tema_06_purificacion_proteinas y lisis celuar

8/7/2019 Tema_06_purificacion_proteinas y lisis celuar

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Tema 6. Purificacin de protenas Bioqumica

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TEMA 6. PURIFICACIN DE PROTENAS

1. Introduccin

2. Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas3. Mtodos cromatogrficos4. Mtodos electroforticos

1. Introduccin

La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin, almenos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmenteun gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de sustancias diferentes, la

molcula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse aconcentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visin general de lastcnicas ms usuales empleadas para la purificacin de protenas, aunquemuchas de ellas son aplicables a la separacin de la mayora de las molculasbiolgicas.

El conocimiento del proteoma, conjunto de protenas de un organismo, hapasado a ser el reto de la comunidad cientfica y de las empresasbiotecnolgicas, una vez que ya se ha completado la secuenciacin delgenoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimientode las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor,

si no se identifica cual es la funcin de dichos genes, en su caso, para queprotenas codifican.

El programa proteoma busca la caracterizacin de todas las protenas de laclula humana, identificando su secuencia de aminocidos. Cuando se obtengatoda la secuencia de aminocidos del proteoma humano se podr relacionarmediante potentes programas informticos la secuencia de aminocidos de unaprotena con el gen que la codifica. Los mtodos de secuenciacin tradicionales(basados en la degradacin de Edman) son demasiado lentos para abordaresta ingente tarea, la secuenciacin de los pptidos debe hacerse porespectometra de masas. Naturalmente las tcnicas de purificacin y

aislamiento de protenas son esenciales para abordar toda esta tarea.

2. Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas

El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, paraposteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodode rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulasde donde se va a aislar la protena, as como de su localizacin. Entre losdistintos mtodos ellos estn:


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Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas detejidos animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias.Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida queel interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior dela clula, causando su hinchamiento y rotura.

Destruccin mcanica. Entre estos mtodos se encuentran lahomogenizacin (hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrioque ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o almina;molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las clulasa gran velocidad a travs de un pequeo orificio), la sonicacin(someter lasclulas a vibraciones de ultrasonido).

Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas aun cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (connitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizantampones de extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como

tales disoluciones acuosas de tampones especficos para protenas solubles obien que contengan adems detergentes si se pretende purificar protenasasociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima nose desnaturalice.

Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta amuchos agentes que pueden daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos ybases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas (enzimasque hidrolizan los enlaces peptdicos) son los principales factores que puedendesnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar estos factores lamanipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse

a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procuraque el proceso sea lo ms corto posible, adems en ocasiones es necesario

Presin

Sonicacin


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aadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionalesespecficos de la protena o bien inhibidores de proteasas.

El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado quecontiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin

se somete a centrifugacin (10.000 15.000 rpm) para eliminar los restoscelulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas solubles, delprecipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenasasociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamientoadicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sindetergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena deinters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener encuenta que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarsesiempre que los rotores estn fijos.

Para purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar

cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico yfcil de llevar a cabo. En este sentido es mucho ms cmodo trabajar conenzimas, pues se detectaran mediante su ensayo de actividad, en caso depurificar protenas no enzimticas, se requieren mtodos de seleccin msespecficos.

3. Mtodos cromatogrficos para separacin de protenas

Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga,tamao o afinidad de las diferentes protenas. Uno de los mtodos mshabitualmente utilizados para la separacin de protenas es la cromatografa encolumna, aunque tambin existe la cromatografa en papel y en placa.

La columna est rellena con un material slido con las caractersticas qumicasadecuadas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace pasar atravs de la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la partesuperior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fasemvil. Cada protena migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidadpor la fase estacionaria.

Generalmente estas cromatografas se realizan de una forma semiautomtica,la fase mvil se hace pasar a la columna a travs de una bomba peristltica yun colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Estecolector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto nmero de gotas o devolumen. Despus hay que localizar en que tubo o tubos est la protena quese pretende purificar.

Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos:

La filtracin o exclusin molecular

El cromatografa de intercambio inico

La cromatografa hidrofbica La cromatografa de afinidad


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Filtracin en gel o cromatografa deexclusin molecular. La fase estacionaria estaconstituida por partculas de polmeros dediferente porosidad. La separacin se basa en eltamao de las partculas. Las protenas msgrandes que no pueden penetrar en los poros delas partculas de la matriz de filtracin soneluidas con ms rapidez que las protenas mspequeas que penetran por los poros de laspartculas y siguen un camino ms tortuoso yms largo. El tamao de los poros internos

depende de la naturaleza del polmero encuestin, y permite la entrada a protenas pordebajo de un determinado peso molecular.

Cromatografa de intercambio inico. En ella, la columna est rellena conun soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambioaninico) o negativamente (intercambio catinico). Estos grupos cargadosnormalmente estn neutralizados por iones del tampn. Estos iones sonreversiblemente reemplazados por las protenas con ms tendencia a unirse alsoporte. Las protenas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadorescatinicos o aninicos dependiendo de su carga neta. Las protenas ms

cargadas se unirn ms fuertemente alintercambiador y por lo tanto sern ms difciles deeluir. La afinidad con la que una protena se une a unintercambiador inico depende de la fuerza inica delmedio, debido a la competencia entre los gruposcargados de la protena y los iones de la fase mvil.

Una vez pegadas las protenas, para eluirlas(retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo lafuerza inica de la fase mvil (aumentando laconcentracin de sal, NaCl), de esta forma se eluyenprimero las protenas mas dbilmente retenidas ycuando la fuerza inica sea mayor saldrn lasprotenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas.

Cromatografa hidrofbica. Se trata de unmtodo similar al anterior con la nica diferencia de

que la fase estacionaria es apolar (hidrofbica), es decir, la protena se pega alsoporte por los resto de aminocidos apolares, cuanto ms residuos de este

Filtracin


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tipo tenga en su superficie, ms apolar ser, ms se retendr en la columna yse eluir ms tarde. En este caso a elusin se realiza aumentando laapolaridad de fase mvil.

Cromatografa de afinidad. Muchas protenas tienen la capacidad de unirse

especficamente a ciertas molculas, mediante uniones fuertes, pero nocovalentes. En esta tcnica la molcula que se une especficamente a laprotena se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a unamatriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de protenas se aplica a lacolumna, la protena buscada se unir al ligando inmovilizado mientras que lasdems saldrn de la columna con el tampn. En este caso tambin se utiliza elincremento de fuerza inica para eluir las protenas.

Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemascromatogrficos tales como el FPLC, en el que se hace uso de bombas de altapresin (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altaspresiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de purificacin yutilizan fases estacionarias con mayor poder de retencin, lo que se incrementalos porcentajes y rendimiento de las purificaciones.

EnzimaSustrato

FPLC: Cromatografa lquidade separacin rpida deprotenas

LIGANDO


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4. Mtodos electroforticos

Para comprobar si la protena de inters se ha separado del resto, es decir si laprotena est pura, se requieren las tcnicas electroforticas. La electroforesisde protenas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata

de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en funcin de laconcentracin de acrilamida.

Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de las protenas esun campo elctrico, y el gel acta como filtro molecular, ralentizando lamigracin de las protenas en funcin de su relacin carga/masa. A diferenciade lo que ocurra en la cromatografa de filtracin, en las electroforesis lasprotenas mayores son retardadas y se mueven ms lentamente a travs delgel, ay que las va frenando el tamao del poro y las protenas ms pequeasavanzan ms rpidamente.

En la figura vemos un tpico aparato de electroforesis. El gel se encuentraentre dos placas (normalmente de vidrio). La colocacin de un peine deelectroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permitela formacin de unos pocillos, donde se colocarn posteriormente y una vezretirado el peine, las muestras, que se desplazarn por calles paralelas alaplicar el campo elctrico.

Las muestras de protena se disuelven en una pequea cantidad de una

solucin tampn, que contiene glicerol, que hace que la muestra se site en elfondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeo pesomolecular que nos indica migracin del frente. El tampn de electroforesiscierra el circuito entre el ctodo (+) y el nodo (-). El sistema se conecta a unafuente de alimentacin y las protenas migran hacia el polo positivo, situado enla base del gel.

Despus el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presenciadel colorante adecuado (azul de Coomassie), que tie por completo el gel. Acontinuacin se destie con una disolucin de etanol/actico y el gel queda

transparente y las bandas de protenas quedan teidas de color azul.

(+)

( -)

(+)

( -)


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Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas lasprotenas se separan en funcin de su carga/masa; y en condiciones

desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente,el SDS (dodecil sulfato sdico). El SDS es un detergente aninico, que se unea todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de micelacargada negativamente. La gran carga negativa del SDS enmascara la cargaintrnseca de las protenas, con lo que stas se separan solo en funcin de sumasa e independientemente de su carga. El nico inconveniente de estatcnica es que el SDS desnaturaliza las protenas y las protenas multimricasse separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS adems de permitircalcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas, nos indican lasdistintas subunidades que posee la protena.

Generalmente la protena inters se analizan incluyendo calles con marcadoresmoleculares, que son protenas de peso molecular conocido que nos permitendeterminar el peso molecular de la cadena polipeptdica, como se muestra enla siguiente figura.

Teir conCoomassie

Desteir con

Actico 10%Metanol 25 %

Protena

desconocida

Migracin de la

banda

Protena

desconocida

Migracin de la

banda

Protena

desconocida

Migracin de la

banda

Protena

desconocida

Migracin de la

banda

Protena

desconocida

Migracin de la

banda


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En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido, en lacalle 2 se encuentra la protena sujeta a estudio, de tal manera que se puedehacer una relacin lineal entre el Log del peso molecular de las protenas y ladistancia que recorren en el gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente).

La siguiente figura nuestra la diferencia entre las electroforesis nativa (NATIVA-PAGE) y la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Como se aprecia enla figura una banda en la Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si laprotena tiene varias subunidades de distinto peso molecular, o bien en unabanda de menor peso molecular, si las subunidades poseen el mismo pesomolecular. De la figura se deduce que, la protena est pura (pues solo apareceun banda) y que adems posee 2 subunidades de 15000 g/mol (o lo que es lomismo 15 kDa ) cada una.

15 kDa

SDS-PAGE

30 kDa

NATIVA-PAGE

150 kDa

90

40

23

12

30 kDa

NATIVA-PAGE

30 kDa30 kDa

NATIVA-PAGE

150 kDa

90

40

23

12

150 kDa

90

40

23

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