TecnologíaTecnología de DNA de DNArecombinanterecombinante

Esther Esther ZorayaZoraya Vega, Ph.D. Vega, Ph.D.CertificadoCertificado en en BiotecnologíaBiotecnología

DNA DNA recombinanterecombinante

Es la Es la tecnologíatecnología queque permitepermite combinarcombinarDNA de DNA de diferentesdiferentes organismosorganismos en en unaunasolasola moléculamolécula de DNA. de DNA.

DNA DNA recombinanterecombinante

Stanley Cohen Herbert Boyer

DNA DNA recombinanterecombinante

EnzimasEnzimas de de restricciónrestricción

SonSonendonucleasasendonucleasas,,queque puedenpuedenromper enlacesromper enlacesfosfodíesterfosfodíester en el en elDNA en DNA en secuenciassecuenciasespecíficasespecíficas..

EnzimasEnzimas de de restricciónrestricción

EnzimasEnzimas de de restricciónrestricción

Las Las enzimasenzimas de de restricciónrestricción reconocenreconocensecuenciassecuencias palindromes de 4 a 8 palindromes de 4 a 8bases.bases.

EnzimasEnzimas de de restricciónrestricción

Las Las enzimasenzimas de de restricciónrestricción no no afectanafectanel DNA del el DNA del organismoorganismo queque lo produce lo produce

MapasMapas de de restricciónrestricción

MapasMapas específicosespecíficos queque se se obtienenobtienen porpor enzimasenzimasde de restricciónrestricción queque se se puedepuede generargenerar utilizandoutilizandocualquiercualquier moléculamolécula de DNA ó de DNA ó genomasgenomas de decualquiercualquier organismoorganismo..

ReplicaciónReplicación del DNA- in del DNA- invitro PCRvitro PCR

DescubiertaDescubierta en en1985 1985 porpor KaryKaryMullis.Mullis.

RecibíoRecibío el el PremioPremioNovel en 1993.Novel en 1993.

PCRPCR TécnicaTécnica queque permitepermite la la amplificaciónamplificación de de unauna

secuenciasecuencia específicaespecífica de DNA de DNA millonesmillones de de vecesveces.. PCR se PCR se fundamentafundamenta en el en el fenómenofenómeno de la de la

extensiónextensión de un de un ““primerprimer”” porpor la la polimerasapolimerasade DNA de DNA descubiertodescubierto en en loslos 60 60’’s.s.

Ha Ha revolucionadorevolucionado muchasmuchas áreasáreas de deinvestigacióninvestigación comocomo: : diagnósticodiagnóstico de deenfermedadesenfermedades, , medicinamedicina forenseforense y yevoluciónevolución molecular. molecular.

PCRPCR PCR PCR utilizautiliza la la amplificaciónamplificación

enzimáticaenzimática parapara aumentaraumentar el elnúmeronúmero de de copiascopias de de cualquiercualquierfragmentofragmento de DNA de DNA hastahasta 6000 6000pares de bases de largo.pares de bases de largo.

ReplicaciónReplicación del DNA del DNA

In vitroIn vitro

PCRPCR

PCR..\Certificado en Biotecnologia\pcrwin.zip

PCRPCR

ReacciónReacción se se sometesomete a a múltiplesmúltiplesciclosciclos de de síntesissíntesis quequeconsistenconsisten de: de:

DesnaturalizaciónDesnaturalizaciónCalentamientoCalentamiento hastahasta cercacerca a a9494ooC, C, rompiendorompiendo loslos puentespuentes de dehidrógenohidrógeno entreentre laslas bases, y la bases, y ladobledoble hebrahebra de DNA se de DNA se separasepara..

PCRPCRHibridizaciónHibridización (annealing) (annealing)

La La disminucióndisminución de la de la temperaturatemperaturaa ~ 65a ~ 65oo permitepermite queque laslas sondassondas(primers) (primers) hibridizenhibridizen con con sususecuenciasecuencia complementariacomplementaria en la en lahebrahebra sencillasencilla de DNA. La de DNA. Latemperaturatemperatura óptimaóptima dependedepende de la de laproporciónproporción de AT a GC en la de AT a GC en lasecuenciasecuencia de la de la sondasonda..

