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Tema 13Genética de hongos filamentosos:
Neurospora crassa
Genética Molecular de Neurospora crassa
•Ciclo de vida
•Neurospora en el laboratorio
•Genética de Neurospora
•Genética molecular de Neurospora
•Transformación
•Herramientas disponibles
•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora
Genética Molecular de Neurospora crassa
•Ciclo de vida
•Neurospora en el laboratorio
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•Genética molecular de Neurospora
•Transformación
•Herramientas disponibles
•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora
Neurospora en la naturaleza
Neurospora crecesobre troncos quehan sido quemados
Primera descripción de Neurospora como el hongo que causóla contaminación de panaderías francesas en 1843
Bernard O. Dodge(1872-1960)
Shear CL y Dodge BO (1927)Life stories and heterotallismof the red bread mold fungi ofthe Monilia sitophila group.J. Agric. Res. 34: 1019-1042.
Describió las estructuras sexuales y lasegregación del tipo sexual en variasespecies de Neurospora.
Ciclos de vida de Neurospora crassa
Especies de Neurospora
N. crassaN. discretaN. intermediaN. sitophila
N. tetrasperma
N. africanaN. dodgeiN. galapagosensisN. lineolataN. terricolaN. pannonica
Heterotálicas Homotálicas
Pseudohomotálica
Ciclo sexual de una especie heterotálica
Ciclo sexual de una especie homotálica
Ciclo sexual de una especie pseudohomotálica
Ciclo vegetativo de Neurospora crassa
conidiosgerminación
micelio
conidióforos
Hifas deNeurospora
Conidiación de Neurospora crassa
Conidios de Neurospora crassa
Macroconidios y microconidios de Neurospora
Un relojcircadianoregula la
conidiación
Genética Molecular de Neurospora crassa
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•Neurospora en el laboratorio
•Genética de Neurospora
•Genética molecular de Neurospora
•Transformación
•Herramientas disponibles
•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora
Cultivos de Neurospora crassa
Cultivos de Neurospora crassa
Medio con sorbosa
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•Neurospora en el laboratorio
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•Genética molecular de Neurospora
•Transformación
•Herramientas disponibles
•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora
Mutagénesis
Agentes mutagénicos usados en Neurospora
• Ácido nitroso• Metanosulfonato de etilo (EMS)• Metilhidroxiamina• ICR170• Nitrosoguanidina
• Ultravioleta• Rayos X
Radiaciones
Agentes químicos
medio completo
medio mínimo
medio con grupos de nutrientes
medio con distintosaminoácidos
el medio con arginina permite el crecimiento
Búsqueda demutantes
auxótrofos
Edward L. Tatum(1909-1975)
George W. Beadle(1903-1989)
El aislamiento y la caracterización mutantes auxótrofos de Neurospora lespermitió formular la hipótesis de que un gen era responsable de unaenzima.
Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1958
Enriquecimiento por filtración
Medio mínimo
Silvestresprotótrofos
Mutantesnutricionales(auxótrofos)
Los protótrofos sequedan en el filtro
Los auxótrofos pasana través del filtro
Sembrar
Los auxótrofos crecenMedio con leucina
Ruta de la carotenogénesis de Neurospora
Medio con sorbosa
Mutante albino
Mutantes de la carotenogénesis de Neurospora
Naranja(silvestre)
Amarillento RojizoAlbino
Mutantes morfológicosde Neurospora
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0654321
0.15
0.46
0.25
0.09
7
0.01 0.01
0.03
Fre
cuen
cia
de lo
s co
nidi
os
Núcleos por conidio
Los heterocariontes nos dan información sobre losmutantes:
• Permite saber si las mutaciones son dominantesof recesivas
• Permite identificar grupos de complementación
Heterocariosis
El micelio de Neurospora es un cenocito
El heterocariontecrece sin arginina
Fusión
Células arg-2 alteradas en unaenzima distinta de la ruta desíntesis de arginina
Células arg-1 alteradas en unaenzima de la ruta de síntesisde arginina
Complementación en Neurospora
+o
oo
oo
oo
oo
o
++
+++
++ + ++ + + +++ + ++ + +++ + ++ + +
+ +oo ooo +
++
+o+
++
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Grupos decomplementación:
mutantesgrupo
I
II
III
IV
V
1, 5
2, 4, 6, 7
3
8, 10
9 o
o
Ciclo sexual deNeurospora
Niveles bajosde C y N
Formación deprotoperitecios
Peritecio
Ciclo sexual de Neurospora
Meiosis
Ciclo sexual de Neurospora
Ascosporas
Las octadas ordenadas permitendetectar el ligamiento al centrómero
El reparto de los cromosomas en la octada permiteobservar varios patrones de segregación
Productos de la meiosis en Neurospora
Desarrollo de ascas con el resultado de la meiosis de un diploide producto deun cruzamiento entre dos mutantes de la coloración de la ascospora. Seobserva la segregación en la primera y segunda división meiótica.
