Atlas de Histologı́a Vegetal y Animal

Técnicas histológicas

OBSERVACIÓN

Manuel Meǵıas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Bioloǵıa Funcional y Ciencias de la Salud.Fcacultad de Bioloǵıa. Universidad de Vigo.

(Versión: Julio 2018)

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Contenidos

1 Introducción 1

2 El proceso histológico 2

3 Observación 4

4 Microscopio óptico 5

5 Microscopio electrónico 8

Técnicas histológicas. Observación. 1

1 Introducción

En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicasvamos a describir los procedimientos experimentalesnecesarios para obtener secciones teñidas y listas paraobservar al microscopio partiendo de tejidos vivos ex-tráıdos de un animal o de una planta. Por tanto, dedi-caremos espacios a la obtención, fijación, inclusión,corte y tinción de los tejidos. Todos estos aparta-dos seguirán el mismo esquema que los caṕıtulos ded-icados a los tejidos o a la célula, partir de un es-quema básico y ampliar la información sucesivamenteen páginas adicionales. No dedicaremos demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto de vistaoperativo, pero śı a la conveniencia de su uso y asus capacidades. Además, se incluye un apartado deprotocolos y recetas donde se incorporan los tiempos,productos y manera de proceder para llevar a cabolas tinciones más comunes y cómo preparar sus reac-tivos.También se han añadido algunos v́ıdeos explica-tivos.

La mayoŕıa de las técnicas histológicas van encam-inadas a preparar el tejido para su observación con elmicroscopio, bien sea éste óptico o electrónico. Ello

es debido a que la composición de los tejidos, salvocontadas ocasiones, no tienen contraste ni colores per-mitan diferenciar sus estructuras de una manera claramediante la observación directa con los microscopios.Por ello hay procesar las muestras, primero para queno se se deterioren y después para resaltar sus estruc-turas y poder estudiarlas en detalle.

Existen procedimientos rápidos y simples para laobservación de tejidos y células vivas que reciben elnombre de vitales. Por ejemplo, la observación delflujo sangúıneo en capilares del sistema circulatorio.Otra forma de observar células o tejidos vivos es medi-ante las técnicas histológicas supravitales, en los quelas células y los tejidos se mantienen o se hacen crecerfuera del organismo, como es el caso de los cultivosde células y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas enlas que las células mueren durante el proceso, pero lascaracteŕısticas morfológicas y moleculares que poséıanen estado vivo se conservan lo mejor posible, lo quedepende del tipo de técnica. Estas páginas estarándedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son lasmás comúnmente usadas en los laboratorios de his-toloǵıa.

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2 El proceso histológico

Denominamos proceso histológico a una serie demétodos y técnicas utilizados para poder estudiarlas caracteŕısticas morfológicas y moleculares de lostejidos. Hay diversos caminos para estudiar los teji-dos, es decir, series de técnicas que se utilizarán de-pendiendo de qué caracteŕıstica deseemos observar.En el siguiente esquema se muestran los métodosy técnicas comúnmente empleados durante el proce-samiento de los tejidos para su observación con losmicroscopios óptico o electrónico. Sin embargo, hayque tener en cuenta que existen muchas variantes a es-tos ”caminos” y su elección dependerá del resultadofinal que queramos obtener.

El proceso histológico comienza con la obtencióndel tejido objeto de estudio. En el caso de los tejidosvegetales directamente se toman muestras de los dis-tintos órganos que componen el cuerpo de la planta,mientras que para los tejidos animales podemos op-tar por dos opciones: coger una porción del tejidou órgano y procesarla o procesar primero el animalcompleto y luego extraer la muestra que nos interese.En cualquier caso las muestras son habitualmente fi-jadas con unas soluciones ĺıquidas denominadas fi-jadores, las cuales se usan para mantener las estruc-turas celulares y moleculares inalterables durante elprocesamiento posterior y con una organización lomás parecida posible a como se encontraban en lamuestra viva. También podemos fijar las moléculas delos tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido escomo hacer una fotograf́ıa de dicho tejido, su estruc-tura se mantendrá hasta su observación. La fijaciónpor congelación se emplea cuando la fijación qúımicao los procesos histológicos posteriores alteran las car-acteŕısticas de la muestra que queremos estudiar, porejemplo una molécula sensible a dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir eltejido para posteriormente obtener secciones. Cuantomás delgada queramos que sea nuestra sección mástenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se con-sigue embebiendo el tejido con sustancias ĺıquidas queposteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán

consistentes (ceras). También se puede conseguirel mismo efecto mediante congelación rápida. Cortesmás gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesi-dad de inclusión usando el vibratomo. Los mediosde inclusión no son normalmente hidrosolubles porlo que tendremos que sustituir el agua de los tejidospor solventes orgánicos liposolubles y posteriormentesustituirlos por el medio de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cor-tar los tejidos, es decir, obtener secciones. Existendiferentes aparatos de corte que permiten conseguirsecciones ultrafinas (del orden de nanometros), semi-finas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm)y gruesas (mayores a 10 µm). Habitualmente las sec-ciones se procesan para poder observarlas y estudiar-las, aunque ciertos tipos de microscoṕıa, por ejemplocon contraste de fase, permiten observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las secciones setiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo quehay que eliminar el medio de inclusión para que loscolorantes pueden unirse al tejido. Las secciones ul-trafinas (observadas con el microscopio electrónico)o semifinas (observadas con el microscopio óptico)se pueden contrastar con metales pesados o con col-orantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con los micro-scopios. Existen dos tipos básicos de microscopios:óptico y electrónico. Los primeros ofrecen una granversatilidad en cuanto a modos de observar los teji-dos: campo claro, fluorescencia, contraste de fase,polarización o contraste de interferencia diferencial,mientras que los segundos permiten un gran poder deresolución, pudiéndose observar caracteŕısticas ultra-estructurales.

Como dijimos al comienzo existen múltiples varia-ciones sobre este esquema general de procesamientohistológico. Por ejemplo, se pueden observar tejidoscon el microscopio electrónico de barrido sin necesi-dad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos su-perficies. En las siguientes páginas veremos con ciertodetalle algunas de las técnicas más empleadas para laobservación de los tejidos.

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Figura 1. Esquema del proceso histológico.

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3 Observación

El último paso de todo proceso histológico es la ob-servación del resultado producido por la técnica real-izada. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2mm (poder de resolución: distancia mı́nima a la quese discriminan dos puntos), mientras que una célulaeucariota t́ıpica suele tener unas dimensiones que os-cilan entre 10 y 50 micrómetros (µm. 1 µm=10-6mm). Además, si queremos estudiar la ultraestruc-tura celular hay que tener en cuenta que el grosorde una membrana celular es de unos 7 nanometros.Todo ello implica que necesitamos aparatos que nospermitan aumentar al imagen de las muestras paradiscriminar estructuras tisulares diminutas como sonlas células o sus compartimentos. Estos aparatos sellaman microscopios.

Hay dos tipos de microscopios: los ópticos y loselectrónicos.

Los microscopios ópticos, o de campo claro, uti-lizan la luz visible y lentes de cristal que permiten unaumento de las muestras de unas 1000 veces, con unpoder de resolución de unos 0,2 micrómetros. Ésta esla máxima resolución que permite la luz visible porsus propiedades de onda. Los microscopios se usan

para observaciones generales, caracteŕısticas celularesy tisulares, y están presentes en todos los laboratoriosde histoloǵıa.

Los microscopios electrónicos se basan en la altafrecuencia de los electrones para conseguir un poderde resolución de 1 nanometro. Se usan para observarla ultraestructura de la célula y los tejidos, es de-cir, para estudiar el nivel subcelular, como orgánulos,membranas u organizaciones moleculares (por ejem-plo, se pueden observar los ribosomas). Hay dos tiposde microscopios electrónicos: los de transmisión, quese usan para estudiar la ultraestructura de la célulaen secciones muy finas, y el de barrido, que permiteestudiar superficies.

A los microscopios, sobre todo los ópticos, se lespueden añadir dispositivos que permiten ampliar supotencialidad. Por ejemplo, al microscopio óptico sele puede adaptar una fuente luminosa y una seriede filtros para observar moléculas fluorescentes, o fil-tros para destacar cambios de densidad en el tejido,etcétera. A las diferentes formas de utilizar los micro-scopios para la observación de caracteŕısticas de lostejidos se les llama microscoṕıa. Aśı podemos hablarde microscoṕıa óptica de contraste de fase, de fluores-cencia, electrónica, etcétera.

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4 Microscopio óptico

El microscopio óptico es un elemento esencial paralos estudios generales de histoloǵıa puesto que es elque nos permite observar las diferentes caracteŕısticasmorfológicas de las células y los tejidos. Se basa enel uso de lentes para aumentar los rayos de luz queatraviesan una muestra de tejido. Su invención seremonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido per-feccionando hasta llegar a los modernos microscopios.Durante estos siglos, el mayor avance en cuanto a per-fección y calidad se ha producido en su principal el-emento, las lentes, las cuales aumentan la imagen delas secciones de tejido y permiten hacer visibles alojo humano detalles ńıtidos que de otra manera seŕıaimposible observar.

