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Técnicas de Estudio a Nivel Molecular
DNA RNA
- Southern Blot-PCR- FISH- Secuenciación
-Northern Blot-RT-PCR-Microarray
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Técnicas mas utilizadas para el estudio de
DNA
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Enzimas de restricción (endonucleasas)
De origen bacteriano. Reconocimiento y corte de secuencias especificas (palindromicas) de 4 a 6 pbSistema de protección bacteriana.
Enzyme Site Enzyme Site
AluI AG'CT NotI GC'GGCCGC
BamHI G'GATCC PstI CTGCA'G
BglII A'GATCT PvuII CAG'CTG
EcoRI G'AATTC SalI G'TCGAC
HaeIII GG'CC Sau3AI 'GATC
HhaI GCG'C SmaI CCC'GGG
HincII GTY'RAC SpeI A'CTAGT
HindIII A'AGCTT TaqI T'CGA
HinfI G'ANTC XbaI T'CTAGA
HpaII C'CGG XhoI C'TCGAG
KpnI GGTAC'C XmaI C'CCGGG
MboI 'GATC
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Formación de extremos cohesivos
Formación de extremos romos
BamHI 5´--G‘ GATCC--3´ 3´--CCTAG’ G--5´
---G´ 3´ 5´ GATCC--- ---CCTAG 5´ 3´ ’G---
HaeIII ---GG CC------CC GG---
HincII ---GTC GAC------CAG CTG---
---GG CC--- ---CC GG---
---GTC GAC------CAG CTG---
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USOS
•Tecnología de DNA recombinante
Inserción en plásmidos
Creación de moléculas híbridas
•Mapas de restricción (caracterización de un gen)
•Análisis de mutaciones
•Creación de bibliotecas genómicas
•Preparación de la muestra para técnicas posteriores (por ej. Southern Blot)
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Southern Blot
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Dos muestras A y B de simple cadenaSe blotearon sobre la membrana Se Incuba con la sonda marcada
Solo la sonda complementaria se“pega” a la secuencia correspondiente
Se revela por autoradiografía o por quimioluminiscencia.
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Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras corridasTras la digestión con EcoRI.
Placa radiográfica revelando las cepas positivas Para el gen de interés.
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Southern.exe
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Polymerase Chain Reaction
Desarrollada por Kary Mullis en 1983 en California y publicada por primera vez en Science en 1985.
Amplificación de fragmentos específicos de hasta 10.000 bp
Ensayo de corta duración, de alta especificidad y reproducibilidad
Pequeñas cantidades de DNA
Se necesita conocer la secuencia o al menos la sec. flanqueante
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
Ciclos deTemperatura
Preparaciónde la mezcla
Análisis de resultados
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PCR
Pcr.exe
Termocicladores modernos
Máquina de PCR primitiva
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Real Time PCRTécnica utilizada para monitorear el progreso de una reacción de PCR a medida que transcurre (tiempo real).
Pueden detectarse y cuantificarse cantidades mínimas de producto de PCR (DNA, cDNA or RNA).
Está basado en la detección de fluorescencia producida por una molécula reportera. Esto ocurre debido a la acumulación del producto de PCR en cada ciclo de amplificación.
Estas moléculas fluorescentes pueden ser colorantes que se unen a la doble hebra de DNA (ej. SYBR® Green ) o secuencias específicas (ej. Molecular Beacons or TaqMan® Probes).
No es necesario pos procesamiento de la muestra.
Real time PCR es fácil de llevar a cabo, con alta sensibilidad y mayor especificidad
También puede estudiarse expresión mediante el uso de RNA como molde
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Secuenciación de DNA
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Método de Sanger
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FISH
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Detección de translocaciones Estudios de cariotipo
Cromosomas marcados con sondas teloméricas
Y un colado!!!!!
Hibridación in situ para localización de expresión en tejidos. a) embrión de pez b) nucleolo
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Técnicas mas utilizadas para el estudio de
RNA
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RT-PCR
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Northern Blot
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Y LO MAS NUEVO!!!!....
LO QUE ESTÁ DE MODA.....
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Microarray
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