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TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
II. Medizinische Klinik und Poliklinik Klinikum rechts der Isar
(Direktor: Univ.-Prof. Dr. R. M. Schmid)
Unter suchungen zur zel ltypspezif ischen Funktion der IκB-Kinasen in ver schiedenen murinen Modellen für
chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Tim Nebelsiek
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Medizin (Dr. med.)
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. D. Neumeier
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. F. R. Greten
2. Univ.-Prof. Dr. M. Ebert
3. Univ.-Prof. Dr. B. Holzmann
Die Dissertation wurde am 06.10.2009 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät am 27.1.2010 angenommen.
2
Inhal tsverzeichnis
1 EINLEITUNG 6
1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen - Meilensteine 6
1.2 NF-κB - ein Schlüsselmolekül bei der Regulation von Immun- und Entzündungsreaktionen 10
1.3 Wege der NF-κB-Aktivierung 12
1.4 Mausm odelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen 15
1.5 Inhibition der klassischen NF-κB-Aktivierung - eine neue Stra tegie bei der Behandlung von immunologischen und rheumatologischen Krankheitsbilder? 18
2 ZIELSETZUNG 20
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 Mausm odelle 21 3.1.2 Chemische Induktion einer akuten Kolitis 21
3.1.3 Zellkultur 22 3.1.4 Pharmakologische IKKβ Inhibition 22
3.2 Genotypisierung 22 3.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 22 3.2.3 Oligonukleotidsequenzen 23
3.3 Histologie 24 3.3.1 Hämatoxylin/Eosin-Färbung 24 3.3.2 Histologische Scores zur Auswertung des Gewebeschadens 25
3.5 Protein und DNA Analyse 26 3.5.1 Isolierung von Gesamtgewebe 26 3.5.2 Isolierung von intestinalen Epithelzellen 26
3.6 RNA-Isolierung und Analyse 27 3.6.1 Realtime Reverse Transkriptase (RT)-PCR 27 3.6.2 cDNA- Synthese 28 3.6.3 Real-Time RT-PCR 28 3.6.4 Delta CT Methode 29 3.6.5 Oligonukleotidsequenzen 30 3.6.7 Microarray Analyse 34
3
3.7 Proteinbiochemie 34 3.7.1 Gewinnung von Proteinextrakten aus Epithel bzw. SW480 Zellen 34 3.7.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 35 3.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblot 35 3.7.4 Immunoblotanalyse 37 3.7.6 Verwendete Antikörper 38 3.7.7 Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) 39 3.7.8 Radioaktive Markierung der Oligonukleotidsonden 39 3.7.9 EMSA Oligo Sequenzen 39
4 ERGEBNISSE 41
4.1 IKKβ förder t die epitheliale Regenera tion im Rahmen von akut-ul zerierenden Entzündungsprozess en im Gastrointestinaltrakt der Maus 41
4.2 Pharmak ologische IK Kβ-Inhibition in der Initiation der Heilungsphase resultiert in einer verminder ten epithelialen Express ion von NF-κB und STAT3 Zielgenen 49
4.3 Inhibition der IK Kβ-abhängigen NF-κB-Aktivierung verhindert e ine suf fi ziente Rekrutierung von inflammatorischen Zellen und vermindert die Express ion der zytoprotektiven Interleukine 11 und 22 54
4.4 Epithelspezi fische Deletion von Ikkβ nach Initiation der Heilungsphase hat keinen Ein fluss auf den Heilungsproze ss 60
4.5 Inhibition der IK Kβ-abhängigen NF-κB-Aktivierung in intestinalen Epithelzellen hat keinen Einfluss auf den Verlauf e iner T-Zell-asso ziierten chronischen Kol itis 63
4.6 Verlust von IK Kβ in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten mildert den Ve rlauf und verlängert das Überleben in T-Zell-assoziierten Entzündungsprozess en 66
5 DISKUSSION 69
6 ZUSAMMENFASSUNG 80
7 LITERATURVERZEICHNIS 81
4
Abkürzungsverzeichnis
CD Cluster of Differentiation
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CED Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen
DNA Desoxyribonukleinsäure
DSS Dextran Sodium Sulfat
EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
g Gramm
GI-Trakt Gastrointestinaltrakt
HSP70 Heat Shock Protein 70
IEC Intestinale Epithelzellen
IKK IκB Kinase
IκB Inhibitor of kappa B
IL Interleukin
IFN Interferon
IRF Interferon regulierender Faktor
KO Knock Out
LPS Lipopolysaccharid
µg Mikrogramm
NEMO NF-κB Essential Modulator
NF-κB Nukleärer Tanskriptionsfaktor kappa B
PCR Polymerase Chain Reaction
PNK Polynukleotid Kinase
RT-Real-Time PCR Reverse Transkriptase Realtime Polymerase
Chain Reaction
RHD Rel homology domain
RNA Ribonukleinsäure
rpm Revolutions per minute
RT Raumtemperatur
SOCS3 Suppressor of cytokine signaling 3
5
STAT3 Signal Transducer and Activator of Transkription 3
TH-Zellen T-Helfer-Zellen
T-reg. Zellen regulatorische T-Zellen
TNBS Trinitrobenzolsulfonsäure
TNF Tumornekrosefaktor
WT Wildtyp
Einleitung
6
1 Einleitung
Entzündungs- und Immunreaktionen stellen eine elementare physiologische Reaktion
auf bakterielle und virale Infektionen dar. Gesteuert werden diese durch das
Immunsystem. Durch das Zusammenspiel verschiedener Zelltypen und
inflammatorischer Zytokine sind Lebewesen in der Lage die Integrität und damit die
Funktionen des Organismus aufrecht zu erhalten. Inadäquate Aktivierung des
Immunsystems stellt einen wichtigen Schritt in der Pathogenese verschiedenster
immunologischer und rheumatologischer Krankheitsbilder dar. Diese sind durch
chronisch-destruierende Entzündungsprozesse ohne den Nachweis einer konkreten
Infektion durch Viren oder Bakterien charakterisiert. Beispiele sind zahlreich und finden
sich in nahezu jedem Organsystem. Zu den wichtigsten gehören die Rheumatoide
Arthritis, Spondyloarthritiden, Vaskulitiden, Multiple Sklerose, Kollagenosen, Vitiligo
und chronisch entzündliche Darmerkrankungen.
1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen - Meilenst eine
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind gekennzeichnet durch schwere
persistierende Entzündungen im Bereich des Gastrointestinaltraktes in Abwesenheit von
derzeitig bekannten mikrobiellen Pathogenen. Unter dem Begriff werden die beiden
Krankheitsbilder Morbus Crohn und Colitis ulcerosa zusammengefasst. Die Inzidenz der
beiden Erkrankungen ist steigend und liegt bei jährlich etwa 4 Fällen pro 100000
Einwohner mit einem Häufigkeitsgipfel zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr. Frauen sind
häufiger betroffen als Männer.
Einleitung
7
Die Colitis ulcerosa ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der oberflächlichen
Kolonmukosa, die sich vom Rektum kontinuierlich auf proximale Dickdarmabschnitte
ausbreitet. Der Entzündungsprozess, der durch die von T-Lymphozyten und
Makrophagen freigesetzten Zytokine aufrechterhalten wird, ist dabei vorwiegend auf die
Mukosa begrenzt und breitet sich nur im akuten Schub der Erkrankung auf
submukosale Bereiche aus. Tiefere Wandschichten wie die Muskularis propria sind nicht
betroffen. Histologisch zeigt sich in aktiven Krankheitsverläufen eine deutliche
Hyperämie, mit massiver lymphozytäre Infiltration des Stromas und eine ungleichmäßige
Kryptenstruktur. Der Nachweis von Kryptenabszessen ist ebenfalls typisch für Colitis
ulcerosa und ist ein differentialdiagnostisches Kriterium zum Morbus Crohn.
Der Morbus Crohn kann sich hingegen im gesamten Verdauungstrakt vom Mund bis
zum After manifestieren. Die Entzündung beschränkt sich dabei auch nicht auf die
oberflächlichen Wandabschnitte, sondern breitet sich transmural auf alle
Wandschichten aus. Charakteristisch ist ein diskontinuierlich-segmentaler Befall mit
histologisch nachweisbaren Epitheloidzellgranulomen. Hauptmanifestationsort ist das
terminale Ileum. Während bei der Colitis ulcerosa das Zytokinmuster für eine durch
TH2 Zellen mediierte Erkrankung spricht, dominiert beim Morbus Crohn eine TH1
gewichte Entzündungsreaktion.
Beide Erkrankungen weisen einen schubweise rezidivierenden Verlauf auf, in dem sich
Perioden der Exazerbation mit Perioden kompletter klinischer Beschwerdefreiheit
abwechseln. Das klinische Bild ist von Patient zu Patient verschieden. Leitsymptome
sind kolikartige abdominelle Schmerzen mit zum Teil blutiger Diarrhö. Begleitet wird
die Symptomatik von Fieber, Gewichtsverlust und extraintestinalen Symptomen, wie
z.B. Hautveränderungen und Gelenkbeschwerden. Außerdem sind beide
Krankheitsbilder mit einem vermehrten Auftreten von anderen
Autoimmunerkrankungen, wie z.B. ankylosierende Spondylitis, Uveitis oder primär
sklerosierenden Cholangitis assoziiert. Zu den wichtigsten Komplikationen zählen bei
der Colitis ulcerosa das toxische Megakolon und Kolitis-assoziierte Karzinome. Beim
Morbus Crohn stehen Stenose, Strikturen, Fisteln und Abszesse im Vordergrund
(Baumgart and Sandborn, 2007).
Einleitung
8
Die exakte Ätiologie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist weiterhin
unbekannt. Sowohl der Morbus Crohn als auch die Colitis ulcerosa sind durch das
Vorhandensein verschiedenster genetischer Abnormalitäten charakterisiert. So weisen
50% der Morbus Crohn Patienten Mutationen im NOD2 Gen auf Chromosom 16 auf.
Heterozygote Patienten haben ein 2,5-fach erhöhtes Risiko an Morbus Crohn zu
erkranken, bei Homozygotie ist das Risiko bis 100-fach erhöht. Die Mutation ist mit
einer verminderten Expression von Defensinen in intestinalen Epithelzellen verbunden
und führt zu einer erhöhten Anfälligkeit der Schleimhaut gegenüber bakteriellen
Infektionen. Des Weiteren deutet vieles darauf hin, dass bei einem Teil der Morbus
Crohn Patienten die Barriere zwischen Darmlumen und Organismus defekt ist. Bei der
Analyse der epithelialen Zellkontakte zeigt sich, dass bei Patienten, die unter CED
leiden, eine erhöhte Permeabilität der Darmschleimhaut vorliegt, die sowohl auf eine
verminderte Anzahl als auch auf eine gestörte Funktion assoziierter Proteine
zurückgeführt werden konnte.
Neben genetischen Abnormalitäten und Umweltfaktoren stellt die pathologische
Aktivierung des Immunsystems einen zentralen Aspekt bei der Pathogenese von
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen dar. Unter physiologischen Bedingungen
kontrolliert das mukosale Immunsystem das Gleichgewicht zwischen pro- und
antiinflammatorischen Mediatoren, so dass eine effektive Abwehr gegen luminale
Pathogene gewährleistet ist, ohne dass es zu einer überschießenden Immunreaktion
gegenüber harmlosen Antigenen kommt. Sowohl bei Morbus Crohn als auch bei der
Colitis ulcerosa ist genau dieses Gleichgewicht gestört. Unbekannte Stimuli provozieren
hier eine aggressive T-Zell Immunantwort, die mit einer exzessiven Freisetzung von
proinflammatorischen Entzündungsmediatoren assoziiert ist und zur Ausbildung von
lokalen Erosionen, Nekrosen und Ulzerationen. Als potentielle Auslöser dieser
inadäquaten Immunantwort werden neben physiologischen und pathogenen
Darmbakterien auch rein autoimmunologische Phänomene diskutiert (Sartor, 2006;
Xavier and Podolsky, 2007).
Einleitung
9
Aufgrund des mangelhaften Verständnisses der pathophysiologischen Hintergründe der
Erkrankung, beschränken sich die heutigen Therapieansätze auf eine eher unspezifische
Suppression des Immunsystems. Zur Anwendung kommen Immunmodulatoren wie z.B.
Sulfasalazin, Glukokortikoide oder Azathioprin, hochpotente Immunsuppressiva wie
Cyclosporin A und spezifische Antikörper gegen TNF-α. Die Nebenwirkung der
immunsupprimierenden Therapie sind allerdings zahlreich und der therapeutische Erfolg
ist häufig nicht zufriedenstellend, so dass bei schweren Verlaufsformen, bei denen
Komplikationen, wie z.B. Abszesse, Strikturen oder Fisteln das klinische Bild
bestimmen, eine chirurgische Intervention mit Resektion der betroffenen
Darmabschnitte unumgänglich wird.
Ziel der heutigen Therapiestrategie ist es deshalb, die Erkrankung im Stadium der
Remission zu halten und Exazerbationen durch frühestmögliche medikamentöse
Intervention zu vermeiden bzw. schnell entgegenzuwirken (Stange and Travis, 2008;
Travis et al., 2006).
Zwar besitzen Patienten die unter CED leiden bei guter ärztlicher Betreuung im Vergleich
zur Normalbevölkerung keine signifikant erniedrigte Lebenserwartung, trotzdem handelt es
sich um zwei hochgradig chronische Krankheitsbilder mit teils sehr schweren Verläufen, die
mit einer deutlichen Einschränkung der Lebensqualität und zahlreichen therapiebedingten
Komplikationen einhergehen (Itzkowitz and Present, 2005). Fatale Verläufe ergeben sich
aus den assoziierten Komplikationen, wie z.B. Perforationen der Darmwand in akuten
Entzündungsschüben oder aus notwendigen chirurgischen Eingriffen (Berg et al., 2002).
Einleitung
10
1.2 NF-κB - ein Schlüsselmolekül bei der Regulat ion von Immun- und
Entzündungsreaktionen
Der nukleäre Transkriptionsfaktor κB (NF-κB) besitzt eine zentrale Funktion bei der
Regulation von Entzündungs- und Immunreaktionen. Dieses gilt auch für chronisch
entzündlichen Darmkrankheiten. Hier konnte gezeigt werden, dass die Aktivität NF-
κBs mit dem Schweregrad und Verlauf der Erkrankung korreliert (Atreya et al., 2008).
Unter der Kontrolle von NF-κB stehen eine Vielzahl von Genen, die für pro-
inflammatorische Zytokine, diverse Chemokine, Adhäsionsmoleküle und
angiogenetische Faktoren kodieren (Karin and Lin, 2002). Neben der Regulation von
Entzündungs- und Immunreaktionen kontrolliert NF-κB weitere entscheidende
Funktionen der Zelle wie z.B. Differenzierung, Proliferation und Apoptose (Sartor,
2006; Viemann et al., 2004). NF-κB setzt sich aus Mitgliedern der Rel-
Transkriptionsfaktor-Familie zusammen. Bisher wurden fünf verschiedene
Untereinheiten identifiziert, die als Homo- oder Heterodimere an das κB DNA Motif
binden können: RelA/p65, RelB, c-Rel, NF-κB1/p50 und NF-κB2/p52 (Ghosh et al.,
1998).
Abb.1 Die NF-κB Fami l ie Schematische Darstellung des Aufbaus der Untereinheiten: RHD=Rel Homology Domain; LZ= Leucine Zipper; DD= Death Domain; ANK= Ankyrin Repeat Motifs; TAD=Transcriptional Activation Domain; TA Rel A Tasnactivation Domain
Abgeändert nach N.D. Perkins, Mol. Cell Biology 2007
Einleitung
11
Während p65, RelB und c-Rel eine eigene Transaktivations-Domänen besitzen und
damit transkriptionell aktiv werden können, sind p50 und p52 Homodimere dazu nicht
in der Lage. Die zur Rel-Familie gehörenden Proteine sind durch eine Rel homology
domain (RHD) gekennzeichnet. Diese erlaubt die Bindung der verschiedenen
Untereinheiten an die DNA und ermöglicht zugleich die Interaktion mit spezifischen
Inhibitoren des Transkriptionsfaktors (IκBs). IκBs maskieren dabei durch so genannten
Ankyrin-Repeats die Kernlokalisationssequenz auf der RHD der NF-κB Untereinheiten.
