TEMA 49: TCNICAS ANALTICAS RELACIONADAS CON LAS PROTENAS 1. Introduccin Las protenas son polmeros de aminocidos. En las protenas podemos encontrar hasta veinte tipos diferentes de aminocidos. Las protenas se diferencian entre s segn el tipo, nmero y secuencia de aminocidos que forman el esqueleto del polipptido. Como resultado, tienen diferentes estructuras moleculares y propiedades fsico-qumicas. Las protenas son componentes importantes de alimentos para una serie de razones diferentes. Son una fuente importante de energa, as como de aminocidos esenciales (lisina, triptfano, metionina, leucina, isoleucina y valina). Muchas protenas son enzimas que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones bioqumicas. A continuacin veremos las principales tcnicas analticas empleadas en el estudio de la concentracin total, el tipo, la estructura molecular y propiedades funcionales de las protenas. 2. Determinacin de la concentracin de protena total 2.1. El mtodo Kjeldahl Por lo general se considera que es el mtodo estndar para determinar la concentracin de protena. Debido a que el mtodo de Kjeldahl no mide el contenido de protenas directamente un factor de conversin (F) es necesaria para convertir la concentracin de nitrgeno medidos a una concentracin de protenas. Un factor de conversin de 6,25 (equivalente a 0,16 g de nitrgeno por gramo de protena) se utiliza para muchas aplicaciones, sin embargo, esto slo es un valor medio, y cada protena tiene un factor de conversin diferentes, dependiendo de su composicin de aminocidos. El mtodo de Kjeldahl convenientemente se puede dividir en tres etapas: la digestin, la neutralizacin y titulacin. 6.2.1.1. Principios La digestin La muestra de alimento a analizar se pesa en un matraz de digestin y digerido por calentamiento en presencia de cido sulfrico (un agente oxidante que digiere los alimentos), sulfato de sodio anhidro (para acelerar la reaccin al aumentar la temperatura de ebullicin) y un catalizador, como el cobre, selenio, titanio, o el mercurio (para acelerar la reaccin). La digestin convierte cualquier nitrgeno en los alimentos (excepto los que se encuentra en forma de nitratos o nitritos) en amoniaco, y otras materias orgnicas de C0 2 y H 2 0. El gas de amonaco no es liberado en una solucin cida debido a que el amoniaco es en forma de ion amonio (NH 4 +) que se une a los iones de sulfato (SO 4 2 -) y por lo tanto permanece en solucin: N (alimentos) (NH 4) 2 SO 4 (1) Neutralizacin

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Despus de la digestin se ha completado el matraz de digestin est conectado a un matraz receptor por un tubo. La solucin en el matraz de digestin se hace entonces alcalinos mediante la adicin de hidrxido de sodio, que convierte el sulfato de amonio en gas amonaco: (NH 4) 2 SO 4 + 2 NaOH 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2) El gas amoniaco que se forma se libera de la solucin y se mueve fuera del matraz de digestin y en el matraz de recepcin - que contiene un exceso de cido brico. El bajo pH de la solucin en el matraz receptor convierte el gas amonaco en el ion amonio, y al mismo tiempo convierte el cido brico para el ion borato: NH 3 + H 3 BO 3 (cido brico) NH 4 + + H 2 BO 3 - (ion borato) (3) Valoracin El contenido en nitrgeno entonces se calcula mediante una valoracin de amonio borato forma con el cido sulfrico o clorhdrico estndar, utilizando un indicador adecuado para determinar el punto final de la reaccin. H 2 BO 3 - + H + H 3 BO 3 (4) La concentracin de iones hidrgeno (en moles) requerido para alcanzar el punto final es equivalente a la concentracin de nitrgeno que estaba en el alimento original (ecuacin 3). La siguiente ecuacin se puede utilizar para determinar la concentracin de nitrgeno de una muestra que pesa gramos m con una x M solucin de cido HCl para la valoracin: (5) Donde s V y V b son los volmenes de valoracin de la muestra y en blanco y 14 gramos es el peso molecular de nitrgeno N. Una muestra en blanco por lo general corri en el mismo tiempo que el material que est siendo analizada para tener en cuenta el nitrgeno residual que puede estar en los reactivos utilizados para llevar a cabo el anlisis. Una vez que el contenido de nitrgeno se ha determinado que se convierte en un contenido de protenas utilizando el factor de conversin: Protena = F% N. 6.2.1.4. Ventajas y desventajas Ventajas. El mtodo de Kjeldahl es ampliamente utilizado a nivel internacional y sigue siendo el mtodo estndar para la comparacin con otros mtodos. Su universalidad, alta precisin y buena reproducibilidad han convertido en el principal mtodo para la estimacin de la protena en los alimentos. Desventajas. No da una medida de la protena verdadera, ya que todo el nitrgeno en los alimentos no es en forma de protenas. protenas diferentes necesitan diferentes factores de correccin debido a que tienen diferentes secuencias de aminocidos. El uso de cido sulfrico concentrado a las altas temperaturas supone un riesgo considerable, al igual que el uso de algunos de los posibles catalizadores La tcnica es mucho tiempo para llevar. 6.2.2. Mayor Dumas mtodo Recientemente, una tcnica instrumental automatizado se ha desarrollado que es capaz de medir rpidamente la concentracin de protenas de muestras de alimentos. Esta tcnica se basa en un mtodo descrito por primera vez por un cientfico llamado Dumas ms de un siglo y medio hace. Se est empezando a competir con el mtodo de

