Technologisches Arsenal der Molekularbiologie

Atomebene

Molekülebene

Zellebene

Gewebeebene

Organebene

Organsystemebene

Individuumebene Ökosystem

Die zwei Sinne der Molekularbiologie

2. Ein technologisches System

1. Untersuchung der Lebensvorgänge zwischen den Ebenen der DNA und der Zelle

1. Untersuchung oder Umwandlung eines Moleküls oder weniger Molekülen

2. Gleichzeitige Untersuchung von vielen Molekülen (Genomik)

3. Komplexe Techniken

(werden in anderen Vorträgen besprochen)

INHALT:

INHALT (1. Untersuchung oder Umwandlung eines Moleküls oder weniger Molekülen):

1. Molekulare Klonierung 2. Polymerase Kettenreaktion (PCR) 3. Gelelektrophorese 4. Detektion von Makromolekülen 5. Gelretardation 6. Footprint-Analyse 7. Immunhistochemie 8. In-situ-Hybridisierung 9. FRET 10. Durchflusszytometrie 11. Facs

1. Molekulare Klonierung

a. Restriktionsendonukleasen b. DNA-Ligasen c. Plasmidvektoren d. Klonierung durch Restriktion/Ligation e. Weitere Enzyme

Restriktionsendonukleasen 1

Restriktionsendonukleasen 1

5’ überhängendes

Ende (z. B. EcoRI)

VOR DEM SCHNITT NACH DEM SCHNITT

3’ überhängendes

Ende (z. B. KpnI)

gerades Ende (z. B.

SmaI)

RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEM

EcoRI Methylase EcoRI schneidet nicht

DNA-Ligase

Ein DNA-Molekül Zwei DNA-Moleküle

DNA-Ligase

DNA-Ligase

2

3

Plasmide 1. Kleine Plasmide mit grosser

Kopienzahl

2. Grosse Plasmide mit kleiner

Kopienzahl

1. Fertilitätsfaktoren

2. Resistenzfaktorenk

3. Virulenzfaktoren

Plasmidvektoren

multiple Klonierungsstelle

3

Plasmidvektoren

Plasmidvektor

Rekombinantes Plasmid

3

Molekulare Klonierung 4

Originale DNA-Moleküle:

EcoRI Stelle EcoRI Stelle

EcoRI Enzym

Rekombinantes DNA-Molekül:

Ligase

Molekulare Klonierung Plasmidvektor DNA-Fragment Rekombinantes Plasmid

Herstellung von einem rekombinanten Plasmid

durch Ligation

Transformation (in Bakterienzellen)

Multiplizierung in der Zelle

Multiplizierung der Bakterienzellen

Eine Kolonie stammt aus einer einzigen Zelle

4

DNA DNA lacZ lacI O lacY lacA C E P rep

Galactose

indoxyl

T

- X-Gal chromogenes Substrat

Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator

IPTG

X-Gal

LacZ Gen 4

DNA DNA lacZ lacI O lacY lacA C E P

trans- acetylase

permease

rep

-gal

T

pol

Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator

- X-Gal chromogenes Substrat LacZ Gen 4

Repressor CAP-Stelle pol-Bindestele Operator Strukturgene Terminator

DNA DNA

lacZ Gen in Klonierung

fremde DNA

lacZ -Fragment

lacZ lacZ

4

lacZ

Andere Enzyme in Klonierung

EcoRI Schnitt

Dephosphorylierung

- Klenow-Fragment

- S1 Nuklease

- Alkalische Phosphatasen

5

2. PCR: Polymerase Chain Reaction

Polymerase-Kettenreaktion

1. Zyklus 2. Zyklus

3. Zyklus

Denaturation Annealing Synthese

Forward Primer

Reverse Primer

1993

6

Kary Mullis

In vitro Methode zur

Vervielfältigung

(Amplifizierung)

von DNA

6

PCR Nötig für die PCR:

1. DNA-Template

2. DNA-Polymerase

3. Zwei Primer

4. dNTPs

5. Puffer

Menge der DNA wird in jedem Zyklus

verdoppelt (unter optimalen Umständen)

Primer neue DNA

alte DNA

Denaturation

(2 DNA Stränge

trennen sich)

Erhitzen auf

94-96 ºC

Annealing

(Primer bindet

einzelsträngige DNAs)

Abkühlen

auf 60-65 ºC

Synthese

(DNA-Polymerase

bildet neuen DNA-

Strang ab den Primer)

