tema 3: genómica griffiths aj et al., (2000) klug ws y cummings mr (1999) links to animal genomic...
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Tema 3: Genómica
Griffiths AJ et al., (2000)Klug WS y Cummings MR (1999)
Links to Animal Genomic Research web site and Database Resourceshttp://www.genome.iastate.edu/resources/other.html
Objetivos:
• Identificar la utilidad del análisis de los marcadores de DNA para la construcción de mapas, la identificación individual y el aislamiento de genes de interés
• Conocer las metodologías que se han utilizado para la construcción de mapas
• Establecer la relación entre genómica y la nueva producción y sanidad animal
¿Qué es un polimorfismo?
¿cuáles conoces?
¿para qué puede servir el análisis de estos polimorfismos?
¿cómo se han construido los mapas del genoma?
¿para qué nos sirven?
Contenidos
• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
Genómica
• ESTRUCTURAL:– Caracterización de la
naturaleza física de genomas completos
• FUNCIONAL:– Caracterización del
proteoma y de los patrones globales de expresión génica
Caracterización molecular de genomas completos
DNA eucariótico
Genes funcionales de copia única
DNA de secuencia repetida
DNA separador
Secuencias funcionalesSecuencias sin función
conocida
Secuencias funcionalesNo codificantes
Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
Familias de genes en tándem
Repeticiones heterocromatinaDel centrómero
VNTR
Secuencias derivadasDe transposiciones
Transposones
Retrotransposones
Clasificación del DNA eucariota
Genómica estructuralCaracterización de la naturaleza física de genomas:
- Polimorfismos del DNA
- Cartografía
Contenidos
• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
Polimorfismo genético
• Existencia de distintos alelos:– Polimorfismo bioquímico:
• Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas
– Polimorfismos del DNA:• Variaciones presentes en la secuencia de
bases– Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales– Polimorfismos del número de repeticiones en
tándem
• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales
1. Cambios de bases:a. Transiciones:
i. Purina Purina:
ii. Pirimidina Pirimidina:
b. Transversionesi. PurinaPirimidina:
ii. Pirimidina Purina
Alelo 1Alelo 2
TACGAGCTATACGGGCTA
A G Purinas
T C Pirimidinas
• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)– 10 a 30 millones de SNP en el genoma
humano– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de
mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)– Fácil estandarización– Aplicaciones en la determinación de
enfermedades y en farmacogenética
• Detección de los SNP:– RFLP:
• Southern Blot• PCR + RFLP
– Secuenciación
– Minisecuenciación
– Sondas específicas
– SSCPs
– PCR en tiempo real…
• RFLPs– Detección mediante
enzimas de restricción:• Southern Blot• PCR+RFLP
– Normalmente determinados en exones
RFLPs-SNP
• Origen: mutaciones puntuales• Variabilidad: 2 alelos• Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador
Detección de mutaciones puntuales
RFLP:Alelo 1Alelo 2
TGGACGTCTTGGATGTCT
MCL1
Aat II
Alelo 1 Alelo 2Sonda
Detección de mutaciones puntuales
Minisequencing
VNTR Tamaño (Kb)
Unidad repetición
Método detección
Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados
Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern
Microsatélites pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación
Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem
• DNA satélite: – repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y
algunas Mb)• DNA no transcrito• Regiones de heterocromatina, principalmente en
centrómeros (DNA alfoide)
• DNA minisatélite– Repeticiones de tamaño moderado (60pb)– Distribuidas por todo el genoma, principalmente en
telómeros– Normalmente no se transcriben– Tipos:
• DNA minisatélite hipervariable• DNA telomérico
Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem
• DNA minisatélite hipervariable– Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb
de longitud, de repeticiones en tándem cortas
– Secuencia repetida común (core):
GGGCAGGAXG
– Son muy polimórficas
– Se encuentran en intrones
– Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares”
VN
TR
s
1
10
4
6
8
INDIVIDUO 2
11
7
1
345
2
3 3’
3
5
9
21
32
4
1
32
4
3’3
INDIVIDUO 1
2
4
6
8
1
3
5
7
9
1 1’
1
3
5
7
2
4
6
1
1
3
5
7
2
4
6
8
1
1
3
5
7
2
4
6
8
1
3
5
2
4
6
2
4
6
1
3
5
7
2’2
1
3
5
7
9
1
3
5
2
4
2 2’
10
2
4
6
8
4
5
7
9 10
11
8
6
INDIVIDUO 1
INDIVIDUO 2
Fingerprints
• DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de
repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)
– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)
– Herencia mendeliana codominante
CA CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA
Alelo 1
Alelo 2
Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem
• Visualización de los microsatélites
ACGT
Secuenciación:Genotipado:
• Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: – Expansión de microsatélites de trinucleótidos:
• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar
(SCA)
– Expansión de tetranucleótidos: DM2– Expansión de pentanucleótidos: SCA10
Enfermedades humanas se han creado animales modelo
Secuencias de DNA dispersas
¿DNA basura?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Mecanismo de reparación?- ¿Puntos de recombinación?
• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:– Diagnóstico genético– Ligamiento con fenotipos– Identificación individual – Construcción de los mapas génicos
Técnicas básicas: Extracción del DNA genómico Electroforesis Hibridación (Southern, Northern) Restriction Fragment Lenght Polymorphism Reacción en Cadena de la Polimerasa Secuenciación (método de Sanger) Clonación
Diagnóstico genético directo:
• Mutaciones puntuales • Inserciones, deleciones • Repeticiones en tándem • Transcripción diferencial • Procesamiento alternativo del RNA• Metilación
RFLPs, Secuenciación, chips
PCR, Southern
PCR, secuenciación
RT-PCR, Northern, chips
RT-PCR, North.
MPCR
Diagnóstico genético indirecto:Análisis de marcadores genéticos
XGen alterado
Marcador polimórfico
Mutación puntualMicrosatéliteRFLPDeleciónInserción
Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado
Identificación individual:
•Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos)
•Análisis de marcadores microsatélites
•PCR, secuenciación
• Fingerprinting (minisat.)
Detección mediante RFLP + Southern
Microsatélites Minisatélites
Control de filiaciónControl de libros genalógicos
Contenidos
• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
• Mapas del genoma:– Mapa genético
• Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico
• Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis
– Mapa físico• Posición exacta de un gen• Distancia entre marcadores determinada por
nº de pb
Mapas genéticos
RequerimientosExistencia de polimorfismo en los genes a mapearAnálisis de familias “informativas” (AaBb x AABB)
Estudios de ligamiento :
-Herencia ligada al cromosoma X
-Marcadores polimóficos asignados a paneles de familias
- Alozimas
- Polimorfismos del ADN (microsatélites, RFLPs)
- Caza de genes relacionados con enfermedades o caracteres productivos:
- Fibrosis Quística (9 años) humano
Mapas físicos
ResoluciónCromosoma (paneles de células híbridas somáticas)Banda cromosómica (FISH)Células híbridas irradiadasSecuencia nucleotídica
Contenidos
• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
Estrategias para la identificación de un gen
Clonado posicional Clonado funcional Gen candidato
Identificación del fenotipo
Mapa
Gen
Mutaciones
Función
Función
Gen
Mutaciones
Mapa
Gen
Mutaciones
Mapa
Función
Identificación de un gen
Identificación clásica
Estudios en familias(modo de herencia)
Análisis de ligamiento o mapa físico(identificación de la región cromosómica)
Acotar la zona cromosómica(clonaje en YAC)
Análisis de los clones (contigs, búsqueda de marcadores, ORF, mutaciones)
gen Estudios de expresión
Genómica
Estudios de expresión
gen
mutaciones
Gen de doble musculatura• Crecimiento anormal
del tejido muscular debido a una hipertrofia (=hiperplasia)
• 20% más de rendimiento de carne
• Aumento de cortes con gran valor económico
• Carne magra• Muy buena conversión
alimentaria• Dificultades en el parto
Azul BelgaPiamontesaLimusinaCharolésAsturiana de los Valles
1995: Carácter controlado por un gen mayor mh
Gen de doble musculatura¿mh?