Eine Translokation in den Kern wird daduch verhindert, so dass NF-κB transkriptionell
inaktiv im Komplex mit seinem Inhibitor im Zytoplasma verbleibt (Atreya et al., 2008;
Hayden and Ghosh, 2004; Huang et al., 2000; Johnson et al., 1999).
Abb.2 Die IκB Fa mi l ie Schematische Darstellung des Aufbaus der Untereinheiten: ANK=Ankyrin; PEST=domain rich in Proline, glutamate, serine, threonine
Abgeändert nach N.D. Perkins, Mol. Cell Biology 2007
Einleitung
12
1.3 Wege der NF-κB-Aktivierung
Bisher sind drei verschiedene Signalwege beschrieben, die zur Aktivierung von NF-κB
führen: Man unterscheidet zwischen dem klassischen, dem alternativen und dem
atypischen Signalweg.
Der klassische NF-κB Signalweg wird durch eine Vielzahl von proinflammatorischen
Stimuli induziert. Zytokine wie z.B. Interleukin 1 (IL-1), Tumornekrosefaktor-α (TNF-
α), virale Proteine und bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) initiieren über
membranständige Rezeptoren die Signalkaskade. Die NF-κB Aktivität wird durch den
IκB Kinase (IKK) Komplex reguliert, bei dem die rezeptorvermittelten Stimuli
zusammenlaufen (Hayden and Ghosh, 2004).
Abb.3 Die kl assische NF-κB- Aktivierung
Einleitung
13
Der IKK Komplex setzt sich aus den zwei katalytischen Untereinheiten, IKKα und
IKKβ, und dem NF-κB essential Modulator (NEMO), auch bekannt als IKKγ,
zusammen. Die katalytischen Einheiten treten dabei jeweils einzeln, die regulatorische
Untereinheit NEMO in einer variierenden Anzahl auf. IKKα und IKKβ sind
Serin/Threonin-Kinasen. Beim klassischen Signalweg kommt es zur IKKβ-vermittelten
Phosphorylierung von IκB Proteinen, was wiederum die konsekutive Poly-
Ubiquitinierung durch die E3-Ligase einleitet. Es folgt die rasche proteasomale
Degradation des Inhibitors, so dass freies NF-κB in seiner häufigsten Form als RelA/p50
Dimer in den Nukleus transloziert, dort an DNA bindet und Zielgene transkripiert
(Hayden and Ghosh, 2004).
Für eine suffiziente Aktivierung von NF-κB über den klassischen Signalweg sind IKKβ
und NEMO essentiell. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass die Inhibition
von IKKβ oder der Verlust von NEMO zur Ablation der klassischen NF-κB-Aktivierung
und damit auch der Transkription von NF-κB Zielgenen führt.
Abb.4 Die IκB Kinase Famil ie Schematische Darstellung des Aufbaus der IκB Kinase Familie: HLH=Helix-Loop-Helix; CC1/2=coiled-coil; LZ=Leucine Zipper; LF=Leucine Finger; NBD=NEMO-Binding-Domain
Abb.5 Z ie lgene klassischer N F-κB-Aktiv ie r u ng
Abgeändert nach N.D. Perkins, Mol. Cell Biology 2007
Einleitung
14
Einige Stimulatoren des klassischen Signalweges, wie der zur TNF-Rezeptorfamilie
gehörende CD40 Rezeptor, sind zusätzlich in der Lage NF-κB über einen alternativen
Signalweg zu aktivieren.
Im Gegensatz zur klassischen NF-κB Signalkaskade ist dieser von IKKβ und
IKKγ unabhängig. Stimulation von membranständigen Rezeptoren führt über die NF-
κB induzierende Kinase (NIK) zur Phosphorylierung und Aktivierung von IKKα
Homodimeren. Es folgt eine ubiquitinabhängige Prozessierung des Vorläuferproteins
p100 zum transkriptionell aktiven p52. Zusammen mit RelB kann p52 als Dimer mit
hoher Affinität an bestimmte κB DNA-Domänen binden und die Expression von NF-
κB-Zielgenen steuern (Senftleben et al., 2001).
Der dritte, so genannte atypische NF-κB Signalweg steht im Zusammenhang mit DNA-
Doppelstrangbrüchen. DNA-Schaden initiiert hier die Translokation von NEMO und
ATM aus dem Zellkern in das Zytoplasma. Hier kommt es zur Aktivierung des IKK-
Komplex und damit der klassischen NF-κB Signalkaskade. Durch die Induktion von
zytoprotektiven Faktoren wird so das Gleichgewicht zwischen apoptotischen und anti-
apoptotischen Signalen aufrechterhalten (Wu et al., 2006).
Einleitung
15
1.4 Mausmodel le für chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Momentan existieren rund 25 bis 30 verschiedene Maus- bzw. Rattenmodelle für
intestinale Entzündungsprozesse. Diese lassen sich vereinfacht in drei Hauptkategorien
gliedern. Man unterscheidet chemisch induzierbare von spontanen Kolitismodellen, die
auf spezifischen genetischen Defekten im Bereich verschiedenster Signalwege beruhen.
Außerdem existieren so genannte Transfermodelle, die durch eine künstlich erzeugte
Störung im Bereich der T-Zell-Homöostase zu gastrointestinalen Entzündungsprozessen
führen. Obwohl keines dieser Modelle für sich allein das klinische und
histopathologische Bild chronisch entzündlicher Darmerkrankungen in seiner
Komplexität ganzheitlich erfasst, eignen sich die unterschiedlichen Modelle jedoch sehr
gut um die einzelnen Teilaspekte der Pathogenese der Erkrankung genauer zu
charakterisieren (Elson et al., 2005).
Induzierbare Modelle basieren auf der Applikation von chemischen Noxen. Die
Induktion der Kolitis ist dabei von T-Zellen unabhängig. Die orale Gabe von Dextran
Sulfat Sodium (DSS) im Trinkwasser führt in der Maus innerhalb von wenigen Tagen zu
einer ulzerierenden Kolitis. DSS wirkt dabei direkt toxisch auf die intestinalen
Epithelzellen an der Basis der Krypte und zerstört so die mukosalen Barriere. Dadurch
kommen inflammatorische Zellen, wie z.B. Makrophagen, mit luminalen Antigenen in
Kontakt und leiten so die Entzündungsreaktion ein. Das histologische Bild wird von
Ulzerationen und massiver Infiltration von Makrophagen und lymphozytären Zellen
dominiert. Klinisch zeigen die Mäuse blutige Diarrhö und Gewichtsverlust. Der Verlauf
der Kolitis ist dabei durch deutlich erhöhte Level von proinflammatorischen Zytokinen
wie IL-2, IL-4 und IL-6 charakterisiert. Der Ausprägungsgrad –akut, chronisch oder
lethal- ist dabei stark vom genetischen Hintergrund der Maus abhängig (Mahler et al.,
1998; Okayasu et al., 1990; Ostanin et al., 2009; Wirtz et al., 2007). Das Modell
erweist sich als besonders nützlich zur Analyse von epithelialen Reparaturmechanismen
in der initialen Phase der Entstehung von CED und anderen akuten
Entzündungsprozessen im Gastrointestinaltrakt. Neben DSS kann auch durch Gabe von
Einleitung
16
Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) in Ethanol eine Kolitis im Darm der Maus
hervorgerufen werden. Eine durch TNBS in Ethanol induzierte Kolitis ist durch eine
transmurale granulomatöse Entzündung mit starker Diarrhö und Gewichtsverlust und
Verdickung der Darmwand gekennzeichnet. Das chronische Stadium ist mit einer
Infiltration von CD4 positiven T-Zellen in die Lamina propria assoziiert. Mit Hilfe des
TNBS Kolitismodels gelang es, pathologische Zytokinsekretionsmuster und Störungen
der Zelladhäsion aufzuzeigen und so entscheidende Erkenntnisse im Bereich der
Immunotherapie zu gewinnen (Williams et al., 2001; Wirtz et al., 2007).
Neben den induzierbaren Modellen gibt es, wie bereits angesprochen, eine Vielzahl von
genetischen Modellen von denen sich allerdings nur eine kleine Anzahl etablieren
konnte. IL-10 defiziente Mäuse sind das mit Abstand am weitesten verbreitete Modell.
Die Versuchstiere entwickeln in einem Alter von 2 - 4 Monaten eine spontane
chronische Enterokolitis, die von einer massiven Infiltration der Mukosa mit
Lymphozyten, aktivierten Makrophagen und neutrophilen Granulozyten begleitet wird
(Berg et al., 1996; Kuhn et al., 1993). IL-10 ist ein bekannter Suppressor der TH1-
Zellantwort und verschiedenster Makrophagenfunktionen. Via IL-12 und TNF-α
inhibiert das Interleukin die T-Zell Proliferation. Auf der anderen Seite fördert IL-10
die Entstehung von pathologischen T-Zellen. IL-10- defiziente Versuchstiere haben sich
besonders als Modell für die chronisch nicht-ulzerierende Entzündungsprozesse etabliert
(Groux et al., 1997).
Auch die spezifische Inhibition des Signal transducer and activator of transcription 3
(STAT3) Gens in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten der Maus führt zur
Entstehung einer transmural ulzerierenden Enterokolitis. STAT3 übernimmt in
Makrophagen und neutrophilen Granulozyten eine wichtige Position bei der
Signaltransduktion von IL-10. IL-10 vermittelt hier seinen wichtigen
antiinflammatorischen Charakter durch Hemmung der Makrophagen- und
Granulozytenfunktion, die einer ständigen Stimulation durch die luminale
physiologische Baktierenflora ausgesetzt sind. Es gibt einschlägige Hinweise, dass
Störungen im Bereich dieser Signalkaskade auch pathophysiologisch ursächlich für die
Entstehung von chronischen entzündlichen Darmerkrankungen beim Menschen sind
(Takeda et al., 1999).
Einleitung
17
Ein weiteres wichtiges Modell basiert auf dem Transfer von naiven T-Zellen, was zu einer
Störung der T-Zell-Homöostase führt. Damit weißt das Modell starke Parallelen zur
Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen beim Menschen auf, wo
chronische Entzündungsprozesse häufig von autoreaktiven T-Zellen aufrechterhalten
werden (Sartor, 2006). CD4+ CD45RBhigh naive T-Zellen werden dabei aus
Wildtypmäusen isoliert und in syngene Versuchstiere, die keine T- und B-Zellen besitzen,
transplantiert. 5 bis 8 Wochen nach dem T-Zelltransfer kommt es zur Induktion einer
Enterokolitis mit transmuraler Infiltration von Immunzellen, Hyperplasie der Epithelzellen
und Formation von Kryptenabszessen, die von schweren epithelialen Erosionen begleitet
werden. In Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund der Maus kommt es zur
unterschiedlich starken Ausprägung von Gewichtsverlust und Diarrhö.
Bei einem neueren Ansatz werden naive T-Zellen in Rekombinase Activating Gene-1
(RAG-/-) defiziente Mäuse transferiert. Hier kommt es zu einer chronischen Entzündung
des gesamten GI-Traktes. Das Modell eignet sich daher besonders zu Untersuchungen des
M. Crohn. Ein weiteres Argument für T-Zell Transfermodelle ist, dass es ähnlich wie das
IL-10-/- Modell auf einen Großteil immunologischer und antibiotischer
Behandlungskonzepte anspricht und sich damit auch für pharmakologische Studien eignet.
(Ostanin et al., 2009; Powrie et al., 1994).
Einleitung
18
1.5 Inhibit ion der klassischen NF-κB-Aktivierung - eine neue Strat egie
bei der Behandlung von immunologischen und rheumatologischen
Krankheit sbildern?
In verschiedenen Tiermodellen für entzündungsassoziierte Krankheitsbilder, wie z.B.
rheumatoide Arthritis, entzündungsvermittelte Osteoporose und allergisch bedingten
Atemwegserkrankungen, bei denen inadäquate Entzündungs- und Immunreaktionen das
Krankheitsbild aufrechterhalten, wirkt sich die Inhibition von IKKβ durch eine
verminderte Synthese und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen positiv auf
den Krankheitsverlauf aus (Broide et al., 2005; Karin et al., 2004; McIntyre et al., 2003;
Ruocco et al., 2005). Ähnliche Ergebnisse konnten im Rahmen von Studien zu
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen erzielt werden. Die direkte Inhibition von
NF-κB mittels gegenläufiger Oligonukleotide gegen RelA/p65 oder die Verwendung
verschiedener IKKβ-Inhibitoren wirkte chronischen Entzündungsprozessen im
Gastrointestinaltrakt entgegen (Lawrence et al., 2003; MacMaster et al., 2003; Neurath
et al., 1996). Die Ergebnisse bestätigen die zentrale Funktion, die NF-κB bei der
Regulation von Immun- und Entzündungsreaktionen besitzt. Ferner demonstrieren sie
den potentiellen Nutzen einer pharmakologischen NF-κB-Inhibition bei der Therapie
von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen.
Im Gegensatz zu den oben postulierten Daten stehen jedoch die im Jahr 2004 von
Greten et al publizierten Ergebnisse. Hier führte die konditionelle Ablation von IKKβ in
intestinalen Epithelzellen der Maus zur Exazerbation einer chemisch induzierten
ulzerierenden Kolitis (Greten et al., 2004). Andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass
bei gewebsspezifischem Verlust von IKKγ im Darmepithel die Entstehung einer
spontanen Kolitis provoziert wird (Nenci et al., 2007). Auch ist bekannt, dass IKKβ-
abhängige NF-κB-Aktivierung in myeloischen Zellen die Prozessierung und Sekretion
von wichtigen proinflammatorischen Zytokinen, wie z.B IL1-β hemmt. IL-1β reguliert
zentrale Elemente der lokalen Entzündungs- und systemischen Immunreaktion, wie z.B.
die Körpertemperatur, Granulozytenproliferation, verschiedene Akute-Phase-Proteine,
Einleitung
19
sowie zahlreiche andere Interleukine (Greten et al., 2007). Untersuchungen im Rahmen
von Kolitis-assoziierter Karzinomentstehung deuten darauf hin, dass IKKβ in
myeloischen Zellen durch Kontrolle der Produktion von Wachstumsfaktoren, wie z.B.
IL-6, Tumorentstehung und Wachstum beeinflusst (Becker et al., 2004; Karin and
Greten, 2005).
Diese zum Teil widersprüchlich erscheinenden Ergebnisse demonstrieren die
Komplexität entzündungsassoziierter NF-κB Aktivierung und veranschaulichen die
Problematik, die hinter einer therapeutischen Anwendung von pharmakologischen
IKKβ-Inhibitoren steht.
Zielsetzung
20
2 Zielsetzung
Eine dysregulierte Produktion und Sekretion von Zytokinen durch immunkompetente
Zellen ist ein zentrales Element bei der Pathogenese von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen. Der Transkriptionsfaktor NF-κB nimmt in diesem komplexen
Szenario eine entscheidende Position bei der Regulation der Immunantwort ein. Bei
Patienten, die an Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa erkrankt sind, ist die NF-κB
Aktivität in Epithelzellen und Makrophagen in den entzündlich veränderten
Darmabschnitten signifikant gesteigert und korreliert deutlich mit dem Schweregrad der
Entzündung (Neurath et al., 1996; Rogler et al., 1998). NF-κB-Aktivierung in
Makrophagen führt dabei zu einer vermehrten Produktion und Sekretion der
proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 und IL-23. Während in
Makrophagen der proinflammatorische Charakter NF-κBs überwiegen soll, dominieren
in Epithelzellen durch die vermehrte Transkription von antiapoptotischen Genen die
protektiven Eigenschaften (Becker et al., 2003; Neurath et al., 1996).
Untersuchungen zum therapeutischen Effekt genetischer bzw. pharmakologischer
IKKβ/NF-κB Inhibition in verschiedenen Modellen für intestinale Entzündungsprozesse
führten bislang aber zu widersprüchlichen Ergebnissen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Funktion der klassischen IKKβ-abhängigen NF-
κB-Aktivierung im Rahmen von akut-ulzerierenden und chronisch nicht-ulzerierenden
Entzündungsprozessen im Kolon der Maus zu klären. Dazu sollen mit Hilfe von
verschiedenen Mausmodellen die zelltypspezifischen Funktionen NF-κBs in
Epithelzellen und inflammatorischen Zellen unter Berücksichtigung der Ausprägung der
Entzündungsreaktion genau charakterisiert werden. Weiterführend sollen
Interaktionsmechanismen der verschiedenen beteiligten Zelltypen aufgezeigt werden.
Material und Methoden
21
3 Material und Methoden
3.1 Mausmodel le
Eine epithelspezifische Ikkβ Deletion (IkkβΔICE) wurde mit Hilfe des Cre/loxP-System
verwirklicht. Dazu wurden Mäuse mit gefloxten Ikkβ Allelen (IkkβF/F) mit Mäusen, die
die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des Villin Promotors exprimieren, auf einem
C57BL/6;129 Hintergrund verkreuzt (el Marjou et al., 2004; Madison et al., 2002).
IkkβΔmye Tiere weisen eine spezifische Deletion von Ikkβ in der myeloischen Zellreihe auf.
Im Gegensatz zum oben genannten epithelspezifischen Modell steht die Cre
Recombinase hier unter der Kontrolle des Lysozym-Promotors (Clausen et al., 1999).
Für eine epithelspezifische, induzierbare Ablation von IKKβ wurden villin-Cre-ERT2-
Mäuse mit IkkβF/F Tieren verkreuzt. Die Deletion von Ikkβ erfolgte durch die orale
Gabe von 1mg Tamoxifen in einem Ethanol/Sonnenblumenöl-Gemisch an fünf
aufeinander folgenden Tagen (el Marjou et al., 2004). Il-10-/- Mäuse (Berg et al., 1996),
bezogen von The Jackson Laboratory, wurden für die entsprechenden Versuche mit
IkkβΔICE und IkkβΔmye verpaart. Das Auftreten einer spontanen Kolitis in IL-10 Mutanten,
und damit auch der Endpunkt des krankheitsfreien Überlebens wurde bei einem
Gewichtsverlust von >20% des Versuchtieres im Vergleich zum vorher bestimmten
Maximalgewicht definiert. Die erkrankten Versuchstiere wurden zu den angegebenen
Zeitpunkten euthanasiert.
3.1.2 Chemische Induktion einer akuten Kolit i s
Die Induktion einer akuten Kolitis erfolgte durch fünf- bis sechs-tägige Applikation von
3% Dextran Sulfat Sodium (DSS, MP Biomedicals) im Trinkwasser.
Material und Methoden
22
3.1.3 Zel lkultur
Bei den verwendeten SW480 Zellen handelt es sich um humane Kolonkarzinom
Zelllinie. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in DMEM Medium (GIBCO) versetzt
mit 10% fätalem Rinder Serum und 1% Streptomycin und Penicillin, bei 37°C und
5%CO2.
3.1.4 Pharmakologische IKKβ-Inhibit ion
Zur spezifischen pharmakologischen Inhibition der IKKβ-abhängigen NF-κB-
Aktivierung wurde der IKKβ-Inhibitor ML120B von Millennium Pharmaceuticals zur
Verfügung gestellt. Für in vivo Experimente erfolgte die Gabe des Inhibitors zweimal
täglich oral in Methylzellulose gelöst, in einer Konzentration von 80mg/kg. Für in vitro
durchgeführte Experimente wurde ML120B in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst
appliziert.
3.2 Genotypisierung
3.2.1 Polymerase-Ket t en-Reaktion (PCR)
Bei der PCR handelt es sich um ein Nachweisverfahren, bei dem eine definierte
Nukleinsäuresequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäuren amplifiziert werden kann.
Dabei nutzt man die Eigenschaft von DNA-Polymerasen, aus einem DNA-Einzelstrang
DNA-Doppelstränge zu synthetisieren, wenn ihnen ein kurzer doppelsträngiger Bereich
als Primer und genügend Oligonukleotide zur Verfügung gestellt werden. Die PCR
basiert auf einem dreiteiligen Zyklus, der zur exponentiellen Amplifikation der
gewünschten Sequenz führt: Primeranlagerung am 5´ Ende der zu amplifizierenden
Sequenz, enzymatische Elongation und anschließender Denaturierung zu Einzelsträngen.
Material und Methoden
23
Durch mehrfache Wiederholung des Zyklus kommt es zur exponentiellen
Vervielfältigung der gewünschten Sequenz. Die Verwendung von thermostabilen DNA-
Polymerasen ermöglicht eine automatisierte Durchführung in Thermoblöcken.
Der einfache PCR Ansatz (20µl) beinhaltet:
10xPuffer (2µl)
50mM MgCl2 (0,8µl)
100mM dNTP (0,4µl)
TaqPolymerase (5u/µl) (0,15µl)
DNA (20-100ng) (1µl)
20mM Primer Forward (1µl)
20mM Primer Reverse (1µl)
H2O (13,65µl)
3.2.3 Oligonukleotidsequenzen
IKKβ−144-F CACAGTGCCCACATTATTTAGATAGG
IKKβ−321-R GTCTTCAACCTCCCAAGCCTT
Cre-370-F ACCTGAAGATGTTCGCGATTATCT
Cre-370-R ACCGTCAGTACGTGAGATATCTT
IL 10 WT/KO IMR87 F GCC TTC AGT ATA AAA GGG GGA CC
IL10 WT/IMR86 R GTG GGT GCA GTT ATT GTC TTC CCG IL10 WT/IMR88 R CCT GCG TGC AAT CCA TCT TG
Material und Methoden
24
3.3 Histologie
Zur mikroskopisch-morphologischen Charakterisierung des Kolons wurden
Paraffinschnitte angefertigt. Dazu wurde das Kolon direkt nach der Präparation
longitudinal eröffnet und spannungsfrei um Holzspatel gewickelt, so dass die
unterschiedlichen Abschnitte des Kolons in Form einer Rolle übereinander zum Liegen
kamen. Die Fixierung erfolgte in 4%iger Paraformaldehydlösung für 12 Stunden bei 4°C.
Anschließend wurde das Gewebe dehydriert und in flüssigem Paraffin eingebettet. Mit
einem Mikrotom (Mikrom HM355S) wurden 3µm dünne Paraffinschnitte angefertigt.
3.3.1 Hämatoxylin/Eosin-Färbung
Die Hämatoxylin/Eosin-Färbung eignet sich besonders gut für eine möglichst
unverfälschte morphologische Darstellung des Gewebes. Dabei färbt Hämatoxylin alle
sauren bzw. basophilen Strukturen, wie z.B. Zellkerne mit den enthaltenen
Desoxyribonukleinsäuren und das raue endoplasmatische Retikulum, blau. Eosin
hingegen färbt vor allem Plasmaproteine, die sich durch ihre Azidophilie bzw.
Eosinophilie auszeichnen, rot. Nach Deparaffinisierung der trockenen Paraffin-Schnitte
durch das Intermedium Xylol für 10 Minuten wird das Präparat in einer absteigenden
Alkoholreihe (100%, 96%, 80%, 70% und 50%) in jeder Verdünnung jeweils 3 Minuten
in ein wässriges Milieu überführt. Zunächst wird für 60 Sekunden mit Hämatoxylin,
anschließend für 15-30 Sekunden mit 1% Eosin gefärbt. Daraufhin folgte in aufsteigender
Alkoholreihe (50%, 70%, 80%, 96%, und 100%) für jeweils 20 Sekunden die
Dehydrierung des Präparates mit anschließender Entfernung des Alkohols durch eine
erneute Inkubation in Xylol für 5 Minuten. Die Konservierung der Paraffin-Schnitte
erfolgte mit VectaMount Medium (Vertor Labs) und einem Deckglas.
Material und Methoden
25
3.3.2 Histologische Scores zur Auswer tung des Gewebeschadens
3.3.2.1 Epithel iealer Schaden
0 - Normal
1 - epitheliale Hyperproliferation
2 - Verlust der Krypte <50%
3 - Verlust der Krypte 50-90%
4 - Kompletter Verlust der Krypte
5 - Kleine bis mittlere Ulzerationen (Ausdehnung <10 Krypten)
6 - Große Ulzerationen (Ausdehnung ≥10 Krypten)
3.3.2.2 Infil trat ion von Immun- und Entzündungszel l en
Mukosa Submukosa Muskularis/Serosa 0 - keine 0 - keine 0 - keine
1 - mild 1 - moderat 1 - moderat bis schwer
2 - moderat 2 - schwer
3 - starke
3.3.2.3 Berechnung des Gesamtscores
Pro Versuchstier wurden die drei am schwersten betroffenen Darmabschnitte nach dem
oben beschriebenen Score bewertet. Der durchschnittlich erreichte Score (0-12) wurde
graphisch dargestellt.
Material und Methoden
26
3.5 Protein und DNA Analyse
3.5.1 Isol ierung von Gesamtgewebe
Nach Resektion des distalen Kolons erfolgte eine sofortige Konservierung eines circa 2 x
2 mm großen Stückes in flüssigem Stickstoff. Die Proben wurden bis zur Verwendung
bei -80° gelagert.
3.5.2 Isol ierung von intest inalen Epithel zel len
Zur Gewinnung von intestinalen Epithelzellen (IEC) wurde den Versuchstieren nach
Tötung durch atlanto-occipitale Dislokation das Colon entnommen, mit PBS gespült
und in ca. 2-3 mm große Stücke zerkleinert. Daraufhin wurden die Darmfragmente in
einem 50 ml Falcon mit 10ml HBSS 30mM EDTA-Lösung auf einem Schüttler bei
100rpm und 37°C für 8 Minuten inkubiert und anschließend für 30 Sekunden bei
maximaler Geschwindigkeit gevortext. Das EDTA interferiert dabei mit Zell-Zell-
Kontakten, so dass es zur Ablösung der Epithelzellen von der Lamina Propria kommt.
Die sich nun in Lösung befindlichen Epithelzellen wurden in ein neues Falcon überführt
und bei 4°C und 1700rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Epithelzellpellet mit 2,5ml, 4°C kaltem PBS gewaschen und zu je 800µl in
Eppendorf Tubes transferiert. Diese wurden bei 4°C und 5000rpm für weitere 5
Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das
Epithelzellpellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Aufbewahrung erfolgte bei -
80°C.
Material und Methoden
27
3.6 RNA-Isol ierung und Analyse
Die Gewinnung von RNA aus Epithelzellen erfolgte mit Hilfe der Qiagen Shredder und
RNeasy Kits. Dabei wird die RNA mit einem Hochsalzpuffer an eine Membran in einer
Plastiksäule gebunden, mehrfach gewaschen und anschließend eluiert. Die Isolierung
erfolgte anhand des Protokolls des Herstellers bei Raumtemperatur:
Die bei -80°C gelagerten Epithelzellpellets wurden mit 1% ß-Mercaptoethanol
versetzten RLT-Puffer (600µl) mit Hilfe einer Pipette lysiert und in die vorgesehenen
Qiagen-Säulen des Shredder Kits überführt. Es folgte eine Zentrifugation bei 10000rpm
für 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Dem Zentrifugat wurde 600µl 70% Ethanol
beigemengt. Die homogene Lösung wurde darauf in eine Qiagen RNeasy-Säule
transferiert und für 15 Sekunden bei 10000rpm bei RT zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen. Es folgt der erste Waschschritt mit 700µl RWI Puffer mit
anschließender Zentrifugation bei 10000rpm für 15 Sekunden. Der Überstand wurde
verworfen und es folgten zwei weitere Waschschritte mit jeweils 500µl RPE-
Waschpuffer. Die Zentrifugation erfolgte zwischen den Waschschritten wie zuvor bei
10000rpm für 15 Sekunden bei RT. Vor der Elution der RNA durch Zugabe von 30µl
RNase free water wurde die Membran der Qiagen Säule durch einminütige
Zentrifugation bei 13000rpm getrocknet. Die Elution erfolgte bei 10000rpm für eine
Minute. Die RNA wurde bei -80°C gelagert.
3.6.1 Realt ime Rever se Transkriptase (RT)-PCR
Um die Transkription eines Genes nachzuweisen, muss die transkribierte RNA
analysiert werden. Die Real-Time RT-PCR dient dabei zur Quantifizierung der
Genexpression und ist eine Kombination aus zwei Methoden:
Material und Methoden
28
3.6.2 cDNA- Synthese
Aus der isolierten Gesamt-RNA muss zunächst mit Hilfe einer reversen Transkriptase
cDNA synthetisiert werden, da die anschließende PCR auf DNA-spezifischen DNA-
Polymerasen beruht. Die Synthese der cDNA erfolgte anhand des Protokolls des
Herstellers (Invitrogen) der reversen Transkriptase:
Bei einem einfachen Ansatz beträgt das gesamte Reaktionsvolumen 20µl:
1µg RNA, 1µl 40µM OligodT Primer und 1µl 100 mM dNTP wurden durch die
Zugabe von H2O auf ein Reaktionsvolumen von 13µl gebracht und bei 65°C für 5
Minuten inkubiert. Anschließend erfolgte durch Zugabe von SSRT 5xPuffer(4µl), 0,1M
DTT(1µl), RNAse Inhibitor out 40U/µl (1µl) und des Enzyms SSRT 200U/µl (1µl) die
katalytische Umwandlung von RNA in cDNA bei 50°C für 60 Minuten. Die Lagerung
erfolgte in 1:4 Verdünnung bei -20°C.
3.6.3 Real-Time RT-PCR
Die Real-Time PCR basiert auf einem speziell fluoreszierenden Farbstoff, SYBR® Green
(Applied Bioscience) der nur doppelsträngige DNA färbt. Die entstehende Fluoreszenz
des amplifizierten Produktes wird kontinuierlich während der einzelnen PCR-Zyklen
detektiert. Am so genannten Schwellenwertzyklus bzw. Ct-Wert kommt es zur ersten
signifikanten Zunahme der Fluoreszenz. Hier übersteigt das „echte“ Fluoreszenssignal
das Hintergrundrauschen der Fluoreszenz. Dieser Wert dient bei der Auswertung mittels
der Δ Ct Methode als relativer Vergleichspunkt unter den getesteten Genen.
Material und Methoden
29
Einfacher Ansatz (25µl):
cDNA (0,5µl) H2O (9,5µl) 2x SYBR MIX (12,5µl)
Forward Primer (20mM) (1,25µl) Reverse Primer (20mM) (1,25µl)
3.6.4 Delt a CT Methode
Die unterschiedliche Genexpression wurde mit Hilfe des Δ-Ct-Wertes angegeben. Dabei
wird die Expression des zu untersuchenden Gens gegenüber einem Housekeeping Gen,
das in jeder Zelle gleichermaßen exprimiert und nicht reguliert wird, normalisiert. Die
Differenz zwischen dem Housekeeping und zu untersuchendem Gen ergibt den ΔCt
Wert. Da es sich bei PCR -wie zuvor beschrieben- um eine exponentielle Methode
handelt verdoppelt sich mit jedem Replikationszyklus der DNA Gehalt. Das heißt, dass
ein Unterschied im Ct-Wert sich exponentiell auf die Menge der replizierten DNA
Menge auswirkt. Die verwendete Gleichung zur Bestimmung des absoluten Expression
war demnach 2- Δct. Die Mittelwerte der einzelnen Gruppen und der Standardfehler
(Standardabweichung/Wurzel der Anzahl der Proben) wurden graphisch gegeneinander
aufgetragen.
