tese parte ii correcao novembro - teses.usp.br · etimologia do nome peperomia (“peper-omos”...

Tese de doutorado Introdução

Karina J. Malquichagua Salazar

INTRODUÇÃO

“Educação gera conhecimento, conhecimento gera sabedoria, e somente um povo

sábio pode mudar seu destino”

Samuel Lima


Karina J. Malquichagua Salazar 23

1. INTRODUÇÃO

1.1. Família Piperaceae

A família Piperaceae, pertencente à ordem Piperales, compreende catorze

gêneros (Calle et al., 1983). É uma das famílias mais primitivas entre as

angiospermas e, junto com Chlorantaceae e Sauraceae, têm sido consideradas

fósseis vegetais vivos (Taylor and Hickey, 1984). Suas espécies podem ser

encontradas em todas as regiões tropicais e subtropicais do planeta, embora a

grande maioria se encontre na parte central e norte da América do Sul (Steyemark,

1984).

As espécies de Piperaceae são predominantemente ervas, arbustos ou

arvoredos, mas também podem ser epífitas ou suculentas, especialmente no caso

de Peperomias.

1.1.1 O gênero Peperomia

Dentre todos os gêneros que compõem essa família, os dois principais, por

ter o maior número de espécies são Peperomia, que alguns autores consideram

família Peperomiaceae, com mais de 1500 e Piper com cerca de 2000 espécies. A

etimologia do nome Peperomia (“peper-omos” – grego: semelhante à Piper) é

baseada na semelhança das flores desse gênero com as de Piper (Wanke et al.,

2007).

A maioria das espécies de Peperomia apresenta folhas providas de tecidos

especializados no armazenamento de água. Esse tecido pode variar em espessura,

determinando maior ou menor suculência à folha. Algumas delas apresentam

elevado grau de suculência, o que muda consideravelmente a morfologia foliar

(Kaul, 1977). A alta capacidade de armazenar água compensa os períodos de seca



que são muito comuns para espécies de hábito epífito (Helbsing et al., 2000).

Muitas espécies são cultivadas, comercializadas e exportadas como plantas

ornamentais. Como se observa (Figura 1) é grande o potencial de espécies de

Peperomias com essa finalidade.

Peperomia urocarpa

Peperomia nítida Dahl.

Peperomia oreophila

Peperomia arifolia

Peperomia tricolor

Peperomia rotundifolia

Figura 1. Espécies de Peperomias



1.1.2. Espécies Peperomia

Entre as espécies de Peperomia coletadas pelo LQPN e identificadas pela

Dra. Elsie Franklin Guimarães (Jardim Botânico do Rio de Janeiro) foram

selecionadas quatro espécies de Peperomia para estudo fitoquímico: P. oreophila, P.

urocarpa, P. arifolia e P. nitida. A espécie Peperomia glabella foi selecionada para o

estudo biossintético de um policetídeo. Todas as exsicatas foram depositadas nesse

herbário (Tabela 1).

Dessas espécies, apenas P. oreophila e P. glabella tiveram estudos

fitoquímicos realizados. Para P. oreophila foi descrita a composição de seus óleos

essenciais (Lago et al., 2007) baseada na presença de hidrocarbonetos

sesquiterpênicos: β-elemeno, α-ilangeno, α-guaieno e β-selineno, espatulenol e

sesquiterpenos como 3-ishwarol (1) e 3-ishwarona (2) (Tabela 2, página 6). Estudos

químicos de espécimes de P. glabella revelaram a presença de uma acetofenona

(3), a 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona (Soares et al., 2006), além de uma

secolignana (4) (Monache & Compagnone et al., 1996) (Tabela 2, página 6).

Para o estudo de genes PKSs foram selecionadas as espécies de

Peperomias descritas na tabela 1, exceto P. oreophila. Dessas apresentam estudos

fitoquímicos P. serpens e P. galioides. Estudos químicos de P. serpens revelaram a

presença de dois cromenos, um deles contendo o ácido orselínico e o segundo a

forma descarboxilada (12-13, página 14) (Kitamura et al., 2006.). P. galioides

acumula três quinonas (9-11), um terpeno (8), um ácido orselínico prenilado e seus

derivados descarboxilados (5-7, páginas 7 e 8) (Mahiou et al., 1995; Mahiou et al.,

1996; Villegas et al., 2001).



Tabela 1. Dados de coleta e depósito das espécies de Peperomias estudadas

Peperomia Local de coleta Data Voucher

P. oreophila Hesch Serra da Piedade,

MG 12/junho/ 2004 K-418

P. urocarpa (Miq) Fisch. & C.A. Mey.

Bairro do Corcovado Ubatuba, SP

19/março/ 2005 K-552

P. arifolia Miq. Brotas, SP 11/abril/ 2004 K-395

P. nitida Dahlst Igatú, Andaraí, BA 13/fevereiro/ 2006 K-698

P. glabella (sw.) A. Dietr.

Lençóis, Guiné, BA 8/agosto/ 2004 K-414

P. incana

(Haw) A. Dietr. Jardim do LQPN

28/janeiro/ 2008

K-343

P. rubricaulis

(Nees) A. Dietr.

Gruta do Tatu,

Intervales, SP 16/outubro/2004 K-455

P. caperata Yunck.

Adquirida no

comércio local, SP 26/abril/2007 K-888

P. serpens (Sw.) Loudon

Trilha do Corcovado, Ubatuba, SP

17/novembro/2007 K-921

P. galioides H.B.K. Pedra Branca, Poços

de Caldas MG 2/junho/2005 K-582



1.2. Metabólitos secundários de espécies de Peperomia

A revisão bibliográfica sobre estudos químicos realizados com espécies de

Peperomia aponta para 18 espécies (Tabela 2). É um conjunto reduzido de

espécies quando se considera um número estimado em torno de 2000 espécies, e

em relação às espécies de Piper, que apresenta centenas de estudos químicos.

Tabela 2. Metabólitos secundários isolados de espécies de Peperomia

Substância Planta (parte estudada) Atividade Referência

O OH

1 2

P. oreophila - Lago et al.,

2007

OHO

O OH

O

O O

P. obtusifolia

(parte aérea)

-

Tanaka et al.,

1998.

OH O

Me

OMeMeO

3

P. glabella - Soares et al.,

2006

O

O

O

O

O O

4

P. glabella

(planta inteira)

- Monache and

Compagnone

et al., 1996



O

ROH

R= H, COOH

O

OH

R

R=H, COOH

P. amplexicaulis

(planta inteira)

- Burke et al.,

2003.

OH

OH

5

P. galioides

(planta inteira)

P. obtusifolia

(parte aérea)

Atividade

antiparasitária

Mahiou et al. ,

1995.

Tanaka

et al. , 1997.

OH

OH

R

6 R=COOH7 R=H

P. galioides

(planta inteira)

Atividade

antiparasitária

Mahiou et al.,

1995.

R3

R2

R

R1

O O

O O

1 R=R1=R2=R3=OCH2O2 R=R1=OCH2O, R2=R3=OMe3 R=R1=R2=R3=OMe

P. japonica

(planta inteira)

- Chen et al.,

1989.



OH

8

P. galioides

(planta inteira)

Atividade

cicatrizante

Villegas et al.,

2001.

OOH

O

O

O n

n=10

1' 12'

5''6''

O n

OOH

n=12

1'

19'

P. vulcanica

-

Mbah et al.,

2002.

O

O

OH 9

O

O

OH10

O

O

O

11

P. galioides

(planta inteira)

Atividade

antiparasitária Mahiou et al.,

1996.

CH3O

CH3O

OCH

OCHCH3O

OCH

3

3

3

P. pellucida

(parte aérea) -

Bayma et al.,

2000.



O

R

R'

R= H e R'=OHR=OH e R'=H

P. blanda

(partes aéreas)

-

Velozo et al.,

2006.

O

O

R1R2

R3

OMe

OMe

MeO

H

O

OMe

OMe

MeO

H

OO OAc

MeO

OH

O

OAcOH

OO

OH

OMe

OMeMeO

R1 R2 R3 1 OH OH OCH3

2 OCH2O OH

P. heyneana

Anti HIV

Zhang et al.,

2007.

H

CH2OAc

H

OH

O

O

OO

OO

OMe

Me

O

H

O

O

OO

OO

O

Me

Me

P. dindygulensis

(parte aérea) -

Govindachari

et al., 1998.



O

O

O

O

H

H

R1

R2

R3

R4

O

O

O

O

H

OH

OMe

OMe

OH

O

O

O

O

H

OMe

H

OMe

OH

O

O

O

OO

OH H

MeO

OMe

MeO

OO

CH2OAcO

O

OMe

MeO

CH2OAc

OO

CH2OHO

O

OMe

MeO

CH2OH

R1 R2 R3 R4 1 OCH3 OCH2O OCH3

2 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3

3 OCH3 OCH3 OH H 4 OCH3 OCH3 OH OCH3

5 H OCH3 OH OCH3

6 OCH3 OCH2O H 7 H OCH2O OCH3

8 OCH3 OH OH OCH3

MeO MeO

P. duclouxii

Atividade contra

células VA-13 e

HepG2

Li et al., 2006.

O

OO

OR1

R2

OMe

OMe

H HO

OO

O

OMe

H H

OH

MeO

O

O

O

HOH2C

OO

MeO

MeO

O

O

OH

CH2OAc

CH2OAc

OMeMeO

OMe

R1 R2 1 OCH2O 2 OCH3 OH 3 OH OH

P. duclouxii

Atividade contra

células

cancerígenas

VA-13 e HepG2

Li et al., 2007.



O

O

R5

R4

R3

CH2OR2

CH2OR1

OMe

O

O

H

R2

R3

R4

R1

O

OH

R1 R2 R3 R4 R5 6 Ac Ac OCH3 OCH3 OCH3

7 Ac H OCH2O OCH3

8 Ac Ac OCH3 OH OCH3

9 H H OCH2O H

R1 R2 R3 R4 1 OCH3 OCH2O OCH3

2 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3

3 OCH3 OCH3 OH H 4 OCH3 OCH3 OH H 5 H OCH3 OH OCH3

P. duclouxii -

Li et al., 2003.

O

OOR1

R2

R4OH2C CH2OR3

OMeMeO

O

OO

HOH2C CH2OAc

OMeMeO

OO

OHO

O

R1 R2 R3 R4 1 OCH2O Ac H 2 OCH2O H Ac 4 OCH3 OH Ac Ac 5 OCH3 OCH3 Ac H

P. dindygulensis

Antiinflamatória

Wu et al.,

2005.