Identidad? Localización cromosómicaAzul Belga x Frisona
Rastreo del genoma con microsatélites
Región BTA2 próxima centrómero
MYOS-/-
MiostatinaGen candidato
MYOS 2q11
Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura
Descripción Tipo de mutación Raza
inserción/deleción en la posición 418
Corrimiento en el marco de lectura
Belgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubrac
transición C T en la posición 610
Sin sentido - terminación
prematura de la proteína
Charoláis
transversión G T en la posición 676
Sin sentido - terminación
prematura de la proteína
Maine-Anjou, Parthenais
Deleción de 11 pb desde la posición 821 hasta la 831
Corrimiento en el marco de lectura -
terminación prematura de la
proteína
Belgian blue, Limousine, South Devon, Asturiana
de los Valles
transición G A en la posición 938
Transversión consentido. Cys Tyr en la proteina
Piemontese, Gascon
Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales
transversión C A en la posición 282
Mutación consentido. Phe Leu en la proteina
Limousine, Aubrac, Devon,
Pirenaica
transición C T en la posición 414
Transición silente – sin cambio en la
proteína
Ampliamente distribuida
Tipificación de animales:
Diagnóstico indirecto:- microsatélites
Diagnóstico directo:- mutaciones MYOS
Herencia autosómica recesiva
Ligamiento vs asociación
• Ligamiento:– Identificación de
regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias)
– Análisis de 500 pols– Regiones candidatas y
acotamiento de la región
– Alelos raros de alto riesgo
• Asociación:– Análisis de individuos
afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos
– Facilidad para la obtención de muestras
– Necesidad de analizar miles de marcadores
– Alelos de acción modesta en enfermedades comunes
Contenidos
• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
Mapa genómico:
Representación lineal de los sitios genómicos importantes (genes y marcadores)
1990: Proyecto Genoma Humano (National Institute of Health and the Department of Energy, USA)
1. Construcción del mapa físico y genético2. Determinar la secuencia de 3000 millones de
caracteres del DNA humano con un 99.9% de fiabilidad3. Determinar y localizar las variaciones del DNA entre
individuos (polimorfismos)4. Localizar todos los genes humanos5. Establecer las funciones de estos genes y otras partes
del genoma
Mapear y secuenciar el genoma humano
• Mapear y secuenciar los genomas de animales modelo:– E. coli (4,6 millones pb)– S. cerevisiae (12 millones pb)– C. elegans (97 millones pb)– D. melanogaster (165 millones pb)– M. musculus (3000 millones)– Otros
• Recolectar y distribuir datos:– Publicar en 24 h toda secuencia >2000pb
• Crear bases de datos• Desarrollar programas de análisis de DNA• Desarrollar herramientas para comparar e interpretar la información
genómica– Compartir la información públicamente
• Estudiar los aspectos éticos, legales y sociales de la investigación en genética
• Entrenamiento de investigadores• Desarrollo de tecnologías
- Desarrollar el catálogo definitivo de genes codificantes de proteínas
-Utilizar la genómica comparativa para alinear el genoma humano con el de otras especies para la identificación de genes
-Encontrar los elementos funcionales que controlan el tiempo y nivel de expresión de genes y micro-RNAs
-Secuenciar el restante 20% de heterocromatina (problemas de repeticiones)
“The end of the begining”
2003: Genoma completado
Contenidos
• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
Mapas genómicos en especies domésticas
1. Mapas de ligamiento, ricos en marcadores de DNA
2. Mapas físicos, ricos en genes conservados (permiten el mapeo comparativo)
3. Unión de ambos mapas4. Mapas de EST (Expressed Sequence Tag)5. Mapas de alta resolución en cromosomas
específicos6. Identificación de genes candidatos y
regiones con QTLs
Mapas genómicos en especies domésticas
• Australian Sheep Gene mapping Web site– http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm
• BovMap database– http://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/bovmap/
intro2.pl
• Pig base– http://www.thearkdb.org/browser?species=pig
• Dogmap– http://www.dogmap.ch/
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• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología
de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas
herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:
ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional
Genómica funcional
• Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional
• Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas
• Identificación de su función• Empleo de chips (microarrays) de
DNA para estudio de regulación génica
Chips de DNA
• Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos
• En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos)
• Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.)
• Se miden variaciones en la expresión de los tejidos
Aplicaciones de la Genómica
• Conocimiento y comprensión de procesos patológicos
• Precisión de diagnóstico:– Clasificación más fina (cáncer de colon, piel)– “Farmacogenómica” respuesta individual a
tratamientos, elección de quimioterapia
• Evaluación correcta del riesgo genético:– Predicción de la agresividad tumoral
• Prevención conocido el riesgo genético– Comenzar planes de vigilancia en riesgo de
cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..
• Análisis de recién nacidos• Detección de portadores• Desarrollo de terapias:
– Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional
– Terapia basada en la genética: • Diseño de nuevas drogas• Tratamientos basados en las bases moleculares• Elección del tratamiento
• Identificación de genes con interés en producción.
Implicaciones del conocimiento del genoma
Videos de genómica
http://www.youtube.com/watch?v=6iFDphWXjw4&feature=related
¿Qué falta aquí?
http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhMhttp://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=relatedhttp://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=related
Microarray: