TECNICA HISTOLÒGICA

DANY LEANDRO PIEDRAHITA G.RESIDENTE DE GINECOLOGÍA U CALDAS

TECNICA HISTOLÒGICA

Conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos.

Pasos de la técnica histológica

Técnicas histológicas • Hay dos técnicas principales para proceder a la

preparación y tinción de los cortes histológicos de los tejidos.

Técnica de la Parafina

• Obtención de la muestra – tinción

Biopsia por congelación

• Solidificar el fragmento mediante congelación

Técnicas Histológicas: Fijación Es el tratamiento del tejido con sustancias químicas que tiene los siguiente objetivos:

Preservar

• Tejido de la putrefacción y autolisis.

Conserva

• Citoarquitectura y ultraestructura

Dureza

• Aumenta la dureza—preparaciòn de finas peliculas de muestra.

Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles.

Fijadores: Como actuan?

Condiciones de un buen fijador

Impedir aparición de procesos autolíticos

Poder de penetración

Poder de difusión

Fácil manipulación

NO disolver componentes tisulares

Fijadores: ClasificaciónOxidante

s

Bicromato de potasio

Bicloruro de mercurio

Acido ósmico

Acido acético

Reductores

formaldehído

Glutaraldehído

Alcohol metílico

Fijadores: Clasificación

GaseososFormaldehido

Líquidos Acido acètico, etílico

Sólidos Bicloruro de mercurio

Simples Compuestos

Fijadores: Clasificación

• Formol: coagulación de proteínas

• un buen poder de penetración y difusión

Simples

• Formol - fosfato (formol tamponado)

• Formol - bicloruro de mercurio: tejido hematopoyètico

Compuestos

Fijadores compuestos

Tejidos hematopoyético y Linfaticoreticularfibras colágenas y células conjuntivasInmunohistoquimica

fijación de embriones y fetos pequeños ejerce poder descalcificante

Criterios para obtener una buena fijación

Elección del fijador• fijador universal”

Tamaño de las muestras• Pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2 cm2

Volumen del fijador• 1 a 20 (muestra – fijador)

Tiempo de fijación• Intervalo entre la interrupción del aporte sanguíneo y

la inmersión de las muestras en la solución fijadora.• Respetarse los tiempos recomendados para cada tipo

de fijador.Temperatura • fijación a bajas temperaturas ( 4 C.)

Inclusión • Los tejidos se infiltran con sustancias denominadas “de

inclusión” y dureza que produzcan secciones, cortes o láminas sumamente delgados y transparentes

Sustancias de inclusión tienen la propiedad de incorporarse e infiltrarse al interior de las células y tejidos con la finalidad de servirles de soporte.

Solubles en agua

Gelatina

Carbowax

Glicol metacrilato

Solventes orgánicos

Parafina

Celoidina

Resinas epòxicas

Inclusión en Parafina•Parafina: Medio de inclusión insoluble en

agua y alcohol.

Deshidratación

1Aclaraciòn

2Formación del bloque

3

Deshidratación •Extraer el agua de los tejidos fijados.•Debe ser completa , el solvente no actúa

de forma adecuada y el bloque de inclusión no alcanza la dureza requerida.

Alcohol etílico

A. Isopropili

coDioxano Cloroform

o

Deshidratación

Diafanización o AclaramientoLa parafina tampoco es soluble en alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por sustancias que sean capaces, simultáneamente, de mezclarse con el alcohol y disolver la parafina.

La diafanización de los tejidos deshidratados se debe a que estas sustancias poseen un alto índice de refracción y al interactuar con los tejidos los vuelven transparentes.

Inclusión y formación del bloque de parafina•Se clasifican en:

• punto de fusión de 45o C 52o C• inmunohistoquímicaBlandas

• Parafina que se emplea con mayor frecuencia

Semiduras

• de fusión de 60o C - 65o C.Duras

La penetración de la parafina al interior de los tejidos se efectúa cuando ésta se encuentre en estado líquido

Inclusión y formación del bloque de parafina

La inclusión o formación del bloque de parafina se efectúa empleando moldes de diversos materiales y diferentes áreas y profundidades.

MICROTOMIA (OBTENCIÓN DE LOS CORTES)

•Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos mecánicos diseñados para que en forma mas o menos automática, seccionen el bloque de parafina en cortes delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se denominan: Micrótomos.

Micrótomo

Se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el bloque que contiene el tejido incluido.

• Uso más frecuente

• de 4 a 7 mm de espesor.

Rotación tipo Minot

• Cortes horizontales

• Porciones voluminosas de tejidos

De deslizamiento

Extensión y adhesión de los cortes al portaobjetos.•Los cortes se extienden al depositarlos

sobre la superficie del líquido extendedor contenido en un recipiente denominado “baño de flotación” (éste mantiene la temperatura entre 40o a 45o C).

COLORACION O TINCION.

•El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante.

ColoranteHidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas.

• Anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales

Esqueleto incoloro

• Aporta el color

Cromóforo

• Posibilita la unión a elementos del tejido

Auxocromo

Cromógeno

Clasificación: naturaleza química del radical auxocromo.

Básicos

• Son sales en las que la base aporta el color

• S. ácidas del tejido como el ADN o componentes de la matriz extracelular

Ácidos

• Union a sustancias básicas.

• Estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y el colágeno

Indiferentes

• No se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos

Neutros

• Porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color

Técnica Hematoxilina-eosina

Técnica de Hematoxilina-eosinaConsidera como la técnica de tinción de uso más frecuente en el estudio de células y tejidos, a través del microscopio fotónico.

• los núcleos mediante una hematoxilina,

• Colorean de azul, azul morado, violeta, pardo oscuro o negro, dependiendo de

Nùcleos

• Eosina que les confiere diversos grados de color rosado

Citoplasma y

material extracelul

ar

Tinciòn PAS

Tinción negro de Sudan

BIOPSIA POR CONGELACIÓN o INTRAOPERATORIA

Identificación del tipo de tejido

Naturaleza benigna o maligna del tejido

Valoración del estado de los márgenes de resección

Compromiso de los ganglios

Decisión del cirujano

• 1895 a Thomas Cullen, del Johns Hopkins Hospital, al describir la primera técnica de uso de biopsias por congelación durante un procedimiento quirúrgico en.

• William Welch, del Johns Hopkins School of Medicine, fue el primer patólogo americano en utilizar la técnica de biopsia por congelación durante una cirugía.

BIOPSIA POR CONGELACIÓN o INTRAOPERATORIA•Duración del procedimiento desde el

momento en que llega la muestra al servicio de patología hasta que se encuentra lista para la lectura en el microscopio es de 15 minutos en promedio

BIOPSIA POR CONGELACIÓN o INTRAOPERATORIA

Ingreso de la muestra en fresco

Realiza los cortes

Improntas en fresco sobre láminas portaobjetos.

corte deseado por el patólogo sobre resina de congelación.

Criostato, donde se congela a -30º C durante 3

se realiza el corte con espesores de 5 a 6 micras.

Tinción.