O

OR1O

OR3

OR4

HMeO

MeO

Me

R1 R2 R3 R4 1 CH2 CH3 H 2 CH3 CH3 CH3 H 3 CH3 CH3 H CH3

9 CH2 CH2 10 CH2 CH3 CH3

11 CH3 CH3 CH3 CH3

R2O

O

O

OR1

OR2

HMeO

MeO

OO

R3OH2C

R1 R2 R3 4 CH2 H 5 CH3 CH3 H 6 CH3 H Ac

O

O

OR1

OR2

HMeO

MeO

OO

O

HMeO

MeO

OO

OO

OH

R1 R2 7 CH3 H 12 CH2

P. dindygulensis

Antitumoral Wu et al.,

2006.

O

OH

P. clusiifolia

-

Seeram et al.,

1998.



O

OOH

OH

O

O

O

OOH

O

OH O

OH

OOH

OH

P. sui

Atividade contra

células

cancerígenas

HONE-1 e

NUGC-3

Cheng et al.,

2003.

O

O O

O

O

OMe

OMe OMe

O

O

O

OMe

OMe

P. tetraphylla - Li et al., 2007.

O

OO

OH

H

O

O

O

OH

H

O O

O

OR

H

P. proctorii - Seeram et al.,

2000.



O

OR1R2

H

OO

R3

OMe

MeO

OMe

O

OAcR3O

R1

R2OH

OMe

MeO

MeO

OOMe

MeO

OMe

MeO

OMe

OMe

R1 R2 R3

3 OCH2O H 4 OCH3 OH Ac

R1 R2 R3

1 CH2 OCH3

2 H CH3 OH

P. pellucida

Atividade contra

células

cancerígenas

HL-60 e MCF-7

Xu et al.,

2006.

O

OH

OH

O

n

O

O

O

O

O

O OH

12

1 n=82 n=10 3 n=12

P. ducloxii

Atividade contra

células

cancerígenas

VA-13 e HepG2

Li et al., 2007.

O

OH

O

OHO

OH

12 13

P. serpens Fungicida Kitamura et

al., 2006.



O

RO

OMe

MeO

O

O

OMe

O

OMe

MeO

MeO OH

OMe

OMe

O

OMe

O

O O

O

OMe

O

OMe

MeO

OH

MeO O

O

OMe

1 R=H2 R=Me

P. blanda Tripanocida Felippe et al.,

2008.

O

O

OMe

O

Meo

OOH

O

Meo

O OMe

O

O

R1O

R2O

OR3

O

O

MeO

RO

1 R=H2 R=Me

3 R1=R2=R3=H4 R1=R3=H, R2=Me5 R1=Me,R2=H,R3=Ac

P. villipetiola Fungicida Salazar et al.,

2005.

O

OOH

XyIO

OMeGlu

O

OOH

OH

GluOMe

Glu

P. blanda Antioxidante Veloso et al.,

2009.



1.3. Aspectos gerais da biossíntese

A biossíntese dos produtos naturais é, dentre as áreas modernas da química,

uma das mais recentes e representa nos conceitos e na metodologia a intersecção

da química com a biologia molecular (Lobo e Lourenço, 2007).

Depois da elucidação estrutural do metabólito secundário, geralmente é

possível propor a biogênese para a formação do mesmo, a partir de blocos

construtores, tais como: acetato, mevalonato, chiquimato ou aminoácidos (Mann,

1994).

Ao propor-se um precursor, há sempre necessidade de verificar se ele está de

fato no percurso químico que conduz ao composto em estudo. A confirmação da rota

proposta pode ser feita por dois caminhos. Um deles é através da incubação de

precursores marcados ou não em extratos enzimáticos (in vitro). Nesta técnica, as

enzimas que atuam na formação do metabólito de interesse são extraídas do

organismo em estudo e incubadas com os possíveis precursores. O outro caminho é

a incorporação de precursores isotopicamente marcados, ou não, em organismos

intactos, tais como plântulas, órgãos, vegetais e cultura de células (in vivo). Neste

procedimento, a enzima responsável pela síntese do metabólito de interesse utiliza

todo o maquinário celular para produzí-lo. Sendo assim, não é necessário fornecer

condições especiais para que a enzima expresse sua atividade. É necessário

apenas que o organismo em estudo seja mantido vivo (Bacher et al., 1999).

No primeiro caso, assim que os tecidos são rompidos, as proteínas são

liberadas de sua estrutura organizada, utilizando-se tampões de extração, os quais

geralmente estão oxigenados, e as enzimas proteolíticas que estavam mantidas em



compartimentos dentro da célula, também são liberadas. Assim as enzimas são

expostas a três tipos de circunstancias que podem resultar em perda de atividade:

• Desnaturação. A desnaturação pode ser minimizada evitando pH e temperaturas

extremas, desnaturantes como solventes orgânicos, sais (“chaotropics”), e outros

solutos que podem quebrar ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas.

• Inativação do sítio catalítico. Os sítios ativos de uma enzima contem resíduos de

aminoácidos, que são reativos e susceptíveis à modificação, e são responsáveis

pela habilidade catalítica da enzima. Normalmente a atmosfera no interior da célula

4é redutora e a presença de outras moléculas que contém sulfidrilas protege esses

grupos. Mas, quando expostas a uma alta tensão de oxigênio, podem ocorrer

formação de ligações de dissulfetos (-S-S-), oxidações e reações com metais

iônicos. Nestes casos duas medidas de proteção podem ser tomadas: (i) a adição de

EDTA para a remoção de traços de íons metálicos, através da complexação; e (ii) a

adição de um reagente contendo sulfidrilas como o β-mercaptoetanol ou

ditiotreitol/ditieritritol. Outro fator que leva à inativação é a perda de cofatores

durante o processo de solubilização das proteínas, que pode ser reposta (no caso

de ser conhecida) no tampão ou antes da reação enzimática. E, no caso de soluções

diluídas de enzimas a atividade é perdida rapidamente, sendo assim a presença de

ovo albumina (BSA) é necessária. No entanto, seu modo de ação é controverso,

possivelmente interagindo com a enzima diminuindo a dissociação ou agindo como

uma chaperona minimizando o desdobramento da enzima. A seroalbúmina é

também utilizada para minimizar a perda de proteína por absorção nas paredes do

recipiente, especialmente se este for de vidro (Scope, 1994).



• Degradação proteolítica. As células contem fatores que podem resultar na sua

própria degradação, incluindo as enzimas hidrolíticas de digestão, tais como as

nucleases, hidrolases de polissacarídeo, fosfatases e proteases. Nas células de

mamíferos, essas enzimas encontram-se acumuladas em lisossomas, as quais

agem sobre os polipetídeos indesejados e outros polímeros quando sua degradação

é demandada por circunstâncias fisiológicas. Em plantas, as enzimas digestivas

estão estocadas nos espaços vacuolares e sua ação no citoplasma pode estar sob o

controle de uma variedade de inibidores específicos. No entanto, o delicado

equilíbrio envolvido na organização espacial e funcional de sistemas enzimáticos

sempre é perturbado no processo de obtenção de um extrato enzimático, em função

da mistura das enzimas hidrolíticas com todos os constituintes celulares.

Conseqüentemente deve-se aceitar o fato que enzimas digestivas estarão

sempre presentes e, em função disso, medidas devem ser tomadas para a

manutenção da atividade desejada. Inibidores proteolíticos são compostos químicos

ou biológicos que inibem especificamente enzimas proteolíticas, porém a eficácia

desses é sempre variável (Scope, 1994).

1.4. Policetídeos

Os produtos naturais policetídicos constituem-se um dos maiores e mais

diversificado grupo de metabólitos secundários. Esses metabólitos são produzidos

por cerca de mil diferentes organismos desde procarióticos até eucarióticos.

Antibióticos e micotoxinas produzidos por fungos e actinomicetos, estilbenos e

flavonóides produzidos por plantas são exemplos de substâncias policetídicas. Os

policetídeos têm um papel importante na medicina, devido as suas atividades



antimicrobianas, antiparasitárias, antineoplásica e imunossupressivas

(Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009; Austin and Noel, 2003)

1.4.1. Policetídeos sintases (PKSs)

Policetídeos sintases (PKSs) constituem-se num grupo de enzimas que

catalisam a condensação de ésteres-CoA, tais como acetil-CoA, com extensores de

ésteres de CoA, tais como malonil-CoA (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009). As

PKSs são classificados segundo a sua configuração arquitetônica, como PKS I, II e

III.

O tipo I, presentes em bactérias ou fungos, refere-se a um sistema de um ou

mais proteínas multifuncionais que contém um diferente sítio ativo por cada reação

catalisada pela enzima na montagem e modificação da cadeia de carbonos do

policetídeo. São organizadas em módulos, contendo pelo menos uma aciltransferase

(AT), proteína carregadora de grupos acila (ACP) e atividade β-ceto acil sintase (β-

KS) (Figura 2, página 41).

O tipo II é um sistema de enzimas individuais que carregam um único

conjunto de atividades que agem interativamente. Um conjunto mínimo consiste de

duas unidades cetosintases e uma ACP, que serve como âncora para a cadeia

carbônica. As subunidades adicionais como cetoredutases, ciclases ou aromatases

definem o padrão de ciclização do policetídeo intermediário, seguindo-se de

modificações adicionais como oxidações, reduções ou glicosilações (Figura 3,

página 41). O único grupo conhecido de organismos que utilizam esse sistema são

os actinomicetos Gram positivos do solo e marinhos.

O tipo III está presente em bactérias (Figura 4, página 41), plantas e fungos, e



são enzimas essencialmente condensadas com ausência de ACP e agem

diretamente com substratos acil-CoA (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009).

Figura 2: Sistema modular do sistema enzimático de PKS I

Figura 3: Sistema enzimático de PKS II

Figura 4: Sistema enzimático de PKS III

Todos as PKSs, de maneira semelhante aos seus ancestrais ácidos graxos



sintase (FAS), possuem a atividade ß-ceto sintase (KS) que catalisa a incorporação

seqüencial de uma unidade contendo dois átomos de carbonos numa cadeia

policetídica crescente. No entanto, os sistemas FAS realizam reações adicionais de

redução e desidratação sobre as cadeias policetometilênicas resultantes para

produzir um acido graxo alifático predominantemente saturado.