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Kjeldahl como el mtodo estndar de anlisis de las protenas de algunos alimentos debido a su rapidness. 6.2.2.1. Principios generales Una muestra de masa conocida se quema a una temperatura alta (900 C) en la cmara de la presencia de oxgeno. Esto conduce a la liberacin de CO 2, H 2 O y N 2. El CO 2 y H 2 O se eliminan al pasar los gases en columnas especiales que absorberlos. El contenido de nitrgeno se mide haciendo pasar los gases restantes a travs de una columna que tiene un detector de conductividad trmica en el extremo. La columna de ayuda a separar el nitrgeno de cualquier residuo de CO 2 y H 2 O que han permanecido en la corriente de gas. El instrumento se calibra mediante el anlisis de un material que es puro y tiene una concentracin de nitrgeno conocidos, tales como EDTA (= 9,59% N). As, la seal del detector de conductividad trmica se puede convertir en un contenido de nitrgeno. Al igual que con el mtodo de Kjeldahl es necesario para convertir la concentracin de nitrgeno en una muestra de ese contenido, utilizando los factores de conversin adecuados que dependen de la secuencia de aminocidos de la protena precisa. 6.2.2.2. Ventajas y desventajas Ventajas: Es mucho ms rpido que el mtodo de Kjeldahl (menos de 4 minutos por cada medicin, en comparacin con 1.2 horas para Kjeldahl). No necesita productos qumicos txicos o catalizadores. Muchas muestras se pueden medir de forma automtica. Es fcil de usar. Desventajas: Alto costo inicial. No da una medida de la protena verdadera, ya que todo el nitrgeno en los alimentos no es en forma de protenas. protenas diferentes necesitan diferentes factores de correccin debido a que tienen diferentes secuencias de aminocidos. El tamao de la muestra hace que sea difcil obtener una muestra representativa. 6.2.3. Los mtodos que utilizan espectroscopa UV-visible Un nmero de mtodos se han ideado para medir la concentracin de protena, que se basan en la espectroscopia UV-visible. Estos mtodos de utilizar la capacidad natural para absorber las protenas (o dispersin) la luz en la regin UV-visible del espectro electromagntico, o qumica o modificar fsicamente de las protenas para hacerlas absorber (o dispersin) la luz en esta regin. El principio bsico detrs de cada una de estas pruebas es similar. En primer lugar una curva de calibracin de absorbancia (o turbidez) en comparacin con la concentracin de protenas se prepara a partir de una serie de soluciones de protenas de concentracin conocida. La absorbancia (o turbidez) de la solucin que se analiza se mide en la misma longitud de onda, y su concentracin de protena determina a partir de la curva de calibracin. La principal diferencia entre las pruebas son los grupos qumicos que son responsables de la absorcin o dispersin de la radiacin, por ejemplo, los enlaces peptdicos, aromticos grupos secundarios, grupos de base y agregados de protenas. Algunos de los comnmente utilizados UV-visible la mayora de los mtodos para la determinacin del contenido en protenas de los alimentos se destacan a continuacin: 6.2.3.1. Principios Medicin directa a 280 nm

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Triptfano y tirosina absorben la luz ultravioleta fuertemente a 280 nm. El contenido de tirosina y triptfano de muchas protenas se mantiene bastante constante, por lo que la absorbancia de las soluciones de la protena en 280 nm puede ser utilizado para determinar su concentracin. Las ventajas de este mtodo son que el procedimiento es sencillo de realizar, que no es destructiva, y no reactivos especiales se requieren. La principal desventaja es que los cidos nucleicos tambin absorben fuertemente a 280 nm, por lo que podra interferir con la medicin de la protena si estn presentes en concentraciones suficientes. A pesar de ello, se han desarrollado mtodos para superar este problema, por ejemplo, midiendo la absorbancia a dos longitudes de onda diferentes. Mtodo de Biuret A-violceo color violeta se produce cuando los iones de cobre (Cu 2 +) interactan con los enlaces peptdicos en condiciones alcalinas. El reactivo de biuret, que contiene todos los productos qumicos necesarios para llevar a cabo el anlisis, se pueden adquirir comercialmente. Se mezcla con una solucin de protenas y luego se deja reposar durante 15-30 minutos antes de que se lee la absorbancia a 540 nm. La principal ventaja de esta tcnica es que no hay interferencia con materiales que absorben a menores longitudes de onda, y la tcnica es menos sensible al tipo de protena, ya que utiliza la absorcin de participacin de los enlaces peptdicos que son comunes a todas las protenas, en lugar de los grupos secundarios especficos. Sin embargo, tiene una sensibilidad relativamente baja en comparacin con otros mtodos visible-UV. Mtodo de Lowry El mtodo de Lowry combina el reactivo de biuret con otro reactivo (el Ciocalteau fenol reactivo Folin-), que reacciona con los residuos de tirosina y triptfano en las protenas. Esto le da un color azulado que puede ser ledo en alguna parte entre 500 750 nm en funcin de la sensibilidad necesaria. Hay un pequeo pico alrededor de 500 nm que se pueden utilizar para determinar las altas concentraciones de protenas y un gran pico alrededor de 750 nm que se pueden utilizar para determinar las protenas bajas concentraciones. Este mtodo es ms sensible a bajas concentraciones de protenas que el mtodo de biuret. Mtodos de tincin Un exceso conocido de una carga negativa (aninicos) colorante se agrega a una solucin de protena cuyo pH se ajusta de modo que las protenas tienen carga positiva (es decir,