Material und Methoden
30
3.6.5 Oligonukleotidsequenzen
Die verwendeten Primer zur Analyse der Mausgene wurden mit Hilfe der Software
PrimerExpress 1.0 erstellt. Primer Dimere und unspezifische Produkte wurden durch
vorherige PCR-Analysen ausgeschlossen.
CCL6-F AACCCAGGTCTGTGCCGAC
CCL6-R TGGGCCTTGCTTCAGGG
CCL20-F TGGCAAGCGTCTGCTCTTC
CCL20-R TTGCTGCTTCTGCCTGGC
CD49B-F TGGCGAGTCCCATGATGG
CD49B-R TGCCGAACCTCAGTATCTCGT
CD4-F GAGGCTCAGATTCCCAACCA
CD4-R GCAGCAAGCGCCTAAGAGAG
CD8-F CGTGGTGGTGCATGCCT
CD8-R CCTCGAACTCAGAGAGATCCGC
Claudin2 F TGCGACACACAGCACAGGCATCACC
Claudin2 R TCAGGAACCAGCGGCGAGTAGAA
Claudin3 F AGCATCATCACGGCGCA
Claudin3 R TGCTCTGCCCACGCAGT
Material und Methoden
31
Claudin4 F CCTGGACCGCTCACAACG
Claudin4 R CCAGCCGACGTAAAGCGA
Claudin5 F TTAAGGCACGGGTAGCACTCACG
Claudin5 R TTAGACATAGTTCTTCTTGTCGTAATCG
Claudin6 F ACTATGCTGCGCCTGCTCTTCTGG
Claudin6 R GATATTCGGAGGGTCCCCGAGA
Claudin11 F TCAGGTGGTGGGTTTCGTCA
Claudin11 R CCAGAACGGAGGCAGCAATCA
Claudin12 F CAGCCACCGTCCTGTCCTT
Claudin12 R GTGATCAGCCGCAGTTTCCT
Claudin19 F CGGTCATATCCAGTCAGCACGA
Claudin 19R AGACCTGCCAAGAGGAAGAGAGCA
Claudin 20 F CAGCTCCTTGCTTTCATCCTG
Claudin 20 R CAGACTCCTCCAGCAAAGGAA
CXCL1-F TATCGCCAATGAGCTGCG
CXCL1-R GGATGTTCTTGAGGTGAATCCC
Material und Methoden
32
CXCL5-F TCCATCTCGCCATTCATGC
CXCL5-R GATGCTGCGGCAGCGGCAGCGT
CYCLO-F ATGGTCAACCCCACCGTGT
CYCLO-R TTCTGCTGTCTTTGGAACTTTGTC
F4/80-F CTTTGGCTATGGGCTTCCAGTC
F4/80-R GCAAGGAGGACAGAGTTTATCGTG
FOXP3-F TAGGAGCCGCAAGCTAAAAGC
FOXP3-R TCCTTGTTTTGCGCTGAGAGT
GR1-F GCAATGCAGCAGTTCCCACT
GR1-R ATTGAATGGATCATCAGAGAAAGGTC
IL-1β-F GTG GCT GTG GAG AAG CTG TG
IL-1β-R GAA GGT CCA CGG GAA AGA CAC
IkBα-F CCA GAA CAA CCT GCA GAC
IkBα-R GCT CAG GAT CAC AGC CAG CTT
IFNα-F TGTACCTGAGAGAGAAGAAACACAGC
IFNα-R GGAAGACAGGGTTCTCCAGACTT
IFNβ-F AGCTCCAAGAAAGGACGAACAT
IFNβ-R GCCCTGTAGGTGAGGTTGATCT
IFNγ-F TTACTGCCACGGCACAGTCA
IFNγ-R AGTTCCTCCAGATATCCAAGAAGAGA
Material und Methoden
33
IL-6-F GTATGAACAACGATGATGCACTTG
IL-6-R ATGGTACTCCAGAAGACCAGAGGA
IL-10-F GGTTGCCAAGCCTTATCGGA
IL-10-R ACCTGCTCCACTGCCTTGCT
IL-11-F CTGCACAGATGAGAGACAAATTCC
IL-11-R GAAGCTGCAAAGATCCCAATG
IL-12p40-F AAACCAGACCCGCCCAAGAAC
IL-12p40-R AAAAAGCCAACCAAGCAGAAGACAG
MIP2-F ATCCAGAGCTTGAGTGTGACGC
MIP2-R AAGGCAAACTTTTTGACCGCC
Occludin F GTGAGCTGTGATGTGTGTTGAGCT
Occludin R GTGGGGAACGTGGCCGATATAATG
SOCS3-F CTTCCCATGCCGCTCACA
SOCS3-R CCCAGCCCCATACCTGACTT
Material und Methoden
34
3.6.7 Microarray Analyse
Genexpressionsprofile der Epithelzellen wurden unter Verwendung des Affymetrix Gene
ST GeneChip (circa 28000 Gene aus der Maus) durchgeführt. Als Proben wurde RNA
verwendet, die zuvor wie beschrieben aus den Epithelzellen des Kolons isoliert wurde.
Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der SAM 3.0 Software.
3.7 Proteinbiochemie
3.7.1 Gewinnung von Proteinextrakten aus Epithel bzw. SW480 Zel l en
IEC Zellpellets wurden in gefrorenem Zustand mit Hilfe eines Pistills in 200µl
Lysepuffer lysiert, für 15 Minuten bei 4°C inkubiert und anschließend für 10 Minuten
bei 13000rpm bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf Tube
überführt und zur Proteinanalyse eingesetzt.
Protein-Lysepuffer:
Lysepuffer Stock: 50mM Tris HCl pH 7,5; 250mM NaCl; 3mM EDTA; 3mM EGTA;
1%Triton; 0,5% NP40; 10% Glycerol; 25mM Natrium Pyrophosphat
plus
eine Tablette Protease-Inhibitoren (Roche) auf 50ml Lysepuffer (Inhibition gegen
Chymotrypsin, Pankreas Extract, Papain, Pronase, Thermolysin, Trypsin)
plus
Phosphatase Inhibitor für 10ml Lysepuffer Komplett: 8,2 ml Lysepuffer inklusive
Protease-Inhibitoren; 10µl 1M DTT; 500µl 1M β-Glycerolphosphat; 500µl 500mM
NaF; 200µl 100mM Na PMSF; 500µl 100mM Na Orthovanadat.
Material und Methoden
35
3.7.2 Best immung der Proteinkonzentrat ion
Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe eines Photospektrometers nach Bradford
bestimmt. Die Methode nutzt die Eigenschaft des Farbstoffes „Coomassie Brilliant Blue
G250“ sich an Proteine zu binden und deren Absorptionsmaximum von rot (595nm)
nach blau (465nm) zu verschieben. Die Erhöhung der Absorption korreliert in einem
begrenzten Konzentrationsbereich mit der Proteinmenge. Die Absorption wurde bei 595
nm gemessen. Die Proteinmenge konnte anhand zuvor erstellter Eichgrade mit
bekannten Albumin Konzentrationen von 2 bis 0,0625mg/ml ermittelt werden. Es
wurde das Protein Assay Kit der Firma Biorad verwendet.
3.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblot
Ziel dieser beiden aufeinander aufbauenden Methoden ist ein qualitativer bzw.
quantitativer Proteinnachweis. Neben der relativen Proteinmenge kann durch
spezifische Antikörper auch der Aktivierungszustand des Proteins detektiert werden.
Mittels SDS-Page werden denaturierte Proteine elektrophoretisch ihrer Größe nach
aufgetrennt. Dabei binden die Proteine an im Überschuss vorhandenes SDS und
erhalten dadurch eine negative Ladung, die proportional zu ihrem Molekulargewicht ist.
Die elektrophoretische Beweglichkeit hängt damit von der Größe des Proteins ab, so
dass die SDS-Protein-Komplexe in der Gelmatrix entsprechend der Molmasse separiert
werden.
Bei der verwendeten Methode nach Lämmli wurden zunächst die relativen
Proteinmengen der Proben bestimmt und untereinander angeglichen. Daraufhin erfolgte
die Zugabe von 15µl Lämmli-Puffer incl. 5% ß-Mercaptoethanol zum Proteingemisch.
Material und Methoden
36
Lämmli-Puffer: 3,55ml H2O dest; 1,25ml Tris HCl 0,5M pH6,8; 2,5ml Glycerol; 2ml
10% SDS; 0,2 ml Bromphenol Blau
plus β-Mercaptoethanol (Endkonzentration 5%)
Die Proteine wurden anschließend für fünf Minuten bei 95°C denaturiert. Die
elektrophoretische Auftrennung erfolgte in vertikal aufgerichteten Gel-Apparaturen der
Firma “BioRad“. Für Sammel- bzw. Trenngel wurden entsprechend dem
Molekulargewicht des zu untersuchenden Proteins unterschiedliche Acrylamid-
konzentrationen zwischen 10% und 15% verwendet.
Ein 12%- Gel enthielt beispielsweise bei einem 10ml Ansatz 2,5ml 40% Acrylamid,
4,4ml H2O, 0,1ml SDS und 2,5ml Sammel- bzw. Trenngel-Puffer. Die individuelle
Polymerisation der beiden Gele wurde durch Zugabe von 50µl 10%
Ammoniumpersulfat und 5µl bzw. 10µl TEMED erreicht. Die elektrophoretische
Auftrennung erfolgte bei einer konstanten Spannung von 100 V in vertikalen mit 1x
Laufpuffer gefüllten Gelkammern für ca. 90 Minuten.
Die aufgetragenen Proben wurden dabei zunächst im Sammelgel konzentriert und
anschließend im Trenngel aufgetrennt. Zur Bestimmung des Molekulargewichts dienten
10µl eines gefärbten Proteingemischs mit bekannten Molekulargewichtsgrößen
(Precision Plus Protein Standard All Blue, BioRad). Unmittelbar darauf erfolgte der
elektrophoretische Transfer der Proteine auf eine zuvor in Methanol aktivierte Protein-
bindende Membran (Immobilon TM Transfer Membran; Millipore).
Dabei wurde das Acrylamidgel luftblasenfrei einerseits von Membran, Filterpapier,
Konzentration
des Gels
Acrylamide-bisacrylamide (40% ) in ml
Lauf- bzw. Trenngel
puffer in ml
Destilliertes H2O in ml
TEMED in Lauf-/ Trenngel
in µl
10% APS
in µl
8% 2 2.5 5.5 5/10 50 10% 2.5 2.5 5 5/10 50 12% 3 2.5 4.5 5/10 50 15% 3.75 2.5 3.75 5/10 50
Material und Methoden
37
Zelluloseschwamm und andererseits ausschließlich von Filterpapier und
Zelluloseschwamm bedeckt. Diese Anordnung wurde in eine Halterung eingespannt
und vertikal in eine mit 4°C kalten 1X Transferpuffer gefüllte Blotkammer überführt.
Die Orientierung wurde so gewählt, dass das Gel zur Kathode und die Membran zur
Anode ausgerichtet waren, so dass die negativ geladenen Proteine durch Anlegen einer
Stromstärke von 400mA bei 4°C in 60 Minuten auf die Membran transferiert werden
konnten. Sowohl bei der SDS-PAGE als auch beim Immunoblot wurden vertikale
Elektrophorese-Apparaturen der Firma „BioRad“ benutzt.
Verwendete Puffer:
10xLaufpuffer: 30,3g Tris; 144,1g Glycin; 10g SDS in 1000ml H2O 1xTransferpuffer: 100ml 10xTransferpuffer; 200ml Methanol; 700ml H2O
10xTransferpuffer: 14,5g Tris (12mM); 72g Glycin (96mM) in 1000ml H2O
Konzentration in 1xTransferpuffer
3.7.4 Immunoblotanalyse
Zur Absättigung unspezifischer Antikörperbindungsstellen wurde die Membran nach
dem Transfer mit 3% Magermilch in PBS Tween 0,1% für 30 Minuten bei
Raumtemperatur geschüttelt. Die Inkubation mit dem spezifischen Primärantikörper
erfolgte in einer Verdünnung von 1:500 bis 1:1000 in 3% Rinderalbuminserum oder
Magermilch in PBS Tween 0,1% über Nacht bei 4°C. Im Anschluss wurde die Membran
3x5 Minuten in PBS Tween 0,1% gewaschen. Als Sekundärantikörper dienten
Peroxidase konjugierte anti-Maus bzw. anti-Hase IgG Antikörper (ECL Anti Rabbit
bzw Anti Mouse IgG Horseradish Peroxidase; GE Healthcare). Der entsprechende
Sekundärantikörper wurde 1: 3000 - 1:5000 in 3% Magermilch in PBS Tween 0,1%
verdünnt und für 45 Minuten mit der Membran inkubiert. Zur Detektion der
gebundenen Sekundärantikörper wurde nach erneutem Waschen der Membran das
Material und Methoden
38
SuperSignal ECL-Detektionskit der Firma Pierce verwendet. Dazu wurde die Membran
mit je 2,5ml der Lösung A und B für 5 Minuten inkubiert. Die antikörpergebundene
Peroxidase oxidiert dabei ein im Kit vorhandenes Substrat. Die bei der enzymatischen
Reaktion entstehende Chemilumineszenz wurde mit Hilfe eines Röntgenfilms
detektiert. Alle Inkubations- und Waschschritte wurden, wenn nicht anders erwähnt,
auf einem Schüttler bei Raumtemperatur durchgeführt.
3.7.6 Verwendete Antikörper
Primärantikörper:
anti-RelA/p65; 1:1000 in 3% BSA; Santa Cruz
anti-cRel; 1:1000 in 3% BSA; Santa Cruz
anti-p50; 1:1000 in 3% BSA; Santa Cruz
anti-IKKα; 1:1000 in 3%BSA; Imgenex
anti-IKKβ; 1:1000 in 3% BSA; UBI
anti-ß-Actin; 1:1500 in 3% Skim Milk; Sigma
anti-Hsp70; 1:1000 in 3% BSA; Cell Signaling
anti-STAT3; 1:1000 in 3% BSA; Cell Signaling
anti-phospho STAT3; 1:1000 in 3% BSA; Cell Signaling
Material und Methoden
39
Sekundär-Antikörper:
anti-mouse IgG; 1:3000 in 3% Milch; GE Healthcare
anti-rabbit IgG; 1:5000 in 3% Milch; GE Healthcare
3.7.7 Electrophoresi s Mobil ity Shift Assay (EMSA)
Diese Methode dient dem Nachweis von Protein-DNA-Interaktion, wie z.B. die
Bindung eines Transkriptionsfaktors an spezifische DNA-Sequenzen, mittels nicht-
denaturierender Gelelektrophorese. Die Interaktion des Transkriptionfaktors an eine
radioaktiv markierte Oligonukleotidsonde bewirkt eine Verlangsamung der
Migrationsgeschwindigkeit im Vergleich zur ungebundenen Sonde im Polyacrylamidgel.
Im Autoradiogramm zeigen sich Banden, deren Intensität mit der Stärke der Protein-
DNA-Interaktion korreliert.
3.7.8 Radioaktive Markierung der Oligonukleotidsonden
100ng doppelsträngiges Oligonukleotid wurden in 20µl Reaktionsvolumen mit 2µl 10x
T4 Polynukleotid Kinase (PNK) Puffer, 1µl T4 PNK sowie 1µl [γ-32p]-ATP für 30
Minuten bei 37°C inkubiert. Daraufhin erfolgte die Aufreinigung des markierten
Oligonukleotides mit Hilfe der Amersham Mircospin Säule. Das Zentrifugat enthielt das
markierte Oligonukleotid. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
3.7.9 EMSA Oligo Sequenzen
NF-κB: Forward: 5’ AGT TGA GGG GAC TT CCC AGG C 3’
Reverse: 5’ GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T 3’
Material und Methoden
40
3.7.10 Nachweis der DNA-Bindung
10µg einer aus IEC gewonnenen Proteinprobe wurden in 20µl Reaktionsvolumen mit
5µl 10x EMSA Puffer, 1µl 20mM DTT, 2µg Poly dI/dc (0,5mg/ml) und 0,2µl der
markierten Oligonukleotidsonde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
Zugabe von 2x EMSA Loading Dye erfolgte die Auftrennung im Polyacrylamidgel in
einer mit 0,5x TBE Laufpuffer gefüllten vertikalen Gel-Elektrophoresenapparatur bei
einer konstanten Spannung von 200 Volt. Nach Trocknung des Gels auf Filterpapier bei
80°C unter Vakuum für ca. 60 Minuten erfolgte die Auswertung via Autoradiogramm
mittels eines Röntgenfilms.
Verwendete Puffer:
10x EMSA Puffer: 0,1 M Tris HCl pH 7,6; 0,5 KCl; 0.01M EDTA; 50% Glycerol
10x EMSA Ladepuffer: 250mM Tris HCl pH7,5; 40% Glycerol;
0,2% Bromophenol Blau
5x TBE Puffer: Tris 54g; Borsäure 27,5g; EDTA 2,92g in 1000ml
H2O
EMSA Polyacrylamidgel: 33,75ml H2O; 10ml 5xTBE; 6,25ml 40% Acrylamid;
337µl 10% APS
Ergebnisse
41
4 Ergebnisse
4.1 IKKβ fördert die epithel ial e Regenerat ion im Rahmen von akut -
ulzerierenden Entzündungsprozessen im Gastrointest inaltrakt der Maus
IKKβ vermittelt in Epithelzellen wichtige protektive Effekte, die es der Zelle
ermöglichen, auf verschiedenste Formen von Stress adäquat zu reagieren (Chen et al.,
2003; Egan et al., 2004). Durch IKKβ-abhängige NF-κB-Aktivierung in frühen Stadien
der akuten Kolitis kann durch die Induktion von anti-apoptotischen Genen die
epitheliale Integrität und intestinale Barriere aufrechterhalten werden (Greten et al.,
2004). Außerdem konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass NF-κB eine
Schlüsselposition bei der Kontrolle der Zellmigration besitzt. Zellmigration ist ein
wichtiger Aspekt bei der Regeneration nach Epithelschaden (Egan et al., 2003).
Inwiefern IKKβ Einfluss auf die frühe Heilungsphase nach akuten entzündlichen
Prozessen im Kolon nimmt, wurde bisher nicht untersucht.
In der Maus verursacht die Applikation von DSS in Trinkwasser eine akut-ulzerierende
Kolitis mit einer reproduzierbaren maximalen Ausprägung ab Tag 5. Um den Effekt von
IKKβ auf die Heilungsphase zu charakterisieren, wurde epithelspezifischen IKKβ-Knock-
Out-Mäusen (IkkβΔIEC) und einer Kontrollgruppe 5 Tage lang 3% DSS-haltiges Trinkwasser
zugeführt. 16 Tage nach DSS Applikation erfolgte die histologische Analyse in der
Heilungsphase an Tag 21. Im Vergleich zu Wildtyptieren weisen IKKβ-defiziente Tiere
deutlich mehr und auch höhergradig entzündlich-ulzerös veränderte Darmwandareale auf.
Ergebnisse
42
Abb.6 Delet ion von Ikkβ i n IE C im Rah men e ine r akut-u lze r ie renden Kol it is füh rt zu r Beeint rächtigu ng de r He i l u ngsphase (a) Orientierende Darstellung des verwendeten Schemas zur Induktion einer Kolitis durch DSS in IkkβF/F und IkkβΔIEC Versuchstieren; Histologische Analyse des Schweregrades der Entzündung (b)und der (c)Größe der Ulzerationen im Kolon; (d)Repräsentative H&E Färbung von IkkβF/F und IkkβΔIEC Mäusen in der späten Heilungsphase an Tag 21.
Ergebnisse
43
Eine definitive Aussage, ob der beobachtete Unterschied in der Heilungsphase das Resultat
vermehrter Epithelschädigung in Initialphase der Kolitis darstellt oder ob IKKβ zusätzlich
zu seiner anti-apoptotischen Wirkung weitere Funktionen besitzt, die den Verlauf der
Entzündung positiv beeinflussen, lässt das Experiment nicht zu.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der gestörte Heilungsprozess in IkkβΔIEC Tieren
auf eine höhergradige initiale epitheliale Schädigung zurückzuführen ist, wurde zunächst in
unbehandelten Wildtyptieren durch die 5-tägige Gabe von DSS eine akute ulzerierende
Kolitis induziert. Daraufhin wurde ein Teil dieser Tiere mit dem spezifischen IKKβ-
Inhibitor, ML120B (Nagashima et al., 2006), behandelt, während dem anderen Teil
lediglich der Vehikel verabreicht wurde. Der initiale epitheliale Schaden war damit in
beiden Gruppen identisch und nicht durch eine komprimitierte NF-κB Aktivierung
beeinträchtigt.
Die pharmakologische Inhibition von IKKβ war hochgradig effektiv. Die Analyse der NF-
κB-DNA-Interaktion durch EMSA zeigte im Vergleich zu den Kontrolltieren eine fast
vollständige Hemmung der NF-κB Bindeaktivität im entzündlich veränderten Kolon. Die
anschließende histologische Analyse zu Beginn der Heilungsphase, 10 Tage nach DSS
Applikation, zeigte in ML120B behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe eine
deutlich schwerere Ausprägung der Kolitis. Die Ergebnisse unterstützen damit die These,
dass IKKβ unabhängig seines zytoprotektiven Effekts in der frühen Entzündungsphase
weitere antiinflammatorische Funktionen besitzt, welche die Heilungsphase positiv
beeinflussen.
Sowohl die pharmakologische IKKβ-Inhibition als auch die genetische epithelspezifische
Deletion von Ikkβ führen letztendlich zu einer Exazerbation von akuten
Entzündungsprozessen im Kolon der Maus.
Ergebnisse
44
Abb.7 IKKβ ve r mitte lt u nabhäng ig se ine r ant i-apoptotischen F u nkt ion zytoprotektive Effekte in de r f r ü hen He i l u ngsphase e ine r akuten Kol it is (a)Orientierendes Schema zur Induktion einer Kolitis. (b)NF-κB DNA Bindeaktivität in Kolon- Gesamtmukosaextrakten an Tag 10; (c)Histologische Analyse des Schweregrades der Entzündung und der Größe der Ulzerationen (d) ; (e) vergleichende H&E Färbung von ML120B und Vehikel behandelten Wildtypen an Tag 10 nach Induktion einer akuten Kolitis durch DSS
Ergebnisse
45
Die angeführten Ergebnisse stehen jedoch im Widerspruch zu den von Neurath et al
postulierten Daten. Durch die Inhibition der klassischen NF-κB Aktivierung, mittels
antisense Oligonukleotiden gegen eine der NF-κB Untereinheiten, RelA/p65, konnte
dort ein Rückgang der Entzündung beobachtet werden (Neurath et al., 1996). Um die
Möglichkeit auszuschließen, dass RelA/p65 und IKKβ unterschiedliche Funktionen im
Rahmen einer akuten Kolitis besitzen, wurde in induzierbaren epithelspezifischen RelA
KO Mäusen, villin Cre ERT2/RelAΔIEC , ebenfalls durch die Applikation von DSS, eine
Kolitis induziert. Ähnlich wie bei IkkβΔIEC Tieren zeigte sich in der histologischen
Analyse, dass es beim epithelialen Verlust von RelA/p65 im Zuge einer akut-
ulzerierenden Kolitis zu einer Exazerbation der Entzündungsreaktion mit deutlich
gesteigerter Ausprägung der Ulzerationen kommt. Die Ergebnisse unterstreichen damit,
den protektiven Charakter einer suffizienten klassischen IKKβ-abhängigen NF-κB-
Aktivierung im Epithel während der Initialphase einer Kolitis.
Abb.8 IKKβ u nd Re lA /p65 ve r mitte ln s ich e rg änzende zytoprotektive Eigenschaften während akute r intest ina le r Entzü nd u ngsprozesse (a) Schematische Darstellung der Induktion einer Kolitis in villin Cre ERT2/RelAΔIEC Tieren und Kontrollen. (b) Histologische Analyse des Schweregrades der Entzündung und der (c)Größe der Ulzerationen
Ergebnisse
46
In den verschiedenen Theorien über die Pathogenese von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen nimmt die Barrierefunktion der intestinalen Schleimhaut eine zentrale
Stellung ein. Der Transkriptionsfaktor NF-κB ist mit der Regulation einer Reihe von
Genen, die für Zelladhäsionsproteine kodieren, assoziiert (Karin and Lin, 2002). Eine
durch die Inhibition von IKKβ gestörte Aktivierung von NF-κB könnte folglich mit einer
quantitativ oder qualitativ fehlerhaften Transkription von Proteinen verbunden sein, die
für die Funktion von Zellkontakten und damit für eine intakte epitheliale Barrierefunktion
essentiell sind. Um festzustellen, ob die Transkription von zellkontaktassoziierten
Proteinen und damit die Barrierefunktion beeinflusst ist, wurden IEC aus dem distalen
Kolon an Tag 7 nach Beginn der DSS-Applikation isoliert. An Tag 7 findet sich die
maximale Ausprägung des Gewebeschadens. Außerdem stellt dieser Zeitpunkt den Beginn
der frühen Heilungsphase dar. Verglichen wurden Vehikel und ML120B behandelte Tiere.
Die quantitative mRNA-Analyse von insgesamt 25 NF-κB assoziierten Zellkontakt-
proteinen zeigte keine signifikante Einschränkung der Transkription in ML120B
behandelten Tieren, die auf eine gestörte Barrierefunktion Hinweis geben könnte.
Ergebnisse
47
Abb.9 Phar mako log ische IKKβ- Inh ibit ion hat keinen s ig ni f ikanten Einf l uss auf d ie Transkr ipt ion von Zel lad häsionsproteinen Quantitative mRNA Analyse von NF-κB assoziierten Zelladhäsionsproteinen in Wildtyp Mäusen an Tag 10 nach 5 Tagen DSS mit anschließender pharmakologischer IKKβ Inhibition
Ergebnisse
48
Die zusätzliche morphologische Analyse der epithelialen Zellkontakte mittels
Elektronenmikroskopie zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den
beiden Gruppen. Auffällig war allerdings eine ausgeprägte Neutrophilie in ML120B
behandelten Versuchtieren.
Abb.10 Elektronenmikroskopische Darste l lu ng de r Morpho log ie de r Zel lkontakte u nd de r beobachteten Neut rophi l i e in ML120B behande lten Tie ren
Übersicht (a) und stärkere Vergrößerung (b) der Morphologie der Zellkontakte in ML120B behandelten Wildtypen an Tag 10 nach DSS Applikation. (c) und (d)Charakteristische Neutrophilie in ML120B behandelten Versuchstieren
Ergebnisse
49
4.2 Pharmakologische IKKβ-Inhibit ion in der Init iat ion der
Heilungsphase re sult ier t in einer verminder t en epithel ialen Expression
von NF-κB und STAT3 Zielgenen
Um den zu Grunde liegenden Mechanismus für die Störungen im epithelialen
Heilungsprozess in IKKβ-Inhibitor behandelten Tieren näher zu charakterisieren, wurde
RNA aus IEC an Tag 7 isoliert und einer Microarray-Analyse unterzogen. Da davon
auszugehen ist, dass die Inhibition von IKKβ und dem daraus resultierenden Phänotyp
eher mit einem Verlust an protektiven Funktionen, als mit einer gesteigerten Transkription
von destruktiven Faktoren assoziiert ist, konzentrierte sich die Analyse Microarrays auf die
Gene, die in ML120B behandelten Tieren um den Faktor 2,5 geringer exprimiert waren.
Circa 100 Gene erfüllten dieses Kriterium und über 30% dieser Gene stellten spezifische
NF-κB- Zielgene dar, die als Mediatoren an Entzündungsreaktionen beteiligt sind.
Ergebnisse
50
Abb.11 Ergebnisse de r Microar ray-Daten: Alphabetische Auflistung der Gene, die in ML120B behandelten Tieren im Vergleich zu Kontrollen um den Faktor ≥2,5 geringer exprimiert waren. Die in Bezug auf diese Arbeit relevanten NF-κB und Stat3 Zielgene wurden rot unterlegt.
Ergebnisse
51
Cxcl1, Cxcl2, Cxcl5, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl20, Ccl5, Ccl8, Icam1 und Pla2g2a stellen wichtige
NF-κB assoziierte Zytokine dar und sind entscheidend an der Regulation von
Entzündungsreaktionen beteiligt (Li et al., 2002; Wu and Chakravarti, 2007). Die
verminderte Transkription dieser Gene in mit IKKβ-Inhibitor behandelten Tieren konnte
durch Real-Time PCR validiert werden. Sie besitzen jedoch weitgehend
proinflammatorische Eigenschaften, so dass die beobachtete Exazerbation der Entzündung
dadurch nicht erklärt werden kann.
Abb.12 IKKβ- Inh ibit ion in de r f r ü hen He i l u ngsphase fü h rt zu r ve r minderten Transkr ipt ion vo n N F-κB Zie lgenen Bestimmung relativer mRNA-Level mittels Real-Time PCR in isolierten intestinalen Epithelzellen von Wildtyptieren, die nach Ende einer 5-tägigen DSS Applikation 2 Tage mit IKKβ-Inhibitor bzw. Vehikel behandelt wurden.
Ergebnisse
52
Neben dem NF-κB assoziierten Gencluster ließ sich in der Microarray-Analyse eine
weitere Gruppe von Genen abgrenzen, die durch die Transkriptionsfaktorgruppe
STAT/IRF kontrolliert werden und keine bekannten NF-κB Zielgene darstellen. Im
Vergleich zu Kontrolltieren war die Expression von folgenden Genen in ML120B
behandelten Versuchstieren um den Faktor 2,5 vermindert: Hspa1a, Tgtp, Ifitml, Igtp,
Ifi47, H2-Aa, H2-Ab1 und Socs3. Die Ergebnisse konnten in einer quantitativen mRNA
Analyse bestätigt werden. Besondere Bedeutung kommt Hspa1a zu. Dieses Gen, kodiert
für das induzierbare Hitze-Schock-Protein 70 und vermittelt zentrale zytoprotektive
Funktionen im Darmepithel während akut-ulzerierenden Entzündungsprozessen
(Tanaka et al., 2007).
Die quantitative Proteinbestimmung im Westernblot von Epithelzellextrakten zeigte
eine fast vollständige Abwesenheit von Hspa1a in IKKß-Inhibitor behandelten Tieren.
Unterstützend fand sich eine verminderte Stat3-Aktivierung in Epithelzellen des Kolons.
STAT3 reguliert wichtige Schritte bei der Transkription und Aktivierung von Hspa1a.
Unterschiede in der Aktivierung bzw. Phosphorylierung von STAT1 ließen sich nicht
nachweisen.
Um unspezifische off-target Effekte, bzw. einen direkten Effekt des IKKβ-Inhibitors auf
STAT3 auszuschließen, wurden Zellen aus der humanen Kolonkarzinom-Zelllinie SW480
mit ML120B vorbehandelt und anschließend mit IL-6, einem direkten Aktivator des
STAT3 Signalweges, stimuliert (Sugimoto, 2008). Im Vergleich mit Zellen, die lediglich
mit dem Vehikel vorbehandelt wurden, zeigte sich kein Unterschied in der STAT3-
Aktivierung.
Ergebnisse
53
Abb.13 IKKβ beeinf l usst d ie Transkr ipt ion von STAT3 Zie lgenen (a) Bestimmung relativer mRNA Expression von STAT3 Zielgenen in IEC mittels Real-Time. Vergleich der Versuchstiere an Tag 7 nach 5-tägigem DSS-Zyklus und anschließender Behandlung mit ML120B bzw. Vehikel für 2 weitere Tage. (b) Immunoblotanalyse zum Nachweis von HSP70-Expression und Stat3- Aktivierung in IEC; (c) Nachweis der Spezifität des IKKβ Inhibitors ML120B. STAT3-Aktivierung in ML120B behandelten SW480 Kolonkarzinomzellen nach IL-6 Stimulation (50ng/ml für 30 Min).
Ergebnisse
54
4.3 Inhibit ion der IKKβ-abhängigen NF-kB-Aktivierung verhindert eine
suffiziente Rekrutierung von inflammatorischen Zel l en und vermindert
die Expression der zytoprotektiven Interl eukine 11 und 22
Eine verminderte Synthese des protektiven Hitzeschock-Proteins Hspa1a in IKKβ-
defizienten Epithelzellen könnte auf eine verminderte Expression von STAT3-
aktivierenden Mediatoren zurückzuführen sein.
Um die Hypothese zu prüfen, ob IKKβ im Modell der DSS-induzierten Kolitis die
Expression von STAT3-Aktivatoren in der Kolonmukosa beeinflusst, wurde RNA aus der
Gesamtmukosa des Kolons isoliert. Der Isolation erfolgte an Tag 7 nach Induktion einer
akut-ulzerierenden Kolitis durch DSS und anschließender Behandlung des Versuchtieres
mit ML120B bzw. dem Vehikels über zwei Tage. Die quantitative Analyse der mRNA
Expression mittels RT-Realtime PCR beinhaltete neben Typ I und Typ II-Interferonen
auch die Zytokinfamilie IL-6 und IL-10. Die mRNA-Expression von IFN-α, IFN-ß, IFN-γ
und IL-10 zeigte in IKKβ-Inhibitor behandelten Versuchstieren keinen signifikanten
Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bemerkenswerterweise verhindert die
Inhibition von IKKβ durch ML120B jedoch die bei einer Kolitis zu erwartende gesteigerte
Transkription der zytoprotektiven Gene für Il-11, Il-22 und Il-6.
Ergebnisse
55
Abb.14 IKKβ- Inh ibit ion fü h rt z ur ve r minderten Transkr ipt ion de r zytoprotektiven I nter leukine 11 u nd 22 Bestimmung relativer mRNA Level von Typ I und Typ II Interferonen und der Zytokinfamilien IL-6 und IL-10
in der Gesamtmukosa des Kolons mittels Real-Time-PCR. Vergleich der Versuchstiere an Tag 7 nach 5-tägigem
DSS-Zyklus und anschließender Behandlung mit ML120B bzw. Vehikel.
Ergebnisse
56
Um zu prüfen, ob die fehlende Induktion von IL-11 und IL-22 direkt NF-κB abhängig
ist, wurden Kontroll- und IKKβ-Knock-Out Knochenmarkmakrophagen 4 Stunden mit
LPS stimuliert, um anschließend die mRNA-Level von Il-11 und Il-22 quantitativ
mittels Real-Time PCR zu analysieren. LPS-Stimulation führte sowohl in Wildtyp, als
auch in IKKβ defizienten Makrophagen zur Induktion von Il-11 und Il-22. Die
Induktion von Il-11 war in IKKβ KO Makrophagen sogar signifikant höher als in den
Wildtypen. NF-κB scheint damit in Makrophagen nicht direkt für die Induktion von Il-
11 und Il-22 notwendig zu sein. Die Expression von Il-6 und Il-10, beides bekannte NF-
κB-Zielgene, in IKKβ-defizienten Makrophagen wie erwartet signifikant vermindert.
Abb.15 Verminderte Expression von IL-11 u nd IL-22 in Knochenmark-makrophagen ist NF-κB-u nabhäng ig Bestimmung relativer mRNA- Level mittels Real-Time PCR in IKKβ WT und KO Knochenmarkmakrophagen vor und nach 4-stündiger LPS-Stimulation (100ng/µl)
Ergebnisse
57
Da eine direkte Regulation von Il-11 und Il-22 durch NF-κB ausgeschlossen werden
konnte, sollte untersucht werden, ob die fehlende Zytokinexpression in IKKβ-
defizienten Tieren Ausdruck einer gestörten Rekrutierung von immunkompetenten
Zellen ist. Diese Hypothese wurde durch die Analyse der Microarray-Daten unterstützt,
die eine deutlich eingeschränkte Expression verschiedenster Chemokine in IEC von
ML120B behandelten Versuchstieren zeigte. Da verschiedenste Zellpopulationen in der
Lage sind, diese Botenstoffe parakrin freizusetzen, wurde zunächst die Expression von
spezifischen Oberflächenmarkern immunkompetenter Zellen in der Gesamtmukosa
mittels Real-Time PCR analysiert.
Zu den getesteten Markern gehörten CD11c für dendritische Zellen, F4/80 als
Makrophagen-spezifisches Oberflächenmolekül, CD4 und CD8 als T-Zell-Marker, Gr1
für neutrophile Granulozyten, CD49 für natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Foxp3,
charakteristisch für regulatorische T-Zellen (T-reg-Zellen).
Ober flächenantigen Zell typ
CD11c
F4/80
CD4
CD8
GR1
CD49
Foxp3
Dendritische Zellen
Makrophgen
T-Zellen
T-Zellen
Neutrophile
Natürliche Killerzellen
Regulatorische T-Zellen
Abb.16 Zusammenstel l u ng vo n Oberf lächenmarker n immu nkompetenter Zel lt ypen
Ergebnisse
58
Die Auswertung der quantitativen mRNA Analyse zeigte, dass nach DSS-Applikation in
Inhibitor-behandelten Tieren die Expression der Oberflächenmarker für Makrophagen,
neutrophile Granulozyten und CD4-positive T-Zellen signifikant reduziert war. Die
Expression der Marker für NK Zellen, CD8- positive T-Zellen und regulatorische T-
Zellen war nicht beeinflusst. Gr-1, ein charakteristisches Oberflächenmolekül der
neutrophilen Granulozyten, war in ML120B behandelten Tieren erhöht. Diese
Beobachtung passt zu der in der Literatur bereits beschriebenen Entwicklung einer
Neutrophilie bei Applikation des Inhibitors (Greten et al., 2007; Nagashima et al., 2006)
und der im Zuge dieser Arbeit gemachten Beobachtung in der Elektronenmikroskopie
(siehe auch Abb. 9).
Ergebnisse
59
Abb.17 Phar mako log ische IKKβ- Inh ibit ion resu lt ie rt i n e ine r insu ff iz ienten Rekrut ie ru ng von inf la mmator ischen Zel len Bestimmung relativer mRNA Level von Oberflächenmarkern immunkompetenter Zellen in der Gesamtmukosa
des Kolons mittels Real-Time-PCR. Vergleich der Versuchstiere an Tag 7 nach 5-tägigem DSS-Zyklus und
anschließender Behandlung mit ML120B bzw. Vehikel.
Ergebnisse
60
4.4 Epithelspezifische Dele t ion von Ikkβ nach Init iat ion der Heilungs-
phase hat keinen Einfluss auf den Heilungsprozess
Um zu bestätigen, dass eine eingeschränkte Rekrutierung von Entzündungszellen in IKKβ-
defizienten Tieren die Initiation der Heilungsphase beeinträchtigt, wurde ein Mausmodell
etabliert, das eine induzierbare Ikkβ-Deletion in intestinalen Epithelzellen ermöglicht.
Diese Mäuse besitzen eine durch Tamoxifen induzierbare Cre-Recombinase, die unter der
Kontrolle des enterozyten-spezifischen Villin-Promoters steht. Nach Verkreuzung mit
Ikkβ F/F Tieren, führt die orale Gabe von Tamoxifen an 5 aufeinander folgenden Tagen zur
epithelspezifischen Deletion von Ikkβ. Die Expression von IKKβ in der Lamina propria
und allen anderen getesteten Geweben unterscheidet sich bei diesem Modell nicht von
Wildtyp-Tieren.
Abb.18 IKKβ Expression in Vil l in Cre ERT2 IkkβΔIEC Mäusen Immunoblot Analyse zum Nachweis der selektiven Ablation von IKKβ in intestinalen Epithelzellen im
Duodenum, Jejunum, Ileum, Kolon in villin Cre ERT2 IkkβΔIEC Versuchstieren nach Induktion der Cre-
Rekombinase durch 1mg Tamoxifen (TAM) für 5 Tage.
Ergebnisse
61
In den oben beschriebenen Villin Cre ERT2 IkkβΔIEC Mäusen wurde nach 5-tägiger
Applikation von DSS im Trinkwasser an Tag 10 durch die Gabe von Tamoxifen eine
epithelspezifische Deletion von Ikkβ induziert. Mit Beginn der Deletion an Tag 10 war die
Initiation der Heilungsphase bereits abgeschlossen. Anders als in den konstitutiven IkkβΔIEC
Tieren zeigten diese Mäuse in der histologischen Analyse an Tag 21 keinen signifikanten
Unterschied im Ergebnis des Heilungsprozesses bzw. im Schweregrad der Entzündung.
Abb.19 Delet ion von Ikkβ i n IEC nach I n it iat ion de r He i l u ngsphase hat keinen Einf luss auf den He i l u ngsprozess (a)Schematischer Überblick der DSS und Tamoxifen Applikation in Villin-Cre-ERT2/IkkβF/F Mäusen. (b)histologische Analyse des Schweregrades der Entzündung und der Größe der Ulzerationen (c) 21 Tage nach Beginn der DSS-Gabe in Villin-Cre-ERT2/IkkβF/F Tieren.
Ergebnisse
62
Im Zusammenhang mit den Ergebnissen aus den anderen Mausmodellen zeigt dieser
Versuch, dass die für die Initiation der Heilungsphase wichtige Rekrutierung von
Immunzellen bereits in der frühen Phase der Entzündung stattgefunden haben muss. Die
für den Verlauf der Heilungsphase wichtige parakrine Freisetzung von IL-11 und IL-22
durch immunkompetente Zellen und die damit assoziierte Aktivierung epithelialer
Schutzmechanismen via HSP70 verläuft dann im Gegensatz zur Rekrutierung der
entsprechenden Zelltypen NF-κB unabhängig.
Ergebnisse
63
4.5 Inhibit ion der IKKβ-abhängigen NF-κB-Aktivierung in intest inalen
Epithel zel len hat keinen Einfluss auf den Verlauf einer T-Zel l -
assoziier t en chronischen Kolit is
Um die Funktion von IKKβ im Rahmen von nicht-ulzerierenden Entzündungsprozessen
im Gastrointestinaltrakt zu untersuchen wurde ein T-Zell-assoziiertes Kolitismodell
verwendet. IL-10 defiziente Mäuse entwickeln über Monate eine spontane nicht-
ulzerierende Enterokolitis, die von einer massiven Infiltration der Schleimhaut mit
Lymphozyten, aktivierten Makrophagen und neutrophilen Granulozyten begleitet wird
(Kuhn et al., 1993). Die Analyse der entzündlich veränderten Darmschleimhaut mittels
EMSA zeigte sowohl in Epithelzellen, als auch in der Lamina propria der
Kolonschleimhaut eine deutliche NF-κB-Aktivierung .
Abb.20 Spontane Enterokol it is in IL-10 def iz ienten Mäusen ist m it e ine r geste igerten NF-κB-Akt iv ie r u ng in Epithe lzel len u nd de r Lamina propr ia assozi ie rt Analyse der NF-κB DNA-Bindeaktivität in intestinalen Epithelzellen, Lamina propria und Gesamtmukosa des Kolons von Il-10-/-Mäusen mit und ohne klinische Zeichen einer Kolitis
Ergebnisse
64
Um festzustellen, inwiefern epithelspezifische NF-κB-Aktivierung auch im Rahmen
einer T-Zell-assoziierten Kolitis Einfluss auf den Verlauf der Entzündungsreaktion
nimmt, wurden Il-10-/- Mäuse mit konditionalen Ikkβ ΔIEC-Mäusen verpaart. Als
Kontrollen dienten IL-10-defiziente Mäuse mit gefloxten Ikkβ-Allelen (Ikk F/F) und
keine Cre-Rekombinase exprimieren. Im Vergleich zu dieser Kontrollgruppe zeigten Il-
10-/-/Ikkβ ΔIEC Tiere keinen signifikanten Unterschied im klinischen Verlauf der Kolitis.
Unabhängig vom Genotyp verloren die Tiere circa 20% ihres maximalen
Körpergewichts im gleichen Zeitintervall. Auch der Gewichtsverlust in den letzten 2
Wochen vor Krankheitsbeginn -definiert durch einen Gewichtsverlust von 20% in
Bezug auf das Maximalgewicht- war nicht signifikant verschieden. Die histologische
Analyse zeigte ebenfalls keine relevanten Unterschiede in der Ausprägung bzw. im
Schweregrad der Entzündung im Kolon. Die beobachtete vermehrte NF-κB-Aktivierung
in den Epithelzellen scheint damit das Modell nicht maßgeblich zu beeinflussen.
Ergebnisse
65
Abb.21 Epithe l ia le I nh ibit ion de r IKKβ-abhäng igen N F-κB-Aktiv ie r u ng hat keinen Einf l uss auf den Ver lauf e ine r T-Zel l-assozi ie rten Ko l it is (a)Kaplan Meier-Überlebenskurven von Ikk F/F bzw. Ikkβ ΔIEC Versuchstieren auf einem IL-10 defizienten Hintergrund; (b)Wochen bis zur Tötung der Versuchstiere nach maximalen Gewichtsverlust; (c) Gewichtsverlust in g während der letzten 2 Wochen vor Krankheitsbeginn - definiert durch Gewichtsverlust von 20% bezogen auf das Maximalgewicht der Maus); (d)Repräsentative H&E Färbung von IkkβF/F /Il-10-/- und IkkβIEC/ Il-10 -/-Mäusen; (e)Analyse der Kryptentiefe und Anzahl der infiltrierenden Zellen ( f).
Ergebnisse
66
4.6 Verlust von IKKβ in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten
mildert den Verlauf und verlängert das Überleben im T-Zel l-assoz iiert en
Entzündungsprozessen
Um zu prüfen, ob die beobachtete gesteigerte NF-κB-Aktivität auf eine NF-κB-
Aktivierung in inflammatorischen Zellen in der Lamina propria zurückzuführen ist und
diese so Einfluss auf den Verlauf der Kolitis nehmen, wurden IL-10-defiziente Mäuse
mit IkkβΔmye Mäusen verkreuzt. In IkkβΔmye Mäusen ist Ikkβ selektiv in Zellen der
myeloiden Zellreihe deletiert. Die Abwesenheit von IKKβ in Makrophagen und
neutrophilen Granulozyten in IL-10 defizienten Tieren führte zu einer signifikanten
Verlängerung des Überlebens. Die spezifische Inhibition der klassischen IKKβ-
abhängigen NF-κB-Aktivierung in inflammatorischen Zellen im Rahmen von T-Zell-
assoziierten chronischen Entzündungsprozessen im Gastrointestinaltrakt hat damit im
Gegensatz zur epithelialen Inhibition einen deutlichen antiinflammatorischen Effekt.
Abb.22 Ablat ion von IKKβ i n mye lo iden Zel len ve r länge rt das Über leben im Rah men e ine r T-Zel l-assozi ie rten Ko l it is Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Ikkβ Δmye verglichen mit IkkβF/F Versuchstieren
Ergebnisse
67
In der Literatur ist eine Vielzahl von inflammatorischen Zytokinen beschrieben, die im
Verlauf einer chronischen Kolitis eine wichtige Rolle spielen und den chronischen
Entzündungsprozess aufrechterhalten. Zu den wichtigsten gehören neben TNF-α und
IL-1, IL-6, IL-12 und IL-23 (Baumgart and Carding, 2007; Rogler et al., 1998). Um zu
klären, ob die Deletion von IKKβ in myeloiden Zellen Einfluss auf die Transkription
diverser Zytokine hat, wurden Knochenmarkmakrophagen aus IL-10 defizienten Tieren
isoliert und anschließend mit LPS stimuliert. Daraufhin wurde mittels Real-Time PCR
die mRNA Expression für Tnf-α, Il-1β, Il-6, Icam-1, Il12-p40 und Il23-p19 untersucht.
Während die alleinige Stimulation mit LPS zu einer deutlichen Induktion der
untersuchten Zytokine führte, blieb diese bei vorheriger Inhibition von IKKβ durch
ML120B aus.
Abb.23 IKKβ- Inh ibit ion fü h rt z ur red uz ie rten Transkr ipt ion vo n inf la mmator ischen Zytokinen in IL-10 def iz ien ten Knochenmarkmakrophagen Bestimmung relativer mRNA Level mittels Real-Time PCR in mit LPS (100ng/ml) behandelten IL-10-defizienten Knochenmarkmakrophagen mit und ohne ML120B-Stimulation (30µM) zu den angegebenen Zeitpunkten.
Ergebnisse
68
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass IKKβ im Rahmen einer chemisch
induzierten akuten Kolitis, die mit einem massiven epithelialen Schaden assoziiert ist,
im Epithel neben der Induktion von anti-apoptotischen Genen, über die Rekrutierung
von Immunkompetenten Zellen wichtige epitheliale Schutzmechanismen vermittelt. Im
Gegensatz dazu besitzt IKKβ bei nicht-ulzerierenden T-Zell-assoziierten
Entzündungsprozessen proinflammatorischen Charakter. Dieser Effekt ist von der
IKKβ-Aktivität in myeloischen Zellen abhängig. Hier kommt es zur NF-κB-abhängig
zur vermehrten Transkription von proinflammatorischen Zytokinen, die den
Entzündungsprozess aufrechterhalten. Epitheliale NF-κB-Aktivität beeinflusst hingegen
den Verlauf und die Ausprägung der Erkrankung nicht.
Diskussion
69
5 Diskussion
Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen den protektiven Charakter epithelialer NF-
κB-Aktivierung im Rahmen von akut ulzerierenden Entzündungsprozessen im
Gastrointestinaltrakt. Außerdem konnte die Hypothese eines parakrinen Modells
bestätigt werden, indem die pharmakologische Inhibition von IKKβ die
Zytokinexpression in Epithelzellen signifikant mindert und damit eine suffiziente
Rekrutierung von inflammatorischen Zellen verhindert wird. Die Abwesenheit dieser
Zellen resultiert einer eingeschränkten parakrinen Freisetzung von IL-11 und IL-22,
beides Interleukine, die für eine epitheliale STAT3-abhängige Induktion des
zytoprotektiv wirkenden Hitze Schock Proteins HSP70 entscheidend sind.
Abb.24 Schematische Darste l lu ng des parakr inen Mode l ls
Diskussion
70
Des weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass bei chronischen nicht-
ulzerierenden Entzündungsprozessen, die im Gegensatz zu akuten Verlaufsformen nicht
mit einer exzessiven Schädigung der Mukosa einhergehen, die proinflammatorischen
Eigenschaften NF-κBs in myeloischen Zellen dominieren. Die Inhibition der IKKβ-
abhängigen NF-κB-Aktivierung in myeloischen Zellen wirkte durch verminderte
Transkription von proinflammtorischen Zytokinen der chronischen
Entzündungsreaktion entgegen und verlängerte das Überleben der Versuchstiere. Durch
eine zellspezifische und die Entzündungsphase berücksichtigende Analyse der NF-κB
Funktion ist es gelungen, die scheinbar widersprüchlichen Daten im Rahmen chronisch
entzündlicher Darmerkrankungen zu relativieren (MacMaster et al., 2003; Neurath et
al., 1996).
Greten et al. beobachteten, dass es durch den epithelspezifischen Verlust von IKKβ
während der akuten Phase einer Kolitis zur Exazerbation der Entzündungsreaktion
kommt (Greten et al., 2004). Ebenso ist die epithelspezifische Deletion von IKKγ in der
Maus mit einer schweren, sich spontan entwickelnden Enterokolitis assoziiert. Die
Ablation der klassischen NF-κB Aktivierung führte in diesem Modell zu vermehrter
Apoptose von intestinalen Epithelzellen und einer signifikant eingeschränkten
Expression von antimikrobiellen Peptiden. Im Zusammenhang mit einem verstärkten
epithelialen Defekt konnte auch eine vermehrte Translokation von Bakterien in die
Mukosa beobachtet werden. Die im Anfangsstadium durch Makrophagen und
Granulozyten dominierte Entzündungsreaktion wird im Verlauf der Erkrankung mehr
und mehr durch das Auftreten von T-Zellen charakterisiert. Neben der Aktivierung von
Toll-like-Rezeptoren durch bakterielle Membranbestandteile konnte auch eine
gesteigerte Sensibilität der Epithelzellen gegenüber TNF-α als Ursache für die
Entstehung der Kolitis in diesem Modell identifiziert werden (Nenci et al., 2007).
Beide Publikationen unterstreichen den protektiven Effekt einer suffizienten klassischen
NF-κB-Aktivierung während der Entstehungsphase einer Kolitis auf epithelialer Ebene.
NF-κB vermittelt hier seine zytoprotektive Wirkung durch eine gesteigerte
Transkription von anti-apoptotischen Genen wie z.B. Bcl-x. Über diesen bereits
beschriebenen Mechanismus hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden,
Diskussion
71
dass NF-κB in Epithelzellen die Expression von Zytokinen reguliert, die für die
Rekrutierung von inflammatorischen Zellen, wie z.B. Makrophagen und T-Zellen
essentiell ist. Es ist bekannt, dass diese Zellen speziell im Rahmen einer chemisch
induzierten akuten Kolitis wichtige antiinflammatorische Aufgaben übernehmen, indem
sie zytoprotektive Zytokine, wie z.B. IL-11 und IL-22, freisetzen. Der zytoprotektive
Effekt dieser Interleukine im Zusammenhang akuter Entzündungsprozesse im Darm
konnte bereits durch die direkte Gabe oder durch lokale Genüberexpression in vivo
demonstriert werden (Qualls et al., 2006; Sugimoto et al., 2008).
Peterson et al. zeigten, dass humanes rekombinantes Interleukin 11 die klinischen
Symptome einer Kolitis im Tiermodel für chronisch entzündliche Darmerkrankungen
signifikant mindert (Peterson et al., 1998). Real-Time PCR-Analysen demonstrierten,
dass es durch die lokale Applikation des Interleukins zu einer signifikanten Suppression
der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ kommt. Ferner
kontrolliert IL-11 die Aktivität der Myeloperoxidase, ein Enzym in neutrophilen
Granulozyten, dass bei der Regulation und Terminierung von Entzündungsreaktionen
eine bedeutende Rolle spielt. Neben seiner antiinflammatorischen Funktion fördert IL-
11 die Proliferation der Epithelzellen in der Krypte und fördert dadurch die
Regeneration der Mukosa (Sugimoto, 2008).
Andere Studien haben gezeigt, dass Zytokine neben ihren immunmodulatorischen
Effekten auch direkt gastrointestinale Funktionen, wie z.B. den intestinalen Wasser- und
Ionentransport beeinflussen. So fördern antiinflammatorische Zytokine, wie z.B. IL-10
und IL-4 die intestinale Absorption von Natrium und Chlorid (Madsen et al., 1997;
Zund et al., 1996), während proinflammatorischen Zytokine wie IL-1 und IL-3, die
Chloridsekretion stimulieren (Chiossone et al., 1990). In einem Rattenmodell für
chronisch entzündliche Darmerkrankungen konnte unterstützend gezeigt werden, dass
die Wasser- und Elektrolytabsorption im Gastrointestinaltrakt IL-11 abhängig ist. Die
Gabe von IL-11 führte zur Normalisierung der Stuhlkonsistenz und verminderte den
Gewichtsverlust der Tiere signifikant (Keith et al., 1994).
Diskussion
72
Elektrolytverschiebungen stellen auch beim Menschen einen zentralen Aspekt bei
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen dar. Erkrankte Personen leiden unter
schwerer Diarrhö und konsekutiver Malabsorption. Der assoziierte Gewichtsverlust
führt schnell zu einer starken Verschlechterung des Allgemeinzustandes und reduziert
damit entscheidend die Lebensqualität des Patienten deutlich.
Neben IL-11 ist auch die Expression von IL-22 im Rahmen von entzündlichen
Prozessen signifikant gesteigert. Patienten, die unter chronisch entzündlichen
Darmkrankheiten leiden, weisen deutlich erhöhte IL-22-Level in der intestinalen
Schleimhaut auf (Andoh et al., 2005; Brand et al., 2006). Die genaue Funktion von IL-
22 im Zuge von akuten und chronischen Entzündungen im Gastrointestinaltrakt bleibt
allerdings noch unklar. Der IL-22-Rezeptor ließ sich bisher nur auf Zellen des
angeborenen Immunsystems nachweisen. Zellen des erworbenen Immunsystems, wie
z.B. T- und B-Lymphozyten, exprimieren den Rezeptor nicht. Interessanterweise besitzt
IL-22 im Zuge von Entzündungsreaktionen in Abhängigkeit des Gewebes sowohl pro-
als auch antiinflammatorischen Charakter. 2008 demonstrierten Sugimoto et al, dass die
lokale Mikroinjektion des IL-22-Gens in entzündlich veränderte Darmareale mit einem
Rückgang der Entzündungsreaktion assoziiert war.
In einem anderen Mausmodell für eine TH2-mediierte Kolitis führte die, durch
Mikroinjektion induzierte, Überexpression des IL-22 Gens in Epithelzellen des Kolons
zu einer gesteigerten STAT3-Aktivierung. Die darauf folgende STAT3-abhängig
Expression von Mukosa-assoziierten Molekülen war mit einer deutlich schnelleren
Regeneration mukusproduzierender Becherzellen assoziiert. Außerdem wiesen IL-22
behandelte Tiere eine gesteigerte Mukusproduktion auf, die für eine intakte
Barrierefunktion essentiell ist und dessen Fehlen als ein wichtiger Aspekt bei der
Pathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen diskutiert wird.
Unterstützend wurde gezeigt, dass bei Überexpression des IL-22-bindenden Proteins die
Regeneration der Becherzellen in der Heilungsphase einer durch DSS induzierten Kolitis
deutlich eingeschränkt ist (Sugimoto et al., 2008). Die im Zuge dieser Arbeit
angefertigte Analyse zur Zytokinexpression und deren Wirkung auf das Epithel während
der unterschiedlichen Entzündungsphasen wies einschlägige Parallelen zu den oben
Diskussion
73
angeführten Ergebnissen auf. Sowohl die Expression von IL-11 als auch von IL-22 war in
Gesamtmukosaextrakten signifikant vermindert und zudem mit einem nahezu
kompletten Verlust des Hitze-Schock-Proteins 70 in Epithelzellen assoziiert.
Hitze-Schock-Proteine übernehmen in eukaryotischen Zellen elementare Aufgaben. Sie
arbeiten jeweils mit ihrem eigenen Satz an assoziierten Proteinen, die ihnen helfen,
andere Proteine zu falten bzw. entfalten. Die korrekte Konformation und damit auch
die Funktion eines Proteins werden dabei durch eine spezielle Klasse von Proteinen, die
man als molekulare Chaperone bezeichnet, ermöglicht. Chaperone sind feste
Bestandteile der Hitze-Shock-Proteine, welche in großer Anzahl synthetisiert werden,
wenn eine Zelle thermischem oder oxidativem Stress ausgesetzt wird. Dieser Prozess
wirkt folgeschweren Fehlfaltungen von Proteinen entgegen und verhindert somit ihren
proteasomalen Abbau (Bukau et al., 2000; Hartl and Hayer-Hartl, 2002; Mayer and
Bukau, 2005).
HSP70 interagiert mit einer Vielzahl von zentralen Regulatoren von diversen
Signaltransduktionswegen, die wichtige Funktionen der Zellhomöostase wie z.B.
Proliferation, Differenzierung, und Apoptose kontrollieren (Bukau and Horwich, 1998).
So wurde zum Beispiel gezeigt, dass HSP70 via Modulation von Caspasen Apoptose
induzierende Signale inhibieren kann. Außerdem soll die Überexpression von HSP70 zu
einer Resistenz gegenüber proapoptotischen Zytokinen und diversen
Chemotherapeutika führen, während die Suppression von HSP70 durch Antisense-
Technologie die Sensitivität gegenüber den oben genannten Stimuli erhöht (Jaattela,
1999; Jaattela et al., 1998; Mayer, 2005). Diese Beobachtungen stehen in Beziehung zu
diversen pathologischen Prozessen in der Onkogenese. In verschiedensten Tumoren
lassen sich erhöhte HSP70-Level nachweisen, die mit Malignität und Therapieresistenz
des Tumors korrelieren. Niedrige Konzentrationen von HSP70 unterstützen hingegen
Differenzierung und Apoptoseinduktion in Tumorzellen (Nylandsted et al., 2000).
Diskussion
74
Neben seiner bedeutenden Funktion in Tumoren soll HSP70 ebenfalls ein großes
zytoprotektives Potential in intestinalen Epithelzellen besitzen. Es existieren
einschlägige Daten, dass die transgene Expression von HSP70in intestinalen
Epithelzellen einer DSS-induzierten Kolitis entgegen wirkt (Laubitz et al., 2006; Sikora
and Grzesiuk, 2007).
Hspa1a kodiert für HSP70 und steht unter Kontrolle des Transkriptionsfaktors STAT3
(Stephanou and Latchman, 1999). Der Promotor von Hspa1a besitzt keine NF-κB-
Bindungsstellen und auch die Aktivierung von NF-κB führt zu keiner Induktion von
HSP-70, so dass nicht von einer direkten Regulation durch NF-κB ausgegangen werden
kann. Wie in dieser Arbeit demonstriert werden konnte, kommt es durch epitheliale
NF-κB-abhängige Zytokinfreisetzung zur Rekrutierung von myeloischen Zellen und T-
Lymphozyten, die wiederum IL-11 und IL-22 in hohem Maße sezernieren können.
Sowohl IL-11 als auch IL-22 führen via STAT3 zur Induktion von HSP70(Nagalakshmi
et al., 2004; Sugimoto, 2008). Die Rekrutierung von immunkompetenten Zellen ist NF-
κB-abhängig und damit essentiell für die Induktion des zytoprotektiven HSP70 in
intestinalen Epithelzellen.
Neue Untersuchungen über Funktion von STAT3 im Zusammenhang mit Kolitis
assoziierter Tumorentstehung unterstreichen diesen zytoprotektiven Effekt des
Transkriptionsfaktors. Enterozytenspezifische Deletion von Stat3 führt in DSS
stimulierten Mäusen zu einer deutlich schwereren Ausprägung der Kolitis. Es konnte
gezeigt werden, dass STAT3-Aktivierung in Enterozyten vor Apoptoseinduktion
schützen kann und somit die Wundheilung maßgeblich unterstützt. Während
Wildtyptiere nach Absetzen des DSS schnell wieder an Gewicht zunehmen, erholen sich
STAT3 defiziente Mutanten signifikant langsamer (Bollrath et al., 2009).