Entretanto, o sistema PKS omite ou modifica alguma dessas últimas reações,

preservando a reatividade química com variações de polaridade, junto com cadeias

lineares policetometilênicas crescentes.

As enzimas PKSs aproveitam a reatividade desses intermediários

policetídicos, para promover ciclizações intramoleculares (Esquema 1, página 44),

gerando assim, uma diversidade de produtos monocíclicos e policíclicos substituídos

a partir de simples blocos de acetato (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009; Austin &

Noel, 2003).

1.4.2. PKS III

Vários tipos de PKSs III têm sido encontrados em plantas e participam na

biossíntese de metabólitos secundários (Tabela 3, página 22) incluindo chalcona

sintases (CHS), 2-pirona sintases (2-PS), estilbeno sintases (STS), bisbenzil

sintases (BBS), homoeriodictiol/eriodictiol sintases (HEDS ou HvCHS), acridona

sintases (ACS), benzofenona sintases (BPS), florisovalerofenona sintases (VPS),

isobutirofenona sintases (BUS), ácido triacético cumariol sintases (CTAS),

benzolacetona sintases (BAS), C-metilchalcona sintases (PstrCHS2) e estilbeno

carboxilato sintases (STCS). Em função das CHSs e STSs serem as enzimas mais

estudadas, este grupo é freqüentemente denominado de família tipo-CHS/STS. Uma



análise das seqüências descritas para PKS III de plantas revela uma identidade de

46-95% nas seqüências de amino ácidos. Tais enzimas utilizam uma variedade de

substratos iniciadores, que abrange desde compostos alifáticos (R-CoA) até

aromáticos (Ar-CoA), substratos de tamanho reduzido como acetil-CoA até

volumosos como p-cumaroil-CoA, ou ainda substratos polares como malonil-CoA até

menos polares como isovaleroil-CoA, provendo às plantas uma extraordinária

diversificação funcional (Flores-Sanchez and Verpoorte, 2009)

1.4.3. Reações de ciclização em cadeias policetometilênicas

As PKSs de plantas apresentam como características diferentes números de

reações de condensação (alongação na cadeia do policetídeo), tipos de reações de

ciclização e substratos de partida. Baseados nos mecanismos de ciclização, eles

são classificados como tipo-CHS, tipo-STS e tipo-CTAS (Tabela 3, página 46).

A ciclização intramolecular, do tipo condensação de Claisen, envolvendo

enzimas tipo-CHS ocorre entre os carbonos C6 e C1. Esse mecanismo de formação

de ligação C-C não é apenas utilizado para a biossíntese de policetídeos, mas

também para a de ácidos graxos. Nas enzimas tipo-STS a ciclização ocorre entre os

carbonos C2 e C7 via condensação intramolecular aldol que pode ser seguida de

descarboxilação do carbono C1 na forma de CO2 ou não, resultando no estilbeno

ácido como ocorre em H. macrophylla L. (Eckermann et al., 2003) (Esquema 1,

página 44). Exemplos de metabólitos que podem ser formados por enzimas tipo-

STCS são o ácido olivetóico em Cannabis sativa, ácidos anacárdicos de Ginkgo

biloba e o ácido orselínico glicosilado em Syzygium aromatica (Charles et al., 1998)

(Esquema 2, página 47). No caso das enzimas tipo-CTAS, ocorre a formação de

uma lactona entre os carbonos C5 e C1. Junto com esses diferentes tipos de



ciclizações mencionadas acima, algumas PKSs de planta só catalisam reações de

condensação, porém sem a etapa de reação de ciclização. BAS, tem sido isolada de

R. palmatun e catalisa uma única condensação de malonil-CoA e p-cumaroil-CoA

para formar p-hidroxibenzalacetona (Tabela 3, página 45).

CoAS

O

R

O

R

CoAS

OOO

R

OO

O SCoA

O

R

OO

O O

SCoA

R

OH

OH

O

R

OH

OH OH

CO2

OH

OO

CoAS

OO

OH

R

O

O

R

OH

OOO

R

OH

OH

O OH

Tipo- STSTipo-CHS

estilbenochalcona

Tetracetideo

12

3 4 56

78

9+

3

Tipo-PKS III

Tipo-CTAS

Lactona

Reação de claisenReação de aldol

Lactonização

estilbeno ácido

Tipo-STCS

C6-C1

C2-C7

C5-C1

Esquema 1. Tipos de ciclizações de enzimas PKS de plantas



Enzima Substratos (iniciador, extensor, Nº condensações)

Tipo de ciclização,

tipo de anel

Produto (Esq. 2)

Planta (espécie) Referência

Nenhuma reação de

ciclização

benzalacetona sintase (BAS)

p-cumaroil-CoA, malonil-CoA (1x)

feruloil-CoA, malonil-CoA (1x)

-

-

1

2

Rubus idaeus

R. palmatum

Abe et al., 2001.

Abe et al., 2007.

Uma reação de ciclização

benzalacetona sintase (BAS)

N-metilantraniloil-CoA (ou antraniloil-CoA)

malonil-CoA (ou metil-malonil-CoA)(1x) -, heterocílico 3 R. palmatum Abe et al., 2006.

Tipo-CTAS

C-metilchalcona sintase

(PstrCHS2)

2-pirona sintase (2-PS)

ácido p-cumaroiltriacético

sintase (CTAS)

Dicetídeo-CoA, metil-malonil-CoA (1x)

acetil-CoA, malonil-CoA(2x)

p-cumaroil-CoA, malonil-CoA(3x)

Lactonização,

heterocíclico

4

5

6

Pinus strobus

G. Hybrida

H. macrophylla

Var. thunbergii

Schroder et al., 1998.

Eckerman et al.,1998.

Akiyama et al., 1999.

Tipo-CHS

chalcona sintase (CHS)

florisovalerofenona sintase

(VPS)

isobutirofenona sintase (BUS)

benzofenona sintase (BPS)

acridona sintase (ACS)

homoeriodictiol/eriodictiol


Isovaleroil-CoA, malonil-CoA (3x)

Isobutiril-CoA, malonil-CoA (3x)

m-hidroxibenzoil-CoA, malonil-CoA (3x)

benzoil-CoA, malonil-CoA (3x)

N-metilantraniloil-CoA, malonil-CoA (3x)

feruloil-CoA, malonil-CoA (3x)

Claisen, Aromático

7

8

9

10

11

12

13

M. sativa

H. lupulus

H. calycinum

C. erythracea

H. androsaemu

H. serrata

Austin et al., 2003.

Okada et al., 2001.

Klingauf et al., 2005.

Beerhues et al., 1996.

Liu et al., 2003.





Tabela 3. Exemplos de PKS III, substratos preferidos e produtos de reação

sintase(HEDS ou HvCHS) cafeoil-CoA, malonil-CoA (3x) 14 H.vulgare Austin et al., 2003.

Tipo-STS

estilbeno sintase(STS)

pinosilvin sintase

bibenzil sintase(BBS)

bifenil sintase(BIS)

carboxilato de estilbeno

sintase (STCS)


cinamoil-CoA, malonil-CoA (3x)

di-hidro-m-cumaroil-CoA, malonil-CoA (3x)

benzoil-CoA, malonil-CoA (3x)

Aldol,

Aromático

15

16

17

18

A. hupogaea

Pinus estrobus

Bletilla striata

S. aucuparia


Fliegmann et al., 1992.

Preisig et al., 1995.

Liu et al., 2007.

di-hidro-p-cumaroil-CoA, malonil-CoA (3x)

Aldol sem

descarboxilação

, aromático

19

H. macrophylla

Eckermann et al.,

2003.

Duas ou mais reações de

ciclização, miscelânea.

Cromeno pentacetídeo

sintase (PCS)

hexacetídeo sintase (HKS)

aloesona sintase (ALS)

octacetídeo sintase (OKS)

acetil-CoA, malonil-CoA (4x)




-,

heterocíclico

ou aromático

20

21

22

23, 24

A. arborescens

P. indica

R. palmatum

A. arborescens

Abe et al., 2005.

Jinda et al., 2008.

Abe et al., 2004.

Abe et al., 2005.



O

CH3

OH

R

NO

R2

OH

R1

O

R1

R2

O

OH

R3

OO

OH

OO

OH

O

OH

O

R1

R2OHOH

OH

O

OHOH

OH

R1

R3

R2

O

OHOH

OH

R

N

O

OH

OH

CH3

R

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

OH

O

OH

O

O

OH

OH

O

OHOH

OH

O

O

O

OH

OH

O

O

O

O

O

OH

OH

OH

O

OOH

O

OH

OH

O OH

OH

COOHO-Glu

OH

COOH

R

OH

COOH OH

HOOC

OMe

OH

OH

COOH

OH

COOH

OH

(1) R=H(2) R=OCH3 (3)

R=H ou CH3

R=H ou CH3

(4)R1,R2=H, R3=CH3

(5)

(6)

(7) R1=OH, R2=H(13) R1=OH, R2=OCH3

(14) R1, R2=OH

(8) R1=H, R2,R3=CH3

(9) R1=CH3, R2,R3=H

(10) R=OH(11) R=H

(12) (15) R=OH (16) R= H

(17)

(18)

(19)(20)

(21)

(22) (23) (24) ácido olivetoico (C. sativa)ácido orselínico glicosilado (S. aromática)

Ácidos anacardicos (G. biloba)

R:C13H27

C15H31

C17H35

Amorfrutim (A. fruticosa)ácido hidrangeico (H. macrophylla)

ácido lunulárico (liverworts)

Esquema 2. Exemplos de produtos biossintetizados por PKS de plantas

1.4.4 . Mecanismos de reações com PKSs III

O principio básico do mecanismo da reação em PKS III consiste na utilização

de um tioéster de CoA iniciador para executar reações de condensações

seqüenciais com duas unidades de carbono de um extensor descarboxilado,

usualmente malonil-CoA. Um intermediário policetometilênico linear é rearranjado

para ciclizar e, posteriormente, formar um sistema aromático. O sítio ativo desses

PKSs é constituido de um túnel que se liga a CoA, um compartimento que se liga ao

substrato de partida e um compartimento onde ocorre a ciclização, e três resíduos

conservados em todos as PKSs conhecidos: Cys164, His303 e Asn336 (numerado



na Medicago sativa CHS). Cada sítio ativo está contido no monômero e os

substratos aproximam-se através do longo túnel e se liga a CoA. A Cys164 é o

nucleófilo que inicia a reação e ataca ao grupo carbonílico do tioéster de partida

resultando na transferência do grupo de partida para a cisteina. O resíduo Asn336

orienta o grupo carbonílico do tioéster do malonil-CoA perto da Hi303 e Phe215,

provendo um ambiente no polar para o carboxilato terminal, que facilita a

descarboxilação. A ressonância do íon enolato para a forma ceto permite a

condensação do carbânion do acetil com o intermediário policetídico ligado á

enzima. Os resíduos Phe215 e a Phe265 agem como porteiros. A recaptura da

cadeia CoA-dicetideo-acetil-substrato de partida pela Cys164 e o estágio da

liberação da CoA para adicionais ciclos de elongação (Esquema 3), resulta na

formação do intermediário do policetídeo final. Na etapa final ocorre a ciclização

intramolecular do intermediário policetídico (Staunton et al., 2001, Sanchez and

Verpoorte, 2009; Austin and Noel, 2003).