Los microscopios ópticos tienen un ĺımite máximode resolución de 0,2 µm. El poder de resolución es ladistancia mı́nima a la que se pueden discriminar dospuntos. Este ĺımite viene determinado por la longitudde onda de la fuente de iluminación, en este caso laluz visible.

Contiene normalmente dos sistemas de lentes: elobjetivo y el ocular. El objetivo recoge la luz queatraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular esel que proyecta la imagen sobre la retina. El aumentototal que permite un microscopio óptico se calculamultiplicando la magnificación que produce el obje-tivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si es-tamos usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces)y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultadofinal sera de 400x, es decir, vemos la muestra aumen-tada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanza-dos se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivode 100x junto con oculares de 10x o 15x). Algunosmicroscopios ópticos tienen lentes internas que pro-ducen aumentos adicionales que tendremos que teneren cuenta para calcular la magnificación de la imagenque se observa. No debemos confundir los aumentoscon el poder de resolución. Por más que consigamosaumentar una imagen tomada de un microscopio, in-cluso con metodoloǵıa digital, no se puede aumentarla resolución de la imagen.

PARTES del MICROSCOPIO

Un microscopio óptico básico está formado por lassiguientes partes:

Oculares. Son las lentes que forman la imagen queobservaremos con nuestros ojos. Todos los microsco-pios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo.Por eso a los microscopios actuales se les llama binoc-ulares. Los primeros microscopios eran monoculares,es decir, poséıan un solo ocular. Hay que tener encuenta que en los microscopios más avanzados tantoel objetivo como el ocular suelen estar compuestospor varias lentes. Al menos uno de los oculares puederegularse para alejar o acercar la lente al objetivo,permitiendo ajustar el enfoque a las condiciones devisión, dioptŕıas, de cada observador.

Figura 2. Partes de un microscopio simple.

Objetivos. Los objetivos son las lentes que recibenla lux directamente tras atravesar la sección his-tológica y quizá sean los elementos más importantesdel microscopio. Hoy en d́ıa los microscopios ópticosposeen un tambor o revólver donde se encuentran var-ios objetivos. Cada uno de ellos posee lentes que per-miten diferentes aumentos. Las magnificaciones de losobjetivos más usados suelen ser de 4x, 10x, 20x, 40xy 100x. Rotando el revólver se puede seleccionar elobjetivo y por tanto el aumento al que queremos ob-servar la preparación. Aparte de los aumentos, los ob-jetivos tienen una serie de caracteŕısticas para mejo-rar la imagen. Aśı, pueden ser acromáticos, de fluo-rita o apocromáticos, los cuales corrigen alteracionescromáticas, de campo plano que eliminan la curvatura

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del campo de observación, de contraste de interferen-cia, etcétera.

Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x)es necesario emplear un ĺıquido denominado aceite deinmersión , que se añade entre el objetivo y la mues-tra. Esto es debido a que la refracción de la luz esalta en el aire y provoca alteraciones en la imagenque se manifiestan cuando se usan objetivos con estacapacidad de aumento. El aceite de inmersión reduceenormente esta refracción permitiendo imágenes mu-cho más ńıtidas.

Figura 3. Imágenes resultantes del uso de objetivos condiferentes aumentos (especificados en las imágenes) al ob-servar un epitelio estratificado plano queratinizado.

Platina. Es la plataforma donde se coloca el por-taobjetos con nuestro tejido. Posee un dispositivopara sujetar el portaobjetos, el cual se puede de-splazar en el plano de la platina, movimiento con-trolado manualmente.

Condensador. Es un dispositivo con una lente queconcentra y focaliza la luz proveniente de la fuentesobre la sección de tejido.

Diafragma. Se sitúa entre la fuente luminosa y elcondensador. Permite aumentar el contraste de lamuestra y la profundidad de campo, es decir, el espe-sor de la muestra que está enfocado.

Lámpara luminosa. Es la que proporciona la luzque atraviesa la sección de tejido. Inicialmente se us-aba la luz natural, la cual se pod́ıa concentrar en lasección de tejido mediante espejos cóncavos. Actual-mente se usa una lámpara cuyo haz de luz atraviesael diafragma, el condensador, la muestra, y tras ellopenetra por el objetivo y atraviesa los oculares hastanuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa sepuede regular mediante un reostato.