STAT3 wurde ebenfalls als ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der
erworbenen Immunantwort identifiziert und nimmt damit eine entscheidende Funktion
bei der Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ein. Makrophagen
in der Darmwand unterliegen einer ständigen Stimulation durch bakterielle Antigene.
Die selektive Inhibition von STAT3 in Makrophagen provoziert eine chronische Kolitis
im Darm der Maus. In STAT3 defizienten Mutanten befinden sich die Makrophagen
Diskussion
75
und neutrophile Granulozyten in einem konstitutiv aktiven Status und sezernieren als
Antwort auf inflammatorische Stimuli großen Mengen an proinflammatorischen
Zytokinen wie z.B. TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 und IL-18 (Takeda et al., 1999).
Von entscheidender Bedeutung ist hier das Zytokin IL-10, das als Gegenspieler der
Entzündung agiert. Unter physiologischen Verhältnissen wird IL-10 kontinuierlich aus
Makrophagen und neutrophilen Granulozyten der Darmwand auto- bzw. parakrine
freigesetzt und hemmt so durch Aktivierung von STAT3 eine überschießende Sekretion
von proinflammatorischen Zytokinen aus inflammatorischen Zellen. Dadurch vermittelt
es wichtige antiinflammatorische Effekte und hält die Entzündungsreaktion im
Gleichgewicht. IL-10 defiziente Mutanten besitzen diese Möglichkeit der
Gegenregulation nicht, so dass entzündlich veränderte Areale durch eine hohe
Konzentration von proinflammatorischen Zytokine gekennzeichnet sind. Ferner kommt
es bei IL-10 Mutanten zur verstärkten Infiltration von T-Helferzellen in die Darmwand.
Diese T-Zellpopulation wird von TH1 Zellen dominiert, die massiv TNF-α
produzieren können. TNF-α stimuliert wiederum Makrophagen, die via Sekretion von
IL-12 und IL-18 die Rekrutierung von weiteren TH-1 Zellen fördern und so die
Entzündungsreaktion aufrecht erhalten (Takeda et al., 1999).
Auf der anderen Seite fördert STAT3 das Überleben von autoreaktiven T-Zellen. Diese
Zellen besitzen bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen eine zentrale Position,
indem sie ohne adäquaten Reiz inflammatorische Zytokine sezernieren und so eine
Immunantwort auslösen. Die zum Teil gegensätzlichen Funktionen von STAT3 in den
verschiedenen Zellpopulation machen therapeutische Ansätze derzeit sehr schwierig
(Atreya et al., 2000; Sugimoto, 2008).
Diskussion
76
Im Gegensatz zur akuten ulzerierenden Kolitis beeinflusst die epitheliale IKKβ-
Expression den Verlauf und die Ausprägung einer chronischen Kolitis nur unwesentlich.
Der Motor der chronischen Kolitis ist im Vergleich zur akuten Kolitis nicht der direkte
Epithelschaden, sondern eine immunologische Dysregulation. In IL-10-defizienten
Versuchstieren unterhält ein Ungleichgewicht zwischen entzündungsprovozierenden T-
Effektor-Zellen und entzündungshemmenden regulatorischen T-Zellen im die
Entzündung (Kuhn et al., 1993). Epithelialer Schaden ist kein zentrales
Charakteristikum und tritt erst spät im Verlauf als Folge der Einwanderung von
inflammatorischen Zellen auf und ist dann eher durch epitheliale Hyperproliferation als
durch die typischen Ulzerationen gekennzeichnet (Rennick and Fort, 2000). Zwar
konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass es zu einer vermehrten NF-κB-
Aktivierung im Epithel kommt, diese nimmt jedoch keinen Einfluss auf den Verlauf der
Erkrankung nimmt.
Im Gegensatz dazu verlängert die Deletion von Ikkβ in Makrophagen und neutrophilen
Granulozyten das Überleben der Maus im Rahmen einer T-Zell-assoziierten
chronischen Kolitis. Es konnte gezeigt werden, dass NF-κB in myeloiden Zellen in
diesem Szenario verstärkt proinflammatorische Eigenschaften vermittelt und so
entscheidend an der Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses beteiligt ist.
Die Daten knüpfen damit an zuvor veröffentliche Ergebnisse anderer Autoren an und
erklären den antiinflammatorischen Effekt von anti-sense Oligonukleotiden gegen NF-
κB/RelA in anderen T-Zell-assoziierten Kolitismodellen. Neurath et al benutzten neben
IL-10-defizienten Versuchstieren ein induzierbares 2,4,6,-trinitrobenzene sulfonic acid
(TNBS) Modell, das stark abhängig von Hintergrund bzw. Genotyp der Maus, aber
ebenfalls T-Zell-assoziiert ist. In beiden Modellen konnte eine starke NF-κB/p65-
Aktivierung beobachtet werden. Lokale Administration von p65 antisense
Oligonukleotiden führte zum Rückgang der klinischen und histologischen Merkmale der
Kolitis und war effektiver als eine Glukokortikoidtherapie (Neurath et al., 1996).
Es wird deutlich, dass der Transkriptionsfaktor NF-κB einen essentiellen und zugleich
sehr potenten Modulator von Entzündungsreaktionen darstellt. Neben einer Vielzahl
von pro- und antiinflammatorischen Chemokinen und Zytokinen stehen auch diverse
Diskussion
77
anti-apoptotisch wirksame Proteine unter dem direkten Einfluss NF-κBs (Karin and
Lin, 2002). Gerade diese Tatsache macht die Signalkaskade für pharmakologische
Therapieansätze äußerst attraktiv. Unter Berücksichtigung früherer Publikationen und
der hier neu gewonnenen Erkenntnisse zeigte sich, dass die dominierende Funktion des
Transkriptionsfaktors hochgradig zellspezifisch und auch maßgeblich vom zugrunde
liegenden schädigenden Mechanismus abhängig ist. So besitzt NF-κB in intestinalen
Epithelzellen im Zuge einer akuten ulzerierenden Kolitis eine Schlüsselfunktion bei der
Vermittlung von Zellüberleben. Außerdem reguliert NF-κB die Expression von
wichtigen Chemokinen, die zur Rekrutierung inflammatorischen Zellen führen.
Während diese Zellen einerseits für proinflammatorische Zytokinexpression
verantwortlich sind, aktivieren sie auf der anderen Seite über die Sekretion von IL-11
und IL-22 entscheidende epitheliale Schutzmechanismen. Bei chronischen
Entzündungsprozessen, die auf einer Dysfunktion des Immunsystems beruhen und T-
Zell-assoziiert sind, dominieren hingegen die proinflammatorischen Effekte der IKKβ-
abhängigen NF-κB-Aktivierung in myeloischen Zellen.
Die Anwendung von pharmakologischen IKKβ-Inhibitoren in der akuten Phase der
Kolitis, so wie sie von MacMaster und Neurath vorgeschlagen wird, erscheint in
Anbetracht der hier gewonnen Ergebnisse absolut kontraindiziert, da sich das akute
Krankheitsbild durch Suppression der klassischen NF-κB-Akivierung deutlich
verschlechtern würde. MacMaster et al verwendeten bei ihren Studien allerdings einen
anderen IKK-Inhibitor (BMS-345541). Dieser bindet im allosterischen Zentrum von
IKKβ und blockiert nicht kompetitiv die ATP-Bindungsstelle. Eine spezifische
Inhibition der NF-κB Aktivierung durch den Inhibitor konnte in der Arbeit auch nicht
nachgewiesen werden, so dass der beobachtete Effekt nicht sicher auf eine NF-κB-
Inhibition zurückgeführt werden kann. Die Möglichkeit so genannter off-target-Effekte
ist daher nicht sicher auszuschließen (MacMaster et al., 2003).
Auch die protektiven Eigenschaften von p65 antisense Oligonukleotiden, die bei
Neurath et al. zu einem Rückgang der Entzündungsreaktion führten, konnten in dieser
Arbeit nicht bestätigt werden. Epitheliale Deletion von p65/RelA in der akuten Phase der
Entzündung verstärkte im DSS-Modell die Kolitis, so dass die von Neurath
Diskussion
78
beobachteten Effekte gegenläufiger p65 Oligonukleotide nicht auf einer Inhibition NF-
κBs im Epithel beruhen können (Neurath et al., 1996).
Trotz intensiver Bemühungen in der Grundlagenforschung zur Entstehung und
Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gibt es bisher keinen
überzeugenden kausalen Therapieansatz, so dass sich heutige Therapiekonzepte auf die
unspezifische Suppression des Immunsystems und der Entzündungsreaktion
konzentrieren. Sulfasalazin und Glukokortikoide sind zwei klinisch häufig verwendete
Substanzen. Beide Pharmaka interagieren mit dem NF-κB Signalweg und sind in der
Lage, diesen auf unterschiedliche Art und Weise zu hemmen. Sulfasalzin besitzt in der
NF-κB Signalkaskade mehrere Angriffspunkte. Es ist beschrieben, dass Sulfasalazin die
Translokation von RelA/p65 in den Nukleolus blockiert, die Degradation und
Phosphorylierung von IκBα hemmt und außerdem direkten Einfluss auf die
Transkription von NF-κB Zielgenen besitzt (Wahl et al., 1998). Glukokortikoide
finden klinisch ebenfalls breite Anwendung. Im Gegensatz zu Sulfasalazin beeinflussen
diese die Transkription von IκBα, was in einer Vergrößerung des Pools des Inhibitors
resultiert und so die transkriptionelle Aktivität NF-κBs im Nukleolus einschränkt
(Auphan et al., 1995; Scheinman et al., 1995). Beide Substanzen besitzen leider auch
zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen, da sie neben der Inhibition von NF-κB auch
viele weitere zelluläre Funktionen beeinflussen (Domenech, 2006). Gerade diese
Unspezifität und die Interaktion mit anderen Signalwegen scheint aber letztendlich auch
die guten klinischen Ergebnisse herbeizuführen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass NF-κB in Abhängigkeit von Zelltyp sowohl
pro- als auch antiinflammatorische Eigenschaften im Rahmen von
Entzündungsprozessen im Gastrointestinaltrakt besitzen kann. Auch die Ausprägung der
Entzündungsreaktion -ulzerierend versus nicht ulzerierend- und der Zeitpunkt der NF-
κB-Inhibition spielen dabei eine entscheidende Rolle. Bei den meisten entzündlich
geprägten Krankheitsbildern treten akute und chronische Stadien der Entzündung
nebeneinander auf. Die Indikationsstellung für eine spezifische IKKβ/NF-κB-Inhibition
gestaltet sich damit als äußerst schwierig. Während Patienten mit chronischen, nicht-
ulzerierenden Verlaufsformen, bei denen eine Dysfunktion des Immunsystems im
Diskussion
79
Vordergrund der Erkrankung steht, durchaus von einer spezifischen IKKβ-abhängigen
NF-κB-Inhibition profitieren könnten, würde eine Inhibition bei Patienten im akuten
Schub zu einer Exazerbation der Kolitis führen. Ein akuter epithelialer Schaden müsste
vor Einleitung der Therapie daher sicher ausgeschlossen sein und durch eine begleitende
Diagnostik während der Therapie sichergestellt werden.
In Kombination mit einer differenzierten Diagnostik, oder eines spezifischen klinischen
Markers zur Feststellung des beim Patienten vorherrschenden Entzündungsmusters,
wäre eine präventive Anwendung es Inhibitors zur Remissionserhaltung bei Patienten
mit chronisch stabilen Verlaufsformen durchaus denkbar. Speziell bei Patienten, die
hohen Dosen von Glukokortikoiden zur Remissionserhaltung benötigen und unter
therapielimitierenden Nebenwirkungen leiden, scheint die Anwendung eines spezifischen
NF-κB-Inhibitors sinnvoll.
Zusammenfassung
80
6 Zusammenfassung
Der Transkriptionsfaktor NF-κB reguliert eine Vielzahl von Genen, die im Zuge von
Immun- und Entzündungsprozessen Schlüsselpositionen besetzen. Viele immunologische
und rheumatologische Krankheitsbilder basieren auf einer inadäquaten Immunantwort und
sind mit einer gesteigerten NF-κB-Aktivierung assoziiert. Der potentielle Nutzen einer
spezifischen pharmakologischen NF-κB/IKKβ-Inhibition wird aufgrund der sowohl pro- als
auch antiinflammatorischen Eigenschaften des Transkriptionsfaktors kontrovers diskutiert.
In dieser Arbeit kann in verschiedenen murinen Modellen für chronisch entzündliche
Darmerkrankungen gezeigt werden, dass die spezifische Inhibition von NF-κB/IKKβ bei
akuten Entzündungsprozessen zu einer Exazerbation der Entzündung führt, während bei
chronischen Verlaufsformen ein Rückgang der Entzündung zu beobachten ist.
Im Rahmen einer akuten Kolitis reagieren Epithelzellen neben einer NF-κB-vermittelten
Transkription von anti-apoptotischen Genen mit einer gesteigerten Freisetzung von
Entzündungsmediatoren, welche die Rekrutierung von inflammatorischen Zellen initiieren.
Diese rekrutierten Zellen sezernieren wichtige zytoprotektive Zytokine (u.a. IL-11 und
IL-22), die wiederum parakrin in intestinalen Epithelzellen über die Aktivierung des
Transkriptionsfaktors STAT3 eine suffiziente Regeneration der Darmmukosa fördern.
Im Gegensatz zu akuten Entzündungsprozessen im Gastrointestinaltrakt hat die selektive
Inhibition von NF-κB/IKKβ in Epithelzellen in T-Zell-assoziierten chronischen
Kolitismodellen keinen Einfluss auf den Verlauf der Entzündung. Die Inaktivierung des
klassischen NF-κB-Signalweges in myeloiden Zellen reduziert die Ausprägung der
Entzündungsreaktion jedoch deutlich und verlängert das Überleben der Versuchstiere
signifikant.
Die Ergebnisse unterstreichen das komplexe und zelltypspezifische Funktionsspektrum NF-
κBs im Rahmen von Immun- und Entzündungsreaktionen im Gastrointestinaltrakt.
Überdies hinaus warnen sie vor einem unkritischen therapeutischen Gebrauch von
spezifischen IKKβ-Inhibitoren bei akuten Entzündungsprozessen, wo eine strukturelle
Schädigung der Mukosa im Vordergrund steht.
Literaturverzeichnis
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Literaturverzeichnis
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Danksagung
Allen voran möchte ich mich bei Florian Greten für die intensive Betreuung im Rahmen
dieses Projektes, das Vertrauen und die ganzheitliche Unterstützung während der
letzten vier Jahre bedanken. Ich habe in dieser Zeit weit mehr gelernt als
wissenschaftlich zu arbeiten und dafür bin ich sehr dankbar. Das gleiche gilt für Canan
Arkan, die stets ein offenes Ohr für auftretende Probleme hatte und mich über die Zeit
begleitet hat.
Außerdem möchte ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe bedanken: Moritz
Bennecke, Julia Bollrath, Alexander Fingerle, Birgit Wittig, Kristin Retzlaff, Özge Canli,
Sarah Schwitalla, Arun Kumar Mankan, Serkan Göktuna, Manon Schulz und Cigdem
Atay. Besonders zu erwähnen sind Julia Bollrath und Moritz Bennecke. Danke für Eure
Unterstützung.
Ein besonderer Dank gilt auch Lars Eckmann, Department of Medicine, University of
California, San Diego, USA für die enge Kooperation bei der Analyse der Funktion von
IKKβ im T-Zell-assoziierten Kolitismodell.
Außerdem danke ich Roland Lang, Institut für Medizinische Mikrobiologie der
Technischen Universität München für Durchführung des Microarrays und die Hilfe bei
der Auswertung der Ergebnisse.
Ein großer Dank gebührt meinen Eltern Bärbel und Erhard Grünewald, die mir das
Medizinstudium ermöglich haben und mich immer liebevoll aus der Ferne unterstützt
haben.