Esquema 3. Proposta do carregamento do substrato, descarboxilação do malonil e

extensão do policetídeo em chalcona sintase (CHS)

A. Carregamento

B. Extensão

Descarboxilação

Condensação



1.5. O-Metiltransferases (OMTs) em plantas

OMTs dependem da S-adenosil-L-metionina (SAM) para metilar pequenas

moléculas em plantas e estão envolvidos na biossíntese de ligninas, flavonóides,

alcalóides, e muitos outros metabólitos secundários fenólicos de plantas.

Freqüentemente essas metilações são essenciais nas funções fisiológicas das

moléculas por alterarem de forma significativa a polaridade de grupos funcionais. As

OMTs de planta podem ser classificadas em três principais grupos (Websites of the

Schröder Group; Noel et al., 2002):

• Tipo 1. É uma superfamília de proteínas de uma grande diversidade de

substratos. Exemplo são as enzimas metilantes de grupos hidroxílicos de

fenilpropanoides, eugenol, chavicol, flavonóides, isoflavonóides, alcalóides,

cumarinas, orcinois, estilbenos, entre outros. Freqüentemente de ésteres de CoA de

fenilpropanoides que são substratos típicos das enzimas do tipo 2 (ver embaixo).

Características comuns das proteínas do tipo 1: elas são homodímeras com

subunidades de 38-43 kDa, não requerem Mg2+ (ou outros cátions divalentes) para

sua atividade, fato que as diferencia do tipo 2 (Ibdah et al., 2003). Entre os vários

exemplos dessas enzimas tem sido cristalizadas, podem ser citadas a chalcona

O-metiltransferase (ChOMT), a isoflavona O-metiltransferase (IOMT) (Zubieta et al.,

2001) e a hidróxi-isoflavona 4’-O-metiltransferase (HI4’OMT) de Medicago truncatula

(Liu et al., 2006) (Tabela 4, página 51). Tais informações contribuiram para o

entendimento da arquitetura, seletividade do substrato e mecanismo catalítico

dessas reações. No entanto, é ainda difícil prever o substrato fisiológico dos novos

membros desta família tendo como base somente os modelos estruturais. Além

disso, várias enzimas possuem grande promiscuidade por substratos in vitro e não

permite concluir acerca da especificidade in vivo aos substratos. Essa família



também inclui as S-metiltransferases (SMT) e N-metiltransferases (NMT).

• Tipo 2. Essa família possui menos exemplos que a do tipo 1 e menos

diversificado em número de seqüências e genes. Todas essas proteínas parecem

ser específicas à ésteres-CoA de fenilpropanoides e sua principal reação está

associada à biossíntese de ligninas. No entanto, a especificidade não é absoluta e

há exemplos de membros desta família que também são ativos com flavonoides e

fenilpropanoides (Ibdah et al., 2003; Kim et al., 2006) (Tabela 4, página 51). As

proteínas desta família também são homodímeras, mas o tamanho das subunidades

são menores (23-28 kDa) e requerem um cátion divalente como o Mg2+ para mediar

a desprotonação do grupo hidroxílico antes da transferência do grupo metila. Uma

dessas proteínas, a O-metiltransferase do cafeoil Co-A, foi cristalizada e mostrou

alta similaridade ao OMT do catecol de animais que requer Mg2+ (Ferrer et al., 2005;

Vidgren et al., 1994).

• Tipo 3. A maior parte destas enzimas são metiltransferases de grupos

carboxílicos (carboxil metiltransferases). Constituem-se em exemplos as carboxil

metiltransferases do ácido benzóico e do ácido salicílico em Clarkia breweri (Ross et

al., 1999) (Tabela 4, página 30) e do acido jasmônico em Capsicum annum L. (Min

et al., 2005). Cabe ressaltar que esta família também contém outros membros de

OMTs, tais como N-metiltransferases (NMT), enzimas que realizam as metilações na

biossíntese da cafeína (Yonehama et al., 2006). Esta família também é conhecida

como SABATH, a abreviação dos membros mais conhecidos ate 2003, carboxil OMT

do Ácido Salicílico, carboxil OMT do Ácido Benzóico, e N-metiltransferase da

Teobromina (D’aurea et al., 2003). Como esperado, as estruturas 3D das enzimas



carboxil OMTs e NMT mostram seqüências similares e, de uma forma geral, as

estruturas são praticamente idênticas.

O-MT tipo 1 em

Medicago sativa,

ChOMT=

chalcona O-MT

(Zubieta et al.,

2001)

O-MT tipo 2 em

Mesembryanthe

crystallinum,

PFMOMT=O-MT

de cafeloil-CoA e

flavonóide (Ibdah

et al., 2003)

O-MT tipo 3 em

Clarkia breweri,

(Dudareva et al.,

1998; Ross et al.,

1999)

Tabela 4. Exemplos de OMTs, substratos e produtos de reação

Isoliquiritigenina



1.6. Biossíntese em Peperomia glabella

Estudos fitoquímicos prévios de P. glabella descreveram a presença da

acetofenona 3, o 2-hidróxi,4,6-dimetoxiacetofenona no esquema 5, como o principal

metabólito secundário em todas as partes da planta (Soares et al., 2006).

A acetofenona foi previamente isolada de Artemisia maritime (Saxena et al.,

2002) e Plagiochila fasciculata e mostraram atividade fungicida contra Trichophyton

mentagrophytes (Lorimer et al., 1994). Derivados de acetofenona têm mostrado

ainda propriedades anti-inflamatórias (Sala et al., 2001; Favier et al.,1998),

citotóxicas (Huang et al., 1999), anti-HIV e antimicrobiana (Cuesta et al., 1999; Fuller

et al., 1999). O 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona pode ser preparado a partir de 1-

hidróxi-3,5-dimetoxibenzeno (Goldoni et al., 2005; Cunningham et al., 1989), 2,4,6-

triidroxiacetofenona (Aponte et al., 2008) e 1,3,5-trihidroxibenzeno (Matieva et al.,

2002).

A biossíntese da acetofenona (3) (Esquema 5, página 54) não é conhecida,

mas a forma monometilada, o 4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona (Esquema 4, página

53) foi estudada através de experimentos de administração de acetato de sódio

[13C2] que foi incorporado em sua estrutura. Essa se constituía como parte de um

policetídeo maior, o knipholona (Esquema 4, página 53), uma fenilantraquinona

isolada de culturas de Knipholia pumila (Asphodelaceae). Nesse estudo observou-se

a incorporação de três unidades de acetato [13C2], mostrando que a porção 4,6-

diidróxi-2-metoxiacetofenona segue a rota policetídica da mesma maneira que o

crisofanol (Bringmann et al., 2007) (Esquema 4, página 53).



OHO

O

OH

O

OH OH

OMe

OHO

O

OH

O

OH OH

OMe

O

ONa

O O O O

O

O

OO

SR

O

ONa

O

ONa

OMT

*

3

PKS

SEnz

8

PKS

+

knipholona

crisofanol

4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona

acetato de sódio [13C2] +

Esquema 4. Proposta biossintética do 4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona em Knipholia

pumila (Asphodelaceae)

A natureza estrutural da acetofenona (3) (Esquema 5, página 54) e o estudo

de incorporação de o 4,6-diidróxi-2-metoxiacetofenona (Esquema 4) sugeriram que

sua rota biossintética segue a via policetídica e que, posteriormente, seria metilada

nas hidroxilas 4 e 6 (Esquema 5, página 54). Para a primeira etapa é proposta a

atuação da enzima policetídeo sintase (PKS III), executando a condensação de

quatro moléculas de acetato, sendo que o substrato de partida seria uma molécula

de acetil-CoA e como moléculas extensoras, três de malonil-CoA, para formar o

tetracetídeo. Na seqüência, ocorre a ciclização através de condensação de Claisen

intramolecular formando a 2,4,6-triidroxiacetofenona. A condensação de Claisen

indica que a ciclização ocorreria entre os C1 e C6 e, portanto, deveria pertencer as

enzimas tipo-CHS. Na segunda etapa da biossíntese, a 2,4,6-triidroxiacetofenona



seria metilada nas hidroxilas em C-4 e C-6, pela enzima O-metiltransferase, que

deve pertencer à família do tipo 1 ou tipo 2.

O

SCoA

O

SCoA

COOH

O O O O

O

O

O

OO

OH

HO

OO

OO

O O

OH

O

O

MeO

OH O

OMe

+ 3 X PKS

SEnz

SEnz

SEnz

-

-

2,4,6-triidroxiacetofenona

Claisen

Enolizaçao Expulsão do grupo de saída

OMTSAM

2-hidroxi,4,6-dimetoxiacetofenona

3

Esquema 5. Proposta biossintética do 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona

1.7. Estudo de cetosintases (KSs) de Peperomias que participam da

biossíntese do ácido orselínico

O estudo fitoquímico de Peperomia oreophila, P. urocarpa, P. arifolia Miq. e

P. nitida revelou que todas essas espécies acumulam pelo menos um ácido

orselínico (ou orselinato) prenilado, cuja natureza estrutural sugere que a sua

biossíntese ocorre pela via policetídica e através de condensação aldólica (Esquema



6, página 56).

A biossíntese do ácido orselínico envolve a formação de uma cadeia poli-β-

cetometilênica formada por acoplamentos de quatro unidades de C2 através de

reações de condensações de Claisen sucessivas. O ácido orselínico tem sido

isolado de fungos como Penicilinium madriti, no qual foi estudada sua biossíntese e

determinada como sendo via policetidica (Gaucher et al., 1968). Pode ser

comumente encontrado em líquens formando dímeros ou trímeros através de

esterificações (Honda, 1999).