PCRPCR

CadaCada ciclociclo duradura ~ 2 ~ 2 minutosminutos.. 25 25 ciclosciclos de de síntesissíntesis produce, produce,

teóricamenteteóricamente, 1,000,000 de, 1,000,000 decopiascopias de la de la secuenciasecuencia blancoblanco..

25 25 ciclosciclos tomatomaaproximadamenteaproximadamente 1 hr. 1 hr.

PCRPCRDetecciónDetección

ClonajeClonaje

GeneraciónGeneración de de múltiplesmúltiples copiascopias de defragmentosfragmentos de DNA de DNA porpor amplificaciónamplificaciónó ó multiplicaciónmultiplicación de de moléculasmoléculas de DNA de DNArecombinanterecombinante en un en un hospederohospedero comocomounauna bacteria. bacteria.

ReplicaciónReplicación del DNA- del DNA-ClonajeClonaje del DNA del DNA

RequisitosRequisitos de de loslos vectoresvectoresde de clonajeclonaje

OrigenOrigen de de replicaciónreplicación MarcadorMarcador dominantedominante –– gengen queque

confieraconfiera resistenciaresistencia a a antibíoticoantibíotico LugaresLugares únicosúnicos de de restricciónrestricción

VectoresVectores de de clonajeclonaje--pBR322pBR322

PlasmidiosPlasmidios –– se secomportancomportan comocomomini-mini-cromosomascromosomas pBR322 pBR322 –– tettet++ y y

ampamp++;;fragmentosfragmentospequeñospequeños ~ 5 ~ 5kbkb

pUC18pUC18

Se Se producenproducen en # alto en # altode de copiascopias..

MCS- (MCS- (polylinkerpolylinker))lugarlugar de de insercióninserción DNA DNA

ResistenciaResistencia a amp y a amp ylaclacZZ gene gene

En En presenciapresencia de IPTG de IPTGy X-gal, y X-gal, laslas coloniascoloniasson son azulesazules ( (porpor la lapresenciapresencia de la de laenzimaenzima activaactiva).).

VectoresVectores de de clonajeclonaje FagosFagos –– derivadosderivados de de

fagofago λλ (10-15 kb) (10-15 kb) CíclicoCíclico líticolítico eses

posibleposible; ; lisogénicolisogénico no no ContieneContiene ““coscos ends ends””

del del fagofago ( (parapara hacerhacerλλ circular) circular)

PresenciaPresencia de de placasplacasen en gramasgramas de de E. coliE. coliindicaindica la la presenciapresencia de demoléculasmoléculasrecombinantesrecombinantes

VectoresVectores de de clonajeclonaje

CosmidosCosmidos- - vectoresvectores híbridoshíbridos artificialesartificialesqueque contienencontienen componentescomponentes de y de y dedefagosfagos, , aumentandoaumentando el el tamañotamaño del delfragmentofragmento a a clonarclonar a 45 Kb (in vivo a 45 Kb (in vivo comocomoplasmidiosplasmidios; in vitro ; in vitro comocomo fagosfagos)) LuegoLuego de de empacarseempacarse, , fagosfagos recombinantesrecombinantes son son

utilizadosutilizados parapara infectarinfectar bacteriasbacterias dondedonde se sereproduciránreproducirán comocomo plasmidiosplasmidios

VectoresVectores de de clonajeclonaje

YACsYACs - - hastahasta 1000 1000Kb; Kb; llevanllevancentrómeroscentrómeros,,origenorigen de dereplicaciónreplicación y ytelómerostelómeros

VectoresVectores de de clonajeclonaje

BACsBACs - - basadobasado en en7 Kb factor F de 7 Kb factor F de E.E.colicoli queque actúaactúacomocomo factor F factor F’’(100-300 Kb)(100-300 Kb)

VectoresVectores de de expresiónexpresión

VectoresVectores de de expresiónexpresión–– permitepermite la la expresiónexpresiónde de secuenciassecuenciasclonadasclonadasfusionándolasfusionándolas con con““transcription andtranscription andtranslation start andtranslation start andstop sequencesstop sequences””..PermitePermite la la expresiónexpresióndel DNA del DNA clonadoclonado en en susurespectivorespectivo hospederohospedero..