Macrométrico y micrométrico. El enfoque de la

muestra se consigue variando la distancia de la mues-tra a la lente del objetivo. Esta distancia dependede los aumentos que produzca el objetivo, mayor dis-tancia cuanto menores aumentos, y del tipo de ob-jetivo. La distancia se controla mediante dos ruedasdenominadas macrométrico y micrométrico, respec-tivamente. La primera permite movimientos ascen-dentes y descendentes amplios de la platina y la se-gunda ajustes finos.

Figura 4. Recorrido de la luz desde la fuente, pasando através de los diferentes lentes de un microscopio básico,hasta el observador.

MODIFICACIONES

Contraste de fase. Esta modificación del microsco-pio de campo claro necesita de objetivos especiales yse basa en el ligero retraso que sufre la luz cuandopasa por las estructuras tisulares en función de sudensidad. De esta manera se consiguen diferentes lu-minosidades para distintas estructuras tisulares. Seemplea para ver muestras sin teñir o acuosas, aśı comocélulas vivas, por ejemplo en cultivos celulares.

Campo oscuro. La observación en campo oscuro esun buen sustituto del contraste de fase para observarespećımenes sin teñir o medios acuosos. Consiste enla incorporación de un objeto opaco bajo el conden-sador, entre la fuente luminosa y la sección de tejido.Este objeto sólo deja pasar la luz más lateral que in-cidirá sobre la muestra de forma oblicua y sólo aquellaluz que sea reflejada por la muestra llegará a los ob-jetivos. Alĺı donde no haya tejido aparecerá obscuroy distintas densidades o propiedades del tejido refle-jarán diferente cantidad de luz.

Contraste de interferencia y Nomarski. Este tipode microscoṕıa aparece sólo en los microscopios másavanzados y supone tener objetivos especiales. Estosmétodos dan a los tejidos un aspecto tridimensional,es decir, aumentan la profundidad de campo (espe-

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sor de tejido que está simultáneamente enfocado, esdecir, que se ve ńıtidamente). Se basa en el uso defiltros que polarizan la luz, lo cual consiste en dejarpasar sólo a la ondas electromagnéticas que vibran enun determinado plano. Posteriormente pasan por unprisma que reagrupa esta luz en elementos separadospor una distancia que es similar al poder de resolucióndel objetivo que se está usando. Existe un prismapara cada objetivo. Entonces la luz pasa por el mues-tra y las diferencias de densidad del tejido, como losbordes de las células o densidades del interior celular omatriz extracelular, provocarán alteraciones en la luzque se dirige hacia los objetivos, los cuales transfor-marán esas diferencias en cambios en la luminosidad.Todav́ıa existe una lente adicional entre el objetivoy los oculares que permiten modular la luminosidadaún más.

FLUORESCENCIA

El microscopio de fluorescencia se usa para obser-var sustancias fluorescentes denominadas fluoróforos.Una molécula fluorescente es aquella que es capaz decaptar radiación electromagnética con una longitudde onda determinada y emitir otra radiación electro-magnética con otra longitud de onda diferente, nor-malmente dentro del espectro de la luz visible. Losfluoróforos se utilizan como marcadores para la de-tección de otras moléculas tisulares, normalmente me-diante la técnica de inmunofluorescencia. Los usadosen microscoṕıa absorben en el rango de la luz ultra-violeta, normalmente producida por una lámpara demercurio, y emiten en el rango de la luz visible. Paraseleccionar el rango de longitud de onda con que serániluminados se utilizan filtros espećıficos localizadosentre la fuente y la muestra que sólo dejan pasar undeterminado rango de frecuencias. Con un tambor defiltros se consigue iluminar la muestra con diferentes

rangos de ondas electromagnéticas y por tanto activarselectivamente a diferentes fluoróforos.

La microscoṕıa de fluorescencia nos permite usarmás de un fluoróforo para detectar varias moléculastisulares de forma simultánea siempre que los espec-tros de absorción y emisión de estos fluoróforos no sesolapen, puesto que entonces seŕıa imposible discrim-inarlos.

Figura 5. Imágenes de fluorescencia. A la izquierda, in-munocitoqúımica para el neuropétido Y en cerebro de rata,utilizando el fluoróforo Texas-Red. A la derecha, motoneu-ronas en el encéfalo de lamprea marcadas con el trazadorneuronal fluorescéına que es en śı mismo un fluoróforo.Cada uno de los fluoróforos se ha estimulado con frecuen-cias diferentes y lo que se observa es la emisión en el es-pectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y verde,respectivamente.