Algumas espécies de Peperomia acumulam derivados de ácido orselínico, na

forma prenilada, metilada, acetilada, oxidada e, após ciclização com a cadeia

prenilada, produzindo cromenos (Salazar et al., 2005).

Considerando a transferência horizontal de genes entre fungo-planta, tal qual

em P. polybothria, na qual foi demonstrada a presença de Introns I a partir de fungos

(Adams et al., 1998), foi objetivado estudar a presença do gene do PKS que

biossintetiza o ácido orselínico em Peperomias (Seeram et al., 1998, Tanaka et al.,

1997, Mahoiu et al., 1995). Espera-se assim, contribuir para o conhecimento desse

gene de PKS para essas espécies.



O

SCoA

O

SCoA

COOH

O O O O

OO

O

O

OO

OH

HO

OO

O

O

O

O

O O

O

O OH

OH

O O

O

OH

HO

COOH

O

O

OH

+ 3 X

SEnz

SEnz

SEnz

-

+-

Enolizaçao

Hidrólise

Ácido orselínico

H2O

Floracetofenona

aldol Claisen

Enolizaçao

Expulsão do grupo de saída

SEnz

SEnz

SEnz

A B

Esquema 6. Biossíntese de ácido orselínico e floracetofenona (Dewick, 1984)

Tese de doutorado Objetivos


2. OBJETIVOS

� Descrição dos principais metabólitos secundários de espécies de peperomias,

através do fracionamento cromatográfico dos extratos e determinação estrutural das

substâncias isoladas baseada em análises espectrométricas.

� Investigar a atividade de policetídeo sintase nas folhas de Peperomia glabella

através do desenvolvimento de protocolos para a conversão de precursores, bem

como realizar experimentos para identificar os genes correspondentes.

Tese de doutorado Parte Experimental


EXPERIMENTAL

Dificuldades reais podem ser resolvidas; apenas as imaginárias são insuperáveis. Dificuldades reais podem ser resolvidas; apenas as imaginárias são

"A imaginação é mais importante que o conhecimento."

Albert Einstein

Tese de doutorado Equipamento, materiais e métodos


3. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Equipamentos

3.1.1. Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear

� Bruker, modelo AC-200, de 200 MHz.

� VARIAN, modelo DPX-300, de 300 MHz.

� Bruker DRX-500, de 500 MHz.

3.1.2. Cromatografia gasosa – Espectrometria de massas (CG-EM)

� Espectrômetro Shimadzu modelo MS-QP-5050, acoplado a um cromatógrafo

Shimadzu, modelo CG-17A (IQ-USP), com ionização por impacto de elétrons (70

eV), equipado com coluna capilar DB5 de 30 m de comprimento e 0,25 mm de

diâmetro.

3.1.3. Espectrofotômetro no Infravermelho

� Espectrofotômetro Bomen 100, Perkin Elmer, empregando-se pastilha KBr ou

filme.

3.1.4. Espectrofotômetros no Ultravioleta

� A determinação das concentrações das proteínas totais foi realizada num

espectrofotômetro Shimadzu, modelo UV 1650 PC.

3.1.5. Cromatógrafo líquido de alta eficiência

� Em escala analítica foi utilizado o cromatógrafo analítico Shimadzu com

sistema binário de bombas, modelo LC-10AD, detector UV-visível com arranjo de

diodos modelo SPD-10AD e injetor automático Shimadzu SIL-10A, utilizando

coluna analítica de fase reversa, Phenomenex LC-18, 25 cm x 4,6 mm x 5µm.



3.1.6. Centrífuga

� As centrifugações dos extratos enzimáticos foram realizadas numa centrífuga

refrigerada Hitachi, modelo CR22GII e das partições dos ensaios enzimáticos numa

centrifuga de mesa, modelo 5415D da Eppendorf.

3.1.7. Termociclador

� As reações em cadeia da polimerase foram realizadas no termociclador da

Biorad my cycler TM.

3.1.8. Eletroforese em gel de agarose

� Cubas de eletroforese, Sub-cell® e Mini-Subcell® da Biorad.

3.2. Materiais

3.2.1. Cromatografia em camada delgada analítica ou comparativa

3.2.1.1. Fase estacionária

� Para cromatografia em camada planar comparativa (CPC) utilizou-se, como

fase estacionária sílica gel 60 F 254 com partículas de tamanho 4-45 µm e

espessuras de 0,50 mm, da Merck sob suporte de alumínio.

3.2.1.2. Agentes reveladores

� As revelações foram efetuadas com irradiação de luz na região do UV (254 e

360 nm) ou sulfato cérico seguido de aquecimento.

3.2.2. Cromatografia em camada delgada preparativa


� Foi utilizada a cromatografia em camada delgada preparativa planar (CPP)

com fase estacionária sílica gel 60 PF 254 com partículas de 4-45 µm e uma

espessura de 1 mm.

3.2.2.2. Agentes reveladores



� As revelações foram efetuadas com irradiação de luz na região do UV (254 e

360 nm).

3.2.3. Cromatografia em coluna (CC)


� A fase estacionária empregada para cromatografia em coluna sob vácuo foi

sílica gel 60 com partículas de 63-210 µm da Merck.

3.2.3.2 Solventes

� Para cromatografia, utilizaram-se solventes P.A. da Supren e Synth.

3.2.4. Solventes para RMN

� Solvente deuterado da Acros, CDCl3.

3.2.5. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)


� Coluna analítica de fase reversa, Phenomenex LC-18, 25 cm x 4,6 mm x 5µm.

3.1.2.5.2. Fase móvel

� Utilizaram-se como eluentes MeOH ou Acetonitrila grau CLAE da Synth e

água MilliQ.

3.2.6. Cromatografia por permeação de gel

� Foram utilizados como fase estacionaria Sephadex LH-20 da Merck e

Sephadex TM G-25 da GE Healthcare.

3.2.7. Eletroforese em gel de agarose

� TopVision™ LE GQ Agarose, da Fermentas

3.2.8. Reagentes da reação em cadeia da polimerase

� MgCl2 (25mM), dntps (25mM), Taq DNA polimerase (500 U), tampão 10X taq

e marcador de massa molecular 100pb da Fermentas.



� Os iniciadores da BIONEER.

3.2.9. Kits de extração e purificação de ADN

� Kit de extração de ADN genômico de plantas ‘’NucleoSpin® Plant II’’ da

Macherey-Nagal.

� Kits de purificação de ADN de gel de agarose ‘’PureLink™ Quick Gel’’ da

invitrogen e ‘’ GFX PCR DNA and Gel Band’’ da Amersham Biosciences.

3.2.10. Material Botânico

� Os materiais vegetais foram identificados pela Dra. Elsie Franklin Guimarães

(Instituto de Pesquisas Jardim botânico do Rio de Janeiro). As exsicatas dos

materiais vegetais estão depositadas neste herbário.

A classificação botânica das espécies Peperomia de acordo com o Sistema

de classificação de Angiospermas proposto por Cronquist (1981) encontra-se nas

Tabelas 5.

Tabela 5. Classificação morfológica da família Piperaceae, (Cronquist, 1981)

Reino Plantae

Divisão Angiospermae A. Brau & Doill (Magnoliophyta)

Classe Dicotiledonae

Subclasse Magnolidae

Ordem Piperales

Família Piperaceae Agardth



3.3. Metodologia 3.3.1. Processamento do material vegetal

O material vegetal de cada espécie depois de coletada (Tabela 1, página 26)

foi seco em estufa a 50°C por 48 horas. Ao final do período, o material seco foi

triturado em um moinho de facas para obtenção do material pulverizado.

3.3.2. Obtenção do extrato bruto, análise preliminar, fracionamento e purificação

das substâncias presentes em maior quantidade em espécies de Peperomia.

3.3.2.1. Peperomia oreophila

• Obtenção do extrato bruto - As folhas (38,6 g) foram submetidas a extração com

600 mL de metanol por 12 horas à temperatura ambiente, (essa operação foi

repetida mais três vezes). Na seqüência, a solução obtida foi filtrada e concentrada

em rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se assim 4,6 g do extrato bruto

de consistência viscosa.

• Partição líquido-líquido - Uma parte do extrato obtido (600 mg) foi submetida à

partição líquido-líquido com EtOAc e H2O. A fase orgânica foi concentrada em

rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se 288 mg.

• Análise preliminar do extrato - A análise preliminar foi baseada em cromatografia

em camada delgada comparativa, utilizando-se como eluente Hex-EtOAc (4:1).

Observaram-se cinco manchas principais sob a lâmpada de UV em 256 nm. A

seguir, para ter um perfil melhor do extrato, foi injetado no CLAE-DAD

(Concentração da amostra, 2mg/mL; vazão, 1,0 mL/min; volume de injeção, 20 µL,

gradiente, tabela 5) obtendo-se um perfil abundante em picos, sendo que o maior

número de picos foram observadas em 301 nm (Figura 5, figura 64).



Figura 5. Cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em EtOAc do extrato

metanólico das folhas de Peperomia oreophila. Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH

(modo gradiente), vazão: 1mL/min, λ= 301 nm.

Tabela 6. Gradiente utilizada para a análise do extrato das folhas da

Peperomia oreophila por CLAE-DAD

Tempo (minutos) % de MeOH % de H2O

0.1 40 60 5 40 60 35 100 0 40 100 0 45 40 60 50 40 60

• Fracionamento cromatográfico - O extrato foi submetido a uma cromatografia em

coluna utilizando como fase estacionária Sephadex LH-20 (70 gramas), com

gradiente de polaridade, utilizando como eluentes Hexano, DCM e acetona.

Obtiveram-se 28 frações, que após CPC foram reuniram em 9 frações (Tabela 7,

página 67).

M in u t e s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0

mA

U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

mA

U

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

1 2 0 0

7.7

74

9.6

00

11

.20

0

12

.69

31

3.6

73

14

.50

71

5.6

80

16

.80

4

18

.13

31

8.6

67

20

.16

02

1.0

13

21

.90

7

23

.25

32

4.1

07

25

.60

02

6.5

60

28

.33

5

30

.34

8

31

.96

9

34

.81

4

37

.97

3 39

.22

9

D e te c to r A-3 0 1 n mo r e o fi l a 1o r e o fi l a 1

R e t e n t io n T im e



• Purificação das substâncias presentes em maior quantidade - A purificação foi

realizada mediante CPP, obtendo-se no total nove compostos (Esquema 7, página

67).



Esquema 7. Fracionamento do extrato bruto e purificação das substâncias presentes em maior quantidade em P. oreophila

d

f

c b

Extrato metanólico das folhas da Peperomia oreophila (600 mg)

1. Partição líquido-líquido do extrato bruto (AcOEt:H2O)

2. Coluna cromatográfica da fase orgânica (288 mg),

Sephadex LH-20 Hex:DCM:Acetona (incremento

a e g

a -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) b -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) c -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) d -CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1) h- CCP (Sílica) Hex / AcOEt (4:1)

h F1-F4

(56,6 mg) 1

(38,00mg) 2

(12,0 mg)

F5 (32,0 mg)

1 (20,0 mg)

2 (9,0 mg)

F6-F7 (14,2 mg)

1 (3,8 mg)

2 (2,0 mg)

5/6 (8,0 mg)

F8-F12 (23,0 mg)

3 (8,8 mg)

4 (8,6 mg)

7 (5,4 mg)

F13 8

(9,6 mg)

F21-F22 9

(6,8 mg)

F23-F26 (71,6 mg)

9 (23,6 mg)

F14-F20 8 + 9

(45,4 mg)

F27-F28 Impureza polar

(18,2 mg)

i



Tabela 7. Massas das frações obtidas, eluentes utilizados e frações reunidas do

fracionamento em coluna do extrato de folhas de P. oreophila

N° Fração Massas (mg) Eluentes (V:V) Grupo

1 11,24 DCM:Hex (4:1) a

2 13,20 DCM:Hex (4:1) a

3 21,40 DCM:Hex (4:1) a

4 10,60 DCM:Hex (4:1) a

5 32,00 DCM:Acetona (3:2) b

6 8,80 DCM:Acetona (3:2) c


8 7,20 DCM:Acetona (3:2) d





13 9,60 DCM:Acetona (1:4) e

14 7,00 DCM:Acetona (1:4) f







21 2,60 DCM:Acetona (1:4) g

22 4,20 DCM:Acetona (1:4) g

23 9,40 DCM:Acetona (1:4) h

24 13,20 DCM:Acetona (1:4) h

25 32,00 DCM:Acetona (1:4) h

26 17,00 DCM:Acetona (1:4) h

27 2,20 DCM:Acetona (1:4) i

28 16,00 MeOH i



3.3.2.2. Peperomia urocarpa

• Obtenção do extrato bruto - Folhas secas e moídas (9,88 g) foram submetidas á

extração com 300 mL de DCM:MeOH (2:1) e Turrax® (3000 rpm) a temperatura

ambiente por 1 minuto (essa operação foi repetida mais três vezes). Na seqüência,

as soluções obtidas foram filtradas, reunidas e concentradas em rotaevaporador sob

pressão reduzida, obtendo-se assim 1,11 g do extrato bruto das folhas.

• Partição líquido-líquido - O extrato obtido foi submetido à partição líquido-líquido

com EtOAc e H2O. A fase orgânica foi concentrada em rotaevaporador sob pressão

reduzida obtendo-se 0,81 g.

• Análise preliminar do extrato - A análise preliminar foi baseada em cromatografia

em camada delgada comparativa, utilizando-se como eluentes uma mistura de Hex-

EtOAc (8,5:1,5). Observaram-se duas manchas principais sob a lâmpada de UV em

256 nm. Para obter-se um perfil melhor do extrato, este foi analisado no CLAE-DAD

(Concentração aproximada da amostra, 2mg/mL; vazão, 1,0 mL/min; volume de

injeção, 20 µL), em gradiente (Tabela 5, página 62), obtendo-se um cromatograma

que mostrou dois picos principais em 267 nm.

• Fracionamento cromatográfico - O novo extrato foi submetido a uma

cromatografia em coluna utilizando Sephadex LH-20 e como eluentes, misturas de

Hex:DCM:Acetona, com gradiente de polaridade, obtendo-se 25 frações (Tabela 8 e

esquema 8).



Figura 6. Cromatograma obtido por CLAE da fração solúvel em EtOAc do extrato

DCM:MeOH das folhas de Peperomia urocarpa. Coluna C18, fase móvil

H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão: 1mL/min, λ=287 nm.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

mA

U

0

20

40

60

mA

U

0

20

40

60

16

.18

3

18

.56

0

26

.60

92

8.6

54

29

.40

22

9.8

67

30

.29

33

2.0

35

33

.49

33

4.4

04

35

.82

13

6.6

93

37

.91

33

8.7

77

39

.89

34

1.6

07

42

.68

44

4.5

47

46

.11

4

48

.79

0

Detector A-267 nmurocarpa2urocarpa2

Retention Time



1. Coluna cromatográfica da fase solúvel em AcOEt , Sephadex LH-20/ Hex:DCM e DCM:Acetona (incremento gradual de polaridade)

F25

12+mistura polar

(15,0 mg)

Fração solúvel em AcOEt (810 mg) do extrato DCM:MeOH (2:1)

de folhas de Peperomia urocarpa

F22-24

12 (217,8 mg)

F20-21

11 + 12 (74,1 mg)

F19

11 (32,9 mg)

Esquema 8. Fracionamento do extrato bruto das substâncias presentes em maior quantidade em Peperomia urocarpa



Tabela 8. Massas das frações obtidas e eluentes utllizados no fracionamento em

coluna do extrato de folhas de P. urocarpa.

N° Fração Massas (mg) Eluentes (V:V)

1 12,70 DCM:Hex (4:1)

2 28,60 DCM:Hex (4:1)

3 22,60 DCM:Hex (4:1)

4 19,10 DCM:Hex (4:1)

5 20,50 DCM:Acetona (3:2)





10 21,10 DCM:Acetona (3:2)

11 26,80 DCM:Acetona (3:2)

12 16,50 DCM:Acetona (3:2)

13 19,20 DCM:Acetona (1:4)


15 22,50 DCM:Acetona (1:4)

16 20,80 DCM:Acetona (1:4)

17 23,10 DCM:Acetona (1:4)

18 21,70 DCM:Acetona (1:4)

19 32,90 DCM:Acetona (1:4)

20 38,40 DCM:Acetona (1:4)

21 35,70 DCM:Acetona (1:4)

22 44,90 DCM:Acetona (1:4)

23 42,70 DCM:Acetona (1:4)

24 130,20 DCM:Acetona (1:4)

25 15,00 MeOH



3.3.2.3. Peperomia arifolia

• Obtenção do extrato bruto - As folhas secas e moidas (620 mg) foram submetidas

a extração a temperatura ambiente por 12 horas, com 100 ml de DCM:MeOH (2:1)

(essa operação foi repetida mais uma vez).

• Na sequência, a solução obtida foi filtrada e concentrada em rotaevaporador sob

pressão reduzida, obtendo-se assim 97,50 mg de extrato bruto que apresentou uma

cor verde intensa.

• Análise preliminar - Foi baseada em cromatografia em camada delgada

comparativa, utilizando-se como eluentes uma mistura de Hex-EtOAc (4:1).

Observou-se na placa uma mancha principal, sob a lâmpada de UV em 254 nm e a

seguir foi analisado no CLAE-DAD, utilizando-se o método da tabela 6, página 64

(concentração da amostra, 2mg/mL; vazão 1,0 mL/min; volume de injeção, 20 µL). O

cromatograma obtido mostrou a presença de um pico majoritário e intenso, sendo

que as majores absorções foram observados em torno de 220 e 280 nm (Figura 7,

página 73). Devido a presença de uma substancia majoritária no extrato, foi obtido

um espectro de RMN de 1H que mostrou sinais similares ao apresentado pela

substância 8 isolada de P. oreophila.

• Fracionamento cromatográfico - O extrato obtido foi submetido a uma coluna

cromatográfica utilizando sephadex LH-20 (40 gr) e, como eluentes, misturas de

Hex:DCM:Acetona, com gradiente de polaridade. Obtiveram-se 20 frações que após

fazer CPC se reuniram a três frações, F1-F3. Foram obtidos os espectros de RMN

de 1H das três frações, sendo que somente na F3 (29 mg) constatou-se a presença

de sinais de uma substancia contendo um anel aromático.



Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

mA

U

0

100

200

300

mA

U

0

100

200

300

2.3

13

2.7

61

20

.55

7

22

.40

0

24

.53

3

Detector A-263 nmarifolia1arifolia1

Retention Time

Figura 7. Cromatograma obtido por CLAE do extrato DCM:MeOH das folhas da

Peperomia arifolia .Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão:

1mL/min, λ=263 nm.

• Purificação - A fração 3 (29 mg) foi novamente submetida à cromatografia em

coluna utilizando Sephadex LH-20 (30 g) e misturas de Hex:DCM:Acetona com

gradiente de polaridade. Obtiveram-se 10 frações, que foram submetidas a

cromatografia em CPC e reunidas às frações puras, obtendo-se a substância 10

(16,0 mg).

3.3.2.4. Peperomia nítida

• Obtenção do extrato bruto - As folhas, caules e raízes de Peperomia nítida foram

secas e moídas juntas foram submetidas a extrações sucessivas (18 g) com 250 mL

de DCM:MeOH (2:1) e Ultra Turrax ® (9500 rpm) por 3 minutos a temperatura

ambiente (3x). Na sequência, as soluções foram filtradas, reunidas e concentradas

em rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se assim 1,5 g de extrato bruto.



• Análise preliminar - A placa de CPC do extrato mostrou três manchas principais e

três fracas em 254 nm. O cromatograma (CLAE-DAD) do extrato foi obtido

utilizando-se o método da tabela 5 (Concentração da amostra, 2mg/mL; fluxo, 1,0

mL/min; volume de injeção, 20 µL) (Figura 8, página 76). O espectro de RMN de 1H

do extrato sugeriu a presença majoritária de um cromeno com duas metoxilas.

• Fracionamento cromatográfico - O extrato foi dividido em três porções que foram

submetidas à cromatografia em coluna utilizando Sephadex LH-20 (60 gr), como

eluentes foram utilizadas misturas de Hex:DCM:Acetona com gradiente de

polaridade. Cada uma das colunas forneceu oito frações, e apõs CPC foram

reunidas ás frações equivalentes das demais porções (Tabela 9).

• Purificação das substâncias presentes em maior quantidade: A purificação foi

realizada mediante uma segunda coluna cromatográfica com Sephadex LH-20 das

frações 2-3 (517 mg) , obtendo-se essa vez 6 frações (FF1-FF6) e na seqüência com

CPP das frações FF3-4 (Esquema 9, página 75) obtendo-se no total três

substâncias (13-15).

Tabela 9. Massas das frações obtidas e eluentes utilizados no fracionamento em

coluna do extrato de P. nitida.

N° Fração Massas reunidas (mg) Eluentes (V:V) Frações reunidas

1 231,6 DCM:Hex (3:2) a

2 313,8 DCM:Hex (3:2) b

3 203,2 DCM:Hex (4:1) b

4 164,5 DCM:Hex (4:1) c







a. Coluna cromatográfica de Sephadex LH-20/ Hex:DCM e DCM:Acetona (incremento gradual de polaridade)

Extrato (1,5 g) DCM:MeOH (2:1) de Peperomia

nitida

F4-5

15 (357,9mg)

F2-3 (517,0mg)

13+14 (10 mg)

15 (12 mg)

B. Coluna cromatográfica de Sephadex LH-20 / eluentes Hex:DCM (incremento gradual de polaridade)

B

FF3-4 (30mg)

FF5-6 15 (268mg)

b c

C. CPP/Hex:EtOAC (8:2)

Esquema 9. Fracionamento do extrato bruto e purificação das substâncias

presentes em maior quantidade em Peperomia nitida



Figura 8. Cromatograma obtido por CLAE do extrato DCM:MeOH das folhas da

Peperomia nítida. Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão:

1mL/min, λ=326 nm.

3.3.3. Avaliação da atividade da enzima policetídeo sintase (PKS) de folhas de

Peperomia glabella

3.3.3.1. Obtenção de diversos extratos enzimáticos das folhas

Os estudos de conversão de substratos foram baseados no uso de enzimas

PKS solubilizadas (Paniego et al., 1999 , Raharjo et al., 2004) e, para tal, foram

utilizadas apenas folhas, devido à difícil propagação da espécie. O estudo iniciou-se

com a obtenção do extrato enzimático cuja fração sobrenadante apresenta maior

atividade de policetídeo sintase frente ao acetil-CoA e ao malonil-CoA. Para tal

finalidade foram obtidos vários extratos enzimáticos partindo de 1 g de folhas,

utilizando-se tampão A (fosfato de potássio pH=7,5 (0,1 M) e β-mercaptoetanol 2,5

mM) ou tampão B (tampão fosfato de potássio pH=7,5 (0,1 M) e β-mercaptoetanol

Minutes

0 10 20 30 40 50

mA

U

0

250

500

750

1000

1250

1500

mA

U

0

250

500

750

1000

1250

1500

14

.30

9

18

.09

7

30

.02

6

32

.25

6 35

.61

8

39

.34

1

41

.47

2

44

.92

8

D etecto r A-326 n mn itid a1n itid a1

Retention Time



2,5 mM e 7 % Dowex 1), com e sem PVPP ou dessalinização. Todas as operações

foram realizadas a 4°C, segundo o esquema 10.

Esquema 10. Obtenção de extratos enzimáticos das folhas de P. glabella

3.3.3.2. Reação enzimática com cada um dos extratos

Na seqüência, os ensaios enzimáticos e os brancos (controles) foram

realizados em duplicata ou triplicata, em tubos de centrifuga de 1,5 mL por um

período de 30 minutos, a 30°C. As quantidades dos reagentes utilizados esta

descrito na tabela 10.

Tabela 10. Concentrações e volumes dos reagentes utilizados nos ensaios enzimáticos

Reagente Concentração no

ensaio Quantidade

(volume) Extrato protéico 300 ul=1,9 µg

Tampão de reação: Fosfato de

potássio pH=7,5, β-mercaptoetanol

e seroalbúmina

0,1 M, 2,5 mM e 2,8% 182 µL

Acetil-CoA 0,2 mM (100nmoles) 4,5 µL

Malonil-CoA 0,6 mM (300nmoles) 13,5 µL

Centrifugação, 4ºC, 20’, 14000 RPM

Dessalinização

Folhas frescas de P. glabella

Suspensão Suspensão

N2

i. Trituração com PVPP ii. Extração com tampão A

i. Trituração sem PVPP ii. Extração com tampão A ou B

Sobrenadante PVPP-A Sobrenadante A ou B

Extrato PVPP-D Extrato PVPP-SD Extrato A-SD ou B-SD

Extrato A-D ou B-D

Dessalinização Sem dessalinização

Precipitado Precipitado



3.3.3.3. Análises dos produtos de reação através de CLAE

Depois de finalizadas as reações, o meio reacional foi submetido à extração

com EtOAc (3x300 uL) e as fases orgânicas foram reunidas e concentradas.

Posteriormente, os extratos foram ressuspendidos em MeOH e analisados por

CLAE-DAD, Coluna C18, fase móvil H2O/CH3OH (modo gradiente), vazão: 1mL/min,

λ288 nm, e utilizando o método descrito na Tabela 6, página 64.

3.3.4. Otimização das condições da reação enzimática de PKSs (tempo,

temperatura, pH e saturação dos reagentes)

3.3.4.1. Reação enzimática

Na seqüência, foi selecionada a metodologia (Esquema 10, tabela 10) que

forneceu o extrato com atividade enzimática PKSs e OMT, na qual foram realizadas

as determinações do ótimo enzimático. Para otimizar o pH do tampão de extração,

foram realizadas reações enzimáticas com os tampões fosfato de potássio (pH= 6,0

a 8,0) e Tris-HCl (pH=8,0 a 9,0) de 0,5 em 0,5 na faixa de pH = 6 até pH 9. Foram

estudados tempos pré-determinados (10-60 min) para determinar o tempo ótimo e

diferentes temperaturas (20-60°C) para determinar a temperatura ótima (Tabela 10,

página 55). Para determinar a concentração dos reagentes na qual ocorre a

saturação das enzimas foram estudadas varias concentrações de acetil-

CoA:malonil-CoA numa proporção de 1 para 3 de acordo com a proposta na qual se

requer um mol de acetil-CoA e três de malonil-CoA (0,02 mM - 0,06 mM; 0,10 mM -

0,30 mM; 0,2 mM - 0,6 mM; 0,4 mM - 1,2 mM; 0,8mM - 2,4mM). Neste estudo os

dados do extrato protéico e tampão são mostrados na tabela 10.



3.3.4.2. Dosagem protéica dos sobrenadantes dos extratos

A dosagem protéica dos sobrenadantes dos extratos enzimáticos foi realizada

utilizando-se o método de Bradford (Bradford, 1976), o qual envolve a formação de

um complexo de cor azul, entre as proteínas e o azul de Comassie G-250, com um

máximo de absorção em 595 nm e que é medido por espectrofotometria. Para isso,

foi construída uma curva analítica utilizando diferentes concentrações de

seroalbúmina (1µg/mL a 20µg/mL), cuja equação permitiu determinar a quantidade

de proteínas totais presentes nos sobrenadantes. Em todos os experimentos de

otimização foi utilizado 1,9 µg de proteínas totais (Esquema 10, página 77).

0 5 10 15 200,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Abs

orbâ

ncia

seroalbumina (µg/mL)

A=(0,0099+0,0037) + (0,0353+0,0004)CR2=0,9996

Esquema 11. Curva analítica de determinação de seroalbúmina


Depois de finalizadas as reações, os extratos foram submetidos à partição

com EtOAc (3x300 µL), as fases orgânicas reunidas e concentradas. Os produtos

foram resuspendidos em MeOH e injetados no CLAE, utilizando-se o método

descrito na Tabela 11 (página 80).



Tabela 11. Gradiente utilizada para a análise dos produtos da reação enzimática

3.3.5. Estudo da variação circadiana da atividade de PKSs

Finalizando a determinação das condições ótimas de reação, foi determinado

também o horário de maior expressão das enzimas PKS e OMT envolvidas na

biossíntese do 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona, para isso foram coletadas folhas

de P. glabella a cada 3 horas durante 27 horas e em duplicata nos horários de maior

expressão. Para os experimentos de otimização também foi utilizado 1,9 µg de

proteínas totais.

3.3.5.1. Reação enzimática

A reação foi realizada sob as condições otimizadas de pH, tempo,

temperatura e saturação dos substratos. As concentrações e volumes dos reagentes

utilizados nos ensaios enzimáticos encontram-se na tabela 10.


Depois de finalizadas as reações, elas foram submetidas à partição com

EtOAc (3x300 µL), as fases orgânicas reunidas e concentradas. Os produtos foram

resuspendidos em MeOH e injetadas no CLAE, utilizando o método descrito na

Tempo (minutos) % de MeOH % de H2O 0.1 70 30 2 70 30 10 100 0 13 100 0 17 70 30 20 70 30



Tabela 11.

3.3.5.3. Quantificação do 2-hidróxi-4,6-dimetoxiacetofenona nas folhas de

Peperomia glabella

Foram coletadas amostras de folhas, com o objetivo de quantificar a

acetofenona presente, nos horários de maior expressão das enzimas, e assim

corroborar os dados obtidos na determinação do horário de coleta ótimo. Para isso,

a cada três horas foram coletadas as folhas, congeladas em N2 liquido e liofilizadas,

moídas na presença de SiO2 e submetidas à extrações sucessivas com EtOAc. As

fases foram reunidas e concentradas, ressuspendidas em MeOH e injetadas no

CLAE, utilizando o método descrito na tabela 11, página 80.

Para quantificar a acetofenona foi construída uma curva de calibração

utilizando diferentes concentrações (3µg/mL a 36 µg/mL), cuja equação permitiu

determinar a quantidade de acetofenona presente nas amostras (Esquema 12).

0 5 10 15 20 25 30 35 400

400000

800000

1200000

1600000

2000000

Are

a

Acetofenona (µg/mL)

Area = (41373+41950) + (50785+2066)CR2=0,99341

Esquema 12. Curva analítica de determinação da acetofenona



3.3.6. Estudo de genes PKSs

3.3.6.1. Pesquisa bibliográfica

Foi realizada uma busca na literatura e no NCBI para identificar seqüências

de genes que produzem as PKSs que biossintetizam o ácido orselínico e análogos

mais complexos contendo o ácido orselínico (Tabela 12, esquema 13).

