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Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos

Tecniche di studio in Biologia Cellulare

-‐  Colture cellulari

-‐ Gi an-corpi: policlonali e monoclonali

-‐ Tecniche morfologiche: la microscopia -‐ Colorazioni e immunocitochimica -‐ Microscopia o?ca: a campo chiaro, a fluorescenza (confocale) -‐ Microscopia eleDronica: trasmissione, a scansione

-‐ Tecniche biochimiche: -‐  Frazionamento cellulare -‐  Marcatura metabolica -‐ EleDroforesi dei acidi nucleici e delle proteine -‐ Southern, northern e western blot

-‐  Citometria di flusso

-‐  ELISA e RIA



COLTURE CELLULARI

-‐ Colture di cellule primarie: presse dal animale o dal uomo, crescono per tempo limitato. -‐ Colture di linee cellulari: cellule trasformate procedenM di tumori o faDe in laboratorio.

Si lavora in cappa sterile, con terreni di coltura contenenM siero bovino (faDori per la nutrizione, sopravvivenza e crescita cellulari) o chimicamente definiM, usando materiale sterile in plasMca (monouso) o vetro.



ANTICORPI

Sono ‘gli aDrezzi’ fondamentali per lo studio delle proteine. Fanno possibile rilevare specificamente la proteina soDo studio fra tuDe le altre proteine cellulari, in diverse tecniche di studio. -‐  Policlonali: mescola di tu? gli anMcorpi generaM contro una proteina (anMgene) dalla risposta immune del animale ospite. Si oDengono come siero immune, che può essere ulteriormente purificato per tenere solo la frazione IgG o gli anMcorpi specifici per l’anMgene. In genere da coniglio, capra. -‐  Monoclonali: anMcorpi procedenM di un solo clone di linfociM B isolato e messo in coltura. Si o?ene come terreno di coltura, che si può usare direDamente o per purificare gli anMcorpi. In genere da topo.



La scala di missura…



MICROSCOPIA

I primi microscopi sono del secolo XVII. Robert Hooke, 1665: ‘cellule’ del sughero visto al microscopio: erano pareM cellulari, ma il nome rimane. Da questo momento in poi, l’uso del microscopio permeDe lo studio delle cellule vegetali ed animali, e la nascita della Biologia Cellulare (secolo XIX). 1860: gli esperimenM di Louis Pasteur convincono agli scienziaM della teoria cellulare: non esiste la generazione spontanea.

Fino ad oggi, ogni progresso tecnologico del microscopio ha portato al progresso della conoscenza in biologia cellulare.



Come è faDo un microscopio



Microscopia a campo chiaro: illuminazione con luce visibile.

Campo chiaro

Contrasto di fase

Contrasto di interferenza (Nomarski)

Queste due sono tecniche o?che che permeDono vedere meglio campioni non coloraM sfruDando la variazione sofferta per la luce al passare per sostanze con diverso indice di refrazione. Molto uMli per osservare cellule vive (in coltura).

Fibroblasto in coltura



Colorazioni e immunocitochimica

Per visualizzare meglio i campioni. Richiede diversi passi: -‐  Fissazione: per immobilizzare i componenM cellulari nei loro posM. Alcoli, aldeidi. -‐  Disidratazione: per facilitare il passo seguente… -‐  Inclusione: i tessuM vengono inseriM in un materiale più consistente per fare sezioni so?li da colorare, in paraffina (o?co) o in resine (eleDronico). -‐  Sezionamento: taglio a fe?ne per la colorazione e osservazione. Al microtomo: per microscopio o?co: 20 µm, per eleDronico: 0.1 µm. -‐  Reidratazione: per facilitare il passo seguente… -‐  Colorazione istologica:

-‐  Con coloranM acidi o basici: ematossilina (basica, colora il nucleo acido in blue) /eosina (acida, colora il citoplasma in rosa).

IntesMno e tumore



-‐ Immunocitochimica o immunoistochimica: uso di anMcorpi per rilevare proteine specifiche nei tessuM. Gli anMcorpi sono marcaM con enzimi che producono un colore di localizzazione, o con molecole fluorescenM.

Organo soDocommessurale di raDo



Microscopia a campo chiaro: cell live imaging.



Microscopia a fluorescenza: illuminazione con luce fluorescente



Variante: microscopio confocale: è in grado di fare una sezione o?ca (per scansione col laser) e dare una immagine molto più niMda.

Embrione d’inseDo, immunocitochimica per l’acMna (in verde).

Immunocitochimica per la neuroserpina (roso), il reMcolo endoplasmaMco (sinistra,

verde) e il Golgi (destra, verde).



Microscopia ele?ronica di trasmissione: illuminazione con eleDroni, lenM: anelli magneMci. Specimen nel vuoto. Si ‘colora’ (contrasta) lo specimen con metalli pesanM che fermano gli eleDroni.



Filamento di DNA

Una cellula



Microscopia ele?ronica a scansione: illuminazione con eleDroni, lenM: anelli magneMci. Specimen nel vuoto, ‘colorato’ con una lamina di metallo, si vede la superficie.

Polline

Stereocillia nel udito interno



Marcatura metabolica



Ele?roforesi dei acidi nucleici: in gel di agarosio, colorazione con bromuro di eMdio (s’intercala nel DNA), visibile con luce ultravioleDa.



Ele?roforesi delle proteine: in gel di poliacrilamide, coloraM con Coomassie blue o con sali d’argento.



Ele?roforesi delle proteine: visualizzazione di proteine dopo marcatura metabolica radioa?va, per autoradiografia.

Mme 0 Mme 45 min cells cells medium EndoH -‐ + -‐ + -‐ +

PC12-‐W

T NS

PC12-‐G392E NS



Western blot: analisi di proteine dopo eleDroforesi e trasferimento a filtro usando anMcorpi.



Citometria a flusso: per analizzare e separare cellule diverse di un campione.



ELISA (colorimetrico) e RIA (radioa?vo): per rilevare e quanMficare una proteina in un campione complesso.



Tecniche biochimiche

Frazionamento cellulare: permeDe l’isolamento dei componenM cellulari in funzione della sua dimensione e densità.



Southern and northern blot: analisi di DNA e RNA dopo eleDroforesi e trasferimento a filtro.

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