Durante larecombinación se
producenmoléculas de ADN
heterodúplices
Detección de la conversióngénica
Estimación de la distancia genética porrecombinación
cyhR al hom nic
+ + + +
hom: auxórofo de homoserinanic: auxórofo de nicotóicoal : albino
cyhR: resistente a cicloheximida
1 2 3
cyhR al hom nic + + ++ parentales 99 106
rec en 1
rec en 2
rec en 3
rec en 1 y 2
rec en 1 y 3
rec en 2 y 3
22 22
4 8
22 17
1 1
0 0
3 5
cyhR + + + + al hom nic
cyhR al + + + + hom nic
cyhR al hom nic+ ++ +
cyhR alhom nic + + ++
cyhR al homnic ++ ++
cyhR al homnic ++ ++
cyhR al hom nic silvestre
cyhR al hom nic
+ + + +
1 2 3
17.4 % 4.5 % 15.2 %
cyhR al hom nic
17.4 4.5 15.2
Estimación de la distancia genética porrecombinación
Grupo de ligamiento I
Existen unos 1000 marcadores genéticoslocalizados en siete grupos de ligamiento
Detección de mutaciones en el ADNmitocondrial
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•Transformación
•Herramientas disponibles
•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora
Ingeniería genética en Neurospora
Introducción de ADN:• Transformación de esferoplastos• Electroporación de conidios
Plásmidos integrativos• Resistencia a benomilo e higromicina
Otras herramientas:• Promotores regulables: qa-2• Fusiones con lacZ, GFP y luciferasa para medirtranscripción y detectar proteínas.
• Inactivación génica.
Integración del ADN en hongos
Vector
Receptor de latransformación
Cromosoma I
Cromosoma II
Reemplazamientogénico
Duplicación
Integraciónectópica
Vector
vectorReceptor
Integración ectópica
Integración ectópica múltiple
Reemplazamiento
Integración homóloga
Transformación en Neurospora
• La competencia es una propiedad del núcleo (co-transformación).
• Cuando ocurre integración homóloga no suele ocurrir integraciónectópica en el mismo núcleo.
• El 1% de los transformantes estables han sufrido recombinaciónhomóloga (si es posible).
• 10% de transformantes ectópicos han sufrido alteracionescromosómicas con frecuencia.
• 100% de transformantes por recombinación homóloga en estirpescon una mutación en el gen mus-51 o mus-52 responsables de larecombinación no homóloga.
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•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora
Cósmidos para construir genotecas en Neurospora
Clonación enNeurospora por
selección degrupos (sibselection)
Núcleos de Neurospora marcados con H1-GFP
Microtúbulos deNeurospora
marcados contubulina-GFP
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•El genoma de Neurospora
El genoma de Neurospora
Tamaño: 42 MbGenoma secuenciado: 39.225.835 bp (rel. 7)
CromosomaIIIIIIIVVVIVII
Tamaño (Mb)10.39.25.75.14.64.04.0
Total: 50%ADN codificante: 44%ADN no codificante: 56%
Contenido G+C
Presentes en el 80% de los genesLongitud promedio: 134 pbPromedio de 1,7 intrones por gen
Intrones
Un transposón activo, Tad, muchas copias detransposones inactivos (RIP),
Haemophilus
C. elegans
Drosophila
Homo
Saccharomyces
1.709
Genes
6.144
18.266
13.338
20.0003000
165
1,8
12
100
Tamaño (Mb)
Neurospora 42 ?10.620
Fin