Tabela 12. Organismos que produzem o ácido orselínico

Gene Organismo Estrutura Fonte de informação

AviM Streptomices

viridochromogenes Avilamicina Gaisser et al., 1997

CaLO5 Micromonospora

echinospora Calicheamincina Ahlert et al., 2002

evrJ Micromonospora

carbonacea

Everninomicina Hill, 2001

Um dos dados mais relevantes foi publicado por Gaisser et al,.1997 (Figura

9), que descreve o gene AviM de Streptomyces viridochromogenes que apresenta

3879 pb (1293 amino ácidos) e na qual a região cetosintase ou cetoacilsintase (KS),

que catalisa a adição de uma unidade de acetato (C2) na cadeia do policetídeo a ser

alongada (Austin and Noel, 2003), representa aproximadamente 34% da seqüência

(Shen, 2003).

Figura 9. Seqüência de amino ácidos do AviM do PKS (tipo I) que biossintetíza

o ácido orselínico

Visto que os genes AviM, CaLO5 e evrj são os responsáveis pela síntese do

ácido orselínico nas respectivas bactérias, considerou-se que a região de KS dos



genes PKS responsáveis pela síntese dessa mesma substância nas peperomias

seriam bastante semelhantes ao seu equivalente KS no genoma dessas bactérias

(Tabela 12, página 82).

Esquema 13. Metabólitos derivados de ácido orselínico produzidos por bactérias

Everninomicina Micromonospora carbonacea

Avilamicina

Streptomyces

viridochromogenes

Calicheamincina

Micromonospora carbonacea



Continuando com a busca de informação foi sugerido que as PKSs de genes

de fungos, especificamente da região KS que expressam policetídeos que não

apresentam redução (NR), tal qual ocorre com o ácido orselínico, podem ser

isolados utilizando-se o par de iniciadores LC1 e LC2c (Bingle et al., 1999).

3.3.6.2. Desenhos de iniciadores degenerados

3.3.6.2.1. Iniciadores degenerados LC1/LC2c

O desenho desses iniciadores foi baseado nas regiões mais conservadas de

KSs de vários fungos cujos policetídeos produzidos não apresentam redução (NR),

tal como ocorre com o ácido orselínico (Tabela 12, página 82). O tamanho dos

produtos de amplificação deve ser aproximadamente de 700 – 800 pb (Bingle et al.,

1999).

3.3.6.2.2. Iniciadores degenerados AOR1/AOR2

O desenho do segundo par de iniciadores degenerados, realizado em

colaboração com o Prof. Gabriel Padilla do ICB-USP (Tabela 13, página 85), foi

baseado na seqüência KS do gene AviM de Streptomyces viridochromogenes (NCBI

AAK83194.1), junto com seqüências KS homólogas identificadas no program BLAST

(Esquema 13). As seqüências foram alinhadas no programa BioEdit (Hall, 1999) de

acordo com as regiões conservadas, que permitiram propor os iniciadores

AOR1/AOR2. O tamanho dos produtos de amplificação é de aproximadamente de

700 – 800 pb.



3.3.6.2.3. Iniciadores degenerados AOS1/AOS2

O desenho do terceiro par de iniciadores degenerados denominados

AOS1/AOS2 foi baseado também nas seqüências protéica de KS de AviM da

bactéria Streptomyces viridochromogenes alinhadas desta vez com seqüências de

proteínas de plantas superiores (PKSs), para isso também foram utilizados

programas disponíveis na rede (BLAST, ClustalX e CODEHOP) com a colaboração

do Dr. Ari José Scattone Ferreira (Tabela 13). O tamanho dos produtos de

amplificação esperado seria de aproximadamente de 750 pb.

LC1: 5'-GAYCCIMGITTYTTYAAYATG

LC2c: 5'-GTICCIGTICCRTGCATYTC

AOR1: 5'-GCIGTIGTIGGIATHGGITG

AOR2:5'-GGIGCCATDATICCRTTIGTYCT

AOS1: 5'-GGNCCRAANCCRAANARNAC

AOS2: 5'-GCNACNATHYTNGCNATHGG

Tabela 13. Seqüências de nucleotídeos dos Iniciadores utilizados

3.3.6.3. Extração de ADN genômico de Peperomias

A extração de DNA genômico das folhas de Peperomias foi obtido através do

Kit ‘’NucleoSpin® Plant II’’ ou utilizando-se do protocolo descrito (Ferreira &

Grattapaglia, 1996):



1. Foi pesado 30-50 mg do tecido seco (folhas cortadas em fragmentos) e

macerado utilizando-se um pistilo e nitrogênio liquido em um tubo eppendorf de 1,5

mL.

2. Foi adicionado então 700 µL de solução tampão de extração* e misturado em

vortex.

3. Os tubos foram incubados em banho-maria à 60-65°C por 30 minutos.

Durante a incubação, os tubos foram agitados a cada 10 minutos para

homogeneizar a suspensão.

4. Os tubos foram retirados do banho-maria e deixados esfriar em capela de

exaustão.

5. As soluções foram extraídas com 600 µL de solvente orgânico CIA

(clorofórmio:álcool isoamílico, 24:1) com agitação durante 5 minutos, invertendo-os

no mínimo 20 vezes ou até obter uma emulsão homogênea.

6. Os tubos foram centrifugados em microcentrífuga a velocidade máxima

(12000-15000 rpm) durante 5 minutos.

7. Os tubos foram cuidadosamente retirados da centrifuga, evitando a

perturbação das fases formadas. A fase superior de cada uma das amostras foi

pipetada (aquosa) para um novo eppendorf.

8. Foram repetidos os passos 5, 6 e 7.

9. Foi adicionado, a cada solução obtida no ítem 7, 500 µL de isopropanol frio

(-20°C). Foi misturado gentilmente para precipitar os ácidos nucléicos e mantidos em

freezer durante uma noite.

10. Os tubos foram centrifugados a 7000 rpm por 5 minutos.

11. Foram descartados os sobrenadantes mantendo-se o precipitado.



12. A cada eppendorf foi adicionado 1 mL de etanol 70 % e os tubos deixadas em

repouso por 10 minutos.

13. O tubos foram centrifugados a 7000 rpm por 3 minutos.

14. Os sobrenadantes foram descartados sem perder o pellet.

15. Os passos 12,13 e 14 foram repetidos.

16. Foi adicionado 1 mL de etanol absoluto a cada tubo e os precipitados foram

deixados imersos por 3 minutos e, posteriormente, separados os sobrenadantes.

17. Os precipitados foram deixados em secagem ao ar.

18. Os precipitados foram ressupendidos em 50-100 µL de água destilada.

19. Finalmente foi adicionado 2 µL de RNAse em cada tubo e incubados em

banho-maria a 37 °C por, no mínimo, 1h para a digestão do RNA.

*100 mL de Tampão de extração 2X CTAB:

2%CTAB 2g

1,4 M de NaCl 8,19 g

20 mM de EDTA 0,75 g

100 mM tris-Cl PH=8,0 10 mL de solução estoque 1M

1% de PVP 1 g

0,2 % mercaptoetanol 0,2 mL

3.3.6.3.1. Quantificação do ADN por espectrofotometria

Uma alíquota de 1 µL de cada extrato de ADN foi diluído 1:1000 com água

(destilada e autoclavada) e submetida a leitura em λ= 260 nm.



3.3.6.4. Amplificação das regiões alvo utilizando a reação em cadeia de polimerase

(PCR).

3.3.6.4.1. Amplificação das regiões alvo utilizando a reação em cadeia de

polimerase (PCR) com os iniciadores LC1 e LC2c.

Foram preparados os Mix (mistura de todos os componentes da reação) com

os ADNs das folhas de Peperomia urocarpa, Peperomia glabella e Peperomia

arifolia (Tabela 14).

Reagente Concentração

inicial Concentração ou quantidade

final de reagentes Volume por

amostra (µL)

Tampão, contendo

MgCl2 15 mM 10 X 1 X 2 µL

dntps 10 mM 0,2 mM 0,4 µL

Lc1 20 µM 1 µM 1 µL

Lc2 20 µM 1 µM 1 µL

Taq polimerase

- 1U 0,2 µL

H2O - - 14,4 µL

ADN 100 ng/ µL 100 ng 1 µL

Total - - 20 µL

Tabela 14. Quantidades e Concentração dos componentes da reação em cadeia da

polimerase (PCR) com os iniciadores LC1 e LC2c

Condições no termociclador:

Desnaturação inicial 94 C°, 3 min

Desnaturação 94 C°, 1 min

Anelamento 55 C°, 1 min 34 ciclos

Extensão 72 C°, 3 min

Extensão final 72 C°, 10 min



3.3.6.4.2. Amplificação das regiões alvo utilizando a PCR com os iniciadores AOR1

e AOR2


inicial

Concentração ou quantidade

final de reagentes

Volume por

amostra (µL)

Tampão 10 X 1 X 2 µL

MgCl2 50 mM 5 mM 2 µL


AOR1 20 µM 1 µM 1 µL


Taq polimerase

- 1U 0,2 µL

H2O - - 11,6 µL

ADN 500 ng/ µL 1000 ng 2 µL

Total - - 20 µL

Tabela 15. Quantidades e concentração dos componentes da reação em cadeia da

polimerase (PCR) com os iniciadores AOR1 e AOR2

Condições no termociclador:

Desnaturação inicial 94 C°, 3 min

Desnaturação 94 C°, 1 min

Anelamento 56 C°, 1min 40 ciclos

Extensão 72 C°, 1 min

Extensão final 72 C°, 10 min



3.3.6.4.3. Amplificação das regiões alvo utilizando a reação de cadeia de polimerase

(PCR) com os iniciadores AOS1 e AOS2


inicial

Concentração ou quantidade

final de reagentes

Volume por

amostra (µL)

Tampão 10 x 1 x 2 µL

MgCl2 25 mM 5,5 mM 4,4 µL




Taq polimerase

- 1U 0,2 µL

H2O - - 9,5 µL

ADN 500 ng/ µL 750 ng 1,5 µL

Total - - 20 µL

Tabela 16. Quantidades e concentração dos componentes da reação em cadeia da

polimerase (PCR) com os iniciadores AOS1 e AOS2

Esquema 14. Condições no termociclador do PCR com os iniciadores AOS1 e AOS2

94 °C 94 °C 5 min 1 min

55 °C

94 °C

65 °C

45 s

72 °C 1,5 min

55 °C

72 °C 1,5 min

30 s

∞ min

4 °C x1 x20

72 °C

x30 x1

10 min

tese parte ii correcao novembro - teses.usp.br · etimologia do nome peperomia (“peper-omos”...

Documents