cultivo lquido respecto al recipiente, ya que en este experimento el

estrs se realiz en microtubos de 1.5 ml donde el espacio para el oxgeno es

mucho mas limitado que en frascos de 1L utilizados por Desjardin et al 2001.

El perxido de hidrgeno (H2O2) a concentraciones 10mM y 20mM, y el etanol al

5,10 y 15% (V/v) no fueron buenos inductores para la expresin de la alfa

cristalina, debido a que no se evidenci una mayor intensidad de la banda a la

altura de 16KDa en ninguna de las concentraciones y tiempos evaluados (figuras

13 y 14), y no hubo incremento en la concentracin de protenas totales respecto

al control negativo despus del los tratamientos (tablas 6 y 7). Kendall et al 2004 a

travs de microarreglos, report un incremento en la sntesis del mRNA del

sistema de dos componentes DosRs de 70 y 6 veces mediante etanol al 5% (v/v) y

54

H2O2 respectivamente. Segn los resultados obtenidos por kendall et al 2004 en

este experimento se hubiera esperado que la expresin de la alfa cristalina fuese

mucho ms notoria de lo que se obtuvo, ya que el gen hspX est regulado por el

DosR. Este hecho hace pensar que al igual que en el estrs por pH,durante el

proceso de traduccin del mRNA-hspX a protena existe algn evento que no

permite la traduccin de ese mensajero a protena en la cantidad esprada.

Debido a que los estreses por pH e hipoxia resultaron en una mayor intensidad de

la banda a la altura de 16KDa y con el fin de llevar a cabo una mayor

aproximacin al ambiente dinmico de eventos que experimenta Mycobacterium

tuberculosis al interior del granuloma, se realiz la combinacin entre estos dos

mtodos de estrs. El resultado de este experimento (figura 15) mostr que la

intensidad de la banda a la altura de 16KDa se increment respecto al estrs por

pH y fue muy similar al estrs por hipoxia, evidenciando as que la hipoxia es la

seal censada por el bacilo tuberculoso que induce en mayor nivel la expresin de

la protena Alfa Cristalina cuando se combinan estos dos mtodos de estrs. Los

resultados de la cuantificacin de protenas demostraron un incremento del 17

18% en la expresin de protenas respecto al control negativo despus del

tratamiento.

Las otras posibles combinaciones de los diferentes mtodos de estrs no se

llevaron a cabo debido a que los resultados de cada uno de ellos evaluados de

forma individual no presentaron intensidades de la banda a la altura de 16KDa ni

incremento en los porcentajes de expresin obtenidos a partir de la cuantificacin

por el mtodo de Bradford. La combinacin de todos los mtodos de estrs

evaluados en este trabajo hubieran reflejad una mayor aproximacin al ambiente

en el interior del granuloma, pero debido a que los resultados del estrs por H2O2 y

por etanol evaluados individualmente no fueron satisfactorios, no se llevaron a

cabo las posibles combinaciones.

Sherman et al 2003 encontr que bajo condiciones de hipoxia el gen hspX es el

nico (dentro de los 47 genes que regula el DosR) que posee dos sitios de

55

reconocimiento (uno proximal y otro distal) por parte del DosR. De esta forma,

bajo condiciones anaerbicas se potencializa la expresin de la alfa cristalina,

razn por la cual, en el estrs por hipoxia la intensidad de la banda es mayor que

en los otros mtodos de estrs evaluados de forma individual. La hiptesis

planteada por Sherman et al 2003 coincide con los resultados obtenidos es este

trabajo, ya que la banda a la altura de 16 KDa fue de poca intensidad en el estrs

por pH y no fue observada en H2O2 y etanol, mientras que en la combinacin pH-

hipoxia, la banda a la altura de 16Kda fue ms notoria respecto a los mtodos de

estrs probados individualmente.