Erhitzen

auf 68-72 ºC

theoretisch: exponentieller Anstieg der gewünschten DNA praktisch: Plateau-Phase

3. Gelelektrophorese

a. Agarose Gelelektrophorese

b. Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(PAGE)

7

DNA-Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern Sie in einem elektrischen Feld von der Katode in die Richtung der Anode

Agarose Gelelektrophorese

Molekulargewichtmarker

7

Laufphasen

Auftragpuffer: Probe ist in einer Glycerollösung mit einem Farbstoff (z.B. Bromphenolblau)

7 Agarose Gelelektrophorese

Färbung mit Ethidium-Bromide

DNA-Banden fluoreszieren

horizontal

Anwendung: Trennung von Nukleinsäuren mit einem gröβeren Molekulargewicht.

Transilluminator

Polyacrylamid Gelelektrophorese 7

Molekulargewichtmarker

40 Nucleotid

10 Nucleotid Gel

(polymerisiertes Acrylamid)

Anwendung: Trennung von Nukleinsäuren mit einem kleinen Molekular-gewicht, Trennung von Proteinen

vertikal

7 SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat – Polyacrylamid-Gelelektrophorese

2 Untereinheiten des Proteins

gekoppelt durch Disulphidbrücke Protein aus einer Untereinheit

Negativ geladene

SDS-Moleküle

SDS: denaturiert die Proteine und maskiert ihre eigenen Ladungen.

4. Detektierung von Makromolekülen

a. Southern Blot

b. Northern Blot

c. Western Blot

d. Eastern Blot

Southern Blot 8

DNA

Restriktionsverdauung

Ge

lele

ktr

op

ho

rese

Filterpapier

Nitrocellulose

Gel

alkalische Lösung

Nitrocellulose-membran

Autoradiogram

Hybridisierung mit radioaktiv

markierter Probe

DNA-Transfer mit Hilfe von Kapillarkraft vom Gel auf die Nitrocellulose-Membran

Anwendung: für die Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz in einem komplexen DNA-Gemisch.

Southern Blot 8

(A) DNA-Transfer vom Gel auf die Membran

DNA-Marker

verdaute DNA

Agarosegel Puffer

Papierhandtuch

Nylonmembran

Gel

Nylonmembran

(B) Hybridisierungsanalyse

Nylonmembran

markierte DNA-Probe

Röntgenfilm

hybridisierte Banden

9

Zellen, Geweben

RNA-Extrakt

RNA

Agarose Gelelektrophorese

RNA-Marker RNA-Probe

(Heterogenität der Moleküle)

Blotten

Filterpapier Nitrocellulose

Gel

Hybridisierung und Autoradiographie

Northern Blot

Anwendung: z.B. für die Detektion der Expression eines Gens unter unterschiedlichen Umständen.

9 Northern Blot

Zellen

RNA-Extrakt

Gelelektrophorese

RNA-Probe

Blotten, Northern-Hybridisierung, Autoradiographie

Hybridisierung der DNA-Probe mit dem komplementären RNA-Molekül

Elektroblot

10 Western Blot (A) Elektrophorese/Transfer

Elektrischer Strom

Inkubation mit Antikörper-1: Ab1 ( )

(B) Antikörperreaktion

Inkubation mit Enzym-gekoppeltem

Antikörper: Ab2

Zugeben des Substrats

(C) Farbreaktion

SDS-PAGE Membran

Anwendung: für die Detektion von spezifischen Proteinen in einer Probe.

5. Gelretardierungsanalyse Anwendung: für die Detektion von DNA-Protein Wechselwirkungen

Bestimmung, ob irgendeines Protein (z.B. Transkriptionsfaktor) zu einem

gegebenen DNA-Abschnitt bindet.

11

Restriktionsfragmente Restriktionsfragmente + Kernproteine

DNA-Marker

Retardierte Bande

Prinzip: die mit Protein gebundene DNA wandert im Gel langsamer

12 6. Footprint-analyse Anwendung: für die Detektion von DNA-Protein Wechselwirkungen

am Ende markierte Restriktionsfragmente

- Zellkernextrakt

am Ende markierte Restriktionsfragmente

+ Zellkernextrakt

DNA-bindendes Protein

partielle DNA-Verdauung

Gelelektrophorese, Autoradiographie

Footprint

Footprint

13 7. Immunhistochemie - Immunfluoreszenz

fluoreszierende Farbe

anti-C Antikörper

Zellkern Zellkern

Cytoplasma Cytoplasma

Zelloberflächenantigene

Cytoplasmatische Antigene Cytoplasmatische Antigene

Zelloberflächenantigene

Direkte Methode Indirekte Methode

Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege anti-C Primärantikörper

aus Hase

Anwendung: Bestimmung, in welchen Geweben das untersuchte Protein vorhanden ist, in welchem Kompartiment der Zelle es lokalisiert ist.

7. Immunhistochemie - Immunperoxidase-Methoden

13

Peroxidase

anti-Hase Antikörper (Sekundärantikörper)

anti-C Antikörper Peroxidase

Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege

anti-C Primärantikörper aus Hase

Zellkern

Cytoplasma

Zelloberflächenantigene

Cytoplasmatische Antigene

Indirekte Methode anti-C Antikörper

Peroxidase

Peroxidase Peroxidase

Biotin

anti-Hase Antikörper (Sekundärantikörper) Avidin

- Peroxidase – Diamino-Benzidin (in der Anwesenheit von Peroxid): brauner Ausschlag

- Biotin – Avidin – Peroxidase

13 7. Immunhistochemie - Immunperoxidase-Methoden

ABC-Methode (ABC= Avidin-Biotin Komplex)

Avidin

Biotin Peroxidase anti-Hase Anti-körper (Sekundär-antikörper)

Primärantikörper

Antigen

Rolle: Signalverstärkung

1 Proteinmolekül wird hier mit vielen Enzymen markiert, die eine viel intensivere Farbreaktion ermöglichen.

7. Immunhistochemie - alkalische Phosphatase

- Digoxigenin – anti-Digoxigenin – alkalische Phosphatase

- Substrat X-Phosphat wird gespaltet, was

zu einer Farbreaktion führt (Indoxyl)

alk. Phosphatase

alk. Phosphatase

alk. Phosphatase

alkalische Phosphatase

Zellkern

Cytoplasma

Zelloberflächenantigene

Cytoplasmatische Antigene

anti-Hase Antikörper

anti-C Antikörper

Anti-Hase Sekundär-antikörper aus Ziege

anti-C Primärantikörper aus Hase

anti-Hase Antikörper

anti-C Antikörper anti-C Antikörper

13

8. In-situ-Hybridisierung – Detektierung von DNA oder mRNA Markierung der Probe:

1. radioaktiv (S35)

2. nicht-radioaktiv

- fluoreszent

- enzymatisch

14

radioaktiv

Peroxidase

enzymatisch

anti-DIG Antikörper

DIG anti-DIG Peroxidase

ZielDNA

Probe

anti-DIG Antikörper

Fluoreszenz

fluoreszenter Farbstoff

DIG

fluoreszenter Farbstoff

Streptavidin

Biotin

Probe (DNA oder RNA)

ZielDNA

fluoreszent (FISH) Avidin

Biotin

9. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 14

Objektglas

sich teilende Zelle

Metaphasechromosom

DNA wird denaturiert

Fluoreszente Markierung

9. FRET 15 Fluorescence resonance energy transfer

Zyan fluoreszierendes Protein (CFP) Gelb fluoreszierendes Protein (GFP)

keine Proteinwechselwirkung Proteinwechselwirkung

UV Licht Blaues Licht

UV Licht Gelbes Licht

Protein X Protein Y

Anregung mit UV-Licht

Emission: blaues Licht

Anregung mit blauem Licht

Emission: gelbes Licht

FRET: Die Energie eines angeregten Fluoreszenz-farbstoffs wird auf einen zweiten Fluoreszenz-farbstoff strahlungsfrei übertragen.

Anwendung: Aufklärung von Signaltransduk-tionswegen

10. Durchflusszytometrie 16

PMT4

PMT3 PM: Photomultiplier (Verstärkung der eingehenden Signale)

PMT2

PMT1 Filter

zweifarbige Filter

Laser

Zellen werden einzeln durch eine Kapillare gesaugt, streuen einen Teil des Lichts

Probe

Scatter Detektoren

Sortierung

Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen monochromatischen Laserstrahl passiert.

Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Gröβe und Komplexität.

Fluoreszente Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden, oder fluoreszent markierte Antikörper können auch verwendet werden.

Anwendung: z.B. Diagnose von Läukemie, Trennung von Spermien mit X oder Y Chromosom

11. FACS 17 Fluorescence activated cell sorting

Probe

Laser

Detektionsscheiben

Rote Fluoreszenz

Grüne Fluoreszenz

Sammelröhrchen

Füllkragen

Hüllenflüssigkeit

90 Lichtwerfer (Granularität)

„Vorne” Lichtwerfer (Gröe)

Geeignet für die Auftrennung von biologisch heterogenen Zellpopulationen.