Una aplicación más avanzada de la fluorescencia seda en los microscopios confocales, los cuales permiteneliminar la luz difusa procedente de fluoróforos queestán en el tejido fuera del plano de enfoque. Estaluz difusa, que aparece en los microscopios de fluo-rescencia convencionales, provoca una difuminación ypérdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el mi-croscopio confocal se consiguen imágenes mucho másńıtidas y mediante la digitalización y solapamiento deplanos de foco sucesivos se pueden conseguir imágenestridimensionales.

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5 Microscopio electrónico

Cuando se quieren observar estructuras celulares queestán por debajo del ĺımite de resolución del micro-scopio óptico, como algunos orgánulos, membranas,estructuras citosólicas, complejos moleculares de lamatriz extracelular o virus, se recurre al microsco-pio electrónico. Se inventó en la primera mitad delsiglo XX y su aplicación a la histoloǵıa desveló las es-tructuras celulares más pequeñas denominadas en suconjunto ultraestructura celular. Por tanto, observarultraestructuralmente a la célula significa observarlacon el microscopio electrónico. Este tipo de microsco-pio tiene un ĺımite de resolución más pequeño que 1nanómetro gracias a que no usa la radiación electro-magnética de la luz visible sino la alta frecuencia deun haz de electrones que incide sobre la muestra, ypermite aumentos de varios millones de veces.

El microscopio electrónico no usa lentes sino imanesque concentran los haces de electrones emitidos por unfilamento. Normalmente son aparatos grandes puestoque el viaje de los electrones tiene que ocurrir en vaćıo.Por eso, son grandes tubos dentro de los cuales se creay manipula el haz de electrones.

En histoloǵıa se usan dos tipos de microscopioselectrónicos: de transmisión y de barrido.

Microscopio electrónico de transmisión

En este tipo de microscopio electrónico se produceel haz de electrones en un filamento de tungstenoque funciona como cátodo. Los electrones se conden-san mediante electroimanes y se focalizan sobre unasección de tejido. Las secciones de tejido deben sermuy finas, se denominan ultrafinas (de unas decenasde nanómetros), para permitir que sean atravesadaspor los electrones y para conseguir imágenes ńıtidas.Previamente las secciones deben ser tratadas con met-ales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo. Lafunción de estos metales es similar a las tinciones us-adas en el microscopio óptico, dar color a las estruc-turas celulares, pero sólo en tonalidades de grises. Es-tos metales se concentran fundamentalmente en mem-branas y en los complejos macromoleculares. Los elec-trones que chocan con estos metales rebotarán y nocruzarán el tejido. Aquellos que consigan atravesar el

tejido chocarán contra una pantalla fluorescente queemitirá un destello luminoso tras cada choque. Esaimagen emitida por la pantalla fluorescente es la quepodemos observar nosotros. Por ello las imágenes ob-servadas con el microscopio electrónico son siempreen blanco y negro, aunque posteriormente se puedencolorear con un ordenador.

Figura 6. Comparativa de la composición básica de unmicroscopio óptico (izquierda), electrónico de transmisión(centro) y electrónico de barrido (derecha).

Figura 7. Imágenes tomadas en con microscopioelectrónico de transmisión. Se puede ver la capacidad deestos microscopios observando el incremento de resoluciónde las imágenes de izquierda a derecha. Las ĺıneas negrasde la imagen de la derecha corresponden a las membranascelulares

Microscopio electrónico de barrido

Los microscopios electrónicos de barrido sirven paraobservar superficies tisulares. Ello es posible porquelos electrones no atraviesan la muestra sino que inter-accionan con su superficie y rebotan. Para que estoocurra hay que cubrir a la muestra con una máscarade metales que se adapta perfectamente al relieve dela muestra. La muestra se barre con el haz de elec-trones y los electrones reflejados por un punto de lasuperficie son captados por una pantalla receptora quecreará una imagen en una pantalla digital. La ima-

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gen completa se formará cuando el haz recorra todala superficie de la muestra y se consiga información decada uno de los puntos. Es decir, se escanea la mues-tra, y de ah́ı el nombre de microscopio de barrido, oen inglés ”scannig”.

Por supuesto, las muestras que se observan no sonsecciones, sino porciones de órganos con superficies deinterés. Se pueden observar superficies de seccioneshechas con un vibratomo o con un microtomo de con-gelación, pero no aquellas que han sido incluidas enresina o parafina.

Figura 8. Imágenes obtenidas con un microscopioelectrónico de barrido. Muestran el interior del canal cen-tral de una médula espinal de lamprea. Se pueden observarnumerosos cilios (con más detalle en B) y pequeñas mi-crovellosidades en los dominios apicales de las células queforman las paredes de dicho canal. (Ver imagen de barridode estomas de una hoja).

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