En vista que el experimento para el reconocimiento de la protena Alfa cristalina

utilizando Western blot no se logr ejecutar, debido a que el anticuerpo

monoclonal no alcanz a llegar a tiempo para la finalizacin de esta tesis y que

hubiera sido la prueba confirmatoria para identificar la protena Alfa cristalina

16KDa, se procedi a realizar una revisin bibliogrfica y bsqueda en BoviList

Web Server (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/genome.cgi) para encontrar

protenas con un peso molecular similar al de la Alfa cristalina 16227.24Da, y los

factores por los cuales stas se expresan para tener mayor confiabilidad respecto

a la validez de los datos obtenidos. Los resultados de la revisin y la bsqueda

(datos no mostrados) indicaron que el proteoma de Mycobacterium bovis BCG y

Mycobacterium tuberculosis posee 16 protenas entre 15158.92 y 16292.63Da. De

las cuales solamente 6 poseen valores muy cercanos al de la Alfa Cristalina (entre

16013.22 y 16292.63Da); de esas 6 protenas, 4 son protenas hipotticas

conservadas (se han encontrado en otras cepas pero su funcin no ha sido

determinada) y las otras dos Carboximuconolactona decarboxilasa CMD y

Succinato deshidrogenasa estn involucradas en el catabolismo de compuestos

aromticos y en el ciclo de cidos tricarboxlicos respectivamente. Dentro de estas

6 protenas ninguna se encontr que fuera inducible bajo estrs por hipoxia, pH,

perxido de hidrgeno o etanol, y ninguna de ellas ha sido reportada como

protenas de mantenimiento ni que la expresin de sus correspondientes genes

estn regulados bajo el sistema de dos componentes DosR (Sherman et al 2003,

56

http://genolist.pasteur.fr/TubercuList)

(http://www.tigr.org/tigrscripts/CMR2/GenomePage3.spl?database=gmt.).

Los resultados obtenidos a partir de la revisin bibliogrfica, la bsqueda en las

bases de datos descritas anteriormente, y la cuantificacin de protenas totales,

sugieren que el incremento en la intensidad de la banda a la altura de 16KDa de

Mycobacterium bovis BCG es consecuencia de la expresin de la protena Alfa

cristalina despus de someter la bacteria a los diferentes mtodos de estrs y no

como la sumatoria de las 15 protenas de pesos similares.

Los resultados de la cuantificacin de protenas por la tcnica de Bradford del

estrs por pH, hipoxia y la combinacin de ambos, demostraron que la cantidad de

protena total increment respecto al control negativo de cada uno, de igual forma,

en esos tratamientos se observ mayor intensidad de la banda a la altura de

16KDa, lo cual permite sugerir que el incremento en la cantidad de protena total

encontrada a travs de la tcnica de Bradford es el resultado de la expresin de la

protena Alfa cristalina como respuesta al mantenimiento celular que requiere el

bacilo cuando se encuentra en ambientes hostiles de crecimiento como lo son pHs

cidos e hipoxia.

.

CONCLUSIONES

57

Se logr establecer un protocolo para la lisis de Mycobacterium bovis BCG a partir

del mtodo mecnico, ya que a travs de este se observ el mejor bandeo de las

protenas intracelulares; a dems es un mtodo rpido, eficaz y econmico.

Comparando los porcentajes de expresin de protenas a partir de la cuantificacin

de cada uno de los mtodos de estrs por la tcnica de Bradford, y comparando la

intensidad de la banda de cada uno, se encontr que el mejor agente inductor fue

la combinacin entre el estrs por hipoxia y pH 5.5.

A travs de resultados cualitativos (SDS-PAGE) y cuantitativos (Bradford) se

comprob que el perxido de hidrgeno (H2O2) a 10, 15 y 20mM, y el etanol al 5,

10 y 15y% (p/v) no son buenos inductores para la expresin de la protena Alfa

cristalina de 16KDa.

58

TRABAJOS FUTUROS

Realizar el Western blot para la identificacin precisa de la protena Alfa cristalina

16KDa.

Llevar a cabo electroforesis en dos dimensiones (2D- PAGE) para tener una

determinacin mas especfica de la protena Alfa cristalina de 16KDa.

59

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